HYDRAGEL 7 ISO-PAL HYDRAGEL 15 ISO-PAL
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1. HYDRAGEL 7 ISO PAL Ref 4112 HYDRAGEL 15 ISO PAL Ref 4132 2008 01 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 ESPECIFICACIONES DE USO Los kits HYDRAGEL 7 ISO PAL e HYDRAGEL 15 ISO PAL est n dise ados para la identificaci n y cuantificaci n de los isoenzimas de la fosfatasa alcalina FAL en suero humano Los kits se usan junto con el sistema de electroforesis semiautom tico HYDRASYS para obtener geles listos para su interpretaci n Las muestras de suero son sometidas a electroforesis en geles de agarosa tamponados pH 9 1 Los isoenzimas de la FAL separados son visualizados usando un sustrato cromog nico espec fico Los geles secos est n listos para un examen visual y para la densitometr a para obtener una cuantificaci n relativa precisa de cada tracci n Cada gel de agarosa est dise ado para el an lisis de 3 muestras en el kit HYDRAGEL 7 ISO PAL 7 muestras en el kit HYDRAGEL 15 ISO PAL Para Uso Diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST La fosfatasa alcalina es una metaloglicoproteina con actividad monofosfoesterasa Cataliza la hidr lisis de steres monofosf ricos que es activada por iones magnesio en medio alcalino Este enzima se encuentra en muchos tejidos humanos por ejemplo h gado hueso ri n intestino y placenta Su elevaci n es evidente en una variedad de afecciones hep ticas y no hep ticas as como en el crecimiento adolescente normal Los enzimas de la fosfatasa alcalina est n2. Aspire los restos de soluci n del sustrato Sostenga la pipeta verticalmente y apoye suavemente la punta de la pipeta en el pocillo Fig 6 Aspire el reactivo cuidadosa y progresivamente Saque la plantilla Coja la solapa de la plantilla Eleve la plantilla y s quela Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel Incline el papel de filtro unos 45 Alinee el lado inferior del papel de filtro con el borde del gel Haga descender el papel de filtro sobre el gel Presione sobre toda la superficie del papel de filtro para asegurar una perfecta adherencia al gel Cierre la tapa del HYDRASYS Inicie la secuencia de secado con el papel de filtro presionando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado En pantalla aparece el mensaje siguiente ABSORCI N PAPEL Limpie la plantilla con agua destilada o alcohol y s quela completamente con un papel absorbente suave Antes de volver a usarla aseg rese de que la plantilla est completamente seca APLICACI N DE PAPEL DE FILTRO DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Secado con papel de filtro a 45 C durante 3 minutos Suena un pitido hasta que el operario interviene En pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente PAPEL NOTA Durante el secado con papel la tapa del m dulo de migraci n permanece bloqueada 50 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 IV SECADO DEL GEL 1 Abra la tapa 2 Saque el papel de filtro y
3. estudiada BIBLIOGRAF A Bayer PM Intestinal alkaline phosphatase and the ABO blood group system A new aspect Clin Chem Acta 1980 108 81 87 Farley J et al Skeletal alkaline phosphatase activity in serum Clin Chem 1995 41 1551 1553 Faure G et al Les phosphatases alcalines aspect g n tique identification et interpr tation clinique Ann Biol Clin 1990 48 119 125 Poy Fishman WH Alkaline phosphatase isoenzymes Recent progress Clin Biochem 1990 23 99 104 53 11 12 18 14 15 16 17 18 19 20 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 Foucault P Inter t de l tude des phosphatases alcalines totales et de l isoenzyme osseuse dans une population de sujets atteints d ost oporose Ann Biol Clin 1991 49 477 481 Kuwana T et al Reference limits of bone and liver alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of healthy subjects according to age and sex as determined by wheat germ lec tin affinity electrophoresis Clin Chem Acta 1988 173 273 280 Mc Kenna MJ Hamilton TA Sussman HH Comparison of human alkaline phosphatase isoenzymes Structural evidence for three protein classes Biochem J 1979 181 67 73 Moss DW Alkaline phosphatase isoenzymes Clin Chem 1982 28 2007 2016 Moss DW Diagnostical aspects of alkaline phosphatase and its isoenzymes Clin Biochem 1987 20 225 230 Piva MT D tection de m tastases h patiques d un cancer digestif Inter t des ph
4. n lt 8 IU L Podr a ser de origen membranoso y estar asociada con lipoprote nas Un aumento de L2 puede darse en la colestasis y en enfermedades biliares por ejemplo cirrosis hepatitis v rica y en tumores malignos por ejemplo de pecho h gado pulm n pr stata aparato digestivo con met stasis hep tica En los geles HYDRAGEL 7 15 ISO PAL L2 migra claramente entre las fracciones L1 B y las intestinales Isoenzima seo Este es un isoenzima significativo presente en todas las muestras La fracci n sea tiene que interpretarse respecto a la edad ya que su elevaci n es fisiol gicamente normal durante la edad de crecimiento El aumento del isoenzima seo est asociado principalmente con las afecciones siguientes En tumores malignos como el cancer de pecho con met stasis sea o hep tica Tambi n en el osteosarcoma y en el linfoma con o sin met stasis En enfermedades reum ticas hiperparatiroidismo enfermedad de Paget y en el raquitismo En la hiperfosfatasemia transitoria de la infancia que est asociada con una fracci n hep tica especial m s an dica que la L1 En tal caso la FAL total est muy elevada gt 2000 IU L Cuando est asociada con el aumento de otra fracci n por ejemplo L1 L2 puede indicar malignidad del recto pulm n y pr stata con met stasis sea y hep tica Isoenzimas intestinales La movilidad de los isoenzimas intestinales del adulto es la misma en los dos carriles
5. 8 13 9 Exactitud Estudio comparativo Se analizaron sesenta 60 muestras de suero diferentes normales y patol gicas usando el kit de SEBIA HYDRAGEL 15 ISO PAL y otro sistema comercial para la determinaci n electrofor tica de los isoenzimas de la fosfatasa alcalina Hab a una concordancia perfecta entre las dos pruebas en a detecci n visual de los isoenzimas de la fosfatasa alcalina Los resultados del an lisis de regresi n lineal de los valores densitom tricos de las fracciones L1 sea y L2 n 60 est n tabulados debajo y valores de SEBIA Par metro Coeficiente de Intersecci n en y Pendiente Gama de valores en IU L correlaci n prueba de SEBIA Fracci n L1 0 994 3 840 0 946 12 556 Fracci n B 0 968 5 307 0 978 12 387 Fracci n L2 0 993 4 396 0 985 0 288 Sensibilidad Una muestra de suero con las fracciones l1 12 e 13 y otra con las fracciones P1 y P2 fueron diluidas serialmente y las diluciones se sometieron a electroforesis en un gel HYDRAGEL 15 ISO PAL La menor actividad detectada mediante densitometr a de los isoenzimas individuales oscilaba entre 2 y 3 IU L Linealidad Se usaron dos muestras la n 1 conten a L1 y L2 FAL total 1000 IU L la n 2 conten a L1 y B FAL total 600 IU L Se analizaron diluciones seriales que oscilaban entre 1000 10 IU L y 600 50 IU L respectivamente en geles HYDRAGEL 15 ISO PAL El sistema fue lineal dentro de toda la gama
6. geles y la lectina pueden permanecer sin refrigeraci n 15 a 30 C durante 15 d as sin ning n efecto adverso en su funcionamiento REACTIVOS NECESARIOS pero suministrados a parte de los kits 1 SALINA Preparaci n Prepare una soluci n de NaCl 0 15 M 0 9 g dL con agua destilada o desionizada Uso Para reconstituir el vial de lectina Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene la salina a temperatura ambiente o refrigerada Des chela despu s de 3 meses o si cambia su aspecto por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana Para per odos de almacenaje m s prolongados a ada azida s dica 0 1 g dL 2 SOLUCI N DECOLORANTE Preparaci n Cada vial de la Soluci n Decolorante stock SEBIA PN 4540 10 viales de 100 mL se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada Es conveniente diluir s lo 5 mL de la soluci n stock hasta 5 litros que es el volumen del contenedor de soluci n decolorante Despu s de la diluci n la soluci n decolorante de trabajo contiene cido c trico 50 mg dL Uso Para lavar el gel despu s de la visualizaci n enzim tica y secado y para lavar el compartimento de tinci n del HYDRASYS Para neutralizar la acidez de la soluci n decolorante al desecharla dispense 15 mL de una soluci n al 50 de hidr xido s dico en el contenedor de desechos vac o Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene la soluci n decolorante stock a t
7. 5 ISO PAL para el HYDRAGEL 15 ISO PAL 5 Saque las esponjas tamponadas de su envoltorio C jalas por los extremos de pl stico Engarce los extremos pertorados del respaldo de pl stico de las esponjas con los polos del soporte de los electrodos el respaldo de pl stico de las esponjas debe quedar encarado hacia el soporte Fig 2 6 Saque el gel de agarosa HYDRAGEL de su envoltorio Extienda un papel de filtro fino de manera r pida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de l quido Retire el papel inmediatamente ADVERTENCIA Para evitar que se deshidrate no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo Dispense 120 pL de agua destilada para el HYDRAGEL 7 ISO PAL 6 200 uL para el HYDRAGEL 15 ISO PAL en el tercio inferior del marco impreso en la placa de control de la temperatura del m dulo de migraci n Ponga el gel con el lado de agarosa hacia arriba con su borde inferior contra el tope situado debajo del marco impreso Fig 3 Doble el gel y haga que contacte con el agua Fig 3 Aseg rese de que no se formen burbujas de aire de que el agua est extendida bajo toda la superficie del gel y de que ste est alineado con el marco impreso 7 Coloque una m scara de pl stico sobre el gel Coja una m scara de pl stico Alinee el lado superior de la m scara de pl stico con la linea horizontal impresa en el soporte de pl stico del gel Aplique la m scara de pl s
8. A suero normal B suero con fracciones intestinales 11 e 12 C suero con las fracciones hep ticas L1 y L2 elevadas Cada muestra se aplic en todos los carriles de un nico gel Las separaciones electrofor ticas fueron evaluadas mediante densitometr a La tabla siguiente muestra las medias SD y CV de cada fracci n de fosfatasa alcalina en cada muestra de suero para cada gel PAR METRO L1 B L2 I1 12 13 Muestra A MEDIA 53 2 39 9 6 9 1 SD 0 9 1 0 0 1 CV 1 2 4 1 8 Muestra B MEDIA 38 4 33 9 5 9 6 1 12 8 2 9 SD 1 0 0 5 0 1 0 2 0 5 0 1 CV 2 5 1 6 2 4 3 9 3 8 5 1 Muestra C MEDIA 55 2 11 7 33 1 SD 0 6 0 7 0 6 1 CV 1 1 6 0 1 9 1 Reproducibilidad interserial Se analizaron siete muestras de suero diferentes en 10 geles HYDRAGEL 15 ISO PAL del mismo lote Las medias SD y CV n 10 se calcularon para cada muestra de suero y cada fracci n de fosfatasa alcalina Los resultados fueron esencialmente los mismos en todas las muestras La tabla siguiente muestra la gama de SD y CV que representa a todas las muestras y un CV medio calculado a partir de los CV agrupados de todas las muestras FRACCI N SD CV CV MEDIO L1 04 13 0 7 17 2 6 6 P1 1 0 1 3 21 42 3 1 B 0 3 1 7 0 3 7 9 41 L2 0 2 0 5 12 127 6 2 P2 0 6 0 9 3 3 11 3 73 m 0 2 44 98 7A 12 0 4 3 5 3 5 13 0 2 0 3 7 1 20
9. M TICAS Los dos soportes descienden de forma que las esponjas tamponadas y los aplicadores contactan con la superficie del gel El soporte del aplicador de muestra se eleva La migraci n se realiza a 10 W de potencia constante en el HYDRAGEL 7 ISO PAL 6 a 20 W de potencia constante en el HYDRAGEL 15 ISO PAL a 35 C seguidos por 30 C hasta que se han acumulado 80 Vh durante unos 18 minutos El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos Suena un pitido y la tapa se desbloquea Esta se al se mantiene hasta que el operario interviene Aparece en pantalla el siguiente mensaje intermitente Y SUSTRATO NOTA La tapa del m dulo de migraci n permanece cerrada durante todas las etapas de la migraci n I PREPARACI N PARA LA INCUBACI N CON EL SUSTRATO DE ISO PAL 1 2 3 B i Despu s de la migraci n abra la tapa El mensaje siguiente deja de ser intermitente SUSTRATO Saque los aplicadores de muestra y des chelos Eleve ambos soportes extraiga las esponjas tamponadas por sus extremos de pl stico y des chelas Saque el soporte de los electrodos y los aplicadores Limpie los electrodos limpi ndolos cuidadosamente con un pa uelo de papel suave humedecido Deje el gel en el sitio que ocupa en el m dulo de migraci n Saque la m scara de pl stico por una esquina y des chela Prepare la plantilla de aplicaci n de reactivos 4 como sigue Fig 5 Coloque la gu a de la pl
10. Pueden verse como 1 2 6 3 fracciones Alrededor de un 40 de los individuos normales poseen el isoenzima intestinal Su actividad puede estar aumentada en algunas enfermedades como la cirrosis hep tica la diabetes y el fallo renal cr nico Isoenzima placentario Siempre hay dos formas de isoenzimas placentarios la forma principal P1 y la forma minoritaria P2 que representan alrededor del 90 y el 10 respectivamente Se encuentra durante el embarazo y en algunas enfermedades malignas principalmente en c nceres ov ricos as como en los sarcomas y en c nceres pancre ticos y de est mago Su aumento puede deberse tambi n a fumar en exceso se libera desde los pulmones Complejo de inmunoglobulina o macro fosfatasa alcalina Esta fracci n aparece raras veces Es un complejo de inmunoglobulina FAL Permanece muy cerca del punto de aplicaci n en ambos carriles Complejo fosfatasa alcalina LP Este es un complejo de lipoprote na L2 Permanece muy cerca del punto de aplicaci n en ambos carriles Puede aparecer en enfermedades biliares obstructivas Isoenzimas at picos Los isoenzimas con migraciones at picas como el Nagao Regan y Kasahara son dif ciles de identificar Limitaciones Consulte MUESTRAS PARA EL AN LISIS Los l pidos y la bilirrubina hasta 100 mg L a elevadas concentraciones no interfieren en la determinaci n de los isoenzimas de la FAL usando el procedimiento HYDRAGEL 7 15 ISO PAL NOTA En un
11. YS est dise ada para limpiar el compartimento de tinci n del HYDRASYS sela peri dicamente por ejemplo si el instrumento se utiliza diariamente lave el compartimento de tinci n semanalmente Consulte la hoja de instrucciones para conocer el modo de empleo Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene las soluciones de lavado stock y de trabajo en contenedores cerrados a temperatura ambiente o refrigeradas Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de soluci n de lavado Deseche la soluci n de lavado de trabajo si cambia su aspecto por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana 48 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Sistema HYDRASYS SEBIA PN 1210 PN 1211 Micropipeteador manual o autom tico como el HYDRAPLUS SEBIA PN 1216 HYDRAPLUS 2 SEBIA PN 1217 para una forma alternativa de cargar los aplicadores de muestra C mara de Almacenamiento H meda suministrada con el HYDRASYS PN 1270 Barra de Gu a de las Plantillas SEBIA suministrada con el HYDRASYS Kit de Accesorios ISO LDH ISO PAL CHOL para HYDRASYS SEBIA PN 1261 Pipetas 10 pL 200 uL 1 mL y 5 mL Densit metro esc ner capaz de escanear geles de 82 x 51 mm 82 x 102 mm a 570 nm filtro amarillo por ejemplo HYRYS SEBIA DVSE SEBIA o el programa PHORESIS para esc ner de sobremesa Consulte las instrucciones del fabrican
12. a muestra ict rica la coloraci n amarilla debida a la presencia de bilirrubina se reparte en 2 fracciones Una aparece al nivel de la Alb mina lo que significa que es 1 cm m s r pida que la fracci n Hep tica 1 y la otra m s difusa est situada al mismo nivel que la fracci n Hep tica 2 Despu s de la detecci n de los diferentes isoenzimas de la fosfatasa alcalina con el sustrato espec fico esta tinci n amarilla es eliminada en la absorci n con papel de filtro grueso y en las ltimas etapas de lavado Las trazas residuales de bilirrubina no interfieren durante la lectura del HYDRAGEL 7 15 ISO PAL porque su tinci n azul se lee con un filtro amarillo 570 nm Resoluci n de problemas Llame al Servicio de Atenci n T cnica de su distribuidor cuando la prueba no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la preparaci n y almacenaje de los materiales y para el procedimiento Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de su distribuidor B52 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 CARACTERISTICAS T CNICAS Se us el densit metro HYRYS de SEBIA en todas las medidas densitom tricas Reproducibilidad intraserial Tres muestras de suero diferentes A B amp C fueron sometidas a electroforesis en geles HYDRAGEL 15 ISO PAL del mismo lote Las muestras eran
13. al disordey or metabolic bone diseases Clin Chem 1996 42 1796 1804 Wolf P Clinical significance of serum high molecular mass alkaline phosphatase alkaline phosphatase lipoprotein X complex and intestinal variant alkaline phosphatase J Clin Lab Anal 1994 8 172 176 PATRONES DE MIGRACI N Oseo gt L gt a A L2 1 a aa P2 gt lt P2 2 D O l3 gt 18 mm Oseo lt lipo ALP complejo Punto de applicaci n SIN CON lectina lectina bas HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 SCH MAS FIGURES Figure 2 Figure 4 Figure 1 Figure 6 Figure 3 Figure 5 173 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 SCH MAS FIGURES Figure 7 174
14. antilla de aplicaci n en las horquillas de sujeci n la gu a puede estar colocada en el HYDRASYS en todo momento Sostenga la solapa de la plantilla y ponga sus ganchos en las marcas de la gu a Haga descender la plantilla sobre el gel Despu s de haber mezclado el crom geno y el sustrato consulte REACTIVOS Y MATERIALES p rrafo 4 aplique inmediatamente 2 5 mL de la soluci n del sustrato de ISO PAL en el HYDRAGEL 7 ISO PAL 6 5 mL en el HYDRAGEL 15 ISO PAL como sigue Fig 6 Sostenga la pipeta verticalmente Apoye suavemente la punta de la pipeta en el agujero de la plantilla Dispense el reactivo con cuidado y progresivamente sin introducir burbujas de aire por debajo de la plantilla Cierre la tapa del HYDRASYS Inicie inmediatamente la incubaci n presionando la flecha verde INICIO del lado izquierdo del teclado En pantalla aparece el mensaje siguiente INCUBACI N INCUBACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 37 C durante 45 minutos y a 50 C durante 15 minutos Suena un pitido y la tapa se desbloquea Esta se al se mantiene hasta que el operario interviene En pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 SUSTRATO PAPEL NOTA Durante la incubaci n la tapa del m dulo de migraci n permanece bloqueada Ill ELIMINACI N DEL SUSTRATO Y APLICACI N DEL PAPEL DE FILTRO 1 2 ps Abra la tapar El mensaje siguiente deja de ser intermitente SUSTRATO Y PAPEL
15. codificados por 3 genes estructurales 2 genes codifican los isoenzimas placentario e intestinal respectivamente El 3 er gen denominado gen de tejido no espec fico se expresa en una variedad de tejidos tales como el hueso el h gado y el ri n Los isoenzimas individuales de la FAL pueden separarse normalmente mediante electroforesis de acuerdo con las diferencias de carga Sin embargo las movilidades electrofor ticas de los isoenzimas hep tico y seo son inducidas s lo por glicosilaci n o modificaciones postraduccionales y por lo tanto son bastante parecidas Deben separarse con un tratamiento especial de la muestra La cuantificaci n de los isoenzimas de la FAL ayuda a identificar los tejidos responsables de la elevaci n La electroforesis de suero humano en los geles HYDRAGEL 7 15 ISO PAL separa casi todos los isoenzimas de la fosfatasa alcalina excepto el hep tico 1 L1 y el seo B y el placentario 1 P1 cuando est presente que migran juntos en una nica fracci n ancha De nodo a c todo el patr n de migraci n es como sigue vea la figura Patrones de Migraci n L1 B P1 hep tico 2 L2 este isoenzima se conoce tambi n como macrohep tico o hep tico r pido intestinal 1 2 y 3 I1 12 e 13 El placentario 2 P2 cuando est presente est situado entre 11 e 12 En algunas muestras muy ict ricas puede observarse una fracci n adicional cerca del punto de aplicaci n Es un complejo de fosfatasa alcalina
16. deje el gel en su lugar 3 Cierre la tapa del HYDRASYS 4 Inicie el secado presionando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado En pantalla aparece el mensaje siguiente SECADO SECADO DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Secado del gel a 60 C durante 2 minutos Suena un pitido y la tapa se desbloquea La temperatura de la placa permanece a 50 C hasta que se abre la tapa NOTA Durante el secado la tapa del m dulo de migraci n permanece bloqueada V LAVADO Y PROCESAMIENTO FINAL DEL GEL 1 Abra la tapa 2 Saque el gel seco 3 Abra el soporte del gel Exti ndalo y coloque el gel con el lado de agarosa hacia arriba en las ranuras de las dos barras y cierre el soporte Aseg rese de que el gel est colocado correctamente dentro del soporte Fig 7 4 Ponga el soporte del gel en el m dulo de procesamiento tinci n del gel IMPORTANTE Antes de iniciar el programa de procesamiento tinci n del gel compruebe lo siguiente el contenedor de soluci n decolorante contiene por lo menos 400 mL de soluci n decolorante el contenedor de desechos est vac o Para conocer en qu posiciones conectar los reactivos consulte la informaci n que aparece en la pantalla del instrumento seleccione la tecla PANTALLA DE CANALES IMPORTANTE No olvide bloquear los canales no utilizados 5 Seleccione el programa de lavado LAVADO ISO ENZIMAS en el men del instrumento e inicie el procedimiento pre
17. eden cuantificarse de manera precisa mediante la densitometr a del perfil con lectina Consulte el patr n de migraci n como ayuda en la identificaci n de los isoenzimas individuales 1 Suero normal Los isoenzimas hep tico L1 y seo son las dos fracciones que aparecen normalmente en los sueros de individuos sanos En el HYDRAGEL 7 15 ISO PAL migran superpuestos en el carril sin lectina y se separan completamente en el carril con lectina Pueden tambi n observarse una o varias hasta tres fracciones intestinales en el suero normal A un nivel normal de actividad total de FAL la presencia de la s fracci n es intestinal es no se ha asociado con ninguna condici n patol gica En los individuos que no han ayunado y en los que poseen el grupo sangu neo B O aparece este isoenzima intestinal m s a menudo 2 Casos especiales Isoenzimas hep ticos Hay dos isoenzimas hep ticos L1 y L2 La fracci n L1 es la m s an dica de todos los isoenzimas y la m s significativa de los dos isoenzimas hep ticos L1 est aumentado en algunas enfermedades no malignas tales como la colestasis la cirrosis la hepatitis v rica y en varias patolog as biliares y hep ticas Tambi n est aumentado en tumores malignos con met stasis hep ticas en el c ncer de pulmones y el tracto digestivo y en el linfoma La fracci n L2 tambi n denominada macrohep tica o hep tica r pida tambi n existe en los individuos sanos pero a una baja concentraci
18. ellos Si el producto contacta con la piel l vese inmediatamente con agua en abundancia Uso Las esponjas tamponadas act an como un reservorio del tamp n de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora NO LAS CONGELE Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa est abierta o si las esponjas est n secas 3 LECTINA Preparaci n El vial de lectina contiene Wheat Germ Agglutinin WGA en una forma liofilizada estabilizada Reconstituya el vial de lectina con exactamente 0 5 mL de salina Cierre el vial Mezcle suavemente y deje el vial en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos Despu s mezcle con cuidado para obtener una soluci n de lectina clara que est lista para su uso Uso Para el tratamiento de las muestras de suero que migran durante las separaciones electrofor ticas Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene la lectina liofilizada refrigerada 2 a 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial de lectina Despu s de la reconstituci n la soluci n de lectina debe cons
19. emperatura ambiente o refrigerada Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial de soluci n decolorante La soluci n decolorante de trabajo es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella cerrada No le a ada azida s dica Deseche la soluci n decolorante de trabajo si cambia su aspecto por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana Para impedir la proliferaci n microbiana en la soluci n decolorante diluida que se vaya a conservar durante m s de una semana a ada 5 pL dL de ProClin 300 El decolorante diluido al que se ha a adido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante 3 SOLUCI N DE LAVADO HYDRASYS Preparaci n Cada vial de la Soluci n de Lavado HYDRASYS stock SEBIA PN 4541 10 viales de 80 mL se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de lavado de trabajo contiene tamp n alcalino pH 8 8 0 3 azida s dica ADVERTENCIA La soluci n de lavado stock contiene un 0 625 de azida s dica No la ingiera Si la ha ingerido consulte a un m dico inmediatamente La azida s dica puede formar compuestos explosivos o t xicos en contacto con cidos plomo o cobre Lave siempre con una gran cantidad de agua al desechar el producto Uso La soluci n de lavado HYDRAS
20. ervarse a 20 C con ese prop sito recomendamos preparar al cuotas de 50 pL 100 yL para el HYDRAGEL 7 ISO PAL 6 HYDRAGEL 15 ISO PAL respectivamente O bien se puede conservar todo el volumen reconstituido a 20 C puede sufrir diez 10 ciclos de congelaci n descongelaci n sin ning n efecto adverso en su funcionamiento siempre y cuando la soluci n no est expuesta a la temperatura ambiente durante m s de 15 minutos en cada ciclo La soluci n de lectina congelada es estable a 20 C durante un m ximo de 6 meses 4 SUSTRATO Preparaci n El sustrato est listo para su uso Contiene BCIP 5 Bromo 4 Cloro 3 Indolil Fosfato en tamp n Aminometil Propanol AMP pH 10 0 y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Prepare la soluci n de visualizaci n protegida de la luz justo antes de usarla En el HYDRAGEL 7 ISO PAL a ada 0 5 mL de crom geno a 2 mL de sustrato y mezcle En el HYDRAGEL 15 ISO PAL a ada 1 mL de crom geno a 4 mL de sustrato y mezcle Uso Para preparar la soluci n de visualizaci n Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene el sustrato a temperatura ambiente o refrigerado Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial de sustrato El sustrato puede presentar una leve cristalizaci n sin ning n efecto adverso en su funcionamiento 5 CROM GENO Preparaci n El crom geno est
21. listo para su uso Contiene NBT Nitro Azul de Tetrazolio en agua Uso Para preparar la soluci n de revelado como se ha descrito en el p rrafo 4 Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene el crom geno a temperatura ambiente o refrigerado Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial de crom geno 47 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 6 APLICADORES Uso Aplicadores precortados de un solo uso para aplicar las muestras y la soluci n de lectina en el gel Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados 7 PAPELES DE FILTRO FINOS Uso Papeles de filtro finos absorbentes precortados de un solo uso para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicaci n de la muestra Conservaci n Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera 8 PAPELES DE FILTRO GRUESOS Uso Papeles de filtro gruesos absorbentes precortados de un solo uso para secar el gel despu s de la visualizaci n enzim tica Conservaci n Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera 9 M SCARAS DE PL STICO Uso L minas de pl stico de un solo uso para proteger el gel de la evaporaci n durante la migraci n electrofor tica NOTA Durante el transporte los
22. mL 1 vial de 10 mL Aplicadores listos para usar 2 cajas de 10 7 dientes 2 cajas de 10 15 dientes Papeles de Filtro Finos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 Papeles de Filtro Gruesos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 M scaras de pl stico 1 paquete de 10 1 paquete de 10 Los kits HYDRAGEL 7 ISO PAL e HYDRAGEL 15 ISO PAL contienen aplicadores con 7 y 15 dientes respectivamente Como cada muestra se aplica por duplicado se pueden analizar 3 7 muestras problema por gel respectivamente El carril restante puede usarse para el control PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y seg n las instrucciones incluidas LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 1 GELES DE AGAROSA Preparaci n Los geles de agarosa est n listos para su uso Cada gel contiene agarosa 1 g dL tamp n alcalino pH 9 1 0 05 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ADVERTENCIA Los geles contienen un 0 10 de azida s dica No los ingiera Si los ha ingerido consulte a un m dico inmediatamente Uso Medio de soporte para la electroforesis de los isoenzimas de la fosfatasa alcalina Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacene los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales preferenteme
23. n los isoenzimas L1 L2 P1 y P2 es d bil y la reacci n de arriba se desplaza hacia la izquierda Por lo tanto estos isoenzimas se ven ralentizados s lo ligeramente si se compara con su posici n en el patr n obtenido al realizar la electroforesis sin lectina Por otra parte la interacci n con el isoenzima B rico en cido si lico es fuerte y suficiente para precipitar la mayor a de B como una banda definida cerca del punto de aplicaci n de la lectina Cuando la capacidad de uni n de la lectina es excedida por ejemplo si el isoenzima seo est muy elevado como sucede en los c nceres seos y en el metabolismo seo activo en la edad de crecimiento la precipitaci n puede ser incompleta y ocasionalmente puede observarse una mancha an dica La mancha no afecta a la densitometr a del perfil con lectina consulte la Interpretaci n Los isoenzimas de la FAL separados son visualizados usando un sustrato cromog nico espec fico 5 Bromo 4 Cloro 3 ndolil Fosfato Nitro Azul de Tetrazolio en un tamp n Aminometil Propanol AMP pH 10 0 REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 7 ISO PAL E HYDRAGEL 15 ISO PAL ART CULOS PN 4112 PN 4132 Geles de Agarosa listos para usar 10 geles 10 geles Esponjas Tamponadas listas para usar 10 paquetes de 2 10 paquetes de 2 Lectina liofilizada 1 vial 2 viales Sustrato listo para usar 1 vial de 20 mL 2 viales de 20 mL Crom geno soluci n stock 1 vial de 10
24. nte refrigerados 2 a 8 C La flecha situada en la cara frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba Evite fluctuaciones de temperatura evidentes durante el almacenaje por ejemplo no los almacene cerca de una ventana o de una fuente de calor Los geles son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del envoltorio del gel NO LOS CONGELE Deseche el gel cuando 1 se formen cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda consecuencias de la congelaci n del gel Il se observe crecimiento bacteriano o f ngico IIl haya una cantidad de l quido anormal en la caja del gel como resultado de la exudaci n del tamp n debida a un almacenamiento inadecuado 2 ESPONJAS TAMPONADAS Preparaci n Las esponjas tamponadas est n listas para su uso Cada una contiene tamp n alcalino pH 9 3 0 2 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ADVERTENCIA El tamp n de las esponjas contiene un 0 5 de azida s dica No las ingiera Son perjudiciales si se ingieren Si las ha ingerido accidentalmente consulte a un m dico inmediatamente Al desechar el producto evite que contacte con cidos plomo o cobre ya que se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos o t xicos con la azida s dica El contacto del producto con cidos libera un gas muy t xico Cuando se deshaga del producto evite que contacte con
25. osphatases alcalines de leur isoenzyme macromol culaire et de la cerul oplasmine Ann Biol Clin 1997 55 209 214 Rosalki SB et al Lectin affinity electrophoresis of alkaline phosphatase for the differentiation of bone and hepatobiliary disease Electrophoresis 1989 10 604 611 Saheki S et al Intestinal type alkaline phosphatase hyperphosphatasemia associated with liver cirrhosis Clin Chem Acta 1992 210 63 73 Schiele F Henny J Hitz S PetitClerc C Gueguen R Siest G Total bone and liver alkaline phosphatases in plasma biological variation and reference limits Clin Chem 1983 23 634 641 Van Hoof VO Lepoutre LG Hoylaerts MF Chevigne R De Broe ME Improved agarose electrophoretic method for separating alkaline phosphatase isoenzymes in serum Clin Chem 1988 34 1857 1862 Van Hoof VO and Van Mullen M Comparison of two commercially available systems for the electrophoretic separation of alkaline phosphatase isoenzymes J Chrom 1993 646 235 243 Van Hoof VO et al Interpretation and clinical significance of alkaline phosphatase isoenzyme patterns Clinical Lab Sci 1994 vol 31 issue 3 Van Hoof VO Alkaline phosphatase isoenzyme patterns in malignant disease Clin Chem 1992 38 2546 2551 Vergote Placental alkaline phosphatase as a tumor marker in ovarian cancer Obstet Gynecol 1987 69 228 232 Woitge MW et al Comparison of total and bone specific alkaline phosphatase in patients with non skelet
26. peltier LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS I PREPARACI N DE LA MIGRACI N 1 Encienda el instrumento HYDRASYS 2 Es necesario usar dos aplicadores por cada gel HYDRAGEL 7 ISO PAL HYDRAGEL 15 ISO PAL para aplicar las muestras de suero y las soluci n de lectina Ponga los aplicadores dos por cada HYDRAGEL 7 ISO PAL 7 dientes para 3 muestras o HYDRAGEL 15 ISO PAL 15 dientes para 7 muestras en una superficie plana con los n meros de los pocillos hacia arriba Fig 1 Primer aplicador aplique 10 pL de cada muestra de suero en 2 pocillos adyacentes Segundo aplicador aplique 10 pL de soluci n de lectina en cada pocillo de n mero par Cargue cada aplicador en menos de 2 minutos Se puede aplicar un suero control valorado en el ltimo pocillo de cada aplicador Ponga los aplicadores en la c mara de almacenamiento h meda con los dientes hacia arriba c jalos por el marco protector de pl stico de los dientes Deje que las muestras difundan en los dientes durante 5 minutos despu s de la ltima aplicaci n de muestra Consulte la hoja de instrucciones de la c mara h meda para m s detalles 3 Abra la tapa del m dulo de migraci n y eleve los soportes del aplicador y los electrodos ADVERTENCIA No cierre nunca la tapa cuando los soportes est n elevados 4 Seleccione el programa de migraci n en el men del instrumento lado izquierdo del teclado 7 ISO PAL para el HYDRAGEL 7 ISO PAL 6 1
27. ril con lectina El valor del isoenzima B se obtiene restando los valores densitom tricos de las fracciones L1 y P1 obtenidos en el carril con lectina del valor de la fracci n L1 B P1 del carril sin lectina Todas las dem s fracciones L2 11 12 13 P2 y el complejo lipo ISO PAL se determinan en el carril sin lectina Valores normales Los valores normales de los isoenzimas individuales var an con la edad el sexo el estado hormonal embarazo menopausia pubertad y las medicaciones En individuos adultos de 20 a 50 a os de edad los valores son casi independientes de la edad En ni os la FAL total est aumentada debido al isoenzima seo predominante Los valores normales de los principales isoenzimas de la fosfatasa alcalina separados mediante electroforesis en los geles HYDRAGEL ISO PAL han sido establecidos a partir de una poblaci n sana de 100 adultos hombres y mujeres y 50 ni os MUJERES HOMBRES NINOS UI L UVL UWL FAL total lt 80 lt 122 lt 410 L1 18 72 lt 45 15 71 lt 64 1 31 lt 51 B 20 74 lt 44 23 75 lt 73 62 100 lt 370 t2 1 14 lt 8 1 9 lt 8 1 7 lt 19 I1 12 18 Los isoenzimas intestinales est n ausentes en alrededor de un 60 de los individuos normales cuando est n presentes no superan el 14 La actividad total de la FAL de la tabla superior ha sido determinada a 37 C en tamp n AMP Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propio
28. s valores de normalidad Los valores de actividad superiores IU L representan los valores normales m ximos Los valores normales de la actividad total de la FAL 1U L dependen del procedimiento y la temperatura usados para determinar la actividad los kits comerciales y los requisitos del laboratorio pueden variar en este aspecto Las actividades por fracci n deben estar basadas en las actividad total de la FAL y las condiciones del ensayo especificadas 51 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 Interpretaci n La interpretaci n de los patrones electrofor ticos requiere conocer la actividad total de FAL de la muestra el sexo y la edad del paciente Todas las fracciones sializadas son ralentizadas en cierto grado en el carril con lectina comparadas con el carril sin lectina S lo las fracciones intestinales no son afectadas por la lectina En el carril con lectina la fracci n sea normalmente forma una nica banda definida cerca del punto de aplicaci n De vez en cuando adem s de la banda definida puede observarse un rastro an dico Este fen meno generalmente es debido a que se ha excedido la capacidad de uni n de la lectina y por consiguiente se ha dado una precipitaci n incompleta por ejemplo cuando el isoenzima seo est muy elevado como sucede en los c nceres de hueso y en el metabolismo activo del hueso El rastro no se extiende en ning n caso a la posici n de migraci n de L1 o P1 por lo que estas dos fracciones pu
29. sionando la tecla INICIO flecha verde del lado derecho del teclado Durante el lavado y el secado el compartimento permanece bloqueado Despu s del enfriamiento un pitido audible indica que el compartimento se desbloquea la ventilaci n se mantiene hasta que se extrae el soporte del gel 6 Extraiga el soporte del gel del compartimento abra las horquillas y saque el gel seco Si es necesario limpie el reverso el lado de soporte de pl stico del gel seco con un pa uelo de papel humedecido El gel est listo para su evaluaci n 7 La temperatura de la placa desciende hasta 20 C en menos de 5 minutos Cuando se han alcanzado 20 C se puede iniciar una nueva migraci n 8 Coloque en su sitio los soportes del aplicador de muestras y los electrodos 9 Limpie la placa de control de la temperatura con un pa uelo de papel suave humedecido VI EVALUACI N Eval e los geles visualmente Cuando sea necesario l alos usando un densit metro esc ner con un filtro amarillo o a 570 nm RESULTADOS Control de Calidad Se aconseja incluir un suero control valorado o un suero conocido en cada an lisis de muestras Valores La actividad enzim tica de cada fracci n puede calcularse a partir de los valores densitom tricos en tanto por ciento de cada fracci n y la actividad total de la FAL Para cuantificar todos lo isoenzimas de la FAL lea los carriles con y sin lectina Los valores de los isoenzimas L1 y P1 se determinan en el car
30. te para los procedimientos de funcionamiento y cali braci n 8 Materiales de control de calidad na NOORW MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y almacenamiento de muestras Se recomienda analizar muestras de suero frescas Las muestras deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Almacene las muestras entre 2 y 8 C tan pronto como sea posible despu s de su obtenci n siendo as estables durante una semana Preparaci n de las muestras Use suero neto Cuando la actividad total de la fosfatasa alcalina sea elevada diluya las muestras de suero con salina hasta unas 600 IU L Muestras a descartar No use muestras hemolizadas Los enzimas eritroc ticos pueden interferir en la reacci n No use muestras que contengan un inhibidor de la actividad enzim tica de la fosfatasa alcalina tales como el EDTA el citrato o el oxalato PROCEDIMIENTO El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautom tico multiparam trico Las etapas autom ticas incluyen el procesamiento de los geles de agarosa HYDRAGEL en el orden siguiente aplicaci n de las muestras migraci n electrofor tica incubaci n con el sustrato secado con papel lavado y secado final del gel Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles la aplicaci n de los reactivos y la preparaci n del instrumento para el funcionamiento La temperatura de la placa del m dulo de migraci n est controlada por efecto
31. tico sobre la superficie del gel Evite que se formen burbujas de aire entre el gel y la m scara de pl stico Sostenga con un dedo la m scara de pl stico por un lado en la placa del m dulo de migraci n elimine suavemente las burbujas de aire de la superficie del gel Evite mover el gel en la placa de migraci n durante esta manipulaci n ADVERTENCIA La m scara de pl stico debe cubrir el lado superior del gel sin superponerse a la zona de contacto situada entre el gel y la esponja tamponada 8 Baje ambos soportes En esta posici n las esponjas tamponadas no tocan el gel NO FUERCE LOS SOPORTES HACIA ABAJO 49 9 HYDRAGEL 7 amp 15 ISO PAL 2008 01 Saque los aplicadores de la c mara h meda C jalos por el marco protector Rompa el marco protector de los dientes del aplicador Coloque el aplicador con las muestras en la posici n No 3 del soporte del aplicador Coloque el aplicador con la lectina en la posici n No 4 del soporte del aplicador Empuje los aplicadores hacia el lado izquierdo IMPORTANTE Los n meros impresos en los aplicadores deben quedar de cara al operario Fig 4 10 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 11 Inicie el procedimiento inmediatamente presionando la flecha verde INICIO del lado izquierdo del teclado IMPORTANTE Aseg rese de que la entrada de aire de ventilaci n del lado derecho del instrumento no est bloqueada MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTO
32. y lipoprote nas denominado lipo ISO PAL o ultra r pida UF en otros procedimientos Para superar las dificultades inherentes al separar los isoenzimas L1 y B se han explorado varios tratamientos de la muestra y algunos de ellos se usan rutinariamente por ejemplo inactivaci n diferencial mediante calor urea o amino cidos precipitaci n con un antisuero espec fico sensibilidad diferencial a la desializaci n enzim tica con neuraminidasa etc tera Todos los isoenzimas de la FAL est n sializados en cierto grado excepto los isoenzimas intestinales que carecen de cido si lico El sistema de SEBIA utiliza el diferente grado de sializaci n de los isoenzimas L1 y B para separarlos La lectina de germen de trigo WGA Wheat Germ Agglutinin presenta una fuerte afinidad por los residuos de cido si lico y por consiguiente se une preferentemente al isoenzima seo que es el que est m s sializado Para realizar el an lisis cada muestra se aplica por duplicado Durante la migraci n uno de los duplicados de la muestra pasa a trav s de la lectina que ha sido depositada an dicamente respecto al punto de aplicaci n de la muestra la lectina se mueve s lo ligeramente hacia el c todo La interacci n entre la WGA y los isoenzimas de la FAL que la atraviesan es una reacci n reversible 1 Isoenzima sializado WGA lt complejo isoenzima sializado WGA 2 Bajo las condiciones escogidas para la electroforesis la interacci n de la WGA co
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