GAD65 REF 3603 - Representaciones Orgal
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1.2. AESKULISA GAD65 REF 3603 Manual de Instrucciones Contenido 1 Utilizaci n Aplicaciones cl nicas y principio del ensayo Contenido del equipo Almacenamiento y caducidad Precauciones Toma de muestra manipulaci n y almacenamiento Procedimiento del ensayo Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Datos t cnicos Datos de funcionamiento Bibliograf a Esquema de dispensaci n Procedimiento del test 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 1 Utilizaci n AESKULISA GAD65 es un enzimoinmunoensayo en fase s lida que utiliza una prote na humana recombinante la isoenzima glutamato descarboxilasa 65kDa GAD65 para la detecci n cualitativa y cuantitativa de anticuerpos contra dicha prote na en el suero humano El ensayo se utiliza para el diagn stico de la diabetes mellitus de tipo 1 2 Aplicaci n cl nica y principio del ensayo La diabetes mellitus insulinodependiente tambi n denominada diabetes tipo DMT1 es una enfermedad autoinmune cr nica en la que el propio sistema inmunitario destruye la insulina producida por las c lulas 3 de los islotes de Langerhans Se caracteriza por la interrupci n total o casi total de la producci n de insulina y por la presencia de autoanticuerpos contra ant genos de las c lulas El la patog nesis de la DMT1 destaca la formaci n de autoanticuerpos contra ant genos de las c lulas B en la fase precl nica Entre los ant genos que estos anticuerpo
3. los reactivos concentrados Diluya el tamp n de muestra concentrado a 1 5 con agua destilada p e 20 ml en 80 ml Diluya el tamp n de lavado concentrado a 1 50 con agua destilada p e 20 ml en 980 ml Muestras Diluya las muestras de suero a 1 4 con soluci n tamp n para muestra 1x por ejemplo 225 ul de soluci n tamp n para muestra 1x 75 ul de suero Mezcle bien Reconstituya y diluya el conjugado GAD65 biotina Reconstituya el GAD65 biotina liofilizado en dos pasos En primer lugar agregue 1 ml de tamp n para reconstituci n a un vial permita que repose durante 5 minutos y m zclelo hasta que el GAD65 biotina se haya disuelto por completo Aseg rese de que no queden restos de GAD65 biotina liofilizado o reconstituido en el tap n En un segundo paso transfiera 1 ml de GAD65 bio tina reconstituido a 5 ml de tamp n para reconstituci n y mezcle bien Un vial de GAD65 biotina reconstituido es suficiente para seis tiras En caso de que sea necesa rio utilizar m s tiras durante un ensayo se deber n reconstituir y diluir tal como se describi anteriormente los dos viales de GAD65 biotina liofilizado y luego combinarse Mezcle bien Lavado Prepare 20 ml de tamp n de lavado diluido 1x para 8 pocillos o 200 ml para 96 pocillos p e 4 ml de concentrado en 196 ml de agua destilada Lavado autom tico Tenga en cuenta los vol menes de exceso requeridos para purgar el instrumento y el volumen muerto en el dispensador del aparato L
4. n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de conjugado dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de substrato TMB dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente 20 32 C 68 89 6 F protegido de la luz directa Dispense 100 ul de soluci n de paro dentro de cada pocillo siguiendo el mismo orden de pocillos que cuando dispens el substrato Incube un m nimo de 5 minutos Agite la placa cuidadosamente durante 5 segundos Lea la absorbancia a 450 nm opcionalmente a 450 620 nm dentro de los 30 minutos siguientes P gina 4 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 8 Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Para una interpretaci n cuantitativa establezca la curva standard trazando la densidad ptica DO de cada calibrador eje y con respecto a los correspondientes valores de concentraci n en IU ml eje x Para unos mejores resultados recomendamos coordenadas log lin y un ajuste a 4 PL Partiendo de la DO de cada muestra lea la correspondiente concentraci n de anticuerpo expresada en IU ml Rango Normal Resultados Positivos lt 30 IU ml gt 30 IU ml Ejemplo de curva standard Recomendamos dispensar los calibradores en paralelo para cada tanda Calibradores DO 450 620 nm CV Variaci n 0 1U ml 0 105 25 IU ml 0 250 75 IU ml 500 IU ml 2 946 3 1 Ejemplo de cal
5. y la europea Eur Ph 4 ed 4 Almacenamiento y Caducidad Guarde todos los reactivos y la microplaca a 2 8 C 35 46 F en sus envases originales El GAD biotina reconstituido se debe utilizar el mismo d a en el que se realiza la reconstituci n Una vez preparadas las soluciones reconstituidas son estables durante 1 mes a 4 C por lo menos Los reactivos y la microplaca deben ser utilizados solamente dentro del margen de caducidad indicado en cada componente Evite la exposici n de la soluci n TMB a la luz intensa Guarde las microplacas en su sobre correspondiente incluyendo el desecante y s llelo bien P gina 2 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 5 Precauciones 5 1 Datos de riesgo para la salud ESTE PRODUCTO ES SOLO PARA EL USO EN DIAGN STICO IN VITRO Por lo tanto solamente el personal formado y especialmente asesorado en los m todos de diagn stico in vitro puede realizar el ensayo Aunque no se considera este producto como particularmente t xico o peligroso en condiciones de uso normales rem tase a lo siguiente para una m xima seguridad Recomendaciones y precauciones Este equipo contiene componentes potencialmente peligrosos Aunque los reactivos del equipo no est n clasificados como irritantes de los ojos y la piel recomendamos evitar el contacto de los mismos con los ojos y con la piel y utilizar guantes desechables AVISO Los calibradores controles y agentes contienen zida de sodio NaN como conserva
6. F para sistemas automatizados No exponga nunca los componentes a temperaturas m s altas de 37 C 98 6 F Pipetee siempre la soluci n de substrato con puntas nuevas Protega este reactivo de la luz Nunca pipetee el conjugado con puntas previamente utilizadas con otros reactivos Un diagn stico cl nico definitivo no debe estar basado solamente en los resultados del ensayo realizado Debe ser elaborado por el m dico despu s de haber evaluado todos los hallazgos cl nicos y de laboratorio Es necesario verificar el diagn stico por medio de distintos m todos 6 Toma manipulaci n y almacenamiento de las muestras Utilice preferentemente muestras de suero reci n extra das La extracci n de sangre debe seguir los requerimientos de protocolo de su pa s No utilice muestras ictericas lip micas hemolizadas o contaminadas por bacterias Los sueros con part culas deben ser purificados por centrifugaci n a baja velocidad lt 1000 x g Las muestras de sangre deben ser recogidas en tubos limpios secos y vacios Despu s de la separaci n las mues tras de suero deben ser utilizadas inmediatamente Pueden guardarse bien cerradas a 2 8 C 35 46 F hasta tres d as o congelarse a 20 C 4 F para per odos m s largos P gina 3 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 7 Procedimiento del ensayo 7 1 Preparativos antes de dispensar Tenga en cuenta que s lo se deben preparar los reactivos que se vayan a utilizar ese mismo dia Diluya
7. afia 1 Chen S Willis J Maclean C Ananieva Jordanova R Amoroso MA Brooking H Powell M Collins A Bennett S Mitchell S Burne P Furmaniak J Smith BR 2005 Sensitive non isotopic assays for autoantibodies to IA 2 and to a combination of both IA 2 and GAD65 Clin Chim Acta 357 1 74 83 2 Torn C Mueller PW Schlosser M Bonifacio E Bingley PJ Participating Laboratories 2008 Diabetes Antibody Standardization Program evaluation of assays for autoantibodies to glut amic acid decarboxylase and islet antigen 2 Diabetologia 51 5 846 852 3 Lan MS Wasserfall C Maclaren NK Notkins AL 1996 IA 2 a transmembrane protein of the protein tyrosine phosphatase family is a major autoanti gen in insulin dependent diabetes mellitus Proc Natl Acad Sci U S A 93 13 6367 6370 4 Van den Driessche A Eenkhoorn V Van Gaal L De Block C 2009 Type 1 diabetes and autoimmune polyglandular syndrome a clinical review Neth J Med 67 11 376 387 5 Winter WE Harris N Schatz D 2002 Type 1 diabetes islet autoantibody markers Diabetes Technol Ther 4 6 81 7 839 Pagina 7 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 ANEXO A Esquema de dispensacion Se sugiere dispensar los calibradores controles y muestras como sigue Para una interpretaci n cuantitativa utilice calibradores para establecer una curva standard Para una interpretaci n cualitativa utilice el calibradore cut off for quantitative interpretation use cali for
8. avado manual Descarte el l quido de los pocillos invertiendo la placa Golpee vigorosamente el marco con los micropocillos sobre papel absorbente limpio manteniendo la placa invertida Dispense 300 ul de tamp n de lavado diluido dentro de cada pocillo y espere 20 segundos Repita el procedimiento entero dos veces m s Microplacas Calcule el n mero de pocillos necesarios para el ensayo Saque los pocillos no utlizados del marco p ngalos de nuevo en la bolsa de pl stico suministrada junto con el desecante y s llela bien 2 8 C 35 46 F 7 2 Esquema de trabajo Vea Anexo A para el esquema de dispensaci n vea Anexo B para el procedimiento Recomendamos la medici n de pipeta de las muestras y calibradores por duplicado El Calibrador Cut off es solamente para uso en las pruebas cualitativas o Dispense 100 ul de cada suero diluido de paciente dentro del pocillo correspondiente o Dispense 100 ul de los calibratores O calibradore cut off y controles positivo y negativo dentro de los pocillos designados Cubra la placa Incube durante 16 20 horas a 2 8 C 35 46 F Deje que la placa Microtiter y los reactivos reposen durante 30 minutos a temperatura ambiente Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Pipetee 100 ul de GAD65 biotina reconstituido y diluido en cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp
9. culo Paciente Replicado DO Media DO Resultado IU ml 0 454 0 442 0 448 1 279 1 265 1 272 Para conocer los datos espec ficos de lote consulte el documento adjunto de control de calidad Los laboratorios deber an realizar un Control de Calidad interno utilizando controles propios y o un pool de sueros interno tal y como contemplan las regulaciones de la UE No utilice este ejemplo para interpretar resultados de los pacientes Cada laboratorio deber a establecer su rango normal propio basado en sus propias t cnicas controles equipamiento y poblaci n seg n sus propios procedimientos establecidos Para una interpretaci n cualitativa lea la densidad ptica del calibradore cut off y la de las muestras de los pacientes Compare las DO de los pacientes con la DO del calibradore cut off Todas las mues tras que sean m s altas que el cut off se consideran positivas Negativo OD paciente lt OD cut off Positivo OD paciente gt OD cut off P gina 5 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 9 Datos Tecnicos Muestra suero Volumen de muestra 75 ul de muestra diluida a 1 4 con soluci n tamp n para muestra 1x Tiempo total de incubaci n 16 20 horas a 2 8 C 35 46 F y 90 minutos a 20 32 C 68 89 6 F Rango de calibraci n 0 500 IU ml Sensibilidad anal tica 6 IU ml Almacenamiento a 2 8 C 35 46 F utilice solo los viales originales N mero de determinaciones 96 tests 10 Datos de funcionam
10. guiente A continuaci n se determina la cantidad de GAD biotina ligado para ello se a ade el conjugado estreptavidina peroxidasa que se une a la biotina La estreptavidina peroxidasa no ligada se elimina por lavado en el paso siguiente La adici n del substrato TMB genera una reacci n enzim tica colorim trica azul que se detiene con cido diluido el color cambia al amarillo La velocidad de formaci n del color a partir del crom geno es proporcional a la concentraci n inicial de los respectivos anticuerpos en la muestra P gina 1 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 3 Contenido del equipo Para ser reconstituido Tamp n de Muestra 5x 1 vial 20 ml concentrado 5x tap n blanco soluci n amarilla Contiene Tris NaCl BSA azida s dica lt 0 1 conservante Tampon de Lavado 50x 1 vial 20 ml concentrado 50x tap n blanco soluci n verde Contiene Tris NaCl Tween 20 azida s dica lt 0 1 conservante GAD65 biotina 3 viales Liofilizado tap n blanco Contiene Biotina conjugada con GAD65 humana recombinante alb mina de suero bovino BSA Listo para el uso Tamp n para reconstituci n 1 vial 20 ml tap n rojo soluci n rojo Contiene PBS alb mina de suero bovino BSA Control Negativo 1 vial 1 ml tap n verde soluci n incolora Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Control Positivo 1 vial 1 ml tap n rojo soluci n amarilla Contiene Sue
11. iento 10 1 Sensibilidad anal tica L mite de detecci n El l mite de detecci n de AESKULISA GAD65 fue de 6 IU ml tras repetir 60 veces el ensayo con la soluci n de muestra y 8 muestras con valores bajos negativos en 8 ocasiones 10 2 Especificidad y Sensibilidad La placa Microtiter se recubre con GAD65 humana recombinante No se ha observado reactividad cruzada con otros autoantigenos La especificidad de diagn stico de los autoanticuerpos anti GAD65 es del 98 La sensibilidad de diagn stico de los autoanticuerpos anti GAD65 es del 92 10 3 Linealidad Se han analizado con este equipo sueros seleccionados y se encontr que deb an diluirse linealmente No obstante debido a la naturaleza heterog nea de los autoanticuerpos humanos pueden haber mue stras que no sigan esta regla concentraci n concentraci n Factor de medida esperada Recuperaci n diluci n IU ml IU ml 1 32 38 0 35 6 93 7 1 8 122 7 105 4 85 9 P gina 6 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 10 4 Precision Para determinar la precisi n del ensayo se valor la variabilidad intra e inter ensayo a trav s del an lisis de su reproducibilidad en tres muestras de suero Estas muestras fueron seleccionadas para representar un rango por encima de la curva standard Intra Ensayo Media C Media CV me cum eo 10 5 Calibracion El AESKULISA GAD65 se calibra respecto al reactivo de referencia de la OMS codigo NIBSC 97 550 11 Bibliogr
12. nce Catalogue Bestellnummer N mero de cat logo Descrizione lotto Lot Chargen Bezeichnung Lote Conformit europea D claration CE de Conformit Europ ische Konformit t D clarac o CE de Conformidade 96 determinazioni 96 tests 96 Bestimmungen 96 Testes Rispettare le istruzioni per luso Voir les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten Ver as instruc es de uso Da utilizzarsi entro Utilise avant le Verwendbar bis Utilizar antes de Conservare a 2 8 C Conserver 2 8 C Lagerung bei 2 8 C Conservar entre 2 8 C Prodotto da Fabriqu par Hergestellt von Fabricado por Calibratore cut off Etalon Seuil Grenzwert Kalibrator Calibrador de cut off Controllo positivo Contr le Positif Positiv Kontrolle Controlo positivo Controllo negativo Contr le N gatif Negativ Kontrolle Controlo negativo Calibratore Etalon Kalibrator Calibrador Recupero Corr lation Wiederfindung Recuperac o Coniugato Conjug Konjugat Conjugado Micropiastra rivestita Microplaque sensibilis e Beschichtete Mikrotiterplatte Microplaca revestida Piastra ad aghi rivestita Pinplate sensibilis e Beschichtete Pinplatte Pinplate revestida Tampone di lavaggio Tampon de Lavage Waschpuffer Soluc o de lavagem Tampone substrato Substrat Substratpuffer Substrato Reagente bloccante Solution d Arr t Stopreagenz Soluc o de paragem Tampone campione Tampon Echantillons Probenpuffer Diluente de amost
13. nte El NaN puede ser t xico si se ingiere o se absorbe por medio de la piel o de los ojos El NaN puede reaccionar con la fontaner a de plomo y de cobre y formar zida met lica muy explosiva Al tirar tirarla deje correr una gran cantidad de agua para evitar que la zida tome consistencia Por favor consulte los procesos de descontaminaci n del CDC u otras directrices locales o nacionales No fume coma o beba mientras manipule el equipo No pipetee con la boca Todo el material de fuente humana utilizado en algunos reactivos de este equipo por ejemplo con troles standards ha sido analizado a trav s de m todos aprobados y ha resultado ser negativo para HbsAg Hepatitis C y HIV 1 No obstante ning n test puede completamente garantizar la ausencia de agentes virales en ese tipo de material Por lo tanto manipule los controles standards y muestras de los pacientes como si se trataran de aut nticos transmisores de enfermedades infecciosas y seg n los requerimientos de manipulaci n de su pais 5 2 Instrucciones generales para la utilizaci n No mezcle o sustituya reactivos o microplacas de n meros de lote diferentes Esto podr a llevar a una variaci n de los resultados Deje que todos los componentes alcancen la temperatura 20 32 C 68 89 6 F antes de utilizarlos Ag telos bien y siga el esquema de incubaci n recomendado para una ptima realizaci n del ensayo Incubaci n se recomienda realizar las pruebas a 30 C 86
14. qualitative interpretation use cut n to establish a standard curve calibrator eier erlernten B caa cae P1 Inc fp cas car P2 ce ps tst E cac ec pa rc se 1 lt E E ssi A Da ee ee DR H CalD NC CalA calibrator A CalB calibrator B CalC calibrator C CalD calibrator D CalE calibrator E CalF calibrator F PC positive control NC negative control CC Cut off calibrator P1 patient 1 P2 patient 2 P3 patient 3 Pagina 8 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 Anexo B Procedimiento del test Samples 1 4 Controls 5 16h 20h 8 C 100 ul 2 C GAD65 Biotin W 100 ul 100 ul 30 3x 300ul e 100 ul 30 100 ul 5 450 nm P gina 9 de 9 002 2010 12 10 REF 3603 GAD65 LTLT96 VEL9 6 XP A 0L796 YEL9 6p Puoyg Aueunsn Z SUNA WMIOJOTNIJA WISUS SPUSM FETSS HIWD SILLSONDVITAMSAV ele ele e cl O m NO en W en N UTU OWEN I UYDSTIJU dOAMEUSIS ur E on a nyesoduns ainyesradurd neq 2A uru I QNAU voneqnau IS9 BSSY O 0 010 oH CIS lt 010 SS A 010 lt 010 010 010 lt CIS Ci 010 010 010 0 0 010 010 e Diagnosi in vitro Pour diagnostic in vitro In Vitro Diagnostikum Para uso Diagn stico in vitro Numero d ordine R f re
15. ra For in vitro diagnostic use Para uso diagn stico in vitro In Vitro AlayvwoTIK NEOO Cataloge number Numero de cat logo Ap du g Trapayyediac Lot Lote XapakTnpIon g TrapTidag EC Declaration of Conformity Declaraci n CE de Conformidad Eupwrtaiki ouupwvia 4 96 tests 96 pruebas 96 TTPOO IOPIONOI See instructions for use 4 Ver las instrucciones de uso M fete UTT N TIG odnyleg Xpriong Use by 4 Utilizar antes de Xp on p xpl 4 Store at 2 8 C 35 46 F Conservar a 2 8 C DMuAdoCETAI OTOUG 2 8 C Manufactured by Fabricado por KaraoKEUOTETAI OTTO Cut off Calibrator 4 Calibrador de cut off Opiak c op g Avtidpaotnpio BaBuov unons Positive Control Control Positivo OETIK G Op c EAEYXOU Negative Control Control Negativo ApvnTik g Op c EAEYXOU 4 Calibrator 4 Calibrador Avtidpaotnpio Badnov unong Recovery Recuperado Avaktnon 4 Conjugate Conjugado 9 2 Ceuy a 4 Coated microtiter plate Microplaca sensibilizada ETTIKOAUHJEVI pikporrA ka Coated pinplate 4 Pinplate sensibilizada EmikaAuyunevn trAdka Pin Wash buffer Soluci n de lavado PuBduiotik iua TTA ONS Substrate buffer Tampon sustrato PuBuIOTIK dIAAUUA UTTOOTPWNATOG 4 Stop solution Soluci n de parada 9 Avridpaortniipio laKOTTAG avtidpaons 4 Sample buffer Tamp n Muestras PUOLIOTIKO DIG ALLA dEIYN ATWV
16. ro humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradore Cut off 1 vial 1 ml tap n azul soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradores 6 viales 1 ml cada uno 0 25 75 125 250 500 IU ml el color aumenta con la concentraci n soluci n amarilla Contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa de r bano picante alb mina de suero bovino BSA Conjugado 1 vial 15 ml IgG tap n azul soluci n azul Contiene Inmunoglobulinas anti humanas conjugadas con peroxidasa Substrato TMB 1 vial 15 ml tap n negro Contiene TMB H202 estabilizado Soluci n de Paro 1 vial 15 ml tap n blanco soluci n incolora Contiene Acido Clorh drico 1M Placa Microtiter 12x8 tiras rompibles de pocillos Revestimiento ver p rrafo 1 Material necesario pero no suministrado Filtro de lectura de 450 nm del lector de tiras microtiter y filtro de referencia opcional de 620 nm 600 690 nm Equipo de cristal cilindro 100 1000ml tubos de ensayo para disoluciones Mezclador espiral Cubierta de la placa ELISA pipetas de precisi n 10 100 200 500 1000 ul o pipeta m ltiple ajustable 100 1000ul Dispositivo de lavado de la microplaca pipeta de repetici n o microcanal de 300 ul o sistema automatizado papel absorbente Nuestras pruebas se han dise ado para el uso con agua destilada seg n la definici n de la farmaco pea de los Estados Unidos USP 26 NF 21
17. s pueden reconocer se encuentra la insulina la glutamato descarboxilasa isoenzima GAD65 kDa y la tirosina fosfatasa pancre tica IA2 ant geno 2 de las c lulas de los islotes La GAD es una enzima que cataliza la formaci n de cido gamma aminobut rico GABA a partir de glutamina en los tejidos nerviosos y pancre ticos En los seres humanos existen dos isoenzimas de la GAD que reciben el nombre de su peso molecular GAD65 y GAD67 De este modo los autoanticuerpos siempre se dirigen contra la GAD65 y reaccionan principalmente con epitopos conformacionales Los anticuerpos anti GAD65 no s lo est n presentes en el 70 80 de los pacientes con diabetes mellitus incipiente sino tambi n en pacientes con diabetes autoinmune latente del adulto LADA enfermedades poliendocrinas relacionadas con la diabetes y algunas enfermedades neurol gicas raras es especial el s ndrome de la persona r gida SPS Principio del test Las muestras de suero diluidas a 1 4 se incuban durante la noche en placas Microtiter revestidas con el ant geno espec fico Los anticuerpos del paci ente si est n presentes en la muestra se unen al ant geno La fracci n no unida es eliminada por lavado en el paso siguiente A continuaci n se incuba el conjugado GAD biotina Durante este paso los autoanticuerpos GAD65 forman un puente entre la GAD65 inmovilizada en la placa y el GAD biotina de la fase l quida El GAD biotina sin ligar se elimina por lavado en el paso si
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