FuNGITEll® - Associates of Cape Cod, Inc.
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1. Nota 1 los pocillos externos se pueden utilizar si se ha demostrado que los resultados de estos son comparables a los de los pocillos internos Nota 2 para evitar la contaminaci n accidental sustituir la tapa de la microplaca despu s de a adir muestras y reactivos a los pocillos Retirar la tapa antes de colocar la placa en el lector para evitar interferencias pticas causadas por el vaho 3 Adici n de suero y reactivo del pretratamiento a Descongelar las muestras de suero congelado a temperatura ambiente Mezclar bien todas las muestras en v rtex b Transferir 5 uL de la muestra de suero a cada uno de sus pocillos Dsc designados como m nimo por duplicado Repetir para cada muestra de suero c A adir 20 uL del reactivo del pretratamiento del suero a cada pocillo que contenga suero Nota los pasos b y c se pueden llevar a cabo en orden inverso de acuerdo con las preferencias del t cnico d Agitar la placa durante 5 10 segundos para mezclar el contenido de los pocillos se puede usar la funci n de agitaci n de placas del lector a continuaci n incubar durante 10 minutos a 37 C en el lector de placas de incubaci n 4 Reconstituci n del reactivo Fungitell Nota esto se puede realizar convenientemente mientras la incubaci n del pretratamiento est en curso a Reconstituir un vial del reactivo Fungitell a adiendo 2 8 mL de RGW y a continuaci n a adiendo 2 8 mL de disoluci n amortiguadora Pyroso2. RESULTADO NEGATIVO Los valores de 1 gt 3 P D Glucanos lt 60 pg mL se interpretan como resultados negativos RESULTADO POSITIVO Los valores gt 80 pg mL se interpretan como positivos Un resultado positivo significa que se detectaron 1 gt 3 f D Glucanos Un resultado positivo no define la presencia de una enfermedad y se debe utilizar en conjunci n con otros criterios cl nicos para establecer un diagn stico RESULTADO INDETERMINADO Los valores de 60 a 79 pg mL indican una posible infecci n f ngica Se recomienda un muestreo y pruebas adicionales de los sueros El muestreo y las pruebas frecuentes mejoran la utilidad para el diagn stico CONTROL DE CALIDAD e El coeficiente de correlaci n r de la curva est ndar lineal vs lineal debe ser gt 0 980 e Los pocillos 25 uL de RGW son los controles negativos Los controles negativos deben tener valores reales del ndice de densidad ptica Vimedio inferiores al 50 del est ndar m s bajo Si no el ensayo se debe repetir usando todos los reactivos nuevos e Manipular las muestras problem ticas Si el analista observa cin ticas de densidad ptica inusuales en un test de una muestra borrosa con una coloraci n anormal o turbia como las que est n extremadamente hemolizadas lip micas o que contienen un exceso de bilirrubina la muestra se debe diluir en RGW y se debe volver a analizar La diluci n debe ser incluida en el informe de resultados multiplicando el resultad
3. Inf Dis 41 299 305 REFERENCIAS ADICIONALES NO MENCIONADAS A Desmet S Van Wijngaerden E Maertens J Verhaegen J Verbeken E De Munter P Meersseman W Van Meensel B Van Eldere J Lagrou K 2009 Serum 1 gt 3 8 D glucan as a diagnostic tool for Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with HIV infection or hematological malignancy J Clin Microbiol 47 3871 3874 b Koo S Bryar J M Page J H Baden L R Marty F M 2009 Diagnostic performance of the 1 3 B D glucan assay for invasive fungal disease Clin Infect Dis 49 1650 9 c Ellis M Ramadi B Finkelman M Hedstrom U Kristenson J Ali Zadeh H and Klingspor L 2007 Assessment of the clinical utility of serial B D glucan concentrations in patients with persistent neutropenic fever J Med Microbiol 57 287 95 d Marty F M Lowry C M Lempitski S J Kubiak D W Finkelman M A and Baden L R 2006 Reactivity of 1 gt 3 f D glucan assay with commonly used intravenous antimicrobials Antimicrob Agents Chemo 50 3450 3453 e Marty F M Koo S Bryar and J and Baden L R 2007 1 gt 3 B D glucan assay positivity in patients with Pneumocystis carinii jiroveci pneumonia Ann Int Med 147 70 72 f Obayashi T Yoshida M Tamura H Aketagawa J Tanaka S and Kawai T 1992 Determination of plasma 1 gt 3 B D glucan A new diagnostic aid to deep mycosis J Medical and Vet Mycol 30 275 280 g Ta
4. de infecci n f ngica Se recomienda una frecuencia de muestreo de al menos dos a tres veces por semana para los pacientes de riesgo 4 Se han encontrado resultados positivos en pacientes en hemodi lisis 18 19 sujetos tratados con ciertos hemoderivados fraccionados como la alb mina s rica y las inmunoglobulinas 23 y en muestras o sujetos expuestos a gasas que contienen glucanos Los pacientes necesitan 3 4 d as para el restablecimiento de los niveles iniciales de 1 gt 3 P D Glucanos en suero despu s de la exposici n quir rgica a esponjas y gasas que contengan 1 gt 3 P D Glucanos 20 21 En consecuencia se debe tomar esto en cuenta en el desarrollo cronol gico del muestreo de los pacientes quir rgicos 5 Las muestras obtenidas por m todos de punci n en el tal n o en el dedo no son aceptables ya que se ha demostrado que la gasa empapada en alcohol usada para preparar la zona y potencialmente la acumulaci n de sangre en la superficie de la piel contamina las muestras 6 Los niveles de las pruebas se fijaron en los sujetos adultos Los niveles pedi tricos normales se aproximan a los de los adultos 24 No se tienen datos de los reci n nacidos y los beb s menores de seis meses 7 El rango reportable del ensayo es 31 pg mL a 500 pg mL Los valores inferiores a 31 pg mL se deben notificar como lt 31 pg mL Los valores gt 500 pg mL se deben notificar como gt 500 pg mL a menos que se haya diluido la muestra
5. n rigurosa a la t cnica y al entorno de pruebas Una formaci n rigurosa del t cnico en el m todo de ensayo y en evitar la contaminaci n es fundamental para la eficacia del ensayo 1 Algunas especies f ngicas producen niveles muy bajos de 1 gt 3 P D Glucanos y normalmente no son detectados por el ensayo Fungitell Estas especies incluyen el g nero Cryptococcus 3 4 as como los Zygomycetes como Absidia Mucor y Rhizopus 1 4 Adem s Blastomyces dermatididis en su forma levaduriforme produce niveles bajos de 1 gt 3 f D Glucanos y por lo tanto no suele ser detectado por el ensayo Fungitell 5 2 No pipetear ning n material con la boca No fumar comer o beber en reas donde se manipulen muestras o reactivos del kit 3 Establecer un entorno limpio donde se realizar el ensayo Usar materiales y reactivos que est n certificados como libres de 1 gt 3 f D Glucanos interferentes Hay que tener en cuenta que los glucanos provenientes de la contaminaci n f ngica del cuerpo humano ropa recipientes agua y polvo del aire pueden provocar interferencia en el ensayo Fungitell 4 No usar reactivos despu s de la fecha de expiraci n 5 Las muestras turbias o con una coloraci n anormal como las que est n extremadamente hemolizadas lip micas o que contienen un exceso de bilirrubina pueden provocar interfe rencias Si se analizan los resultados de las pruebas se deben examinar para determinar si hay signos de interfe
6. 4 Iwanaga S Miyata T Tokunaga F and Muta T 1992 Molecular mechanism of hemolymph clotting system in Limulus Thrombosis Res 68 1 32 15 Tanaka S Aketagawa J Takahashi S Tsumuraya Y and Hashimoto Y 1991 Activation of a Limulus coagulation factor G by 13 B D glucans Carbohydrate Res 218 167 174 16 Saito H Yoshioka Y Uehara N Aketagawa J Tanaka S and Shibata Y 1991 Relationship between conformation and biological response for 1 gt 3 8 D glucans in the activation of coagulation factor G from Limulus amebocyte lysate and host mediated antitumor activity Demonstration of single helix conformation as a stimulant Carbohydrate Res 217 181 190 17 Aketagawa J Tanaka S Tamura H Shibata Y and Saito H 1993 Activation of Limulus coagulation factor G by several 1 gt 3 8 D glucans Comparison of the potency of glucans with identical degree of polymerization but different conformations J Biochem 113 683 686 18 Kanda H Kubo K Hamasaki K Kanda Y Nakao A Kitamura T Fujita T Yamamoto K and Mimura T 2001 Influence of various hemodialysis membranes on the plasma 1 gt 3 8 D glucan level Kidney International 60 319 323 19 Kato A Takita T Furuhashi M Takahashi T Maruyama Y and Hishida A 2001 Elevation of blood 1 gt 3 8 D glucan concentrations in hemodialysis patients Nephron 89 15 19 20 Kanamori H Kanemitsu K Miyasaka T Ameku K End
7. C activado 1 gt 3 B D Glucano A KON Factor G Factor B activado N Enzima procoagulante lt DA Enzima coagulante Factor B Factor G activado Ruta inactivada l Boc Leu Gli Arg ApN lt Boc Leu Gli Arg ApN Sustrato artificial MATERIALES FACILITADOS CON EL KIT FUNGITELL El kit Fungitell es para el uso diagn stico in vitro Los siguientes materiales facilitados con cada kit son suficientes para analizar 110 pocillos en dos micro placas 55 pocillos en cada una 1 Reactivo Fungitell un LAL liofilizado espec fico para 1 gt 3 f D Glucanos dos viales 2 Disoluci n amortiguadora Pyrosol Tris HCl 0 2 M pH 7 4 dos viales Los viales adicionales de disoluci n amortiguadora Pyrosol c digo de cat lago BC051 se pueden adquirir por separado 3 Est ndar de glucanos paquimano liofilizado y relleno inerte con el contenido de 1 gt 3 P D Glucanos indicado en la etiqueta dos viales 4 Reagent Grade Water RGW Agua libre de 1 gt 3 f D Glucanos detectables dos botellas 5 Pyroplates microplacas no revestidas de fondo plano con 96 pocillos con cubiertas libres de glucanos interferentes dos 6 KCI 1 2 M un vial 7 KOH 0 25 M un vial Todos estos materiales a excepci n del est ndar est n libres de niveles interferentes de 1 gt 3 P D Glucanos MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS Todos los materiales deben estar libres de glucanos interferentes Los materiales de cristal deben secarse med
8. Ensayo para 1 gt 3 B D Glucanos en suero NINTENDO A Manual de instrucciones ASSOCIATES OF Tel fono 1 508 540 3444 A N mero gratuito 1 888 395 2221 A CAPE COD Fax 1 508 540 8680 42 INCORPORATED Asistencia t cnica 1 800 848 3248 Atenci n al cliente 1 800 525 8378 124 Bernard E Saint Jean Drive E Falmouth MA 02536 USA Revisado febrero de 2011 PNOO01268 es Vers 1 APLICACI N El ensayo Fungitell es un ensayo colorim trico basado en zim genos de proteasas para la detecci n cualitativa de 1 gt 3 P D Glucanos en el suero de pacientes con s ntomas o enfermedades que predispongan al paciente a una infecci n f ngica invasiva La concentraci n s rica de 1 gt 3 P D Glucanos uno de los principales componentes de la pared celular de varios hongos 1 considerados importantes desde el punto de vista m dico se puede utilizar como una ayuda en el diagn stico de las micosis y las fungemias 2 muy arraigadas Un resultado positivo no indicar a qu clase de hongos podr an estar causando la infecci n Fungitell se debe usar en conjunci n con otros procedimientos de diagn stico como cultivos microbiol gicos examen histol gico de muestras de biopsia y exploraci n radiol gica Importante Se recomienda facilitar esta informaci n al m dico solicitante El ensayo Fungitell no detecta ciertas especies f ngicas como el g nero Cryptococcus que produce niveles muy bajos de 1 gt 3 B D Glucano
9. SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN Las siguientes condiciones de las muestras pueden afectar al resultado de un ensayo preciso de Fungitell e Hem lisis e Turbidez de la muestra causada por lipemia e La presencia de bilirrubina evidente a simple vista e Suero turbio VALORES ESPERADOS Los valores de beta glucanos son elevados en una variedad de infecciones f ngicas Cuando los signos y los s ntomas est n presentes en el nivel de 80 pg mL o superior el valor predictivo que indica que el sujeto da positivo para una infecci n f ngica var a de 74 4 a 91 7 Tabla 2 En ausencia de signos y s ntomas inferiores a 60 pg mL los valores predictivos negativos variaban de 65 1 a 85 1 CARACTER STICAS DEL PROCEDIMIENTO Pruebas de comparaci n Se realiz un estudio prospectivo multic ntrico para validar las caracter sticas del procedimiento del ensayo Fungitell 25 La prueba se compar con otros m todos est ndar de detecci n es decir hemocultivo examen histopatol gico de la muestra de la biopsia y signos radiol gicos para micosis y fungemias Se analizaron trescientos cincuenta y nueve 359 sujetos en el ensayo Se obtuvo una sola muestra de cada sujeto Los sujetos de bajo riesgo inclu an a los individuos aparentemente sanos y a aquellos de los centros cl nicos que fueron ingresados en los hospitales por otros motivos distintos de las infecciones f ngicas La inscripci n de sujetos se realiz en seis centros cl nicos de Es
10. aron positivos en el ensayo TRATAMIENTO ANTIF NGICO La presencia o la ausencia de tratamiento antif ngico no tuvo ning n efecto estad sticamente significativo en la sensibilidad del ensayo 118 sujetos resultaron positivos para la infecci n f ngica invasiva y recib an tratamiento antif ngico 82 resultaron positivos en el ensayo sensibilidad 69 5 61 2 77 8 CI Adem s veinticuatro 24 sujetos dieron positivo pero no recib an ning n tratamiento antif ngico 18 resultaron positivos en el ensayo sensibilidad 75 57 7 92 3 CD ESPECIFICIDAD Un total de 170 sujetos dieron negativo para la infecci n f ngica y aparentemente eran individuos sanos La especificidad fue del 86 5 con el ensayo 82 8 90 1 CT Cuando los 26 sujetos adicionales que dieron negativo para la infecci n f ngica pero con otros trastornos fueron incluidos se observ una especificidad del 81 1 77 1 85 2 CI CORRELACIONES DE LAS PRUEBAS Cuatro de los centros cl nicos analizaron un total de 285 muestras Los resultados de las pruebas de los centros estaban correlacionados cuantitativamente en el 96 4 con los resultados de Cape Cod Las correlaciones de Associates of Cape Cod con los diferentes centros de pruebas variaron de 90 6 a 99 2 PRECISI N En los Estudios de Precisi n diez 10 muestras diferentes fueron analizadas por tres centros de pruebas en tres d as diferentes La variaci n intraensayo vari de 0 9 a 28 9 L
11. cl nicos 285 muestras se comparan con el diagn stico cl nico la sensibilidad es de 64 3 58 8 69 9 CI para ACC y de 61 5 55 9 67 2 CI para los centros La especificidad es de 86 6 82 7 90 6 CI para ACC versus 79 6 74 9 84 3 CI para los centros Tabla 2 Tabla 2 Resultados de los centros de pruebas en el nivel de corte de 60 80 pg mL por centro Comprobado Probable Especificidad Sensibilidad gt 80pg mL lt 60pg mL g E Centro 5 3 o E o Total o 3 o 00 Z Zo gt E 32 Su e llos pea da o le E 233 Y gt lagal By an AN gt EA Z El gt as as 1 32 50 64 0 74 4 28 40 70 0 65 1 4 90 2 12 24 50 0 75 0 15 20 75 0 65 2 5 44 3 4 22 33 66 7 91 7 40 43 93 0 85 1 5 76 5 22 36 61 1 78 6 30 39 76 9 75 0 7 75 6 x Total 88 143 61 5 79 3 113 142 79 6 73 9 21 285 Centros ACC 92 143 64 3 91 1 123 142 86 6 74 1 18 285 No es un centro de pruebas CANDIDIASIS Hubo 107 sujetos a los que se les diagnostic candidiasis en el estudio prospectivo 83 de los 107 resultaron positivos en el ensayo Fungitell Se facilitaron ciento setenta y cinco 175 muestras de archivo de candidiasis a Associates of Cape Cod 145 de las 175 resultaron positivos en el ensayo ASPERGILOSIS Un total de 10 sujetos dieron positivo para aspergilosis 8 de los 10 resultaron positivos en el ensayo FUSARIOSIS Tres sujetos dieron positivo para fusariosis 2 de los 3 result
12. e tener lugar durante 5 10 segundos antes del inicio de la lectura La configuraci n del ajuste de la curva debe ser lineal lineal o equivalente La lectura debe comenzar sin ning n tiempo de demora 1 Preparaci n del est ndar de glucanos facilitado en el kit a Disolver un vial del est ndar de glucanos con el volumen de RGW que se indica en el vial para hacer una soluci n de 100 pg mL Mezclar en v rtex durante al menos 30 segundos para volver a suspender soluci n 1 La soluci n de glucanos debe conservarse a 2 8 C y usarse dentro de los tres d as posteriores Los pasos b e que se detallan a continuaci n ilustran un ejemplo de un esquema de preparaci n de la curva est ndar b Preparar el est ndar de 50 pg mL mezclando 500 uL de RGW y 500 uL de la soluci n 1 en un tubo libre de glucanos soluci n 2 Mezclar en v rtex durante al menos 10 segundos c Preparar el est ndar de 25 pg mL mezclando 500 uL de RGW y 500 uL de la soluci n 2 en un tubo libre de glucanos soluci n 3 Mezclar en v rtex durante al menos 10 segundos d Preparar el est ndar de 12 5 pg mL mezclando 500 uL de RGW y 500 uL de la soluci n 3 en un tubo libre de glucanos soluci n 4 Mezclar en v rtex durante al menos 10 segundos e Preparar el est ndar de 6 25 pg mL mezclando 500 uL de RGW y 500 uL de la soluci n 4 en un tubo libre de glucanos soluci n 5 Mezclar en v rtex durante al menos 10 segundos 2 Preparaci n del react
13. el lector de microplacas se puede utilizar un agitador de microplacas externo c Recopilar los datos y analizar del siguiente modo examinar los trazos de densidad ptica de las muestras de prueba y comprobar los patrones de se ales cin ticas diferentes al aumento de suavidad comparables a los de los est ndares Invalidar los trazos que indican interferencias pticas Calcular la tasa media del cambio de la densidad ptica unidades de miliabsorbancia por minuto para todos los puntos entre 0 y 40 minutos mo aao INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Los resultados del test Fungitell se deben usar como ayuda en el diagn stico de infecciones f ngicas invasivas Los resultados se expresan an pg mL de suero y rango desde no detectable lt 31 pg mL a gt 500 pg mL y son imprimidos por el software o le dos desde la curva est ndar Los valores exactos por encima de 500 pg mL requieren que la muestra se diluya en RGW y que se vuelva a analizar El laboratorio que realice la prueba debe informar al m dico solicitante de que el test Fungitell no detecta ciertas especies f ngicas como el g nero Cryptococcus 3 4 que produce niveles muy bajos de 1 gt 3 f D Glucanos El ensayo tampoco detecta los Zygomycetes como Absidia Mucor y Rhizopus 1 4 que no se tiene constancia de que produzcan 1 gt 3 f D Glucanos Asimismo Blastomyces dermatitidis en su fase levaduriforme produce poco 1 gt 3 P D Glucanos y normalmente son indetectable 5
14. ens evolving challenges to immunocompromised patients for the twenty first century Transpl Infectious Dis 1999 1 247 261 7 Fishman J A Rubin R H Infection in organ transplant recipients New England Journal of Medicine 1998 338 1741 1751 8 Obayashi T Yoshida M Mori T Goto H Yasuoka A Iwasaki H Teshima H Kohno S Horichi A Ito A Yamaguchi H Shimada K and Kawai T 1995 Plasma 1 gt 3 B D glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes Lancet 345 17 20 9 Fridkin S K and Jarvis W R 1996 Epidemiology of nosocomial fungal infections Clin Micro Rev 9 499 511 10 Alexander B Diagnosis of fungal infection new technologies for the mycology laboratory Transpl Infectious Dis 2002 4 Suppl 3 32 37 11 Lass Florl C 2009 The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe Mycoses 52 197 205 12 Nucci M and Anaissie E 2009 Fungal infections in hematopoietic stem cell transplantation and solid organ transplantation Focus on aspergillosis Clin Chest Med 30 295 306 13 Odabasi Z Mattiuzzi G Estey E Kantarijian H Saeki F Ridge R Ketchum P Finkelman M Rex J and Ostrosky Zeichner L 2004 B Glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections Validation cut off development and performance in patients with Acute Myelogenous Leukemia and Myelodysplastic Syndrome CID 39 199 205 1
15. iante un proceso de despirogenizaci n a calor seco por lo menos a 235 C durante 7 horas o un equivalente validado para que puedan considerarse adecuados para el uso Puntas de pipeta 250 uL N de cat PPT25 1000 uL N de cat PPT10 Pipeta capaz de dispensar vol menes de 5 25 uL y de 100 1000 uL Pipeta de repetici n con puntas de jeringa capaz de dispensar 100 uL Tubos de ensayo para la preparaci n de la serie est ndar y combinar reactivos del tratamiento del suero Vidrio de borosilicato de 13 x 100 mm N de cat TB013 5 Lector de placas de incubaci n 37 C capaz de monitoriar la longitud de onda dual a 405 y 490 nm con una gama din mica de hasta al menos 2 0 Unidades de Absorbancia relacionado con un software apropiado para ensayos cin ticos por computador 6 Tubos de diluci n con tapa de rosca est riles y libres de glucanos para dividir las muestras en al cuotas la mayor a de los tubos que est n certificados como libres de pir genos ARNasa y ADNasa est n libres de 1 gt 3 P D Glucanos interferentes 7 Parafilm Estos productos proporcionados por Associates of Cape Cod Inc ACC est n certificados como libres de glucanos interferentes Advertencia las pipetas de vidrio con tapones de algod n son una fuente potencial de contaminaci n por glucanos e A a ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Este producto es para el USO DIAGN STICO IN VITRO El ensayo Fungitell exige una atenci
16. ivo del pretratamiento del suero El reactivo alcalino del pretra tamiento del suero convierte los glucanos de triple h lice en glucanos de hebra simple 16 17 que son m s reactivos en el ensayo El pH elevado tambi n inactiva las ser n proteasas y los inhibidores de ser n proteasas en suero lo que puede dar un resultado falso positivo y falso negativo respectivamente 22 a Preparar el reactivo del pretratamiento del suero combinando vol menes iguales de 0 25 M KOH y 1 2 M KCI y mezclando bien en v rtex Los vol menes recomendados son de hasta 900 uL de cada reactivo permitiendo dos preparaciones Cubrir los viales con Parafilm para el uso con la segunda placa Cubrir el vial con Parafilm usando el lado del Parafilm que estaba orientado hacia el papel i Nota al trazar la curva est ndar multiplicar la concentraci n de los est ndares por cinco de manera que el intervalo sea de 500 hasta 31 pg mL Introduzca los est ndares en las configuraciones del software como 500 250 125 62 5 y 31 pg mL respectivamente El volumen del est ndar en el ensayo es 25 uL por pocillo o cinco veces el volumen de la muestra de suero La micro placa con los est ndares est controles negativos neg y 21 desconocidos dsc cada uno analizado por duplicado est configurada como sigue Dsc13 Dsc16 Dsc13 Dsc16 Dsc14 Dsc17 Dsc14 Dsc17 Dsc15 Dsc18 A B C D E F G Dsc15 Dsc18
17. l usando la pipeta de 1000 uL Cubrir el vial con Parafilm usando el lado del Parafilm Mezclar cuidadosamente el vial para disolver por completo no mezclar en v rtex 5 Adici n de controles negativos y est ndares de glucanos Al final de la incubaci n del pretratamiento del suero paso 3 d retirar la placa del lector de placas de incubaci n y a adir los est ndares y controles negativos a la placa A adir 25 uL de RGW a los pocillos G2 y G3 A adir 25 uL de la soluci n est ndar 5 de 6 25 pg mL a los pocillos F2 y F3 A adir 25 uL de la soluci n est ndar 4 de 12 5 pg mL a los pocillos E2 y E3 A adir 25 uL de la soluci n est ndar 3 de 25 pg mL a los pocillos D2 y D3 A adir 25 uL de la soluci n est ndar 2 de 50 pg mL a los pocillos C2 y C3 A adir 25 uL de la soluci n est ndar 1 de 100 pg mL a los pocillos B2 y B3 6 Adici n del reactivo Fungitell y procedimiento de incubaci n de la placa a A adir 100 uL del reactivo Fungitell a cada pocillo con controles negativos est ndares y muestras usando la pipeta de repetici n b Insertar la placa en el lector de microplacas calibrado a 37 C con la tapa puesta y agitarlo durante 5 10 segundos Realizar la lectura de la placa sin la tapa a 405 nm menos 490 nm durante 40 minutos a 37 C Si la sustracci n de fondo a 490 nm no est disponible es aceptable realizar la lectura a 405 nm Si no hay disponible una funci n de agitaci n de placas con
18. mura H Arimoto Y Tanaka S Yoshida M Obayashi T and Kawai T 1994 Automated kinetic assay for endotoxin and 1 gt 3 8 D glucan in human blood Clinica Chimica Acta 226 109 112 h Yasuoka A Tachikawa N Shimada K Kimura S and Oka S 1996 1 gt 3 B D glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia Clinical and Diagnostic Lab Immuno 3 197 199 i Yoshida M Obayashi T Iwama A Ito M Tsunoda S Suzuki T Muroi K Ohta M Sakamoto S and Miura Y 1997 Detection of plasma 1 gt 3 8 D glucan in patients with Fusarium Trichosporon Saccharomyces and Acremonium fungaemias J Med Vet Mycology 35 371 374 j Yuasa K Goto H Iguchi M Okamura T and Ieki R 1996 Evaluation of the diagnostic value of the measurement of 1 gt 3 f D glucan in patients with pulmonary aspergillosis Respiration 63 78 83 LEYENDA DE LOS S MBOLOS Utilizar antes de Contenido suficiente para lt n gt ensayos z lt DI LOT C digo de lote Dispositivo m dico para diagn stico in vitro REF N de cat logo L mite de temperatura Fabricante Consulte las instrucciones de uso Representante autorizado Aa Marcado CE Associates of Cape Cod International Inc Deacon Park Moorgate Road Knowsley Liverpool L33 7RX Reino Unido
19. o S Aoyagi T Inden K Hatta M Yamamoto N Kunishima H Yano H Kaku K Hirakat Y and Kaku M 2009 Measurement of 1 gt 3 8 D glucan derived from different gauze types Tohoku J Exp Med 217 117 121 21 Mohr J Paetznick V Rodriguez J Finkelman M Cocanour C Rex J and Ostrosky Zeichner L 2005 A prospective pilot survey of B glucan BG seropositivity and its relationship to invasive candidiasis IC in the surgical ICU SICU ICAAC Poster M 168 22 Tamura H Arimoto Y Tanaka S Yoshida M Obayashi T and Kawai T 1994 Automated kinetic assay for endotoxin and 1 gt 3 8 D glucan in human blood Clin Chim Acta 226 109 112 23 Ogawa M Hori H Niiguchi S Azuma E and Komada Y 2004 False positive plasma 1 gt 3 f3 D glucan following immunoglobulin product replacement in adult bone marrow recipient Int J Hematol 80 97 98 24 Smith P B Benjamin D K Alexander B D Johnson M D Finkelman M A and Steinbach W J 2007 1 gt 3 B D glucan levels in pediatric patients Preliminary data for the use of the beta glucan test in children Clin Vaccine Immunol 14 924 925 25 Ostrosky Zeichner L Alexander B D Kett D H Vazquez J Pappas P G Saeki F Ketchum P A Wingard J Schiff R Tamura H Finkelman M A Rex J H 2005 Multicenter clinical evaluation of the 1 gt 3 B D glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans Clin
20. o por el factor de diluci n Generalmente el factor de diluci n se introduce en la configuraci n del software para la muestra y la correcci n se aplica autom ticamente e Las muestras de control en los niveles de corte y altamente positivos pueden ser ensayados para verificar que los reactivos y el ensayo est n funcionando correctamente Cada usuario de la prueba debe fijar un programa de control de calidad para garantizar la competencia en la realizaci n de la prueba LIMITACIONES DE LA PRUEBA 1 Las localizaciones del tejido de infecci n f ngica 10 encapsulaci n y la cantidad de 1 gt 3 f D Glucanos producida por ciertos hongos puede afectar a la concentraci n s rica de este an lito La disminuci n de la capacidad de aportar 1g3 P D Glucanos a la circulaci n sangu nea puede reducir la capacidad de detectar ciertas infecciones f ngicas Los Cryptococcus spp producen bajos niveles de 1 3 B D Glucanos 3 4 No se tiene constancia de que los Zygomycetes incluidos Absidia spp Mucor spp y Rhizopus spp 1 4 produzcan 1 gt 3 P D Glucanos Blastomyces dermatitidis en su fase levaduriforme produce poco 1 gt 3 B D Glucanos y los resultados de la prueba suelen ser negativos 5 2 Algunos individuos tienen niveles elevados de 1 gt 3 f D Glucanos que entran en la zona indeterminada En tales casos se recomienda realizar una prueba adicional 3 La frecuencia de las pruebas del paciente depender del riesgo relativo
21. os pat genos f ngicos oportunistas incluyen Candida spp y Aspergillus spp Fusarium spp Trichosporon spp Saccharomyces cerevisiae Acremonium spp Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Sporothrix schenckii y Pneumocystis jirovecii Los 1 gt 3 B D Glucanos producidos por stos y otros organismos se pueden detectar mediante el ensayo Fungitell 1 8 13 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO El ensayo Fungitell mide los niveles de 1 gt 3 P D Glucanos El ensayo se basa en una modificaci n de la ruta del lisado de amebocitos de Limulus LAL 14 15 16 17 Figura 1 El reactivo Fungitell se modifica para eliminar el Factor C y de este modo reaccionar s lo los 1 gt 3 B D Glucanos a trav s del lado de la ruta mediada por el Factor G Los 1 gt 3 B D Glucanos activan el Factor G un zim geno de ser n proteasa El Factor G activado convierte la enzima procoagulante inactiva en la enzima coagulante activa que a su vez divide el ApN del sustrato p ptido cromog nico Boc Leu Gli Arg ApN creando un crom foro que absorbe a 405 nm El ensayo cin tico Fungitell descrito abajo se basa en la determinaci n de la tasa de aumento de la densidad ptica aportada por una muestra Esta tasa se interpreta en relaci n con una curva est ndar para producir c lculos aproximados de la concentraci n de 1 gt 3 P D Glucanos en la muestra FIGURA 1 Ruta del lisado de amebocitos de Limulus Endotoxina LPS Factor co MA Factor
22. os valores del interensayo variaron de 3 9 a 23 8 Las cuatro 4 muestras negativas fueron excluidas de ambos an lisis REFERENCIAS 1 Odabasi Z Paetznick V Rodriguez J Chen E McGinnis M and Ostrosky Zeichner L 2006 Differences in beta glucan levels of culture supernatants of a variety of fungi Medical Mycology 44 267 272 2 De Pauw B Walsh T J Donnelly J P et al 2008 Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institutes of Allergy and Infeectious disease Mycosis Study Group EORTC MSG Concensus Group Clin Inf Dis 46 1813 1821 3 Miyazaki T Kohno S Mitutake K Maesaki S Tanaka K I Ishikawa N and Hara K 1995 Plasma 1 gt 3 B D glucan and fungal antigenemia in patients with candidemia aspergillosis and cryptococcosis J Clinical Microbiol 33 3115 3118 4 Mitsuya M Wada K and Yamaguchi H 1994 In vitro studies on the release of G Test positive 1 gt 3 f D glucans from various fungal pathogens In Committee on Organic Dusts ICOH Report 1 94 Rylander R and Goto H editors pp 29 37 5 Girouard G Lachance C and Pelletier R 2007 Observations of 1 gt 3 8B D glucan detection as a diagnostic tool in endemic mycosis caused by Histoplasma or Blastomyces J Med Mycology 56 1001 1002 6 Walsh T J Groll A H Emerging fungal pathog
23. rencia ptica y o patrones de se ales cin ticas poco usuales 6 Utilizar ropa protectora adecuada y guantes libres de polvo al manipular muestras de pacientes 7 El suero de los pacientes en hemodi lisis puede contener niveles elevados de 1 gt 3 P D Glucanos cuando se utilizan ciertas membranas de celulosa para di lisis 18 19 La hemodi lisis con membranas de triacetato de celulosa o membranas de polimetilmetacrilato no parece afectar al ensayo 8 Las esponjas y las gasas quir rgicas pueden filtrar niveles elevados de 1 gt 3 B D Glucanos que pueden contribuir a un resultado positivo transitorio basado en la contaminaci n del ensayo Fungitell tal como se ha observado en pacientes posquir rgicos 0 21 9 No se deben usar los kits con contenidos da ados 10 Los materiales expuestos a fluidos que contienen pat genos potencialmente contaminados se deben desechar de una forma acorde a las normativas regulatorias locales Conservaci n de los reactivos Guardar todos los reactivos tal como se suministran de 2 8 C en un lugar oscuro El reactivo Fungitell reconstituido se debe conservar a 2 8 C y se debe utilizar dentro de 2 horas despues de su reconstituci n De forma alternativa el reactivo Fungitell reconstituido puede congelarse a 20 C durante un m ximo de 20 d as descongelarse una vez y utilizarse Manipular las muestras 1 Obtenci n de muestras las muestras de suero se deben recoger en tubos est riles al
24. s 3 4 El ensayo tampoco detecta los Zygomycetes como Absidia Mucor y Rhizopus 1 4 debido a que no se tiene constancia de que produzcan 1 gt 3 f D Glucanos Adem s la fase levaduriforme de Blastomyces dermatitidis produce pocos 1 gt 3 P D Glucanos y no pueden ser detectados por el ensayo 5 Incluir esta declaraci n al notificar los resultados de las pruebas del ensayo de Glucano SUMARIO Y EXPLICACI N Existe un aumento en la incidencia de infecciones f ngicas por pat genos oportunistas especialmente en pacientes inmunodeprimidos 6 7 8 Las infecciones f ngicas invasivas como infecciones oportunistas son habituales entre los pacientes con c ncer hematol gico y con SIDA y dan cuenta de un creciente n mero de infecciones nosocomiales especialmente entre los receptores de trasplantes de rganos y otros pacientes que reciben tratamientos inmuno supresores 9 10 Muchas infecciones f ngicas se adquieren inhalando esporas f ngicas que surgen de la tierra de detritus de plantas de sistemas de aire acondicionado y o de superficies expuestas Algunos hongos oportunistas est n presentes en la piel humana el tracto intestinal y en las membranas mucosas 11 12 El diagn stico de las micosis y fungemias invasivas se basa normalmente en un diagn stico no espec fico o en t cnicas radiol gicas Recientemente se han a adido marcadores biol gicos de infecciones f ngicas a los m todos de diagn stico disponibles 2 L
25. tados Unidos Cuatro de los centros cl nicos realizaron el ensayo y analizaron un total de 285 muestras ACC analiz las 359 muestras dos veces pero s lo utiliz el segundo grupo de resultados para determinar los resultados del ensayo Los resultados del segundo grupo de an lisis no fueron estad sticamente diferentes del primer grupo La sensibilidad de la poblaci n total de sujetos 359 incluido Cryptococcus fue de 65 0 60 1 70 0 Intervalo de Confianza ClD La especificidad fue de 81 1 77 1 85 2 CI Tabla 1 Los resultados de los cuatro centros de pruebas tuvieron un rango de sensibilidad de 50 0 a 66 7 El rango de especificidad vari de 70 0 a 93 0 en las 285 muestras analizadas Tabla 2 Tabla 1 Resultados de las pruebas de ACC en el nivel de corte de 60 80 pg mL por centro Comprobado Probable Especificidad Sensibilidad gt 80pg mL lt 60pg mL g 3 Centro E a 5 o Total o o y 5 o 0 4 F ze 2 B ay 2 lseB3l Z A E 5 3 28 2 T PY EY A N gt AA Z El gt Pas as 1 32 50 64 0 97 0 39 40 97 5 69 6 1 90 2 14 24 58 3 93 3 17 20 85 0 70 8 5 44 3 14 19 73 7 46 7 36 54 66 7 90 0 3 73 4 25 33 75 8 92 6 37 43 86 0 86 0 6 76 5 21 36 58 3 80 8 30 39 76 9 69 8 6 75 6 0 1 0 0 N D 0 0 N D 0 0 0 1 Total 106 163 65 0 80 9 159 196 81 1 76 8 21 359 Incluye una muestra del Centro 6 Cuando los resultados obtenidos por ACC 359 muestras y por los centros
26. vac o tapones rojos o tubos separadores de suero SST y dejar que se coagulen Entonces el suero se separa del co gulo y se decanta en un recipiente apropiado que est libre de 1 gt 3 P D Glucanos interferentes 2 Conservaci n de muestras las muestras de suero se pueden conservar a 2 8 C antes del ensayo o congelar a temperaturas de 20 C o mayores La prueba se debe realizar cuanto antes para evitar la posibilidad de que se degrade la muestra 3 Etiquetado de muestras las muestras se deben etiquetar claramente de acuerdo con las pr cticas autorizadas de la instituci n PROCEDIMIENTO Nota las configuraciones pueden variar con los diferentes instrumentos y software En general se aplicar lo siguiente configurar el software del lector de placas para recopilar datos en el modo Vmedio Comprobar las configuraciones apropiadas en el manual de software para garantizar que el valor calculado sea la tasa media del cambio de la densidad ptica para todos los puntos de datos recopilados Ajuste el intervalo entre las lecturas del instrumento al m nimo permitido por el software y el instrumento por encima del periodo de 40 minutos de la prueba Las configuraciones de la longitud de onda del software deben ser de 405 nm menos la se al de fondo de 490 nm Si la lectura de la longitud de onda dual no est disponible realizar la lectura a 405 nm La temperatura de incubaci n se debe establecer a 37 C La agitaci n de placas deb
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