ENFERMEDAD DE LA CABEZA AMARILLA
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1. 3 15 SPANN K M COWLEY J A WALKER P J amp LESTER R J G 1998 A yellow head like virus from Penaeus monodon cultured in Australia Dis Aquat Org 31 169 179 SPANN K M DONALDSON R A COWLEY J A amp WALKER P J 2000 Differences in susceptibility of some penaeid prawn species to gill associated virus GAV infection Dis Aquat Org 42 221 225 SPANN K M MCCULLOCH R J COWLEY J A amp WALKER P J 2003 Detection of gill associated virus GAV by a situ hybridisation during acute and chronic infections in Penaeus monodon and Penaeus esculentus shrimp Dis Aquat Org 56 1 10 Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 431 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 29 26 27 28 29 30 31 32 33 SPANN K M VICKERS J E amp LESTER R J G 1995 Lymphoid organ virus of Penaeus monodon from Australia Dis Aquat Org 23 127 134 TANG K F J amp LIGHTNER D V 1999 A yellow head virus gene probe nucleotide sequence and application for n situ hybridization Dis Aquat Org 35 165 173 TANG K F J SPANN K M OWENS L amp LIGHTNER D V 2002 In situ detection of Australian gill associated virus with a yellow head virus gene probe Aquaculture 205 1 5 WALKER P J BONAMI J R BOONSAENG V CHANG P S COWLEY J A ENJUANES L FLEGEL T W LIGHTNER D V LOH P C SNIJDER E J amp TANG K 2004 Ro2. certificados El tercer protocolo consiste en una PCR de transcripci n inversa anidada proporcionada por Wijegoonawardane Cowley amp Walker no publicada Esta prueba se puede utilizar para el detectar virus de la familia cabeza amarilla en gambas sanas Con ella se pueden detectar los seis genotipos conocidos en la actualidad incluidos el YHV y el GAV pero no sirve para establecer diferencias entre genotipos La especificaci n del genotipo se puede lograr mediante an lisis del producto PCR RT en secuencias de nucle tidos Preparaci n de la muestra Con gambas juveniles o adultas para la preparaci n de ARN total se puede usar el rgano linfoide tejido de branquia o hemolinfa siendo preferible un tejido fresco Tambi n son adecuados para la preparaci n de ARN total el rgano linfoide y el tejido de branquia conservados en etanol de grado anal tico al 95 o ARN ater hay varios fabricantes o congelados y guardados a 70 C Se alteran 10 20 mg de rgano linfoide o tejido de branquia o 50 ul de hemolinfa en 500 ul de reactivo Trizol Invitrogen Carlsbad California USA y se extrae ARN total siguiendo el manual de instrucciones del producto Se resuspende ARN en 25 pl de agua tratada con DEPC dietilpirocarbonato se calienta a 55 C durante 10 minutos se enfr a en hielo y se usa de inmediato o se guarda a 70 C hasta que se requiera de nuevo Lo ideal es preparar una diluci n 1 200 ie 2 5 ul de ARN en 500 ul de agua
3. envoltura completos Los precursores de la nucleoc psida son filamentos largos de aproximadamente 15 nm de di metro y longitud variable 80 450 nm que aparecen en el citoplasma a veces densamente api ados en series paracristalinas Los viriones son part culas en forma de bast n y con una envoltura 40 60 nm x 150 200 nm con extremos redondeados y protuberancias destacadas 8 11 nm que se extienden desde la superficie Los viriones suelen encontrarse en el citoplasma de las c lulas infectadas asociadas a las ves culas intracelulares Tambi n pueden observarse viriones que germinan en la membrana citoplasm tica y en los espacios intersticiales Los viriones y las nucleoc psidas del GAV no se distinguen de los del YHV cuando se observan mediante MET ii Aislamiento e identificaci n del agente e Cultivo celular medios artificiales aunque existen m todos primarios de cultivo celular de gambas no se recomiendan para el aislamiento identificaci n del YHV debido al elevado riesgo de contaminaci n por agentes inesperados e Bioensayo el procedimiento del bioensayo se basa en el descrito por Spann ef al 22 pero se han descrito procedimientos similares por otros autores 16 20 30 Se debe emplear el bioensayo con gambas susceptibles v ase la secci n 2 b m s arriba para las que se haya certificado la ausencia de un agente pat geno espec fico y que se hayan recogido en una instalaci n de cr a biosegura De forma alternati
4. hielo y se centrifuga brevemente en un microcentrifuga para recoger el contenido del tubo Para el primer paso de la PCR se a ade 1 ul de CADN a una mezcla de reacci n total de 25 ul que contenga 1 X tamp n Tag 10 mM de Tris HCl pH 9 0 50 mM de KCI 0 1 de Triton X 100 1 5 ul 25 mM de MgCl 0 35 ul de mezcla de cebadores que contenga 25 pmoles ul de cada grupo de cebadores v ase m s adelante YC Flab y YC Rlab 0 5 ul 10 mM de mezcla de dNTP y 0 25 ul 5 U pl de ADN polimerasa Tag Fisher Biotech Se realiza la amplificaci n por PCR mediante desnaturalizaci n a 95 C durante Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 427 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 428 1 minuto seguida de 35 ciclos a 95 C durante 30 segundos 60 C durante 30 segundos 72 C durante 40 segundos y una extensi n final a 72 C durante 7 minutos Para el segundo paso de la PCR se usa 1 ul del primer producto PCR en la mezcla de reacci n tal como se prepar anteriormente pero sustituyendo por los grupos de cebadores YC F2ab y YC R2ab Se realiza la amplificaci n por la PCR mediante desnaturalizaci n a 95 C durante 1 minuto seguida de 35 ciclos a 95 C durante 30 segundos 60 C durante 30 segundos 72 C durante 30 segundos con una extensi n final a 72 C durante 7 minutos Se a ade 8 ul de producto PCR amplificado a geles de agarosa al 2 TAE que contengan 0 5 ug ml de bromuro de etidio a lo largo de una es
5. imposible la interpretaci n Frotis con gambas moribundas por brotes de ECA los frotis de hemolinfa no son tiles porque normalmente los hemocitos est n mermados en las fases avanzadas de la enfermedad Las muestras de hemolinfa deben obtenerse de gambas claramente sanas procedentes de un estanque sospechoso del que tambi n han recogido las gambas moribundas Se descarga la hemolinfa dentro de una jeringa que contenga dos vol menes bien sea de formalina al 25 o de fijaci n de Davidson en la que el cido ac tico de la f rmula ha sido reemplazado por agua o formalina Se mezcla cuidadosamente sin preocuparse por los co gulos de la jeringa se coloca una gota sobre un porta de microscopio se frota y luego se deja que se seque al aire antes de te ir con H amp E o con otro m todo de tinci n est ndar de frotis de sangre Se deshidrata se a ade una gota de l quido de montaje y un cubre Se examina al microscopio de campo claro con lentes de objetivo de x40 Con muestras obtenidas tras un brote de la ECA algunos de los frotis mostrar n cantidades de hemocitos entre moderadas y grandes con n cleos cariorr cticos o pien ticos 19 Es importante que en los portas en que aparecen estos n cleos no se detecte la presencia de bacterias contaminantes dado que las infecciones bacterianas pueden producir cambios similares en los hemocitos Cuando se realiza un diagn stico presuntivo de un brote de ECA pueden usarse los resultados obtenidos
6. of penaeid shrimp samples for virological assay using cDNA probes J Virol Methods 66 227 236 KHONGPRADIT R KASORNCHANDRA J AND BOONYARATALIN S 1995 Susceptibility of the postlarval stages of black tiger shrimp Penaeus monodon to yellow head baculovirus YBV In Diseases in Asian Aquaculture II Shariff M Subasinghe R P and Arthur J R eds Asian Fisheries Society Manilla 6 LIGHTNER D V ED 1996 Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp World Aquaculture Society Baton Rouge USA LIGHTNER D V HASSON K W WHITE B L amp REDMAN R M 1998 Experimental infection of western hemisphere penaeid shrimp with Asian white spot syndrome virus and Asian yellow head virus J Aquat Anim Health 10 271 281 LIMSUWAN C 1991 Handbook for Cultivation of Black Tiger Prawns Tansetakit Bangkok Thailand in Thai LOH P C CESAR E NADALA B JR TAPAY L M amp LU Y 1998 Recent developments in immunologically based and cell culture protocols for the specific detection of shrimp viral pathogens In Advances in Shrimp Biotechnology Flegel T W ed National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Bangkok Thailand 255 259 LONGYANT S SITHIGORNGUL P CHAIVISUTHANGKURA P RUKPRATANPORN Ss SITHIGORNGUL W amp MENASVETA P 2005 Differences in the susceptibility of palaemonid shrimp species to hellow head virus YHV infection Dis Aguat Or
7. por GAV y YHV La sensibilidad de detecci n del segundo paso de la PCR es 1 000 veces mayor que la del primer paso de la PCR y el ARN de GAV o de YHV puede detectarse hasta un l mite de 10 fg de ARN total de rgano linfoide Las secuencias de cebadores para RT PCR gen rica para el GAV y el YHV GY o espec fica para el GAV G o el YHV Y son las siguientes GY1 5 GAC ATC ACT CCA GAC AAC ATC TG 3 GY2 5 CAT CTG TCC AGA AGG CGT CTA TGA 3 GY4 5 GTG AAG TCC ATG TGT GTG AGA CG 3 GY5 5 GAG CTG GAA TTC AGT GAG AGA ACA 3 Y3 5 ACG CTC TGT GAC AAG CAT GAA GTT 3 G6 5 GTA GTA GAG ACG AGT GAC ACC TAT 3 Protocolo 3 PCR anidada RT para la detecci n de todos los genotipos actualmente conocidos del complejo de la cabeza amarilla incluidos el YHV y el GAV Para la s ntesis de cADN se mezcla 2 ul de ARN lo ideal es 1 0 ug de ARN total si se cuantifica 50 ng de hex meros aleatorios como cebadores y 1 0 ul 10 mM de dNTP hasta completar un volumen total de 14 ul en agua tratada con DEPC est ril se incuba a 65 C durante 5 minutos y se enfr a en hielo Se a ade 4 0 ul de tamp n Superscript HI x 5 Invitrogen 1 0 ul 100 mM de DTT 1 0 ul 40 U ul de RNasaOUT Invitrogen y 1 0 ul 200 U ul de transcriptasa inversa Superscript Invitrogen y se mezcla con suavidad Se incuba a 25 C durante 5 minutos y luego a 42 C durante 55 minutos se detiene la reacci n calentando a 70 C durante 15 minutos se enfr a en
8. por frotis de hemolinfa en conjunci n con los obtenidos por tinci n r pida de preparaciones montadas completas v ase m s arriba o de cortes de tejido te idos Cortes fijados se fijan seis gambas moribundas procedentes de un brote sospechoso de ECA con fijador de Davidson y se procesan para preparaci n de cortes de tejido est ndar te idos con H amp E 2 11 Se examinan los cortes con un microscopio de campo claro para buscar cantidades grandes o moderadas de bas filos te idos de forma uniforme inclusiones citoplasm ticas de aproximadamente 2 um de di metro o m s peque as en tejidos de origen mesod rmico o ectod rmico 3 Son muy tiles los tejidos de rganos linfoides del subcut culo estomacal y de las branquias Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla Los esferoides de los rganos linfoides se observan normalmente en las P monodon sanas infectadas cr nicamente con GAV y a menudo se observa necrosis de los rganos linfoides 22 25 Sin embargo la formaci n de esferoides y la degeneraci n del tejido de los rganos linfoides tambi n se produce durante la infecci n con otros virus de las gambas 11 21 e Microscop a electr nica no se aplica c Detecci n del agente y m todos de identificaci n e M todos de detecci n directa i M todos microsc picos e Microscop a electr nica de transmisi n MET los tejido
9. tratada con DEPO y Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 425 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 426 determinar las absorbancias A nm y Agp nm se requiere un espectr metro UV para cuantificar y comprobar la calidad del ARN El producto ARN var a seg n el tipo de tejido y lo fresco que est y seg n la calidad del conservante utilizado y el per odo de conservaci n No obstante el producto aproximado de ARN procedente de tejidos frescos var a entre 0 2 y 2 0 ug ul y los tejidos conservados en alcohol var an aproximadamente entre 0 1 y 1 wg ul En un tanque de cr a que contenga 100 000 6 m s postlarvas PL se muestrean en torno a 1 000 PL en cinco puntos diferentes Se mezclan las muestras en un recipiente se agita suavemente el agua del recipiente y a continuaci n se selecciona una muestra de ensayo de entre las PL vivas del centro del recipiente Se escoge el n mero de la muestra seg n la prevalencia asumida o diana Se homogeneiza la muestra en un volumen adecuado de reactivo Trizol y se extrae el ARN de acuerdo con el manual de instrucciones del producto Con cada juego de muestras de ARN de ensayo deben incluirse agua tratada con DEPC y extractos que contengan ARN de YHV y o ARN de GAV seg n cu l sea pertinente para la prueba como controles positivo y negativo respectivamente Protocolo 1 RT PCR para la detecci n espec fica del YHV en gambas infectadas
10. virus de la enfermedad de la cabeza amarilla La enfermedad afecta normalmente a formas juveniles tempranas y tard as y puede presentarse en forma de cese de la alimentaci n concentraci n de gambas en los bordes del estanque Las gambas moribundas pueden presentar un aspecto blanquecino y una decoloraci n amarillenta del cefalot rax causada por el hepatop ncreas amarillo subyacente La mortalidad puede alcanzar el 100 pero tambi n se dan Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 429 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla infecciones subcl nicas Los criterios de diagn stico confirmativo se presentan resumidos en la secci n 3 del presente cap tulo b Definici n de caso confirmado La enfermedad de la cabeza amarilla puede confirmarse mediante la detecci n de niveles elevados de infecci n propagada por los tejidos de origen ectod rmico y mesod rmico por medio de la hibridaci n n situ conjuntamente con la detecci n de productos amplificados del tama o prescrito utilizando ensayos RT PCR discriminatorios como los descritos en la secci n 3 del presente cap tulo Puesto que en algunas regiones son comunes las infecciones cr nicas de bajo nivel debidas al virus del complejo de la fiebre amarilla la detecci n de la presencia del virus no constituye por s sola una prueba de etiolog a 6 M TODOS DE DIAGNOSTICO DETECCI N PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCI N La PCR de dos pas
11. B GCT V AGC D AGT N AGCT Hibridaci n in situ A continuaci n describimos el protocolo de Tang amp Lightner 26 El m todo es adecuado para la detecci n del YHV o el GAV 27 A fin de conservar el ARN v rico se fijan gambas vivas con fijador de Davidson modificado neutralizado con tampon y sin cido ac tico fijador RF 9 Se procesan las gambas fijadas mediante m todos histol gicos estandarizados y se realizan cortes de 4 um de espesor sobre portaobjetos Superfrost Plus Fisher Scientific Pennsylvania USA Antes de la hibridaci n se incuban los cortes a 65 C durante 45 minutos se retira la parafina con Hemo de Fisher Scientific Pennsylvania USA y se rehidrata con una serie de etanoles y agua Se digieren los cortes en proteinasa K 100 ug ml en 50 mM de Tris HCl pH 7 4 10 mM de NaCl 1 mM de EDTA durante 15 minutos a 37 C y se fija en formaldeh do 0 4 durante 5 minutos Se lava en 2 X SSC citrato salino est ndat a continuaci n se prehibrida con 500 ul de soluci n de prehibridaci n 4 X SSC 50 formamida 1 x soluci n Denhardt 0 25 mg ml de ARN de levadura 0 5 mg ml de ADN de esperma de salm n triturado sulfato de dextrano al 5 a 42 C durante 30 minutos Para la hibridaci n se cubren los cortes con 250 ul de soluci n de hibridaci n que contenga una sonda marcada con digoxigenina 20 40 ng ml a 42 C durante toda la noche Al d a siguiente se lavan los cortes del siguiente modo 2 X SSC u
12. CAP TULO 2 3 3 ENFERMEDAD DE LA CABEZA AMARILLA 1 DEFINICI N DE LA ENFERMEDAD A efectos de este cap tulo se considera que la enfermedad de la cabeza amarilla ECA es una infecci n causada por el virus de la enfermedad de la cabeza amarilla YHV 2 INFORMACI N PARA EL DISE O DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA a Factores del agente e Agente etiol gico y cepas del mismo el virus de la enfermedad de la cabeza amarilla genotipo 1 es uno de los seis genotipos conocidos de virus del complejo de la cabeza amarilla y es el nico agente conocido de la enfermedad de la cabeza amarilla Se designa como genotipo 2 al virus asociado de la branquia GAV El GAV y otros cuatro genotipos conocidos del complejo los genotipos 3 4 5 6 se presentan generalmente en Penaeus monodon sanos del este de frica de Asia y de Australia y o bien no se asocia con la enfermedad o lo hace en raras ocasiones 29 32 El YHV y otros genotipos del complejo de la cabeza amarilla son clasificados por la Comisi n Internacional para la Taxonom a de los Virus como especies nicas del g nero Okavirus de la familia Roniviridae del orden de los Nidovirales 28 Existe evidencia de la existencia de recombinaci n gen tica entre los genotipos 32 e Supervivencia fuera del hospedador el YHV permanece viable por un periodo de hasta 72 horas en aguas marinas oxigenadas 8 Estabilidad del agente el YHV puede inactivarse por calor a 60 C durante 15 min
13. Se mezclan 2 ul de RNA en 20 ul de tamp n PCR 10 mM de Tris HCl pH 8 3 50 mM de KCl que contenga 2 5 U de M MLV virus de la leucemia murina de Moloney transcriptasa inversa 1 0 U de inhibidor de ribonucleasa 0 75 uM de cebador inverso o antisentido 144R que aparece m s adelante 1 mM de cada uno de los cebadores dATP dTTP dCTP y dGTP y 5 mM de MgCl y se incuba a 42 C durante 15 minutos para sintetizar el cADN A continuaci n se incuba la mezcla a 100 C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa y se deja enfriar la mezcla hasta los 5 C Se a ade la mezcla PCR 10 mM de Tris HCl pH 8 3 50 mM de KCl que contiene 2 5 U de ADN polimerasa Tag Perkin Elmer Cetus 2 mM de MgCl y 0 75 uM de cebador sentido o directo 10F m s abajo hasta un volumen final de 100 ul Se recubren los tubos con 100 ul de aceite mineral y se lleva a cabo la amplificaci n por PCR en 40 ciclos a 94 C durante 30 segundos 58 C durante 30 segundos 72 C durante 30 segundos finalizando con 72 C durante 10 minutos Se a aden 20u1 de producto PCR amplificado a geles de agarosa al 2 TAE Tris acetato EDTA cido etilendiaminotetrac tico que contengan 0 5 ug ml de bromuro de etidio a lo largo de una escalera de ADN adecuada y se realiza la detecci n mediante un transiluminador UV La reacci n positiva ser indicada por un producto de 135 pb La sensibilidad del ensayo es de aproximadamente 0 01 pg de ARN purificado de YHV 10 geno
14. TP y dGTP y 2 5 U de polymerasa Tag Promega en un tubo cuya pared sea de 0 5 ml Se recubre la mezcla de reacci n con 50 ul de parafina l quida se calienta a 85 C durante 2 3 minutos y luego se a ade 1 ul de cADN Se realiza la amplificaci n por PCR utilizando 35 ciclos 95 C durante 30 segundos 66 C durante 30 segundos y 72 C durante 45 segundos con una extensi n final a 72 C durante 7 minutos Para el segundo paso de la PCR se prepara una mezcla de reacci n de 50 ul que contenga 2 ul de producto del primer paso de la PCR 1 X tamp n Tag ver m s arriba 1 5 mM de MgCl 35 pmoles de cada cebador GY2 Y3 y G6 200 uM de cada uno de los cebadores dATP dTTP dCTP y dGTP y 2 5 U de polimerasa Tag Promega en un tubo con pared de 0 5 ml y recubierto con parafina l quida Se realiza la PCR en las mismas condiciones de amplificaci n descritas anteriormente Se a ade 10 pl del producto PCR amplificado a geles de agarosa al 2 TAE que contengan 0 5 ug ml de bromuro etidio a lo largo de una escalera de ADN adecuada y se realiza la detecci n mediante un transiluminador UV Si la carga v rica es lo suficientemente grande se amplificar ADN de 794 pb bien sea de GAV o de YHV en el primer paso de la PCR En el segundo paso de la PCR un producto de 277 pb indica que se ha detectado el YHV y un producto de 406 pb indica que se ha detectado el GAV La presencia de ambos productos 406 pb y 277 pb indica la existencia de una infecci n doble
15. a en general es muy alta 50 100 la prevalencia de los virus del complejo de la cabeza amarilla en P monodon sanos tal como se detecta por medio de la reacci n en cadena de la polimerasa anidada PCR en la mayor a de las poblaciones de piscifactor a y silvestres muestreadas en Australia Asia y el Este de frica La prevalencia de genotipos individuales var a de acuerdo con el origen geogr fico de las gambas La prevalencia del YHV genotipo 1 puede ser baja gt 1 en P monodon silvestres o de piscifactor a pero podr a ser muy alta cercana al 100 en los estanques con brotes de la enfermedad Mediante otros m todos de detecci n menos sensibles ej la histolog a la inmunotransferencia el dot blot la hibridaci n in situ la prevalencia de la infecci n en las gambas sanas ser a m s baja e Distribuci n geogr fica se ha descrito la ECA en la Rep blica Popular China India Indonesia Malasia Filipinas Sri Lanka Taiwan Tailandia y Vietnam 1 11 18 29 30 31 Se han detectado el GAV y otros genotipos del complejo de la cabeza amarilla en P monodon sanas procedentes de Australia India Indonesia Malasia Mozambique Filipinas Taiwan Tailandia y Vietnam 29 32 e Mortalidad y morbilidad la ECA puede causar una mortalidad de hasta un 100 en estanques de P monodon infectados dentro de los 3 d as siguientes a la aparici n de los primeros signos cl nicos En Australia se ha asociado a los GAV con una morta
16. a capa de grasa y se pasa por un filtro de 0 45 um Se mantiene el filtrado a 4 C para su uso inmediato o se congela y almacena en al cuotas a 80 C o en nitr geno l quido Se descongela r pidamente el filtrado a 37 C y se mantiene en hielo antes de usar Se inyectan al menos doce ejemplares juveniles de gamba 1 5 g de una especie susceptible conocida P monodon P esculentus M japonicus F merguiensis L vannamei L stylirostris con 5 ul de filtrado por gramo de peso corporal en el segundo segmento abdominal utilizando una aguja del calibre 26 Se inyectan dos grupos equivalentes de al menos 12 gambas con tamp n TN y un extracto de tejido filtrado y preparado a partir de gambas sanas Finalmente debe inyectarse un grupo adicional de al menos 12 gambas con un in culo de control positivo conocido y calibrado procedente de gambas infectadas con YHV o GAV seg n sea el caso Se mantiene cada grupo de gambas en tanques cubiertos separados y con suministro independiente de agua mientras dure el bioensayo Siguiendo la buena pr ctica de laboratorio debe impedirse la transferencia accidental de agua entre los tanques Se observan las gambas y se registran las mortalidades durante al menos 21 d as o hasta que los grupos control de prueba y positivo alcancen el 100 de mortalidad Se recoge al menos una gamba moribunda de cada uno de los cuatro grupos para su examen por histolog a MET hibridaci n m situ de cido nucleico y PCR o e
17. ado Se detiene la reacci n empapando la membrana con agua destilada Todas las incubaciones deben realizarse a 25 C 2 C Se usa una preparaci n v rica purificada como control positivo y se identifican 2 4 bandas de prote na importantes caracter sticas del YHV a 116 64 y 20 kDa La sensibilidad es 0 4 ng de prote na de YHV 10 viriones de YHV e T cnicas moleculares Reacci n en cadena de la polimerasa de transcripci n inversa RT PCR Se describen tres m todos de RT PCR El primer protocolo es la RT PCR simple adaptada de Wongteerasupaya el al 33 que puede utilizarse para la confirmaci n de YHV en gambas recogidas en zonas en las que se sospecha que hay un brote de YHV no de GAV ni de otros genotipos El segundo protocolo es una PCR anidada de transcripci n inversa m ltiple m s sensible que se ha adaptado de Cowley ef al 4 Puede utilizarse para la detecci n diferenciada de YHV y de GAV en gambas afectadas por brotes de la enfermedad o para el an lisis de portadores sanos Con esta prueba no se detectar n todos los genotipos conocidos del complejo cabeza amarilla y el genotipo 3 puede reaccionar como GAV Una forma de la prueba convenientemente modificada disponible en una fuente comercial Farming IntelliGene Technology Corporation Taiwan La OIE exige un proceso formal de validaci n y pruebas comerciales para la certificaci n En la p gina Web de la OIE se ofrece una lista de kits y productos de prueba
18. calera de ADN adecuada y se realiza la detecci n mediante un transiluminador UV Si la carga v rica es lo bastante alta se amplificar ADN de 358 pb en el primer paso de la PCR En el segundo paso de la PCR anidada se amplifica un producto de 146 pb La detecci n de estos productos indica que se ha detectado uno de los seis genotipos del complejo de la cabeza amarilla Es posible la tipificaci n adicional del genotipo en caso de que as se requiera mediante an lisis de la secuencia de nucle tidos de cualquiera de los dos productos PCR seguido de la comparaci n de secuencias de los genotipos por alineamiento m ltiple de secuencias y an lisis filogen tico Los l mites de la sensibilidad de detecci n del primer paso de la PCR y la PCR anidada son 2 500 y 2 5 moldes de RNA respectivamente Secuencias de cebadores de la PCR cada cebador comprende un conjunto de cantidades iguales de dos secuencias relacionadas de oligonucle tidos Conjunto YC Flab 5 ATC GTC GTC AGC TAC CGC AAT ACT GC 3 5 ATC GTC GTC AGY TAY CGT AAC ACC GC 3 Conjunto YC Rlab 5 TCT TCR CGT GTG AAC ACY TTC TTR GC 3 5 TCT GCG TGG GTG AAC ACC TTC TTG GC 3 Conjunto YC F2ab 5 CGC TTC CAA TGT ATC TGY ATG CAC CA 3 5 CGC TTY CAR TGT ATC TGC ATG CAC CA 3 Conjunto YC R2ab 5 RTC DGT GTA CAT GTT TGA GAG TTT GTT 3 5 GTC AGT GTA CAT ATT GGA GAG TTT RTT 3 C digos de bases mixtas R AG Y CT M AC K GT S GC W AT H ACT
19. do hematopoy tico las laminillas de las branquias y el tejido conjuntivo esponjoso del subcutis el intestino la gl ndula antenal las gl ndulas sexuales los tractos nerviosos y los ganglios 3 11 e Infecci n persistente con portadores asintom ticos GAV persiste como una infecci n cr nica en las P esculentus supervivientes al menos durante 50 d as despu s del desaf o experimental 24 La elevada prevalencia de la infecci n por GAV y otros virus del complejo de la cabeza amarilla genotipos 2 6 en todas las fases de vida de las P monodon sanas nos sugiere que las infecciones cr nicas asintom ticas son habituales 29 32 Tambi n existe evidencia de la persistencia del YHV genotipo 1 en supervivientes de la infecci n experimental T W Flegel pers comm e Vectores no existen vectores conocidos del YHV Patr n de la enfermedad e Mecanismos de transmisi n el YHV puede transmitirse horizontalmente por inyecci n Por ingesti n de tejidos infectados por inmersi n en extractos de tejido filtrados por membrana o por cohabitaci n con gambas infectadas 8 11 Tambi n se ha demostrado la transmisi n por inyecci n de extractos de camar n de pasta Acefes sp recogidos de estanques infectados 7 Se ha demostrado que la ECA se transmite verticalmente desde los progenitores hembra y macho probablemente por contaminaci n de la superficie o por infecci n del tejido que rodea al huevo fertilizado 5 Prevalenci
20. e puede darse una gran actividad alimenticia seguida de un cese repentino de alimentaci n a los 2 4 d as de la aparici n de signos cl nicos graves de la enfermedad y de mortalidad 3 13 Las gambas moribundas pueden congregarse en los bordes de los estanques cerca de la superficie Las gambas moribundas pueden mostrar una apariencia blanquecina en su conjunto y una decoloraci n amarillenta del cefalot rax causada por el hepatop ncreas amarillo subyacente que puede aparecer excepcionalmente blando cuando se compara con el hepatop ncreas marr n de una gamba normal En muchos casos se produce una p rdida total de la cosecha a los pocos d as de la primera aparici n de gambas con signos graves de ECA Mientras que los brotes de ECA siempre van acompa ados del cese de la alimentaci n congregaci n en los bordes de los estanques y aspecto generalmente blanquecino estas caracter sticas de la enfermedad no son espec ficas de la ECA Los otros signos m s patognom nicos no se ven siempre y por tanto no son fiables incluso para diagn sticos presuntivos de la ECA Los signos graves de la enfermedad del GAV incluyen la nataci n cerca de la superficie y en los bordes de los estanques el cese de la alimentaci n el enrojecimiento del cuerpo y del ap ndice y la coloraci n de las branquias entre rosa y amarillo Sin embargo estos signos que ocurren generalmente en las gambas enfermas no se consideran patognom nicos para la enfermedad de
21. ente se a ade una gota de l quido de montaje y un cubreobjetos Se usa la presi n de la luz para allanar la preparaci n lo m ximo posible Tambi n se puede utilizar este procedimiento con capas finas de tejido subcuticular Se examina con un microscopio de campo claro con una lente de X40 Para muestras de brotes de ECA se observar n inclusiones citoplasm ticas esf ricas te idas de forma uniforme profundamente bas filas en cantidades moderadas o grandes aproximadamente 2 um de di metro o menores 6 Esta evidencia debe utilizarse de forma conjunta con los resultados de frotis de hemolinfa v ase m s adelante a la hora de hacer el diagn stico presuntivo de un brote de ECA Por lo que respecta a los tejidos fijados y los filamentos en xileno estos portas con preparaciones completas pueden conservarse como registros permanentes Si se requieren resultados r pidos se puede acortar la fase de fijaci n a dos horas cambiando la porci n de cido ac tico en la f rmula de preparaci n de fijador de Davidson a concentrado de HC1 al 50 Para obtener los mejores resultados esta fijaci n no debe almacenarse por m s de dos d as antes de ser utilizada Despu s de la fijaci n se lava cuidadosamente para retirar el fijador y se comprueba que el pH vuelva a ser casi neutro antes de la tinci n No se debe fijar por per odos largos o por encima de los 25 ya que esto podr a da ar en exceso los tejidos con lo que se har dif cil o
22. g 64 5 12 Lu Y TAPAY L M BROCK J A amp LOH P C 1994 Infection of the yellow head baculo like virus YBV in two species of penaeid shrimp Penaeus stylirostris Stimpson and Penaeus vannamei Boone J Fish Dis 17 649 656 Lu Y TAPAY L M GOSE R B BROCK J A amp LOH P C 1997 Infectivity of yellow head virus YHV and the Chinese baculo like virus CBV in two species of penaeid shrimp Penaeus stylirostris Stimpson and Penaeus vannamei Boone In Diseases in Asian Aquaculture III Flegel T W amp MacRae 1 H eds Asian Fisheries Society Manila the Philippines 297 304 MOHAN C V SHANKAR K M KULKARNI S amp SUDHA P M 1998 Histopathology of cultured shrimp showing gross signs of yellow head syndrome and white spot syndrome during 1994 Indian epizootics Dis Aquat Org 34 9 12 NASH G L AKARAJAMORN A WITHYACHUMNARNKUL B 1995 Histology and rapid haemocytic diagnosis of yellow head disease in Penaeus monodon In Diseases in Asian Aquaculture Il Shariff M Subasinghe R P amp Arthur J R eds Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila the Philippines 89 98 NUNAN L M POULOS B T amp LIGHTNER D V 1998 The detection of white spot syndrome virus WSSV and yellow head virus YHV in imported commodity shrimp Aquaculture 160 19 30 PANTOJA C R amp LIGHTNER D V 2001 Necrosis due to WSSV can mimic YHV lesions in lymphoid organ of penaeid shrimp The Advocate 4
23. gn stico del YHV Los s mbolos utilizados en el cuadro indican A el m todo es el recomendado por razones de disponibilidad utilidad especificidad y sensibilidad del diagn stico B se trata de un m todo est ndar con buena sensibilidad y especificidad de diagn stico C aplicable en algunas situaciones pero su coste precisi n y otros factores limitan seriamente su aplicabilidad D actualmente no se recomienda el m todo para este fin Esta clasificaci n es un tanto subjetiva ya que en el tema de la adecuaci n est n implicadas otras cuestiones como la fiabilidad la sensibilidad la especificidad y la utilidad Aunque no todas las pruebas incluidas en las categor as A o B se han sometido a estandarizaci n y validaci n formales v ase el cap tulo 1 1 2 su car cter rutinario y el hecho de que se hayan utilizado ampliamente sin resultados dudosos las convierte en aceptables Vieilanci M todo eee Presuntivo Confirmativo Juveniles A o Mer dE UT lc c po A Bes p gt b B anticuerpos pcr apa a A A Cuadro 1 M todos de vigilancia detecci n y diagn stico de YHV PLs postlarvas MCC microscop a de campo claro MET microscop a electr nica de transmisi n PCR reacci n en cadena de la polimerasa 5 CRITERIOS DE DIAGN STICO CONFIRMATIVO a Definici n de caso sospechoso La enfermedad de la cabeza amarilla es sobre todo una enfermedad del Penaeus monodon de cultivo causada por el
24. l GAV b M todos cl nicos Lesiones macrosc picas v ase secci n 3 a m s arriba Qu mica cl nica no se ha descrito ninguna Examen microsc pico Las gambas moribundas recogidas de los bordes de los estanques durante un brote de la enfermedad constituyen el material preferido para realizar el examen Aparentemente las gambas normales tambi n podr an recogerse del mismo estanque e Preparaciones montadas se fija la gamba entera o filamentos de branquia con fijador de Davidson durante toda la noche 11 Despu s de la fijaci n se lavan bien varios Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 421 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 422 filamentos de branquia con agua corriente para separar el fijador y se ti en con hematoxilina y eosina de Meyer H amp E 11 Despu s de la tinci n y deshidrataci n cuando el tejido est en xileno se coloca un filamento de branquia en el porta de un microscopio en una gota de xileno y utilizando un par de agujas finas es til un microscopio est reo se rompen varios filamentos secundarios Se reemplaza el filamento principal en xileno donde pueda almacenarse de forma indefinida en un vial sellado como referencia permanente Sin dejar que se seque el xileno se deshilachan los filamentos secundarios sobre el porta del microscopio y se desechan los fragmentos grandes a part culas que puedan espesar la preparaci n de forma innecesaria Finalm
25. l an lisis por inmunoelectrotransferencia para confirmar la presencia de YHV o GAV seg n sea el caso en la muestra m s adelante aparecen los cortes con los procedimientos de prueba correspondientes Advi rtase que las gambas de prueba que son sospechosas de ser portadoras de infecciones cr nicas de bajo nivel pueden producir un in culo con una dosis muy peque a de virus En el bioensayo dicho in culo puede que no cause mortalidad s ntomas generales de la enfermedad o signos histol gicos de una infecci n letal Si ese es el caso deben aplicarse a las gambas del bioensayo pruebas moleculares o an lisis por MET M todos de detecci n de ant geno basados en el uso de anticuerrpos Detecci n por inmunotransferrencia Se preparan los reactivos y se realizan los ensayos de acuerdo con los protocolos de Lu et al 16 y Loh ez al 14 Ello incluye la purificaci n de los viriones de YHV de gambas infectadas en el laboratorio la generaci n de inmunoglobulinas Igs en conejos blancos de Nueva Zelanda la purificaci n de la IgG mediante columnas de prote na G bacteriana recombinante y la separaci n de los ant genos de gamba normal de reacci n cruzada por adsorci n en tejido de m sculo y hemolinfa de gamba secada en acetona y molida Para el ensayo se separa 0 1 ml de hemolinfa de ejemplares de gamba viva y se diluye en un volumen igual de tamp n de citrato para uso inmediato o se almacena a 80 C hasta su uso Para la inm
26. la enfermedad var a seg n la especie En las pruebas de laboratorio se ha demostrado que el YHV puede causar gran mortalidad en P monodon L vannamei L stylirostrus F aztecus F duorarum M sintangene P styliferus y P serrifer 12 15 17 e Fases susceptibles del hospedador las P monodon son susceptibles a la infecci n por YHV en fases posteriores a la de L15 10 Las infecciones experimentales con GAV indican que los Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 419 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 420 langostinos M japonicus m s grandes 20 g son menos susceptibles a la enfermedad que las m s peque as 6 13 g de la misma especie 23 e Predilecci n de subpoblaci n o especies probabilidad de detecci n entre las especies de gambas susceptibles s lo se sabe que los virus del complejo de la cabeza amarilla genotipos 2 6 aparecen prevalencia hasta un 100 en P monodon sanas que parecen ser el hospedador natural 29 32 Sin embargo las infecciones por YHV genotipo 1 se detectan generalmente s lo en caso de enfermedad y habitualmente no se presentan en las P monodon sanas Se han detectado infecciones naturales por YHV en M japonicus F merguiensis L setiferus M ensis P styliferus y E superba 7 8 e rganos diana y tejidos infectados el YHV afecta a tejidos de origen ectod rmico y mesod rmico incluido el rgano linfoide los hematies el teji
27. lidad de hasta un 80 en los estanques de P monodon e Repercusi n econ mica y productiva de la enfermedad en 1996 se estim que el impacto econ mico del YHV en Tailandia hab a sido de 30 millones de d lares en 1992 y de 40 millones en 1993 Aunque esto representa s lo un 3 4 del valor bruto de la producci n la Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla p rdida total de la cosecha durante el cultivo tiene un impacto muy significativo en los productores particulares d Control y prevenci n Vacunaci n no se han desarrollado m todos efectivos de vacunaci n de forma consistente Quimioterapia no existen informes confirmados cient ficamente Inmunoestimulaci n no existen informes confirmados cient ficamente Producci n de resistentes no se ha descrito Repoblaci n con especies resistentes no se ha descrito Agentes bloqueadores no se han descrito Pr cticas generales de manejo para reducir el riesgo de la enfermedad se pueden utilizar stocks de in culo libres de pat geno espec fico LPE o negativos por la PCR agua biosegura y sistemas de cultivo 3 M TODOS DE DIAGN STICO a M todos de diagn stico de campo Signos cl nicos el YHV puede infectar las gambas de cultivo desde las formas postlarvarias en adelante pero la mortalidad masiva generalmente aparece en las formas juveniles tempranas y tard as Excepcionalment
28. mas Secuencias de cebadores PCR 10F 5 CCG CTA ATT TCA AAA ACT ACG 3 144R 5 AAG GTG TTA TGT CGA GGA AGT 3 Protocolo 2 PCR anidada RT para la detecci n diferenciada del YHV y el GAV en gambas sanas o enfermas Para la s ntesis de cADN se mezclan 2 ul de ARN lo ideal es 1 0 ug de ARN total si se cuantifica y 0 7 ul de 50 pmoles ul cebadores GY5 hasta un total de 6 ul en agua tratada con DEPC se incuba a 70 C durante 10 minutos y se enfr a en hielo Se a ade 2 ul de tamp n Superscript II x 5 250 mM de Tris HCL pH 8 3 375 mM de KCl 15 mM de MgCL 1 ul 100 mM de DTT y 0 5 ul 10 mM de mezcla stock de dNTP i e 10 mM de dATP 10 mM de dTTP 10 mM de dCTP 10 mM de dGTP y se mezcla suavemente Se precalienta a 42 C durante 2 minutos se a ade 0 5 ul de 200 U ul de transcriptasa inversa de Superscript II Gibco BRL y se incuba a 42 C durante 1 hora Luego se calienta la reacci n a 70 C durante 10 minutos se enfr a en hielo y se Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla centrifuga brevemente en un microcentrifuga para recoger el contenido del tubo Para el primer paso de la PCR se prepara una mezcla de reacci n de 50 ul que contenga 1 x tamp n Taq 10 mM de Tris HCl pH 8 3 50 mM de KCl 0 1 de Trit n X 100 1 5 mM de MgCl 35 pmoles de cada uno de los dos cebadores GY1 y GY4 200 uM de cada uno de los cebadores dATP dTTP dC
29. na vez durante 30 minutos a temperatura ambiente 1 X SSC dos veces durante 5 minutos a 37 C 0 5 x SSC dos veces durante 5 minutos a 37 C Se incuban los cortes con un conjugado de Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla anti digoxigeninna de oveja fosfatasa alcalina Roche a 37 C durante 30 minutos Se lava dos veces con 0 1 M de Tris HCl pH 7 5 0 15 M de NaCl durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se lava con 0 1 M de Tris HCl pH 9 5 0 1 M de NaCl Se incuba con nitroazul de tetrazolio y 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato en la oscuridad durante 1 2 horas para que se desarrolle el color Se ti e para contraste con marr n Bismarck Y 0 5 se deshidrata con una serie de etanol y Hemo de se a ade Permount Fisher Scientific Pennsylvania USA y se cubre con un cubreobjetos Las c lulas infectados por YHV presentan un color entre azul y morado sobre un fondo marr n de contratinci n Se deben incluir controles positivos de tejido infectado por YHV y controles negativos de tejido de gambas sanas Se puede preparar la sonda de diagn stico mediante etiquetado por PCR usando los siguientes cebadores YHV1051F 5 ACA TCT GTC CAG AAG GCG TC 3 YHV1051R 5 GGG GGT GTA GAG GGA GAG AG 3 4 VALORACI N DE LAS PRUEBAS SEG N SU FINALIDAD En el cuadro 1 aparecen los m todos disponibles en la actualidad para la vigilancia detecci n y dia
30. niviridae In Virus Taxonomy VIlIth Report of the ICTV Fauquet C M Mayo M A Maniloff J Desselberger U and Ball L A eds Elsevier Academic Press London 973 977 WALKER P J COWLEY J A SPANN K M HODGSON R A J HALL M R amp WITHYACHUMNARNKUL B 2001 Yellow head complex viruses Transmission cycles and topographical distribution in the Asia Pacific Region In The New Wave Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Culture Aquaculture 2001 Browdy C L amp Jory D E eds The World Aquaculture Society Baton Rouge LA USA 292 302 WANG Y C amp CHANG P S 2000 Yellow head virus infection in the giant tiger prawn Penaeus monodon cultured in Taiwan Fish Pathol 35 1 10 WANG C S TANG K F J amp CHEN S N 1996 Yellow head disease like infection in the Kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in taiwan Fish Path 31 177 182 WIJEGOONAWARDANE P COWLEY JA KIATPATHOMCHAI W MIELSEN L amp WALKER PJ 2004 Phylogenetic analysis and evidence of genetic recombination among six genotypes of yellow head complex viruses from Penauen monodon Book of Abstracts 7 Asian Fisheries Forum Penang Malaysia 30 November 4 December 2004 p 210 WONGTEERASUPAYA C BOONSAENG V PANYIM S TASSANAKAJON A WITHYACHUMNARNKUL B amp FLEGEL T W 1997 Detection of yellow head virus YHV of Penaeus monodon by RT PCR amplification Dis Aquat Org 31 181 186 NB Existe un labo
31. os y la secuenciaci n son los m todos prescritos para declarar la ausencia de infecci n Se requieren resultados negativos de la PCR de dos pasos Cuando un resultado positivo por PCR de dos pasos no puede confirmarse mediante secuenciaci n eso tambi n cuenta como resultado negativo REFERENCIAS 1 ALBALADEJO J D TAPAY L M MIGO V P ALFAFARA C G SOMGA J R MAYO S L MIRANDA R C NATIVIDAD K MAGBANUA F O ITAMI T MATSUMURA M NADALA E C B JR amp LOH P C 1998 Screening for shrimp viruses in the Philippines In Advances in Shrimp Biotechnology Flegel T W ed National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Bangkok Thailand 251 253 2 BELL T A amp LIGHTNER D V 1988 A Handbook of Normal Penaeid Shrimp Histology World Aquaculture Society Baton Rouge USA 114 pp 3 CHANTANACHOOKIN C BOONYARATPALIN S KASORNCHANDRA J DIREKBUSARAKOM S AEKPANITHANPONG U SUPAMATTAYA K SRIURAITANA S amp FLEGEL T W 1993 Histology and ultrastructure reveal a new granulosis like virus in Penaeus monodon affected by yellow head disease Dis Aquat Org 17 145 157 4 COWLEY J A CADOGAN L C WONGTEERASUPAYA C HODGSON R AJ SPANN K M BOONSAENG V amp WALKER P J 2004 Differential detection of gill associated virus GAV from Australia and yellow head virus YHV from Thailand by multiplex RT nested PCR J Virol Methods 117 49 59 5 COWLEY J A HALL M R CADOGAN L C SPANN K M am
32. p WALKER P J 2002 Vertical transmission of gill associated virus GAV in the black tiger prawn Penaeus monodon Dis Aquat Org 50 95 104 6 FLEGEL T W BOONYARATPALIN S amp WITHYACHUMNARNKUL B 1997 Current status of research on yellow head virus and white spot virus in Thailand Iv Diseases in Asian Aquaculture II Flegel T W MacRae I H eds Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila the Philippines 285 296 7 FLEGEL T W FEGAN D F amp SRIURAIRATANA S 1995 Environmental control of infectious shrimp diseases in Thailand In Diseases in Asian Aquaculture II Shariff M Subasinghe R P amp Arthur J R eds Asian Fisheries Society Manila the Philippines 65 79 8 FLEGEL T W SRIURAIRATANA S WONGTERRASUPAYA C BOONSAENG V PANYIM S amp WITHYACHUMNARNKUL B 1995 Progress in characterization and control of yellow head virus of Penaeus monodon In Swimming Through Troubled Water Proceedings of the Special Session on Shrimp Farming Aquaculture 95 Browdy C L amp Hopkins J S eds World Aquaculture Society Baton Rouge USA 76 83 430 Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Zi 22 23 24 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla HASSON K W HASSON J AUBERT H REDMAN R M amp LIGHTNER D V 1997 A new RNA friendly fixative for the preservation
33. ratorio de referencia de la OIE para la enfermedad de la cabeza amarilla v ase el cuadro al final del presente Manual de animales acu ticos o cons ltese la lista actualizada en la p gina Web de la OIE www oie int 432 Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006
34. s de gambas moribundas sospechosas de infecci n por YHV que resultan m s apropiados para su uso con la MET son los de rganos linfoides y branquias Para el an lisis o la vigilancia de las gambas de apariencia normal el tejido m s apropiado es el de rganos linfoides Se aturden las gambas vivas mediante inmersi n en agua helada hasta que queden inmovilizadas o mueran por inyecci n de fijador R pidamente se diseccionan y se retiran peque as porciones de tejido diana de un di metro de unos pocos cent metros y se fijan en al menos 10 vol menes de glutaraldehido al 6 y a 4 C y tamponado con soluci n de cacodilato s dico Na CH5 AsO 3H O 8 6 g de cacodilato de Na 10 g de NaCl agua destilada hasta un volumen de 100 ml ajustado a pH 7 con 0 2 N HCl o soluci n de fosfato 0 6 g de NaH PO H O 1 5 g de Na HPO 1 g de NaCl 0 5 g de sacarosa 100 ml de agua destilada ajustado a pH 7 con 0 2 N HC Se fija durante al menos 24 horas antes de su procesamiento Para almacenarlo durante largo tiempo en fijador a 4 C se reduce el glutaraldehido al 0 5 1 0 El procesamiento implica la post fijaci n con tetra xido de osmio al 1 deshidrataci n inclusi n seccionado y tinci n con acetato de uranilo y citrato de plomo seg n los m todos MET Se han descrito en otros sitios los reactivos utilizados en estos procedimientos 11 En las c lulas infectadas por Y HV se observan los precursores de la nucleoc psida y los viriones de
35. unoelectrotransferencia se usa una muestra de 200 ul se Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla clarifica a 8 000 g durante 5 minutos y luego se precipita el sobrenadante 140 000 g durante 5 minutos Se resuspende el precipitado en 100 ul 2 X tamp n de carga 2 5 ml 0 5 mM de Tris HCl pH 6 8 4 ml de dodecil sulfato de sodio al 10 SDS 2 ml de glicerol 1 ul de beta mercaptoetanol y 0 5 ml de agua destilada desionizada y se calienta a 95 C durante 5 minutos Se coloca una submuestra de 10 ul en SDS al 5 gel de poliacrilamida y se realiza electroforesis a 200 V Se seca el gel sobre una membrana de nitrocelulosa con poros de 0 1 mm en tamp n para electroforesis 3 03 g de Tris base 14 4 g de glicina y 200 ml de metanol por litro a 100 V durante 1 hora Se lava la membrana con soluci n salina tamponada con fosfato PBS pH 7 4 se empapa con 5 de leche desnatada en PBS durante 1 hora y aclarar con PBS durante 5 minutos A continuaci n se trata la membrana con una diluci n 1 1 000 del anticuerpo primario IgG durante 1hora se lava tres veces con PBS durante 5 minutos y luego se trata con una diluci n 1 2500 de conjugado de peroxidasa de r bano e IgG de cabra anti rat n durante 1 hora Se lava de nuevo tres veces con PBS durante 5 minutos y luego se trata con substrato 3 3 5 5 tetrametilbenzidina hasta que se torne de color azulado mor
36. utos 8 Actualmente existe poca informaci n sobre otros m todos de inactivaci n pero parece que el virus es susceptible al tratamiento con cloro a 30 ppm 6 e Ciclo biol gico no se han descrito infecciones por YHV con multiplicidad alta en cultivos celulares La infecci n con una multiplicidad infectiva de 0 001 en cultivo celular del rgano linfoide primario indic que se obtiene un t tulo v rico m ximo 4 dias despu s de la infecci n Los signos cl nicos de la ECA se presentan en P monodon a los 7 10 d as de la exposici n b Factores del hospedador e Especies hospedadores susceptibles se ha descrito que las infecciones naturales y o experimentales se presentan en las siguientes especies de gambas peneidas y palem nidas y de langostinos y krill langostino jumbo Penaeus monodon langostino tigre marr n Penaeus esculentus langostino japon s Marsupenaeus japonicus langostino banana Fenneropenaens merguiensis langostino patiblanco Litopenaeus vannamei langostino azul Litopenaues stylirostris langostino blanco norte o Litopenaens setiferus langostino caf Farfantepenaeus aztecus langostino rosado Farfantepenanes duorarum langostino resbaloso Metapenaeus ensis langostino rabo verde Metapenaeus bennettae camar n Machrobrachium sintangene camar n rosna Palaemon styliferus camar n carpintero Palaemon serrifer camar n de pasta Ascetes sp krill Euphasia superba La susceptibilidad a
37. va las gambas silvestres o cultivadas susceptibles que se hayan de utilizar en el bioensayo deben analizarse mediante PCR anidada de transcripci n inversa RT con muestras de hemolinfa a fin de confirmar la ausencia de infecciones pre existentes cr nicas por Manual de pruebas de diagn stico para los animales acu ticos 2006 423 Cap tulo 2 3 3 Enfermedad de la cabeza amarilla 424 YHV GAV o virus relacionados Las gambas deben mantenerse en condiciones ptimas a lo largo del proceso para garantizar la supervivencia de la especie en cultivos de laboratorio Se recogen gambas moribundas tras el brote de la enfermedad o gambas sospechosas de ser portadoras de la enfermedad y se mantienen a 4 C o en hielo Se separan y desechan la cola y los ap ndices Si es preciso se congela la gamba entera o el cefalot rax y se guarda a 80 C o en nitr geno l quido hasta que se necesiten Se descongelan r pidamente las muestras guardadas con un ba o de agua a 37 C dentro de de dos bolsas de pl stico selladas y luego se mantienen a 4 C o en hielo durante todo el proceso Se desechan el caparaz n y las partes calc feras de la boca Se suspenden los tejidos restantes en seis vol menes de tamp n TN 0 02 M de Tris HCl pH 7 4 0 4 M de NaCl y se homogeneiza con un triturador de tejidos hasta formar una suspensi n fina Se clarifica el homogeneizado a 1 300 g durante 20minutos a 4 C Se separa el l quido sobrenadante que hay debajo de l
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