(LISTOS)ESManual de instrucciones PAPI
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1. Despu s del primer uso mantener la proteinasa K y la soluci n de digesti n a 2 8 C Proteinasa K Irritante y Sensibilizante Irrita los ojos las v as respiratorias y la piel Posibilidad de sensibilizaci n por inhalaci n y en contacto con la piel No respirar los vapores Ev tese el contacto con la piel En caso de contacto con los ojos l vense inmediata y abundantemente con agua y ac dase a un m dico Xn R36 37 38 42 43 523 24 26 36 37 Reactivos necesarios no suministrados Agua destilada Cloruro s dico 0 9 agarosa tamp n TBE bromuro de etidio tamp n de carga de electroforesis 5X 4 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ADN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 5 Procedimiento Dependiendo de la referencia utilizada proceder seg n se indica Papitype PAPI procedimiento completo Papitype PASC seguir el procedimiento hasta el punto 5 4 Papitype PAID seguir el proced2. EXEIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 www progenie molecular com Papitype PAPI v 1 PASC v 1 PAID v 1 1 Descripci n del m todo Papitype es un sistema de reactivos que permite la detecci n y el tipado de los papilomavirus humanos VPH en muestras cl nicas El sistema Papitype consiste en 1 Extracci n del ADN v rico se realiza mediante digesti n de las prote nas celulares y v ricas mediante incubaci n con proteinasa Ken un tamp n adecuado 2 Amplificaci n se realiza mediante un protocolo que utiliza unos oligonucle tidos gen ricos que permiten obtener un producto del ORF L1 com n a todos los tipos de papilomavirus La longitud de este producto es 450 pares de bases pb aproximadamente dependiendo del tipo de VPH La mezcla de amplificaci n permite la amplificaci n de un control interno Cl de 590 pb Este producto debe aparecer en todas las muestras y permite descartar los falsos negativos Debido a su tama o y a la ausencia de dianas de restricci n no interfiere en la interpretaci n de los resultados 3 An lisis de restricci n del producto de amplificaci n se realiza mediante 2 digestiones simult neas utilizando las enzimas Enzl y Enzll Cada digesti n es analizada electrofor ticamente en un gel de agarosa 4 Identificaci n del patr n de restricci n se realiza por comparaci n con los patrones te r
3. acci n de amplificaci n que impiden la obtenci n del producto del control interno banda de 592 pb En este caso se recomienda repetir todo el proceso utilizando el sistema de purificaci n de ADN QIAamp DNA Blood Mini Kit de Qiagen Si se obtuviera el mismo resultado habria que informar resultado NO VALORABLE y solicitar una nueva muestra 7 Ejemplo de resultado VPH VPH VPH VPH VPH VPH 72 52 IND 72 53 16 ci E peteca po porites r po j L 1 I 1 1212 M1712 12M1712 12M Resultados obtenidos con diferentes muestras cl nicas 8 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit Papitype ha sido validado tras pasar un exhaustivo control de calidad Este manual sirve para las referencias Papitype PAPI kit completo detecci n e identificaci n de VPH Papitype PASC kit parcial s lo detecci n de VPH Papitype PAID kit parcial s lo identificaci n de VPH Fecha de publicaci n Abril 2012
4. icos inclu dos en la tabla adjunta El an lisis permite la identificaci n del tipo de papilomavirus de forma inequ voca 2 Especificaciones Sensibilidad 1000 Ul uL La sensibilidad anal tica se ha demostrado mediante diluci n l mite utilizando el VPH 16 1st WHO International Standard for Human Papillomavirus HPV Type 16 DNA NIBSC code 06 202 Se ha demostrado esta sensibilidad en ensayos replicados con una reproducibilidad superior al 95 La sensibilidad puede variar dependiendo del tipo v rico analizado Especificidad Virus del papiloma humano 3 Componentes El sistema Papitype incluye los siguientes componentes Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Dependiendo de la referencia utilizada los reactivos incluidos son los siguientes Papitype PAPI todos los componentes indicados en la tabla Papitype PASC Proteinasa K Soluci n de digesti n 2X Amplimix VPH Taq polimerasa y Control positivo ADN VPH Papitype PAID Enzl Enzll y Marcador peso molecular Componente Viales Volumen Conservaci n Proteinasa K 2 1000 uL 15 25 C Soluci n digesti n 2X 2 1000 uL 15 25 C AmpliMix VPH 2 900 pL 15 25 C Enz I 10 U pL 1 42 uL 15 25 C Enz II 5 U L 1 82 uL 15 25 C Taq polimerasa 1 10 uL 15 25 C Control positivo ADN VPH 1 50 pL 15 25 C Marcador peso molecular 1 26 uL 15 25 C
5. imiento desde el punto 5 5 en adelante 5 1 Preparaci n de muestras cervicales uretrales y anales tomadas con escobillones sin medio 1 A adir 1 5 mL de cloruro s dico 0 9 al tubo que contiene la torunda 2 Agitar en el vortex durante 1 min 3 Decantar el sobrenadante en un tubo de 1 5 mL autoclavado 4 Centrifugar durante 5 min a 13000 rpm 5 Descartar el sobrenadante con la pipeta con cuidado de no arrastrar el pellet de c lulas 5 2 Extracci n del ADN v rico 1 A adir 50 uL de Soluci n de Digesti n 2X y 50 uL de Proteinasa K a la preparaci n de c lulas 2 Incubar a 55 C durante 2 h 3 Incubar a 95 C durante 10 min para inactivar la Proteinasa K 4 Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min 5 Conservar a 15 25 C hasta su uso en la reacci n de amplificaci n 5 3 Preparaci n de la reacci n de amplificaci n 1 Preparar y rotular los tubos de 0 2 mL necesarios para la amplificaci n de muestras y controles Se recomienda seguir el siguiente esquema Control Control MuestraA MuestraB Muestra C 2 Descongelar la AmpliMix VPH y el ADN de muestras y controles 3 En un tubo de 1 5 mL tomar el volumen de AmpliMix VPH necesario para todas las reacciones por cada muestra 44 8 uL 4 A adir el volumen necesario de Taq polimerasa 0 2 uL por reacci n Mezclar fuertemente 5 Pipetear 45 uL de la mezcla anterior en cada tubo de amplificaci n Descartar el volumen restante 6 A adir 5 uL del sobrenada
6. nte de cada extracci n de ADN v rico al tubo correspondiente 7 Colocar los tubos en el termociclador y someterlos al siguiente perfil t rmico Tiempo Temperatura Ciclos 4 00 94 C 1 0 30 94 C 0 45 52 C 40 0 30 72 C 4 00 72 C 1 4 C 5 4 Detecci n de los productos de amplificaci n 1 Tomar una alicuota de 10 uL del producto de amplificaci n de muestras y controles 2 A adir 2 5 uL de tamp n de carga de electroforesis 5X 3 Cargar en un gel de agarosa al 2 y realizar la electroforesis Este punto es opcional si se va a proceder al tipado 5 5 Tipado de VPHs 1 Preparar 2 alicuotas de 20 uL con el producto de amplificaci n 2 A adir a uno de los tubos 1 uL de Enzl y al otro 2 uL de Enzll 3 Incubar a 37 C durante 1 hora 4 A adir 3 uL de tamp n de carga de electroforesis 5X a cada tubo 5 Cargar el volumen de las 2 digestiones en pocillos adyacentes de un gel de agarosa al 3 y realizar la electroforesis Se recomienda cargar las digestiones junto al marcador de peso molecular 6 Interpretaci n de los resultados 6 1 Detecci n de papilomavirus Interpretar los resultados seg n la siguiente tabla Resultado e Interpretaci n banda 590 pb banda 450 pb NO SE DETECTA E j VPH POSITIVO VPH POSITIVO VPH NO VALORABLE prueba no v lida 6 2 Identificaci n del tipo v rico 1 Anotar el tama o de los fragmentos de restricci n obtenidos en la diges
7. ti n con Enzl y Enz Il excepto la banda del control interno 2 Comprobar que la suma de los tama os de los fragmentos en ambos casos es 450 pb aprox en caso de una muestra portadora de 2 VPHs la suma deber a ser 900 pb aprox 3 Interpretar el resultado seg n la siguiente tabla Resultado Interpretaci n A NO se observan bandas de restriccci n de VPHs NO SE DETECTA SI se observa la banda del C I 590 pb VPH B Se observan bandas de restricci n de VPHs Distinguir entre una de las siguientes opciones B1 Se identifican los patrones de restricci n de POSITIVO Enzl y Enzll con alg n VPH VPH X B2 Se identifican los patrones de restricci n de POSITIVO Enzl y Enzll con varios VPHs VPHs X y Z B3 No se identifican los patrones de restricci n POSITIVO con los de ning n VPH VPH INDETERMINADO C NO se observan bandas de restricci n de VPHs NO VALORABLE NO se observa la banda del C prueba no v lida En las muestras con alta carga viral el producto de amplificaci n del control interno podr a no aparecer por competici n con el de VPH Las bandas de menor tama o no suelen ser visibles en el gel excepto en las muestras con alta carga viral Algunas muestras son portadoras de dos o m s virus En este caso los patrones de restricci n de ambos virus se superponen dificultando su identificaci n Algunas muestras cl nicas presentan inhibidores de la re
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