Manual de usuario del programa Confocal Uniovi ImageJ
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1. Desde el men principal de ImageJ ver icono deberemos seleccionar la herramienta necesaria para dibujar la ROI Podemos seleccionar un rect ngulo 1 un c rculo 2 un pol gono 3 o un dibujo a mano alzada 4 14 M anual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 File Edit Image Process Analyze Plugins Window Help A NJ A 0701 Z ue m Tras dibujar la ROI en nuestra imagen serie pulsaremos la casilla OK en el mensaje y la imagen se ajustar s lo a la ROI dibujada Si queremos dibujar varias ROIs en la imagen debemos mantener pulsada la tecla may sculas Shift Calibrar imagen Con esta funci n podremos realizar una calibraci n de la imagen de manera que las medidas que hagamos se obtengan en unidades reales micras mm cm etc Para calibrar una imagen podemos proceder de dos maneras 1 Si tenemos marcada en la imagen una distancia conocida En este caso con la herramienta l nea del men de ImageJ marcaremos la distancia conocida 320x347 pixels RGB 434K A continuaci n pulsaremos en el icono calibrar la imagen y se nos abrir el siguiente men 15 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Distance in Pixels Known Distance Pixel Aspect Ratio Unit of Length micras Click to Remove Scale W Global Scale 0 238 pixels micras OK Cancel El primer valor Distance in pixels corresponde a la longitud en pi2. Al pulsar el icono aparece la ventana del visor interactivo de volumen de ImageJ A Volume Viewer 1 24 Slice Trilinear v Axes En el centro aparece la imagen del visor interactivo c rculo azul En la zona inferior de la ventana tenemos las opciones para a2 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 l cambiar la escala de la imagen que aparece en el visor interactivo Scale 2 activar o desactivar los ejes axes y las marcas Markers del visor interactivo 3 cambiar el ngulo de visi n del volumen pulsando en las casilla xy yz xz 4 definir en angle of rotation el ngulo x y z con el que nosotros queremos estudiar nuestro volumen Para desplazarnos interactivamente sobre el volumen de nuestra serie pulsaremos la barra indicada con una flecha roja en la ventana del visor interactivo de volumen de ImageJ y desplazaremos el rat n La imagen del visor interactivo ira cambiando seg n nos desplacemos en los ejes seleccionados En el margen izquierdo de la ventana se representa la informaci n de los tres ejes xy xz y yz y se se ala en cada eje con una l nea la posici n a la que corresponde la imagen que aparece en el visor interactivo S1 queremos salvar la imagen que aparece en el visor interactivo pulsaremos la casilla save view en la zona superior derecha de la ventana Co Par estereosc pico Permite crear un par estereosc
3. nicamente girar ese contenido Para rotar todos los contenidos hay que pulsar con el rat n en una zona en que no haya nada para deseleccionar todos los contenidos Una vez deseleccionados si realizamos la rotaci n nos rotar todo Si tenemos m s de un contenido visualiz ndose para que se muevan conjuntamente deberemos seleccionar los dos o m s contenidos desde menu select y despu s activar la opci n lock desde menu Transformation Lock Es posible cambiar el color o el modo de visualizaci n de un contenido para ello primero debemos seleccionar dicho contenido nos aparecer el recuadro rojo y a continuaci n pulsando en edit seleccionaremos display as para cambiar el modo de visualizaci n o attributes para cambiar los atributos de la imagen color transparencia threshold etc La opci n fill selection del men edit ofrece la posibilidad de eliminar zonas de nuestro volumen Esta opci n s lo funciona en el modo de visualizaci n de volumen Para trabajar con esta opci n primero seleccionaremos el volumen del que queremos eliminar una zona a continuaci n en el men de ImageJ seleccionaremos la herramienta de dibujo a mano alzada a continuaci n marcaremos con el rat n la zona a eliminar y seleccionaremos edit fill selection La zona de volumen seleccionada se nos borrar de la imagen Con esta opci n podemos cortar un volumen para ver lo que hay detr s 36 Manual de
4. pico a partir de una serie de im genes Al pulsar el icono se abre una ventana en la que se alaremos la opci n Red Green Anapelyph Stereo Pairs Angle of rotation Try angles between 5 10 M Red Cyan Anaglyph jw Red Green Anaglyph Stereo Pair Rotation movie OK Cancel El programa comienza a generar las dos proyecciones y finalmente muestra la imagen Red Green que deberemos ver utilizando las gafas estereosc picas SH 33 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Red Green 50 1040x1024 pixels RGB 4 1MB Visor de im genes 3D Realiza reconstrucciones en tres dimensiones de una serie de im genes de un volumen de muestra y las visualiza en diferentes formatos Al pulsar en el icono se nos abre la ventana de visualizaci n Previamente tenemos que tener abiertas la serie de im genes que queremos visualizar Para cargar una serie de imagenes en la ventana de visualizaci n iremos a File Add content Se abrir el siguiente men File Edit Select Transformation View Help Image Series005 Green e Name Series005 Gree Display as Volume Color feet v Threshold 0 Resampling factor 2 Channels Iw red M green M blue OK Cancel 34 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Los par metros que debemos seleccionar son e Image Seleccionaremos la serie de im genes que queremos visualizar Podemos seleccionar c
5. Range 1 30 OK Cancel Si marcamos la casilla duplicate stack y pulsamos OK se crear una copia de la serie S1 queremos duplicar s lo una imagen de la serie desactivaremos la casilla duplicate stack y escribiremos en la casilla range el n mero de posicionamiento de dicha imagen en el ejemplo se selecciona la secci n n mero 4 de las 30 secciones totales de la serie _ Duplicate Xx Title Series041 Red 1 F Duplicate Stack Range qs gt OK Cancel Si queremos duplicar un rango de im genes de una serie en la casilla range escribiremos el rango que deseamos por ejemplo 1 10 y nos duplicar las 10 primeras im genes de la serte En el caso de que lo que queremos duplicar sea un Hiperstack nos aparecer la siguiente ventana 12 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Title RARO A a Duplicate hyperstack Channels cy 1 3 Slices 2 1 29 OK Cancel Al igual que en el caso anterior podemos seleccionar duplicar todo el hyperstack o elegir que canales y que secciones queremos duplicar Esta funci n puede ser muy til para eliminar secciones iniciales o finales con poca o nula informaci n o para separar canales en un hiperstack LB Escalar imagen Permite modificar el n mero de p xeles de una imagen Al pulsar el icono se abre una ventana en la que podemos escribir el numero de pixeles de la nueva imagen o bien
6. de la parte inferior la Leer imagen de cualquier microscopio BIOFORMATO Permite leer m ltiples formatos de im genes microsc picas Utiliza el pluging Bio Formats Importer desarrollado por el Laboratory for Optical and Computational Instrumentation de la Universidad de Wisconsi Madison USA 2 Con este pluging podemos abrir formatos de imagen de los Microscopios Confocal m s habituales Leica Zeiss Nikon Olympus Biorad etc Un listado de todos los formatos soportados puede consultarse en la siguiente direcci n web http loci wisc edu bio formats formats Al pulsar el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos el fichero que deseamos y pulsaremos abrir Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Lo IMAGEJ stack Mtubulos Le 5eq0016 DU 1024 tif _ Stack Mtubulos nd2 Stack Mtubulos001 nd2 k mtubulos001201 tif stack mtubulos001202 tif Fee stack mtubulos001z14 tif stack mtubulos001215 tif stack mtubulos001216 tif stack mtubulos001217 tif stack mtubulos001218 tif stack mtubulos001z19 tif stack mtubulos001220 tif stack mtubulos001z21 tif stack mtubulos001222 tif stack mtubulos001223 tif stack mtubulos001224 tif stack mtubulos001225 tif stack mtubulos001226 tif stack mtubulos001227 tif stack mtubulos001228 tif stack mtubulos001203 tif stack mtubulos001204 tif DU4 1024 2 tif Espectral 1024 tif Largelmage PIEL tif stack mtubulos001205 tif
7. reiniciar el programa para que el cambio tenga efecto Leer imagen del Confocal Leica Permite abrir im genes almacenadas en el formato del Microscopio Confocal Leica TCS SP2 AOBS Este equipo almacena las im genes por experimentos Cada experimento se almacena en un directorio que contiene un fichero lei para la apertura del experimento en el microscopio confocal un fichero de texto txt con los metadatos informacion de la configuraci n del microscopio objetivos ganancia apertura del pinhole tama o de la imagen etc y un conjunto de im genes que a su vez pueden estar formadas por series de im genes de uno o varios canales Cada una de las im genes es un fichero tif Al pulsar en el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos el directorio del experimento que nos interesa y seleccionaremos el fichero de texto txt d Leica List Opener Buscar en Dr convallaria D A convallaria avi PA convallaria 3DAnimMax_00_A0004_ch00 tif elie Be _ convallaria lei PA convallaria 3DAnimMax_00_40004_ch01 tif Di Elementos convallaria 3DAnimMax_00_A0004_ch02 tif m dee A convallaria_3DAnirnMax_00_A0000_ch00 tif PM convallaria_3DAnimMax_00_A0005_ch00 tif convallaria 3DAnimMax 00 40000 ch ur PM convallaria 3DAnimMax 00 _A0005 ch01 tif il PA convallaria 3DAnimMax_00 A0000 ch02 tif PR convallaria 3DAnimMax D I A0005 chO2 tif m Escritorio MA convallaria_3DAnimMax_00_40001_ch00 tif PM convallaria_ 3DAnimMa
8. serie de par metros de configuraci n del equipo para la adquisici n Estos par metros se engloban dentro del apartado Instrument e incluyen entre otros Configuraci n de los detectores ganancia y offset Caracter sticas del objetivo utilizado Aumentos Apertura num rica modelo etc Rango de longitudes de onda de los filtros de detecci n En el apartado Image se engloban los siguientes par metros Fecha de adquisici n Resoluci n del pixel en x y 3 Numero de canales de la serie Tama o de la imagen en x e y en p xeles y n mero de series de la imagen tama o en z Metadata convallane lel e aE o ep lt OME xmins http www openmicroscopy org Schemas OME 20 11 06 xmins xsi http www w3 org 200 1 XMLSchema instance xsisschemaLocation http www openmicroscopy org Schemas OME 20 11 06 http www openmicroscopy org Schemas OME 201 A lt Instrument ID Instrument 0 gt lt Detector ID Detector 0 0 Type PMT gt lt Detector ID Detector 0 1 Offset 5 700000000000003 Type PMT Voltage 383 6283704572098 gt lt Detector ID Detector 0 2 Offset 2 299999999999997 Type PMT Voltage 393 30011723329426 gt lt Objective Correction Other ID Objective 0 0 Immersion Oil LensNA 1 4 Model HCX PL APO lbd BL NominalMagnification 63 SerialNumber 506 192 gt A lt Filter ID Filter 0 0 Model SP Mirror 1 gt lt TransmittanceRange Cu
9. 1 4 S1 tenemos una serie abierta y activamos la opci n Label all Slices la barra de escala aparecer en todas las im genes de la serie El texto que sale debajo de la barra de escala lo podemos poner en negrita marcando la casilla Bold Text cambiar entre dos tipos de letra marcando la casilla Serif Font o cambiar el tama o de letra escribiendo en Font Size S1 marcamos la casilla Hide text el texto desaparece y s lo veremos la barra de escala Kai Zoom Permite ampliar o reducir el tama o de la imagen activada Al pulsar este icono se activa una barra con funciones de zoom que se adosa a la derecha de la imagen activada Si pinchamos en otra imagen la barra de zoom se desplaza a la nueva imagen seleccionada MAX_Series041 Red 50 238 10238 10 m 10241024 8 bit 1MB Dentro de la barra de zoom encontramos los siguientes botones a Zoom out Pulsando este bot n se disminuye el zoom de la imagen hasta 3 1 d Reset zoom Elimina el zoom y deja la imagen a tama o real 100 Zoom in Aumenta el zoom hasta 3200 x g a D Cierra el men de zoom 18 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Cargar LUT Permite aplicar una paleta de colores a una imagen serie proyecci n Al pulsar este icono se abre la siguiente ventana Seleccionando una de las paletas de colores nuestra imagen se visualizar con esa gama de colores An
10. 30 M anual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Si deseamos hacer una proyecci n de un n mero determinado de secciones dentro de la serie podemos escribir el n mero de la imagen de inicio y de final de la proyecci n en los apartados Start slide y Stop slide respectivamente a Proyecci n 3D Permite realizar en forma de animaci n una proyecci n en Z desde distintos ngulos para tener una visi n completa de la estructura tridimensional de la muestra Para utilizar est funci n debemos trabajar con una serie de im genes Al pulsar el icono de proyecci n 3D aparece la siguiente ventana 3D Projection Projection Method ENE Kg Axis of Rotation Y Axis vj Slice Spacing m Initial Angle 0 359 degrees Total Rotation 0 359 degrees 3 Rotation Angle Increment Lower Transparency Bound Upper Transparency Bound Opacity 0 1 00 Surface Depth Cueing 0 100 Interior Depth Cueing 0 100 f Interpolate OK Cancel Projection method Nos permite elegir entre 3 m todos Nearest point Brightest Point y Mean value El m s utilizado es el Brightest Point Axis of rotation Podemos elegir entre rotar la reconstrucci n tridimensional en el eje X el Y o el Z Slide spacing es la distancia entre secciones pticas Si hemos abierto la imagen como un hyperstack con la funci n de Abrir Bioformato el programa inclui
11. 4MB Press I image gt Show info for information about this image z Al pulsar el icono MH obtendremos la imagen de la derecha con la imagen separada en tres paneles uno para cada canal UL OC Intercambiar Mover Pulsando en este bot n podemos intercambiar los paneles entre s o moverlos a una nueva posici n Para ello pulsamos con el rat n encima del panel que queremos mover nos aparece una especie de muelle con el que seleccionamos la nueva posici n soltamos el rat n y nos cambiar las posiciones de los paneles Si la posici n de destino no est ocupada por ning n panel nos mover el panel seleccionado dejando vac a la posici n que ocupaba Si queremos ampliar el tama o del montaje con nuevas posiciones llevaremos el extremo del muelle hacia uno de los bordes siempre ampliando el tama o del montaje hacia la derecha OO OO Seleccionar panel Permite seleccionar uno de los paneles del montaje Extraer Seleccionado Extrae el panel seleccionado a una nueva imagen Marcar Paneles Para marcar varios paneles seleccionaremos en la imagen del montaje el primer panel a seleccionar y pulsamos en este bot n Se nos abrir la ventana del ROI Manager en la que aparecer la referencia del primer panel seleccionado A continuaci n marcamos el siguiente panel y pulsamos el bot n add en el ROI Manager para a adirlo a la lista de paneles de este modo iremos seleccionando los paneles a mar
12. ALIZAR MON Ed ia 39 Herramientas de et 39 Herramientas de Dibujo TEE 44 Herramientas de EES 45 EE 47 REFERENCIAS aia 48 Edificio Severo Ochoa Campus de El Cristo c Fernando Bonguera s n 33006 OVIEDO Tel 985103659 Correo electr nico procesoimagenes uniovi es http www10 uniovi es spi Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Introducci n ConfocalUniovi ImageJ es una compilaci n del programa ImageJ con una serie de funciones y plugins orientadas al trabajo con im genes de Microscop a Confocal Inicialmente dirigido a visualizar y procesar im genes obtenidas con el Microscopio Confocal Leica TCS SP2 AOBS a partir de la versi n 1 3 permite trabajar con m ltiples formatos de im genes de microscopios confocales Leica Zeiss Nikon Olympus etc ImageJ es un programa de proceso y an lisis de im genes de dominio p blico open source realizado en lenguaje Java Su author Wayne Rasband 1 trabaja en el Research Services Branch National Institute of Mental Health Bethesda Maryland USA Existen versiones del programa para Windows Mac y Linux Con el paso de los a os el programa se ha visto complementado por un creciente n mero de plugins y macros desarrolladas por un gran n mero de colaboradores Estos plugins se pueden a adir a conveniencia al programa original Toda la informaci n sobre ImageJ se puede encontrar en http rsb info nih gov 1 En ConfocalUniovi Imag
13. M 4 DETECTORES tif i stack mtubulos001206 tif stack mtubulos001207 tif M RED Max tif stack mtubulos001208 tif M RESONANTE tif stack mtubulos001209 tif Piel 4 DETECTORES ZOOM tif Ed stack mtubulos001210 tif Piel 4 DETECTORES tif stack mtubulos001711 tif Piel Transmitida tif stack mtubulos001712 tif _ seq0016 jp2 stack mtubulos001713 tif 4 II M ESPECTRAL tif Nombre de archivo Stack Mtubulos001 nd2 Archivos de tipo Todoslos archivos A continuaci n nos abre la ventana de importaci n de Bio formatos en la que podremos elegir una serie de opciones a la hora de importar el fichero La explicaci n de las diferentes opciones aparece en la ventana Information cuando pasamos el cursor por el nombre de la opci n Information Metadata viewing Display metadata View stack with Hyperstack v Stack order XYCZT View stack with The type of image viewer to use when displaying the dataset Display OME XML metadata Display ROIs Possible choices are Dataset organization Memory management Group files with similar names Use virtual stack Metadata only Display no pixels only metadata e Standard ImageJ This option is deprecated i e intended for use by old macros only Please use Hyperstack instead e Hyperstack Display the pixels in ImageJ s built in 5D viewer e Data Browser Display the pixels in LOCT s multidimensional Data T Open files individual
14. PositionZ 26 1519049 1696516 TheC 0 TheT 0 TheZ 0 gt lt Plane DeltaT 0 0 ExposureTime 0 0 PositionZ 26 1519049 1696516 TheC 1 TheT 0 TheZ 0 gt i lt lt Plane DeltaT 0 0 ExposureTime 0 0 PositionZ 26 15190491696516 TheC 2 TheT 0 TheZ 0 gt e lt Plane DeltaT 1 625 ExposureTime 0 0 PositionZ 26 15190491696516 TheC 0 TheT 0 TheZ 1 gt m 10 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 F F Salvar TIFF Permite salvar como tiff la imagen seleccionada Al pulsar el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos la carpeta donde queremos guardar el fichero escribiremos el nombre del fichero y pulsaremos el bot n guardar Save as TIFF sl 2000 D 051207 E 051207_Series04 1_2006_ch00 Fil 051207_SeriesO4 1_2013_ch00 21051207 MM 051207_Series041_7006_ch01 M 051207_SeriesO4 1_2013_cho1 Documentos p 051207_Series041_2000_ch00 M 051207_Series04 1_2007_ch00 Ml 051207_Series041_2014_ch00 recientes 9 051207_Series041_2000_ch01 fll 051207_Series041_2007_ch01 fl 051207_Series041_7014_chO1 051207_Series041_2001_ch00 M 051207_Sertes041_7008_ch00 M 051207_Series041_2015_ch00 8 051207_SeriesO41_2001_ch0O1 M 051207_Seriesd41_7008_ch01 Bl 051207_Series041_7015_chO1 E 051207_SeriesO4 1_2002_ch00 fll 051207_Series041_2009_ch00 M 051207_Series041_2016_ch00 8 051207_SeriesO41_2002_ch01 M 051207_SeriesO04 1_2009_chO1 M 051207_Series041_2016_ch01 m 051207_S
15. Uniovi ImageJ zal Unit gt 1 25H BE ERRE A continuaci n se describen cada una de las funciones incluidas en el men ConfocalUniovi Para conocer el funcionamiento del men principal de ImageJ ir a la documentaci n on line de la p gina Web http rsb info nih gov 1 docs Antes de empezar a trabajar Antes de comenzar a trabajar con el programa es aconsejable definir la cantidad de memoria RAM reservada para ejecutar ImageJ Las aplicaciones Java nicamente utilizan la cantidad de memoria que se les ha reservado en ImageJ por defecto son 640 MB Para aumentar esta cantidad iremos al men principal de ImageJ y seleccionaremos Edit Options Memory and Threads Nos aparecer la siguiente ventana en la que por defecto la cantidad m xima de memoria reservada es 640 MB Maximum memory 640 Parallel threads forstacks 2 Iw Run garbage collector on status bar click OK Cancel Help Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Para cambiarla en el valor Maximun memory teclearemos la cantidad deseada En sistemas de 32 bits el valor m ximo de memoria admitido es de 1700 MB En sistemas de 64 bits la cantidad m xima de memoria depender de la memoria total instalada en el sistema Se aconseja reservar alrededor de un 75 de la memoria total del sistema Si por ejemplo tenemos 8 GB de RAM reservariamos para ImageJ 6100 MB Una vez modificada la cantidad de memoria debemos
16. ama Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Live histogram of MAX_Series041 328240 pixels RGB 308K 0 Count 1048576 Min 3 Mean 54 289086342 Max 255 StdDev 53 815310722Mode 4 107189 Value 146 List Copy Linear k Count 1129 Min Plot 0 Max Plot TEE C auto Manual Min Bin 0 Max Bin 255 Si seleccionamos el modo manual podemos cambiar las escalas del histograma Los valores Min Plot y Max Plot son para el eje Y y los valores Min Bin y Max Bin son para el eje X Al pulsar el recuadro List se abre una nueva ventana con los valores de niveles de intensidad del histograma Este listado lo podemos guardar como una tabla de datos fichero de Excel Al pulsar el recuadro Copy copiamos los valores de intensidad del histograma y podemos pegarlos en un documento de texto Word o en un fichero de datos Excel Si estamos trabajando con una serie podemos ir viendo el histograma de cada imagen de la serte Si queremos conocer el histograma de una regi n concreta de la imagen serie dibujaremos con el rat n un rect ngulo sobre la imagen y el histograma se aplicar a la regi n dibujada MAX_Series041 Red 50 29 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 A continuaci n se presentan tres herramientas para poder mejorar la calidad de las im genes mediante t cnicas de deconvoluci n La deconvoluci n es una t cnica computacional que per
17. amos data browser o hyperstack o standard imagen y desactivamos la opci n de open all series en el apartado dataset organization el programa nos presenta un men con las im genes y series contenidas en ese experimento permiti ndonos escoger la que deseamos abrir if Series 1 Series005 512 x 512 150 planes 30 x 507 Series 2 3DAnimMax 00 A0000 550 x 512 60 planes 30 x 20T Cancel Select All Deselect All Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Si en un mismo experimento tenemos gran cantidad de im genes y o Series es muy posible que el programa tarde mucho tiempo en presentarnos el men anterior o incluso se quede colgado Por esta raz n se ha mantenido la opci n de Leer im genes del Confocal Leica ya que en estos casos las abre m s r pidamente y no se queda colgado Para leer los metadatos de un experimento es aconsejable seleccionar la opci n Display OME XML metadata Esta opci n visualiza los metadatos en forma de rbol seg n el modelo de datos del Open Microscopy Enviroment OME La estructura de este fichero es siempre la misma independientemente del formato del fichero de imagen En un primer nivel se presentan los datos de Configuraci n del equipo lt Instrument ID Instrument 0 gt Imagen adquirida con esa configuraci n lt Image ID Image 0 Name Series005 gt Cada imagen o serie de im genes adquiridas llevar asociados una
18. ation View Help gt File Edit Select Transformation View Help Volume Orthoslice Surface Para variar la vista del objeto utilizaremos las siguientes combinaciones de herramientas de ImageJ y botones del raton Mover el rat n pulsando el bot n izq Desplazar i Pulsar la tecla shift y mover el rat n pulsando el bot n 1zq Mover la rueda del rat n Mover el rat n pulsando el bot n 1zq 35 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Podemos cambiar las secciones visualizadas en modo Orthoslice pulsando en Edit Ajust Slices Nos aparece el siguiente men con el que podemos variar cada una de las secciones en los planos yz xz y Xy k 33 l Adjust slices Y Show yz plane xcoordinate lt t 444 Y Show xz plane y coordinate lt t 417 Iw Show xy plane zcoordinate lt t 42 You can use the x y and z key plus the arrow keys to adjust slices in x y and z direction respectively X yY Z SPACE switches planes on and off OK Cancel Podemos usar tambi n las teclas r pidas manteniendo pulsadas las teclas x y o z y moviendo la rueda del rat n o las flechas del teclado Cuando tenemos m s de un contenido visualiz ndose simult neamente podemos rotar simult neamente todos los contenidos o uno de ellos Para rotar un contenido pulsaremos sobre l para seleccionarlo y nos aparecer un recuadro marcando el contenido Si realizamos la operaci n de rotar
19. car Cada panel marcado aparecer con un recuadro azul 40 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 0256 1280 0256 0768 0768 0256 Update Delete Measure Deselect Properties Flatten F 7 Show All Edit Mode ml Extraer Paneles Marcados Pulsando en este bot n extrae los paneles marcados a una nueva imagen en forma de stack Las im genes en el stack aparecen en el orden en que seleccionamos los paneles Los dos botones anteriores nos permiten extraer en una serie de im genes stack aquellas secciones que nos interesan para crear una nueva serie Si tenemos el siguiente montaje de una serie de imagenes de Microscop a Confocal y nos interesa extraer las secciones 8 a la 21 haremos lo siguiente weg 7 Montage of SE Series005 16 7 831 71 950 52 microns 3584x4096 RGB 56MB 4 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Seleccionamos las im genes que deseamos con el bot n Marcar Paneles pulsamos en el bot n Extraer Paneles Marcados y obtendremos una nueva serie con las im genes GE seleccionadas que podemos visualizar como un nuevo montaje pulsando el icono ME montage A AA AAA WEB Extracted Panels of Montage of C1 convallariaei Series005 33 3 2048 00x2048 0Qokxels 2048x2048 RGB 16MB _ C Copiar Copia al portapapeles el panel seleccionado tecla de acceso r pido c P Pegar P
20. eJ se han agrupado junto al programa ImageJ una serie de plugins de gran utilidad para el proceso de im genes de confocal Todas las funciones del programa se agrupan en una interface gr fica con un conjunto de botones que facilitan su utilizaci n por los usuarios Instalaci n ConfocalUniovi ImageJ incluye la versi n para Windows de ImageJ Para su instalaci n se necesita un ordenador con Windows 2000 XP Vista o 7 con 512 Mb de RAM Existe versi n tanto para Windows 32 bits como para 64 bits Se recomienda instalar la versi n de 64 bits en aquellos ordenadores que cuenten con este sistema operativo Se puede descargar de la p gina web de la Unidad de Microscop a Fot nica y Proceso de Im genes de la Universidad de Oviedo http www sct uniovi es index php option com_content amp task view amp id 224 amp Itemid 145 Una vez descargado el fichero setup_Confocal Uniovi ImageJ exe lo ejecutaremos y comenzar su instalaci n Nos aparece la pantalla siguiente Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 y Instalar ConfocalUniovi Bienvenido al asistente de instalaci n de ConfocalUniovi Este programa instalar ConfocalUniovi ImageJ 1 0 en su sistema Se recomienda que cierre todas las dem s aplicaciones antes de continuar Haga clic en Siguiente para continuar o en Cancelar para salir de la instalaci n Pulsaremos siguiente y nos preguntar por e
21. ega el contenido del portapapeles en el panel seleccionado tecla de acceso r pido v Cuando trabajamos con im genes de varios canales por ejemplo varios marcadores fluorescentes podemos copiar la imagen de un canal y pegarla en el panel donde se representa otro canal La resultante ser la suma de ambos canales 42 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Con estos dos botones podemos hacer montajes de marcadores fluorescentes a la carta representando cada marcador por separado los marcadores dos a dos y la suma de todos los marcadores como aparece en la imagen siguiente 1536 00x1024 00 pixels 1536x1024 RGB 6MB Pegar contenido del portapapeles en un panel Pega el contenido del portapapeles en el panel seleccionado en el montaje El contenido del portapapeles puede ser una imagen del propio montaje o cualquier otra imagen que hayamos abierto con ImageJ y la hayamos copiado al portapapeles orescentCells tif 50 1536 00x1024 00 pixels 1536x1024 RGB 6MB 43 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 BA Borrar panel seleccionado Borra el contenido del panel que previamente hayamos seleccionado La aplicaci n de montaje no tiene opci n de deshacer por lo que cualquier operaci n que realizamos no tiene vuelta atr s Las anteriores opciones del panel de montaje nos permiten manipular las im genes del panel Las opciones que se descr
22. eh ASTURIAS ce CAMPUS DE EXCELENCIA K INTERNACIONAL ja AD FUTURUM lad ae Oviedo Manual de usuario del programa Confocal Uniovi ImageJ Version 1 4 Ara Lee 13 20 127 63x118 82 m 550x512 RGB 21MB ngel Mart nez Nistal Marta Alonso Guervos SERVICIOS CIENT FICO T CNICOS Servicio de Microscop a Fot nica y Proceso de Im genes Edificio Severo Ochoa Campus de El Cristo c Fernando Bonguera s n 33006 OVIEDO Tel 985103659 Correo electr nico procesoimagenes uniovi es http www10 uniovi es spi m ASTURIAS ce CAMPUS DE EXCELENCIA INTERNACIONAL AD FUTURUM NDICE INTRODUCCION acaricio 1 INSTALACI N EN 1 FUNCIONAMIENTO cias 5 ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR EEN 5 LEER IMAGEN DEL CONFOCAL LEICA Ee 6 LEER IMAGEN DE CUALQUIER MICROSCOPIO BIOFORMATO ccccccccccccccesessseeeccecccceeeeeeueeeesseeeeceeceeeeauensseeeeers 7 SALVAR H ai 11 CERRAR IMAGENES A o EE PR EEE 11 DOP GAR IMAGEN risas aaa 11 ESCALAR IMAGEN Ee 13 SELECCIONAR RO ratico 14 EE 15 PINTAR BARRA DE ESCALA EE 17 ZOON E 18 CARO EE 19 ANIMAR SERIES eege 19 SEPARAR BANDAS COLO Rca iaa 21 MEZCLAR BANDAS COLOR a ata 21 AJUSTAR NIVEL GRIS aa 22 Eege 23 FISTOGRAMAINTERACIIVO EE 24 Ee 26 DECONVOLUCION 2 D na e ases 27 DECON VO TUCI N MO sans 29 PROC elle 30 PROYECCION SD NEEN 31 SECCIONES ORTOGONALES E 32 PAR ESTEROS CO J C8 andanada dba 33 VISOR DE IM GENES 30 aaa 34 PEGARIMAGENES EE 37 RE
23. el factor de aumento o reducci n que queremos aplicar Cuando se trata de im genes cuadradas los valores de Xscale o Yscale ser n iguales lo mismo sucede con los valores de ancho width y altura he1ght En caso de que estemos aumentando el n mero de p xeles de la imagen debemos indicar s1 queremos que los p xeles se creen como interpolaci n de los existentes con sus vecinos m s pr ximos bilinear o c bica o no queremos interpolaci n none S1 la casilla Create new window est activada la nueva imagen aparecer en una nueva ventana Si se desactiva esta opci n la imagen original se elimina y s lo aparecer la imagen escalada 13 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 X Scale Y Scale Width pixels Height pixels Interpolation Bilinear w Fill with Background Color Iw Create new window MAX_Series041 R OK Cancel Title Es Seleccionar ROI Permite seleccionar una regi n de inter s ROI del ingl s region of interest en nuestra imagen o serie Al pulsar este icono aparece un mensaje en la pantalla para duplicar la imagen con el fin de que al extraer la regi n de inter s no perdamos la imagen original Title Seri es005 Red 1 OK Cancel Una vez duplicada la imagen aparece el siguiente mensaje Selecciona una herramienta marca la region de Inter s y pulsa OK
24. en de la animaci n TTT HTH Delete slice elimina la imagen de la ventana Add slide a ade una imagen en negro Duplicate slide duplica la imagen de la ventana Cierra el men de animar series 20 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 S Separar bandas color Permite separar una imagen RGB en tres im genes independientes rojo verde y azul Cuando hemos abierto una imagen en formato Hyperstack con varios canales esta funci n nos permite separar cada uno de los canales en un stack individualizado Ch Mezclar bandas color Genera una imagen mezcla a partir de im genes de bandas de colores distintos Esta funci n permite mezclar im genes de dos o tres fluorocromos distintos en una nica imagen Por ejemplo si tenemos las tres im genes siguientes 8 FluorescentCells jpg blue REX 512x512 pixels 8 bit 256K 512x512 pixels 8 bit 256K 612x512 pixels 8 bit 256K pr red FluorescentCells jpg gree Si pies Merge LS Red FluorescentCells jpg red Green FluorescentCells jpg green Blue FluorescentCells jpg blue Gray None Create Composite lv Keep Source Images OK Cancel Se seleccionara para cada color el nombre de la imagen correspondiente En nuestro ejemplo queremos mezclar una imagen roja una verde y una azul y no tenemos imagen gris La imagen resultante es la si
25. erdo pulsaremos el bot n de Instalar Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 el Instalar ConfocalUniovi Listo para Instalar Ahora el programa est listo para iniciar la instalaci n de ConfocalUniovi en su sistema Haga clic en Instalar para continuar con el proceso o haga clic en Atr s si desea revisar o cambiar alguna configuraci n Carpeta de Destino a CG maged Carpeta del Men Inicio ConfocalUniovi ImageJ Tareas Adicionales Iconos adicionales Crear un icono en el escritorio Una vez finalizado el proceso de instalaci n nos aparece la siguiente ventana indic ndonos que se complet con xito la instalaci n Completando la instalaci n de ConfocalUniovi E programa complet la instalaci n de ConfocalUniovi en su sistema Puede ejecutar la aplicaci n haciendo clic sobre el icono instalado Haga clic en Finalizar para salir del programa de instalaci n S1 durante la instalaci n hemos seleccionado la opci n correspondiente al finalizar la instalaci n en el escritorio nos aparecer un icono para acceder directamente al programa M anual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Funcionamiento Al arrancar el programa nos aparecen dos men s l El general de ImageJ File Edit Image Process Analyze Plugins Window Help EE ETGEN Qval elliptical or brush selections right click to switch 2 El que contiene las funciones de Confocal
26. eries041_2003_ch00 M 051207_Series04 1_2010_ch00 M 051207_Series041_7017_ch00 E 051207_SeriesO41_2003_ch01 M 051207_Series041_2010_ch01 M 051207_Series041_2017_ch01 9 051207_Series041_z004_ch00 M 051207_Sertes041_7011_ch00 M 051207_Series041_7018_ch00 9 051207_Series04 1_2004_chO1 M 051207_Series041_2011_chO1 M 051207_SeriesO41_2018_chO1 MM 051207_Series041_2005_ch00 MM 051207_SeriesO41_2012_ch00 M 051207_Series041_2019_choa MM 051207_Series041_2005_ch01 M 051207_Series041_2012_ch01 9051207_Series041_2019 chO1 lt gt Nombre de archivo kc dete Tos bs aco Ces Guardar en 2007 12 05 Convalllaria Si el fichero es una serie de im genes se salvar toda le serie en un nico fichero de imagen x Cerrar imagenes Al pulsar sobre est icono se cierran todas las imagenes abiertas PARA Duplicar imagen Permite duplicar el fichero seleccionado ya sea una serie o una nica imagen Si tenemos seleccionada la ventana de una imagen al pulsar el bot n se abrira la siguiente ventana 11 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Duplicate Series041_z004_ch01 1 08 OK Cancel Escribiremos un nombre de la nueva imagen o dejaremos el que nos asigna el programa por defecto pulsaremos OK y se creara una copia de la imagen S1 tenemos seleccionada la ventana de una serie al pulsar el bot n se abrira la siguiente ventana Duplicate l Duplicate Stack
27. f Health MD 1997 2010 http rsb info nih gov ij 2 Melissa Linkert Curtis T Rueden Chris Allan Jean Marie Burel Will Moore Andrew Patterson Brian Loranger Josh Moore Carlos Neves Donald MacDonald Aleksandra Tarkowska Caitlin Sticco Emma Hill Mike Rossner Kevin W Eliceiri and Jason R Swedlow 2010 Metadata matters access to image data in the real world The Journal of Cell Biology Vol 189no 5777 782 doi 10 1083 jcb 201004104 3 Bob Dougherty Diffraction PSF 3D http www optinav com imagej html C digo de campo cambiado 4 Piotr Wendykier Parallel iterative deconvolution https sites google com site piotrwendykier softtware deconvolution parallelitera tivedeconvolution 5 Benjamin Schmid Johannes Schindelin Albert Cardona Mark Longair and Martin Heisenberg A high level 3D visualization API for Java and ImageJ BMC Bioinformatics 2010 11 274 6 S Preibisch S Saalfeld P Tomancak 2009 Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions Bioinformatics 25 11 1463 1465 48
28. gt jw Dark background Auto Apply Reset set 23 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Moviendo las barras buscaremos los mejores valores de segmentaci n para nuestra imagen El recuadro senalado en rojo nos permite escoger entre diferentes m todos de segmentacion En el recuadro se alado en azul seleccionaremos la opci n B amp W La opci n Dark background debe estar activada Los botones inferiores en la ventana permiten Auto Se aplica autom ticamente el m todo de segmentaci n elegido en la ventana anterior Reset elimina los cambios realizados Set permite escribir el valor m nimo y el valor m ximo de segmentaci n para la imagen serie Apply aplica los cambios realizados sobre la imagen serie Una vez ajustados los valores de segmentaci n pulsaremos el bot n Apply y se abrir una nueva ventana Convert to Mask Convert all images in stack to binary Calculate Threshold for Each Image Deberemos activar la opci n Dark background y pulsar OK El resultado final de segmentaci n ser una imagen binaria en la que el fondo tiene un valor de 0 y la se al de inter s tiene un valor de 255 Leg Histograma interactivo Permite conocer el histograma de intensidad de se al de nuestra imagen Podemos aplicarlo a toda la imagen o a una regi n concreta de la imagen Al pulsar el icono aparece la siguiente ventana 24 Manual del progr
29. guiente 21 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 A RGB 6 50 IN les 1512512 pixels RGB 1MB Si se tiene una imagen de transmisi n o de contraste de fases se incluir dicha imagen en el campo correspondiente a imagen gris Seleccionando la opci n Keep Source Image las im genes originales de cada color no se eliminan de la pantalla Con esta funci n podemos mezclar im genes individuales o series Si tenemos un hiperstack y queremos mezclar sus canales debemos utilizar primero la funci n separar bandas de color y a continuaci n la de mezclar bandas de color lt Ajustar Nivel Gris Permite realizar un ajuste del brillo y contraste de la imagen o serie Al pulsar el icono se abre la siguiente ventana 22 M anual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Minimum Maximum Brightness Contrast Moviendo las barras buscaremos el mejor ajuste de brillo y contraste para nuestra imagen Los botones inferiores en la ventana nos permiten Auto ImageJ aplica automaticamente el ajuste de niveles de gris que el programa cree adecuado para la imagen Reset elimina los cambios realizados Set permite escribir el valor m nimo y el valor maximo de intensidad para la imagen serte Apply aplica los cambios realizados sobre la imagen serie 5 Segmentaci n Permite trasformar nuestra imagen o serie en una imagen binaria O ean
30. iben a continuaci n nos van a permitir realizar dibujos y anotaciones sobre el panel de im genes Los dibujos y anotaciones se realizan en overlay sin alterar el contenido de la imagen que hay debajo Para dibujar debemos seguir el siguiente proceso e Elegir las opciones de la herramienta que deseamos utilizar e Seleccionar la herramienta de dibujo y dibujar sobre el panel e A adir el dibujo al Overlay pulsando el icono de herramientas de Overlay As para marcar con una flecha un elemento de una imagen iremos a las opciones de flecha y definiremos el formato de la flecha i Width lt Size 4 Color red e Style Filled y Double headed OK Cancel A continuacion seleccionaremos la herramienta flecha y dibujamos la flecha finalmente para fijarla en la posici n deseada pulsamos el icono Herramientas de Dibujo Flecha Dibuja una flecha en el panel seleccionado Flechas sincronizadas Si previamente hemos dibujado una flecha en uno de los paneles al pulsar en este icono nos copia la flecha en todos los paneles del montaje RSR A me Cruces sincronizadas Marca una cruz en cada uno de los paneles del montaje 44 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Anotar Esta herramienta permite asignar una letra a cada uno de los paneles del montaje Texto Permite escribir texto sobre los paneles de la imagen A adir bordes Dibuja los bordes de los
31. iempo 1 imagesum2 50 113 1701x1025 pixels 8 bit 5MB 4 It I Una vez mostrada la imagen resultante si tenemos m s im genes para pegar el programa pedir que abramos la siguiente y la pegar al mosaico de las dos anteriores 38 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 H Image zum 50 2513x1072 pixels RGB 10MB Este proceso se repetira hasta que haya pegado todas las imagenes Cuando se trata de realizar mosaicos compuestos de varias filas de imagenes hay que realizar los mosaicos de cada fila individualmente y posteriormente juntarlos Esta funcion utiliza el pluging Stitching desarrollado por S Preibisch S Saalfeld P Tomancak 6 SE i Realizar Montaje Utiliza el pluging Magic Montage para crear montajes de series de im genes o im genes RGB Pulsando en el bot n se abre el siguiente men Herramientas de Montaje E Crear Montaje Crea un montaje de la imagen seleccionada separando las distintas bandas o stacks en paneles Por ejemplo si seleccionamos la siguiente imagen de la izquierda fluorescentCells tif 39 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 E d FluorescentCells tif ar MS EE 3 3 Blue 518x512 pixels 8 bit 768K FE Montage of FluorescentCells tif 50 1024 00x1024 00 pixels 1024x1024 RGB
32. imar series Permite observar una serie en forma de animacion Al pulsar este icono se activa una barra que se adosa a la derecha de la imagen activada S1 pinchamos en otra imagen la barra se desplaza a la nueva imagen seleccionada Bec gt gt U amp YVAROE EI En la barra de animar series encontramos los siguientes botones 19 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 gt Start animation pulsar para empezar la animaci n Stop animation pulsar para parar la animaci n Animation options abre una nueva ventana en la que podemos definir las opciones de la animaci n Animation Options Speed 0 1 1000 fps 10 First Frame E LastFrame 30 i Y Loop Back and Forth l Start Animation OK Cancel Podemos modificar la velocidad de la animaci n Speed imagenes por segundo y tambi n indicar cu l ser la primera imagen First Frame y la ltima Last Frame Si activamos la opci n Loop Back and Forth la animaci n ira del inicio al final y del final al inicio efecto ping pong Si se alamos la opci n Start animation la animaci n se activar inmediatamente al pulsar la casilla OK K Go to first slice abre la primera imagen de la animaci n Previous slice abre la imagen anterior de la animaci n Next slice abre la imagen siguiente de la animaci n Last slice abre la ltima imag
33. l directorio de instalaci n Dejaremos el que nos aparece por defecto que ser c limageJ y pulsaremos siguiente i ra Conocio O Seleccione la Carpeta de Destino D nde debe instalarse ConfocalUniovi A E programa instalar Confocal Uniovi en la siguiente carpeta Para continuar haga clic en Siguiente Si desea seleccionar una carpeta diferente haga clic en Examinar lt StS Se requieren al menos 107 4 MB de espacio libre en el disco Nos preguntar d nde colocar los accesos directos del programa Dejaremos por defecto ConfocalUniovi ImageJ y volveremos a pulsar siguiente Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Seleccione la Carpeta del Men Inicio D nde deben colocarse los accesos directos del programa E programa de instalaci n crear los accesos directos del programa en la siguiente carpeta del Men Inicio Para continuar haga clic en Siguiente Si desea seleccionar una carpeta distinta haga clic en Examinar Confocal Uniovi ImageJ Si deseamos crear un icono de acceso directo en el escritorio marcaremos la opci n correspondiente Seleccione las Tareas Adicionales Qu tareas adicionales deben realizarse Seleccione las tareas adicionales que desea que se realicen durante la instalaci n de ContocalUniovi y haga clic en Siguiente Iconos adicionales Crear un icono en el escritorio Finalmente se nos presentar n las opciones elegidas y si estamos de acu
34. l programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Fie Edit Image Process Analyze Plugins Window Help alo GON 4 13 4 aJ0 Oz AL m 0 gt Esta funcion utiliza el pluging 3D Viewer desarrollado por Benjamin Schmid Albert Cardona Mark Longair Johannes Schindelin 5 Ena Pegar im genes Esta funci n permite pegar im genes consecutivas para formar una nica imagen mosaico de im genes Las im genes deben de tener una parte com n para que el programa realice la uni n de forma correcta Al pulsar en el icono nos aparece un mensaje pidi ndonos el n mero de im genes a pegar y el n mero de la primera imagen de la serie N mero de im genes 3 Primera imagen de la serie 1 OK Cancel A continuaci n nos pedir que abramos la primera imagen del mosaico Abre imagen 1 del mosaico ok Se Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Pulsaremos OK y seleccionaremos la primera imagen a continuaci n nos pedir abrir la imagen siguiente que compone el mosaico Esta imagen debe de tener una parte en com n con la primera Looe z eeler CS a gt 1400 171499 27 m 1024r 0 Bl 2 m1 t 102411024 RGB 4M5 Una vez abierta la segunda imagen el programa iniciar la funci n de pegado Deberemos esperar hasta que nos aparezca la imagen resultante dependiendo del tama o de las im genes y de la potencia del ordenador este proceso puede llevar su t
35. ly Specify range for each series T Swap dimensions I Crop on import T Open all series IT Concatenate series when compatible Split into separate windows Stitch tiles Split channels IT Split focal planes e Split timepoints El primer conjunto de opciones se refiere al tipo de datos del fichero que queremos visualizar metadatos im genes y el modo en que los visualizaremos S1 seleccionamos Hyperstack y marcamos Display metadata se nos abrir una ventana con los metadatos del fichero bits por pixel tama o de imagen n de canales objetivo utilizado para tomar la imagen l neas de l ser etc junto con una ventana que contiene un hyperstack En el caso de una serie de varias im genes de tres canales de Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 fluorescencia la primera de las barras nos permite movernos en los distintos canales y la segunda entre las distintas secciones del canal seleccionado 0 2 37 21 29 CH 221 29 Stack Mtubulos001 nd2 series 13 61 741 724 microns 512512 BitsPerPixel DimensionOrder Isinterleaved ISRGB LittleEndian PixelType Series O Name sizeC sizeT Sizex SizeY sizeZz Average AverageToQuality Canales M I La la zm zs Aje zz ss zs zk i 4 Secciones Cuando el Bioformato almacena varias imagenes de un mismo experimento o sesi n por ejemplo los formatos lei y lif de Leica y seleccion
36. media se refiere al ndice de refracci n del medio de inmersi n utilizado Para objetivos de inmersi n en aceite es de 1 520 La apertura num rica del objetivo la tendremos en el fichero de metadatos en este caso NA 1 4 Wavelength es el valor en nan metros de la longitud de onda de excitaci n Si la imagen a deconvolucionar es una imagen de fluorescencia marcada con FITC la longitud de onda es 488 nm El valor de Longitudinal Spherical Aberration lo dejaremos a 1 00 El image pixel spacing es la resoluci n del pixel de la imagen en x e y Seg n el fichero de metadatos de nuestro ejemplo el valor ser a 0 232 micras pero como hay que ponerlo en las mismas unidades que la longitud de onda de excitaci n el valor ser 232 00 nm Slice spacing Z es la distancia entre cada secci n en nuestro caso 0 936 micras o lo que es lo mismo 936 nm With pixels y Eight pixels son las dimensiones en p xeles de la imagen a deconvolucionar y Depth slices el n mero de secciones de la imagen El par metro normalization lo dejaremos con el valor que tiene por defecto y finalmente le daremos un nombre a la imagen de la PSF que vamos a generar por ejemplo PSF Cuando en vez de una serie de im genes queremos deconvolucionar una nica imagen en el valor de Slice Spacing debemos poner 0 y en Depth Slices 1 Una vez calculada la PSF procederemos a deconvoluci
37. mite cambiar el tama o de selecci n de paneles Width 2 Height 2 OK Cancel El par metro Width indica el n mero de paneles a lo ancho en los que se dividir nuestro montaje El par metro Height define el n mero de paneles a lo alto Por ejemplo si tenemos un montaje de 4 im genes 2 x 2 y definimos un tama o de selecci n de Width 2 Height 2 cada imagen va a ser un panel Si cambiamos el tama o de selecci n y ponemos Width 1 Height 2 tendremos un montaje con nicamente 2 paneles uno arriba y otro abajo Cada panel ocupar dos im genes Las herramientas de Overlay son A ade el dibujo al Overlay Borra el Overlay oO Oculta el Overlay M Muestra el Overlay Con la utilizaci n de las opciones vista anteriormente podemos realizar montajes como el siguiente 46 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 m d Montage of MAX SE Mengen EE BW x Ea a 377 46x251 64 microns 3072x2048 RGB 24MB Celula a IJ Pulsando este icono desaparece el menu general de ImageJ y s lo queda en pantalla el men que contiene las funciones de ConfocalUniovi ImageJ S1 queremos volver a activar el men general de ImageJ pulsaremos de nuevo en el icono 47 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Referencias 1 W S Rasband ImageJ U S National Institute o
38. mite corregir parcialmente las distorsiones causadas en la imagen por el microscopio atenuando la luz fuera de foco e incrementando la resoluci n de la imagen Para poder deconvolucionar una imagen necesitamos conocer su Point Spread Function PSF La PSF es el modelo tridimensional de difracci n de la luz emitida por un punto infinitamente peque o en el esp cimen transmitido al plano de imagen a trav s de un objetivo con alta apertura num rica PSF o Calcula la PSF Esta funci n utiliza el pluging Diffraction PSF 3D escrito por Bob Dougherty 3 Calcula la PSF te rica de una imagen para poder realizar su deconvoluci n Pulsando en este icono nos aparecer la siguiente ventana Rayleigh resolution 0 6 lambda NA Index of refraction of the media Numerical Aperture n sin theta Wavelength perhaps in nm Longitudinal Spherical Aberration at max aperture same units Image pixel spacing same units ccd cell spacing magnification Slice spacing 7 same units Width pixels Height pixels Depth slices 50 Normalization Sumofpixelvalues 1 e Title PSF T PSF in dB Para rellenar la mayoria de los parametros que se nos piden necesitamos abrir el fichero de metadatos del experimento ver Leer bioformato en el que se incluyen las caracter sticas de adquisici n de la imagen que queremos deconvolucionar 26 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 El valor de Index of refraction of the
39. n el pluging Parallel iterative deconvolution de Piotr WendyKier 6 MO y E Proyecci n Z Permite realizar una proyecci n en Z a partir de una serie de im genes Al pulsar el icono de proyecci n Z aparece la siguiente ventana _ ZProjection x Start slice 1 Stop slice 30 Projection Type Max Intensity OK Cancel En la opci n Projection Type podemos seleccionar entre varios tipos de proyecciones Average Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el valor medio de cada columna Max Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el p xel de valor m ximo de cada columna Min Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el p xel de valor m nimo de cada columna Sum Slides cada pixel de la proyecci n corresponde con la suma de los valores de los p xeles de esa columna La imagen resultante es una imagen de 32 bits por p xel para que los valores de la imagen resultante puedan ser superiores a 255 Standard Deviation cada pixel de la proyecci n corrresponde a la desviaci n standard de los p xeles de esa columna La imagen resultante es una imagen de 32 bits por p xel para que puedan tener p xeles con valores decimales Median cada pixel de la proyecci n corresponde al valor de la mediana de los p xeles de esa columna El tipo de proyecci n m s utilizado habitualmente es el Max intensity
40. n se muestra la misma imagen antes y despu s de deconvolucionar Se puede apreciar claramente la mejora en la nitidez de la imagen 28 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 l En j 4 C1 convallaria lei Series Uache C1l convallaria_deblurred eS 118 82x118 82 microns 256x256 8 bit 64K 256x256 pixels 32 bit 256K 30 DE cow Deconvoluci n 3D Seleccionaremos esta opci n si deseamos realizar la deconvoluci n para una imagen en 3D de la muestra compuesta de una serie de im genes en Z Como en el caso anterior previamente debemos realizar la PSF de la imagen En este caso la PSF ser un stack de Im genes El men de deconvoluci n 3D es id ntico al de la deconvoluci n en 2D En el campo Image seleccionaremos la imagen a deconvolucionar en el PSF la imagen de la PSF el resto de par metros se aconseja poner los mismos que para la 2D A continuaci n se muestra una imagen 3D antes y despu s de realizar la deconvoluci n T o X 29 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 El proceso de deconvoluci n en 3D precisa de un gran n mero de recursos computacionales por lo que para su uso es aconsejable contar con un ordenador con sistema operativo de 64 bits y al menos 4 GB de memoria RAM debiendo reservarse para el programa Image J las Y partes de la memoria disponible Las funciones Deconvoluci n 2D y 3D utiliza
41. onar la imagen Dependiendo de que se trate de una nica imagen o de una serie de im genes en Z optaremos por la opci n de 2D Deconvoluci n o 3D deconvoluci n DO DE EON Deconvoluci n 2D Si la imagen a deconvolucionar corresponde a un solo plano elegiremos esta opci n Al pulsar sobre el icono nos aparecer el siguiente men 2I Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Ci convallaria lei Series005 PSF Spatially variant PSF Method WPL Options Preconditioner FFT preconditioner Tolerance 0 0 Boundary Reflexive Resizing Auto Output Float 32 bit Precision Double Max number of iterations 20 Show iterations Max number of threads power of 2 2 En el campo Image seleccionaremos el nombre de la imagen a deconvolucionar En el campo PSF seleccionaremos el nombre de la imagen que contiene la PSF correspondiente a la imagen a deconvolucionar ver Calcula la PSF Ambas imagenes tiene que estar abiertas Para el resto de parametros se aconseja utilizar los siguientes valores 3 4 5 6 ER 8 9 1 0 Method WPL Preconditioner FFT preconditioner Tolerance 0 0 Boundary Reflexive Resizing Auto Output Float 32 bit Precision Double Max number of iterations entre 5 y 20 Max number of threads 2 Pulsamos en el bot n Deconvolve y obtendremos la imagen deconvolucionada A continuaci
42. paneles del montaje Si previamente no hemos seleccionado las opciones de bordes nos dar un error A adir barra de escala Permite a adir una barra de escala al montaje Las im genes del montaje deben de estar calibradas para que la barra de escala aparezca en unidades reales micras mm En el men Scale Bar seleccionaremos el tama o de la escala y su posici n en el panel WA ba microns 20 La opci n de barra de escala es la nica que se dibuja Heightin pixels 12 sobre el montaje de la imagen y no sobre el overlay ES Una vez que la hayamos dibujado no podremos eliminarla salvo que borremos el panel sobre el que se Color White encuentra Background None v Location Lower Right jw Bold Text Hide Text Serif Font OK Cancel Herramientas de Opciones Opciones de flecha cos Tipo de fuente Determina la fuente de texto utilizada en las herramientas anotar y texto an Opci n de anotaci n En el men de opciones de anotaci n definiremos las letras que vamos a usar para anotar cada panel as como la posici n en la que se colocar n Labels ABCDEF Lowercase labels if Resetlabel counter Position Lower lett OK Cancel 45 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 HH Opciones de bordes Permite elegir el color y el grosor utilizados en la herramienta a adir bordes m Definir tama o de selecci n Esta herramienta per
43. r de forma autom tica este valor Si no lo hubiese hecho podemos obtenerlo busc ndolo en el fichero de metadatos Initial angle indicaremos el ngulo donde queremos iniciar la animaci n Total rotation indicaremos los grados totales de la animaci n Rotation angle increment indicaremos el incremento en ngulos entre una posici n y la siguiente 31 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Los par metros de Lower transparency bound Upper transparency bound y Opacity est n relacionados con la intensidad de los pixels en la reconstrucci n 3D Se recomienda dejar los que aparecen por defecto Surface Depth Cueing y Interior Depth Cueing Dejar el dato que aparece por defecto s lo se aplica en series con un gran n mero de secciones pticas Interpolate Si marcamos esta casilla el programa genera la informaci n entre planos obteniendo una reconstrucci n 3D de mayor calidad Si la dejamos sin marcar los p xeles correspondientes a zonas entre planos aparecen en negro Es aconsejable utilizar esta opci n aunque el proceso de reconstrucci n sea m s lento a q Secciones ortogonales Permite realizar secciones ortogonales de un volumen de una serie de forma interactiva desplaz ndose en cualquier eje sobre la serie y pudiendo capturar las im genes obtenidas Para utilizar est funci n debemos trabajar con una serie de im genes
44. tadatos la calibracion de la imagen y no es necesario realizar esta operacion 16 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 Pintar barra de escala Con esta funci n podemos incluir una barra de escala en una imagen serie proyeccion Primero debemos haber calibrado la imagen de trabajo siguiendo las instrucciones explicadas en el apartado anterior Calibrar imagen o bien haber abierto una imagen ya calibrada Al pulsar el icono se abrir la siguiente ventana ScaleBar Plus Eg Width in m Height in pixels H Font Size 28 Color White v Background None v Location Lower Right Y Y Bold Text Hide Text Serif Font Label all Slices OK Cancel Escribiremos en with in m la longitud de barra de escala que deseamos a adir a nuestra imagen serie proyeccion y en Hight in pixels el grosor de la barra de escala En Location podemos escoger la posici n donde colocar la barra de escala upper 29 66 right lower right lower left upper left La opci n at selection no funciona _ Series041 Red G 50 4 30 1024 00x235 52 micras 1024x1024 8 bit 30MB El color de la escala ser el de la paleta de colores LUT que tenga la imagen seleccionada por tanto las opciones Color y Background de la escala no tienen utilidad y es preferible dejarlas como aparecen por defecto 17 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n
45. tin 500 CutOut 535 gt A lt Filter ID Filter 0 1 Model SP Mirror 2 gt io lt TransmittanceRange CutIn 678 CutOut 730 gt lt Filter ID Filter 0 2 Model SP Mirror 3 gt lt Instrument ID Instrument 1 gt lt Image ID Image 0 Name Series005 gt lt AcquiredDate gt 2013 08 19T 16 15 01 lt AcquiredDate gt lt Description gt lt InstrumentRef ID Instrument 0 gt lt ObjectiveSettings ID Objective 0 0 gt gt de lt Pixels DimensionOrder XYCZT ID Pixels 0 PhysicalSizeX 0 23206075032552084 PhysicalSizeY 0 23206075032552081 PhysicalSizeZ 0 936 1771409964182 SizeC 3 SizeT 1 SizeX 512 SizeY 512 SizeZ 50 Type uint8 gt 8 AN lt Channel ID Channel 0 0 Name FITC PinholeSize 114 41860465116278 SamplesPerPixel 1 gt lt DetectorSettings ID Detector 0 0 gt lt LightPath gt 1 lt EmissionFilterRef ID Filter 0 0 gt a A lt Channel ID Channel 0 1 Name PROPIDIUM IODIDE PinholeSize 114 41860465116278 SamplesPerPixel 1 gt lt DetectorSettings ID Detector 0 1 gt Ji lt LightPath gt ion lt EmissionFilterRef ID Filter 0 1 gt a lt Channel ID Channel 0 2 PinholeSize 114 41860465116278 SamplesPerPixel 1 gt lt DetectorSettings ID Detector 0 2 gt lt LightPath gt i lt BinData races false Length 0 xmins http www openmicroscopy org Schemas Binar yFile 2011 06 gt i lt Plane DeltaT 0 0 ExposureTime 0 0
46. ualquier serie de im genes que tengamos abierta e Name El nombre de este contenido en el visor Puede haber m s de un contenido visualiz ndose simult neamente e Display as M todo de visualizaci n del volumen Tenemos tres opciones o Volume La imagen se visualiza como un volumen con la informaci n de todos los p xeles en el espacio tridimensional o OrthoSlice Se visualizan tres secciones ortogonales x y z o Surface Se visualiza un volumen renderizado e Color Permite seleccionar el color en el que queremos visualizar el objeto e Threshold En caso de que elijamos la opci n surface indica la porci n de volumen que se visualiza en funci n de su intensidad Las zonas del volumen que tienen una intensidad por debajo del valor de Threshold no se visualizan e Resampling factor Es el factor por el que la serie de imagenes es remuestreada para realizar la renderizaci n Un factor de 1 utilizar todas las secciones para renderizar un factor de 3 utilizar 1 de cada 3 secciones en la renderizaci n Cuanto menor es este factor m s exacta es la renderizaci n y m s tarda en realizarla e Channels Si estamos visualizando una imagen en color marcaremos los canales que queremos visualizar En caso de im genes monocromas podemos dejar marcados los tres A continuaci n pueden verse tres tipos de visualizaci n 3D de la misma serie de Im genes Lis Image 30 Viewer II A E ei 30 Viene II File Edit Select Transform
47. x_00_A0006_ch00 tif M convallaria 3DAnimMax_00_A0001_ch01 tif PR convallaria 3DAnimMax 00 A0006 chO1 tif m convallaria 3DAnimMax_00_A0001_ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_A0006_ch02 tif m 8 PA convallaria 3DAnimMax00_A0002 ch00 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_40007_ch00 tif PS Documentos convallaria 3DAnimMax 00 A0002 cht nf PM convallaria 3DAnimMax_00_40007_ch01 tif PA convallaria 3DAnimMax_00_A0002 ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_40007_ch02 tif M PA convallaria 3DAnimMax_00_40003_ch00 tif PM convallaria_3DAnimMbMax_00_A0008_ch00 tif m PA convallaria 3DAnimMax DO A0003_ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax 00_40008_ch01 tif M convallaria 3DAnimMax DO A0003_ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax 00_40008_ch02 tif m d mt Nombre de archivo Archivos de tipo AAA Nos aparecer la siguiente ventana que nos permite escoger que imagen o conjunto de im genes en caso de que se trate de una serie queremos abrir y en caso de tener m s de un canal si queremos verlas como im genes separadas o intercaladas en una serie Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 4 d Select Images to Open w Split channels convallaria bd contains 2 image er es Iw Series005 3DAnimMax 00 OK Cancel Es aconsejable seleccionar la opci n de Split Channels para ver los canales como Im genes separadas S1 la imagen tiene m s de una secci n podemos desplazarnos por todo el conjunto moviendo la barra
48. xeles de la l nea marcada y no debemos tocarlo El siguiente valor Know Distance corresponde a la distancia en unidades reales de la l nea marcada en este caso 400 micras El siguiente valor pixel ratio se refiere a la relaci n longitud anchura del pixel Siempre que trabajemos con p xeles cuadrados su valor ser 1 0 En el campo Unit of Length teclearemos las unidades de medida micras en este caso Finalmente marcaremos el campo global si queremos que este factor de calibraci n se aplique a todas las im genes que abramos En caso de que deseemos que se aplique s lo a esta imagen lo dejaremos sin marcar 2 si conocemos el valor de calibraci n del p xel de la imagen En el caso de conocer el valor de calibraci n del p xel de la imagen fichero de metadatos de la imagen teclearemos su valor en el campo Know Distance En el campo Distance in Pixels pondremos el valor 1 y el resto de los valores haremos como en el caso anterior _ Distance in Pixels 1 Known Distance 0 23 Pixel Aspect Ratio 1 0 Unit of Length micras Click to Remove Scale Y Global Scale lt no scale gt Finalmente pulsaremos OK para aplicar esta calibracion En este momento aparece en la parte superior de la imagen la informacion de sus dimensiones reales con las dimensiones en pixeles entre par ntesis Si abrimos la imagen con la herramienta de leer Bioformato el programa lee del fichero de me
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