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1. UMELOSA HCV CUALITATIVO Por ltimo se evalu la exactitud en los resultados mediante el sistema cuantitativo AMPLICOR HBV MONITOR Test Roche Diagnostics con el empleo muestras est ndares de concentraciones conocidas del virus de hepatitis B VHB Al evaluar los equipos TEMPER 1 y TEMPER 2 y el termociclador de referencia PTC 150 la eficiencia del funcionamiento fue del 100 la concordancia en uno de los montajes fue de 95 8 la concordancia precisi n interensayo fue de 97 9 Al ensayar muestras positivas y negativas al VHC provenientes de pacientes mediante el UMELOSA HCV CUALITATIVO la concordancia fue del 100 Se evidenci exactitud en los resultados cuyos valores estaban dentro de rangos v lidos reportados en la literatura l mites de aceptaci n de 0 5 logio copias de genomas virales en el ensayo de est ndares a diferentes concentraciones de cido dexosirribonucleico ADN del VHB Los resultados de este estudio avalan el empleo del TEMPER en el diagn stico y otras aplicaciones relacionadas con la tecnolog a de amplificaci n de cidos nucleicos mediante la RCP Palabras claves termociclador secuenciador t rmico precisi n exactitud RCP z O ha q 2 a S 2 T Biotecnolog a Aplicada 2006 23 305 310 ABSTRACT Validation of the TEMPER thermocycler in nucleic acid amplification by polymerase chain reaction The thermocycler is a programmable cycling incubator that automatically performs the cyclic ch2. ensayo AMPLICOR HBV MONITOR Test con el empleo de los termocicladores TEMPER 2 y PTC 150 Los l mites de aceptaci n estuvieron por debajo de 0 5 logio de las copias reacci n para todas las concentraciones de est ndares del VHB ensayadas tabla 5 En la caracterizaci n funcional del TEMPER con el objetivo de evaluar el desempe o de este equipo en ensayos de detecci n cualitativa de cidos nucleicos o de cuantificarlos en una muestra determinada se obtuvo una buena precisi n intraensayo e interensayo Tambi n hubo concordancia entre los resultados tras el empleo de controles positivos a diferentes concentraciones de ARN del VHC y muestras Muestras positivas al VHC n 23 Porcentaje de Resultado esultado Concordancia 23 23 100 23 13 PCR Cycler Validation Extended Information CYCLERtest Products 2004 Sitio en Internet Disponible en http www cyclertest com Ultimo acceso 4 agosto 2005 14 Wild D The immunoassay handbook The Macmillan Press Ltd Concepts 1994 84 5 15 Joseph DC Yao Marcel GHM Beld Lynette LEO et al Multicenter Evaluation of the VERSANT Hepatitis B Virus DNA 3 0 Assay Journal of Clinical Microbiology 2004 42 800 6 16 Gilbert N Corden S ljaz S Grant PR et al Comparison of commercial assays for the quantification of HBV DNA load in health care workers calibration differences Journal of Virological Methods 2002 100 37 47 17 Dailey PJ Hayden D The AIDS K
3. otra placa de ultramicroelosa con reactivos diferentes y se obtuvo nuevamente un resultado negativo La t cnica anal tica empleada UMELOSA HCV CUALITATIVO ha sido validada por los resultados satisfactorios en cuanto a su precisi n lo cual sucedi en todos los casos en que se ensay un control positivo de baja carga viral independientemente del operario y de los lotes de reactivos empleados 9 En toda t cnica anal tica siempre que no sea totalmente automatizada existe el riesgo de que el Tabla 2 An lisis de la precisi n inter ensayo del UMELOSA HCV CUALITATIVO con el empleo de los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y el equipo de referencia PTC 150 N mero de muestras E Porcentaje de Equipo utilizado iti Resultado ji annn 1 ramo PTC 150 48 48 100 TEMPER 1 48 48 100 TEMPER 2 48 47 97 9 Biotecnolog a Aplicada 2006 Vol 23 No 4 Anny Armas y cols operario cometa errores de manipulaci n De modo que el resultado negativo que se obtuvo para una de las 24 r plicas amplificadas de la muestra positiva en el TEMPER 2 pudo deberse a este tipo de errores los cuales traen como consecuencia la no amplificaci n del cido nucleico Tambi n pudo deberse a la presencia de otros factores de la operaci n que hayan causado la degradaci n del ARN tales como la presencia de ribonucleasas en el tubo o en la punta que se utiliz para la transferencia del ARN al tubo de reacci n en el ocurrir a la RCP Los errore
4. picos precipitaci n del ARN en isopropanol y posteriores lavados del ARN con etanol al 75 y acetona hasta la resuspensi n final en agua libre de ribonucleasas RNasa Transcripci n inversa TI del ARN molde para generar cido desoxirribonucleico complementario ADNC y su amplificaci n por RCP con el empleo de iniciadores espec ficos TI RCP y un ter mociclador Amplificaci n de un segmento del fragmento previamente amplificado con el empleo de iniciadores internos uno de los cuales est marcado con biotina RCP anidada y un termociclador Hibridaci n del producto amplificado con una sonda espec fica y su detecci n por fluorescencia en una placa de tiras con el empleo del conjugado estreptavidina fosfatasa alcalina Para la detecci n se usa un fluor metro que lee ultramicroplacas en el que la luz que incide es de 365 nm y emite a una longitud de onda de 450 nm Biotecnolog a Aplicada 2006 Vol 23 No 4 2 Erlich HA PCR Technology Principles and applications for DNA amplification Macmillan Publishers Ltd 1989 3 Mobile Temperature Acquisition System MTAS Basic Information CYCLERtest Products 2004 Sitio en Internet disponible en http www cyclertest com Ultimo acceso 4 agosto 2005 4 Departamento Central de Asegura miento y Control de la Calidad Centro de Inmunoensayo Norma de proceso Fases del Protocolo de Validaci n de Nuevos Equipos La Habana Cuba 1999 5 Gentil
5. un complejo coloreado La intensidad de la reacci n de color se mide a 405 nm con un lector autom tico de microplacas C Muestras empleadas Las muestras est ndares se prepararon a partir de diluciones a un plasma positivo a 1 38 x 10 UI mL de ARN del VHC cuantificado con el estuche cuantitativo AMPLICOR HCV MONITOR Test version 2 0 Roche Diagnostics Para los experimentos se emplearon las siguientes diluciones 750 UI mL de ARN del VHC que representan aproximadamente 7 veces el l mite de detecci n LD del UMELOSA HCV CUALITATIVO LD 95 101 7 UI mL con intervalo de confianza entre 81 a 162 8 UI mL de ARN del VHC 9 lt 6200 Ul mL de ARN del VHC representa aproximadamente 61 veces el LD 95 del UMELOSA HCV CUALITATIVO 9 Se emplearon adem s muestras de sueros negativas y positivas al VHC provenientes de pacientes en fase inicial y final del tratamiento antiviral las cuales se confirmaron con el empleo del estuche cualitativo AMPLICOR HCV Test version 2 0 Roche Diagnostics Los est ndares de carga viral conocida del VHB suministrados en el estuche AMPLICOR HBV MONITOR Test Roche Diagnostics con valores de 10 100 1 000 10 000 y 1000 000 copias reacci n del VHB se emplearon en el ensayo de exactitud 307 Validaci n del TEMPER en ensayos basados en la reacci n en cadena de la polimerasa D Ensayos realizados Evaluaci n de la precisi n intraensayo e interensayo del UMELOSA HCV CU
6. ALITA TIVO con el empleo de los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y PTC 150 En este experimento se evalu la precisi n intraensayo mediante el empleo de un est ndar secundario de baja concentraci n del VHC 750 UU mL de ARN del VHC El est ndar se ubic en las 24 posiciones de los tres equipos y en la posici n restante se coloc un control negativo Este ensayo se repiti en dos ocasiones los d as y los operarios fueron diferentes para evaluar la precisi n interensayo El objetivo de la prueba fue comprobar que el ensayo UMELOSA HCV CUALI TATIVO era reproducible independientemente del termociclador empleado y de las peque as diferencias de temperatura que existen entre dos puntos del bloque de los termocicladores Se extrajo el ARN viral a partir de 24 al cuotas de la muestra est ndar secundaria y una al cuota de control negativo del ensayo con el empleo del sistema UMELOSA HCV CUALITATIVO 8 Los 24 ARN extra dos de cada muestra est ndar se mezclaron y homogeneizaron en un vial Se realiz la transcripci n inversa RCP y la RCP anidada de acuerdo con el procedimiento que se emplea en el UMELOSA HCV CUALITATIVO 8 Para estos dos pasos se utilizaron los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y el equipo de referencia Por ltimo se realiz la detecci n de la se al de fluorescencia mediante hibridaci n en ultra microplacas Por ser un ensayo cualitativo la precisi n se evalu mediante el porcentaje de conc
7. VHC ensayadas con el empleo de los tres termocicladores se obtuvo el 100 de concordancia tabla 3 Un resultado similar se obtuvo cuando se ensayaron las 60 muestras cl nicas de ellas 23 correspond an a muestras positivas de pacientes y 37 muestras negativas al VHC tabla 4 Evaluaci n de la exactitud del AMPLICOR HBV MONITOR Test con el empleo de los termocicladores TEMPER 2 y PTC 150 En mediciones o ensayos anal ticos la exactitud se define como cu n cerca del valor real est un valor promedio medido o calculado 14 La exactitud del ensayo cuantitativo AMPLICOR HBV MO NITOR Test se evalu mediante los est ndares de carga viral de VHB conocidas los cuales se amplificaron en posiciones aleatorias del bloque del TEMPER 2 y PTC 150 Se hall la media del logaritmo logo de las copias por reacci n de cada est ndar que se amplific con el empleo del TEMPER 2 y se compar cada valor con el logo de las copias por reacci n esperadas de cada est ndar Igualmente se compararon los valores de logo de las copias por reacci n de cada est ndar que se amplific con el PTC 150 con el logo de las copias por reacci n 309 Validaci n del TEMPER en ensayos basados en la reacci n en cadena de la polimerasa Tabla 3 An lisis de la concordancia entre los resultados al ensayar 8 r plicas de dos concentraciones bajas de ARN del virus de hepatitis C 750 y 6 200 Ul mL ubicadas en posiciones aleatorias del bloque de lo
8. Validaci n del termociclador TEMPER en ensayos basados en la amplificaci n de cidos nucleicos por reacci n en cadena de la polimerasa a Anny Armas Iria Garc a Enny Morales Vivian Alonso Idania Gonz lez Jorge G Mart nez Casado Yenitse Perea Yaim Gonz lez Laboratorio de Biolog a Molecular Subdirecci n de Inmunoqu mica Centro de Inmunoensayo CIE Calle 134 y Ave 25 Apartado Postal 6653 Cubanac n Playa Ciudad de La Habana Cuba Fax 53 7 208 6800 E mail iqbmolecular2 cie sld cu Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad CIE Subdirecci n de Instrumentaci n CIE RESUMEN El termociclador es un equipo que permite realizar de manera autom tica los cambios c clicos de temperatura que ocurren en la reacci n en cadena de la polimerasa RCP En este art culo se exponen los resultados de la etapa de calificaci n del funcionamiento de la serie cero del termociclador TEMPER Centro de Inmunoensayo CIE seg n sus especificaciones de operaci n Se emplearon dos sistemas comerciales para evaluar el funcionamiento de dos termocicladores del modelo TEMPER fabricados en el CIE TEMPER 1 y TEMPER 2 El equipo que se us como referencia fue el termociclador comercial PTC 150 MJ Research Al ensayar muestras positivas y negativas al virus de la hepatitis C VHC se evalu la precisi n intraensayo e interensayo del equipo y la concordancia entre los resultados mediante el empleo del
9. anges in temperature required for Polymerase Chain Reaction PCR In this paper we present the results of the Operational Qualification OQ of TEMPER thermocyclers Center for Immunoassays CIE OQ is carried out to ensure that they meet the previously defined functional and performance specifications The performance of two thermocycler models produced at CIE TEMPER 1 and TEMPER 2 were evaluated using two commercial diagnostic systems The commercial thermocycler PTC150 MJ Research was used as reference equipment Intra assay and inter assay precision and the agreement among data sets obtained with different equipment were estimated using the UMELOSA Cualitativo HCV Test CIE The accuracy of the results was assessed with the quantitative AMPLICOR HBV MONITORTM Test Roche Diagnostics using Hepatitis B Virus HBV calibrated standards Both devices showed 100 performance efficiency and the agreement with the PTC150 thermocycler were 95 8 and 97 9 for within and between assay precision respectively When positive and negative HCV samples were evaluated with UMELOSAO HCV CUALITATIVO a 100 within assay precision among thermocyclers was documented Moreover the values of HBV DNA standards agreed with the previously reported ranges which demonstrate the high accuracy of the test tolerance limits of 0 5 log10 viral genome copies The results indicate that TEMPER thermocyclers can be successfully used for diagnostic purposes or other applicatio
10. d del ensayo para el equipo de referencia PTC 150 Resultados y discusi n Evaluaci n de la precisi n intraensayo e interensayo del UMELOSA HCV CUALITATIVO con el empleo de los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y PTC 150 La precisi n de un ensayo cualitativo no puede ser expresada de la misma manera que para los ensayos cuantitativos medibles mediante el coeficiente de variaci n Una posible medida de la precisi n en los ensayos cualitativos puede ser el grado de concordancia de los resultados de una serie de r plicas utilizando la misma muestra 11 La precisi n de un ensayo puede estar afectada por factores como el tiempo la t cnica los analistas y los equipos entre otras causas 11 La precisi n intraensayo e interensayo del UMELOSA HCV CUALITATIVO se evalu por el porcentaje de concordancia en los resultados al analizar una muestra positiva al ARN del VHC con baja carga viral 750 UI mL de ARN del VHC En el paso de amplificaci n se emplearon los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y PTC 150 En la primera evaluaci n de la precisi n intraensayo se obtuvo el 100 de concordancia entre los resultados al ensayar de manera repetida la muestra positiva a 750 Ul mL de ARN del VHC independientemente del termociclador empleado y de las peque as diferencias de temperatura que se presentan entre dos posiciones del bloque de los termocicladores tabla 1 Sin embargo en el segundo montaje que permiti evaluar ta
11. e JF Herrera H Pico JF Vald s JA S nchez N Centro de Inmunoensayo Sistema de control de temperatura para la unidad de atemperaci n de un termo ciclador Oficina Cubana de la Propiedad Industrial Ciudad de La Habana Cuba No 22973 2 de junio de 2004 6 Brush M Up on blocks A profile of thermal cycler with interchangeable blocks The Scientist 1998 12 21 3 7 Gentile J Ferreira A Alfonso J Herrera H Rodr guez A M ndez J Mora MN Armas A Fern ndez AK Gonz lez Y Morales E Alonso V Garc a l Gonz lez l Validaci n del dise o del termociclador Temper para su aplicaci n en labora torios de diagn stico molecular In Congresso Latino Americano de En genharia Biom dica XIX Congreso Brasileiro de Engenharia Biom dica de 22 a 25 de setembro de 2004 Jo o Pessoa Brasil 8 Gonz lez YJ Gonz lez l Vi a A Armas A Garc a l Sol s RL Desarrollo de un sistema de diagn stico molecular para la detecci n cualitativa del ARN del virus de la hepatitis C Biotecnolog a Aplicada 2003 20 122 5 9 Gonz lez P rez l Gonz lez YJ Armas A Vi a Rodr guez A Medina A Trujillo N et al Validation of a nested PCR assay UMELOSA HCV CUALITATIVO for detec tion of Hepatitis C Virus Biologicals 2003 31 55 61 10 Roche Molecular Systems Instructivo del ensayo AMPLICOR HBV MONITOR Test Branchburg NJ USA 2002 Anny Armas y cols 2 AMPLICOR HBV MONITOR Test Roche Diagnostics 10 en
12. ebas de seguridad caracterizaci n funcional y pruebas de terreno En este art culo se describen los resultados de diferentes pruebas anal ticas bajo condiciones controladas de uso que forma parte de la caracterizaci n funcional del nuevo equipo Esta fase constituye un proceso de calificaci n de la operaci n o funcionamiento del instrumento seg n sus especificaciones de operaci n en el sitio seleccionado 1 Para evaluar el funcionamiento de dos termoci cladores del modelo TEMPER fabricados en el CIE TEMPER 1 y TEMPER 2 5 se emplearon dos sistemas comerciales basados en la amplificaci n de cidos nucleicos mediante la RCP En la caracterizaci n funcional del TEMPER se utiliz el termociclador comercial PTC 150 de la firma MJ Research 6 como equipo de referencia Su dise o y las especificaciones t cnicas son muy similares a las del TEMPER 7 y es ampliamente utilizado en la t cnica de RCP 6 En los ensayos de certificaci n luego de haber demostrado que el termociclador TEMPER es preciso exacto y uniforme 7 se evaluaron los par metros de precisi n intraensayo e interensayo y la concordancia en los resultados con el empleo del ensayo UMELOSA HCV CUALITATIVO CIE 8 9 La exactitud en los resultados se evalu mediante el sistema cuantitativo AMPLICOR HBV MONITOR Test Roche Diagnostics 10 306 Validaci n del TEMPER en ensayos basados en la reacci n en cadena de la polimerasa Materia
13. ecibido en september de 2005 Aprobado en april de 2006 310 Validaci n del TEMPER en ensayos basados en la reacci n en cadena de la polimerasa investigaciones de laboratorio y en todos los casos se obtuvieron resultados similares entre el empleo de este equipo de referencia y las dos series cero de termocicladores evaluadas Ello permite aseverar que el termociclador TEMPER desarrollado y producido por el CIE es un equipo confiable que se puede emplear en t cnicas de detecci n y cuantificaci n de cidos nucleicos o en aplicaciones similares donde sea necesario amplificar cidos nucleicos mediante la reacci n en cadena de la polimerasa Biotecnolog a Aplicada 2006 Vol 23 No 4
14. erasa RCP de forma eficiente y r pida mediante la realizaci n autom tica y c clica de los cambios de temperatura que se requieren para la amplificaci n de una cadena de cido desoxirribonucleico ADN a partir de una enzima termoestable La RCP posibilita que una peque a cantidad de mol culas de ADN sea amplificada muchas veces de manera exponencial Esta metodolog a es com nmente empleada en laboratorios m dicos y de investigaciones biol gicas con una gran variedad de aplicaciones entre ellas la detecci n de la expresi n de genes y de enfermedades hereditarias la identificaci n de huellas gen ticas la clonaci n de genes las pruebas de paternidad la inform tica del ADN y el diagn stico de enfermedades infecciosas 2 Los termocicladores se emplean para amplifi caciones cualitativas o para cuantificar la cantidad de ADN amplificado Los resultados de estas t cnicas de amplificaci n tienen un impacto sustancial en nuestra sociedad por lo que se debe asegurar que los termoci cladores sean precisos exactos y uniformes con el fin de obtener resultados confiables 3 En los ensayos de certificaci n en el Centro de Inmunoensayo CIE se evaluaron estos par metros a partir de un protocolo elaborado por el Departamento Central de Aseguramiento y Control de la Calidad el cual contempla las etapas para validar los nuevos modelos de equipos que se han desarrollado 4 Estas etapas son ensayos de certificaci n pru
15. f diagnostic kits Part 2 General principles and outline procedures for the evaluation of kits for qualitative tests 1987 12 Gerold Z Assessment of Validation Studies from a Fractionator s Point of View Biologicals 1999 27 295 301 Anny Armas y cols Test Roche Diagnostics 10 Se procesaron cinco est ndares de carga viral conocida del VHB suministrados en el estuche con valores de 10 100 1 000 10 000 y 1 000 000 copias reacci n del VHB Estos se amplificaron mediante el procedimiento descrito en el manual de usuario del estuche comercial 10 Para ello se emple el TEMPER 2 con el cual se amplificaron dos r plicas de cada muestra est ndar y una r plica con el equipo control PTC 150 Para el an lisis de los resultados se hall la media del logaritmo logo de las copias por reacci n para cada muestra est ndar que se amplific con el empleo del TEMPER 2 las cuales se compararon con el logo de las copias por reacci n esperadas para cada muestra est ndar La diferencia entre estos valores permiti evaluar la exactitud cualidad de aproximaci n de una muestra a su valor real del ensayo cuantitativo en el que se utiliz el termociclador TEMPER as como el equipo de referencia en los pasos de amplificaci n por RCP de los est ndares suministrados en el estuche comercial Con el objetivo de detectar alg n problema de manipulaci n durante la ejecuci n de la t cnica se realiz el mismo an lisis de exactitu
16. les y m todos A Termocicladores empleados Termocicladores de la serie cero TEMPER 1 N de serie 030001 y TEMPER 2 N de serie 030002 CIE 5 7 Rango t rmico de O a 105 C Exactitud 0 3 C despu s de 30 segundos a 90 C Precisi n en el control 0 1 C Homogeneidad t rmica 0 5 C de pozo a pozo durante los 30 segundos de alcanzada la temperatura programada Velocidad de rampa para una variaci n de tempe ratura entre 50 y 95 C en el bloque la rampa m xima para el calentamiento es de 3 C s y para el enfriamiento es de 1 C s Rango t rmico de la tapa caliente desde temperatura ambiente hasta 115 C Capacidad de muestras 25 tubos de 0 2 mL Termociclador comercial PTC 150 MJ Research 6 Rango t rmico de 9 a 105 C Exactitud 0 3 C Precisi n en el control 0 1 C Homogeneidad t rmica 0 3 C Velocidad de rampa para el calentamiento la rampa m xima es de 2 4 C s y para el enfriamiento es de 1 2 C s Capacidad de muestras 25 tubos de 0 2 mL B Sistemas utilizados Para la evaluaci n del funcionamiento de los termocicladores se utilizaron los siguientes estuches comerciales 1 UMELOSA HCV CUALITATIVO CIE 8 9 ensayo comercial para la detecci n del ARN del VHC en suero o plasma humano Consta de cuatro pasos fundamentales Extracci n del ARN de la muestra a partir de suero o plasma mediante lisis de los viriones con agentes caotr
17. now ledge base Viral load Assays Metho dologies variables and interpretation 1996 18 Schirm J Van Loon AM Valentine Thon E Klapper PE Reid J Cleator GM External Quality Assessment Program for Qualitative and Quantitative Detection of Hepatitis C Virus RNA in Diagnostic Virology Journal of Clinical Micro biology 2002 40 2973 80 Tabla 5 Evaluaci n de la exactitud del ensayo cuantitativo Amplicor HBV Monitor Test con el empleo del TEMPER 2 y el termociclador PTC 150 como equipo de referencia para la amplificaci n de los est ndares de concentraci n conocida de ADN del virus de hepatitis B desde 10 hasta 10 copias reacci n Media del logio Logio Copias reacci n Logio copias reacci n copias reacci n copias reacci n esperadas esperadas obtenidas obtenidas TEMPER 2 PTC 150 10 1 00 0 80 1 10 10 2 00 1 85 2 0 10 3 00 3 10 3 0 104 4 00 4 00 3 9 10 6 00 6 00 6 1 Biotecnolog a Aplicada 2006 Vol 23 No 4 Anny Armas y cols negativas y positivas a este virus Se pudo constatar que con el TEMPER no solo se logra un resultado negativo o positivo para una muestra que realmente es negativa o positiva a una entidad viral determinada sino que adem s este se puede emplear con seguridad en ensayos cuantitativos en los que es importante obtener la concentraci n de una muestra cl nica con exactitud En todos los ensayos se emple un termociclador comercial validado para el diagn stico y las R
18. ns involving PCR amplification of nucleic acids Key words thermal cycler precision accuracy PCR Introducci n La calificaci n de un equipo seg n las regulaciones de la Food and Drug Administration FDA es el proceso global que asegura que un instrumento es apropiado para el uso al cual est destinado 1 Este proceso se divide en cuatro etapas calificaci n del dise o calificaci n de la instalaci n calificaci n de la operaci n o funcionamiento del equipo y XA Autor de correspondencia calificaci n del funcionamiento consistente de este 1 En la calificaci n del dise o se establecen las especificaciones de la operaci n y el funcionamiento del equipo La calificaci n de la instalaci n es la etapa en la cual se ejecuta y documenta la instalaci n en el lugar seleccionado La calificaci n de la operaci n o 1 Equipment Validation and Qualifi cation 2005 Sitio en Internet Disponible en http www labcompliance com Ulti mo acceso 10 febrero 2006 Anny Armas y cols funcionamiento de un equipo es el proceso para probarlo en el sitio seleccionado y as asegurar que funcionar de acuerdo con sus especificaciones de funcionamiento La ltima etapa es la calificaci n del funcionamiento consistente del equipo en la cual se determina si funciona de modo consistente para su empleo en la rutina 1 El termociclador o secuenciador t rmico es un equipo que permite la reacci n en cadena de la polim
19. nto la precisi n intraensayo 24 r plicas como interensayo con d as y operarios diferentes se obtuvo un resultado negativo a partir de una de las 24 r plicas del control positivo amplificadas por el TEMPER 2 tabla 1 lo que signific el 95 8 de concordancia como resultado de la precisi n intraensayo con el empleo del TEMPER 2 En el an lisis de precisi n interensayo tabla 2 se obtuvo el 97 9 de concordancia al emplear este mismo equipo 308 Validaci n del TEMPER en ensayos basados en la reacci n en cadena de la polimerasa Tabla 1 Evaluaci n de la precisi n intra ensayo del UMELOSA HCV CUALITATIVO con el empleo de los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y el equipo de referencia PTC 150 Resultado Porcentaje N mero de r plicas de la muestra positiva de concordancia Equipo utilizado 750 Ul mL de ARN del VHC ensayadas Montaje 1 Montaje 2 PTC 150 24 24 100 24 100 TEMPER 1 24 24 100 24 100 TEMPER 2 24 24 100 23 95 8 En los montajes 1 y 2 se ensayaron 24 r plicas de una muestra positiva con baja concentraci n de ARN del virus de hepatitis C 750 Ul mL 7 veces el l mite de detecci n del 95 del UMELOSA HCV CUALITATIVO la cual se ubic en 24 posiciones de los tres termocicladores Cada montaje se realiz en d as diferentes y por operarios diferentes El resultado falso negativo en el segundo experimento de precisi n con el TEMPER 2 pudo estar relacionado con el calentamie
20. nto no uniforme del bloque la t cnica de detecci n empleada y los errores de operaci n o del operario El calentamiento no uniforme del bloque de un termociclador puede llevar a resultados falsos negativos para muestras que son realmente positivas Esto es especialmente importante cuando se realizan ensayos de RCP para el diagn stico o cuantificaci n de agentes infecciosos en los que se emplean m ltiples muestras pues el resultado puede estar influenciado por el comportamiento de este par metro 3 Se conoce que en el termociclador TEMPER la uniformidad de la temperatura m xima diferencia de temperatura entre dos pozos es de 0 5 C 7 valor que es aceptado en las t cnicas de diagn stico por RCP y que caracteriza a varios equipos que se comercializan en el mundo 6 Como la uniformidad de la temperatura en el TEMPER 2 se demostr en los ensayos de certificaci n de este con valores bajos comparables a los del equipo de referencia PTC 150 y otros termocicladores comerciales 6 se considera que el termociclador TEMPER 2 no fue el causante de los valores de precisi n intraensayo segundo montaje e interensayo obtenidos con este equipo 95 8 y 97 9 respectivamente Adem s se demostr que la etapa de detecci n del producto amplificado del UMELOSA HCV CUALITATIVO 8 no fue la causante de la discordancia en el resultado de la muestra Esto se comprob mediante la repetici n de la misma muestra amplificada en
21. ordancia 11 Evaluaci n de la concordancia en los resultados La concordancia entre los resultados se evalu al ensayar controles positivos a dos concentraciones de ARN del VHC conocidas 750 UI mL y 6 200 UI mL Estas se consideran concentraciones con baja carga de ARN del virus de la hepatitis C teniendo en cuenta que la sensibilidad requerida para la detecci n del ARN del VHC en donaciones individuales por los ensayos cualitativos basados en t cnicas de amplificaci n de cidos nucleicos por RCP es de 5 000 UI mL seg n entidades regulatorias europeas como el Instituto Paul Ehrlich de Alemania 12 Adem s se evalu la concordancia entre los resultados al ensayar muestras cl nicas en los dos equipos TEMPER 1 y TEMPER 2 y en el equipo control PTC 150 De cada concentraci n de control positivo se ensayaron 8 r plicas en los tres termocicladores y 60 muestras cl nicas en total de ellas 37 negativas y 23 positivas al VHC Los pasos de extracci n amplificaci n y detecci n se realizaron de acuerdo con los procedimientos del ensayo UMELOSA HCV CUALITATIVO 8 Evaluaci n de la exactitud del AMPLICOR HBV MONITOR Test con el empleo de los termocicladores TEMPER 2 y PTC 150 La exactitud en los resultados se evalu a partir del m todo cuantitativo AMPLICOR HBV MONITOR Biotecnolog a Aplicada 2006 Vol 23 No 4 11 Broughton PMG Bergonzi C Lindstedt G Loeber JG Malan PG Guidelines for the evaluation o
22. s de manipulaci n pueden afectar la precisi n de un ensayo espec ficamente los debidos a la manipulaci n de la pipeta y en el momento de la adici n de los reactivos 14 La preparaci n de las muestras para la RCP es un proceso que requiere m ltiples pasos con micropipetas los cuales podr an ocasionar resultados falsos negativos y problemas de contaminaci n de las muestras por el fen meno de carryover 2 Teniendo en cuenta que los errores de manipulaci n pueden existir en este tipo de t cnicas y que pueden afectar la precisi n de un ensayo estos valores de precisi n intraensayo e interensayo 95 8 y 97 9 respectivamente con el empleo del TEMPER 2 se consideran v lidos y pueden incrementarse en la medida en que se realicen m s r plicas del control positivo 11 Evaluaci n de la concordancia en los resultados Para la evaluaci n de concordancia entre los resultados se emplearon muestras positivas y negativas al VHC as como diferentes concentraciones conocidas de ARN del VHC obtenidas a partir de diluciones de trabajo de un control positivo alto 1 38 x 10 UI mL de ARN del VHC Las dos concentraciones de trabajo con diferencias de logo mayores de 0 5 logo UI mL de ARN del VHC se amplificaron en los tres termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y el termociclador de referencia PTC 150 al igual que las muestras negativas y positivas al VHC provenientes de pacientes Para las diferentes concentraciones de ARN del
23. s equipos TEMPER 1 TEMPER 2 y el termociclador de referencia PTC 150 Muestras positivas a 750 Ul mL Muestras positivas a 6200 Ul mL de ARN g de ARN del VHC del VHC Equipo n 8 n 8 utilizado Porcentaje de Porcentaje de R s ltado i Concordancia R ssolfado k Concorda ncia PTC 150 8 8 TEMPER 1 8 100 8 100 TEMPER 2 8 8 Tabla 4 An lisis de la concordancia en los resultados al ensayar muestras negativas y positivas al ARN del virus de hepatitis C VHC de pacientes con el empleo de los termocicladores TEMPER 1 TEMPER 2 y el termociclador de referencia PTC 150 en el pasode amplificaci n de las muestras Muestras negativas al VHC n 37 Equipo utilizado Porcentaje de Resultado Concordancia PTC 150 37 TEMPER 1 37 100 TEMPER 2 37 esperadas de cada est ndar Los resultados se muestran en la tabla 5 Para ensayos de carga viral de VHB VIH 1 y VHC se han reportado l mites de aproximadamente 0 5 log o de aceptaci n de las diferencias entre el logio de las copias de genomas esperadas y las obtenidas 15 18 de modo que una diferencia mayor representa un cambio significativo Teniendo en cuenta que la m xima diferencia que se obtuvo entre la media logar tmica de las copias reacci n de VHB esperadas y las obtenidas fue de 0 2 logio resultado que se obtuvo para el est ndar de copia 10 con el empleo del TEMPER 2 tabla 5 se concluye que se logr una buena exactitud durante la ejecuci n del
24. sayo comercial para la cuantificaci n del ADN del VHB en suero o plasma humano Se basa en cuatro procesos principales Preparaci n de la muestra mediante lisis de los viriones presentes en el suero o plasma y adici n de un agente neutralizante para proporcionar condi ciones tamp n apropiadas para la amplificaci n por RCP Amplificaci n simult nea por RCP del ADN objetivo del VHB y el ADN del est ndar internlo con el empleo de iniciadores espec ficos uno de los cuales est marcado con biotina La amplificaci n se realiza mediante un termociclador Hibridaci n de los productos amplificados a sondas oligonucle tidas espec ficas Despu s de la amplificaci n por RCP el amplic n del VHB y el de est ndar interno son inmovilizados en una microplaca revestida de estreptavidina Despu s de la hibridaci n el amplic n bicatenario se des naturaliza qu micamente y la cadena no biotinilada no conjugada se extrae por lavado para dejar un ADN monocatenario conjugado a la microplaca Detecci n de los productos amplificados ligados a la sonda por determinaci n colorim trica Despu s del paso anterior se favorece la hibridaci n al amplic n inmovilizado de las sondas oligo nucle tidas marcadas con dinitrofenilo DNP Luego del paso de lavado se adiciona el conjugado fosfatasa alcalina anti DNP De seguido se adiciona sustrato que contiene para nitrofenilfosfato y la fosfatasa alcalina cataliza la formaci n de
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