Manual de usuario
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1. se detecta en el receptor del trasplante y no en el donante Para determinar la informatividad de los polimorfismos se han desarrollado los sets imegen Quimera Screening El dise o de todos los ensayos incluir los controles negativos adecuados as como un calibrador El Instituto de Medicina Gen mica le recomienda emplear como calibrador el ADN del receptor antes del trasplante 4 Preparaci n de las reacciones de amplificaci n 1 Descongelar el M ster Polimorfismo el M ster B globina y el ADN de las muestras Dar un v rtex a cada uno de los reactivos y mantener en fr o 2 En un tubo de 1 5 ml a adir las cantidades necesarias para todas las reacciones del gen f globina Se recomienda realizar los c lculos a adiendo reactivos suficientes para analizar una reacci n mas o bien calcular y a adir un 10 m s de cada uno de los reactivos 3 En un tubo de 1 5 ml a adir las cantidades necesarias para todas las reacciones del polimorfismo Se recomienda realizar los c lculos a adiendo reactivos suficientes para analizar una reacci n mas o bien calcular y a adir un 10 m s de cada uno de los reactivos M ster fB globina o polimorfismo M ster Mix PCR 2x 4 Mezclar los Mix de PCR y pipetear 8 ul en los pocillos de PCR correspondientes 5 A adir 2 ul de ADN 50 ng ul a cada una de las reacciones Rev 22 04 2010 1 2 A instituto de medicina gen mica Parque Cient fico Universidad de Valencia C Catedr2. A instituto de medicina gen mica Parque Cient fico Universidad de Valencia C Catedr tico Agust n Escardino 46980 Paterna Valencia Tel 96 321 23 40 Fax 96 321 23 41 www imegen es l i g l imegen Quimera IMG 116 Cuantificaci n de polimorfismos en quimeras hematopoy ticas mediante PCR a tiempo real 1 Descripci n La cuantificaci n relativa mediante PCR a tiempo real de polimorfismos de inserci n deleci n permite determinar la presencia de quimerismos hematopoy ticos en el periodo post trasplante El set imegen Quimera contiene los oligonucle tidos necesarios para cuantificar polimorfismos de inserci n deleci n o alelos nulos respecto a la cantidad total de ADN presente en la muestra 2 Componentes y almacenamiento del set Este set contiene reactivos suficientes para la realizaci n de 50 reacciones M ster Polimorfismo 25 reacciones 80 ul de agua vial M ster f globina 25 reacciones 80 ul de agua vial Despu s de la rehidrataci n mantener los reactivos a 200C 3 Procedimiento de an lisis La cuantificaci n relativa mediante PCR a tiempo real de polimorfismos de inserci n deleci n permite determinar la presencia de quimerismos hematopoy ticos en el periodo post trasplante Para realizar dicha cuantificaci n es necesario analizar un gen de referencia f globina y un polimorfismo informativo Se considera que un polimorfismo es informativo cuando
3. cia PB globina se detecta en un ciclo de PCR no superior a 26 Amplificaciones superiores a este Ct indican que la cantidad de ADN en la muestra no es suficiente lo que producir una disminuci n de la sensibilidad del an lisis 3 Para realizar la cuantificaci n relativa de la quimera hematopoy tica se ha desarrollado un software espec fico disponible en www imegen es Quimera Este software le permitir obtener el resultado una vez que introduzca los siguientes par metros a Seleccionar el polimorfismo empleado en el an lisis b Indicar los Ct del calibrador muestra del receptor antes del trasplante tanto para la f globina como para el polimorfismo empleado c Indicar los Ct de las muestras tanto para la b globina como para el polimorfismo empleado 7 Control de calidad Todos los productos comercializados por el Instituto de Medicina Gen mica son sometidos a un riguroso control de calidad El set imegen Quimera ha superado todas las pruebas de validaci n internas que garantizan la fiabilidad y reproducibilidad de cada ensayo 8 Garant as y responsabilidades El Instituto de Medicina Gen mica le garantiza que todos sus productos est n libres de defectos tanto en los materiales empleados como en su proceso de su fabricaci n Esta garant a se hace extensible a un per odo de un a o desde la fecha de env o del producto siempre que se observen las condiciones de conservaci n especificadas en este Manual Nuestr
4. os productos est n dise ados para uso en investigaci n El usuario de los productos es responsable de validar la utilidad de los protocolo propuestos por el Instituto de Medicina Gen mica Dichos protocolos se consideran nicamente una gu a El Instituto de Medicina Gen mica no le ofrece ninguna otra garant a expresa o impl cita que se extienda m s all del funcionamiento correcto de los componentes de este set La nica obligaci n del Instituto de Medicina Gen mica respecto de las garant as precedentes ser la de reemplazar los productos o bien devolver el precio de la compra de los mismos a voluntad del cliente siempre y cuando se pruebe la existencia de un defecto en los materiales o bien en la elaboraci n de sus productos El Instituto de Medicina Gen mica no ser responsable de ning n da o directo o indirecto que resulte en p rdidas econ micas o en da os que pudieran producirse por el uso de este producto por parte del comprador o usuario 9 Servicio de atenci n al cliente Para cualquier consulta sobre las aplicaciones de este producto o sobre sus protocolos puede contactar con nuestro Departamento T cnico Tel fono 963 212 340 Mail info imegen es Rev 22 04 2010 2 2
5. tico Agust n Escardino 9 46980 Paterna Valencia Tel 96 321 23 40 Fax 96 321 29 41 www imegen es i g paja Co o Gi m Y e 5 Amplificaci n r I OT a 7 al 7 Someter las reacciones de amplificacion al siguiente programa de amplificacion 2 Programs Ea Program Name Cycles Analysis Mode Desnaturalizacion 1 None z implificacion Quantification hd Frio al None z Desnaturalizacion Temperature Targets Target C Acquisition Mode Hold hh mm ss Ramp Rate C s Acquisitions per C Sec Target C Step Size 0 Step Delay cycles 95 Mone lo0 10 00 la jo sjo 0 S Amplificacion Temperature Targets Target C Acquisition Mode Hold hh mm ss Ramp Rate C s Acquisitions per C Sec Target C Step Size C Step Delay cycles None r 00 00 05 AS o None 00 00 10 NUS o 72 Single 00 00 15 34 4 o 0 30 El Frio Temperature Targets Target C Acquisition Mode Hold hh mm ss Ramp Rate C s Acquisitions per C Sec Target C Step Size 0 Step Delay cycles Estas condiciones han sido ensayadas en un termociclador LightCycler 480 6 An lisis de los resultados 1 Comprobar que en los controles negativos no hay amplificaci n En caso de detectarse amplificaci n se recomienda repetir el an lisis para descartar que se haya producido una contaminaci n accidental 2 Comprobar que el gen de referen
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