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Prueba de VPH 16/18 Cervista

1. ADN plasm dico de VPH 16 VPH 18 en la concentraci n indicada copias reacci n mezclado con 100 ng reacci n de ADN gen mico negativo para VPH Jurkat gt ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml Tabla 24 Resumen de los resultados positivos para VPH 16 para el estudio de precisi n Objetivo E opias reacci n o c lulas ml FOZ del VPH 16 Media de Porcentual de VPH 16 positivo n Operador 1 Operador 2 Operador 3 Total 5 000 3 708 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 16 20 000 7 397 100 28 100 28 100 28 100 84 5 000 1 021 0 0 0 0 0 0 0 0 VPH 18 20 000 1 024 0 0 0 0 0 0 0 0 SiHa Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 2 430 82 23 100 28 100 28 94 79 5 000 SiHa 95 000 Jurkat 5 465 100 28 100 28 100 28 100 84 Hela Jurkat 2 500 HeLa 97 500 Jurkat 0 784 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 0 893 ADN plasmidico de VPH 16 VPH 18 en la concentraci n indicada copias reacci n 10 000 0 886 Jurkat 20 000 0 870 100 000 0 917 100 ng reacci n de ADN gen mico negativo para VPH Jurkat mezcla
2. We u THIRD WAVE TECHNOLOGIES Prueba de VPH 16 18 Cervista 95 439 Una prueba de diagn stico in vitro para la detecci n del ADN de los tipos 16 y 18 del virus de papiloma humano VPH en muestras cervicouterinas Y wA Dispositivo de Contiene reactivos Limitaci n de diagn stico cl nico suficientes para temperatura in vitro 96 pruebas NO almacene en un congelador sin escarcha Proteja de la luz 1 de 42 NDICE NOMBRE Y USO PREVISTO ABREVIATURAS USADAS RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO REACTIVOS PROVISTOS ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N DE LOS REACTIVOS REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS OBTENCI N DE MUESTRAS EXTRACCI N DE ADN Y ALMACENAMIENTO PARA EL ANALISIS PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA NOTAS DE PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS CONTROL DE CALIDAD LIMITACIONES CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO REFERENCIAS GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS 2 de 42 NOMBRE Y USO PREVISTO La prueba de VPH 16 18 Cervista es una prueba de diagn stico in vitro para la detecci n cualitativa del ADN del virus de papiloma humano tipos 16 y 18 en muestras cervicouterinas La prueba de VPH 16 18 Cervista utiliza la qu mica de Invader un m todo de amplificaci n de la se al para la detecci n de secuencias espec ficas del cido nucleico Este m todo
3. Tabla 33 Se analiz el ADN clonado o amplicones de PCR para las siguientes muestras en concentraciones de 1x10 copias reacci n y 1x10 copias reacci n a menos que se mencione lo contrario mediante la prueba de VPH 16 18 Cervista Todas las muestras generaron resultados negativos Virus de papiloma humano tipo 1a Virus de papiloma humano tipo 51 Virus de papiloma humano tipo 6 Virus de papiloma humano tipo 52 Virus de papiloma humano tipo 11 Virus de papiloma humano tipo 53 Virus de papiloma humano tipo 31 Virus de papiloma humano tipo 58 Virus de papiloma humano tipo 35 Virus de papiloma humano tipo 59 Virus de papiloma humano tipo 39 Virus de papiloma humano tipo 66 Virus de papiloma humano tipo 42 Virus de papiloma humano tipo 67 Virus de papiloma humano tipo 43 Virus de papiloma humano tipo 68 Virus de papiloma humano tipo 44 Virus de papiloma humano tipo 70 Virus de papiloma humano tipo 45 Gen de control interno humano El virus de papiloma humano tipo 31 produjo resultados positivos para la prueba de VPH 16 18 Cervista a 1X10 copias reacci n Con una valoraci n adicional del VPH 31 se obtuvieron resultados negativos con la prueba de VPH 16 18 Cervista a lt 1x10 copias reacci n Se realiz un estudio adicional de reactividad cruzada de Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitides y Mycoplasma hominis med
4. Para detectar el ADN gen mico de la muestra el instrumento debe configurarse de modo que pueda detectar primero el fluor foro Red Ajuste la ganancia del lector de la placa de fluorescencia para que est en el rango din mico lineal del lector seg n las instrucciones del fabricante La ganancia debe establecerse de modo que el control negativo NTC muestre valores que est n en el rango de fondo del lector con una RFU m nima de 600 No es necesario que los valores del NTC sean id nticos para las lecturas del FAM y Red Tabla 3 Especificaciones configuraciones del lector de la placa de fluorescencia Medici n 2 Red Superior Medici n 1 FAM Superior Par metros de medici n de etiquetado m ltiple Modo de lectura Longitud de onda ancho de banda de la excitaci n Longitud de onda ancho de banda de la emisi n Cantidad de destellos 485 20 nm 560 20 nm 535 25 nm 612 10 nm 10 10 Tiempo de integraci n 12 de 42 NOTAS DE PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES 1 Los laboratorios deben aplicar buenas pr cticas de laboratorio y cumplir con todos los requisitos de las reglamentaciones federales estatales y locales aplicables 2 No agregue reactivos de diferentes lotes o de diferentes viales del mismo lote Estos componentes han sido evaluados como una unidad No intercambie componentes de otras fuentes o de lotes diferentes 3 No use los reactivos despu s de la fecha de vencimi
5. de las sondas i ern yy 3a Las colas de los oligonucle tidos de las sondas de VPH forman una estructura invasiva en los oliaonucle tidos de la FRET del FAM e lt a A As 7 Wawa Bini 7 TARG ey g 3b Las colas de los oligonucle tidos de las sondas del HIST2H2BE forman una estructura invasiva en los oliaonucle tidos de la FRET del Red 4 4 La enzima Cleavase reconoce la estructura libera fluor foros de los oligonucle tidos de la FRET y genera una se al fluorescente Fluorescencia o FAM Fluorescencia he Red Figura 1 Una oi ia gr fica de la qu mica de Invader en la prueba de VPH 16 18 Cervista 8 de 42 REACTIVOS PROVISTOS Tabla 1 Contenidos de la prueba de VPH 16 18 Cervista REF 95 439 Cantidad de Abreviatura de z Reactivo la etiqueta del viales y Descripci n vial volumen del reactivo VPH 16 016 Oligonucle tidos con afinidad al VPH tipo 16 y Mezcla de Tapa y 1 x 1400 ul al HIST2H2BE humano suspendidos en agua y oligonucle tidos tira rojas en amortiguador MOPS pH 7 5 018 ga ae VPH 18 Oligonucle tidos con afinidad al VPH tipo 18 y Mezcla de dira e 1 x 1400 pl al HIST2H2BE humano suspendidos en agua y oligonucle tidos color azu en amortiguador MOPS pH 7 5 verdoso Soluci n de la E Enzima Cleavase suspendida en 140 mM de l 1x11 i MgCl2 10 mM de Tris pH 8 0 25 mM de KCI ee Tapa y tira 00 0 25 de Twee
6. rese de que las puntas de las pipetas toquen s lo la soluci n que se administra No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Es posible que la placa no est en la orientaci n correcta Cuando analice la placa ori ntela de manera que el pocillo A1 est en la esquina superior izquierda Burbujas en los pocillos de la reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Use las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n 38 de 42 La muestra presenta un resultado de IND diferencia porcentual alta Mezcla de muestras insuficiente o inconstante Adici n inconstante de la mezcla de reacci n Adici n inconstante de la muestra Aseg rese de que todos los reactivos y las muestras se mezclen completamente Al agregar una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3 6 4 veces Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones Verifique que se haya agregado la muestra correcta a cada pocillo
7. 15 VPH 16 muestras cervicouterinas Combinaci n de 16 Neg muestras cervicouterinas 30 de 42 Tabla 28 Resumen de los resultados de la prueba de VPH 18 Cervista de un estudio multic ntrico de reproducibilidad Tipo y FOZ del VPH 18 Porcentaje de VPH 18 positivo n concentraci n Desviaci n Muestra de la muestra Media Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3 p est ndar c lulas ml Neg 100 000 Jurkat 0 927 0 042 0 0 0 0 0 0 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 9 322 0 831 100 5 100 5 100 5 5 000 HeLa 95 000 Jurkat 2 500 HeLa 97 500 Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 10 000 SiHa 90 000 Jurkat 5 000 SiHa 95 000 Jurkat 5 000 SiHa 2 500 HeLa 12 500 Jurkat Combinaci n 9 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 10 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 11 Pos VPH 18 de muestras cervicouterinas Combinaci n 12 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 13 VPH 16 de muestras cervicouterinas Combinaci n 14 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 15 VPH 16 de muestras cervicouterinas Combinaci n 16 Neg de muestras cervicouterinas Pos _Pos 6 121 1 105 100 5 100 5 100 5 Pos 3 645 0 455 Pos 0 831 0 043 Pos VPH 16 Pos VPH 16 8 Pos VPH 18 y VPH 16 Sustancias interferentes Se analizaron tres muestras de l neas celulares una negativa para VP
8. 16 1579 1588 Wheeler CM WC Hunt M Schiffman PE Castle 2006 Human papillomavirus genotypes and the cumulative 2 Year risk of cervical cancer J Infect Dis 194 1291 1299 Bosch X and Harper D 2006 Prevention strategies of cervical cancer in the HPV vaccine era Gynecol Oncol 103 1 21 24 Bulkmans NW Berkhof J Bulk S Bleeker MC van Kemenade FJ Rozendaal L Snijders PJ Meijer CJ POBASCAM Study Group 2007 High risk HPV type specific clearance rates in cervical screening Br J Cancer 96 9 1419 1424 Sandadi S RL Flyckt KM Zanotti 2008 Cost effectiveness of a triage strategy for atypical squamous cells of undetermined significance and low grade squamous intraepithelial lesion cytology using human papillomavirus 16 18 genotyping Gynecological Oncol 108 S96 218 34 de 42 17 18 19 20 21 Saslow D Runowicz CD Solomon D Moscicki A B Smith RA Eyre HJ Cohen C 2002 American Cancer Society guideline for the early detection of cervical neoplasia and cancer CA Can Jour Clin 53 342 362 Wright TC Jr Schiffman M Solomon D Cox JT Garcia F Goldie S et al 2004 Interim guidance for the use of human papillomavirus DNA testing as an adjunct to cervical cytology for screening Obstet Gynecol 103 304 309 Wright TC Jr Massad LS Dunton CJ Spitzer M Wilkinson EJ and Solomon D 2007 2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests Am J Obstet G
9. Pap prueba citol gica cervicouterina de Papanicolaou Red fluor foro rojo Redmond RFU unidad de fluorescencia relativa TWT Third Wave Technologies Inc VPH virus de papiloma humano 4 de 42 RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA Se han registrado m s de 100 tipos de VPH en la bibliograf a aproximadamente 40 de los cuales infectan el rea anogenital y se transmiten por v a sexual El VPH anogenital est asociado con casi todos los tipos de c ncer cervicouterino Anteriormente se ha demostrado que es muy f cil prevenir el c ncer cervicouterino cuando se emplean programas de an lisis citol gicos y de detecci n del VPH para facilitar la detecci n y el tratamiento de lesiones precancerosas De los tipos de VPH de transmisi n sexual 14 genotipos oncog nicos VPH 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 se consideran de alto riesgo debido a su ntima asociaci n con tipos de c ncer cervicouterino en comparaci n con los tipos de VPH de bajo riesgo que pr cticamente no se asocian al c ncer cervicouterino Aun asi la gran mayoria de las infecciones por VPH de alto riesgo son erradicadas Muy pocas mujeres con diagn sticos positivos de ADN de VPH de alto riesgo manifiestan una lesi n intraepitelial escamosa de alto grado HSIL que indique una CIN2 3 subyacente o c ncer El riesgo absoluto de presentar una anomal a citol gica incidental debido a una infecci n por VPH de alto riesgo var a en
10. Selecci n del estudio del software es menor que las muestras agregadas a la placa Vuelva a calcular en forma manual la cantidad requerida de mezcla de reacci n necesaria para completar toda la placa Vuelva a crear las copias de impresi n del software usando la cantidad correcta de muestras Se agreg un volumen de mezcla de reacci n excesivo a la microplaca de 96 pocillos Verifique que se hayan agregado los vol menes de mezcla hace correctos a cada pocillo Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada El control negativo produce los siguientes resultados e Aumento de la ganancia para el an lisis 1 e Aumento de la ganancia para el an lisis 2 e Aumento de la ganancia para ambos an lisis La configuraci n de la ganancia del lector de microplacas de fluorescencia es demasiado baja por lo que hace que los valores de las se ales de fluorescencia desciendan por debajo del requisito m nimo Aumente la configuraci n de ganancia del del fluor metro para los an lisis designados de modo que el control negativo produzca una se al m nima de 600 RFU y vuelva a leer la placa 35 de 42 Observaci n Causa probable Soluciones Ocurren errores durante la importaci n de datos Verifique las configuraciones de resultados del FAM y el Red y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Verifique
11. alto riesgo y de VPH 16 18 y se obtiene un resultado de alto riesgo negativo junto con un resultado de 16 18 positivo el resultado de 16 18 no es interpretable SI los resultados de ambas pruebas son negativos interprete los resultados de la misma manera que lo har a con un resultado negativo de alto riesgo La prueba de VPH 16 18 Cervista no determina si hay tipos de VPH de alto riesgo distintos de los tipos 16 18 presentes Una paciente puede estar simult neamente infectada por m ltiples tipos de VPH Las pacientes con resultado positivo en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y negativo en la prueba de VPH 16 18 Cervista tienen m s probabilidad de estar infectadas por un tipo de VPH de alto riesgo que no es 16 18 CONTROL DE CALIDAD Control interno La prueba de VPH 16 18 Cervista incluye un control interno que determina la cantidad relativa de ADN de la muestra en cada reacci n El control interno el gen de la histona humana 2 se mide mediante una se al de color rojo fluorescente que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente en cada reacci n La medida de este objetivo funciona como mecanismo de control de calidad para confirmar que un resultado negativo no se debe a una muestra insuficiente El objetivo de control interno tambi n funciona como medida de procesamiento interno para asegurar que el procedimiento de la prueba se haya realizado correctamente 15 de 42 Controles externos Contr
12. la configuraci n de ganancia del FAM y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Verifique la configuraci n de ganancia del Red y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Problemas del fluor metro Consulte la Gu a de resoluci n de problemas del Manual del usuario del software Invader Call Reporter para obtener informaci n acerca de los problemas del fluor metro que puedan ayudarlo a solucionar este error El per odo de incubaci n t rmica fue m s extenso que el tiempo espec fico que se recomienda Confirme que la incubaci n se haya realizado en el per odo y la temperatura especificados 36 de 42 El control negativo produce los siguientes resultados e Diferencia porcentual alta control negativo de ADNg Mezcla de reactivos insuficiente o inconstante Preparaci n incorrecta de las mezclas de reacci n Adici n inconsistente del control negativo o la mezcla de reacci n a la microplaca e Aseg rese de que todos los reactivos las muestras y las mezclas de reacci n se mezclen completamente e Al agregar una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3 4 veces e Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adi
13. las distintas poblaciones La presencia de ADN de VPH de alto riesgo concurrente con un resultado de citolog a equivoca o ambigua ASC US predispone a la mujer a un mayor ri sgo de presentar una neoplasia intraepitelial cervicouterina subyacente 2 3 CIN2 o CIN3 La CIN3 si bien se produce s lo en aproximadamente un 5 de los casos de ees US es un precursor inmediato del cancer cervicouterino y por consiguiente su detecci n es muy importante para el tratamiento de la paciente Por lo tanto la identificaci n de las mujeres con citolog a ASC US concurrente con una infecci n por VPH de alto riesgo es til pala que los m dicos puedan decidir qui nes deben controlarse o tratarse m s estrictamente 10 11 12 13 La bibliograf a cient fica actual sugiere que una infecci n por VPH de alto riesgo persistente es el principal factor del riesgo de manifestar neoplasia cervicouterina de alto grado y c ncer La persistencia evidente puede representar una infecci n continua por un s lo tipo de VPH m ltiples tipos de VPH o una reinfecci n Sin embargo las mujeres con citolog a cervicouterina normal con resultados negativos de VPH de alto riesgo aperenismente presentan bajos riesgos de contraer o manifestar lesiones cervicouterinas precancerosas Se sabe que los tipos 16 y 18 de VPH son altamente oncog nicos y persistentes y que se asocian con un 60 y un 10 de los tipos de c ncer cervicouterino respectivamente y a la vez
14. mujeres con citologia NILM estratificada por edad Grupo etario Prevalencia del VPH 16 Prevalencia del VPH 18 Prevalencia del VPH 16 y 18 Positivo 30 lt 40 3 4 21 616 0 8 5 616 0 2 1 616 40 lt 50 4 0 27 674 0 7 5 674 0 0 674 50 lt 60 5 1 25 486 1 0 5 486 0 2 1 486 60 lt 70 3 9 6 154 0 0 154 0 0 154 gt 70 0 0 30 0 0 30 0 0 30 Todos 4 0 79 1960 0 8 15 1960 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO Sensibilidad cl nica y especificidad de la prueba VPH 16 18 Cervista en mujeres con resultados de citolog a cervicouterina ASC US 0 1 2 1960 Se realiz un estudio cl nico multic ntrico y prospectivo para evaluar el rendimiento de la prueba VPH 16 18 Cervista entre las pacientes con resultados de citolog a ASC 18 de 42 US para determinar la necesidad de derivaci n para realizar una colposcopia Todas las caracter sticas de rendimiento cl nico se establecieron mediante muestras citol gicas l quidas tratadas con ThinPrep Las muestras cervicouterinas iniciales en ThinPrep se clasificaron siguiendo el sistema Bethesda 2001 Todas las mujeres a partir de los 18 a os con resultados citol gicos de ASC US durante los procedimientos de prueba de detecci n de c ncer cervicouterino de rutina fueron invitadas a participar en el estudio antes de conocer el estado de VPH Para las mujere
15. no se otorga ninguna otra licencia expresa impl cita o por exclusi n Para obtener informaci n acerca de la disponibilidad de licencias adicionales para practicar las metodolog as patentadas comun quese con Legal Department Third Wave Technologies Inc 502 South Rosa Rd Madison WI 53719 608 273 8933 La prueba de VPH 16 18 Cervista utiliza qu mica patentada de Invader y componentes espec ficos protegidos por N de patentes de EE UU 5 614 402 5 795 763 5 846 717 5 985 557 5 994 069 6 001 567 6 090 543 6 090 606 6 348 314 6 458 535 6 555 357 6 562 611 6 635 463 6 673 616 6 759 226 6 872 816 6 875 572 6 913 881 7 060 436 7 067 643 7 087 381 N de patentes canadienses 2 163 015 2 203 627 N de patentes australianas 694 736 731 062 737 449 738 849 744 369 779 443 781 188 N de patente japonesa 3 665 648 N de patente europea 711 361 Todas las patentes estadounidenses y extranjeras seg n corresponda que se hayan emitido o se emitan en lo sucesivo respecto de las solicitudes de dichas patentes as como todas las solicitudes de patentes y las patentes estadounidenses o extranjeras que se emitan por consiguiente seg n corresponda cuyo objeto en su totalidad o en parte tenga derecho al beneficio de las fechas de solicitud de cualquiera de las patentes o solicitudes de patentes antes enumeradas en este prospecto del producto GARANT A LIMITADA DEL PRODUCTO Third Wave Technolog
16. presentan Jas tasas de eliminaci n m s bajas en los procedimientos de exploraci n cervicouterina 15 18 En consecuencia numerosos estudios informan que las mujeres infectadas por los tipos 16 y 18 de VPH presentan un riesgo significativamente m s alto de manifestar gt CIN3 que las mujeres infectadas por otros tipos de alto riesgo 11 Desde 2002 varios grupos de profesionales sanitarios de los Estados Unidos comenzaron a publicar pautas para el tratamiento de las pacientes con recomendaciones acerca de c mo realizar an lisis de detecci n de c ncer cervicouterino en mujeres seg n la edad la presencia de anomal as citol gicas en una muestra cervicouterina y otros factores 81 Estas pautas para el tratamiento de las pacientes recomiendan la realizaci n de pruebas para la detecci n de tipos de VPH de alto riesgo como una herramienta de detecci n habitual concurrente con la citolog a en dos instancias 1 para mujeres a partir de los 30 a os y 2 como herramienta de diagn stico adicional para mujeres a partir de los 21 a os con ASC US 5 de 42 De acuerdo con 2006 Consensus Guidelines for the Management of Women with Abnormal Cervical Cancer Screening Tests Pautas consensuadas de 2006 para el tratamiento de mujeres con resultados an malos en las pruebas de detecci n de c ncer cervicouterino las mujeres con resultados de citolog a cervicouterina negativos que tienen resultados positivos para la presencia de ADN de VP
17. prueba est n por encima del valor de corte anal tico el 95 de las veces Se calcularon los valores del l mite de detecci n LoD individual para ambos tipos de VPH 16 18 Cada ADN plasm dico de VPH se analiz en concentraciones de 5000 2500 1250 y 625 copias por reacci n cada una en un fondo de tres concentraciones de ADN gen mico aisladas de una l nea celular negativa para VPH 10 ng 100 ng y 1 ug por reacci n Todas las muestras positivas se analizaron en r plicas de ocho que resultaron en 24 r plicas por concentraci n de ADN plasm dico del VPH El LoB y el LoD se evaluaron seg n el documento EP17 A del CLSI El l mite de detecci n para cada tipo de VPH se muestra en la Tabla 21 Los l mites se describen en t rminos del FOZ del FAM y como un rango de la cantidad de copias Los valores LoD de la cantidad de copias por reacci n se informaron como el rango de la cantidad de copias en el cual el 95 de los valores FOZ del FAM observados estaban por encima del LoB Tabla 21 Resumen del an lisis de sensibilidad de la prueba de VPH 16 18 Cervista Tipo de ADN del LoD LoD Desviaci n VPH Cantidad de copias reacci n FOZ del FAM est ndar 16 625 1250 1 34 0 10 18 625 1250 1 33 0 07 Adem s del estudio de sensibilidad anal tica descrito anteriormente se prepararon las diluciones de la l nea de c lulas para evaluar el rendimiento del an lisis de VPH 16 18 con dos l neas de c lulas V
18. seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN INFORMACI N DE CONTACTO Fabricante Third Wave Technologies Inc 502 S Rosa Road Madison WI 53719 EE UU Tel fono 608 273 8933 Sitio Web www twt com Soporte t cnico Third Wave Technologies Inc Tel fono 888 898 2357 opci n 3 40 de 42 AVISO PARA EL DESTINATARIO ACERCA DE LA LICENCIA LIMITADA La recepci n de este producto de Third Wave Technologies Inc o su distribuidor autorizado incluye una licencia limitada no exclusiva conforme a los derechos de patente de Third Wave Technologies Inc La adquisici n de este producto constituye la aceptaci n de la licencia limitada por parte del destinatario Los destinatarios que no deseen aceptar la licencia limitada deber n devolver el producto para obtener un reembolso completo Dicha licencia tiene el nico prop sito de usar este producto para detectar un analito espec fico Para evitar dudas la licencia anterior no incluye derechos de uso de este producto para aplicaciones agr colas o veterinarias La anterior licencia no incluye una licencia de uso del producto para nuevas investigaciones o desarrollos fabricaci n del producto ni objetivo alguno de ingenier a inversa El comprador de este producto no est autorizado a transferirlo a terceros con ning n fin sin el consentimiento expreso por escrito de Third Wave Technologies Inc A excepci n de lo especificado expresamente en este p rrafo
19. superior o igual a 1 50 2 1 50 en caso contrario el control no es v lido para el ADN gen mico bajo 3 La diferencia porcentual entre los valores FOZ del ADNg de ambas mezclas debe ser menor al 25 lt 25 Tabla 6 Criterios de control del VPH FOZ Diferencia FOZ del FOZ del E l Control Resultado VPH 16 VPH 18 promedio porcentua del ADNg FOZ del ADNg Control de VPH 16 Control gt 2 13 lt 2 13 gt 1 50 lt 25 0 v lido Control de VPH 18 Control lt 2 13 gt 2 13 gt 1 50 lt 25 0 v lido Nota es posible analizar controles externos adicionales seg n las pautas o requisitos de las reglamentaciones o de las organizaciones de acreditaci n locales estatales o de cada pa s Los an lisis de controles externos adicionales deben realizarse en pocillos designados para las muestras de las pacientes seg n el dise o de la placa 16 de 42 Verificaci n de la prueba 1 Los resultados de la muestra son v lidos cuando los controles positivos y negativos muestran los resultados correctos Si el control negativo o alguno de los resultados de los controles positivos no son v lidos los resultados de las muestras en la placa no ser n v lidos y deber n repetirse las pruebas Consulte las secciones de Resoluci n de problemas en este prospecto y en el Manual del usuario del software Invader Call Reporter Debe cumplirse con todos los requisitos de control de calidad estipulados por las reglamentaciones lo
20. 16 18 Cervista y resultados de la secuenciaci n para PCR ASC US Secuenciaci n para PCR Resultado de Alto Alto Un ee alte Dos tipos de alto riesgo Multiples tipos de alto riesgo la prueba riesgo riesgo 9 16 18 16 v 18 16 18 Total Cervista IND NEG 16 18 Otro 168 18 y Y Otros y y Y Otros otro otro y otro otro otro VPH de alto riesgo positivo VPH a 6 7 25 96 0 41 0 29 0 1 0 6 0 0 205 positivo VERS 0 0 o 2 7 0 0 9 0 0 0 0 0 43 positivo VERG y 18 0 1 2 0 1 2 1 1 0 3 0 1 1 13 positivo vee y 18 32 95 e 2 335 0 1 0 27 0 2 0 3 503 negativo VPH 16 y o 48 indefinido 2 1 0 0 7 0 0 0 2 0 0 0 0 12 VPH de alto riesgo negativo yee 1 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 positivo VPH 16 y 35 510 9 o 10 0 0 0 1 0 0 0 0 565 18 negativo VPH 16 6 18 indefinido 1 5 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 7 Total 78 640 115 29 402 2 31 10 31 3 8 1 4 1354 Entre las pacientes con resultados definitivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y muestras de secuenciaci n para PCR el porcentaje de resultados de la prueba de VPH 16 18 Cervista indeterminada para mujeres con citolog a ASC US fue del 1 4 19 1354 con un IC del 95 de 0 9 a 2 2 Tabla 20 Comparaci n de los resultados de la prueba de VPH 16 Cervista o VPH 18 con los resultados de la secuenciaci n para PCR para la
21. H una positiva para VPH 16 y una positiva para VPH 18 descritas en la Tabla 29 con interferentes que podr an estar presentes en la muestra cervicouterina o pudieron transferirse de manera inadvertida durante la extracci n de la muestra mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Tabla 30 Los niveles de concentraci n se seleccionaron de modo que representaran las condiciones extremas que podr an presentarse durante la obtenci n de 31 de 42 la muestra si el cuello uterino no se limpiase antes de realizar el procedimiento El ADN se aisl de las muestras puras e impuras mediante el kit de extracci n de ADN Genfind y se analiz con la prueba de VPH 16 18 Cervista para evaluar la interferencia producida por las sustancias introducidas Tabla 29 Descripciones de las muestras de las sustancias interferentes Muestra Descripci n Muestra de l nea celular almacenada en soluci n PreservCyt que contiene 100 000 c lulas ml de c lulas Jurkat negativas para VPH Muestra de l nea celular almacenada en soluci n PreservCyt que contiene 7 500 c lulas ml de c lulas SiHa positivas para VPH 16 y 92 500 c lulas ml de c lulas Jurkat Muestra de l nea celular almacenada en soluci n PreservCyt que contiene 2 500 c lulas ml de c lulas HeLa positivas para VPH 18 y 97 500 c lulas ml de c lulas Jurkat Jurkat SiHa Jurkat HeLa Jurkat Tabla 30 Resultados de la interferencia Sustancias interferentes C
22. H de alto riesgo se beneficiarian con la genotipificaci n de los tipos espec ficos de VPH Los estudios respaldan la validez de la genotipificaci n de los tipos 16 y 18 de VPH ya sea utilizada como seguimiento de una prueba de VPH de alto riesgo o realizada concurrentemente 29 10 13 19 20 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO Cervista para VPH 16 18 es una prueba cualitativa in vitro para la detecci n del ADN de dos tipos de VPH de alto riesgo 16 y 18 La prueba de VPH 16 18 Cervista usa la qu mica de Invader como m todo de multiplicaci n de la se al para la detecci n de secuencias espec ficas de cido nucleico La tecnolog a Invader usa dos tipos de reacciones isot rmicas una reacci n primaria que se produce en la secuencia del ADN objetivo y una reacci n secundaria que produce una se al fluorescente consulte la Figura 1 En la reacci n primaria dos tipos de oligonucle tidos espec ficos de la secuencia es decir un oligonucle tido de sonda y un oligonucle tido de Invader se unen a la secuencia del ADN objetivo Cuando los oligonucle tidos se superponen en al menos un par de base en la secuencia objetivo se forma una estructura invasiva que act a como un sustrato de la enzima Cleavase La enzima segmenta la porci n 5 cola de la sonda en la ubicaci n de la superposici n Las sondas est n presentes en un elevado exceso molar y activan y desactivan r pidamente la secuencia objetivo de modo que se generan mu
23. I Cada an lisis consisti en muestras de ADN gen mico aisladas de dos l neas de c lulas VPH positivas SiHa tipo 16 y HeLa tipo 18 una l nea de c lulas VPH negativas Jurkat y muestras artificiales que conten an ADN plasm dico de VPH 16 y VPH 18 y ADN de Jurkat Cada muestra se analiz por duplicado La cantidad total de mediciones por muestra fue de 84 21 d as 2 an lisis por d a 2 r plicas por an lisis Se calcularon los valores de repetibilidad y precisi n intralaboratorio para cada objetivo en cada concentraci n Los valores de precisi n para el FOZ del VPH 16 se muestran en la Tabla 22 y los valores para el FOZ del VPH 18 se muestran en la Tabla 23 En las Tablas 24 y 25 se presenta un resumen de los resultados positivos para VPH 16 y positivos para VPH 18 respectivamente Tabla 22 Valores de precisi n de VPH 16 para cada objetivo y concentraci n Intraan lisis Total precisi n repetibilidad Interserial Interdiaria Interoperador intralaboratorio Copias reacci n DE CV DE CV DE CV DE CV DE CV Objetivo o c lulas ml 5 000 5 6 9 10 11 20 000 9 6 5 4 10 5 000 3 4 3 3 5 20 000 4 1 4 5 71 5 000 SiHa 95 000 Jurkat 71 5 6 6 8 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 2 500 HeLa 97 500 Jurkat 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 10 000 Jurkat 20 000 100 000 VPH 16 VPH 18 a ADN plasm
24. PH positivas HeLa y SiHa diluidas con una l nea de c lulas VPH negativas Jurkat en una concentraci n final de 100 000 c lulas ml en el medio PreservCyt Se aisl el ADN de las muestras de la l nea de c lulas mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Con un valor de corte de FOZ cl nico para VPH 16 y VPH 18 de 2 13 las concentraciones de aproximadamente 2 500 c lulas ml para las c lulas SiHa y HeLa estuvieron por encima del corte cl nico el 95 de las veces Valor de corte cl nico de la prueba de VPH 16 18 Cervista El valor de corte cl nico se evalu sobre la base de los resultados de la prueba de VPH 16 18 con el objetivo de una tasa positiva del 5 en la poblaci n con NILM gt 30 de un estudio cl nico multic ntrico Se determin el percentil 95 de los valores m ximos FOZ del VPH 16 y VPH 18 para las pacientes con NILM gt 30 y sobre la base de este an lisis se seleccion un valor FOZ gt 2 13 como el valor de corte positivo para la prueba de VPH 16 y VPH 18 Cervista 26 de 42 Precisi n La repetibilidad y la precisi n intralaboratorio de la prueba de VPH 16 18 Cervista se demostraron en un estudio de 21 d as de duraci n con tres operadores alternantes y cada uno realiz dos an lisis por d a en equipos asignados de forma individual Cada los an lisis consisti en una placa Se usaron dise os de placas diferentes para los an lisis en cada d a El procedimiento sigui las normas EP5 A2 del CLS
25. Por su dise o las colas de 5 liberadas se unen s lo con sus respectivos oligonucle tidos de FRET para generar una se al objetivo espec fica consulte la Figura 1 Un resultado positivo para VPH 16 VPH 18 VPH 16 y VPH 18 est representado por una se al del FAM fluorescente que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente Para cada reacci n un resultado negativo est representado por una se al fluorescente del FAM que se encuentra por debajo del mismo valor de corte derivado emp ricamente Como medio de determinaci n de la cantidad relativa de ADN de la muestra en cada reacci n el gen 6 de 42 de la histona humana 2 se mide mediante una se al de color rojo fluorescente que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente en cada reacci n La medida de este objetivo funciona como mecanismo de control de calidad para confirmar que un resultado negativo no se debe a una muestra insuficiente El objetivo de control interno tambi n funciona como medida de procesamiento interno para asegurar que el procedimiento de la prueba se haya realizado correctamente 7 de 42 1a Los oligonucle tidos de VPH forman una estructura invasiva en el ADN del VPH Tm MICA men Y ES TARGET 1b Los oligonucle tidos del HIST2H2BE forman una estructura invasiva en el ADN gen mico This This a iF SS wee TT E TARGET Pub 2 La enzima Cleavase reconoce la estructura y segmenta los oligonucle tidos
26. S La prueba de VPH 16 18 Cervista est dise ada para mejorar los m todos existentes para la detecci n de la enfermedad cervicouterina y debe usarse concurrente con la informaci n cl nica derivada de otras pruebas de diagn stico y detecci n exploraciones f sicas y antecedentes cl nicos completos seg n los procedimientos apropiados para el tratamiento de la paciente La prueba de VPH 16 18 Cervista no debe usarse como nica base para la evaluaci n cl nica y el tratamiento de las pacientes ABREVIATURAS USADAS ADN cido desoxirribonucleico ADNg ADN genomico ASC US c lulas escamosas atipicas de significado indeterminado CIN neoplasia intraepitelial cervicouterina CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute Instituto de estandares cl nicos y de laboratorio FAM fluor foro carboxifluoresce na FOZ curvatura sobre cero la se al de la muestra o del control dividida por la se al de control negativo FRET transferencia de energ a por resonancia de fluorescencia HIST2H2BE gen de la histona humana 2 gen H2be LoB l mite de blanco LoD l mite de detecci n LSIL lesi n intraepitelial escamosa de bajo grado M x m ximo M n m nimo NILM resultado negativo del an lisis de detecci n de lesiones intraepiteliales o neoplasia Esta categor a engloba a las categor as anteriores dentro de los l mites normales y cambios celulares benignos NTC control negativo Oligo oligonucle tido
27. VPH Jurkat gt ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml Reproducibilidad La reproducibilidad de la prueba de VPH 16 18 Cervista se evalu en tres sitios externos mediante un panel de c lulas cultivadas positivas y negativas para VPH y muestras cervicouterinas positivas y negativas para VPH El ADN se extrajo de 2 ml de muestra cervicouterina o c lulas cultivadas suspendidas en soluci n PreservCyt El ADN se extrajo mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Se extrajo el ADN de 16 muestras y se analiz con la prueba de VPH 16 18 Cervista en tres sitios durante cinco dias no consecutivos dentro de un per odo de dos semanas Se utilizaron dos lotes de kits de la prueba de VPH 16 18 Cervista y tres lotes de Kits de extracci n de ADN Genfind en tres sitios del estudio La cantidad total de mediciones para cada muestra fue 15 3 sitios x 5 d as x 1 an lisis por d a En la Tabla 26 se muestra un resumen de la coincidencia porcentual entre los resultados previstos y observados combinados para todos los sitios En la Tabla 27 y la Tabla 28 se presenta un resumen de los resultados de las muestras individuales en los sitios con una media acumulada desviaci n est ndar e intervalo de confianza del 95 para los valores FOZ del VPH 16 y el VPH 18 Tabla 26 Resumen de los datos del estudio de reproducibilidad multic ntrico
28. VPH 16 18 Cervista no se estableci adecuadamente para las pacientes vacunadas contra el VPH Se observ interferencia en las muestras cervicouterinas contaminadas con niveles altos 2 de jalea anticonceptiva o cremas antimic ticas cuando se aisl el ADN con el kit de extracci n de ADN Genfind En estas condiciones pueden obtenerse resultados falsos negativos La prueba de ADN de VPH 16 18 Cervista para los tipos de papiloma humano 16 y 18 no se recomienda para evaluaci n en los casos de sospecha de abuso sexual 10 La prevalencia de la infecci n por VPH en una poblaci n puede afectar el rendimiento Los valores predictivos positivos disminuyen al analizar poblaciones con baja prevalencia o pacientes sin riesgo de infecci n 11 La infecci n por VPH no es un indicador de HSIL citol gica o CIN de alto grado subyacente ni implica que se manifestar una CIN2 3 o c ncer La mayor a de las mujeres infectadas por uno o m s tipos de VPH de alto riesgo no desarrollan CIN2 3 ni c ncer 17 de 42 12 Un resultado negativo para VPH 16 18 no excluye la posibilidad de manifestar HSIL citol gica o CIN2 3 subyacentes o c ncer 13 Las muestras en la soluci n PreservCyt que contienen vol menes menores a 2 ml despu s de la preparaci n de los portaobjetos de la prueba de Papanicolau con ThinPrep se consideran inadecuadas para la prueba de VPH 16 18 Cervista RESULTADOS PREVISTOS Prevalencia de VPH 16 y VPH 18 de al
29. Verifique que se haya agregado el volumen correcto de la muestra a cada pocillo Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos Sospecha de contaminaci n durante la adici n de la muestra Use puntas con barrera de aerosol sin nucleasa y tubos est riles durante la configuraci n Use guantes durante la preparaci n de la prueba Aseg rese de que las puntas de las pipetas toquen s lo la soluci n que se administra No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Burbujas en los pocillos de la reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Use las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n 39 de 42 La muestra presenta un resultado de IND ADNg bajo Cantidad insuficiente de c lulas en la muestra Sospecha de error durante la extracci n de ADN En la prueba se utiliz una cantidad insuficiente de ADN e Mezcle bien la muestra y repita la extracci n de ADN para la muestra e Verifique que se haya agregado el volumen correcto de l
30. a muestra a cada pocillo e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN Inhibici n de la muestra de ADN Repita la extracci n de ADN de la muestra Consulte el anexo del paquete en la secci n Caracter sticas de los resultados Sustancias interferentes Es posible que las muestras de ADN no se hayan desnaturalizado completamente Aseg rese de que la muestra se haya desnaturalizado a la temperatura correcta y durante el tiempo adecuado La muestra presenta un resultado de IND FOZ del VPH bajo Sospecha de error durante la extracci n de ADN Inhibici n de la muestra de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN e Consulte el anexo del paquete en la secci n Caracter sticas de rendimiento Sustancias interferentes Volumen de ADN de la muestra insuficiente Volumen de eluci n insuficiente durante la extracci n de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN Cantidad alta de muestras de ADN con valores FOZ del FAM positivos en ambas mezclas de de reacci n Sospecha de error durante la extracci n de ADN Sospecha de contaminaci n del reactivo de extracci n de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se haya
31. as compa as Algunos componentes del an lisis del cido nucleico como las composiciones y los m todos espec ficos de manipulaci n o visualizaci n de los cidos nucleicos que se deben analizar pueden estar cubiertos por una o m s patentes de terceros De forma similar los cidos nucleicos que contienen secuencias de nucle tidos espec ficas pueden estar patentados La fabricaci n el uso o la venta de estos componentes o cidos nucleicos pueden requerir de una o m s licencias Ninguna parte del contenido de este documento debe considerarse como una autorizaci n o licencia impl cita de fabricaci n uso o venta de ning n componente o cido nucleico protegido por dichas patentes 2009 Third Wave Technologies Inc P N 15 3101 2401 Revisi n 100 42 de 42
32. cales estatales y federales as como con los requisitos de acreditaci n correspondientes LIMITACIONES 1 La prueba de VPH 16 18 Cervista s lo detecta el ADN de los tipos 16 y 18 del VPH No detecta los tipos de VPH de alto riesgo 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Tampoco detecta los tipos de VPH de bajo riesgo dado que no se conoce ninguna utilidad clinica para las pruebas de detecci n de dichos tipos de VPH La prueba de VPH 16 18 Cervista muestra una reactividad cruzada con niveles altos del VPH de alto riesgo tipo 31 Se observ un resultado positivo para VPH 16 con 10 copias reacci n de VPH tipo 31 Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infecci n por VPH 16 18 porque los niveles muy bajos de infecci n o un error en la muestra pueden generar un resultado falso negativo La prueba se valid para utilizar con muestras citol gicas cervicouterinas obtenidas en soluci n PreservCyt con una brocha Rovers Cervex Wallach Papette o una brocha esp tula para an lisis cervicouterino El rendimiento de la prueba de VPH 16 18 Cervista se estableci con el uso del ADN extra do con el kit de extracci n de ADN Genfind El rendimiento de la prueba de VPH 16 18 Cervista se estableci con el uso de muestras citol gicas cervicouterinas PreservCyt procesadas en el procesador ThinPrep 2000 no se estableci con el uso de otros procesadores El rendimiento de la prueba de
33. chas colas segmentadas de 5 por secuencia objetivo Luego las colas segmentadas se unen a un oligonucle tido de transferencia de energ a de resonancia de fluorescencia FRET en forma de horquilla y crean otra estructura invasiva que la enzima Cleavase reconoce como un sustrato La enzima segmenta los oligonucle tidos de la FRET entre el fluor foro y la mol cula extintora y produce una se al fluorescente a medida que las colas segmentadas entran o salen del ciclo Para cada copia del objetivo las reacciones primaria Me secundaria combinadas generan una multiplicaci n de la se al de 10 10 veces por hora Las secuencias de las colas y los oligonucle tidos de la FRET son universales ya que no son complementarios de la secuencia objetivo Los reactivos para esta prueba se proporcionan como dos mezclas de oligonucle tidos que detectan VPH 16 y VPH 18 Los oligonucle tidos que se unen al gen de la histona humana 2 H2be HIST2H2BE tambi n est n presentes en estas dos mezclas de oligonucle tidos El HIST2H2BE funciona como un control interno que produce una se al desde el ADN celular presente en la muestra El formato de la prueba de VPH 16 18 Cervista permite la detecci n simult nea de secuencias de ADN de VPH y HIST2H2BE en un mismo pocillo al utilizar dos secuencias de colas de 5 diferentes en las sondas y tambi n dos oligonucle tidos de la FRET diferentes cada uno con un fluor foro de distinto espectro FAM y Red
34. cidad 69 3 480 693 65 7 a 72 6 20 de 42 Tabla 13 Rendimiento de la prueba de VPH 16 18 Cervista comparados con los resultados de colposcopia histolog a central 2 CIN3 en mujeres con citolog a ASC US Resultado de la 2 CIN3 prueba de VPH de Resultado de la prueba de alto riesgo VPH 16 18 Cervista Positivo Negativo Total Cervista VPH 16 positivo 14 187 201 VPH de alto riesgo VPH 18 positivo 1 42 43 positivo VPH 16 y 18 positivos 2 11 13 VPH 16 y 18 negativos 5 495 500 VPH de alto riesgo VPH 16 18 positivos 0 7 7 negativo VPH 16 y 18 negativos 0 548 548 Total 22 1290 1312 Tabla 14 Riesgo de gt CIN3 para diferentes resultados de las pruebas de VPH de alto riesgo Cervista y de VPH 16 18 Cervista Prevalencia de gt CIN3 1 7 Resultado de la Resultado de la prueba prueba de VPH Intervalo de Intervalo de de alto riesgo pe confianza del ndice de confianza del Cervista Riesgo 95 probabilidades 95 E 6 6 VPHdealto VPH 166 18 positivos 47 957 4 2 10 3 4 15 2 99 5 08 riesgo positivo 1 0 VPH 16 y18 negativos ll s s0o O a 23 0 59 0 26 1 14 VPH de alto VPH 16 18 positivos o 0 0 riesgo negativo negativos 0 555 0 0 0 7 0 00 0 00 0 37 Tabla 15 Rendimiento de la prueba de VPH 16 18 Cervista para mujeres con resultado positivo en la prueba de VPH de alto riesg
35. ciones e Verifique que se haya agregado el reactivo correcto a cada pocillo e Verifique que se hayan agregado los vol menes de mezcla de reactivos correctos a cada pocillo e Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada e Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos Sospecha de contaminaci n durante la adici n de la muestra o la preparaci n de la mezcla de reacci n Use puntas con barrera de aerosol sin nucleasa y tubos est riles cuando haga las mezclas de reacci n Use guantes durante la preparaci n de la prueba Dado que puede haber nucleasas presentes aseg rese de que las puntas de las pipetas no toquen ninguna otra superficie excepto la soluci n que se est preparando No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Burbujas en los pocillos de la reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Use las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n 37 de 42 Los controles presentan el resultado Invalid Control control inv lido Mezcla de los controles insuficiente o inc
36. cla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla de de de de de de de de de de de de VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH VPH 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C16 C16 S06 S06 14 14 22 22 30 30 38 38 C18 C18 S07 S07 15 15 23 23 31 31 39 39 NTC NTC S08 S08 S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40 S01 S01 S09 S09 S17 S17 S25 S25 S33 S33 S41 S41 S02 S02 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34 42 42 S03 S03 11 11 19 19 27 27 35 35 43 43 S04 S04 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 S44 S44 ZION MO On iy gt S05 S05 13 13 21 21 29 29 37 37 45 45 Figura 2 Dise o de la placa de la prueba de VPH 16 18 Cervista 2 Cubra bien cada pocillo con 20 pl de aceite mineral y utilice cinta para sellar la placa y minimizar la evaporacion Incube las muestras a 95 C durante 5 minutos en un termociclador Mezcle bien los reactivos y las mezclas de reacci n de forma constante con anterioridad al uso 5 Prepare las mezclas de reacci n como se indica en la hoja de preparaci n de la mezcla impresa del software Invader Call Reporter o seg n los c lculos en la Tabla 2 Prepare una mezcla reactiva para cada una de las dos mezclas de oligonucle tidos de VPH antes de cada uso 11 de 42 Tabla 2 Instrucciones para la preparaci n de la mezcla de reacci n 8 Reactivo Mezcla de oligon
37. de alto riesgo positivo VPH 16 positivo VPH 18 positivo VPH 16 y 18 positivo VPH 16 y 18 negativos VPH de alto riesgo negativo VPH 16 positivo VPH 18 positivo VPH 16 y 18 negativos Total Entre las pacientes con resultados definitivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y muestras de secuenciaci n para PCR el porcentaje de resultados de la prueba de VPH 16 18 Cervista para las mujeres con citolog a NILM fue del 0 0 1933 con un IC del 95 de 0 a 0 2 Tabla 18 Comparaci n de los resultados de la prueba de VPH 16 Cervista o VPH 18 con los resultados de la secuenciaci n para PCR para las mujeres con resultados positivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista NILM gt 30 Secuenciaci n para PCR de alto riesgo positiva VPH 16 VPH 18 Total Prueba de VPH de alto riesgo Cervista oo SRA Positivo Negativo positiva Prueba de VPH 16 y o 18 Cervista positiva 17 58 75 Prueba de VPH 16 y o 18 Cervista negativa 1 266 267 Total 18 324 342 Coincidencia porcentual positiva y coincidencia porcentual negativa Intervalo de confianza Coincidencia Porcentaje A del 95 Coincidencia porcentual positiva 94 4 17118 74 2 99 0 Coincidencia porcentual negativa 82 1 266 324 77 6 85 9 24 de 42 Tabla 19 Rendimiento de la prueba VPH
38. de la prueba de VPH 16 18 Cervista Resultado previsto Cantidad de resultados Resultados coincidentes Coincidencia porcentual L mite inferior del intervalo de confianza del 95 Positivo 150 150 100 0 97 5 Negativo 90 90 100 0 95 9 29 de 42 Tabla 27 Resumen de los resultados de la prueba de VPH 16 Cervista de un estudio multic ntrico de reproducibilidad Tipo y concentraci n de la muestra Manip Muestra Media Desviaci n sitio q Sitio 2 sitios Total c lulas ml estandar n Neg 100 000 Jurkat 0 899 0 048 0 0 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 5 000 HeLa Pos VPH 18 95 000 Jurkat 0 847 0 083 FOZ del VPH 16 Porcentual de VPH 16 positivo n Pos VPH 18 0 883 0 076 2 500 HeLa 97 500 Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 10 000 SiHa Pos VPH 16 90 000 Jurkat 4 933 0 598 5 000 SiHa Pos VPH 16 95 000 Jurkat 3 049 0 473 BE 5 000 SiHa ae Y 2 500 HeLa 3 047 0 387 VPH 16 12 500 Jurkat Pos VPH 18 0 833 0 073 Pos VPH 16 6 345 0 553 Combinaci n 9 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 10 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n 11 Pos VPH 18 de muestras cervicouterinas Combinaci n 12 Neg de muestras cervicouterinas Combinaci n de 13 VPH 16 muestras cervicouterinas Combinaci n de 14 Neg muestras cervicouterinas Combinaci n de
39. do con gt ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml 28 de 42 Tabla 25 Resumen de los resultados positivos para VPH 18 para el estudio de precisi n Porcentaje de VPH 18 positivo n Objetivo Copias reacci n o c lulas ml Media de FOZ del VPH 18 Operador 1 Operador 2 Operador 3 Total 5 000 0 978 0 0 0 0 0 0 0 0 VPH 16 20 000 0 990 0 0 0 0 0 0 0 0 5 000 3 620 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 18 20 000 8 483 100 28 100 28 100 28 100 84 5 000 SiHa 95 000 Jurkat 0 874 0 0 0 0 0 0 0 0 SiHa Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 0 858 0 0 0 0 0 0 0 0 2 500 HeLa 97 500 Jurkat 2 988 100 28 100 28 100 28 100 84 Hela Jurkat 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 7 918 100 28 100 28 86 24 95 80 10 000 0 927 0 0 0 0 0 0 0 0 Jurkat 20 000 0 920 0 0 0 0 0 0 0 0 100 000 0 951 0 0 0 0 0 0 0 0 ADN plasm dico de VPH 16 VPH 18 en la concentraci n indicada copias reacci n mezclado con 100 ng reacci n de ADN gen mico negativo para
40. dor u horno capaz de mantener las temperaturas de reacci n recomendadas 10 de 42 OBTENCI N DE MUESTRAS EXTRACCI N DE ADN Y ALMACENAMIENTO PARA EL ANALISIS Las muestras cervicouterinas deben obtenerse en la soluci n PreservCyt el sistema de conservaci n de la prueba de Papanicolau ThinPrep mediante un dispositivo tipo brocha p ej la brocha Rovers Cervex Wallach Papette o una brocha esp tula para an lisis cervicouterino Para la prueba de VPH 16 18 Cervista las muestras cervicouterinas pueden almacenarse a temperatura ambiente 20 C a 30 C en soluci n PreservCyt hasta 18 semanas antes de realizar la prueba Las muestras en soluci n PreservCyt no pueden congelarse Debe extraerse ADN debe obtenerse de las muestras en PreservCyt mediante el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Nota extraiga ADN de las muestras cervicouterinas obtenidas en soluci n PreservCyt mediante el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 antes de comenzar el procedimiento de reacci n El ADN residual extra do como parte de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista puede utilizarse para la prueba de VPH 16 18 Cervista Procedimiento de reacci n 1 Agregue 10 pl del ADN de cada control y de cada muestra a dos pocillos de una placa de 96 pocillos seg n se indica en el dise o de la placa de la prueba consulte la Figura 2 Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mez
41. encia de la enfermedad Total 13 281 6 0 10 166 intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad Edad a partir de 39 a os 70 0 7 10 80 8 126 156 34 8 a 93 3 73 7 a 86 6 Positivo Negativo VPH de alto riesgo positivo VPH de alto riesgo negativo VPH 16 y o 18 positivos 27 VPH 16 y 18 negativos 103 Prevalencia de la enfermedad Total 17 10 3 15 145 intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad 60 0 9 15 79 2 103 130 32 3 a 83 7 71 2 a 85 8 Prevalencia de gt CIN2 en mujeres con resultados positivos en la prueba de VPH Cervista A PARTIR DE LOS 30 A OS EN MUJERES CON CITOLOG A NILM EL RENDIMIENTO DE LA PRUEBA DE VPH 16 18 CERVISTA COMO PRUEBA ADICIONAL DE VPH PARA GUIAR EL TRATAMIENTO DE LA PACIENTE Se inici un estudio longitudinal de tres a os de duraci n posterior a la aprobaci n para avalar el uso de la prueba de VPH 16 18 Cervista como prueba adicional en mujeres a partir de los 30 a os con citolog a normal y resultados positivos en la prueba de VPH de alto riesgo El dise o del estudio se describe a continuaci n junto con datos anal ticos preliminares 22 de 42 obtenidos de la poblaci n del estudio al momento del ingreso Este estudio anal tico se utiliz para evaluar la coincidencia de la prueba de VPH 16 18 Cervista con secuenciaci n de ADN c
42. ento 4 Mezcle bien las muestras los reactivos y las mezclas de reacci n de forma constante 5 Use puntas de pipeta de barrera en aerosol est riles descartables y sin nucleasa para cada adici n y transferencia para evitar la contaminaci n cruzada 6 Utilice tubos de polipropileno descartables sin nucleasa para la preparaci n de las mezclas de reacci n 7 Verifique que el tipo de placa de 96 pocillos sea compatible con el termociclador espec fico y el lector de la placa de fluorescencia que se usar antes de comenzar la prueba 8 Deben agregarse controles en las posiciones designadas en el dise o de la placa de la prueba que se muestra en la Figura 2 a fin de que el software Invader Call Reporter funcione correctamente 9 Utilice aceite mineral nuevo para la configuraci n de cada reacci n no transfiera estos reactivos nuevamente al contenedor original una vez que los haya aplicado 10 Consulte el dise o de la placa de la prueba a fin de asegurarse de haber agregado la mezcla correcta en la columna apropiada 11 Siempre coloque la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del pocillo para asegurarse de que la mezcla de reacci n se agregue debajo del aceite mineral Para mezclar llene y vac e cuidadosamente la punta de la pipeta de 3 a 5 veces 12 Debe hacerse un seguimiento del procedimiento de la prueba de VPH 16 18 Cervista los controles de calidad y la interpretaci n de los resultados para obtener resu
43. hiffman M and Tarone R 2001 Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance baseline results from a randomized trial Jour Nat Can Inst 93 4 293 299 Sherman ME Schiffman M and Cox TJ 2002 Effects of age and human papilloma viral load on colposcopy triage data from the randomized Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance Low grade Squamous Intraepithelial Lesion Triage Study ALTS Jour Nat Can Inst 94 2 102 107 Davey DD Neal MH Wilbur DC Colgan TJ Styer PE and Mody DR 2004 Bethesda 2001 implementation and reporting rates 2003 practices of participants in the college of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytology Arch Path Lab Med 128 1224 1229 Khan MJ Castle PE Lorincz AT et al 2005 The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus HPV type 16 or 18 and the possible utility of type specific HPV testing in clinical practice J Natl Cancer Inst 97 1072 1079 Castle PE et al 2005 Human Papillomavirus Type 16 Infections and 2 Year Absolute Risk of Cervical Precancer in Women With Equivocal or Mild Cytologic Abnormalities J Natl Cancer Inst 97 1066 1071 Mayrand MH E Duarte Franco Rodrigues SD Walter J Hanley 2007 A Ferenczy S Ratnam F Coutl e EL Franco Human papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening tests for cervical cancer N Engl J Med 357
44. iante microorganismos completos a adidos a la soluci n PreservCyt con c lulas Jurkat negativas para VPH 100 000 c lulas ml Se prepararon tres lotes de cada microorganismo y se aisl el ADN de todas las muestras mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Este estudio demostr que la prueba de VPH 16 18 Cervista no presenta reactividad cruzada con el ADN aislado de las muestras en PreservCyt que contienen hasta 1 0x10 cfu ml de Neisseria meningitides y Mycoplasma hominis 5x10 cfu ml de Neisseria gonorrhoeae y 1 0x10 cfu ml Chlamydia trachomatis 33 de 42 REFERENCIAS 1 10 11 12 13 14 15 16 Sitio Web de la American Society for Colposcopy and Cervical Pathology www asccp org 2008 Sitio Web del National Cancer Institute www cancer gov 2008 Meijer CJ Snijders PJ and Castle PE 2006 Clinical utility of HPV genotyping Gynecol Oncol 103 12 17 Winer RL N Kiviat J Hughes D Adams S Lee J Kuypers L Koutsky 2005 Development and duration of human papillomavirus lesions after initial infection J Infect Dis 191 731 738 Schlecht NF Kulaga S Robitaille J et al 2001 Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia JAMA 286 3106 3114 Wright TC Jr Cox JT Massad LS Twiggs LB Wilkinson EJ 2002 2001 consensus guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities JAMA 287 2120 2129 Solomon D Sc
45. idico de VPH 16 VPH 18 en la concentraci n indicada copias reacci n mezclado con 100 ng reacci n de ADN gen mico negativo para VPH Jurkat gt ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml 27 de 42 Tabla 23 Valores de precisi n de VPH 18 para cada objetivo y concentraci n Media de Intraan lisis Total precisi n Copias reacci n FOZ del repetibilidad Interserial Interdiaria Interoperador intralaboratorio Objetivo o c lulas ml N VPH 18 DE CV DE CV DE CV DE CV DE CV VPH 16 5 000 84 0 978 0 041 4 0 055 6 0 059 6 0 050 5 0 076 8 20 0007 84 0 990 0 055 6 0 068 7 0 062 6 0 043 4 0 087 9 VPH 18 5 000 84 3 620 0 243 7 0 255 7 0 265 7 0 230 6 0 363 10 20 000 84 8 483 0 396 5 0 613 7 0 595 7 0 378 4 0 787 9 5 000 SiHa SiHa 95 000 Jurkat 84 0 874 0 051 6 0 035 4 0 045 5 0 043 5 0 062 7 Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 84 0 858 0 023 3 0 052 6 0 043 5 0 044 5 0 059 7 2 500 HeLa 9 Hela 97 500 Jurkat 84 2 988 0 163 5 0 174 6 0 175 6 0 064 2 0 243 8 Jurkat 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 84 7 918 0 427 5 1 466 19 1 757 22 0 463 6 2 062 26 10 000 84 0 927 0 055 6 0 054 6 0 055 6 0 043 5 0 077 8 Jurkat 20 000 84 0 920 0 035 4 0 038 4 0 035 4 0 027 3 0 051 6 100 000 84 0 951 0 054 6 0 042 4 0 036 4 0 031 3 0 060 6
46. ies Inc garantiza que este producto cumplir las especificaciones establecidas en la hoja de informaci n del producto Si alguno de los componentes de este producto no cumple estas especificaciones Third Wave Technologies Inc a discreci n propia con responsabilidad nica y exclusiva y como recurso nico y exclusivo de los usuarios reemplazar el producto sin cargo o reembolsar el costo del mismo siempre que se notifique del incumplimiento a Third Wave Technologies Inc dentro de los sesenta 60 d as de la recepci n del producto Esta garant a limita la responsabilidad de Third Wave Technologies Inc al reemplazo o el reembolso del costo de este producto THIRD WAVE TECHNOLOGIES INC NO PROPORCIONA NINGUNA OTRA GARANT A EXPRESA O IMPL CITA INCLUIDAS ENTRE OTRAS LA GARANT A IMPL CITA DE COMERCIALIZACI N O ADECUACI N PARA UN FIN PARTICULAR O NO INCUMPLIMIENTO Third Wave Technologies Inc no tendr responsabilidad alguna por da os directos indirectos consecuentes o incidentales que surjan 41 de 42 del uso de los resultados del uso o de la incapacidad de uso de este producto y sus componentes Third Wave Cleavase e Invader son marcas registradas de Third Wave Technologies Inc Cervista e Invader Call Reporter son marcas registradas de Third Wave Technologies Inc Todas las otras marcas comerciales marcas registradas a las que se hace referencia en este prospecto del producto son propiedad de sus respectiv
47. itivos de obtenci n Soluci n PreservCyt con sistema de conservaci n ThinPrep para pruebas de Papanicolaou Dispositivo tipo brocha p ej brocha Rovers Cervex Wallach Papette o brocha espatula para analisis cervicouterino ADVERTENCIAS Esta prueba no est dise ada para determinar la necesidad de tratamiento es decir tratamiento mediante escisi n o ablaci n del cuello uterino en ausencia de displasia cervical de alta malignidad Las pacientes con diagn sticos positivos de VPH 16 18 deben ser monitoreadas estrictamente para detectar el desarrollo de displasia cervical de alta malignidad de acuerdo con las pautas de las pr cticas profesionales actuales La prueba de VPH 16 18 Cervista no est dise ada para utilizarse como un an lisis independiente Los resultados deben interpretarse junto con los resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y la prueba citol gica cervicouterina La prueba de VPH 16 18 Cervista no est dise ada para utilizarse en mujeres menores de 30 a os con citolog a cervical normal 3 de 42 e La prueba de VPH 16 18 Cervista no est dise ada para sustituir el an lisis de detecci n citol gica cervicouterina habitual e El uso de esta prueba todav a no se ha evaluado para el tratamiento de mujeres con anomal as citol gicas o histol gicas previas histerectom as embarazo posmenopausia u otros factores de riesgo p ej VIH inmunodepresi n antecedentes de IT
48. itolog a ASC US Resultado de la 2 CIN2 prueba de VPH de Resultado de la prueba de Pe alto riesgo VPH 16 18 Cervista a o e TSt Cervista VPH 16 positivo 39 162 201 VPH de alto riesgo VPH 18 positivo 1 42 43 positivo VPH 16 y 18 positivos 4 9 13 VPH 16 y 18 negativos 20 480 500 VPH de alto riesgo VPH 16 18 positivos 0 7 7 negativo VPH 16 y 18 negativos 5 543 548 Total 69 1243 1312 Tabla 11 Riesgos de gt CIN2 para diferentes resultados de las pruebas de VPH de alto riesgo Cervista y de VPH 16 18 Cervista Prevalencia de gt CIN2 5 3 Resultado de la prueba de VPH de Intervalo de Intervalo de alto riesgo Resultado de la prueba de confianza del Indice de confianza del Cervista VPH 16 18 Cervista Riesgo 95 probabilidades 95 r d 17 1 WEN de VPH 16018 positivos 44 957 13 0 22 2 3 72 2 93 4 54 alto riesgo 4 0 ag o positive VPH 16 y 18 negativos 205500 26 6 1 0 75 0 51 1 06 VPH de i alto riesgo VEH ad 0 9 negativo p 5 555 0 4 2 1 0 17 0 07 0 36 Tabla 12 Resultados de la prueba de VPH 16 18 Cervista para mujeres con resultado positivo en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Prevalencia de gt CIN2 en mujeres con resultados positivos en la prueba de VPH Cervista 8 5 Intervalo de confianza del 95 Sensibilidad 68 8 44 64 56 6 a 78 8 Especifi
49. jar sin efecto una indicaci n colposc pica inicial positiva Toda interpretaci n citol gica ser realizada por un panel de revisi n de pat logos central Comparaci n de secuenciaci n de ADN y la prueba de VPH 16 18 Cervista para las poblaciones con ASC US y NILM gt 30 Las muestras de ADN residuales de las pacientes con ASC US y con NILM se utilizaron para la amplificaci n y secuenciaci n para la PCR Las muestras de ADN se amplificaron mediante cebadores de consenso para el gen L1 del VPH Tambi n se multiplic una porci n del gen de la beta globina humana como control interno Se usaron amplicones purificados como plantillas en las reacciones de secuenciaci n m ltiple para 14 tipos de VPH de alto riesgo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Los datos de secuenciaci n se analizaron mediante distintos software de alineaci n de secuencias 23 de 42 A continuaci n se presenta una comparaci n entre la prueba de VPH 16 18 Cervista y la secuenciaci n de ADN para la detecci n de VPH 16 y 18 en poblaciones con ASC US y con NILM gt 30 Tabla 17 Rendimiento de la prueba VPH 16 18 Cervista y resultados de la secuenciaci n para PCR NILM gt 30 Secuenciaci n para PCR Resultado de la prueba Cervista Alto riesgo Indeterminado Alto riesgo Negativo Un tipo de alto riesgo Dos tipos de alto riesgo riesgo 18 168 18 16 y otro 18 y otro Otros 16 y otro VPH
50. l o colposcopia negativa y resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y la prueba de VPH 16 18 Cervista conocidos Los resultados cl nicos caracter sticos de la prueba de VPH 16 18 Cervista se muestran en las Tablas 9 15 Tabla 9 Resultados de la prueba de VPH 16 18 Cervista comparados con los resultados de colposcopia histolog a central en mujeres con citolog a ASC US Resultado de la Enfermedad histolog a central prueba de VPH Resultado de la prueba de I i de alto riesgo VPH 16 18 Cervista seer a ote CIN1 CIN2 CIN3 ve Cervista sin biopsia CIN VPH 16 positivo 39 83 40 25 14 201 VPH de alto VPH 18 positivo 11 22 9 0 1 43 riesgo positivo VPH 16 y 18 positivos 1 3 5 2 2 13 VPH 16 y 18 negativos 109 273 98 15 5 500 VPH de alto VPH 16 18 positivos 3 3 1 0 0 7 riesgo negativo VPH 16 y 18 negativos 210 304 29 5 0 548 Total 373 688 182 47 22 1312 Entre las pacientes con resultados definitivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y datos del estado de la enfermedad el porcentaje de resultados indeterminados en la prueba de VPH 16 18 Cervista en el estudio cl nico de mujeres con citolog a ASC US fue del 0 0 1312 con un intervalo de confianza IC del 95 de 0 a 0 3 19 de 42 Tabla 10 Resultados la prueba de VPH 16 18 Cervista comparados con los resultados de colposcopia histolog a central gt CIN2 en mujeres con c
51. las pacientes con citolog a ASC US POS VPH 16 VPH tipo 16 detectado POS VPH 18 VPH tipo 18 detectado POS VPH 16 y 18 VPH tipos 16 y 18 detectados Probabilidad baja pero incrementada de que la CIN de alto grado subyacente se detecte en una colposcopia La bibliograf a cl nica sugiere que es posible el desarrollo de una enfermedad de alto grado 19 Probabilidad incrementada de que la CIN subyacente de alto grado se detecte en una colposcopia IND CV porcentual alto IND ADNg bajo VPH tipos 16 18 no detectados Indeterminado Baja probabilidad de CIN2 3 subyacente o c ncer Los resultados no est n dise ados para impedir que las mujeres procedan a someterse a una colposcopia o se vuelvan a someter a pruebas para la detecci n de VPH 1 1119 La probabilidad de CIN2 3 subyacente o de c ncer es menor pero la infecci n por otros tipos de VPH de alto riesgo que no son 16 18 a n presenta un riesgo Los resultados no est n dise ados para evitar que las mujeres se sometan a una colposcopia Estado desconocido del VPH 16 18 Seg n las pautas consensuadas de 2006 a partir de los 30 a os las mujeres con citolog a de mayor gravedad que la de ASC US que incluye ASC H LSIL o superior deben realizarse una colposcopia independientemente de los resultados de la prueba de VPH En los casos en los que se realiza en el mismo momento una prueba de VPH de
52. ltados confiables de la prueba INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS El valor de la relaci n entre la se al y el ruido se al de la muestra medida con respecto a una se al de un pocillo de la reacci n con control negativo se denomina valor FOZ curvatura sobre cero Los valores FOZ son generados para las reacciones de VPH 16 y VPH 18 Un resultado final positivo negativo o indeterminado para cualquier muestra en particular se genera sobre la base del an lisis de dos pocillos de la reacci n independientes Cuando el valor FOZ del VPH 16 el valor FOZ del VPH 18 es mayor que 2 13 la muestra resulta positiva para VPH 16 VPH 18 Una llamada indeterminada se genera en tres condiciones diferentes 1 cuando la diferencia porcentual entre los valores FOZ del ADNg es 2 25 0 diferencia porcentual alta 2 cuando los valores FOZ de ambos VPH son lt 0 7 FOZ del VPH bajo y 3 cuando el valor FOZ promedio del ADNg de una muestra negativa es lt 1 5 ADNg bajo Una llamada 13 de 42 indeterminada es indicadora de una mezcla insuficiente un error en la medici n en pipeta o un ADNg inadecuado en la muestra consulte la Gu a de resoluci n de problemas En la Figura 3 se muestra un resumen del criterio de llamada de muestra descrito arriba Terminolog a FOZ del VPH para cada mezcla de oligonucle tidos del VPH la se al del FAM de la muestra dividida por la se al del FAM del control negativo FOZ promedio del ADNg el valor
53. n 20 0 25 de Nonidet P40 p rpuras 25 de glicerol y 0 05 mg ml de BSA C16 500 copias ul de ADN de VPH tipo 16 clonado y Control de VPH Tapa 1 x 200 ul 3000 copias ul de ADN del HIST2H2BE clonado 16 transparente H en el ARNt de levadura y 10 mM de Tris y tira negra 0 1 mM de amortiguador EDTA C18 500 copias ul de ADN de VPH tipo 18 clonado y Control de VPH Tapa 1 x 200 ul 3000 copias ul de ADN del HIST2H2BE clonado 18 transparente H en el ARNt de levadura y 10 mM de Tris y tira negra 0 1 mM de amortiguador EDTA NTC l Tapa ARNt de levadura y 10 mM de Tris 0 1 mM de Control negativo anscatente 1 x 200 ul amortiguador EDTA y tira negra ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagn stico in vitro Seguridad y precauciones de manipulaci n 1 Deben emplearse precauciones de seguridad universales para el manejo de tejidos o l quidos humanos Las muestras deben desecharse seg n las normas locales 2 Los componentes del producto residuos o empaque del producto pueden considerarse desechos de laboratorio Deseche los reactivos no utilizados y desperdicios seg n las normas federales estatales y locales aplicables REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N DE LOS REACTIVOS e Almacene todos los reactivos entre 30 C y 15 C e No use reactivos pasada la fecha de vencimiento indicada en la parte externa del paquete 9 de 42 e No almacene en un congelador sin escarcha e Proteja de la luz e Antes de usa
54. o Cervista Prevalencia de gt CIN3 en pacientes con resultados positivos en la prueba de VPH Cervista 2 9 Intervalo de confianza del 95 Sensibilidad 77 3 17 22 56 6 a 89 9 Especificidad 67 3 495 735 63 9 a 70 6 21 de 42 Tabla 16 Rendimiento de la prueba cl nica de VPH 16 18 Cervista estratificado por edad para mujeres con resultados positivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Edad 18 a lt 21 VPH de alto riesgo positivo VPH 16 y o 18 positivos Histolog a central gt CIN2 Positivo 7 VPH 16 y 18 negativos 2 VPH de alto riesgo negativo 0 Prevalencia de la enfermedad Total 9 8 8 9 102 intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad Edad 21 a lt 30 77 8 7 9 58 1 54 93 40 0 a 97 2 47 4 a 68 22 Positivo Negativo VPH de alto riesgo positivo VPH 16 y o 18 positivos 21 117 VPH 16 y 18 negativos 9 197 VPH de alto riesgo negativo 0 138 Prevalencia de la enfermedad Total 30 452 8 7 30 344 intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad Edad 30 a lt 39 70 0 21 30 62 7 197 314 50 6 a 85 3 57 1 a 68 1 Positivo Negativo VPH de alto riesgo positivo VPH 16 y o 18 positivos 7 30 VPH 16 y 18 negativos 3 126 VPH de alto riesgo negativo 3 125 Preval
55. ol negativo El control negativo debe realizarse en cada placa de an lisis y los resultados deben cumplir los siguientes criterios para que las muestras de la placa sean v lidas Si no cumplen estos criterios las muestras y los controles de esa placa no ser n v lidos y deber n repetirse consulte el resumen de la Tabla 5 1 La se al minima para cada mezcla debe ser superior o igual a 600 RFU 2 600 2 La diferencia porcentual entre las se ales del ADNg de ambas mezclas debe ser menor al 30 lt 30 Tabla 5 Criterios de control negativo Resultado Se al m n de Se al m n de Diferencia porcentual VER ADNg m x ADNg Controles positivos Deben realizarse controles de VPH VPH 16 VPH 18 en cada placa de an lisis y los resultados deben cumplir los siguientes criterios para que la prueba sea v lida Si los controles no cumplen estos criterios las muestras de esa placa tampoco ser n v lidas y deber repetirse la prueba consulte el resumen de la Tabla 6 1 El valor FOZ del VPH se determina al dividir la se al del FAM del control por la se al del FAM del control no positivo para cada mezcla respectiva El control del VPH 16 debe generar un valor FOZ del VPH positivo 2 2 13 s lo para la mezcla de oligonucle tidos del VPH 16 y el control de VPH 18 debe generar un valor FOZ del VPH positivo 2 2 13 s lo para la mezcla de oligonucle tidos de VPH 18 2 El promedio de FOZ del ADNg de las dos mezclas debe ser
56. omo comparador para la detecci n de VPH en las poblaciones con ASC US y NILM gt 30 La aprobaci n para esta indicaci n se otorga antes de la finalizaci n de los estudios longitudinales al conocerse los resultados de los estudios anal ticos Adem s los datos constantes obtenidos de m ltiples estudios transversales y prospectivos de cohortes realizados con diversos m todos de muestreo celular y diversos m todos de prueba de ADN de VPH ambos aprobados por la FDA y aptos para uso en investigaci n proporcionan pruebas s lidas de que una prueba del ADN de VPH negativa implica un riesgo muy bajo de CIN2 3 o c ncer diagnosticado o incipiente cuando la citolog a cervicouterina es normal 122 Adem s la ausencia de VPH 16 18 en esta poblaci n de mujeres reduce a n m s el riesgo de desarrollar una enfermedad cervicouterina y por otra parte la presencia de VPH 16 VPH 18 aumenta el riesgo relativo de desarrollar una enfermedad cervicouterina en mujeres de gt de 30 a os independientemente de los hallazgos citol gicos NILM 113 24 Descripci n del estudio cl nico de NILM 2 30 Se inscribieron aproximadamente 2 000 pacientes pacientes que cumpl an los requisitos y con resultados de la prueba de Papanicolau normales NILM de 26 centros cl nicos activos en los Estados Unidos Se anticipa que no menos de 1 000 pacientes contar n con datos de seguimiento de 3 a os El ndice de retenci n de pacientes al final del primer a o de seg
57. oncentraciones Se observa analizadas interferencia Sangre Detectable visualmente No Mucosa Detectable visualmente No Sangre mucosa Detectable visualmente No Irrigaci n vaginal 0 5 2 No Jalea anticonceptiva 0 5 2 si Crema antimic tica con 2 de clotrimazol 0 5 2 Crema antimic tica con 4 de miconazol Kit de extracci n de Soluci n PreservC yt 0 5 2 ADN Genfind 70 de etanol Procesamiento de la muestra Microesferas magn ticas Los niveles de sustancias interferentes requeridos para producir fallas en las pruebas 2 son inusualmente elevados y no deben encontrarse en las muestras cl nicas reales Fuente Tipo Muestra de c lulas cervicouterinas 0 5 2 Durante la extracci n del ADN la jalea anticonceptiva mostr una interferencia visualmente detectable con la separaci n de microesferas magn ticas en 10 mM de amortiguador Tris lo que produjo una recuperaci n baja de ADN y una muestra insuficiente de ADN para realizar la prueba Los niveles de sustancia interferente requeridos para provocar fallas en las pruebas son inusualmente elevados y no deben encontrarse en las muestras cl nicas reales si el m dico sigue el procedimiento de muestreo citol gico cervicouterino correspondiente que consiste en limpiar el cuello uterino antes de obtener la muestra de c lulas para la citolog a cervicouterina Reactividad cruzada Se analiz un panel bacteriano mic tico y
58. onstante Adici n inconstante de la mezcla de reacci n Adici n insuficiente o inconstante de control e Aseg rese de que todos los controles y reactivos se mezclen bien y de forma constante e Al agregar una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3 4 veces e Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Aseg rese de que se haya agregado el control correcto a cada pocillo e Aseg rese de que se haya agregado el volumen de control correcto a cada pocillo e Revise la informaci n de calibraci n del equipo e Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos No se agregaron los controles correctos a la placa o no se agregaron en la posici n correcta de la placa Verifique que se hayan agregado los controles correctos en las posiciones de la placa adecuadas El per odo de incubaci n fue m s corto o m s extenso que el tiempo recomendado Confirme que la incubaci n se haya realizado en el per odo y la temperatura especificados Sospecha de contaminaci n durante la adici n de la muestra Use puntas con barrera de aerosol sin nucleasa y tubos est riles durante la configuraci n Use guantes durante la preparaci n de la prueba Aseg
59. promedio determinado a partir de los dos valores FOZ del ADN gen mico obtenidos de ambas mezclas de reacci n calculado al dividir la se al del Red de la muestra por la se al del Red del control negativo Diferencia porcentual del FOZ del ADNg el valor absoluto de la diferencia entre los valores FOZ del ADN gen mico de VPH 16 y VPH 18 dividido por el valor FOZ promedio del ADN gen mico de las dos mezclas de oligonucle tidos del VPH Criterios Resultados generados Diferencia porcentual NO gen mica ADN lt 25 gt IND diferencia porcentual alta Si Uno o m s valores FOZ NO del VPH gt 0 70 NOOO IND FOZ del VPH bajo AR POS VPH 16 y 18 POS VPH 16 E FOZ del VPH 16 lt 2 13 FOZ del VPH 18 lt 2 13 si Y FOZ del VPH 18 lt 2 13 NO QS pos ver 18 si dlrs i oe so lt 1 50 si IND ADNg bajo Figura 3 Criterios de llamada de muestra ordenados de arriba a abajo de la prueba de VPH 16 18 Cervista Nota la prueba de VPH 16 18 Cervista no requiere el uso de una zona equ voca o de reiteraci n de la prueba 14 de 42 Tabla 4 Interpretaci n de los resultados de la prueba de VPH 16 18 Cervista cuando los resultados de VPH de alto riesgo son positivos Resultado de la prueba de VPH 16 18 Cervista Informe del resultado Interpretaci n para pacientes 2 30 a os con citolog a NILM Interpretaci n para
60. r saque los reactivos del congelador y d jelos al menos 30 minutos a temperatura ambiente o hasta que la inspecci n visual indique que no hay material congelado presente e Agite con v rtex los reactivos antes de usarlos e Third Wave Technologies recomienda no m s de diez 10 ciclos de congelaci n descongelaci n para todos los reactivos de las pruebas de VPH 16 18 Cervista REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES El software Invader Call Reporter es un componente necesario de esta prueba de diagn stico in vitro Se proporciona este software una vez con el pedido inicial de la prueba de VPH 16 18 Cervista y posteriormente con el lanzamiento de actualizaciones de las versiones del software El kit de extracci n de ADN Genfind es un accesorio de la prueba de VPH 16 18 Cervista Comun quese con Third Wave Technologies para solicitar el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS Materiales fungibles e Puntas de pipetas con barrera de filtro y sin nucleasa e Placas de polipropileno de 96 pocillos e Sellador de placa transparente e Aceite mineral para biolog a molecular e Tubos est riles de 2 ml de polipropileno y tapas roscadas Equipos e Pipetas e Agitador vortex e Lector de placa de fluorescencia consulte la Tabla 3 e PC de escritorio con sistema operativo Microsoft Windows XP con Microsoft Excel y el software Adobe Reader e Termocicla
61. s mujeres con resultados positivos en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista ASC US Secuenciaci n para PCR de alto riesgo positiva VPH 16 VPH 18 Total Prueba de VPH de alto riesgo Cervista ve F ne Positivo Negativo positiva Prueba de VPH 16 y o 18 Cervista positiva 177 77 254 Prueba de VPH 16 y 18 Cervista negativa 11 460 471 Total 188 537 725 Coincidencia porcentual positiva y coincidencia porcentual negativa 0 Coincidencia Porcentaje aia dado el puntaje Coincidencia porcentual positiva 94 1 177 188 89 8 96 7 Coincidencia porcentual negativa 85 7 460 537 82 4 88 4 25 de 42 Sensibilidad anal tica El ADN plasm dico de VPH clonado que representa los tipos 16 y 18 de VPH detectados por la prueba de VPH 16 18 Cervista se analiz para determinar la sensibilidad anal tica de las pacientes para cada tipo espec fico Nueve muestras de ADN caracterizado como VPH negativo aisladas de las muestras cervicouterinas se analizaron en r plicas de ocho 9 muestras por 8 r plicas muestra 72 puntos de datos para determinar el l mite del blanco LoB Los valores LoB FOZ del FAM fueron 1 18 y 1 21 de VPH 16 y VPH 18 respectivamente El l mite de detecci n LoD es la concentraci n m s baja de analito presente en una muestra que presenta los resultados de la prueba como VPH 16 VPH 18 detectado al menos el 95 de las veces los resultados de la
62. s que dieron su consentimiento posteriormente se obtuvieron sus muestras iniciales de ASC US residuales en ThinPrep para la prueba de VPH 16 18 Cervista Todas las pacientes que dieron su consentimiento para la realizaci n del estudio fueron sometidas a colposcopias Los investigadores y las pacientes estaban cegadas al estado de VPH de las pacientes hasta que finalizaron los procedimientos colposc picos para evitar sesgos Las muestras histol gicas dirigidas colposc picamente fueron examinadas por pat logos que tambi n desconoc an la condici n de VPH de las pacientes Finalmente se inscribieron en el estudio 1 514 mujeres a partir de los 18 a os con resultados ASC US de 89 cl nicas en los Estados Unidos El rendimiento cl nico de la prueba de VPH 16 18 Cervista se compar con los resultados histol gicos y de la colposcopia Se obtuvieron muestras de biopsia de las mujeres con citolog a ASC US seg n lo requieren las normas sanitarias est ndar en cada sitio cl nico que particip del estudio Los resultados histol gicos consensuados brindados por un panel de revisi n de pat logos central fueron el criterio de referencia para la determinaci n de la presencia o ausencia de la enfermedad En ausencia de datos histol gicos la falta de lesiones cervicouterinas visibles mediante la colposcopia y de biopsia se equipar a la ausencia de enfermedad Hubo 1 312 pacientes con ASC US con estado de la enfermedad histolog a centra
63. to riesgo El rango de prevalencia informada de infecci n por VPH en mujeres es muy amplio desde el 14 hasta m s del 90 Diversos factores pueden afectar la prevalencia del VPH entre las poblaciones de pacientes debido a la heterogeneidad en la ubicaci n geogr fica la edad el n mero de parejas sexuales los antecedentes de citolog a cervicouterina anormal junto con las diferencias en las t cnicas de muestreo los m todos de prueba y la naturaleza intermitente de la infecci n El estudio cl nico multic ntrico y prospectivo de VPH 16 18 Cervista incluy a mujeres de 89 sitios cl nicos en 23 estados en todo el territorio de los Estados Unidos lo que produjo una poblaci n de pacientes demogr ficamente diversa Las tablas 7 y 8 muestran la prevalencia de VPH 16 y VPH 18 observada en el estudio estratificada por edad Tabla 7 Prevalencia de VPH 16 y VPH 18 en mujeres con citolog a ASC US estratificada por edad Grupo etario Prevalencia del VPH 16 Prevalencia del VPH 18 Prevalencia del VPH 16 y 18 Positivo 18 lt 21 31 40 129 7 8 10 129 1 6 2 129 21 lt 30 23 7 117 493 6 3 31 493 1 6 8 493 30 lt 39 11 9 37 312 2 6 8 312 0 6 2 312 39 lt 49 8 3 22 266 1 9 5 266 0 0 266 49 lt 59 5 9 7 118 1 7 2 118 0 0 118 gt 59 13 3 6 45 2 2 1 45 0 0 45 Todos 16 8 229 1363 4 2 57 1363 0 9 12 1363 Tabla 8 Prevalencia de VPH 16 y VPH 18 en
64. ucle tidos de VPH 16 18 Soluci n de la enzima Cleavase Volumen total de la mezcla Hl Reacci n N de reacciones muestras y controles k Volumen total 8k 1 25 pl 2k 1 25 pl 10k 1 25 pl Reduzca la configuraci n de la temperatura del termociclador a 63 C Agregue 10 ul de la mezcla de reacci n adecuada a cada pocillo que contenga un control o una muestra consulte la Figura 2 teniendo cuidado de aspirar con la pipeta por debajo del aceite mineral Incube la placa en una configuraci n de 63 C durante 4 horas Obtenci n de datos 1 Lleve siempre la placa a temperatura ambiente antes de realizar la lectura Si no se puede leer la placa de inmediato almac nela a una temperatura entre 2 C y 8 C se recomienda leer la placa dentro de las 24 horas de realizada la prueba Coloque la placa de 96 pocillos el pocillo A1 debe estar en la esquina superior izquierda en el recipiente de la placa del lector de la placa de fluorescencia Quite la cinta que sella la placa Defina el tipo de placa para configurar las coordenadas y la altura de la sonda para el tipo de placa espec fico Guarde las configuraciones Lea toda la placa Se requieren dos lecturas independientes FAM Excitaci n 485 nm Emisi n 535 nm y Red Excitaci n 560 nm Emisi n 612 nm Para detectar la se al del VPH debe configurarse el instrumento de manera que pueda detectar primero el fluor foro del FAM
65. uimiento fue de aproximadamente un 80 Durante 3 a os se realizar un seguimiento de las pacientes que deber n acudir a consultas anuales para la realizaci n de an lisis En cada consulta de seguimiento se realiza una prueba citol gica cervicouterina Se realizar una colposcopia a las mujeres que presentan resultados ASC US o citolog a de mayor grado y subsiguientemente una biopsia de ser necesario El an lisis de estos datos se centrar en el riesgo de desarrollar una enfermedad cervicouterina en un per odo de tres a os asociado con las pacientes con resultados NILM positivos para la prueba de VPH 16 18 Cervista en comparaci n con las pacientes con resultados negativos en el momento del ingreso al estudio To y tambi n el riesgo de desarrollar una enfermedad cervicouterina en un per odo de tres a os asociado con las pacientes con resultados NILM positivos para la prueba de VPH 16 18 Cervista en comparaci n con las pacientes con resultados negativos para cualquier tipo de VPH de alto riesgo en el momento del ingreso al estudio To La presencia o ausencia de VPH en el momento del ingreso al estudio To se comparar con la presencia o ausencia de a gt CIN2 y b gt CIN3 durante el estudio La presencia de CIN2 CIN3 o c ncer cervicouterino se determinar mediante una histolog a central Los resultados negativos se definir n por la colposcopia a menos que los resultados histol gicos centrales est n disponibles para de
66. usa dos tipos de reacciones isot rmicas una reacci n primaria que se produce en la secuencia del ADN objetivo y una reacci n secundaria que produce una se al fluorescente consulte la Figura 1 La prueba de VPH 16 18 Cervista se indica 1 En mujeres a partir de los 30 a os la prueba de VPH 16 18 Cervista puede utilizarse concurrente con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en combinaci n con citolog a cervicouterina para evaluar la presencia o ausencia de VPH tipos 16 18 de alto riesgo Esta informaci n junto con la evaluaci n cl nica de los antecedentes citol gicos otros factores de riesgo y las normas profesionales puede usarse para guiar el tratamiento de las pacientes Para utilizarse en combinaci n con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en pacientes con resultados de citolog a cervicouterina de c lulas escamosas at picas de significado indeterminado ASC US a fin de evaluar la presencia o ausencia de VPH tipos 16 y 18 de alto riesgo Esta informaci n concurrente con la evaluaci n cl nica de los antecedentes citol gicos otros factores de riesgo y las normas profesionales puede usarse para guiar el tratamiento de las pacientes Los resultados de esta prueba no est n dise ados para evitar que las mujeres se sometan a una colposcopia Las muestras cervicouterinas que pueden analizarse con la prueba de VPH 16 18 Cervista incluyen el siguiente sistema de conservaci n y los siguientes dispos
67. v rico que habitualmente se encuentran en el tracto anogenital femenino y tambi n se analizaron diversos tipos de virus de papiloma humano de riesgo alto bajo o indefinido con la prueba de VPH 16 18 Cervista para evaluar una posible reactividad cruzada 32 de 42 Tabla 31 Los microorganismos enumerados a continuaci n se agregaron a la soluci n PreservCyt en concentraciones de aproximadamente 1 x10 cfu ml y 1x10 cfu ml Se extrajo ADN de estos microorganismos y una l nea celular negativa Jurkat 1x10 c lulas ml mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Todas las muestras presentaron resultados negativos con la prueba de VPH 16 18 Cervista Candida albicans Corynebacterium pseudodiptheriticum Enterococcus faecalis Escherichia coli Lactobacillus acidophilus Proteus vulgaris Staphylococcus aureus Staphylococcus epideridis Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Tabla 32 Se analiz el ADN purificado obtenido de los microorganismos enumerados a continuaci n en concentraciones de 1x10 copias reacci n y 1x10 copias reacci n mediante la prueba de VPH 16 18 Cervista Todas las muestras generaron resultados negativos Virus del herpes simple tipo 1 VHS 1 Chlamydia trachomatis Virus del herpes simple tipo 2 VHS 2 Neisseria gonorrhoeae Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 Neisseria meningitides VIH 1 regiones pol y env Mycoplasma hominis
68. ynecol 197 4 346 355 Castellsague X et al 2006 Worldwide Human Papillomavirus Etiology of Cervical Adenocarcinoma and lts Cofactors Implications for Screening and Prevention J Natl Cancer Inst 98 303 315 Hall JG Eis PS Law SM Reynaldo LP Prudent JR Marshall DJ Allawi HT Mast AL Dahlberg JE Kwiatkowski RW de Arruda M Neri BP and Lyamichev VI 2000 Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction PNAS 97 15 8272 8277 22 Revzina N DiClemente R 2005 Prevalence and incidence of human papillomavirus infection in women in the USA a systematic review Int J of STD amp AIDS 528 537 23 Woodman CB Collins S Winter H Bailey A Ellis J Prior P Yates M Rollason TP Young LS 2001 Natural history of cervical human papillomavirus infection in young women a longitudinal cohort study Lancet 357 9271 1831 1836 24 Woodman CB Collins S Rollason TP Winter H Bailey A Yates M Young LS 2003 Human papillomavirus type 18 and rapidly progressing cervical intraepithelial neoplasia 361 9351 40 43 25 CLSI document EP17 A Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation Approved Guideline GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS TABLA 34 Gu a de resoluci n de problemas Observaci n Causa probable Soluciones Volumen insuficiente para las mezclas de reacci n La cantidad de muestras ingresadas en la ficha Assay Selection

Prueba de VPH 16/18 Cervista

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