Estandarización de los métodos de electroforesis en geles de
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1. DO548nm 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 No de fracciones Detecci n KDO DO 548nm Soluci n reguladora Tris HCI EDTA Desoxicolato de sodio pH 8 5 Flujo 0 3 mL min Conclusiones La evaluaci n del sistema electrofor tico indic resultados adecuados en cuanto a la linealidad exactitud repetibilidad y precisi n del sistema La determinaci n de la calidad del empaquetamiento y la precisi n del sistema cromatogr fico result ser satisfactoria para las matrices estudiadas Referencias 1 Farmacopea de los Estados Unidos de Am rica Edici n XXIII Estados Unidos 1995 2 OMS Technical Report Series 823 Validation of analytical procedures used in the examination of pharmaceutical material 1992 3 Catalogo Amersham Biosciences en Latinoam rica 2003 4 Gel filtration Amersham Biosciences Suecia 2002 5 Campa C Sierra G et al Inventors Centro Nacional de Biopreparados assignee Vaccine against group B Neisseria meningitides gammaglobulin and transfer factor Ep O301 992 A2 1988 6 Westphal O Jam K Bacterial Lipopolysaccharides In Whistter RL ed Methods in carbohydrate chemistry Academic Press Inc New York 1965 5 83 91 7 Pharmacia Manual del Usuario Phast System Suecia 8 Casta eda P Barn s CG M todos anal ticos Validaci n Comisi n Permanente de Farmacopea de Estados Unidos de M xico Secretar a de Salud 1991 9 U S De2. todos pueden contribuir a la caracterizaci n de prote nas de membrana externa y de lipopolisac rido purificados a partir de los microorganismos Vibrio cholerae Leptospira ssp Pseudomona aeruginosa Shigella ssp Estos ant genos se eval an como vacunales en fase de investigaci n dentro de la VPI del Instituto Finlay Materiales y m todos Materiales de referencia Se evalu el par metro de linealidad utilizando los patrones de pesos moleculares para SDS PAGE Fosforilasa b 94 kDa Alb mina 67kDa Ovoalb mina 43kDa Anhidrasa carb nica 30 kDa Inhibidor de tripsina 20 1 kDa a Lactalb mina 14 4 kDa todos de la firma Pharmacia Suecia Se utilizaron ademas patrones de pesos moleculares cromatogr ficos Tiroglobulina 669 kDa Apoferritina 443 kDa P Amilasa 200 kDa Alcohol deshidrogenasa 150 kDa Alb mina 66 kDa Ovoalb mina 43 kDa Anhidrasa carb nica 29 kDa Citocromo C 12 4 kDa procedentes de la firma Sigma EU excepto Quimotripsin geno 25 kDa procedente de Pharmacia Suecia Muestras Se utiliz una soluci n de alb mina de suero bovino BSA Sigma EU 1mg mL 66 kDa para la estandarizaci n del m todo electrofor tico Se evaluaron prote nas de membrana externa purificadas a partir de V cholerae Leptospira ssp P aeruginosa y Shigella ssp 1 2 mg mL seg n lo recomendado por Campa y col 5 de lipopolisac rido purificado de P aeruginosa 2 mg mL por peso se
3. Y 50 C No hay diferencias www tratamiento de las Fcal 3 87x10 Ftab 5 318 muestras tcal 0 0062 ttab 2 306 Exactitud CV lt 3 lt 4 Sin referencias VacciMonitor 3 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Linealidad Intervalos de pendiente Intervalo de intercepto Coeficiente R 11 58 A 12 04 gt 0 99 Numero total de aplicaciones analizadas n 108 Fcal Par metro F calculado en un an lisis de varianza 0 01567 a 0 006603 0 01188 a 0 0064 75 0 5 a 0 34 11 85 A 11 99 4 03 a 5 73 gt 0 98 Ftab Par metro F obtenido a partir de una tabla para un determinado tama o de muestra n y a 0 05 tcal Par metro t calculado en un an lisis de medias ttab Par metro t obtenido a partir de una tabla para un determinado tama o de muestra n y a 0 05 Se analiz la linealidad a trav s de los par metros que caracterizan la regresi n lineal los intervalos de confianza de la pendiente y el intercepto y los valores de los coeficientes de correlaci n y determinaci n En todos los casos Tabla 1 resultaron en el orden de los obtenidos durante la validaci n de la electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones reductoras como prueba de identidad de la materia prima y del producto final de la vacuna VA MENGOC BC resumidos en el Informe T cnico del Protocolo de Validaci n PV 11 028 10 del Instituto Finlay Se seleccion BSA para el an lisis general del resto de los par metros ten
4. a este m todo se caracterizaron algunas de tres microrganismos En la Figura 4 se muestras de prote nas de membrana externa representan los perfiles electrofor ticos purificadas en la etapa de investigaci n a partir principales del estudio realizado Figura 4 Electroforesis en geles de poliacrilamida 12 5 en Phast System de prote nas de membrana externa purificadas a partir de diferentes microorganismos Su o E w af E T 2 u y ze a A A E o a E c i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Muestras de prote nas de membrana externa 2 ug en 4 uL Patrones PM Fosforilasa b 94 kDa Alb mina 67 kDa Ovoalb mina 43 kDa Anhidrasa carb nica 30 kDa Inhibidor de tripsina 20 1 kDa a Lactalb mina 14 4 kDa A Vibrio cholerae 1 4 Prote nas de membrana externa 5 Patr n PM B Shigella ssp 6 10 Prote nas de membrana externa 11 Patr n PM C Leptospira ssp 12 Patr n PM 13 16 Prote nas de membrana externa Tabla 2 Resumen de los par metros de estandarizaci n para la determinaci n del tama o molecular de biomol culas por cromatograf a en gel PARAMETROS DE SUPEROSA 12 SEPHACRYL S 100 SEPHACRYL SEPHAROSA CL 4B ESTANDARIZACION S 1000 REPETIBILIDAD CV 1 2 8 lt 2 7 0 989 lt 2 AA OO CALIDAD DEL EMPAQUETAMIENTO No Platos m 5494 4241 3545 3 3081 7 Altura platos cm 0 018 0 023 0 028 0 032 ASIMETRIA 1 1 23 1 11 1 LINEALIDAD y 0 7665x 3 9528
5. todo 1 2 No existen referencias acerca de los criterios generales para la validaci n del m todo electrofor tico en geles de poliacrilamida ejecutado en un Phast System Pharmacia Suecia Este sistema de alta precisi n rapidez y sensibilidad comparable con las t cnicas radioisot picas puede separar mol culas a trav s de diferentes variantes de operaciones electroforesis nativa y bidimensional SDS PAGE focalizaci n isoel ctrica a la vez que permite la detecci n a trav s de diferentes formas programadas de tinci n 3 El m todo de cromatograf a de tamizaje molecular es tambi n muy utilizado para la caracterizaci n de ant genos vacunales Su correcta aplicaci n depende de una serie de par metros que permiten la verificaci n de la eficiencia del sistema En el presente trabajo se propone la evaluaci n de cuatro matrices cromatogr ficas Superosa 12 Sephacryl S 100 VacciMonitor 1 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Sephacryl S 1000 y Sepharosa CL 4B en cuanto a calidad del empaquetamiento numero de platos te ricos altura del plato y asimetr a linealidad de las curvas y precisi n del sistema 4 Se propone adem s el an lisis electrofor tico de los par metros Linealidad de las curvas para determinaci n de tama o molecular Repetibilidad Precisi n intermedia Exactitud y Robustez para su aplicaci n como control anal tico del m todo con la variante de SDS PAGE Ambos m
6. Cromatograf a en gel Se realizaron corridas cromatogr ficas en los cuatro geles seleccionados y en un sistema FPLC Pharmacia LKB Suecia Se utilizaron dos soluciones reguladoras de pH Tris HCI EDTA Desoxicolato de sodio pH 8 5 para la equilibraci n de las matrices Superosa 12 Sephacryl S 100 y Sephacryl S 1000 y NaCl 0 15 mol L para la Sepharosa CL 4B Se aplicaron muestras de 100 1000 uL con velocidades de flujo de 0 3 0 4 mL min y se registraron absorbancias a 280 nm en un detector SII Pharmacia LKB Suecia y la variaci n del ndice de refracci n en un refract metro K 2300 Knauer Alemania respectivamente Se determin el volumen total Vt en el que eluye el m ximo de absorbancia de la acetona 1 y el volumen de elusi n Ve en el que eluye el m ximo de absorbancia de las muestras aplicadas disueltas en una u otra soluci n 4 Se evalu el valor de la constante de distribuci n Kav y las curvas patrones Kav vs Log PM para cada tipo de matriz 4 La calidad del empaquetamiento de la columna se determin a trav s del n mero de platos te ricos N altura de platos te ricos HETP y asimetr a Af del pico 4 La evaluaci n se realiz a partir del tamizaje molecular de la acetona 1 y de lo recomendado para la determinaci n de estos par metros 4 Se determin la precisi n del sistema a trav s del coeficiente de variaci n entre los valores del par metro obtenidos en diferentes d as p
7. Estandarizaci n de los m todos electrofor ticos en geles de poliacrilamida en el Phast System y cromatogr ficos para la caracterizaci n de nuevos ant genos vacunales y componentes de medios de cultivo lleana Mart nez Mar a de los ngeles Padr n Rub n Cabrera Michel Acosta Yadira Pino Yamisley Gonz lez Miguel E Mart nez Gustavo Bracho Yisabel Aranguren Yovania Fern ndez Jos Luis P rez Marta Gonz lez Sara Catalina Esnard B rbara Cedr Luis Garc a Instituto Finlay Centro de Investigaci n Producci n de Vacunas y Sueros Ciudad de La Habana Cuba E mail imartinez finlay edu cu En este trabajo se realiz un an lisis de diferentes par metros que caracterizan la estandarizaci n para la determinaci n del tama o molecular de nuevos ant genos de inter s vacunal a trav s de electroforesis en Phast System y de distintas matrices cromatogr ficas La evaluaci n electrofor tica de la linealidad en las curvas de patrones indic valores de coeficientes de correlaci n y determinaci n superiores a 0 98 con una adecuada repetibilidad no se manifestaron diferencias entre los resultados obtenidos por varios analistas en d as diferentes y el m todo result ser exacto y robusto en las condiciones recomendadas Se evaluaron los par metros que caracterizan la eficiencia en el empaquetamiento de cuatro matrices cromatogr ficas Superosa 12 Sephacryl S 100 Sepharosa CL 4B y Sephacryl S 1000 Los resultad
8. ara la misma muestra 8 Resultados y discusi n Electroforesis en geles de poliacrilamida En el presente trabajo se describe la estandarizaci n de la determinaci n del tama o molecular de biomol culas en el Phast System como un sistema r pido sensible y preciso para la caracterizaci n de ant genos de inter s vacunal Los requisitos para el desarrollo de este proceso no se encuentran descritos en trabajos anteriores por lo que se tuvo en cuenta que la t cnica deb a clasificarse dentro de la categor a A de m todos anal ticos relacionados con la evaluaci n de la identidad de sustancias a granel o principios activos 9 De tal manera que los par metros seleccionados para el an lisis respondieron a esta clasificaci n Los resultados se muestran en la Tabla 1 Tabla 1 Resumen de los par metros de estandarizaci n para la determinaci n del tama o molecular de las prote nas por SDS PAGE en el sistema Phast System Par metros de estandarizaci n Coomassie Repetibilidad CV 2 4 Precisi n intermedia 5 D as CV 4 i O Analistas CV No hay diferencias Fcal 0 633 Ftab 4 196 M todo de tinci n con azul Referencias M todo de tinci n con plata Ferreiro y col 1999 PV 11 028 1 5 lt 3 6 lt 5 5 lt 5 No hay diferencias Sin diferencias Fcal 1 729 Ftab 4 196 tcal 0 796 tcal 1 315 ttab 2 048 ttab 2 048 Robustez Sensibilidad a CV 2 variaciones en el 18
9. co a trav s del procedimiento dise ado por Westphal y Jam 6 y cuatro lotes de BSA Sigma EU 1 mg mL utilizada como ingrediente a medios de cultivo M todos Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones reductoras Se utiliz un sistema homog neo discontinuo de geles concentrador 6 separador 12 5 con una soluci n reguladora del gel de acetato 0 112 mol L Tris 0 112 mol L pH 6 5 y una soluci n reguladora de corrida Tricina 0 2 mol L Tris 0 2 mol L SDS 0 55 pH 8 1 El equipo se program para condiciones de corridas de 250 V 1 0 mA 3 0 W a 15 C seg n se describe en el Manual del Usuario 7 Se aplicaron 4 wl de muestras tratadas previamente con una soluci n de Tris HCI 0 1 mol L pH 6 8 B mercaptoetanol 1 SDS 2 glicerol 0 1 bromofenol azul 0 1 en una relaci n 1 1 y calentadas a 100 C durante 5 min Para la tinci n de las bandas se utilizaron dos variantes una con una soluci n colorante de azul Coomassie 0 1 metanol 40 y cido ac tico 10 durante 1 h y se desti eron con una soluci n decoloradora metanol 40 Acido ac tico 10 la segunda con un sistema de revelado con plata en el que se lav previamente el gel con etanol 50 cido ac tico 10 durante 2 min a 50 C Se incub con formaldeh do 8 3 durante 6 min a 50 C Se lav dos veces con agua durante 2 min a 50 C y se incub con nitrato de plata 0 25 durante 13 min a 40 C Posteriormente se
10. de determinaci n superiores a 0 99 lo que avala una satisfactoria exactitud Figura 1 Determinaci n del rango de concentraciones de prote na para la evaluaci n del tama o molecular por SDS PAGE en el Phast System 1 2 3 4 5 6 A Tinci n con Azul Coomassie 1 2 3 4 5 6 B Tinci n con Plata 1 Patr n PM BSA Sigma en 4uL 2 2 ug 3 1 ug 4 0 5 ug 5 0 25 ug 6 0 125 ug VacciMonitor 4 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Figura 2 An lisis de la exactitud en la determinaci n de prote nas patrones de referencia Pharmacia Suecia PM det er 10000 m n 2000 ado Da 6000 4000 2000 0 3f PM referido Da A 0 20000 40000 60000 80000 100000 100000 PM det 80000 er mi 60000 na 40000 do D 20000 a o r r r 0 20000 40000 60000 80000 10001 PM referido Da Patrones de PM Fosforilasa b 94 kDa Alb mina 67 kDa Ovoalb mina 43 kDa Anhidrasa carb nica 30 kDa Inhibidor de tripsina 20 1 kDa a Lactalb mina 14 4 kDa A Tinci n con azul Coomassie y 0 9588x 702 81 r2 0 997 B Tinci n con plata y 0 8495x 3286 5 r2 0 9917 Finalmente se comprob que las variaciones apreciables en la temperatura del revelado no afectaron el resultado final cuando se realiz la tinci n con azul Coomassie Tabla 1 El estudio de estandarizaci n de este m todo electrofor tico permiti evaluar diferentes lotes de BSA utilizados en me
11. dios de cultivos para el crecimiento microbiano En la Figura 3 se muestra la presencia de la banda correspondiente a esta prote na con un tama o molecular de 66 1 kDa similar a lo que describe el productor Sigma Sin embargo cuando se utiliz el revelado con plata y se increment la cantidad de prote na aplicada hasta 4 ug se detectaron algunas bandas de menores y mayores tama os moleculares que no se corresponden con los valores de pureza que declara el productor 99 y que con la tinci n con azul Coomassie no se detectan Probablemente se deba a degradaciones de algunas de las mol culas y o por presencia de otras posibles impurezas como globulinas del suero bovino en el producto y que s lo podr a demostrarse si se realizara un Western Blot en este sistema con un suero espec fico o con un anticuerpo monoclonal contra BSA Figura 3 Electroforesis en geles de poliacrilamida 12 5 en Phast System de diferentes lotes de BSA utilizados en medios de cultivo 1 2 3 4 5 6 VacciMonitor 5 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Muestra aplicada BSA 4 ug en 4uL Patrones de PM Fosforilasa b 94 kDa Alb mina 67 kDa Ovoalb mina 43 kDa Anhidrasa carb nica 30 kDa Inhibidor de tripsina 20 1 kDa a Lactalb mina 14 4 kDa A Tinci n con Azul Coomassie B Tinci n con plata 1 4 Lotes BSA para medios de cultivo 5 Lote de referencia BSA Sigma 6 Patr n de PM Gracias
12. iendo en cuenta que es una prote na ampliamente utilizada para el desarrollo de otros m todos anal ticos y electrofor ticos lo que permitir una referencia m s general si posteriormente se deseara analizar otros tipos de ant genos En las Figuras 1 A y B se muestra la presencia de las bandas de alb mina con tama os moleculares en un intervalo de confianza de 66 1 kDa que se hizo m s evidente cuando se realiz el revelado con plata en el rango de 0 25 2 ug lo que demostr una mayor sensibilidad en dicho revelado con relaci n a la tinci n con azul Coomassie Los valores de los coeficientes de variaci n CV entre los tama os moleculares de las r plicas pueden considerarse satisfactorios a n cuando se recomiendan valores menores del 3 para m todos colorim tricos 1 8 El m todo es preciso por cuanto no se presentaron diferencias significativas entre analistas y d as y puede considerarse que la exactitud es adecuada en las condiciones analizadas en t rminos de los CV calculados entre los tama os moleculares determinados y los referidos para la BSA Tabla 1 Como dato adicional en la Figura 2 se muestra el an lisis de las correlaciones entre los tama os moleculares determinados para las diferentes prote nas patrones cuando se utiliz como referencia un est ndar de Sigma EU y los tama os moleculares que refiere el productor de las mismas Pharmacia Suecia Los resultados indicaron coeficientes
13. lav dos veces con agua durante 30 s a 30 C y se desarroll el color con una soluci n de carbonato de sodio 2 5 y 40 uL de formaldeh do Finalmente se lav con agua destilada y se detuvo la reacci n con una soluci n de cido ac tico 5 durante 2 min a 50 C 7 Se determin el tama o molecular PM de las muestras a trav s de un programa computarizado acoplado a un densit metro ImageMaster USD con un software 1DIlmageMaster Pharmacia Biotech Suecia tomando como referencia las prote nas de tama os moleculares conocidos Para la estandarizaci n se utiliz una soluci n de BSA 1 mg mL y se determinaron los par metros Linealidad an lisis de la regresi n en t rminos de coeficiente de correlaci n r y de determinaci n r Repetibilidad coeficiente de variaci n entre los valores de PM de las r plicas Precisi n intermedia coeficientes de variaci n y pruebas F y t entre los valores de PM obtenidos por dos VacciMonitor 2 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 analistas en tres dias Exactitud coeficientes de variaci n entre los PM determinados y los valores referidos para la BSA Robustez coeficientes de variaci n entre los PM obtenidos cuando el revelado se realiz a 18 y 50 C 7 Se evaluaron prote nas de membrana externa purificadas a partir de V cholerae Leptospira ssp P aeruginosa y Shigella y diferentes lotes de BSA utilizados en la preparaci n de medios de cultivo
14. os obtenidos para ambos sistemas de determinaci n permitieron la evaluaci n satisfactoria de muestras de prote nas de membrana externa y lipopolisac rido procedentes de Vibrio cholerae Leptospira ssp Pseudomona aeruginosa y Shigella ssp Palabras claves Estandarizaci n electroforesis cromatograf a Vibrio cholerae Leptospira ssp Pseudomona aeruginosa Shigella ssp Introducci n La evaluaci n de m todos anal ticos para la caracterizaci n de mol culas componentes de nuevos productos biol gicos desde la etapa de investigaci n garantiza el desarrollo posterior de metodolog as anal ticas adecuadas que cumplan con las regulaciones para el control de la calidad de los mismos El proceso de estandarizaci n de un m todo permite estudiar las condiciones de temperatura pH agitaci n iluminaci n humedad y otros requisitos pr cticos que influyen en el resultado final Este conjunto de estudios constituye la antesala de la validaci n que como proceso m s complejo establece que las caracter sticas determinadas previamente re nen los requisitos para la aplicaci n de la t cnica anal tica Este proceso requiere un entorno que garantice la seguridad de los resultados obtenidos en cuanto al entrenamiento y calificaci n del personal y las instalaciones verificaci n de los instrumentos de medici n control de equipamiento y de la documentaci n por ltimo la evaluaci n de los par metros de validaci n del m
15. partment of Health and Human Services Food and Drug Administration FDA Analytical Procedures and Methods Validation Guidance for Industry 2000 10 Protocolo de Validaci n PV 11 028 Validaci n del m todo de electroforesis en geles de poliacrilamida para la determinaci n de la identidad proteica de la vacuna VA MENGOC BC 1999 VacciMonitor 7 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Phast System acrylamyde gel electrophoresis and chromatography method standardization for the characterization of new vaccine antigens and culture media components Abstract We have analyzed different parameters to standardize the molecular weight determination of new vaccine antigens by gel electrophoresis in the Phast System and by a chromatography method Linearity was obtained by SDS PAGE using the reference curves with correlation and determination coefficients higher than 0 98 Repeatability was acceptable and there were no differences between the results of several analysts obtained on three different days This method is exact and robust under the recommended conditions Column efficiency was evaluated in four chromatographic matrixes Superosa 12 Sephacryl S 100 y Sepharosa CL 4B y Sephacryl S 1000 Good results in both systems allowed the evaluation of outer membrane proteins and lipopolysaccharide from Vibrio cholerae Leptospira ssp Pseudomona aeruginosa Shigella ssp Keywords Standardization gel electrophoresis chromatograph
16. y 0 3782x 1 9833 r 0 9969 r 0 9886 0 5378x 3 2089 r 0 9929 N mero de muestras analizadas n 12 tres r plicas por determinaci n VacciMonitor 6 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003 Cromatografia en gel El tamano molecular es una de las caracteristicas importantes de los antigenos concebidos con fines vacunales y este par metro puede ser evaluado por cromatograf a en gel Por esta raz n se procedi a la estandarizaci n de la evaluaci n del tama o molecular por este m todo Este an lisis se resume en la Tabla 2 con resultados satisfactorios en t rminos de la repetibilidad del m todo La linealidad fue analizada en tres de las matrices y result satisfactoria En el caso de la cuarta matriz Sephacryl S 1000 no se comercializan materiales de referencia de altos PM por lo que se propone evaluar la relaci n entre el volumen de elusi n de las prote nas y el volumen total de la matriz En la Figura 5 se muestra un ejemplo del perfil cromatogr fico obtenido en Sephacryl S 100 del lipopolisac rido procedente de P aeruginosa como parte de su caracterizaci n molecular Estos resultados indicaron la presencia de distribuciones de diferentes tallas moleculares de esta biomol cula lo que permitir ofrecer elementos para su posterior destoxificaci n y utilizaci n como ant geno vacunal Figura 5 Perfil cromatogr fico en Sephacryl S 100 del lipopolisac rido purificado de P aeruginosa
17. y Vibrio cholerae Leptospira ssp Pseudomona aeruginosa Shigella ssp VacciMonitor 8 A o 12 No 4 Octubre Diciembre del 2003
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