Micropropagación de plantas de lechosa en recipientes de
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1. Sartorius de 250 ml de capa Micropropagaci n de lechosa en recipientes de inmersi n temporal 71 cidad La frecuencia de inmersi n fue de tres veces al d a durante un minuto Como resultado fue posible multiplicar los embriones som ticos logrando coefi cientes de multiplicaci n de 40 en el medio de cultivo suplementado con 1 mg de 2 4 D transcurridos 45 d as y una germinaci n del 87 Existe un estudio an terior sobre cultivos l quidos de embriones som ticos en agitaci n para el escalamiento de la producci n masiva de plantas de lechosa Castillo et al 1998 en el cual se cuantifica y eval a el potencial de la produc ci n de embriones som ticos a partir de explantes de hipocotilos de papaya cv Solo en medios l quidos en agitaci n a 120 rpm Seg n esta investigaci n se pro dujeron 455 embriones som ticos por cada 200 mg de callo en el medio l quido de maduraci n despu s de 112 d as en comparaci n con 174 en medio soli dificado Seg n los autores el uso de un sistema l qui do para la producci n de embriog nesis secundaria result una estrategia m s eficiente para la prolifera ci n a gran escala de embriones inmaduros ya que se requieren periodos de cultivo m s cortos para obtener mayores rendimientos Se indica que el sistema l quido es adecuado para la automatizaci n de la producci n r pida de embriones som ticos y la propagaci n con t nua en biorreactores En cuant2. 20 veces o m s al utilizar la embriog nesis som ti ca pero existe el riesgo de aumentar la variabilidad de las plantas producidas Posada 2005 Clarindo et al 2008 Homhuan et al 2008 En el presente trabajo se estandarizaron las condicio nes de iniciaci n multiplicaci n y enraizamiento de plantas de lechosa hermafroditas a partir de brotes axilares en Recipientes de Inmersi n Temporal Au tomatizado RITAS y la aclimatizaci n de las plantas micropropagadas adem s se evalu la estabilidad ge n tica y la sanidad de las mismas mediante marcado res RAPDs y la t cnica de ELISA respectivamente Materiales y m todos Micropropagaci n a partir de brotes axilares de plantas hermafroditas tipo IV o elongata del cv Maradol en recipientes de inmersi n temporal Siembra de los brotes axilares en los medios l quidos y semis lidos Material vegetal Se emplearon brotes axilares de plantas hermafroditas cv Maradol obtenidos de culti vos semis lidos los cuales se colocaron en recipientes de inmersi n temporal automatizados RITA CIRAD Francia con 200 ml de medio de cultivo l quido Los medios estuvieron constituidos por las sales y vitami nas de Murashige y Skoog 1962 complementados con bencil amino purina BAP 0 2 mg y cinetina 0 1 mg Fitch 1993 Se implantaron cuatro brotes de 2 a 3 cm de longitud por recipiente en condicio nes as pticas Los recipientes se conectaron a tres l
3. la producci n comercial de plantas Colmenares y Gim nez 2003 Berthouly y Etienne 2005 Niemenak et al 2008 Sin embargo pueden aparecer anormalidades fisiol gicas especialmente la hiperhidricidad la cual se reduce al exponer los explantes al medio l quido de manera in termitente por lo que se considera crucial ajustar los tiempos de inmersi n de manera de evitar la expre si n de la hiperhidricidad Berthouly y Etienne 2005 Los SIT pueden utilizarse en la propagaci n masiva de plantas elites mediante la multiplicaci n de brotes axi lares microtub rculos y embriones som ticos Se han se alado experiencias exitosas de micropropagaci n de frutales como la uva Amelanchier x grandifolia bananos pl tanos c tricos pi a usando diferentes sistemas de inmersi n temporal y algunas de ellas se producen en escala comercial Colmenares y Gim nez 2003 Jim nez 2005 Berthouly y Etienne 2005 Niemenak et al 2008 En lechosa se conocen algunas experiencias previas de micropropagaci n mediante sistemas de inmersi n temporal Damiano et al 2003 utilizando el sistema de doble frasco operado manualmente obtuvieron mayores tasas de propagaci n de brotes de lechosa al compararlo con los cultivos en medio semis lido y l quido estacionario Posada et al 2003 emplearon el SIT para la multiplicaci n y germinaci n de embrio nes som ticos de lechosa cv Maradol Roja usando sistemas de filtraci n
4. neas con los siguientes tiempos de inmersi n l nea 1 5 min 4h l nea 2 2 min 4h l nea 3 1 min 4 h y se colocaron 6 envases en promedio por l nea en condi ciones de fotoper odo de 16 h de iluminaci n diaria a una intensidad de 32 umolm s de luz fluorescente blanca una temperatura entre 23 2 y 25 C y HR en tre 50 9 a 55 4 Transcurridos entre 30 a 45 d as se cuantificaron los brotes nuevos enraizados o sin ra z obtenidos y se clasificaron de acuerdo al tama o por un per odo de seis meses Los brotes menores de 2 a 3 cm se continuaron multiplicando en los mismos me dios de cultivo los brotes elongados gt 3 cm enraizados o sin ra z se aclimatizaron utilizando el Sistema Auto tr fico Hidrop nico SAH Rigato et al 2001 Ade m s se calcul la tasa de proliferaci n de las l neas de producci n n mero de brotes producidos n mero de brotes sembrados n mero de brotes sembrados En el caso de las siembras en cultivo semis lidos se utilizaron envases de vidrio de 200 ml contentivos de 30 ml de medio Fitch 1993 solidificado con agar a 7gl en los cuales se implantaron 4 brotes medianos de 2 a 3 cm de longitud en un total de 15 frascos y se reciclaron transcurridos entre 30 a 45 d as Los frascos sembrados permanecieron a las mismas condiciones de luz y temperatura especificadas anteriormente Este ensayo se repiti una vez Se calcul la tasa de prolife raci n de los brotes en los medios
5. ART CULO DE INVESTIGACI N Micropropagaci n de plantas de lechosa en recipientes de inmersi n temporal a partir de brotes axilares Micropropagation of papaya plants in temporary immersion recipients from axilary shoots Ariadne Vegas Garc a Yanet Sandrea Ohitza Gonz lez Andy D az Jos Gerardo Albarran Alexandra Schmidt Efra n Salazar Yris Mujica Ra l Casado Jos Fern ndez Carlos Mar n R DOI 10 15446 rev colomb biote v17n1 50718 Resumen Se estandarizaron las condiciones de iniciaci n multiplicaci n enraizamiento y aclimatizaci n de plantas hermafroditas de lechosa cv Maradol provenientes de brotes axilares producidos en recipientes de inmersi n temporal RITA En cada envase contentivo de 200 ml de medio de cultivo l quido de Fitch se colocaron cuatro brotes de 2 a 3 cm de longitud Los biorreactores se conectaron a tres l neas de inmersi n de 5 2 y 1 min cada 4h y se colocaron 6 envases en promedio por l nea en condiciones de fotoper odo de 16 h Transcurridos 30 a 45 d as se cuantificaron los brotes y se clasificaron de acuerdo al tama o lt 2 cm peque os entre 2 a 3 cm medianos gt 3 cm con y sin ra z grandes Los dos primeros tipos de brotes se continuaron multiplicando en los mismos medios y los m s elongados se aclimatizaron utilizando el Sistema Autotr fico Hidrop nico SAH Se determin la sanidad y la fidelidad de las plantas producidas mediante prue
6. D Liebe rei R 2008 Regeneration of somatic embryos in Theobroma cacao L in temporary immersion bioreactor and analyses of free amino acids in different tissues Plant Cell Report 27 667 676 Noa Carranza J Gonzalez de Le n D Silva Rosalez L 2007 Molecular of severe isolates of papaya ringspot virus in Mexico and its relationship with other isolates Virus Genes 35 109 117 Posada L G mez R Reyes M 2003 Empleo Sistemas de Inmer si n Temporal en la multiplicaci n y germinaci n de embriones som ticos de banano cultivar Gran Enano AAA y papaya var Maradol Rojo Biotecnolog a Vegetal 3 143 147 Posada L 2005 Aplicaciones de la biotecnolog a a la propagaci n de la papaya Biotecnologia Vegetal 5 67 79 Rigato S Gonz lez A Huarte M 2001 Producci n de pl ntulas de papa a partir de t cnicas combinadas de micropropagaci n e hidropon a para la obtenci n de semilla preb sica Revista Latinoamericana de la papa 12 110 120 Rohman M Islam N Alam S Rashid M Kumar T 2007 Lateral bud culture of papaya Carica papaya for clonal propagation Biotechnology 6 339 343 Solis R Olivera J La Rosa R 2011 Propagaci n in vitro de Ca rica papaya var PTM 331 a partir de meristemos apicales Rev Peru Biol 18 343 347 Talavera C Espadas F Contreras F Fuentes G Santamar a J 2009 Acclimatization rooting and field establishment of micro propa
7. a presente investigaci n la aparici n de brotes hiperh dricos fue baja plantas de 3 envases de los 47 cosechados lo que represent el apenas 6 de los envases utilizados De igual manera Damiano et al 2003 y Posada et al 2003 no encontraron pro blemas de hiperhidricidad en los brotes o embriones som ticos micropropagados El porcentaje de contaminaci n fue bajo 12 5 en los primeros 2 meses predominantemente de origen bacteriano 5 posiblemente debido a contamina ci n end gena de los tejidos la cual no fue percibida en los medios semis lidos Varios autores han se ala do la presencia de bacterias end genas no fitopat genas en el cultivo in vitro de lechosa Posada 2005 este problema fue f cilmente detectable en los medios l quidos lo cual hizo que los brotes contaminados fue ran descartados al inicio de la micropropagaci n y durante la producci n de brotes en los meses 2 5 y 6 hubo una baja contaminaci n por hongos 7 debi do posiblemente a contaminaci n del ambiente Aclimatizaci n de brotes y las plantas de lechosa Utilizando el m todo convencional se lograron por centajes de sobrevivencia bajos 40 9 y 49 0 utilizando brotes gt 3 cm enraizados o no respectiva mente y no hubo diferencias significativas entre los resultados tabla 2 Utilizando el SAH se increment el porcentaje de plantas aclimatizadas logr ndose un 89 5 cuando se usaron brotes de gt 3 cm enraizad
8. aci n a partir de brotes axilares de plantas de lechosa hermafroditas tipo IV o elongata cv Maradol en recipientes de inmersi n temporal Durante un per odo de seis meses se cosech un to tal de 47 recipientes en las tres l neas con diferentes tiempos de inmersi n los cuales produjeron un total de 1 091 brotes Se produjo un promedio mensual de 182 brotes en 6 envases cosechados por mes como promedio El rango de brotes cosechados por mes fluctu entre 68 y 298 al igual que los envases cose chados los cuales estuvieron entre 4 a 12 Los brotes producidos fueron clasificados de la siguien te manera 377 brotes peque os lt 2 cm 482 brotes medianos 2 a 3 cm 175 brotes grandes mayores de 3 cm sin ra z y 57 brotes grandes con ra z La mayor a de los brotes fueron de tama o mediano cercano a la mitad de los brotes producidos 44 18 y sirvieron para ser reciclados y multiplicados en los RITA los brotes grandes enraizados y sin ra ces representaron el 21 26 y se aclimatizaron directamente Por otro lado los brotes peque os 34 56 se colocaron en medios semis lidos Fitch 1993 para su mantenimien to y desarrollo Seg n el ANAVAR no hubo diferencias significativas con respecto al n mero total de brotes producidos en las tres l neas de inmersi n evaluadas sin embargo se observ que difieren en cuanto al tipo de brotes producidos en las frecuencias de 1 y 2 min se produjo la mayor cantidad de br
9. antes mencionada Esta experiencia se repiti una vez En ambos m todos los brotes trasplantados se man tuvieron en una temperatura de 23 2 a 25 C y una humedad relativa de 50 9 al 55 4 en c maras de cre cimiento con 16 h de iluminaci n diaria Se evalu el porcentaje de sobrevivencia durante la aclimatizaci n n mero de brotes enraizados aclimati zados n mero de brotes sembrados x 100 Se aplic una prueba binomial a los porcentajes de sobreviven cia obtenidos Las plantas estuvieron aptas para la siembra en campo en un periodo de tres a cuatro me ses y fueron transplantadas en cuatro reas diferentes del estado Aragua en donde fueron evaluadas morfo l gicamente datos no mostrados Extracci n y amplificaci n de ADN de lechosa por RAPD Se muestrearon 20 brotes tomados al azar de los RITA S en las l neas de producci n Para la extracci n del ADN se utiliz el protocolo de Dellaporta modifica do por CIAT 1999 a partir de tejido foliar Una vez extra do el ADN gen mico se verific su cali dad y concentraci n Los 20 iniciadores utilizados fue ron las veinte secuencias de la serie OPA de Operon technologies seg n el protocolo de Chen et al 2011 La visualizaci n y an lisis se realiz con el equipo Che mi Doc Bio Rad Software Quantity One Versi n 4 2 Los productos RAPD se compararon con el patr n de peso molecular del ADN del fago Lambda digerido con BST E2 Aplicaci n de las prueba
10. aya Science Asia 34 347 352 InfoStat 2002 InfoStat versi n 1 1 Manual del Usuario Grupo InfoStat FCA Universidad Nacional de C rdoba Primera Edi ci n Editorial Brujas Argentina Jim nez E 1995 Mass propagation of tropical crops in temporary immersion systems In Liquid Culture for in vitro plant propaga tion A K Hvoslef Eide W Preil eds pp 165 195 Lai C Dewi P Su T Lee W 2003 Rooting and acclimatization of micropropagated tropical fruits trees Proc 1 IS on Acclim and Establt of Micropropagated Plants Acta Hort 616 15HS 199 206 L pez A Ardisana E Cornide M Coto O Vargas D Aren cibia A 2006 Estabilidad gen tica de plantas de pa paya Carica papaya L cv Maradol Roja propagadas in vitro Revista Innovaci n tecnol gica Septiembre 2006 Vol 12 No 3 ISSN 1025 6504 RNPS 1813 Disponible en http innovacion lastunas cu Vol12N03 No 3 htm Marys E Carballo J Izaguirre Mayoral M 2000 Ocurrence and relatives incidences of viruses infecting papaya in Venezuela Annals Applied Biology 136 121 134 May C Gil F Contreras F Santamar a J 2007 Field performan ce of 100 hermaphrodite micropropagated papaya plants Acta Horticulturae 1 219 222 Murashige T Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures Physiologia Plantarum 15 473 497 Niemenak N Saare Surminski K Rohsius C Omokolo
11. bas de ELISA y RAPD respectivamente Durante un periodo de 6 meses se reciclaron un total de 47 recipientes los cuales produjeron 1 091 brotes 377 peque os 482 medianos 175 grandes sin ra z y 57 con ra z Usando el SAH se obtuvo 89 5 de plantas aclimatizadas cuando se usaron brotes enraizados y 41 6 a partir de brotes sin ra ces Con la combinaci n de las t c nicas RITA y SAH se logr un sistema continuo y eficiente de producci n de plantas sanas y fieles al tipo en comparaci n con los m todos convencionales de micropropagaci n y aclimatizaci n Palabras clave Carica papaya RITA sistema autotr fico estabilidad gen tica Abstract We standardized initiation multiplication rooting and acclimatization conditions of papaya cv Maradol hermaphrodite plants from axillary buds produced in temporary immersion reactor RITA Recipients contained 200 ml of Fitch liquid cultu re medium and four shoots of 2 to 3 cm in length were placed in each The bioreactors were connected to three different immersion lines of 5 2 and 1 min each 4h with 6 containers per line on average in 16 h photoperiod After 30 to 45 days the shoots produced were quantified and classified according to size lt 2 cm small from 2 to 3 cm medium gt 3 cm with or without roots large The first two types of shoots were multiplied in the same culture media and more elongated shoots were acclimatized using Autotrophic Hydroponic System AHS The sanity a
12. e 10 614 01 ha y una producci n de 199 002 Tm FAO 2013 En la actua lidad se ha alcanzado un gran avance tecnol gico en este rubro y la tendencia es a sustituir los huertos de cultivares criollos de baja tecnolog a por h bridos del grupo Maradol dependientes de semillas certificadas importadas las cuales producen plantas uniformes de menos porte mayor productividad y calidad de los fru tos Aular y Casares 2011 La lechosa se propaga convencionalmente por semi llas sin embargo se han se alado problemas de laten cia los cuales afectan la germinaci n y conservaci n a mediano y largo plazo por lo que la siembra debe efectuarse lo m s cercano posible a la poca de reco lecci n solo un porcentaje de las plantas son andro monoicas con flores hermafroditas y producen frutos elongados comerciales y por esta raz n se siembran tres plantas por punto se producen plantas heterog neas cuando provienen de semillas no seleccionadas e h bridos adem s la sanidad de las semillas debe es tar garantizada ya que algunas enfermedades como la bacteriosis producida por Erwinia sp se transmiten por esa v a Guevara et al 1993 Posada 2005 Con protocolos eficientes de micropropagaci n de cultivares hermafroditas de lechosa se reducir a de 6 000 a 2 000 el n mero de plantas que se necesita r an para sembrar una hect rea Ensayos de campo han demostrado que las plantas obtenidas de la micro propagaci n de yemas re
13. e las tres frecuencias de inmersi n 1 2 y 5 min cada 4h y los tipos de brotes de lechosa producidos en los RITA a los seis meses de la micropropagaci n Contribuci n a la prueba Ji cuadrado Autovalor Inercias Ji cuadrado acumulado 1 0 80 0 63 272 20 28 10 28 10 2 0 65 0 42 179 20 18 50 46 60 74 Rev Colomb Biotecnol Vol XVII No 1 Junio 2015 70 78 Tabla 1 N mero acumulado de acuerdo al tipo de brote de lechosa cv Maradol producido en los RITA usando tres l neas de P P frecuencias de inmersi n a los seis meses de la micropropagaci n Tipo de brote L nea de inmersi n x lt 2cm 2 3cm gt 3cm sin ra z gt 3cm enraizados Total general min cada 4h 1 151 164 47 18 380 2 137 143 68 21 369 5 89 175 60 18 342 Total 377 482 175 57 1091 Ji Cuadrado Pearson 22 51 6 p 0 0010 Ji Cuadrado MV G2 23 16 6 p 0 0007 Coef Conting Cramer 0 08 Coef Conting Pearson 0 14 inmersi n de 60 min d a en medio de multiplicaci n MS con 0 15 y 0 015 mg de BAP y AIB respectiva mente en comparaci n con los testigos en medios se mis lidos y hubo inhibici n en la multiplicaci n de los brotes en los cultivos l quidos est ticos Sin embargo los brotes proliferados se mostraron poco elongados y dif ciles de separar para la siguiente etapa de enraiza miento in vitro la cual no fue abordada en ese trabajo Las tasas de proliferaci n
14. encontradas en la presente investigaci n fueron similares a las obtenidas en caf C arabica y C canephora durante la multiplicaci n de micro esquejes Berthouly y Etienne 2005 y en brotes de banano Alvard et al 1993 con tiempos de inmersi n de 20 min 2h con este mismo sistema Sin embargo Colmenares y Gim nez 2003 lograron tasas mucho m s altas trabajando con varias especies de mus ceas 8 4 para banano cv Williams y 11 2 para pl tano Hart n con tiempos de inmersi n de 20 min 4h Los brotes producidos por la proliferaci n de las ye mas axilares de lechosa cv Maradol en los RITA formaron macollas alrededor de los brotes iniciales y fueron m s alargados que los de los medios semi s lidos Por otro lado debido al empobrecimiento de los medios l quidos despu s de los 30 d as en cultivo hubo senescencia de las hojas y se indujo el enraiza miento de algunos de los brotes Las ra ces producidas tuvieron un aspecto normal fibroso sin formaci n de callo en la base figura 2 b Figura 2 Proceso de micropropagaci n de plantas de lechosa cultivar Maradol a partir de brotes en los RITAO y aclimatizaci n mediante el sistema autotr fico hidrop nico SAH a RITA mostrando el crecimiento de los brotes en condiciones controladas b detalle de la producci n de brotes y pl ntulas en uno de los envases c aspecto de los brotes sin ra ces provenientes de los RITA tratados con AIB d Endurecimi
15. ento paulatino de las plantas despu s de los 26 d as del trasplante en el sistema autotr fico hidrop nico SAH e Detalle del desarrollo de las ra ces de las plantas f Desarrollo de las plantas aclimatizadas 26 d as despu s del transplante en el SAH Micropropagaci n de lechosa en recipientes de inmersi n temporal 75 Con la micropropagaci n de brotes de lechosa en los RITA no hubo necesidad de la aplicaci n de cido giber lico AG para la elongaci n de los brotes ni de auxinas para la inducci n de ra ces como ha sido recomendado por varios autores Drew et al 1991 Solis et al 2011 Este proceso hace innecesarios los cambios a diferentes medios de cultivo hecho que disminuye los costos operacionales de elaboraci n y la manipulaci n adem s que acorta los tiempos de producci n de plantas completas En este estudio las tasas de multiplicaci n obtenidas en el sistema RITA y el vigor de las plantas fue mayor m s del doble en comparaci n con la estimada de 2 a 2 5 en el sistema convencional semis lido cada 30 a 45 d as En este ltimo caso los brotes fueron m s peque os y rara vez enraizaban en el medio de multiplicaci n Algunos autores han reportado tasas de proliferaci n similares de 3 42 Solis et al 2011 sin embargo otros autores han obtenido tasas mucho mayores de 7 50 9 87 12 73 veces Lai et al 2003 Gallardo 2002 Rohman et al 2007 en medios se mis lidos En l
16. ficientes para la multiplicaci n y acli matizaci n de plantas Con las pruebas moleculares e inmunol gicas se ga rantiz la estabilidad gen tica y la sanidad respecti vamente de las plantas producidas a trav s de este proceso de micropropagaci n Agradecimientos A trav s del proyecto Desarrollo de un Referencial Tecnol gico para la Producci n Masiva de Frutales Requeridos por la Industria mediante Sistemas de Bio rreactores de Inmersi n Temporal FCI 09PS38 05 fue posible adaptar y optimizar un sistema de propa gaci n asexual masiva Con el proyecto Mejoramien to gen tico de la lechosa en zonas productoras de la regi n Central mediante t cnicas convencionales y biotecnol gicas C digo 10 03 02 01 financiado por el Plan Nacional de Semilla del Instituto Nacional de Investigaciones Agr colas se reactiv este sistema de propagaci n con la finalidad de producir plantas ma dres para la obtenci n de semilla de buena calidad se mejor la aclimatizaci n y se realizaron los ensayos de campo Referencias bibliogr ficas Alvard D Teisson C 1993 Comparation of methods of liquid medium for banana micropropagation Plant Cell Tiss Org 32 55 56 Agresti A 1990 Categorical Data Analysis John Wiley Sons Inc New York Anandan R Thirugnanakumar S Sudhakar D Balasubramanian P 2011 In vitro organog nesis and plantlet regeneration of Micropropagaci n de lechosa e
17. gated papaya plants In Proc 111 IS on Acclim and Establt of Micropropagated Plants Acta Hort ISHS 812 373 378 Tetsushi H Sadao K Masahiko Y Hiroshi F 2008 Mass pro duction of papaya Carica papaya L saplings using shoot tip culture for commercial use South Pacific Studies 28 87 95 78 Rev Colomb Biotecnol Vol XVII No 1 Junio 2015 70 78
18. imilares o menores a los testigos negativos para cada prueba entre 0 0 a 0 03 mientras los testigos positivos dieron 3 08 2 6 y 2 1 respectivamente Estos an lisis garantizaron la sanidad de dichos brotes Conclusiones En este trabajo se logr un sistema continuo de pro ducci n de plantas de lechosa cv Maradol hermafro ditas tipo elongata sanas y fieles al tipo mediante la estandarizaci n de los procedimientos de iniciaci n multiplicaci n enraizamiento y aclimatizaci n de plantas producidas con el sistema RITA a partir de brotes axilares in vitro Se demostr que el sistema de inmersi n temporal fue m s eficiente ya que se au ment la tasa de multiplicaci n a un promedio de 5 7 en comparaci n al m todo convencional en medios semis lidos bajo las mismas condiciones ambientales Los brotes no fueron sensibles al medio l quido en las frecuencias de inmersi n utilizadas L neas con frecuencias de inmersi n de 1 o 5 min 4h 1 producen brotes peque os y medianos y la frecuen cia de 2 min 4 1h sirvi para la multiplicaci n de los cuatro tipos de brotes incluyendo los elongados aptos para aclimatizaci n o fase ex vitro La utilizaci n del SAH con brotes enraizados in vitro increment la eficiencia en el proceso de aclimatiza ci n de plantas ya que mejor el porcentaje de sobre vivencia y facilit el manejo de las mismas La aplicaci n de las dos t cnicas conjuntas SIT y SAH fueron las m s e
19. manejo de los lotes de plantas en un Tabla 2 Porcentajes de sobrevivencia de los brotes con o sin ra ces aclimatizados de lechosa cv Maradol producido en los RITA M todo de aclimatizaci n M todo Convencional M todo SAH utilizado Brotes gt 3cm sin ra z 41 6 Brotes gt 3 cm enraizados 89 5 Promedios 65 55 M todo convencional brotes aclimatizados en vasos pl sticos conteniendo una mezcla de sustrato comercial SunshineO N 5 y tierra cernida Metodo SAH aclimatizados en bandejas de 32 x 25 cm conteniendo sustrato comercial SunshineO N 5 Solo hubo diferencias significativas entre los porcentajes de sobrevivencia de los brotes enraizados in vitro aclimatizados usando en m todo SAH con respecto los dem s tratamientos Considerando ambos m todos el convencional tiene menor porcentaje de sobrevivencia a un nivel de p lt 0 01 76 Rev Colomb Biotecnol Vol XVII No 1 Junio 2015 70 78 mismo envase para la aplicaci n de riego semanal y el control de la humedad y por su peso ligero estas ban dejas pueden ser enviadas y distribuidas a los produc tores Las plantas estuvieron aptas para la siembra en campo en un periodo de tres a cuatro meses y fueron morfol gicamente normales y de sexo hermafrodita datos no mostrados Amplificaci n de ADN de brotes de lechosa cv Maradol hermafrodita por RAPD producidos en los RITA Los resultados indicaron que no hubo diferencia
20. n recipientes de inmersi n temporal 77 Carica papaya L Journal of Agricultural Technology 7 1339 1348 Aular J Casares M 2011 Consideraciones sobre la producci n de frutas en Venezuela Revista Brasileira de Fruticultura 33 187 198 Berthouly M Etienne H 2005 Temporary immersion system a new concept for use liquid medium in mass propagation In Liquid Culture for in vitro Plant Propagation A K HvoslefEide W Preil eds pp 165 195 Chen P Salazar E Fern ndez H Castro L Russo A V squez S 2011 Detecci n de polimorfismos RAPD en materiales de Musa sp con respuesta diferencial al ataque de Xanthomonas campestris pv musacearum Agron Tropic 61 125 132 CIAT 1999 Protocolos para marcadores moleculares Gonz lez D Palacios N Gallego G Tohme J comps y eds 82 p Castillo B Smith M Yadava U 1998 Liquid system scale up of Carica papaya L somatic embryogenesis J Horticultural Scien ce and Biotechnology 73 307 311 Clarindo W Carvahlo C Santos F Abreu l Campos W 2008 Recovery polyploid papaya in vitro regenerants as screened by flow cytometry Plant Cell Tiss Organ Cult 92 207 214 Damiano C Monticelli S La Starza S R Gentile A Fratta relli A 2002 August Temperate fruit plant propagation through temporary immersion In XXVI International Horti cultural Congress Biotechnology in Horticultural Crop Im provement Achie
21. nd fidelity of the produced plants were de termined using ELISA and RAPD respectively For a period of six months 47 vessels were recycled and 1 091 shoots were produced 377 small 482 medium 175 large without roots and 57 rooted shoots Using AHS 89 5 acclimatized plants were obtained when rooted shoots were used and 41 6 from rootless shoots With the combination of RITA and AHS techniques we achieved a continuous and efficient production of healthy and true to type papaya plants in comparison to conventional micropropagation and acclimatization procedures Key words Carica papaya RITA autotrophic system genetic stability Recibido mayo 16 de 2014 Aprobado abril 21 de 2015 Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias Instituto Nacional de Investigaciones Agr colas Apdo 4653 Maracay 2101 Estado Ara gua Venezuela Correos electr nicos avegas inia gob ve melanigs hotmail com adlopez inia gob ve jgalbarran inia gob ve aschmidt inia gob ve esalazar inia gob ve ymujica inia gob ve casadobatista yahoo es jgfernandez inia gob ve cmarin inia gob ve Estudiante de Maestr a Menci n Gen tica Facultad de Agronom a Universidad Central de Venezuela Maracay 2101 Estado Aragua Vene zuela t04 2012 Rev Colomb Biotecnol Vol XVII No 1 Junio 2015 70 78 70 Introducci n La lechosa Carica papaya L es uno de los frutales tradicionales de mayor importancia en Venezuela con una superficie sembrada d
22. o a la estabilidad gen tica de las plantas mi cropropagadas se ha demostrado que son estables a partir de la proliferaci n de brotes axilares y meriste mos por sus caracter sticas morfol gicas agron micas e industriales y por los an lisis citol gicos isoenzim ticos y moleculares y se considera el sistema m s adecuado para la multiplicaci n clonal de la lechosa Lopez et al 2006 Sin embargo se han observado peque as diferencias entre plantas micropropagadas y las producidas por semilla siendo las primeras lige ramente de menor porte y m s precoces lo cual es ventajoso para la cosecha Fitch et al 2005 May et al 2007 Talavera et al 2009 Por otro lado cuando se ha utilizado la embriog nesis som tica como proceso de micropropagaci n se han conseguido variaciones morfol gicas tales como la altura de la planta n mero y longitud de flores al igual que n mero de frutos las dimensiones y la forma de los mismos sobre todo cuando se usaron altas concentraciones de 2 4 D 15 mg l y estas diferencias se pudieron asociar a patro nes polim rficos obtenidos en el an lisis molecular del ADN usando iniciadores arbitrarios RAPD Homhuan et al 2008 En otro estudio y con concentraciones bajas de 2 4 D de 2 mg hubo un porcentaje alto de variaciones de ploidia del 14 en las plantas in vitro regeneradas Clarindo et al 2008 Las tasas de multi plicaci n pudieran ser aumentadas significativamente en
23. os in vitro sin em bargo fue bajo cuando se aclimatizaron brotes sin ra z y hubo diferencias significativas entre estos porcenta jes tabla 2 La sobrevivencia in vivo durante la aclimatizaci n fue mayor con los brotes enraizados in vitro en compa raci n los resultados logrados por otros autores los cuales oscilan entre 65 y 85 Posada 2005 Tetsushi et al 2008 Anandan et al 2011 Aproximadamente a los 26 d as las plantas se mostraron muy vigorosas presentaron abundantes ra ces fibrosas y estuvieron aptas para el transplante a macetas figura 2 d e f Cuando se usaron los brotes sin ra ces se observ la aparici n de ra ces en algunas de las plantas a los 30 d as de transplantadas en el sustrato y hubo que espe rar 30 d as m s para que estuvieran aptas para el tras plante a macetas En la fase de aclimatizaci n pareci necesario la presencia de ra ces para una mayor so brevivencia en el sustrato est ril tal como ha sido se alado por otros autores quienes han observado que si bien las ra ces no son del todo funcionales debido a la escasez de pelos absorbentes un mayor tama o y n mero de ra ces inducen la formaci n ex vitro de nuevas ra ces y pelos absorbentes que extraer n del suelo los nutrientes necesarios para el desarrollo de las pl ntulas Solis et al 2011 Las bandejas tuvieron ventajas con respecto al uso de vasos individuales en cuanto a que implic una mayor facilidad en el
24. otes de tama o lt 2 cm en la frecuencia de 5 min 4h fue mayor la pro liferaci n de brotes de 2 3 cm as mismo los brotes mayores de 3 cm con y sin ra z se produjeron predo minantemente en la l nea con una frecuencia de riego de 2min 4h De esta manera en las l neas de 1 y 5 min 4h se produjo una mayor cantidad de brotes pe que os y medianos y la frecuencia de 2 min 4 h sirvi para la producci n de los cuatro tipos de brotes inclu yendo los elongados enraizados o sin ra z aptos para la fase ex vitro tabla I Lo descrito anteriormente se puede visualizar en el an lisis de correspondencia m l tiple entre el tipo de brote y la frecuencia de inmersi n figura 1 En general hubo fluctuaciones en el n mero promedio de brotes mes en las l neas de producci n con una mayor cantidad de brotes en los primeros tres meses y en el mes 6 Datos no mostrados De acuerdo a los resultados anteriores las tasas de proliferaci n se calcularon en 5 3 6 0 y 5 9 veces para las l neas 1 2 y 3 respectivamente y la tasa de prolife raci n promedio de 5 7 En los resultados de Damiano et al 2003 esta tasa fue significativamente m s alta de hasta 24 3 32 para brotes de lechosa micropro pagados en el SIT de doble frasco con un per odo de Epi 050 gt ioa Snin sow am Imin e Ham a s aok sam or s min gt 0 a a o 20 oe 15 Figura 1 An lisis de correspondencias m ltiples entr
25. procedentes de los RITA usando el procedimiento convencional Se prepar una mezcla de sustrato comercial Sunshine N 5 y tierra cernida en proporci n 3 2 luego se esteriliz y se llenaron vasos pl sticos de 270 ml previamente perforados Los brotes con ra ces se lavaron con suficiente agua destilada para eliminar completamente el agar to mando la precauci n de no da ar las mismas Los brotes sin ra z fueron tratados con una soluci n de AIB a 8 mg L Posada 2005 Los brotes fueron trans plantados individualmente en los vasos pl sticos y se cubrieron con otro vaso transparente de menor ca pacidad con la finalidad de crear una c mara h me da con un microclima adecuado para su adaptaci n Se regaron con una soluci n compuesta por sales MS al 50 cada dos a tres d as A partir de la segunda semana se retiraron progresivamente los vasos que cubr an las plantas hasta lograr la aclimatizaci n de la misma Posteriormente se transplantaron a bolsas negras o materos Sistema de aclimatizaci n hidrop nico SAH Se sembraron 24 brotes enraizados y 24 brotes sin ra z cada tipo separadamente en cajas pl sticas transpa rentes desechables de 32 x 25 cm conteniendo sus trato comercial Sunshine N 5 al cual previamente se le aplic una soluci n compuesta por sales MS al 50 en una proporci n 1 1 peso volumen En las cajas se aplic 400g de sustrato y el riego se realiz una vez por semana con la soluci n
26. s diagn stico de virus fitopat genos en las plantas regeneradas Se usaron hojas de los brotes de lechosa cv Maradol provenientes de la propagaci n masiva en los RITA para la detecci n de los virus fitopat genos Se toma ron cuatro muestras aleatorias de los brotes multiplica dos en las tres l neas de inmersi n La t cnica de diagn stico que se utiliz fue los inmu noensayos ELISA directos con doble capa de anticuer pos policlonales y anticuerpo de detecci n conjugado con fosfatasa alcalina de la casa comercial AGDIA los cuales fueron dise ados espec ficamente para de tecci n de los virus que afectan m s frecuentemente a la lechosa tales como la Mancha Anillada de la Le chosa Papaya ringspot virus PRSV el Mosaico de la Lechosa Papaya Mosaic Virus Pap MV y el Mosaico del Pepino Cucumber mosaic virus CMV Se us el protocolo descrito por Noa Carrazana et al 2007 para su aplicaci n Se incluyeron testigos negativos o sanos y positivos suministrados con el estuche y disponibles en el laboratorio Las lecturas se realiza ron a una longitud de onda de 405 nm para medir absorbancia con un espectrofot metro o lector de placas de ELISA marca LAB SYSTEM modelo MultiS kan EX Para el c lculo del punto de corte se utiliz el doble del valor del promedio de absorbancia del testigo sano Micropropagaci n de lechosa en recipientes de inmersi n temporal 73 Resultados y discusi n Micropropag
27. s en tre los patrones de fragmentos amplificados en las 20 muestras analizadas provenientes de los RITA ya que los fragmentos se distribuyeron de manera similar para los 20 iniciadores utilizados demostrando la uniformi dad gen tica de los brotes micropropagados Estos resultados garantizaron la fidelidad de las plantas pro ducidas a partir de la multiplicaci n de yemas axilares figura 3 Resultados similares fueron obtenidos por L pez et al 2006 micropropagando el mismo culti var a partir de segmentos nodales y utilizando marca dores AFLP adem s de las caracter sticas morfol gicas de las plantas en campo OPA M 12 34 5067891011121314151617181920 Muestra 2 Figura 3 ADN amplificado de dos muestras foliares de las vitroplantas cultivar Maradol con 20 iniciadores OPERON mostrando fragmentos similares amplificados En el primer carril se muestra el patr n de peso molecular del ADN del fago Lambda digerido con BST E2 y en los carriles 1 al 20 los fragmentos amplificados con los iniciadores Pruebas diagn stico de enfermedades virales en los brotes de lechosa cv Maradol hermafrodita producidos en los RITA Las muestras foliares analizadas de los brotes micro propagados resultaron negativas para los virus de la Mancha Anillada de la Lechosa Papaya ringspot virus PRSV el Mosaico de la Lechosa Papaya Mosaic Virus PapMV y el Mosaico del Pepino Cucumber mosaic virus CMV dando lecturas s
28. saic virus CMV A fin de detectarlos el uso de la t cnica de inmunodiagn stico ELISA enzy me linked immunosorbent assay es la estrategia m s sencilla econ mica y eficaz ya que estos virus son muy buenos inmun genos permitiendo obtener anti cuerpos policlonales con muy altos t tulos En el pa s se han obtenido de manera experimental anticuerpos po liclonales espec ficos contra la prote na de la c pside viral Marys et al 2000 sin embargo existen estuches comerciales de comprobada eficiencia como Agdia empleados extensamente en el mundo para el diag n stico de estos y otros virus El desarrollo de sistemas de inmersi n temporal SIT ha permitido la optimizaci n de la multiplicaci n de especies vegetales y la propagaci n a escala comer cial debido que se reducen los costos operativos mediante el uso de los medios l quidos de mayor faci lidad de manipulaci n se disminuyen los tiempos de establecimiento de los explantes iniciales in vitro se aumentan las tasas de multiplicaci n de los explantes se obtienen plantas con mayor vigor en comparaci n con las formas convencionales de propagaci n in vi tro en medios semis lidos o l quido semisumergido o sumergido las plantas se comportan mejor durante la fase de aclimatizaci n que el material obtenido de medios semis lidos y l quidos se posibilita la automa tizaci n de algunas de las etapas del cultivo in vitro lo cual reduce el trabajo manual para
29. semis lidos como se mencion en el p rrafo anterior Se elabor una matriz de datos categorizados por l nea y mes con las variables n mero de envases sem 72 Rev Colomb Biotecnol Vol XVII No 1 Junio 2015 70 78 brados n mero de envases cosechados tipos de brotes n mero de brotes n mero de brotes conta minados con bacterias y hongos La matriz fue tabu lada en la hoja de c lculo Microsoft Excel 2007 y exportada a la aplicaci n Infostat v 1 0 P InfoStat 2002 Los datos fueron modelados bajo un arreglo factorial 3x4 N mero de l neas x Tipos de brotes con 4 repeticiones bajo un dise o totalmente alea torizado para cada mes de producci n Adem s se analiz el conjunto de la producci n a los seis me ses mediante un an lisis de la varianza combinado en el tiempo mes l nea y tipo de brote Previamen te fueron probados exitosamente los supuestos de normalidad para ambos modelos Infostat InfoStat 2002 Para el an lisis de la interacci n L nea x Tipo de brote se emple la prueba de Ji al cuadrado a un nivel de p 0 05 El an lisis factorial de Correspon dencias M ltiples fue empleado para observar los patrones de asociaci n entre las tres l neas de pro ducci n y los cuatro tipos de brote Agresti 1990 Greenacre y Hastie 1987 Aclimatizaci n Se utilizaron dos m todos para la acli matizaci n de los brotes M todo convencional Se aclimatizaron 304 brotes enraizados o no
30. sultaron uniformes conserva ron 100 de hermafroditismo y sus frutos elongados mientras que las plantas de semillas mostraron solo 75 de flores hermafroditas y por lo tanto 25 dieron frutos redondos que son menos comerciales Talavera et al 2009 En este frutal los protocolos de micro propagaci n precisan ser mejorados para llevarlos a la fase comercial Se consideran superadas las fases de iniciaci n a partir de plantas de campo la elongaci n y la multiplicaci n de cultivares h bridos y plantas trans g nicas particularmente se han logrado coeficientes de multiplicaci n altos entre 2 5 hasta 12 veces Sin embargo los bajos porcentajes de enraizamiento in vitro y ex vitro de los brotes y la alta mortalidad de las pl ntulas obtenidas in vitro durante la fase de aclima tizaci n se han se alado como los principales cuellos de botella y en m s de una d cada se han generado diversos trabajos que abordan estos temas Chan et al 2003 Rohman et al 2007 Talavera et al 2009 Adicionalmente en un esquema de propagaci n co mercial la presencia de virus en los tejidos in vitro ini ciales se deber an monitorear Este aspecto no ha sido abordado en los trabajos revisados sobre micropropa gaci n Los virus que afectan con frecuencia al cultivo de lechosa son la Mancha Anillada de la Lechosa Pa paya ringspot virus PRSV el Mosaico de la Lechosa Papaya mosaic virus Pap MV y el Mosaico del Pepino Cucumber mo
31. vements Opportunities and Limitations pp 193 200 Drew R Simpson B Osborne W 1991 Degradation of exoge nous indole 3 butyric acid and riboflavin and their influence on rooting response of papaya in vitro Plant Cell Tissue and Organ Culture 26 29 34 FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Pro duction 2013 Disponible en faostat3 fao org download Q QCJ E Fitch M 1993 High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from papaya hypocotyl callus Plant Cell Tissue and Organ Culture 32 205 212 Fitch M Leong T Akashi L Yeh A White S De la Cruz A Santo L Ferreira S Moore P 2005 Growth and yield of clonally propagated and seedling derived papayas i growth ii yield Journal of Horticultural Science and Biotechnology 40 1283 1290 Gallardo J Posada L G mez R 2002 Micropropagaci n del h brido cubano de Papaya IBP 42 99 Biotecnolog a Vegetal 2 211 215 Greenacre M Hastie T 1987 The Geometric Interpretation of Correspondence Analysis Journal of the American Statistical As sociation 82 437 447 Guevara Y Rond n A Maselli A Salcedo F Betancourt J 1993 Marchitez bacteriana del lechosero Carica papaya L en Venezuela Agronom a Tropical 43 107 116 Homhuan S Kijwijan B Wangosomnuk P Bodhipadma K 2008 Variation of plant derived from indirect somatic em bryogenesis in cotyledon explants of pap
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