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Prueba de VPH de alto riesgo Cervista

1. Tabla 11 Resumen de rendimiento cl nico de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en comparaci n con los resultados de la colposcopia histolog a central 2 CIN2 entre mujeres con citolog a ASC US Sensibilidad 92 8 64 69 Intervalo de confianza del 95 84 1 96 9 Especificidad 44 2 558 1263 Intervalo de confianza del 95 41 5 46 9 PPV 8 3 64 769 Intervalo de confianza del 95 7 6 8 9 NPV 99 1 558 563 Intervalo de confianza del 95 98 1 99 6 Prevalencia de la enfermedad 5 2 69 1332 Nota entre las mujeres con citolog a ASC US el 1 1 15 de 1347 obtuvo resultados indeterminados en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista con un intervalo de confianza del 95 0 7 a 1 8 Este estudio se llev a cabo antes de la implementaci n de las pautas que recomiendan restringir las pruebas de VPH para ASC US a mujeres a partir de los 21 a os de edad 19 Tabla 12 Resumen de rendimiento cl nico de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en comparaci n con los resultados de la colposcopia histolog a central 2 CIN3 entre mujeres con citolog a ASC US Sensibilidad Especificidad PPV NPV 100 22 22 43 563 1310 2 9 22 769 100 563 563 Intervalo de confianza del 95 85 1 100 Intervalo de confianza del 95 40 3 45 7 Intervalo de confianza del 95 2 4 3 0 Intervalo de confianza del 95 99 4 100
2. Prevalencia de la enfermedad 1 7 22 1332 Nota entre las mujeres con citolog a ASC US el 1 1 15 de 1347 obtuvo resultados indeterminados en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista con un intervalo de confianza del 95 0 7 a 1 8 Los resultados histol gicos de la CIN2 47 se consideran negativos para la enfermedad gt CIN3 en esta tabla Tabla 13 Rendimiento cl nico de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista estratificado por edades en comparaci n con los resultados de la colposcopia histolog a central 2 CIN2 entre mujeres con citolog a ASC US Edad 18 a lt 21 Histolog a central gt CIN2 a Prueba de VPH de alto riesgo Cervista Negativo Positivo Positivo 96 Negativo 28 Total 124 Prevalencia de la enfermedad 6 8 9 133 Sensibilidad Especificidad PPV NPV Edad 21 a lt 30 Prueba de VPH de alto riesgo Cervista 100 9 9 22 6 28 124 8 6 9 105 100 28 28 Histologia central 2 CIN2 Negativo 30 7 15 70 100 0 Positivo Positivo 321 31 Negativo 136 0 Total Prevalencia de la enfermedad 457 6 4 31 488 31 Intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad PPV NPV 100 31 31 29 8 136 457 8 8 31 352 100 136 136 89 0 100 0 25 8 34 1 6 1 12 27 97 3 100 0 Edad 30 a lt 39 Histologia central 2 CIN2 Prueba de VPH de alto rie
3. Virus de papiloma humano tipo 43 Gen de control interno humano Los tipos 67 y 70 de virus de papiloma humano presentaron resultados positivos con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en 1x10 y 1x10 copias reacci n En una valoraci n de una disoluci n posterior de estas muestras se obtuvieron resultados negativos de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en 1000 copias reacci n y 10 000 copias reacci n respectivamente Adem s se analiz ADN extra do de un panel de doce muestras cervicouterinas que se almacenaron en la soluci n PreservCyt y previamente se confirmaron como portadoras de tipos de VPH de riesgo bajo o indeterminado tipos 6 42 43 44 53 70 por la PCR secuenciaci n con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y obtuvo resultados negativos Se realiz un estudio adicional de reactividad cruzada de Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitides y Mycoplasma hominis mediante organismos completos a adidos en la soluci n PreservCyt con c lulas Jurkat VPH negativas 100 000 c lulas ml Se prepararon tres lotes de cada organismo y se aisl el ADN de todas las muestras mediante el Kit de extracci n de ADN Genfind Este estudio demostr que la prueba de VPH de alto riesgo Cervista no reacciona de forma cruzada con el ADN aislado de las muestras de PreservCyt que contienen hasta 1 0 x 10 cfu ml de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitides 5x10 cfu ml
4. Sensibilidad anal tica El ADN plasm dico del VPH clonado en representaci n de los 14 tipos de VPH detectados por la prueba de VPH de alto riesgo Cervista fue analizado para determinar la sensibilidad anal tica individual para cada tipo espec fico Nueve muestras de ADN caracterizado como VPH negativo aisladas de las muestras cervicouterinas se analizaron en r plicas de ocho 9 muestras por 8 r plicas muestra 72 puntos de datos para determinar el l mite del blanco LoB El valor LoB ratio FOZ del FAM fue 1 20 El L mite de detecci n LoD es la cantidad m s baja de analito necesaria para que la muestra tenga el resultado VPH detectado FOZ gt 1 20 al menos el 95 de las veces los resultados de la prueba est n por encima del valor de corte anal tico el 95 de la veces Los valores del L mite de detecci n LoD individual se calcularon para los 14 tipos de VPH 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 68 Cada ADN plasm dico del VPH se analiz en concentraciones de 7500 5000 2500 y 1250 copias por reacci n cada una en un fondo de tres concentraciones de ADN gen mico aisladas de la l nea de c lulas VPH negativas 10 ng 100 ng y 1 ug por reacci n Todas las muestras positivas se analizaron en r plicas de ocho que resultaron en 24 r plicas por concentraci n de ADN plasm dico del VPH El LoB y el LoD se evaluaron seg n el documento EP17 A del CLSI 23 En la Tabla 17 se indica el L
5. 1 347 57 1 769 1347 1 966 18 5 363 1966 La Tabla 8 muestra la prevalencia del VPH de alto riesgo entre pacientes con citolog a ASC US estratificada seg n la edad Tabla 8 Prevalencia del VPH de alto riesgo seg n la edad Edad Poblaci n con ASC US Edad Poblaci n con NILM 18 lt 21 77 8 105 135 30 lt 40 21 4 132 618 21 lt 30 71 7 352 491 40 lt 50 17 5 118 674 30 lt 39 55 3 167 302 50 lt 60 16 2 79 489 gt 39 34 6 145 419 gt 60 18 4 34 185 Todos 57 1 769 1347 Todos 18 5 363 1966 La Tabla 9 muestra la prevalencia del VPH de alto riesgo independientemente de la citolog a como se inform en varios estudios en mujeres en distintas poblaciones de EE UU Tabla 9 Prevalencia del VPH de alto riesgo en varias poblaciones de EE UU hecha de Tamang total Rango Prevalencia del VPH publicaci n del estudio etario Nuevo M xico 2001 3 863 18 40 26 7 Ubicaci n Poblaci n civil de EE UU 2007 1 921 14 59 15 2 Oreg n 2003 20 156 16 94 16 3 Arizona CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO SENSIBILIDAD CL NICA Y ESPECIFICIDAD PARA EL AN LISIS DE PACIENTES CON RESULTADOS DE CITOLOG A CERVICOUTERINA DE ASC US PARA DETERMINAR LA NECESIDAD DE DERIVACI N PARA LA REALIZACI N DE UNA COLPOSCOPIA Se realiz un estudio cl nico prospectivo en centros m ltiples para evaluar el rendimiento de la prueba de
6. Jurkat 20 000 100 000 VPH 59 VPH 66 3 ADN plasm dico del VPH en la concentraci n indicada copias reacci n mezclado con 100 ng reacci n de ADN gen mico de c lulas VPH negativo Jurkat P ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml 25 Objetivo Tabla 19 Resumen de los resultados positivos del estudio de precisi n de 21 d as VPH positivo n Copias reacci n o C lulas ml extra das Media del ratio FOZ del VPH Operador 1 Operador 2 Operador 3 Total VPH 16 5 000 2 827 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 976 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 18 5 000 2 236 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 182 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 31 5 000 2 199 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 032 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 33 5 000 1 840 89 25 100 28 100 28 96 81 10 000 2 622 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 35 5 000 1 640 61 17 71 20 82 23 71 60 10 000 2 339 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 39 5 000 2 078 100 28 100
7. we i lt THIRD WAVE TECHNOLOGIES Prueba de VPH de alto riesgo TM Cervista 95 438 Una prueba de diagn stico in vitro para la detecci n de ADN de 14 tipos de virus de papiloma humano VPH de alto riesgo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 en muestras cervicouterinas X wek Dispositivo de Contiene reactivos diagn stico suficientes para 96 imitacion de cl nico in vitro pruebas temperatura NO almacene en un congelador sin escarcha Proteja de la luz NDICE NOMBRE Y USO PREVISTO ABREVIATURAS USADAS RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO REACTIVOS PROVISTOS ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N DE LOS REACTIVOS REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS OBTENCI N Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA REALIZACI N DE ANALISIS PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA NOTAS DE PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS CONTROL DE CALIDAD LIMITACIONES RESULTADOS PREVISTOS CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO REFERENCIAS GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS NOMBRE Y USO PREVISTO La prueba de VPH de alto riesgo Cervista es una prueba de diagn stico in vitro para la detecci n cualitativa del ADN de 14 tipos de virus de papiloma humano 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 en muestras cervicouterinas La prueba de VPH de alto riesgo Cer
8. 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Los datos de secuenciaci n se analizaron mediante distintos software de alineaci n de secuencias El an lisis de VPH aprobado por la FDA se realiz seg n la clasificaci n aprobada Los resultados del an lisis compuesto se muestran en las Tablas 15 y 16 que est n a continuaci n 22 Tabla 15 Prueba de VPH de alto riesgo Cervista para la poblaci n con ASC US vs Comparador compuesto Secuenciaci n de PCR y prueba de VPH aprobada por la FDA Prueba de VPH de alto riesgo Cervista Positivo Negativo Compuesto Positivo 536 25 Resultado de Negativo alto riesgo Indeterminado Total Coincidencia porcentual positiva 95 5 536 561 con intervalo de confianza del 95 93 5 97 1 Coincidencia porcentual negativa 89 4 370 414 con intervalo de confianza del 95 86 0 92 2 Tabla 16 Prueba de VPH de alto riesgo Cervista de la poblaci n gt 30 con NILM vs Comparador compuesto Secuenciaci n de PCR y prueba de VPH aprobada por la FDA Prueba de VPH de alto riesgo Cervista Positivo Negativo Compuesto Positivo 17 1 Resultado de Negativo 67 357 alto riesgo Indeterminado 10 9 Total 94 367 Coincidencia porcentual positiva 94 4 17 18 con intervalo de confianza del 95 72 7 99 9 Coincidencia porcentual positiva 84 2 357 424 con intervalo de confianza del 95 80 4 87 5
9. 28 100 28 100 84 10 000 2 986 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 45 5 000 2 514 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 606 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 51 5 000 2 301 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 329 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 52 5 000 1 961 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 2 756 100 28 VPH 56 5 000 2 280 96 27 100 28 100 28 99 83 10 000 3 310 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 58 5 000 2 255 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 3 121 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 59 5 000 1 822 82 23 100 28 100 28 94 79 10 000 2 663 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 66 5 000 2 126 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 2 968 100 28 100 28 100 28 100 84 VPH 68 5 000 2 015 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000 2 823 100 28 100 28 100 28 100 84 SiHa Jurkat 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 3 303 100 28 100 28 100 28 100 84 Hela Jurkat 2500 HeLa 97 500 Jurkat 2 495 100 28 100 28 100 28 100 84 10 000
10. 3 Criterios de llamadas de la muestra ordenados de arriba a abajo Nota la prueba de VPH de alto riesgo Cervista no requiere el uso de una zona equivoca 0 de reiteraci n de la prueba Tabla 4 Interpretaci n de los resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Resultado de la prueba Informe del Interpretaci n de Interpretaci n de de VPH de alto riesgo resultad las pacientes con las pacientes 230 a os de Cervista citolog a ASC US edad con citolog a de NILM Probabilidad baja pero e Tipos de VPH 16 incrementada de que la CIN de EE E EN 18 31 33 35 alto grado subyacente se detecte Dor VPH puede S r 39 45 51 52 en una colposcopia La transitoria estar en proceso 56 58 59 66 bibliograf a cl nica sugiere que de esoluci osef 68 detectados es posible el desarrollo de una E enfermedad de alto grado 29718 PeraiSicnto Baja probabilidad de CIN2 0 3 Muy baja probabilidad de CIN subyacentes o c ncer Los maligna subyacente o c ncer resultados no est n dise ados Los resultados no excluyen para impedir que las mujeres infecciones por VPH futuras ni procedan a la realizaci n de una anomal as citol gicas con colposcopia CIN2 3 subyacentes o c ncer Tipos de VPH 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 no detectados IND CV porcentual alto IND ADNg bajo Seg n las pautas consensuadas en 2006 a partir de los 30 a os las
11. C3 S7 S7 S7 S15 S15 S15 S23 S23 S23 S1 S1 S1 S9 S9 S9 S17 S17 S17 525 525 S25 S2 S2 S2 S10 S10 S10 S18 S18 S18 S26 S26 S26 S3 S3 S3 S11 S11 S11 S19 S19 S19 527 S27 S27 Figura 2 Dise o de la placa de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista 2 Cubra bien cada pocillo con 20 pl de aceite mineral y utilice cinta para sellar la placa y minimizar la evaporaci n 3 Incube las muestras a 95 C durante 5 minutos en un termociclador 10 Mezcle bien los reactivos y las mezclas de reacci n de forma constante con anterioridad al uso Prepare las mezclas de reacci n como se indica en la hoja de preparaci n de la mezcla impresa del software Invader Call Reporter o seg n los c lculos de la Tabla 2 Prepare una mezcla de reacci n para cada una de las tres mezclas de oligonucle tidos de VPH antes de cada uso La mezcla de reacci n preparada debe usarse dentro de los 30 minutos Tabla 2 Instrucciones para la preparaci n de la mezcla de reacci n Reactivo Mezcla 1 2 0 3 de oligonucle tidos de VPH Hl Reacci n N de reacciones muestras y controles k Volumen total 8k 1 25 pl Soluci n de la enzima Cleavase Volumen total de la mezcla 2k 1 25 pl 10k 1 25 pl Reduzca la configuraci n de la temperatura del termociclador a 63 C Agregue 10 ul de la mezcla de reacci n adecuada a cada pocillo que conteng
12. Cervista RESULTADOS PREVISTOS Prevalencia del VPH de alto riesgo La prevalencia informada de la infecci n por VPH en mujeres var a dentro de un amplio espectro de un 14 a m s de un 90 Existen varios factores que pueden afectar a la prevalencia del VPH entre las poblaciones de pacientes debido a la heterogeneidad de ubicaciones geogr ficas edades cantidad de parejas sexuales antecedentes de citolog a cervicouterina an mala junto a las diferencias de las t cnicas de muestreo y los m todos de an lisis y la naturaleza intermitente de la infecci n El estudio cl nico prospectivo en centros m ltiples de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista inscribi a mujeres de 89 cl nicas de 23 estados de los EE UU que produjeron una poblaci n de pacientes demogr ficamente diversa La Tabla 7 muestra los resultados de prevalencia de cuatro Centros de estudios cl nicos que realizaron la prueba de VPH de alto riesgo Cervista para dicho estudio Las muestras de todos los sitios de inscripci n se distribuyeron aleatoriamente entre los centros de prueba 17 Tabla 7 Prevalencia del VPH de alto riesgo en los Centros de prueba para los estudios cl nicos kPoblaci nconAscUSs _____ Poblacion con NILM_ owe Haast a Centro se as a riesgo positivo se realiz la prueba riesg T 1007 60 5 429 709 o 57 1 178 312 28 4 za Ea 5 s3s a3lzar 18 7 185 721 a 7 367 29 79 EET
13. Proteus vulgaris Corynebacterium pseudodiptheriticum Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Staphylococcus epideridis Escherichia coli Streptococcus mitis Lactobacillus acidophilus Streptococcus pyogenes 29 Tabla 25 El ADN purificado que se obtuvo de los organismos enumerados a continuaci n se analiz en concentraciones de 1x10 copias reacci n y 1x10 copias reacci n mediante la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Todas las muestras generaron resultados negativos Virus del herpes simple tipo 1 VHS 1 Chlamydia trachomatis Virus del herpes simple tipo 2 VHS 2 Neisseria gonorrhoeae Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 Neisseria meningitides VIH 1 regiones pol y env Mycoplasma hominis Tabla 26 El ADN clonado o los amplicones de la PCR de las siguientes muestras se analizaron en concentraciones de 1x10 copias reacci n y 1x10 copias reacci n o lo que se especifique La prueba de VPH de alto riesgo de Cervista no mostr reactividad cruzada con los tipos de VPH de bajo riesgo 6 11 42 43 44 y 53 Las muestras de VPH de tipo y el control interno generaron resultados negativos Virus de papiloma humano tipo 1a Virus de papiloma humano tipo 44 Virus de papiloma humano tipo 6 Virus de papiloma humano tipo 53 Virus de papiloma humano tipo 11 Virus de papiloma humano tipo 67 Virus de papiloma humano tipo 42 Virus de papiloma humano tipo 70
14. VPH31 VPH33 VPH35 VPH39 VPH45 VPH51 VPH52 VPH56 VPH58 VPH59 VPH66 VPH68 y ADN de c lulas Jurkat Cada muestra fue comprobada en duplicados en tres concentraciones La cantidad total de mediciones por muestra fue de 84 21 d as 2 an lisis por d a 2 r plicas por serie Tabla 18 Resumen estad stico del estudio de precisi n de 21 d as Media del Intraan lisis Total precisi n ratio FOZ repetibilidad intralaboratorio del VPH DE CV DE 6 DE CV DE 6 DE CV 5 000 2 827 1 052 37 0 694 25 0 529 19 0 074 3 1 048 37 10 000 3 976 0 136 3 0 263 7 0 276 7 0 281 7 0 316 8 5 000 2 236 0 280 13 0 230 10 0 176 8 0 089 4 0 304 14 10 000 3 182 0 105 3 0 153 5 0 092 3 0 054 2 0 160 5 VHS 5 0007 2 199 0 098 4 0 142 6 0 119 5 0 079 4 0 174 8 10 000 3 032 0 123 4 0 178 6 0 159 5 0 082 3 0 219 7 VPH 33 5 000 1 840 0 319 17 0 261 14 0 214 12 0 121 7 0 362 20 10 000 2 622 0 100 4 0 236 9 0 164 6 0 102 4 0 230 9 Copias Reacci n Interserial Interdiaria Interoperador Objetivo o C lulas mI VPH 18 5 000 10 000 5 000 10 000 5 000 VPH 68 76 000 SiHa 20 000 SiHa Jurkat 80 000 Jurkat 2 500 HeLa Hela 97 500 Jurkat Jurkat 10 000 HeLa 90 500 Jurkat 10 000
15. de Mycoplasma hominis y 1 0 x 10 cfu ml de Chlamydia trachomatis 30 REFERENCIAS 1 Wallboomers JM Jacobs MV Manos MM Bosch FX Kummer JA Shah KV Snijders PJ Peto J Meijer CJ Mu oz N 1999 Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide J Pathol 189 1 12 19 2 Sitio Web del National Cancer Institute Instituto Nacional del Cancer www cancer gov 2008 3 Meijer CJ Snijders PJ y Castle PE 2006 Clinical utility of HPV genotyping Gynecol Oncol 103 12 17 4 Plummer M Schiffman M Castle PE Maucort Boulch D Wheeler CM ALTS Group 2007 A 2 year prospective study of human papillomavirus persistence among women with a cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance or low grade squamous intraepithelial lesion J Infect Dis Jun 1 195 11 1582 1589 Epub 2007 Apr 16 5 Castle PE Wacholder S Sherman ME Lorincz AT Glass AG Scott DR Rush BB Demuth F Schiffman M 2002 Absolute risk of a subsequent abnormal Pap among oncogenic human papillomavirus DNA positive cytologically negative women Cancer Nov 95 10 2145 2151 6 Sherman ME Schiffman M y Cox TJ 2002 Effects of age and human papilloma viral load on colposcopy triage data from the randomized Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance Low grade Squamous Intraepithelial Lesion Triage Study ALTS Jour Nat Can Inst 94 2 102 107 7 Wright TC Jr Cox JT Massad LS Twiggs LB W
16. de placa de 96 pocillos sea compatible con el termociclador espec fico y el lector de la placa de fluorescencia que se usar antes de comenzar la prueba Deben agregarse controles en las posiciones designadas en el dise o de la placa de la prueba que aparece en la Figura 2 para que el software Invader Call Reporter funcione correctamente Use aceite mineral nuevo para la configuraci n de cada reacci n no transfiera estos reactivos nuevamente al contenedor original una vez que los haya aplicado Consulte el dise o de la placa de la prueba para asegurarse de haber agregado la mezcla correcta en la columna apropiada Coloque siempre la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del pocillo para asegurarse de que la mezcla de reacci n se agregue debajo del aceite mineral Para mezclar llene y vac e cuidadosamente la punta de la pipeta de 3 a 5 veces Debe hacerse un seguimiento del procedimiento de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista los controles de calidad y la interpretaci n de los resultados para obtener resultados confiables de la prueba 12 INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Para cada una de las tres reacciones se genera un valor se al ruido se al de la muestra comparada con la se al del pocillo de la reacci n de control negativo Este valor se al ruido se denomina valor FOZ curvatura sobre cero del ingl s Fold Over Zero Se genera un resultado final positivo negativo o indeterminado para cualquier
17. del FOZ del ADNg de una muestra negativa es lt 1 5 ADNg bajo Una llamada indeterminada es indicadora de una mezcla insuficiente un error en la medici n en pipeta o un ADNg inadecuado en la muestra consulte la Gu a de resoluci n de problemas En la Figura 3 se muestra un resumen del criterio de llamada de muestra descrito arriba Terminolog a FOZ del VPH para cada mezcla de oligonucle tidos del VPH la se al del FAM de la muestra dividida por la se al del FAM del control negativo Ratio FOZ del VPH la FOZ del VPH m s alta de las tres mezclas de oligonucle tidos del VPH se divide por la m s baja normalizada a 1 0 si el valor FOZ es menor FOZ promedio del ADNg el valor promedio determinado a partir de los tres valores FOZ del ADN gen mico obtenidos de cada una de las tres mezclas de reacci n calculado al dividir la se al del Red de la muestra por la se al del Red del control negativo CV porcentual del FOZ del ADNg el coeficiente porcentual de la variaci n para los valores FOZ del ADNg generados por las tres mezclas de oligonucle tidos de VPH 13 Criterios Resultados generados CV porcentual del ADNg lt 25 No IND CV porcentual alto S Uno o m s valores FOZ del VPH gt 0 70 No IND FOZ del VPH bajo Si Ratio FOZ del VPH lt 1 525 NS POS S Uno o m s valores FOZ del VPH lt 1 93 NO POS S FOZ promedio del ADNg lt 1 50 NO NEG si IND ADNg bajo Figura
18. infecci n por VPH de alto nese es util para que los m dicos puedan decidir qui nes deber an controlarse m s estrictamente 10 11 La bibliograf a cient fica actual sugiere que una infecci n por VPH de alto riesgo persistente es el principal factor de riesgo de manifestar neoplasia cervicouterina de alta malignidad y c ncer 121314 La persistencia evidente puede representar una infecci n continua por un s lo tipo de VPH m ltiples tipos de VPH o una reinfecci n Sin embargo las mujeres con citolog a cervicouterina normal con resultados negativos de VPH de alto riesgo aparentemente presentan bajos riesgos de contraer o manifestar lesiones cervicouterinas precancerosas 1 16 Desde el a o 2002 varios grupos de profesionales sanitarios de los EE UU comenzaron a publicar normas para el tratamiento de pacientes con recomendaciones acerca de c mo realizar an lisis de detecci n de c ncer cervicouterino en mujeres seg n la edad la presencia de anomal as citol gicas en una muestra cervicouterina y otros factores Estas normas para el tratamiento de las pacientes recomiendan la realizaci n de pruebas para la detecci n de tipos de VPH de alto riesgo como una herramienta habitual de cribado junto con la citolog a en instancias espec ficas Las principales recomendaciones en relaci n a las pruebas de VPH de alto riesgo extra das de las normas de las pr cticas profesionales m s recientes las 2006 Consensus Guidelines fo
19. mite de detecci n para cada tipo de VPH Los l mites se describen en t rminos del ratio FOZ del FAM y como un rango de cantidad de copias Los valores LoD de cantidad de copias por reacci n se informaron como el rango de cantidad de copias en el que el 95 de los ratios FOZ del FAM observadas estaban por encima del LoB Tabla 17 Resumen de sensibilidad anal tica de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Tipo de ADN LoD LoD Desviaci n Cantidad de copias reacci n Ratio FOZ del FAM est ndar 1250 2500 1 34 0 08 1250 2500 1 34 0 08 1250 2500 1 30 0 06 2500 5000 1 31 0 07 5000 7500 1 34 0 09 2500 5000 1 30 0 06 1250 2500 1 31 0 06 2500 5000 1 35 0 09 1250 2500 1 28 0 04 1250 2500 1 37 0 10 2500 5000 1 35 0 09 2500 5000 1 35 0 09 2500 5000 1 30 0 06 2500 5000 1 30 0 06 1 324 0 074 Adem s del estudio de sensibilidad anal tica descrito arriba se prepararon las diluciones de la l nea de c lulas para evaluar el rendimiento de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista mediante dos l neas de c lulas VPH positivas HeLa y SiHa diluidas con una l nea de c lulas VPH negativas Jurkat en una concentraci n final de 100 000 c lulas ml en el medio PreservCyt Mediante el uso del valor de corte cl nico del ratio FOZ del FAM de 1 525 las concentraciones que estaban por encima del valor de corte cl nico el 95 de las veces eran de aproximadamente 2 500 c lulas ml pa
20. riesgo Cervista no se ha establecido adecuadamente para las pacientes vacunadas contra el VPH 8 Se observ interferencia en las muestras cervicouterinas contaminadas con niveles altos 2 de jalea anticonceptiva o cremas antimic ticas cuando se aisl el ADN con el Kit de extracci n de ADN de Genfind En estas condiciones pueden obtenerse resultados falsos negativos 9 La prueba de VPH de alto riesgo Cervista para los virus de papiloma humano de tipo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 no se recomienda para la evaluaci n de la sospecha de abuso sexual 10 La prevalencia de la infecci n por VPH en una poblaci n puede afectar el rendimiento Los valores predictivos positivos disminuyen al analizar poblaciones con baja prevalencia o pacientes sin riesgo de infecci n 11 La infecci n por VPH no es un indicador de HSIL citol gica o CIN de alto grado subyacente ni implica que se manifestar una CIN2 3 o c ncer La mayor a de las mujeres infectadas por uno o m s tipos de VPH de alto riesgo no desarrollan CIN2 3 ni c ncer 12 Un resultado negativo de la prueba de VPH de alto riesgo no excluye la posibilidad de HSIL citol gicas CIN2 3 subyacentes o c ncer en el futuro 13 Las muestras de la soluci n PreservCyt que contienen vol menes menores a 2 ml despu s de la preparaci n de los portaobjetos de la prueba de Papanicolaou con ThinPrep se consideran inadecuadas para la prueba de VPH de alto riesgo
21. tira negra amortiguador EDTA 03 1000 copias pl de ADN del VPH tipo 16 Control 3 de clonado y 3000 copias ul de ADN del gen de VPH Tapa 1 x 200 pl la histona humana 2 clonado en el ARNt de transparente levadura y 10 mM de Tris 0 1 mM de y tira negra amortiguador EDTA NTC Control Tapa 1 x 200 ul ARNt de levadura y 10 mM de Tris 0 1 mM negativo transparente x H de amortiguador EDTA y tira negra ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagn stico in vitro Seguridad y precauciones de manipulaci n 1 Deben emplearse precauciones de seguridad universales para el manejo de tejidos o l quidos humanos Las muestras deben desecharse seg n las normas locales 2 Los componentes del producto residuos o empaque del producto pueden considerarse desechos de laboratorio Deseche los reactivos no utilizados y desperdicios seg n las normas federales estatales y locales aplicables REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N DE LOS REACTIVOS e Almacene todos los reactivos entre 30 C y 15 C e No use reactivos pasada la fecha de vencimiento indicada en la parte externa del paquete e No almacene en un congelador sin escarcha e Proteja de la luz e Antes de usar saque los reactivos del congelador y d jelos al menos 30 minutos a temperatura ambiente o hasta que la inspecci n visual indique que no hay material congelado presente e Agite con v rtex los reactivos antes de usarlos e Third Wave Technologies no r
22. una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3 6 4 veces e Asegurese de que se expulse todo el liquido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Verifique que se haya agregado el reactivo correcto a cada pocillo e Verifique que se hayan agregado los vol menes de mezcla de reactivos correctos a cada pocillo e Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada e Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos Sospecha de contaminaci n durante la adici n de la muestra o la preparaci n de la mezcla de reacci n e Use puntas de barreras en aerosol sin nucleasa y tubos est riles al preparar las mezclas de reacci n e Use guantes durante la preparaci n de la prueba e Aseg rese de que las puntas de las pipetas toquen s lo la soluci n que se administra e No toque las puntas de las pipetas con las manos e Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Burbujas en los pocillos de la placa de reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Us
23. utiliz una cantidad insuficiente de ADN e Mezcle bien el pocillo de la muestra y repita la extracci n de ADN e Verifique que se haya agregado el volumen correcto de la muestra a cada pocillo e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN Inhibici n de la muestra de ADN Repita la extracci n de ADN de la muestra Consulte prospecto incluido en el envase en la secci n Caracter sticas de los resultados Sustancias interferentes Es posible que las muestras de ADN no puedan desnaturalizarse por completo antes de la prueba Aseg rese de que la muestra se haya desnaturalizado a la temperatura correcta y durante el tiempo adecuado La muestra presenta un resultado de IND FOZ del VPH bajo Sospecha de error durante la extracci n de ADN Inhibici n de la muestra de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN e Consulte el prospecto incluido en el envase en la secci n Caracter sticas de rendimiento Sustancias interferentes Volumen de ADN de la muestra insuficiente Volumen de eluci n insuficiente durante la extracci n de ADN Repita la extracci n de ADN de la muestra Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN Cantidad alta de muestras de ADN con valores FOZ del FAM positivos en las tres mezcla
24. 4 veces e Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Verifique que se haya agregado la muestra correcta a cada pocillo e Verifique que se haya agregado el volumen correcto de la muestra a cada pocillo e Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada e Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos Sospecha de contaminaci n durante la adici n de la muestra Use puntas con barrera de aerosol sin nucleasa y tubos est riles durante la configuraci n Use guantes durante la preparaci n de la prueba Aseg rese de que las puntas de las pipetas toquen s lo la soluci n que se administra No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Burbujas en los pocillos de la reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Use las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n 36 La muestra presenta un resultado de IND ADNg bajo Cantidad insuficiente de c lulas en la muestra Sospecha de error durante la extracci n de ADN En la prueba se
25. DE VPH DE ALTO RIESGO CERVISTA COMO AUXILIAR DE LA CITOLOG A CERVICOUTERINA PARA AYUDAR A GUIAR EL TRATAMIENTO DE LAS PACIENTES Se inici un estudio longitudinal de 3 a os despu s de la aprobaci n de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista para avalar su uso como auxiliar de la citolog a cervicouterina en comparaci n con la citolog a cervicouterina sola El dise o del estudio se describe debajo junto con los datos anal ticos preliminares obtenidos de la poblaci n del estudio en el momento de la inscripci n Este estudio anal tico se us para la evaluaci n de la coincidencia de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista con un comparador compuesto de VPH entre las poblaciones 230 con ASC US y NILM La aprobaci n de esta indicaci n se otorga antes de la finalizaci n de los estudios longitudinales a la luz de los resultados de los estudios anal ticos Adem s los datos consistentes obtenidos de varios estudios de cohortes de secciones cruzadas y prospectivos que se realizaron mediante una variedad de m todos de muestreo de c lulas y con el uso de una variedad de m todos de prueba de ADN del VPH aprobados por la FDA y aptos para uso en investigaci n brindaron pruebas 21 s lidas de que un resultado negativo de la prueba de ADN del VPH implica un riesgo muy bajo de prevalencia o de comienzo de CIN2 3 6 de cancer cuando los resultados de la citolog a cervicouterina son normales 187325 Descripci n del estudio cl
26. EF 95 438 Reactivo Abreviatura de Cantidad Descripci n de los componentes la etiqueta del de viales y vial volumen del reactivo 01 Oligonucl otidos con afinidad a los tipos 51 1 x 1400 ul 56 66 de VPH y el gen de la histona humana dl eae Tapa y tira H 2 suspendidos en agua y en amortiguador azules MOPS pH 7 5 02 Oligonucl otidos con afinidad a los tipos 18 Rie ee 1 x 1400 ul 39 45 59 68 del VPH y el gen de la histona 9 SUB Tapa y tira H humana 2 suspendidos en agua y en amarillas amortiguador MOPS pH 7 5 03 Oligonucl otidos con afinidad a los tipos x14001 16 31 33 35 52 58 del VPH y el gen de la 9 del VPH Tapa y tira H histona humana 2 suspendidos en agua y en anaranjadas amortiguador MOPS pH 7 5 Soluci n de la E Enzima Cleavase suspendida en 140 mM 4x 1100 ul MgClo 10 mM de Tris pH 8 0 25 mM de 5 Tapa y tira KCI 0 25 de Tween 20 0 25 de Nonidet p rpuras P40 25 de Glicerol y 0 05 mg ml de BSA 1 1000 copias ul de ADN del VPH tipo 51 Control 1 de clonado y 3000 copias pul de ADN del gen de Q MBR Tapa 1 x 200 pl la histona humana 2 clonado en el ARNt de transparente levadura y 10 mM de Tris 0 1 mM de y tira negra amortiguador EDTA C2 1000 copias ul de ADN del VPH tipo 18 Control 2 de clonado y 3000 copias ul de ADN del gen de VPH Tapa 1 x 200 ul la histona humana 2 clonado en el ARNt de transparente levadura y 10 mM de Tris 0 1 mM de y
27. FOZ FRET HIST2H2BE LoB LoD M x M n NILM NTC Oligo Pap Red RFU TWT VPH cido desoxirribonucleico ADN gen mico c lulas escamosas at picas de significado indeterminado neoplasia intraepitelial cervicouterina Clinical and Laboratory Standards Institute Instituto de est ndares cl nicos y de laboratorio fluor foro carboxifluoresce na curvatura sobre cero la se al de la muestra o del control dividida por la se al de control negativo transferencia de energ a por resonancia de fluorescencia gen de la histona humana 2 gen H2be l mite de blanco l mite de detecci n m ximo m nimo resultado negativo del an lisis de detecci n de lesiones intraepiteliales o neoplasia Esta categor a engloba a las categor as anteriores dentro de los l mites normales y cambios celulares benignos control negativo oligonucle tido prueba citol gica cervicouterina de Papanicolaou fluor foro rojo Redmond unidad de fluorescencia relativa Third Wave Technologies Inc virus de papiloma humano RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA Se han registrado m s de 100 tipos de VPH en la bibliograf a aproximadamente 40 de los cuales infectan el rea anogenital y se transmiten por v a sexual El VPH anogenital est asociado con casi todos los tipos de c ncer cervicouterino Anteriormente se ha demostrado que es muy f cil prevenir el c ncer cervicouterino cuando se emplean programas de an li
28. HeLa 90 000 Jurkat 6 130 100 28 100 28 100 28 100 84 Jurkat 10 000 1 030 4 1 0 0 4 1 2 2 20 000 1 003 0 0 0 0 0 0 0 0 100 000 1 005 100 28 0 0 0 0 100 28 0 0 100 84 0 0 3 ADN plasm dico del VPH en la concentraci n indicada mezclado con 100 ng reacci n de ADN gen mico de c lulas VPH negativo Jurkat copias reacci n 5 ADN gen mico aislado de c lulas VPH positivas SiHa y HeLa o c lulas VPH negativas Jurkat en la concentraci n indicada c lulas ml Con 5000 copias reacci n las muestras de ADN plasm dico presentaron un 97 2 1143 1176 de los resultados positivos previstos Con 10 000 copias reacci n las muestras de ADN plasm dico presentaron un 100 0 1176 1176 de los resultados positivos previstos consulte la Tabla 19 26 Reproducibilidad La reproducibilidad de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista se evalu en tres sitios externos mediante un panel de c lulas de cultivo VPH positivas y negativas y muestras cervicouterinas VPH positivas y negativas El ADN se ext
29. La medida de este objetivo funciona como mecanismo de control de calidad para confirmar que un resultado negativo no se debe a una 6 muestra insuficiente El objetivo del control interno tambi n funciona como medida de procesamiento para garantizar que el procedimiento de la prueba se haya realizado correctamente 1a Los oligonucle tidos del VPH 1b Los oligonucle tidos del gen de la forman estructuras invasivas en el histona humana 2 forman estructuras ADN del VPH invasivas en el ADN aen mico gt A y TARGET 5 y TARGET y TARGET mr A gt A 2 La enzima Cleavase reconoce la estructura y divide a los oligonucle tidos de la sonda D a h Ma 2 3 gt A amp lt al g A Th Ss er 38 Las colas de los oligonucle tidos de las 3b Las colas de los oligonucle tidos de las sondas sondas de VPH forman una estructura invasiva del HIST2H2BE forman una estructura invasiva en en los oligonucle tidos de la FRET del FAM los oliaonucle tidos de la FRET del Red I gt TS 4 La enzima Cleavase reconoce la estructura libera fluor foros de los oligonucle tidos de la FRET y genera una se al fluorescente Fluorescencia Fluorescencia o FAM ra o Figura 1 Una representaci n gr fica de la qu mica de Invader en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista REACTIVOS PROVISTOS Tabla 1 Contenidos de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista R
30. Pos 15 7 345 2 143 100 5 100 5 100 5 15 mezclado 16 neg Combinaci n 15 1 196 0 137 o0 00 00 o cervicouterina neg Sustancias interferentes Las cuatro muestras cervicouterinas una VPH negativa y tres VPH positivas y las tres muestras de l neas de c lulas una VPH negativa tres VPH positivas descritas en la Tabla 22 se analizaron con interferentes que podr an estar presentes en la muestra cervicouterina o transferirse de manera inadvertida durante la extracci n de la muestra mediante el Kit de extracci n de ADN Genfind Tabla 23 Los niveles de concentraci n se eligieron para representar las condiciones extremas que podr an producirse durante la obtenci n de la muestra si el cuello del tero no se limpia previamente Se aisl el ADN de las muestras puras e impuras mediante el Kit de extracci n de ADN Genfind y se analiz con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista para evaluar la interferencia producida por las sustancias introducidas Tabla 22 Descripciones de las muestras con sustancias interferentes Muestra Descripci n Muestra de c lulas cervicouterinas VPH positivo Muestra de c lulas cervicouterinas VPH negativo Muestra cervicouterina almacenada en la soluci n PreservC yt Resultado de la PCR Secuenciaci n positivo Muestra cervicouterina almacenada en la soluci n PreservC yt Resultado de la PCR Secuenciaci n negativo Mue
31. VPH de alto riesgo Cervista para el an lisis de pacientes con resultados de citolog a de ASC US para determinar la necesidad de una derivaci n para realizar una colposcopia Todas las caracter sticas de rendimiento cl nico se establecieron mediante muestras citol gicas l quidas tratadas con ThinPrep Las muestras cervicouterinas ThinPrep iniciales se clasificaron siguiendo el sistema Bethesda 2001 Todas las mujeres a partir de los 18 a os con resultados citol gicos de ASC US durante los procedimientos de prueba de detecci n de c ncer cervicouterino de rutina fueron invitadas a participar en el estudio antes de conocer el estado de VPH Para las mujeres que dieron consentimiento se obtuvieron posteriormente muestras ThinPrep de ASC US residual iniciales para la realizaci n de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Todas las pacientes que dieron su consentimiento para la realizaci n del estudio fueron sometidas a colposcopias Los 18 investigadores y las pacientes estaban cegadas al estado de VPH de las pacientes hasta que finalizaron los procedimientos colposc picos para evitar sesgos Las muestras histol gicas dirigidas colposc picamente fueron examinadas por pat logos que tambi n desconoc an la condici n de VPH de las pacientes 1 514 mujeres a partir de los 18 a os con resultados de ASC US se inscribieron finalmente en el estudio realizado en 89 cl nicas de los Estados Unidos El rendimiento cl nico de la prue
32. Z del ADNg de las tres mezclas debe ser superior o igual a 1 50 2 1 50 o el control no ser v lido para el ADNg bajo 15 3 El CV porcentual del valor FOZ del ADNg medio de las tres mezclas debe ser menor que 25 0 lt 25 0 Tabla 6 Criterios de control del VPH Control Resultado Ratio FOZ Mezcla FOZ FOZ promedio CV porcentual del VPH positiva del ADNg FOZ del ADNg Control 1 Control S lo mezcla 3 Control 2 Control S lo mezcla 5 Control 3 Control S lo mezcla Nota es posible analizar controles externos adicionales seg n las pautas o requisitos de las reglamentaciones o de las organizaciones de acreditaci n locales estatales o de cada pa s Los an lisis de controles externos adicionales deben realizarse en pocillos designados para las muestras de las pacientes seg n el dise o de la placa Verificaci n de la prueba 1 Los resultados de la muestra son v lidos si los controles positivos y negativos producen resultados correctos Si el control negativo o alguno de los resultados de los controles positivos no son v lidos los resultados de las muestras en la placa no ser n v lidos y deber n repetirse las pruebas Consulte las secciones de Resoluci n de problemas de este prospecto y el Manual del usuario del software Invader Call Reporter Debe cumplirse con todos los requisitos de control de calidad estipulados por las reglamentaciones locales estatales y federales as como con los requisitos de
33. a extracci n de ADN la jalea anticonceptiva mostr una interferencia detectable visualmente con la separaci n de las microesferas magn ticas en el amortiguador de Tris de 10 mM que produjo una recuperaci n baja del ADN y una muestra de ADN insuficiente para la prueba Los niveles de sustancia interferente requeridos para provocar fallas en las pruebas son inusualmente elevados y no deben encontrarse en las muestras cl nicas reales si el m dico sigue el procedimiento de muestreo citol gico cervicouterino correspondiente que consiste en limpiar el cuello uterino antes de obtener la muestra de c lulas para la citolog a cervicouterina Reactividad cruzada Se analiz un panel bacteriano mic tico y v rico que se encuentra com nmente en el aparato anogenital femenino como tambi n varios tipos de virus de papiloma humano clonado de riesgo bajo o indeterminado con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista para evaluar la posible reactividad cruzada consulte las Tablas 24 a 26 Tabla 24 Los microorganismos enumerados a continuaci n se agregaron a la soluci n PreservCyt en concentraciones de aproximadamente 1 x10 cfu ml y 1x10 cfu ml Se extrajo ADN de estos microorganismos y una l nea celular negativa Jurkat 1x10 c lulas ml mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Todas las muestras presentaron resultados negativos con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Candida albicans
34. a un control o una muestra consulte la Figura 2 teniendo cuidado de aspirar con la pipeta por debajo del aceite mineral Incube la placa en una configuraci n de 63 C durante 4 horas Obtenci n de datos Lleve siempre la placa a temperatura ambiente antes de realizar la lectura Si no se puede leer la placa de inmediato almac nela a una temperatura entre 2 C y 8 C se recomienda leer la placa dentro de las 24 horas de realizada la prueba Coloque la placa de 96 pocillos el pocillo A1 debe estar en la esquina superior izquierda en el recipiente de la placa del lector de la placa de fluorescencia Quite la cinta que sella la placa Defina el tipo de placa para configurar las coordenadas y la altura de la sonda para el tipo de placa espec fico Guarde las configuraciones Lea toda la placa Se requieren dos lecturas independientes FAM Excitaci n 485 nm Emisi n 535 nm y Red Excitaci n 560 nm Emisi n 612 nm Para detectar la se al del VPH debe configurarse el instrumento de manera que pueda detectar primero el fluor foro del FAM Para detectar el ADN gen mico de la muestra el instrumento debe configurarse de manera tal que detecte el fluor foro Red consulte la Tabla 3 Ajuste la ganancia del lector de fluorescencia de la placa para que est en el rango din mico lineal del lector seg n las instrucciones del fabricante La ganancia debe establecerse de manera tal que el control negativo NTC muestr
35. aci n durante la adici n de la muestra Use puntas con barrera de aerosol sin nucleasa y tubos est riles durante la configuraci n Use guantes durante la preparaci n de la prueba Aseg rese de que las puntas de las pipetas toquen s lo la soluci n que se administra No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies con los materiales adecuados Evaporaci n de la muestra Compruebe que se haya agregado aceite mineral a cada pocillo Orientaci n de la placa incorrecta Al analizar la placa ori ntela de manera que el pocillo A 1 est en la esquina superior izquierda Burbujas en los pocillos de la placa de reacci n De ser posible centrifugue las placas antes de la prueba de fluorescencia 35 Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron dentro del per odo recomendado Use las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n La muestra presenta un resultado de IND CV porcentual alto Mezcla de las muestras insuficiente o inconstante Adici n inconstante de la mezcla de reacci n Adici n inconstante de la muestra e Aseg rese de que todos los reactivos y las muestras se mezclen completamente e Al agregar una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3
36. acreditaci n correspondientes LIMITACIONES 1 La prueba de VPH de alto riesgo Cervista detecta el ADN de los tipos de VPH de alto riesgo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Esta prueba no detecta el ADN de los tipos de VPH de bajo riesgo p ej 6 11 42 43 44 ya que el an lisis para estos tipos de VPH no es de utilidad clinica La prueba de VPH de alto riesgo Cervista muestra una reactividad cruzada con dos tipos de VPH de riesgo desconocido Se observ un resultado de VPH positivo con 5000 copias reacci n de VPH tipo 67 y 50 000 copias reacci n de VPH tipo 70 Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infecci n por VPH ya que niveles muy bajos de infecci n o errores en la muestra pueden producir resultados negativos falsos La prueba ha sido validada para su uso s lo con muestras citol gicas cervicouterinas obtenidas en la soluci n PreservCyt mediante una brocha Rovers Cervex Wallach Papette o brocha esp tula endocervical El rendimiento de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista se estableci exclusivamente mediante el uso de ADN extra do con el Kit de extracci n de ADN Genfind 16 6 El rendimiento de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista se estableci mediante el uso de las muestras de PreservCyt para citolog a cervicouterina procesadas en ThinPrep 2000 No se ha establecido mediante otros procesadores 7 El rendimiento de la prueba de VPH de alto
37. ba de VPH de alto riesgo Cervista se compar con los resultados de la colposcopia y la histolog a Las muestras de las biopsias se obtuvieron de mujeres con citolog a de ASC US seg n lo requieren las pautas de cuidados est ndar en cada cl nica participante Los resultados histol gicos consensuados brindados por un panel de revisi n de pat logos central fueron el criterio de referencia para la determinaci n de la presencia 0 ausencia de la enfermedad En ausencia de datos histol gicos la falta de lesiones cervicouterinas visibles mediante la colposcopia y de biopsia se equipar a la ausencia de enfermedad Hubo 1 347 pacientes con ASC US con estado de la enfermedad histolog a central o colposcopia negativa y resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista conocidos En la Tabla 10 se muestra una comparaci n entre los resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y la colposcopia histolog a central El rendimiento cl nico de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista se resume en las Tablas 11 12 y 13 Tabla 10 Resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en comparaci n con los resultados de la colposcopia histolog a central entre mujeres con citolog a ASC US Histolog a central Prueba de VPH de alto Colposcopia neg No riesgo Cervista sin biopsia presenta CIN1 CIN2 CIN VPH de alto riesgo positivo VPH de alto riesgo negativo VPH de alto riesgo indeterminado Total
38. ducto no est autorizado a transferirlo a terceros con ning n fin sin el consentimiento expreso por escrito de Third Wave Technologies Inc A excepci n de lo especificado expresamente en este p rrafo no se otorga ninguna otra licencia expresa impl cita o por exclusi n Para obtener informaci n acerca de la disponibilidad de licencias adicionales para poner en pr ctica las metodolog as patentadas comun quese con Legal Department Third Wave Technologies Inc 502 South Rosa Rd Madison WI 53719 608 273 8933 La prueba de VPH de alto riesgo Cervista una qu mica Invader propietaria y componentes espec ficos cubiertos por las siguientes patentes N de patentes de EE UU 5 614 402 5 795 763 5 846 717 5 985 557 5 994 069 6 001 567 6 090 543 6 090 606 6 348 314 6 458 535 6 555 357 6 562 611 6 635 463 6 673 616 6 759 226 6 872 816 6 875 572 6 913 881 7 060 436 7 067 643 7 087 381 N de patentes canadienses 2 163 015 2 203 627 N de patentes australianas 694 736 731 062 737 449 738 849 744 369 779 443 781 188 N de patente japonesa 3 665 648 N de patente europea 711 361 Todas las patentes estadounidenses y extranjeras segun corresponda que se hayan emitido o se emitan en lo sucesivo respecto de las solicitudes de dichas patentes asi como todas las solicitudes de patentes y las patentes estadounidenses o extranjeras que se emitan por consiguiente seg n corresponda cuyo objeto en s
39. e la prueba de Papanicolaou ThinPrep mediante un dispositivo tipo brocha p ej la brocha Rovers Cervex Wallach Papette o una brocha esp tula para an lisis cervicouterino Para la prueba de VPH de alto riesgo Cervista las muestras cervicouterinas pueden almacenarse a temperatura ambiente de 20 C a 30 C en la soluci n PreservCyt hasta 18 semanas antes de realizar la prueba Las muestras de la soluci n PreservCyt no pueden congelarse Debe extraerse ADN de las muestras de PreservCyt mediante el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Nota extraiga ADN de las muestras cervicouterinas obtenidas en soluci n PreservCyt mediante el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 antes de comenzar el procedimiento de reacci n Procedimiento de reacci n 1 Agregue 10 ul del ADN de cada control y de cada muestra en tres pocillos de una placa de 96 pocillos como se indica en el dise o de la placa de la prueba consulte la Figura 2 Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez Mez cla1 cla2 cla3 cla1 cla2 cla3 cla1 cla2 cla3 cla1 cla2 cla 3 IIO TM o O mi NTC NTC NTC 58 58 58 516 516 516 524 524 524 54 54 54 512 512 512 520 520 520 528 528 528 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C1 C1 C1 S5 55 55 513 513 513 521 521 521 C2 C2 C2 S6 S6 S6 514 514 514 522 522 522 C3 C3
40. e las mezclas de reacci n dentro de los 30 minutos de la preparaci n 34 Los controles presentan un resultado de Control no valido Mezcla de los controles insuficiente o inconstante Adici n inconstante de la mezcla de reacci n Adici n insuficiente o inconstante del control e Aseg rese de que todos los controles y reactivos se mezclen completa y consistentemente e Al agregar una mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo debajo del aceite mineral y transfiera con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 3 0 4 veces e Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Aseg rese de que se haya agregado el control correcto a cada pocillo e Aseg rese de que se haya agregado el volumen de control correcto a cada pocillo e Revise la informaci n de calibraci n del equipo e Inspeccione visualmente la placa para verificar que haya un volumen equivalente entre los pocillos No se agregaron los controles correctos a la placa o no se agregaron en la posici n correcta de la placa El per odo de incubaci n fue m s corto o m s extenso que el tiempo recomendado Verifique que se hayan agregado los controles correctos en las posiciones de la placa adecuadas Confirme que la incubaci n se haya realizado en el per odo y la temperatura especificados Sospecha de contamin
41. e valores que est n en el rango de fondo del lector con una RFU m nima de 600 No es necesario que los valores del NTC sean id nticos para las lecturas del FAM y Red 11 Tabla 3 Especificaciones configuraciones del lector de la placa de fluorescencia Par metros de medici n de Medici n 1 Medici n 2 etiquetado m ltiple FAM Red Modo de lectura Superior Superior Longitud de onda ancho de banda de la excitaci n Longitud de onda ancho de banda de la emisi n Cantidad de destellos 485 20 nm 560 20 nm 535 25 nm 612 10 nm Tiempo de integraci n NOTAS DE PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES 1 10 11 12 Los laboratorios deben aplicar buenas pr cticas de laboratorio y cumplir con todos los requisitos de las reglamentaciones federales estatales y locales aplicables Estos componentes han sido probados como una unidad No intercambie componentes de otras fuentes o de lotes diferentes No combine los reactivos de diferentes lotes ni de diferentes viales del mismo lote No use los reactivos despu s de la fecha de vencimiento Mezcle bien las muestras los reactivos y las mezclas de reacci n de forma constante Use puntas de pipetas de barrera en aerosol est riles descartables y sin nucleasa para cada adici n y transferencia para evitar la contaminaci n cruzada Use tubos de propileno descartables sin nucleasa para la preparaci n de las mezclas de reacci n Verifique que el tipo
42. ecomienda m s de seis 6 ciclos de congelamiento y descongelamiento para los reactivos de las pruebas de VPH de alto riesgo Cervista REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES El software Invader Call Reporter es un componente necesario de esta prueba de diagn stico in vitro Se proporciona este software una vez con la compra inicial de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista y posteriormente con el lanzamiento de actualizaciones del software El kit de extracci n de ADN Genfind es accesorio a la prueba de VPH de alto riesgo Cervista Comun quese con Third Wave Technologies para solicitar el kit de extracci n de ADN Genfind REF 95 449 MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS Materiales fungibles e Puntas de pipetas con barrera de filtro y sin nucleasa e Placas de polipropileno de 96 pocillos e Sellador de placa transparente e Aceite mineral para biolog a molecular e Tubos est riles de 2 ml de polipropileno y tapas roscadas Equipos e Pipetas e Agitador v rtex e Lector de placa de fluorescencia consulte la Tabla 3 e PC de escritorio con sistema operativo Microsoft Windows XP con Microsoft Excel y el software Adobe Reader e Termociclador u horno con capacidad para mantener temperaturas de reacci n adecuadas OBTENCI N Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA REALIZACI N DE ANALISIS Las muestras cervicouterinas deben obtenerse en la soluci n PreservCyt el sistema de conservaci n d
43. el control negativo produzca una se al m nima de 600 RFU y vuelva a leer la placa Se produjeron errores durante la importaci n de datos Verifique las configuraciones de resultados del FAM y el Red y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Verifique la configuraci n de ganancia del FAM y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Verifique la configuraci n de ganancia del Red y lea toda la placa nuevamente No se permiten lecturas parciales de la placa Problemas del fluor metro Consulte la Gu a de resoluci n de problemas del Manual del usuario del software Invader Call Reporter para obtener informaci n acerca de los problemas del fluor metro que puedan ayudarlo a solucionar este error El per odo de incubaci n fue m s extenso que el tiempo recomendado Confirme que la incubaci n se haya realizado en el per odo y la temperatura especificados 33 El control negativo produce los siguientes resultados CV porcentual alto NTC del VPH CV porcentual alto NTC del ADNg Mezcla de reactivos insuficiente o inconstante Preparaci n incorrecta de las mezclas de reacci n Adici n inconsistente del control negativo o la mezcla de reacci n a la microplaca e Aseg rese de que todos los reactivos las muestras y las mezclas de reacci n se mezclen completamente e Al agregar
44. en With Equivocal Pap Smears A Meta analysis of the Accuracy To Detect High Grade Intraepithelial Neoplasia J Natl Cancer Inst 96 280 293 32 GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS Tabla 27 Gu a de resoluci n de problemas Observaci n Causa probable Soluci n Volumen insuficiente para las mezclas de reacci n La cantidad de muestras ingresadas en la ficha Selecci n del an lisis es inferior a las muestras agregadas a la placa Vuelva a calcular en forma manual la cantidad requerida de mezcla de reacci n necesaria para completar toda la placa Vuelva a crear las copias de impresi n del software usando la cantidad correcta de muestras Se agreg un volumen de mezcla de reacci n excesivo a la microplaca de 96 pocillos Verifique que se hayan agregado los vol menes de mezcla de reacci n correctos a cada pocillo Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo est actualizada El control negativo produce los siguientes resultados e Aumento de la ganancia para el an lisis 1 e Aumento de la ganancia para el an lisis 2 e Aumento de la ganancia para ambos an lisis La configuraci n de la ganancia del lector de microplacas de fluorescencia es demasiado baja por lo que hace que los valores de las se ales de fluorescencia desciendan por debajo del requisito m nimo Aumente la configuraci n de ganancia del fluor metro para los an lisis designados de modo que
45. gies Inc Cervista e Invader Call Reporter son marcas comerciales registradas de Third Wave Technologies Inc Todas las dem s marcas y marcas comerciales registradas de este prospecto del producto son propiedad de cada una de sus respectivas compa as Algunos componentes del an lisis del cido nucleico como las composiciones y los m todos espec ficos de manipulaci n o visualizaci n de los cidos nucleicos que se deben analizar pueden estar cubiertos por una o m s patentes de terceros De forma similar los cidos nucleicos que contienen secuencias de nucle tidos espec ficas pueden estar patentados La fabricaci n el uso O la venta de estos componentes o cidos nucleicos pueden requerir de una o m s licencias Ninguna parte del contenido de este documento debe considerarse como una autorizaci n o licencia impl cita de fabricaci n uso o venta de ning n componente o cido nucleico protegido por dichas patentes 2009 Third Wave Technologies Inc P N 15 3100 2401 Revisi n 100 39
46. ilkinson EJ 2002 Consensus Guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities JAMA 287 2120 2129 8 Solomon D Schiffman M and Tarone R 2001 Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance baseline results from a randomized trial Jour Nat Can Inst 93 4 293 299 9 Davey DD Neal MH Wilbur DC Colgan TJ Styer PE and Mody DR 2004 Bethesda 2001 implementation and reporting rates 2003 practices of participants in the college of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytology Arch Path Lab Med 128 1224 1229 10 Mayrand MH E Duarte Franco Rodrigues SD Walter J Hanley 2007 A Ferenczy S Ratnam F Coutl e EL Franco Human Papillomavirus DNA versus Papanicolaou Screening Tests for Cervical Cancer N Engl J Med 357 16 1579 1588 11 Wheeler CM WC Hunt M Schiffman PE Castle 2 2006 Human papillomavirus genotypes and the cumulative 2 Year risk of cervical cancer J Infect Dis 194 1291 1299 12 Bosch FX Lorincz A Munoz N Meijer CULM Shah KV 2002 The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer J Clin Pathol Apr 55 4 244 265 13 Woodman CBJ Collins S Winter H Bailey A Ellis J Prior P Yates M Rollason TP 2001 Natural history of cervical human papillomavirus infection in young women a longitudinal cohort study Lancet Jun 357 9271 1831 1836 14 Wallin K L Wi
47. klund F Angstrom T Bergman F Stendahl U Wadell G Hallmans G Dillner J 1999 Type specific persistence of human papillomavirus DNA before the development of invasive cervical cancer N Engl J Med Nov 341 22 1633 1638 31 15 Wright TC Jr Schiffman M Solomon D Cox JT Garcia F Goldie S Hatch K Noller KL Roach N Runowicz C Saslow D 2004 Interim guidance for the use of human papillomavirus DNA testing as an adjunct to cervical cytology for screening Obstet Gynecol 103 304 309 16 Kjaer S Hogdall E Frederiksen K et al 2006 The absolute risk of cervical abnormalities in highrisk human papillomavirus positive cytologically normal women over a 10 year period Cancer Res 66 10630 10636 17 Saslow D Runowicz CD Solomon D Moscicki A B Smith RA Eyre HJ Cohen C 2002 American Cancer Society guideline for the early detection of cervical neoplasia and cancer CA Can Jour Clin 53 342 362 18 Wright TC Jr Massad LS Dunton CJ Spitzer M Wilkinson EJ and Solomon D 2007 2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests Am J Obstet Gynecol 197 4 346 55 19 Hall JG Eis PS Law SM Reynaldo LP Prudent JR Marshall DJ Allawi HT Mast AL Dahlberg JE Kwiatkowski RW de Arruda M Neri BP and Lyamichev VI 2000 Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction PNAS 97 15 8272 8277 20 Revzina N DiClemente R 2005 Preva
48. lence and incidence of human papillomavirus infection in women in the USA a systematic review Int J of STD 8 AIDS 528 537 21 Peyton C Gravitt P Hunt W Hundley R Zhao M Apple R Wheeler C 2001 Determinants of Genital Human Papillomavirus Detection in a US Population J Infect Dis 183 1554 1564 22 Dunne E Unger E Sternberg M McQuillan G Swan D Patel S Markowitz L 2007 Prevalence of HPV Infection Among Females in the United States JAMA Feb 297 8 813 819 23 Sherman M et al 2003 Baseline Cytology Human Papillomavirus Testing and Risk for Cervical Neoplasia A 10 Year Cohort Analysis Jour Nat Can Inst 95 46 52 24 Giuliano AR Pepenfuss M Abrahamsen M et al 2001 Human papillomavirus infection in the United States Mexico border implications for cervical cancer prevention and control Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10 1129 1136 25 Liaw K et al 1999 Detection of Human Papillomavirus DNA in Cytologically Normal Women and Subsequent Cervical Squamous Intraepithelial Lesions J Natl Cancer Inst 91 954 960 26 CLSI document EP17 A Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation Approved Guideline 27 Kondratovich M Yousef W 2005 Evaluation of Accuracy and Optimal Cut off of Diagnostic Devices in the Same Study Proceedings of the 2005 Joint Statistical Meeting Biopharmaceutical Section p 2547 2551 28 Arbyn M et al 2004 Virologic Versus Cytologic Triage of Wom
49. ligonucle tidos se superponen en al menos un par de base en la secuencia objetivo se forma una estructura invasiva que act a como un sustrato de la enzima Cleavase La enzima segmenta la porci n 5 cola de la sonda en la ubicaci n de la superposici n Las sondas est n presentes en un elevado exceso molar y activan y desactivan r pidamente la secuencia objetivo de modo que se generan muchas colas segmentadas de 5 por secuencia objetivo Luego las estructuras ramificadas partidas se unen a un oligonucle tido de transferencia de energ a por resonancia de fluorescencia FRET universal en forma de horquilla y crean otra estructura invasiva que la enzima Cleavase reconoce como un sustrato La enzima parte los oligonucle tidos de la FRET entre el fluor foro y la mol cula extintora y produce una se al de fluorescencia a medida que las estructuras ramificadas segmentadas entran o salen del ciclo Para cada copia del objetivo las reacciones primaria y secundaria combinadas generan una multiplicaci n de la se al de 10 10 veces por hora Las secuencias de las colas y los oligonucle tidos de la FRET son universales ya que no son complementarios de la secuencia objetivo Los reactivos de esta prueba se proporcionan como tres mezclas de oligonucle tidos que detectan los 14 tipos de VPH agrupados seg n la relaci n filogen tica es decir los tipos de virus con secuencias de ADN similares grupos de VPH A5 AG6 A7 A9 Los oligon
50. muestra en particular a partir del an lisis de tres pocillos de reacci n independientes La relaci n entre los valores FOZ del VPH generada por las tres mezclas de reacci n determina si una muestra es positiva El ratio FOZ del VPH se calcula al dividir el valor FOZ del VPH m s alto de cualquiera de las tres mezclas de reacci n por el valor FOZ del VPH m s bajo de las tres Cuando cualquiera de los valores FOZ es menor que 1 se redondea a 1 para el c lculo del ratio Si el ratio FOZ del VPH es mayor o igual a 1 525 la muestra es VPH positiva Sin embargo en un subconjunto de infecciones mezcladas los tres pocillos de reacci n pueden generar una se al mucho m s alta que el fondo En algunos casos estas infecciones mezcladas pueden generar se ales positivas de intensidades similares en los tres pocillos de reacci n y por lo tanto un ratio FOZ del VPH menor a 1 525 Para evitar la posibilidad de un resultado negativo falso debido a la condici n positiva descrita arriba se aplica un segundo c lculo de la siguiente manera cuando el ratio FOZ es menor que 1 525 pero los tres valores FOZ individuales de la reacci n son mayores que un segundo valor de corte de 1 93 la muestra es VPH positiva Una llamada indeterminada se genera en tres condiciones diferentes 1 cuando el CV porcentual entre el valor FOZ del ADNg es 2 25 0 CV porcentual alto 2 cuando los tres valores FOZ del VPH son lt 0 7 FOZ del VPH bajo y 3 cuando un promedio
51. mujeres con citolog a de mayor gravedad que la de ASC US que incluye ASC H LSIL o superior deben realizarse una colposcopia independientemente de los resultados de la prueba de VPH Los ensayos cl nicos sobre la prueba de VPH de alto riesgo Cervista demostraron que el indice indeterminado fue de 0 54 intervalo de confianza del 95 0 32 0 86 en todas las muestras de las pacientes analizadas Indeterminado Estado desconocido del VPH de alto riesgo 14 CONTROL DE CALIDAD Control interno La prueba de VPH de alto riesgo Cervista incluye un control interno que determina la cantidad relativa de ADN de la muestra en cada reacci n El control interno el gen de la histona humana 2 se mide mediante una se al de color rojo fluorescente que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente en cada reacci n La medida de este objetivo funciona como mecanismo de control de calidad para confirmar que un resultado negativo no se debe a una muestra insuficiente El objetivo de control interno tambi n funciona como medida de procesamiento para garantizar que el procedimiento de la prueba se haya realizado correctamente Controles externos Control negativo El control negativo debe realizarse en cada placa de an lisis y los resultados deben cumplir los siguientes criterios para que las muestras de la placa sean v lidas Si no cumplen estos criterios las muestras y los controles de esa placa no ser n v lidos
52. nico de NILM 2 30 Aproximadamente 2 000 pacientes que cumpl an los requisitos y con resultados de citolog a cervicouterina normales NILM se han inscripto en 26 centros cl nicos activos en los Estados Unidos Se anticipa que no menos de 1 000 pacientes contar n con datos de seguimiento de 3 a os El ndice de retenci n de pacientes al final del primer a o de seguimiento fue de aproximadamente un 80 Durante 3 a os se realizar un seguimiento de las pacientes que deber n acudir a consultas anuales para la realizaci n de an lisis En cada consulta de seguimiento se realiza una prueba citol gica cervicouterina Se realizar una colposcopia a las mujeres que presentan resultados ASC US o citolog a de mayor grado y subsiguientemente una biopsia de ser necesario El an lisis de estos datos se centrar en el riesgo a los tres a os de manifestar una enfermedad cervicouterina asociada con las pacientes con diagn sticos positivos de NILM en la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en comparaci n con los diagn sticos negativos de la prueba en el momento de la inscripci n To Los resultados positivos y negativos de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en el To se comparar n con la presencia o la ausencia de a 2 CIN2 y b 2 CIN3 en todo el estudio La presencia de CIN2 CIN3 o c ncer cervicouterino se determinar mediante una histolog a central Los resultados negativos se definir n por la colposcopia a menos que los res
53. o y concentraci n de Ratio FOZ del VPH VPH positivo n Muestra la muestra g Desviaci n a SA c lulas ml Media est ndar Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3 1 neg 100 000 Jurkat 1 021 0 044 0 0 0 0 0 0 10 000 HeLa 2 Pos 90 000 Jurkat 6 369 1 522 100 5 100 5 100 5 5 000 HeLa 3 Pos 95 000 Jurkat 5 004 1 004 100 5 100 5 100 5 2 500 HeLa 4 Pos 97 500 Jurkat 15 3 337 0 886 100 5 100 5 100 5 15 20 000 SiHa 5 Pos 80 000 Jurkat 15 4 803 1 087 100 5 100 5 100 5 15 10 000 SiHa 6 Pos 90 000 Jurkat 15 3 194 0 780 100 5 100 5 100 5 15 5 000 SiHa 7 Pos 95 000 Jurkat 15 2 401 0 970 100 5 60 3 100 5 13 5 000 SiHa 8 Pos 2 500 HeLa 15 3 402 0 774 100 5 100 5 100 5 15 12 500 Jurkat Combinaci n de 9 Pos muestras cervicouterinas 15 5 930 2 212 100 5 100 5 100 5 15 A5 A6 Pos Combinaci n de 10 Pos muestras cervicouterinas 15 8 359 2 532 100 5 100 5 100 5 15 A5 A6 Pos Combinaci n 11 Pos cervicouterina A7 Pos 15 5 793 1 493 100 5 100 5 100 5 15 Combinaci n 12 Pos cervicouterina A7 Pos 15 7 127 1 762 100 5 100 5 100 5 15 Combinaci n cervicouterina A9 Pos Combinaci n 14 Pos cervicouterina A9 Pos 15 7 735 2 318 100 5 100 5 100 5 15 Combinaci n 13 Pos 15 8 008 2 313 100 5 100 5 100 5 15 15 Pos cervicouterina
54. os obtenidos del estudio cl nico de TWT son similares a los presentados en las condiciones de estudio controladas descritas en el Estudio de priorizaci n de ASC US LSIL ALTS 292 En la Tabla 14 se muestra una comparaci n del dise o del estudio la prevalencia de la enfermedad y las caracter sticas de rendimiento cl nico del estudio de TWT y ALTS La diferencia en los ndices de 2 CIN2 observados entre los dos estudios puede reflejar diferencias poblacionales como tambi n diferencias en la determinaci n de la enfermedad Tabla 14 Comparaci n del ensayo cl nico de TWT y el ALTS Criterio Cantidad de centros de inscripci n estados Edad media de las pacientes Pacientes a las que se realiz una colposcopia Pacientes sin lesiones no se realiz biopsia Pacientes sin lesiones patol gicas en la biopsia Pacientes con gt CIN1 Pacientes con gt CIN2 ndice de detecci n de gt CIN2 ndice de detecci n de gt CIN3 Valor predictivo negativo de gt CIN2 Valor predictivo negativo de gt CIN3 ndice de derivaci n a colposcopia Concordancia de PCR 3 Fase de colposcopia inmediata de ALTS P Cantidad de pacientes con estado de enfermedad conocido y resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista El ndice de derivaci n en mujeres a partir de los 30 a os de edad fue del 43 EN MUJERES A PARTIR DE LOS 30 A OS DE EDAD EL RENDIMIENTO DE LA PRUEBA
55. po brocha p ej brocha Rovers Cervex Wallach Papette o brocha esp tula para an lisis cervicouterino ADVERTENCIAS e La prueba de VPH de alto riesgo Cervista no est dise ada para su uso como un dispositivo de detecci n para mujeres menores de 30 a os con citolog a cervicouterina normal e La prueba de VPH de alto riesgo Cervista no est dise ada para sustituir el an lisis de detecci n citol gica cervicouterina frecuente e La detecci n del VPH mediante la prueba de VPH de alto riesgo Cervista no diferencia tipos de VPH y no puede evaluar la persistencia de ninguno de ellos El uso de esta prueba todav a no se ha evaluado para el tratamiento de mujeres con anomal as citol gicas o histol gicas previas histerectom as embarazo posmenopausia u otros factores de riesgo p ej VIH inmunodepresi n antecedentes de ITS La prueba de VPH de alto riesgo Cervista est dise ada para mejorar los m todos existentes para la detecci n de la enfermedad cervicouterina y debe usarse junto con la informaci n cl nica derivada de otras pruebas de diagn stico y detecci n exploraciones f sicas y antecedentes cl nicos completos seg n los procedimientos apropiados para el tratamiento de la paciente La prueba de VPH de alto riesgo Cervista no debe usarse como nico fundamento para la evaluaci n cl nica y el tratamiento de las pacientes ABREVIATURAS USADAS ADN ADNg ASC US CIN CLSI FAM
56. r the Management of Women with Abnormal Cervical Cancer Screening Tests Pautas consensuadas en 2006 para el tratamiento de mujeres con resultados an malos en las pruebas de detecci n de c ncer cervicouterino incluyen 1 el an lisis de detecci n de mujeres de 30 a os o m s junto con la citolog a u otros m todos de detecci n y 2 el tratamiento de mujeres a partir de los 21 a os de edad con ASC US En todos los casos las decisiones de tratamiento de las pacientes reflejan sus antecedentes citol gicos generales y otros factores de riesgo adem s de la presencia o ausencia de tipos de VPH de alto riesgo 8 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La prueba de VPH de alto riesgo Cervista es un m todo de diagn stico cualitativo in vitro para la detecci n de ADN de 14 tipos de VPH 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 La prueba de VPH de alto riesgo Cervista usa la qu mica de Invader como m todo de multiplicaci n de la se al para la detecci n de secuencias espec ficas de cidos nucleicos Este m todo usa dos tipos de reacciones isot rmicas una reacci n primaria que se produce en la secuencia del ADN objetivo y una reacci n secundaria que produce una se al fluorescente consulte la Figura 1 En la reacci n primaria dos tipos de oligonucle tidos espec ficos de la secuencia es decir un oligonucle tido de sonda y un oligonucle tido de Invader se unen a la secuencia del ADN objetivo Cuando los o
57. ra las c lulas SiHa y de 1 000 c lulas ml para las c lulas HeLa Valor de corte cl nico para la prueba de VPH de alto riesgo Cervista El valor de corte cl nico se evalu seg n el enfoque descrito en un documento de referencia sobre el c lculo de sensibilidad y especificidad sin sesgo En resumen los valores de corte se evaluaron seg n los objetivos de sensibilidad cl nica especificados previamente para la detecci n de histolog a gt CIN2 que estaban correspondientemente cerca de los valores de corte definidos previamente en los estudios anal ticos Seg n estos criterios se seleccion un valor de corte del ratio FOZ del VPH de gt 1 525 o un valor FOZ del VPH m nimo de gt 1 93 para las tres mezclas de reacci n como valores de corte para la prueba Precisi n La repetibilidad y la precisi n intralaboratorio de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista se demostraron en un estudio de 21 d as con tres operadores alternantes cada uno de los cuales realiz dos series por d a en conjuntos de equipos asignados individualmente Cada an lisis consisti en cuatro placas Se usaron dise os de placas diferentes para los an lisis en cada d a Las muestras analizadas dentro de cada serie 24 incluyeron muestras de ADN gen mico aisladas de dos l neas de c lulas VPH positivas SiHa tipo 16 y HeLa tipo 18 y una l nea de c lulas VPH negativo Jurkat y muestras artificiales que contienen ADN plasm dico de VPH16 VPH18
58. rajo de 2 ml de muestras cervicouterinas o c lulas de cultivo suspendidas en la soluci n PreservCyt El ADN se extrajo mediante el kit de extracci n de ADN Genfind Se extrajeron 16 muestras de ADN y se analizaron con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista en tres sitios durante cinco d as no consecutivos en un per odo de dos semanas Se usaron dos lotes de pruebas de VPH de alto riesgo Cervista y tres lotes de Kits de extracci n de ADN Genfind en los 3 sitios designados para el estudio La cantidad total de mediciones para cada muestra fue de 15 3 sitios x 5 d as x 1 an lisis por d a En la Tabla 20 se muestra un resumen de la coincidencia porcentual entre los resultados previstos y observados combinados para todos los sitios La Tabla 21 presenta los resultados individuales de las muestras de todos los sitios junto a la media acumulada y la desviaci n est ndar para el ratio FOZ del VPH Tabla 20 Resumen de datos del estudio multic ntrico de reproducibilidad de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista L mite inferior del Resultado previsto Cantidad de resultados Resultados coincidentes Coincidencia porcentual intervalo de confianza del 95 Positivo Negativo 210 30 208 30 99 0 100 0 96 6 88 7 Tabla 21 Resumen de los resultados de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista para cada muestra de un estudio multic ntrico de reproducibilidad Tip
59. s de reacci n Sospecha de error durante la extracci n de ADN Sospecha de contaminaci n del reactivo de extracci n de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se haya seguido el procedimiento correcto de extracci n de ADN 37 INFORMACI N DE CONTACTO Fabricante Third Wave Technologies Inc 502 S Rosa Road Madison WI 53719 EE UU Tel fono 608 273 8933 Sitio Web www twt com Soporte t cnico Third Wave Technologies Inc Tel fono 888 898 2357 opci n 3 AVISO PARA EL DESTINATARIO ACERCA DE LA LICENCIA LIMITADA La recepci n de este producto de Third Wave Technologies Inc o su distribuidor autorizado incluye una licencia limitada no exclusiva conforme a los derechos de patente de Third Wave Technologies Inc La adquisici n de este producto constituye la aceptaci n de la licencia limitada por parte del destinatario Los destinatarios que no deseen aceptar la licencia limitada deber n devolver el producto para obtener un reembolso completo Dicha licencia tiene el nico prop sito de usar este producto para detectar un analito espec fico Para evitar dudas la licencia anterior no incluye derechos de uso de este producto para aplicaciones agr colas o veterinarias La anterior licencia no incluye una licencia de uso del producto para nuevas investigaciones o desarrollos fabricaci n del producto ni objetivo alguno de ingenier a inversa El comprador de este pro
60. sgo Cervista Negativo Positivo Total Positivo 157 10 167 Negativo 126 3 129 Total 283 13 296 Prevalencia de la enfermedad 4 4 13 296 Intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad PPV NPV Edad a partir de los 39 anos Prueba de VPH de alto riesgo Cervista 76 9 10 13 44 5 126 283 6 0 10 167 97 7 126 129 Histolog a central gt CIN2 Negativo 49 7 91 8 38 8 50 3 2 9 10 74 93 4 99 5 Positivo Total Positivo 131 14 145 Negativo 268 2 270 Total 399 16 415 Prevalencia de la enfermedad 3 9 16 415 Intervalo de confianza del 95 Sensibilidad Especificidad PPV NPV 87 5 14 16 67 2 268 399 9 7 14 145 99 3 268 270 64 0 96 5 62 4 71 6 5 4 15 67 97 3 99 9 20 Existe una cantidad de variables clave que se sabe influyen en las caracter sticas de rendimiento de cualquier prueba de VPH en un estudio cl nico stas incluyen entre otras las t cnicas de muestreo cervicouterino la calidad de los resultados citol gicos la edad de la poblaci n analizada la prevalencia de la enfermedad los m todos de determinaci n de la enfermedad y los m todos de interpretaci n histol gica Dada la cantidad de variables presentes durante la prueba de VPH de rutina en centros cl nicos m ltiples vale la pena aclarar que muchos de los resultad
61. sis citol gicos y de detecci n del VPH para facilitar la detecci n y el tratamiento de lesiones precancerosas De los tipos de VPH de transmisi n sexual 14 genotipos oncog nicos VPH16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 se consideran de alto riesgo debido a su ntima asociaci n con tipos de c ncer cervicouterino en comparaci n con los tipos de VPH de bajo riesgo que pr cticamente no se asocian con el c ncer cervicouterino Aun as la gran mayor a de las infecciones por VPH de alto riesgo son erradicadas Muy pocas mujeres con diagn sticos positivos de ADN de VPH de alto riesgo manifiestan una lesi n intraepitelial escamosa de alto grado HSIL que indique una CIN2 3 subyacente o c ncer El riesgo absoluto de presentar una anomal a citol gica incidental debido a una infecci n por VPH de alto riesgo var a en las distintas poblaciones La presencia de ADN de VPH de alto riesgo en forma concomitante con un resultado de citolog a equ voca 0 ambigua ASC US coloca a la mujer en una posici n de mayor jengo de presentar una neoplasia intraepitelial cervicouterina subyacente 2 3 CIN2 o CIN3 La CIN3 a pesar de que se produce s lo en aproximadamente un 5 de los casos de ASC US es un precursor inmediato del c ncer cervicouterino y por consiguiente su detecci n es muy importante para el tratamiento de la paciente Por lo tanto la identificaci n de las mujeres con citolog a ASC US junto con una
62. stra de l nea de c lulas almacenada en la soluci n PreservCyt con 100 000 c lulas ml Jurkat VPH negativo Jurkat Muestra de linea de c lulas almacenada en soluci n de PreservCyt con Siberia 10 000 c lulas ml SiHa VPH positivo y 90 000 c lulas ml Jurkat Muestra de l nea de c lulas almacenada en soluci n de PreservCyt con Meta 5 000 c lulas ml HeLa VPH positivo y 95 000 c lulas ml Jurkat 28 Tabla 23 Resultados de las sustancias interferentes Sustancias interferentes Concentraciones Se observa Fuente Tipo analizadas interferencia Sangre Detectable visualmente No Mucosa Detectable visualmente No Sangre mucosa Detectable visualmente Muestra de c lulas Irrigaci n vaginal 0 5 2 cervicouterinas Jalea anticonceptiva 0 5 2 Crema antimic tica 6 con 2 de clotrimazol 0 5 2 Crema antimic tica 7 con 4 de miconazol 0 5 2 Soluci n PreservCyt 0 5 2 Kit de extracci n de ADN Genfind 70 de etanol 5 10 Procesamiento de la muestra Microesferas magn ticas 5 10 Los niveles de sustancias interferentes requeridos para producir fallas en las pruebas 2 son inusualmente elevados y no deben encontrarse en las muestras cl nicas reales PLos niveles de sustancias interferentes que pueden producir fallas en las pruebas son inusualmente elevados y no deben encontrarse en las muestras de ADN purificadas Durante l
63. u totalidad o en parte tenga derecho al beneficio de las fechas de solicitud de cualquiera de las patentes o solicitudes de patentes antes enumeradas en este prospecto del producto 38 GARANT A LIMITADA DEL PRODUCTO Third Wave Technologies Inc garantiza que este producto cumplir las especificaciones establecidas en la hoja de informaci n del producto Si alguno de los componentes de este producto no cumple estas especificaciones Third Wave Technologies Inc a discreci n propia con responsabilidad nica y exclusiva y como recurso nico y exclusivo de los usuarios reemplazar el producto sin cargo o reembolsar el costo del mismo siempre que se notifique del incumplimiento a Third Wave Technologies Inc dentro de los sesenta 60 d as de la recepci n del producto Esta garant a limita la responsabilidad de Third Wave Technologies Inc al reemplazo o el reembolso del costo de este producto THIRD WAVE TECHNOLOGIES INC NO PROPORCIONA NINGUNA OTRA GARANT A EXPRESA O IMPL CITA INCLUIDAS ENTRE OTRAS LA GARANT A IMPL CITA DE COMERCIALIZACI N O ADECUACI N PARA UN FIN PARTICULAR O NO INCUMPLIMIENTO Third Wave Technologies Inc no tendr responsabilidad alguna por da os directos indirectos consecuentes o incidentales que surjan del uso de los resultados del uso o de la incapacidad de uso de este producto y sus componentes Third Wave Cleavase e Invader son marcas comerciales registradas de Third Wave Technolo
64. ucle tidos que se unen con el gen de la histona humana 2 H2be HIST2H2BE tambi n est n presentes en estas tres mezclas de oligonucle tidos El HIST2H2BE funciona como un control interno que produce una se al desde el ADN gen mico presente en la muestra El formato de la prueba de VPH de alto riesgo Cervista permite la detecci n simult nea de secuencias de ADN de VPH y del HIST2H2BE en un mismo pocillo al utilizar dos secuencias de estructuras ramificadas de 5 diferentes en las sondas como tambi n dos oligonucle tidos de la FRET diferentes cada uno con un fluor foro de distinto espectro FAM y Red Por su dise o las colas de liberadas se unen s lo con sus respectivos oligonucle tidos de FRET para generar una se al objetivo espec fica consulte la Figura 1 Un resultado positivo indica que al menos uno de los 14 tipos de alto riesgo est presente en la muestra de ADN Este resultado est representado por una se al fluorescente del FAM que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente Para cada reacci n un resultado negativo est representado por una se al fluorescente del FAM que se encuentra por debajo de un valor de corte derivado emp ricamente Como medio de determinaci n de la cantidad relativa de ADN de la muestra en cada reacci n el gen de la histona humana 2 se mide mediante una se al de color rojo fluorescente que se encuentra sobre un valor de corte derivado emp ricamente en cada reacci n
65. ultados histol gicos centrales est n disponibles para dejar sin efecto una indicaci n colposc pica inicial positiva Toda interpretaci n citol gica ser realizada por un panel de revisi n de pat logos central Coincidencia con un comparador compuesto entre las poblaciones de 2 30 con ASC US y NILM El rendimiento anal tico de la prueba se midi en relaci n con un comparador compuesto de un an lisis de VPH y la PCR Secuenciaci n aprobados por la FDA El comparador compuesto se defini como positivo si los resultados del an lisis de VPH y la PCR Secuenciaci n aprobados por la FDA fueron positivos negativo si los resultados fueron negativos e indeterminado si los resultados fueron discordantes Para este estudio anal tico se utiliz un subconjunto aleatorio de las mismas muestras obtenidas durante el estudio cl nico para las poblaciones con ASC US durante un per odo de inscripci n de 17 meses y las evaluaciones longitudinales posteriores a la aprobaci n al inicio del estudio para poblaciones 2 30 con NILM recolectadas durante un per odo de inscripci n de 15 meses respectivamente Para la PCR Secuenciaci n las muestras de ADN se multiplicaron mediante cebadores consensuados para el gen L1 del VPH Tambi n se multiplic una porci n del gen de la beta globina humana como control interno Se usaron amplicones purificados como plantillas en las reacciones de secuenciaci n m ltiple para 14 tipos de VPH de alto riesgo 16
66. vista no puede determinar el tipo espec fico de VPH presente La prueba de VPH de alto riesgo Cervista usa la qu mica de Invader como m todo de multiplicaci n de la se al para la detecci n de secuencias espec ficas de cidos nucleicos Este m todo usa dos tipos de reacciones isot rmicas una reacci n primaria que se produce en la secuencia del ADN objetivo y una reacci n secundaria que produce una se al fluorescente consulte la Figura 1 La prueba de VPH de alto riesgo Cervista se indica 1 Para analizar pacientes con resultados de citolog a cervicouterina de c lulas escamosas at picas de significado indeterminado ASC US y determinar la necesidad de derivaci n para la realizaci n de una colposcopia 2 En mujeres de 30 a os o m s la prueba de VPH de alto riesgo Cervista puede usarse con citolog a cervicouterina para analizar y evaluar en forma conjunta la presencia o ausencia de tipos de VPH de alto riesgo Esta informaci n junto con la evaluaci n m dica de los antecedentes citol gicos otros factores de riesgo y las normas profesionales puede usarse para guiar el tratamiento de las pacientes Las muestras cervicouterinas que pueden analizarse con la prueba de VPH de alto riesgo Cervista incluyen el siguiente medio de obtenci n y dispositivo de obtenci n del sistema de conservaci n e Soluci n PreservCyt con sistema de conservaci n ThinPrep para pruebas de Papanicolaou e Dispositivo ti
67. y deber n repetirse consulte el resumen de la Tabla 5 1 La se al m nima para cada una de las tres mezclas debe ser superior o igual a 600 RFU 600 2 El CV porcentual de la se al de VPH promedio de las tres mezclas debe ser menor que 25 0 lt 25 0 3 El CV porcentual de la se al de ADNg promedio de las tres mezclas debe ser menor que 25 0 lt 25 0 Tabla 5 Criterios de control negativo Resultado Se al m n de Se al m n de CV porcentual m nima VPH ADNg VPH y ADNg varo oo 00 a Controles positivos Los controles de VPH Controles 1 a 3 de VPH deben realizarse en cada placa de an lisis y los resultados deben cumplir los siguientes criterios para que la prueba sea v lida Si los controles no cumplen estos criterios las muestras de esa placa tampoco ser n v lidas y deber n repetirse las pruebas consulte el resumen de la Tabla 6 1 Un ratio FOZ del VPH se determina dividiendo el valor FOZ de VPH m s alto de las tres mezclas de reacci n por el m s bajo normalizado a 1 0 si es menor El control 1 de VPH debe presentar un valor positivo de FOZ del VPH 2 1 525 s lo para la mezcla 1 de oligonucle tidos del VPH el control 2 del VPH debe mostrar un valor positivo de FOZ del VPH 2 1 525 s lo para la mezcla 2 de oligonucle tidos del VPH y el control 3 del VPH debe generar un valor positivo de FOZ del VPH 2 1 525 s lo para la mezcla 3 de oligonucle tidos del VPH 2 La media de FO

Prueba de VPH de alto riesgo Cervista

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