WARNER INSTRUMENTS/ HARVARD APPARATUS
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1. WARNER INSTRUMENTS HARVARD APPARATUS INDICE 1 Materiales 1 1 Componentes 1 2 Bomba peristaltica de succi n del medio Minipuls Evolution GILBSON 2 Metodologia 2 1 Montaje del sistema de perfusi n jeringuillas y tubos 2 2 Sistema controlador del flujo y su drenaje 2 3 Montaje de la bomba perist ltica de succi n del medio Minipulps Evolution GILBSON 2 4 Montaje del dispositivo de sujeci n de la muestra 2 5 Experimento 1 MATERIALES 1 1 COMPONENTES Lo que necesitamos para montar el sistema de perfusi n abierto es ARA Brazo sujeta jeringuillas con 8 adaptadores para sendas jeringuillas Jeringuillas de 50 ml de volumen Sistema controlador termostatizado de los medios Sistema controlador del flujo de los medios Bomba de succi n del medio Minipuls Evolution Gilbson Vaso de precipitados o recipiente para recoger los medios celulares 1 Tubo de pl stico sin adaptadores para la salida de los medios Dispositivo de montaje de la muestra que se compone de varios elementos 8 1 Base circular met lica negra 8 2 Base met lica negra 8 3 Base de pl stico blanco 8 4 Mecanismo de succi n del medio del dispositivo de montaje 8 5 Cubreobjetos de 15 mm de di metro 8 6 Destornillador Pinzas de punta fina 1 2 BOMBA PERISTALTICA MINIPULS EVOLUTION GILBSON activa desactiva el motor que permite la succi n del medio decrece aumenta la velocid2. la hendidura circular que hay en la base de pl stico blanco de tal forma que la capa de c lulas quede en contacto con la base de pl stico Hacemos un poco de presi n con las pinzas sobre el borde del cubre para asegurarnos de que se quede bien pegado al soporte de pl stico 5 Volteamos de nuevo el soporte de pl stico blanco que ya tiene el cubre pegado en su parte inferior 6 Apoyamos el extremo del soporte de pl stico blanco sobre uno de los extremos de la base met lica negra hay que tener cuidado de la posici n en la que ponemos el soporte de pl stico ya que nos tienen que coincidir la circunferencia de este soporte con la de la base met lica negra y despu s apoyamos el extremo contrario intentando que sea un movimiento lo m s seco posible pero no brusco para evitar deslizamientos del cubre Con el dedo apoyado en uno de los extremos de la base de pl stico seguimos haciendo presi n y con los dedos de la otra mano acercamos hac a la base de pl stico las barras met licas hasta que quede el soporte bien encajado entre las barras S Atornillamos los tornillos manteniendo las barras met licas presionadas hac a el soporte met lico 9 Pasamos un cl nex por debajo del cubre para limpiar el exceso de medio 10 A adimos medio de cultivo para mantener vivas a las c lulas y volvemos a pasar el cl nex para asegurarnos de que no hay escapes de medio y el sistema est bien montado 11 Colocamos todo el dispo
3. ad de succ n de la bomba 3 FIN selecciona el sentido del flujo de succi n 4 PRIME aumenta la velocidad de succi n al m ximo 60 rpm 2 METODOLOGIA A continuaci n vamos a explicar el mecanismo de montaje de este sistema de perfusion abierto con varios medios de cultivos 2 1 MONTAJE DEL SISTEMA DE PERFUSION JERINGUILLAS Y TUBOS En un vaso de precipitados afiadimos el medio con el que queremos rellenar la jeringuilla en nuestro caso podemos tener hasta un total de 8 medios distintos ya que el brazo posee capacidad para 8 jeringuillas 2 Echamos un poco hacia atr s el mbolo de la jeringuilla y metemos la punta en el vaso de precipitados Sin sacar la punta de la jeringuilla del liquido para evitar lo maximo posible que se nos formen burbujas vamos absorbiendo despacito el medio y rellenando la jeringuilla Comprobamos que no haya ninguna burbuja en la jeringuilla porque nos puede dar problemas a la hora de hacer el experimento para quitar las burbujillas que siempre suelen aparecer podemos orientar la jeringuilla hacia arriba y dar golpecitos al cuerpo de sta hasta que las burbujas se queden en la punta y expulsar un poco de medio con la esperanza de que se lleve las burbujas tambi n gt Colocamos la jeringuilla en uno de los adaptadores que tiene el soporte del pie de jeringuillas La velocidad del flujo del medio depender de la altura a la que situemos el soporte en el que va sujeta la
4. io y subir la de la jeringuilla del nuevo medio que se desea inyectar Repetiremos esta operaci n tantas veces como queramos cambiar de medio de cultivo 14 Una vez que hemos acabado el in vivo recogemos todo el material y lo lavamos con agua MQ 15 Limpiamos de nuevo el sistema de flujo dren ndolo con agua MQ
5. jeringuilla siendo mayor cuanto m s alto lo coloquemos 4 Repetimos los pasos del 1 al 3 tantas veces como medios tengamos f Altura gt 1 velocidad flujo J Altura gt I velocidad flujo 2 2 SISTEMA CONTROLADOR DEL FLUJO Y SU DRENAJE 1 Colocamos un vaso de precipitados al final del tubo donde se unifican los tubos que parten de las 8 jeringuillas para recoger el medio que salga por l 2 Encendemos el controlador termostatizado de flujo de los medios y el controlador del paso de stos presionando sobre los interruptores que se encuentran en la parte delantera 3 Para empezar con el rellenado de los tubos que salen de cada una de las jeringuillas que vamos a utilizar subimos de forma consecutiva la palanca que posee cada uno de los ocho adaptadores de jeringuillas en el sistema controlador del flujo de los medios de tal forma que al subir la palanca hasta la posici n ON del controlador de la jeringuilla n mero 1 lo que estamos haciendo es permitir el paso del medio de cultivo desde la jeringuillal hacia las c lulas Una vez que hemos comprobado que el medio de la jeringuilla 1 fluye correctamente por el sistema bajamos su palanca a la posici n OFF para cortar el flujo y subimos la de la jeringuilla n mero 2 para conseguir lo mismo que anteriormente Realizamos sucesivamente esta operaci n hasta verificar el correcto flujo de todas las jeringuillas que hayamos colocado en el brazo En ocasiones hay que hacer un poc
6. o de presi n con el mbolo de la jeringuilla para que el medio empiece a fluir Jeringuilla 1 SEE Valves well not Bloquea paso medio 2 3 MONTAJE DE LA BOMBA PERISTALTICA DE SUCCION DEL MEDIO Minipuls Evolution Enchufar el cable gris a la red el ctrica 2 Encender la bomba pulsando el interruptor de la parte trasera 3 A continuaci n seleccionar con las flechas PITA la direcci n de succi n del medio P1 el medio que se va a eliminar entra por la izquierda y sale por la derecha a el medio que se va a eliminar entra por la derecha y sale por la izquierda 4 Ajustamos la velocidad de absorci n del medio pulsando en los botones Generalmente se suele utilizar velocidad de 1 00 Entrada del medio 2 4 MONTAJE DEL DISPOSITIVO DE SUJECION DE LA MUESTRA Cuando hayamos drenado el circuito montado la bomba de succi n y comprobado que todo funciona perfectamente podemos montar el sistema donde vamos a mantener a nuestras c lulas las cuales han sido previamente crecidas en cubres de cristal de 15mm de diametro Para ello 1 Colocamos sobre la mesa la base met lica negra que ya la tenemos encajada en la base circular met lica negra 2 Desatornillamos los cuatro tornillos de la base y echamos hacia atr s las barras met licas W 4 Ponemos el cubre con las c lulas ligeramente humedecido con el medio sobre
7. sitivo en el microscopio 2 5 EXPERIMENTO 1 Encendemos el equipo ver manual del usuario ubicado http bacterio cbm uam es confocal Manuales Uso 20IN 20VIVO_LEICA pdf 2 Encendemos el controlador del sistema de jeringuillas ver punto 2 del apartado 2 2 Encendemos la bomba perist ltica y la ajustamos ver apartado 2 3 Rellenar las jeringuillas con los medios correspondientes ver apartado 2 1 Comenzamos con el drenaje del sistema ver punto 1 y 3 del apartado 2 2 Montamos el dispositivo de sujeci n de la muestra ver apartado 2 4 SA BR Go Metemos el extremo libre del tubo recolector de los tubos de las jeringuillas en el orificio que hay en el soporte de silicona blanco 8 Introducimos el extremo del tubo del soporte de silicona blanco en el tubo de entrada del medio de la bomba peristaltica 9 El extremo del tubo de salida del medio de la bomba perist ltica lo colocamos en un vaso de precipitados para recoger el medio que se desecha 10 Subimos la palanca a la posici n ON del controlador de la jeringuilla en la que tenemos el medio con el cual queremos empezar a realizar el experimento 11 Apretamos el bot n de RUN de la bomba perist ltica para que empiece a succionar el medio 12 Enfocamos la preparaci n y ajustamos las condiciones para el in vivo 13 Cuando queramos cambiar de medio lo que tenemos que hacer ser bajar la palanca del controlador de la jeringuilla con la que se est inyectando med
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