Anti-HCMV rec. IgG ELISA
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1. 1 Early serodiagnosis of acute human cytomegalovirus infection by enzyme linked immunosorbent assay using recombinant antigens Vornhagen R et coll J Clinical Microbiology 32 981 986 1994 2 Construction of recombinant autologous fusion proteins which enables 1gG specific serodiagnosis of past HCMV infection Vornhagen R et coll Biotest Bull 5 221 227 1995 3 Screening of blood donors for human cytomegalovirus HCMV IgG antibody with an enzyme immunoassay using recombinant antigens Weber B et coll Journal of Clinical Virology 14 173 181 1999 4 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO Z 0 100 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 3 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a contamin pr parer un nouveau tampon de lavage2. partir de A3 200 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Processeur 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 WB 550 550 550 550 tape 2 Puits ul CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Processeur 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 WB 550 550 550 550 tape 3 Puits ul SUB 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp Processeur 15 1 mn rature ambiante dans l obscurit la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690nm Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450nm en voir le sch ma de pipetage pour la d tection qualitative d IgG Mi Bio Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsupport bmd bio rad com Calcul de la d termination quantitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm on retranche la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les de et des chantillons L extinction moyenne des
3. 2010 Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de Nc lt 0 300 DO moyenne de PC 20 600 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NC X laquelle on ajoute 0 300 Valeur seuil NC X 0 300 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 10 Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgG sp cifiques de HCMV Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement D termination quantitative des chantillons HCMV IgG positifs On peut r aliser un dosage quantitatif des anticorps IgG sp cifiques d HCMV en utilisant une des m thodes d incubation suivantes Proc dure de pipetage pour la d termination quantitative d IgG Lais
4. ELISA pour la r alisation des tests Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les Pc et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 pl de Bien m langer Dilution des chantillons au 1 21 avec dilution directement dans la plaque Pipeter 200 ul de dans chaque puits Cette dilution directement dans la microplaque convient tout particuli rement bien en cas d utilisation de dispositifs de pipetage automatiques Si la dilution est effectu e directement dans la plaque manuellement il est important d viter la fixation non sp cifique de prot ines en observant les tapes suivantes Pipeter premi rement 200 ul de dans le puits puis ajouter 10 pl d chantillon ou de moins M langer de 5 7 fois quand on ajoute les 10 pl d chantillon ou de t moins Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 lil de tampon de lavage volume total 550 ul R p ter cette proc dure de lavage 5 fois Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Proc dure de pipetage pour la d termination qualitative d IgG dilution en
5. blancs DO ne doit pas d passer 0 100 La valeur moyenne de DO de doit tre lt 0 300 et celle de doit tre Z 0 600 On calcule les valeurs moyennes des DO des standards dilu s et on trace la courbe donnant ces valeurs en fonction des concentrations d igG correspondantes en unit s ml sur un papier semi logarithmique en reliant les points entre eux Les concentrations d IgG dans les chantillons peuvent tre d termin es par lecture des valeurs sur la courbe d talonnage On peut aussi d terminer la courbe d talonnage et les concentrations des chantillons en utilisant un logiciel de lecteur de microplaques moderne par exemple Anthos HTII L op rateur doit valider le lecteur sous sa propre responsabilit Les valeurs inf rieures la courbe d talonnage sont d finies par U ml lt 1 25 Anthos HTII or U mi lt 1 88 BEP IIl Les chantillons donnant des valeurs sup rieures la courbe d talonnage doivent tre dilu s et mesur s nouveau Pour que la quantification soit correcte il faut que les valeurs de DO soient dans l intervalle de la courbe d talonnage Limitations de la m thode La d tection d anticorps est une m thode indirecte de d tection d un organisme pathog ne Les r sultats n gatifs obtenus avec le test Anti HCMV IgG ELISA n excluent pas une implication du HCMV dans la maladie Par ailleurs un r sultat positif n est pas suffisant pour d finir la maladie La connaissance pr cise des au
6. tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi STD 0 75 ml Etalon HCMV pr t l emploi humain La quantit d unit s sp cifique du lot est imprim e sur l tiquette 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de chloramph nicol 15ml Conjugu d anti lgG humain pr t l emploi Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate de streptomycine 0 2 de Proclin 300 6 ml Tampon de lavage concentr 500 x conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol Solution de substrat pr te l emploi Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 Voir avertissement et pr cautions g O z C SUB 13 ml Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 C1 D1 Et F1 G1 Blanc 200 double test 200 double test 200 Echantillon 1 21 _ 200 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 1 mn 37 1 C processeur 60 1 mn 37 1 C C Conservateurs concentration totale lt 0 11 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm
7. Anti HCMV rec IgG ELISA ELISA pour la d tection d anticorps IgG Anti cytom galo virus dans du s rum et du plasma humain Conditionnement 807 031 Usage pr vu Les infections par le cytom galovirus humain HCMV virus de la famille des R herpes sont r pandues dans le monde entier taux de pr valence 40 100 Alors qu une infection par le HCMV est asymptomatique chez la majorit des personnes immunocomp tentes elle peut conduire de graves complications chez les personnes dont le syst me immunitaire est affaibli ou ne s est pas encore totalement d velopp h patite r tinite pneumonie etc HCMV est l organisme pathog ne le plus fr quent des infections cong nitales Approximativement 10 des enfants infect s cong nitalement par HCMV pr sentent des sympt mes la naissance ict re h patospl nom galie h morragies p t chiales et chorior tinite Les receveurs de greffes d organes et de moelle osseuse et les patients atteints du SIDA constituent d autres groupes de patients pour lesquels une infection aigu par HCMV est tr s grave Gr ce des tests s rologiques il est possible de diff rencier une infection par le CMV d une infection par l EBV ou par un toxoplasme 96 tests coffret de tests complets Principe de la m thode ELISA classique Le test Anti HCMV recombinant rec IgG ELISA de Bio Rad est un titrage immuno enzymatique indirect avec antig ne adsorb ELISA pour le diagnostic in
8. b ou contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de inf rieure lt 0 600 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de sup rieure Z 0 300 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du C 0197 187558 07 06 2010
9. es inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e par exemple diluer 2 ml 1 litre Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou contamination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage L analyse qualitative des anticorps IgG peut tre r alis e en utilisant au choix une m thode manuelle ou une m thode automatique processeur
10. longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de microplaques incubateur pour les ELISA En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Avertissement et pr cautions Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement toutes les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiquement contr l es Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquet
11. ser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi La r activit de l talon de HCMV a t d termin e comparativement l talon du Paul Ehrlich Institut PEI et pr sente une l g re variabilit en fonction du lot Selon la plage de mesure du photom tre spectral il faut pr diluer l talon de HCMV dans comme suit a plage de mesure de DO 0 3 0 par exemple lecteur Anthos Il pr parer des pr dilutions contenant 20 10 5 2 5 et 1 25 U ml b plage de mesure de DO 0 4 0 par exemple processeur ELISA III de Behring pr parer des pr dilutions contenant 30 15 7 5 3 75 et 1 88U ml Les talons pr dilu s et tous les chantillons sont dilu s au 1 168 1 21 1 8 en utilisant le diluant de l chantillon Bien m langer Pipeter 200 ul de dilutions des talons et d chantillons ainsi dilu s ainsi que des contr les positifs et n gatifs dilu s au 1 21 selon le sch ma suivant tape 1 Puits ul A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 Blanc 200 NC double test 1 21 200 PC double test 1 21 200 e 20 U ml a ou 30 U ml b A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 10 U ml a ou 15 U ml b STD dilution 1 1688 T 2 T 1 T STD dilution 1 168 200 5 5 U ml a ou 7 5 U ml b STD dilution 1 168 200 2 5 U ml a ou 3 75 U ml b STD dilution 1 168 200 1 25 U ml a ou 1 88 U ml b Echantillons quantifier
12. te individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium STOP 15 ml Solution d arr t pr te l emploi Laver 5x voir W1 Acide sulfurique lt 1 N H SO 550 550 550 550 sB 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les barrettes de microplaques inutilis es tape 2 Puits ul FOL 1 Feuilles transparentes auto adh sives Feuilles transparentes CONJ 100 100 100 100 auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur CL 1 Notice du corifet ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 processeur 30 1 mn 37 1 C 550 550 550 550 step 3 well ul SUB 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp processeur 15 1 mn la temp rature rature ambiante dans l obscurit ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15mn suivant l arr t 450nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit C 0197 187558 07 06
13. tres informations cliniques et des ant c dents du patient est indispensable pour une interpr tation correcte Les m thodes directes suivantes compl tent le diagnostic s rologique d HCMV dosage de l antig n mie PCR et culture du virus Performance Trois cent deux chantillons de donneurs de sang sains ont t test s comparativement un test ELISA de r f rence bas sur des antig nes d riv s de culture cellulaire Le test IgG ELISA a pr sent une sensibilit de 100 et une sp cificit de 99 03 Cinquante cinq chantillons de s rum plasma avec EDTA plasma avec citrate ont t test s dans chaque cas partir du m me donneur Les r sultats obtenus taient en accord pour tous les chantillons La variabilit intra s rie du test Anti HCMV recombinant IgG ELISA a t tudi e en pipetant un chantillon tr s r actif et un chantillon peu r actif dans 45 puits d une plaque Par cette proc dure on a obtenu le coefficient de variation CV suivant chantillon tr s r actif 7 2 chantillon peu r actif 13 4 La variabilit inter s ries a t valu e en testant un chantillon dans sept s ries successives sur plusieurs jours Un CV de 9 2 a t obtenu Le test Anti HCMV recombinant IgG ELISA a t valu sur 55 chantillons risquant de donner lieu une r action crois e EBV 35 VZV 9 HSV 2 ANA 4 RF 5 Aucun de ces chantillons n a donn de r sultat positif Litt rature
14. vitro qui utilise deux prot ines de fusion autologues tr s purifi es CG1 et CG2 pour d tecter des anticorps IgG sp cifiques 2 Si l chantillon test contient des anticorps sp cifiques ils se lieront l antig ne recombinant dans les puits de la microplaque Les anticorps non sp cifiques sont limin s par une tape de lavage Le complexe anticorps antig ne form est d tect en utilisant un anticorps monoclonal sp cifique dirig contre l IgG humaine marqu par une enzyme La pr sence d anticorps li s est mise en vidence l aide d une r action enzymatique donnant un produit color en utilisant la TMB 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme substrat La r action enzymatique est arr t e avec de l acide sulfurique Mesurer la densit optique 450 nm l aide d un spectrophotom tre longueur d onde de r f rence 615 690 nm La trousse contient MTP 1 Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par les antig nes recombinants CG1 CG2 concentration gt 0 5 ug ml NC 1 2ml Contr le CMV IgG n gatif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V PC 1 2ml Contr le CMV IgG positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V A HE avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrett
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