ImmuBlot™ Anti-P0 Antibody Western Blot
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1. les doucement sur le papier absorbant Manipulez les bandes seulement aux extr mit s et laissez les s cher 15 20 minutes Contr le de qualit Bien que les cartes de commande soient d tail de sort des commandes n gatives et posi tives doivent tre incluses dans chaque essai cm MW marker pour assurer l ex cution appropri e de l analyse R action de contr le positive La bande posi tive montrera une bande bleu violette dense 30kD Ceci peut tre un doublet e sch ma 1 m9 30 kD anti PO R action de contr le n gative Typiquement la contr le n gative ne montrera aucune bande r actions sur la bande mais pas 30kD Les s rums peuvent donner des Le sch ma 1 Diagramme de la r action positive de PO MW Marker Marqueur de Poids Mol culaire INTERPR TATION DES R SULTATS 1 Tenez la bande d essai entre les r actions de contr les positives et n gatives sur la carte de contr le fourni et et alignez la bande d essai en utilisant le marqueur d alignement comme point de r f rence Comparez la r action de la bande d essai ceux des commandes de chaque c t L utilisation d une loupe peut faciliter l alignement appropri des bandes d essai le long du marqueur de poids mol culaire et aider l observation des r actions faibles V rifiez une bande croquante sur la bande d essai qui aligne avec la bande posi tive de contr le Une telle r action devrait tre consid r e positi2. The Hague The Netherlands Tel 31 345 8570 Fax 31 346 7299 REV NOV2004 www emergogroup com Document No PI4192 CE EF 12
3. The Immublot anti PO 30kD antibody Western Blot assay should be used as an aid to the diagnosis of autoimmune hearing loss Positive results may be found in other autoimmune conditions such as in peripheral neuropathy Hence results should be evaluated and inter preted by a medical authority in light of the patient s clinical history and other laboratory findings Some sera may react to antigens of other molecular sizes These are not of any clinical relevance TROUBLESHOOTING GUIDE Strong band at 30kD on Negative Control strip Likely cause contaminated Nega tive Control vial or cross contamination from well containing a positive serum Positive Control appears like Negative Control strip Likely cause Negative Control vial was confused as Positive Control vial Strips are completely blank Likely cause addition of Conjugate or Substrate was omitted High background and poor contrast between bands and background Likely cause wash step s may have been omitted or incorrectly performed or incubations were overextended REFERENCES 10 McCabe BF Autoimmune sensorinerual hearing loss Ann Otol 1979 88 5852 589 Arnold W Pfaltz R Alternalt HJ Evidence of serum antibodies against inner ear tissues in the blood of patients with certain sensorineural hearing disorders Acta Otolaryngol Stockh 1985 99 437 444 Harris JP Sharp PA Inner ear autoantibodies in patients with rapidly progressive sensorinerual hearing los
4. This Western Blot immunoassay uses purified PO antigen from the bovine or primate tissue To perform the test PVDFstrips are incubated with diluted patient serum Antibodies specifi cally bind to the PO protein on the strip After proper washing and incubation steps with the Conjugate strips are washed and incubated with a precipitable substrate Anti PO antibody positive reactions appear as a blue violet band at 30kD sometime this reaction is seen as a doublet REAGENTS Storage and Preparation Store all reagents at 2 8 C Do not freeze Do not use if liquid reagents are turbid or a precipitate is present Prior to starting the assay reagents must be equilibrated to room temperature 722 Antigen strips can only be used once Do not interchange components of different lots Do not use reagents beyond expiration date indicated on labels Precautions All human derived components used have been tested for HBsAg HCV HIV 1 and 2 and HTLV I and found negative by US FDA required tests However all human blood derivatives and patient specimens should be considered potentially infectious and good laboratory practices in storing dispensing and disposing of these materials must be followed 0 WARNING Sodium azide NaN_ may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides Upon disposal of liquids flush with large volumes of water to prevent azide buildup NaN is toxic if ingested Report incidents immediately to la
5. devraient tre valu s et interpr t s par une autorit m dicale la lumi re de l histoire clinique du patient et d autres r sultats de laboratoire Quelques s rums peuvent r agir au marqueur de MW de temps en temps dont la signification n est pas connue GUIDE DE D PANNAGE Bande forte 30kD sur la bande de Contr le Negative Cause probable fiole souill e de Contr le Negative ou contamination en travers partir du puits contenant un s rum positif e Contr le Positif appara t comme la bande de Contr le Negative Cause probable La fiole Contr le N gative a t confondue comme fiole de Contr le Positif Les bandes sont compl tement blanches Cause probable addition de Conjugu ou Substrat ont t omis Contraste de fond lev et de pauvres entre les bandes et le fond Cause probable L tape de lavage a pu avoir t omis ou inexactement ex cut ou des incubations ont t tendues 10 REFERENCES REFERENCIAS LITERATUR RIFERIMENTI McCabe BF Autoimmune sensorinerual hearing loss Ann Otol 1979 88 5852 589 Arnold W Pfaltz R Alternalt HJ Evidence of serum antibodies against inner ear tissues in the blood of patients with certain sensorineural hearing disorders Acta Otolaryngol Stockh 1985 99 437 444 Harris JP Sharp PA Inner ear autoantibodies in patients with rapidly pro gressive sensorinerual hearing loss Laryngoscope 1990 100 516 524 Yamanobe S Harr
6. patient dans les puits appropri s pour obtenir une dilution de 1 51 Incubez 90 minutes 5 minutes la temp rature ambiante sur un culbuteur ou un dispositif trembleur tournant Aspirez la solution t moin dans le bac vidange Lavez compl tement les bandes avec le tampon de lavage en injectant approximativement 2ml de solution directement sur des bandes Lavez les bandes avec l agitation douce pendant 5 minutes et aspirez la solution dans le bac vidange R p tez 2x Attention Le lavage complet des bandes entre les incubations est crucial d obtenir des r sultats valides Le lavage inexact aura comme cons quence le fond lev souillant Introduisez la pipette 1 0 ml diluant pour chantillons suivi 10 ul de Conjugu dans chacun bien Incubez 60 minutes 5 minutes la temp rature ambiante sur le culbuteur ou le dispositif trembleur tournant R p tez L tape 4 Introduisez la pipette 1 0 ml substrat dans chacun puits et incubez avec doux en secouant 5 minutes 5 minutes la temp rature ambiante et la lumi re r duite Aspirez le liquide dans les puits dans le bac vidange Lavez compl tement les bandes avec de l eau d sionis en injectant approximativement 2ml de solution directement sur des bandes Les bandes de lavage avec l agitation douce pendant 5 minutes aspirent le liquide dans le bac vidange R p tez En utilisant le forceps mouss enlevez les bandes du plateau d analyse et placez
7. ImmuBlot Anti PO Antibody Western Blot IVD IMMCO REF Product Code 1192 DIAGNOSTICS 18 Determinations INTENDED USE A Western Blot immunoassay for use in the detection and identification of antibodies to PO a 30kD antigen associated with autoimmune hearing loss SUMMARY AND EXPLANATION Hearing loss may be caused by a number of conditions Certain types of hearing loss can be reversed if diagnosed early and appropriate treatment is instituted Sensorineural hearing loss SNHL commonly referred to as nerve deafness may be caused by genetic or acquired factors such as infections or can be immunologically mediated Correct diagnosis of SNHL can be made with the aid of a combination of comprehensive patient history and laboratory studies In the majority of cases no cause of SNHL is apparent such cases are referred to as idiopathic SNHL Subgroups of idiopathic SNHL cases are treatable with immunosuppressive therapy with gratifying results 2 The laboratory work up to identify these cases may include serum antibody tests to 68 KD hsp 70 inner ear antigen and other auto antigens such as to PO a 30 KD antigen7 9 Approximately 6096 of patients with progressive SNHL have antibodies to PO A strong positive correlation between chronic progressive hearing loss and the presence of anti PO antibodies was observed In addition patients with positive PO antibodies had bilateral hearing loss PRINCIPLE OF PROCEDURE
8. boratory director or poison control center Follow good laboratory practices to minimize microbial and cross contamination of reagents Materials provided ImmuBlot Anti PO Antibody REF 1192 The ImmuBlot anti PO 30kD antibody Western Blot kit contains sufficient reagents to perform 18 determinations 1x18 Western Blot Strips with PO antigen 1 x 120 ul Positive Control red vial cap 1 x 120 ul Negative Control yellow vial cap 1 Control Card 1 x 240 pl Conjugate blue vial cap 1x 60 ml Serum Diluent 1x25ml Enzyme Substrate amber bottle 1 vial Powdered Wash Buffer reconstitute to one liter with deionized or distilled water 3 Assay trays Contains 0 196 NaN Materials Required But Not Provided Clean 1000 ml graduated cylinder Non serrated forceps Filter forceps Rocker or rotating platform shaker Absorbent paper or paper towels e Deionized or distilled water e Squeeze bottle to hold diluted wash buffer Pipettes capable of delivering 10 to 1000 ul Disposable pipette tips Timer SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING Only serum specimens should be used in this procedure Grossly hemolyzed lipemic or microbial contaminated specimens may interfere with the performance of the test and should not be used Store specimens at 2 8 C for no longer than one week For longer storage serum specimens should be frozen Avoid repeated freezing and thawing of samples PROCEDURE Procedural Notes R
9. e and negative control reactions on the provided laminated Control Card and align test strip using the alignment marker as the refer ence point Compare reaction of test strip with those of the controls on either side Use of a magnifying glass can facilitate proper alignment of test strips along the molecular weight marker and assist in observation of weak reactions Check for a band on the test strip that aligns with the 30kD band on the positive control strip Such a reaction should be considered positive Positive reactions can occur in varying intensities from weak to strong Weak reactions should be compared with baseline reaction intensities at the corresponding posi tion on the negative control strip Reactions that are distinctly darker or denser than the baseline intensity should be considered positive Occasionally minor bands may be visible with certain sera However such reactions are not relevant and should be considered as negative for antibodies to PO 30kD antigen Automated Western blot machines can occasionally show extra bands that may not be related to the 30kD band Ensure the washing cycle is thorough Repeat process manually for clarity Antibodies to PO 30kD antigen occur in patients with autoimmune hearing loss Anti P0 30kD Antibodies in Patients with SNHL Disease Group No Tested No Positive Positive Sudden 9 1 11 Progressive 20 14 60 Unspecified 5 2 40 Normal 90 1 1 LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
10. ead Product Insert carefully before starting with the assay e Let serum specimens and test reagents equilibrate to room temperature for 30 minutes prior to starting the test procedure Return all unused specimens and reagents to the refrigerator promptly after use Proper washing technique is critical to the satisfactory performance of the assay Manipulate test strips with clean forceps only Do not touch with bare hands Strips are individually numbered at the top of each strip Assign specimen identification numbers to the respective strips on the Report Form Complete all other relevant information on the Report Form prior to starting the assay Test Method Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Step 6 Step 7 Step 8 Step 9 Quality Control Though the control cards are lot specific nega tive and positive controls must be included in each test run to ensure proper performance of the assay Using blunt forceps place required number of Strips labeled side up into indi vidual wells of the assay tray Pipette 1 0 ml of Serum Diluent into each well Pipette 20 ul of Positive and Negative Control and patient sample into appropriate wells to obtain a 1 51 dilution Incubate 90 minutes 5 min at room tempera ture on a rocker or rotating shaker Aspirate sample solution into waste container Thoroughly wash strips with Wash Buffer by squirting approximately 2ml of solution directly onto strips Wash strips wi
11. is JP Inner ear specific autoantibodies Laryngoscope 1993 103 319 325 Shin S Billings P Keithley EM Harris JP Comparison of anti heat shock protein 70 anti shp 70 and anti 68 kD inner ear protein in the sera of pa tients with meniere s disease Laryngoscope 1997 107 222 227 Harris JP and Aframian D Role of autoimmunity in contralateral delayed endolymphatic hydrops Am J Otol 1994 15 710 716 Yoo TJ Du X Kwon SS Molecular mechanism of autoimmune hearing loss Acta Otolaryngol Suppl 2002 548 3 9 Review Tomasi JP Lona A Deggouj N Gersdorff M Autoimmune sensorineural hearing loss in young patients an exploratory study Laryngoscope 2001 11 2050 3 Boulassel MR Deggouj N Tomasi JP Gersdorff M Inner ear autoantibod ies and their targets in patients with autoimmune inner ear diseases Acta Otolaryngol 2001 121 28 34 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Dis ease Control National Institutes of Health 1993 HHS Pub No CDC 93 8395 For technical assistance please contact IMMCO Diagnostics Inc 60 Pineview Drive Buffalo NY 14228 2120 EE 716 691 0091 716 691 0466 IMMCO en Free USA Canada 1 800 537 TEST DIAGNOSTICS E Mail info immcodiagnostics com or your local product distributor EU Authorized Representative Autorisierter Reprasentant Rappresentante Autorrizzato Representante Autorizado Repr sentant Autoris EMERGO Group Inc Molenstraat 15 2513 BH
12. par un certain nombre de conditions Certains types de perte d audition peuvent tre renvers s si le traitement t t et appropri diagnostiqu est institu La perte d audition neuro sensorielle SNHL g n ralement d sign e sous le nom de la surdit de nerf peut tre provoqu e par des facteurs g n tiques ou acquis tels que des infections ou peut tre immunologiquement n goci e Le diagnostic correct de SNHL peut tre fait l aide d une combinaison des tudes patientes compl tes d histoire et de laboratoire Dans la majorit de cas aucune cause de SNHL n est vidente de tels cas d sign sous le nom de SNHL idiopathique Un sous groupe de cas idiopathiques de SNHL sont traitable avec la th rapie immunosuppressive avec les r sultats agr ables 12 Le travail de laboratoire identifient jusqu ces caisses peut inclure des essais d anticorps de s rum la 68 kD antig ne hsp 70 et d autres autoantig nes comme PO une 30 kD antigene Approximativement 60 de patients avec SNHL progressif ont des anticorps PO On a observ une corr lation positive forte entre la perte d audition progressive chronique et la pr sence des anticorps anti PO En outre les patients avec des anticorps PO positifs ont eu la perte d audition bilat rale PRINCIPE DE PROC D Cette analyse de Western Blot emploie l antig ne PO purifi du tissu de bovin ou de primat Pour r aliser l essai des bandelettes de PVDF sont incub es a
13. position des liquides clat avec de grands volumes de l eau pour emp cher l habillage d azoture NaN s est toxique s ing r Rapportez les incidents imm diatement au centre de commande de directeur ou de poison de laboratoire Suivez les bonnes pratiques en mati re de laboratoire de r duire au minimum la contami nation microbienne et en travers des r actifs Mat riaux fournis Code 1192 Le kit contient les r actifs suffisants pour effectuer 18 d terminations 1x18 bandelettes Western Blot 1 x 120 ul contr le positif pr t l emploi 1 x 120 ul contr le n gatif pr t l emploi 1 carte de contr e 1 x 240 ul conjugu 1x 60 ml diluant pour chantillons 1x25ml substrat enzymatique 1 tampon de lavage pour 1 litre flacon 3 bains d analyse Contient 0 1 NaN 3 Mat riaux Requis Mais Non fournis Nettoyez le cylindre recu un dipl me 1000 par ml e forceps non dentel Culbuteur ou dispositif trembleur tournant de plateforme Papier absorbant ou serviettes de papier D sionis ou eau distill e Bouteille de compression l amortisseur de lavage dilu par prise Pipettes capables de fournir 10 1000 ul Jetable introduisez la pipette les bouts Temporisateur COLLECTION ET MANIPULATION DE SP CIMEN Seulement des sp cimens de s rum devraient tre employ s dans ce proc d H molys s excessivement les sp cimens lip miques ou par microbes souill s peuvent interf rer l e
14. s Laryngoscope 1990 100 516 524 Yamanobe S Harris JP Inner ear specific autoantibodies Laryngoscope 1993 103 319 325 Shin S Billings P Keithley EM Harris JP Comparison of anti heat shock protein 70 anti shp 70 and anti 68 kD inner ear protein in the sera of patients with meniere s disease Laryngoscope 1997 107 222 227 Harris JP and Aframian D Role of autoimmunity in contralateral delayed endolymphatic hydrops Am J Otol 1994 15 710 716 Yoo TJ Du X Kwon SS Molecular mechanism of autoimmune hearing loss Acta Otolaryngol Suppl 2002 548 3 9 Review Tomasi JP Lona A Deggouj N Gersdorff M Autoimmune sensorineural hearing loss in young patients an exploratory study Laryngoscope 2001 11 2050 3 Boulassel MR Deggouj N Tomasi JP Gersdorff M Inner ear autoantibodies and their targets in patients with autoimmune inner ear diseases Acta Otolaryngol 2001 121 28 34 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Disease Control National Institutes of Health 1993 HHS Pub No CDC 93 8395 ImmuBlot Anti PO Antibody Western Blot IVD IMMCO REF Code 1192 DIAGNOSTICS 18 d terminations UTILISATION PR VUE Une analyse de Western Blot pour la d tection et l identification des anticorps l antig ne de PO une 30kD antig ne s est associ e la perte d audition neuro sensorielle SNHL SOMMAIRE ET EXPLICATION La perte d audition peut tre provoqu e
15. th gentle agitation for 5 minutes and aspirate solution into waste container Repeat 2x Caution Complete washing of the strips between incubations is crucial to obtain valid results Improper washing will result in high background staining Pipette 1 0 ml of Serum Diluent followed by 10 pl of Conjugate into each well Incubate 1 hour 5 min at room temperature on rocker or rotating shaker Repeat Step 4 Pipette 1 0 ml Substrate into each well and incubate with gentle shaking 5 min utes 5 min at room temperature and reduced light Aspirate liquid in wells into waste container Thoroughly wash strips with deion ized water by squirting approximately 2ml of solution directly onto strips Wash strips with gentle agitation for 5 minutes aspirate liquid into waste container Repeat Using blunt forceps remove strips from assay tray and place them gently onto absorbent paper Handle strips only at the ends and let them dry 15 20 minutes ES MW marker Positive Control Reaction The positive control 30 kD anti PO strip will exhibit a dense blue violet band at 30kD sometimes a doublet Figure 1 Negative Control Reaction Typically the nega tive control will exhibit no band Sometimes Figure 1 Diagram of PO Positive Reaction some sera may give reactions on the strip but not at 30kD 3 RESULTS Reading and Interpretation Guidelines Step 1 Step 2 Step 3 Note Hold test strip between the positiv
16. ve Les r actions positives peuvent se produire dans des intensit s variables de faible fort Des 8 Note r actions faibles devraient tre compar es aux intensit s de r action de ligne de base la position correspondante sur la bande n gative de contr le Des r actions qui sont distinctement plus fonc es ou plus denses que l intensit de ligne de base 30kD devraient tre consid r es positives De temps en temps le poids mol culaire inf rieur mineur bandes peut soit vident avec certains s rums Cependant de telles r actions ne sont pas appropri es et devraient tre consid r es en tant que n gatif pour des anticorps l antig ne PO 30kD Les machines automatis es de tache de Western peuvent montrer les bandes suppl mentaires qui ne peuvent tre li es la bande 30kD Assurez le cycle de lavage est complet R p tez le processus manuellement pour la clart Les anticorps l antig ne PO 30kD se produisent dans les patients pr sentant la perte d audition autoimmune Anticorps anti PO 30kD dans les patients avec SNHL 8 Groupe Num ro Examin Num ro Positif Positif Soudain 9 1 11 Progressif 20 14 60 Non sp cifi 5 2 40 Normale 90 1 1 LIMITATIONS DU PROC D Le PO Western Blot 30kD kit devrait tre employ e comme aide au diagnostic Des r sultats positifs peuvent tre trouv s en d autres conditions autoimmunes ou certaines maladies infectieuses Par cons quent des r sultats
17. vec le s rum patient dilu Les anticorps lient sp cifiquement la prot ine PO sur la bandelette Apr s des tapes appropri es de lavage et d incubation avec le conjugu des bandelettes sont lav es et incub es avec un substrat Les r actions positives apparaissent car une marque bleu violette sa r action de 30kD La r action peut apparaitre comme doublet R ACTIFS Stockage et Preparation Stockez tous les r actifs 2 8 C Ne gelez pas N employez pas si les r actifs liquides sont troubles ou un pr cipit est pr sent Avant de commencer l analyse des r actifs doivent tre quilibr s la temp rature ambiante 22 Des bandes d antig ne peuvent seulement tre employ es une fois N changez pas les composants de diff rents sorts N employez pas les r actifs au del de la date d ch ance indiqu e sur des tiquettes Pr cautions Tous les composants d riv s humains utilis s ont t examin s pour HBsAg HCV Hiv 1 et 2 et Htlv I et n gatif trouv par les essais exig s par FDA des USA Cependant tous les d riv s humains de sang et sp cimens patients devraient tre consid r s potentiellement 6 infectieux et de bonnes pratiques en mati re de laboratoire en stockant en distribuant et en ayant ces mat riaux doivent tre suivies 10 Attention l azoture de sodium NaN3 peut r agir avec le fil et la tuyauterie de cuivre aux azotures fortement explosifs en m tal de forme Sur la dis
18. x cution de l essai et ne devraient pas tre employ s Stockez les sp cimens 2 8 C pour plus qu une semaine Pour un entreposage plus prolong des sp cimens de s rum devraient tre gel s vitez la cong lation et le d gel r p t s des chantillons M thode Notes Proc durales Lisez les instructions soigneusement avant commen ant par l analyse Laissez les sp cimens de s rum et les r actifs d essai quilibrer la temp rature ambiante pendant les minutes 30 avant de commencer la m thode d essai Renvoyez tous les sp cimens et r actifs inutilis s au apr s utilisation de r frig rateur promptement La technique de lavage appropri e est critique l ex cution satisfaisante de l analyse Manoeuvrez les bandes d essai avec les forceps propres seulement Ne touchez pas avec les mains nues Des bandes sont individuellement num rot es au dessus de chaque bande Assignez les num ros d identification de sp cimen aux bandes respectives sur le rapport Remplissez toute autre information appropri e sur le rapport avant de commencer l analyse Examinez La M thode T 2 3 En utilisant le forceps mouss placez le nombre requis de c t marqu par les bandelettes Western Blot vers le haut dans diff rents puits du plateau d analyse Introduisez la pipette 1 0 ml du diluant pour chantillons dans chacun bien Introduisez la pipette 20 ul du contr les positif et negatif et chantillon
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