Anti-EBV EA IgM ELISA
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1. LR A PRE i i 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par des Proc dure de pipetage pour la d termination qualitative d IgM dilution antig nes p54 138 d EBV EA recombinants concentration en tube gt 0 5 ug ml Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi 1 2 mi Contr le EBV EA IgM n gatif pr t l emploi humain Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement Fa rar Contr le EBV EA 1gM positf prt emploi humain See Pas OA PC 2m ontr le gM positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 streptomycine 0 05 de p nicilline V Blanc 200 DIL 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi NC double test 2 200 INC z conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de INC INC chloramph nicol double test 5 E 200 ma CONJ 15 ml Conjug d anti IgM humain anticorps monoclonal Echantillon 1 21 2s i 200 marqu par de la peroxydase pr t l emploi mi DATES TRETE Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate Recouvrir a MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un de streptomycine 0 2 de Proclin 300 PrOCESSEUr 6ml Tampon de lavage concentr 500 x Incubation 60 1 mn 37 1 C processeur 60 1 mn 37 1 C2. de PC inf rieure lt 0 400 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de sup rieure 2 0 200 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du PC Sch ma d interpr tation du test EA IgM Sch ma des r actions Anti EBV EA EBNA ELISA Etat de l infection par EA EA EBNA Seuil EAIgM Seuil EBNA EBV IgM IgG IgG DO 0 5 DO 0 5 Infection aigu Phase pr coce gt 0 5 Primaire Primaire lt 0 5 Phase tardive Infection aigu douteuse Etat s ronegatif Phase pr coce lt 0 5 douteuse Phase tardive lt 0 5 douteuse R activation Secondaire 20 5 20 5 faible R activation 20 5 Ancienne Infection ancienne Infection ancienne Infection lt 0 5 ancienne iiil Ps Biotest Industriestr 1 D 63303 Dreieich C Germany www biotest de mail biotest de Tel 49 6103 801 0 Fax 49 6103 801 140 Biotest
3. nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de NC 0 200 DO moyenne de PC Z 0 400 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NC X laquelle on ajoute 0 200 Valeur seuil NCX 0 200 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 10 Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgM sp cifiques de l EA de l EBV Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement Pour plus d informations sur les interpr tations du sch ma de r activit 6 un sch ma d interpr tation complet est disponible sur demande aupr s de Biotest Limitations de la m thode Un r sultat de test n gatif obtenu dans le test Anti EBV EA IgM ELISA n exclut pas totalement une infection par l EBV Les r sultats du test doivent tre utilis s conjointement avec les informations disponibles sur l v
4. 1990 J Clin Microbiol 26 2305 2311 5 F rber l Wutzler P Wohlrabe P Wolf H Hinderer W et Sonneborn H H 1993 J Virol Meth 42 301 108 6 Hinderer W Nebel Schickel H Horn J Vornhagen R Wenger S ss R et Sonneborn H H 1993 Biotest Bulletin 5 33 46 7 Tamir D Benderley A Levy J et al 1974 Pediatrics 53 330 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO Z 0 100 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Si l on utilise un dispositif de lavage manuel effectuer 7 cycles de lavage de l tape de lavage Utiliser le de Biotest contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 3 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a contamin pr parer un nouveau tampon de lavage b ou contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne
5. Anti EBV EA IgM ELISA Test immunoenzymatique pour la d tection in vitro des anticorps IgM dirig s contre les antig nes pr coces EA p54 138 du virus d Epstein Barr EBV dans le s rum ou le plasma Conditionnement 807015 96 tests coffret de tests complets Usage pr vu Le test Anti EBV EA IgM ELISA est un test de diagnostic in vitro pour la d tection d anticorps IgM dirig s contre les antig nes pr coces EA p54 et p138 de l EBV Les r sultats obtenus dans ce test associ s d autres donn es cliniques et d autres informations sur le patient obtenues dans des analyses d autres anticorps sp cifiques du virus d Epstein Barr comme les tests anti EA IgG anti VCA IgG IgM et anti EBNA 1 IgG aident poser le diagnostic s rologique d une infection par EBV Une primo infection par EBV peut donner une mononucl ose infectieuse IM maladie de Pfeiffer 1 2 La maladie atteint le plus souvent les grands adolescents et les jeunes adultes La maladie aigu peut donner les sympt mes suivants fi vre angine amygdalite lymphad nopathie malaise maux de t te myalgies spl no et h patom galie ruption cutan e et leucocytose 2 D autres agents pathog nes infectieux comme le cytom galovirus Toxoplasma gondii le virus de la rub ole les virus de l h patite le virus de l immunod ficience humaine HIV peuvent donner des sympt mes similaires On peut utiliser le test Anti EBV VCA IgM ELISA pour l identifi
6. aluation clinique du patient et les autres proc dures de diagnostic existantes Les r sultats des tests de patients immunod prim s peuvent tre difficiles interpr ter Des r sultats de test positifs peuvent ne pas tre valides chez des personnes ayant re u des transfusions sanguines ou d autres produits sanguins au cours des derniers mois Le test Anti EBV EA IgM ELISA a t analys avec les chantillons suivants susceptibles de donner une r action crois e s rums anti virus de la varicelle positifs 6 s rums anti cytom galovirus positifs 6 s rums anti Herpes simplex type 1 et 2 5 et s rums anti toxoplasmose 5 Aucun des chantillons n a t positif dans le test Anti EBV EA IgM ELISA Performance Les r sultats obtenus dans le test Anti EBV EA IgM associ s d autres tests tels que anti EA IgG et anti EBNA 1 IgG facilitent le diagnostic s rologique d une infection par l EBV 4 La sensibilit du syst me de test ELISA dans ces trois tests a t trouv e chez les patients IM gale 99 2 La sp cificit a t trouv e gale 98 8 5 Etude de la pr cision Un panel de 10 s rums repr sentant des chantillons peu r actifs et tr s r actifs a t test sur 11 jours diff rents La variabilit inter s ries pour ces s rums a t trouv gale 10 16 9 Les chantillons de ce m me panel ont t test s huit fois dans une s rie de tests La variabilit intra s ries p
7. ations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les PC et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 pl de Bien m langer Dilution des chantillons au 1 21 avec dilution directement dans la plaque Pipeter 200 ul de dans chaque puits Cette dilution directement dans la microplaque convient tout particuli rement bien en cas d utilisation de dispositifs de pipetage automatiques Si la dilution est effectu e directement dans la plaque manuellement il est important d viter la fixation non sp cifique de prot ines en observant les tapes suivantes Pipeter premi rement 200 pl de dans le puits puis ajouter 10 ul d chantillon ou de t moins M langer de 5 7 fois quand on ajoute les 10 ul d chantillon ou de t moins 1 Microplaque i
8. cation d une infection par EBV Principe de la m thode Le test Anti EBV EA IgM ELISA est un test immunoenzymatique indirect avec antig ne adsorb ELISA tr s sensible pour la d tection d anticorps sp cifiques de l EBV dans le s rum ou le plasma Pendant la premi re tape d incubation les anticorps IgM de l chantillon vont se lier aux antig nes p54 et p138 4 6 recombinants tapissant la MTP Les mati res non sp cifiques seront limin es par lavage Le complexe anticorps antig ne form est d tect en utilisant un anticorps monoclonal sp cifique marqu par une enzyme dirig contre l IgM humaine Le conjugu li de fa on non sp cifique est limin par une autre tape de lavage Pendant la derni re incubation la solution de substrat TMB 3 3 5 5 t tram thylbenzidine est introduite dans les puits La r action enzymatique est arr t e par addition d acide sulfurique la couleur passe du bleu au jaune et la densit optique est mesur e avec un spectrophotom tre 450 nm et avec une longueur d onde de r f rence de 615 690 nm La trousse contient 187716 08 03 2008 moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement les utilis es et les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techn
9. conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol Laver 5x voir W1 13 ml Solution de substrat pr te l emploi 550 550 550 550 Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 tape 2 puits ui Voir avertissement et pr cautions CON 100 100 100 100 STOP 15 ml l arr t pr te l emploi Acide sulfurique lt 1 N H2SO4 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour processeur ELISA conserver les barrettes de microplaques inutilis es Incubation 30 1 mn 37 1 C processeur 30 1 mn 37 1 C UT Rene cures coucou ee puis des EE ri uto ives pour recouvri pui microplaques pendant l incubation 550 550 550 550 BR 1 Notice du coffret tape 3 puits ul Conservateurs concentration totale lt 0 11 SUB 100 100 100 100 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de microplaques avec lavage de fond et incubateur 37 C pour les MTP Avertissement et pr cautions Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti
10. iciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiquement contr l es En cas de trousse d origine d t rior e en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e 1 501 Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou conta mination microbienne et des pr par
11. our ces s rums tait de 2 8 6 3 Valeurs attendues Quatre vingt dix neuf chantillons de s rums provenant de donneurs de sang asymptomatiques sains ont t test s par le test EA IgM ELISA de Biotest Sur les 99 chantillons 5 ont t trouv s positifs 5 05 et 94 ont t trouv s n gatifs 94 95 Ces chiffres sont en accord avec les valeurs publi es pour la pr valence de l exposition l EBV dans la population adulte La pr valence peut varier selon divers facteurs comme la localisation g ographique l ge l tat socio conomique la race le type de test utilis les proc dures de pr l vement et de manipulation des chantillons les ant c dents cliniques et pid miologiques 6 7 Les s rums de patients ayant t atteints de maladies dues au CMV 20 au toxoplasme 20 et de maladies rhumato des 20 ont t analys s En utilisant le syst me EA IgM EA IgG et EBNA IgG ELISA 7 17 et 29 chantillons ont pu tre identifi s comme correspondant une primo infection une infection r activ e et une infection ancienne par l EBV 5 Litt rature 1 Linde A 1992 Rev Med Microbiol 3 43 51 2 Straus S Cohen J I Tosato G et Meier J 1993 Ann Int Med 118 45 58 3 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices 4 Gorgievski Hrisoho M Hinderer W Nebel Schickel H Horn J Vornhagen R Sonneborn H H H Wolf H et Siegl G
12. syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au Incubation 30 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit processeur 15 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 ul de tampon de lavage volume total 550 pl R p ter cette proc dure de lavage 5 fois Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690
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