Anti-EBV VCA IgM ELISA
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1. cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e 1 501 Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou contamination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivr2. d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 150 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de NC 0 200 DO moyenne de PC 0 400 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NC X laquelle on ajoute 0 200 Valeur seuil NC X 0 200 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 10 CE 187830 07 07 2010 Proc dure de pipetage pour la d termination qualitative d IgM dilution en tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ul A1 B1 C1 D1 Et F1 Gi Blanc 200 double test 200 5 double test 200 E Echantillon 1 21 200 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 1 mn 37 1 C Processeur 60 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 2 puits ul CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la
3. d une infection par EBV Principe de la m thode Le test Anti EBV VCA IgM ELISA est un test immunoenzymatique de capture avec antig ne adsorb ELISA sp cifique des IgM cha ne y tr s sensible pour la d tection d anticorps sp cifiques de l EBV dans le s rum ou le plasma 4 Pendant la premi re tape d incubation les anticorps IgM de l chantillon vont se lier la IP Les autres types d immunoglobulines seront limin s par lavage Pendant une seconde incubation les anticorps IgM immobilis s sp cifiques de p23 et p18 de la VCA seront d tect s Pour cela un conjugu antig ne enzyme est ajout Les p23 18 recombinants rec sont marqu s directement et de fa on covalente par de la peroxydase de raifort HRP Le conjugu li de fa on non sp cifique est limin par une autre tape de lavage Pendant la derni re incubation la solution de substrat TMB 3 3 5 5 t tram thylbenzidine est introduite dans les puits La r action enzymatique est arr t e par addition d acide sulfurique la couleur passe du bleu au jaune et la densit optique est mesur e avec un spectrophotom tre 450 nm et avec une longueur d onde de r f rence de 615 690 nm La trousse contient T Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par un anticorps IgM anti humain polyclonal concentration gt 0 5 ug ml 1 2 mi Contr le EBV IgM n gatif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine
4. en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 Processeur 30 1 mn 37 1 C C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 3 puits ul 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit Processeur 15 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgM sp cifiques de la VCA de l EBV Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement Interpr tation de r sultats positifs pour le test Anti EBV VCA IgM Etat de l infection IgM VCA IgG EBNA Informations S ron gatif 1 Primo infection Phase pr coce Phase aigu Phase tardive Apr s infection Infection ancienne IgM pe
5. prim s peuvent tre difficiles interpr ter Des r sultats de test positifs peuvent ne pas tre valides chez des personnes ayant re u des transfusions sanguines ou d autres produits sanguins au cours des derniers mois Le test Anti EBV VCA IgM ELISA a t analys avec les chantillons suivants susceptibles de donner une r action crois e s rums anti rhumato des 23 s rums anti virus de l h patite B positifs phase aigu 6 s rums anti virus de l h patite C positifs phase aigu 6 s rums anti virus de la varicelle positifs phase aigu 3 s rums anti cytom galovirus positifs phase aigu 3 et s rums anti toxoplasmose positifs phase aigu 4 Un chantillon HCV positif a donn un r sultat positif dans le test Anti EBV VCA IgM ELISA Performance Les r sultats obtenus dans le test Anti EBV VCA IgM associ s d autres tests tels que anti VCA IgG et anti EBNA 1 IgG facilitent le diagnostic s rologique d une infection par l EBV Sur 69 s rums de patients primo infect s par l EBV 67 97 1 taient positifs 5 Tous les chantillons s ron gatifs 46 ont t trouv s n gatifs sp cificit 100 par le test Anti EBV VCA IgM ELISA 5 Etude de la pr cision La variabilit intra s rie du test Anti EBV VCA IgM ELISA a t valu e en pipetant un chantillon n gatif un chantillon faiblement r actif et un chantillon tr s r actif dans une m me s rie chacun dans 6 puits Nous avons
6. 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 1 2 mi Contr le EBV IgM positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de chloramph nicol 15 ml Conjugu de la prot ine de fusion p23 18 Rec pr t l emploi Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate de streptomycine 0 2 de Proclin 300 W 6ml Tampon de lavage concentr 500 x conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol SUB 13 ml Solution de substrat pr te l emploi Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H 0 Voir avertissement et pr cautions STOP 15 ml larr t pr te l emploi Acide sulfurique lt 1 N HSO Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les barrettes de microplaques inutilis es 3 Feuilles transparentes auto adh sives Feuilles transparentes auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation Notice du coffret K Z QO Q SERBE E E JE BR 1 Conservateurs concentration totale lt 0 11 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de microplaques avec lavage de fond et incuba
7. Anti EBV VCA IgM ELISA Test immunoenzymatique pour la d tection in vitro des anticorps IgM dirig s contre les antig nes p28 p18 de la capside du virus VCA d Epstein Barr EBV dans le s rum ou le plasma Conditionnement 3 807018 96 tests coffret de tests complets Usage pr vu Le test Anti EBV VCA IgM ELISA est un test de diagnostic in vitro pour la d tection des anticorps IgM dirig s contre les antig nes p23 et p18 de la VCA de l EBV Les r sultats obtenus dans ce test associ s d autres donn es cliniques et d autres informations sur le patient obtenues dans des analyses d autres anticorps sp cifiques du virus d Epstein Barr comme les tests anti EA IgG IgM anti VCA IgG et anti EBNA 1 IgG aident poser le diagnostic s rologique d une infection par EBV Une primo infection par EBV peut donner une mononucl ose infectieuse IM maladie de Pfeiffer 1 2 La maladie atteint le plus souvent les grands adolescents et les jeunes adultes La maladie aigu peut donner les sympt mes suivants fi vre angine amygdalite lymphad nopathie malaise maux de t te myalgies spl no et h patom galie ruption cutan e et leucocytose 2 D autres agents pathog nes infectieux comme le cytom galovirus Toxoplasma gondii le virus de la rub ole les virus de l h patite le virus de l immunod ficience humaine HIV peuvent donner des sympt mes similaires On peut utiliser le test Anti EBV VCA IgM ELISA pour l identification
8. e strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les PC et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 ul de Bien m langer Dilution des chantillons au 1 21 avec dilution directement dans la plaque Pipeter 200 pl de dans chaque puits Cette dilution directement dans la microplaque convient tout particuli rement bien en cas d utilisation de dispositifs de pipetage automatiques Si la dilution est effectu e directement dans la plaque manuellement il est important d viter la fixation non sp cifique de prot ines en observant les tapes suivantes Pipeter premi rement 200 lil de dans le puits puis ajouter 10 ul d chantillon ou de t moins M langer de 5 7 fois quand on ajoute les 10 ul d chantillon ou de t moins Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 ul de tampon de lavage volume total 550 ul R p ter cette proc dure de lavage 5 fois Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs
9. obtenu les coefficients de variation CV respectifs suivants 11 7 2 3 et 4 4 La variabilit inter s ries a t valu e en testant trois chantillons de r activit n gative aible et forte chacun dans six puits et dans trois s ries successives Nous avons obtenu le coefficient CV suivant 7 4 3 5 et 4 8 Litt rature 1 Linde A 1992 Rev Med Microbiol 3 43 51 2 Straus S Cohen J l Tosato G et Meier J 1993 Ann Int Med 118 45 58 3 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices 4 Hinderer W Lang D Rothe M Vornhagen R Sonneborn H H et Wolf H 1999 J of Clin Microbiol Vol 37 No 10 p3239 3244 5 F rber l Hinderer W Rothe M Lang D et Wutzler P 2001 J of Med Virol 63 271 276 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO 0 150 a SUB devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Si l on utilise un dispositif de lavage manuel effectuer 7 cycles de lavage de l tape de avage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directemen
10. port omd bio rad com sup rieures la plage normale gt 2 500 RU ml sont suspectes Le marqueur classique pour la d finition s rologique de la r activation de l EBV est constitu par les anticorps IgG dirig s contre l antig ne pr coce EA par exemple anti EBV EA IgG ELISA N de catalogue 807 016 Les IgG anti EA doivent tre d termin s en outre en cas de suspicion d une r activation d EBV 5 Les sch mas de r activit non plausibles sont des situations extr mement peu probables qui n ont pas t mises en vidence dans les tudes cliniques Les valeurs d IgG de VCA dans la zone grise devraient tre d finies comme positives L interpr tation dans ce cas est infection ancienne Pour les valeurs d IgG de VCA inf rieures la zone grise il conviendra de recommencer totalement la s rologie de l EBV pour liminer toute erreur dans la proc dure du test En cas de r sultat non plausible nouveau il est recommand de demander un nouveau pr l vement Si le r sultat se confirme le diagnostic infection ancienne sera pos Limitations de la m thode Un r sultat de test n gatif obtenu dans le test Anti EBV VCA IgM ELISA n exclut pas totalement une infection par l EBV Les r sultats du test doivent tre utilis s conjointement avec les informations disponibles sur l valuation clinique du patient et les autres proc dures de diagnostic existantes Les r sultats des tests de patients immunod
11. rsistantes R activation Non plausible Non plausible 1 Dans la toute premi re phase d une infection primaire la s rologie peut tre encore n gative Il est recommand dans le cas d un r sultat d IgM anti VCA dans la zone grise de traiter l chantillon comme un cas de possible phase pr coce d une primo infection et de confirmer ou infirmer ce r sultat en analysant un autre chantillon pr lev plus tard 2 Il existe une exception dans le cas d un patient immunod prim ou immunoprive o ce r sultat peut tre secondaire la perte des IgG d EBNA Dans cette situation il est recommand d interpr ter les valeurs des IgG d EBNA trouv es dans la zone grise comme tant positives et poser comme diagnostic pour l chantillon infection ancienne 3 Les IgM persistent dans de nombreux cas pendant plus de six mois et peuvent ce moment l co ncider avec un r sultat positif pour les IgG d EBNA Cependant on ne peut donner comme r sultat phase tardive d une primo infection que dans le cas d un tr s faible EBNA DO lt 0 500 Dans le cas contraire le diagnostic est infection ancienne 4 Il est impossible de d finir une r activation au moyen d une s rologie de VCA La quantification des IgG de VCA peut apporter une aide Les valeurs tr s Mi Bio Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsup
12. t apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera es valeurs de DO d approximativement 0 120 3 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a WB contamin pr parer un nouveau tampon de lavage b DIL ou contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de lacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de inf rieure lt 0 400 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de sup rieure Z 0 200 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du PC CE 187830 07 07 2010
13. teur 37 C pour les MTP Avertissement et pr cautions Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement les utilis es et les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiqumenet contr l es En cas de trousse d origine d t rior e en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En
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