Notice QuantiFERON Monitor (QFM) ELISA
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1. Reconstituer le standard du kit 8 0 Ul ml avec de l eau distill e ou d ionis e Pr parer 4 dilutions de standard Reconstituer le concentr de conjugu 100x lyophilis avec de l eau distill e ou d ionis e Pr parer le conjugu concentr pr t l emploi dans le diluant vert et ajouter 50 pl dans tous les puits Ajouter 50 pl des chantillons de plasma de test non dilu s dilutions au 1 10 et 1 100 suivant le cas et 50 pl de standards aux puits appropri s M langer avec l agitateur Incuber pendant 120 5 minutes temp rature ambiante Laver les puits au moins fois avec 400 bl puits de tampon de lavage Ajouter 100 pl de solution de substrat enzymatique aux puits M langer avec l agitateur Incuber pendant 30 minutes temp rature ambiante Ajouter 50 pl de solution de blocage d enzyme aux puits M langer avec l agitateur Lire les r sultats 450 nm avec un filtre de r f rence de 620 650 nm Analyser les r sultats N LJ LE L Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Remarques Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 A1 Remarques 42 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Marques d pos es QIAGEN QFM QuantiFERON QuantiFERON Monitor groupe QIAGEN LyoSphere LyoSpheres Biolyph Excel Microsoft Microsoft ProClin Rohm and Haas Col Accord de licence limit e pour le k2. tudes cliniques Deux tudes cliniques ont t men es pour valuer les r ponses des individus apparemment sains n 114 en comparaison des receveurs de greffe n 30 Parmi les receveurs de greffe 18 faisaient partie de la cohorte de post trans plantation pr coce post Tx pr coce au cours des 3 mois suivant la transplan tation et 12 faisaient partie de la cohorte de posttransplantation tardive ou cohorte stable post Tx tardive gt 12 mois apr s la transplantation M Les pr l vements d chantillons ont t effectu s jusqu 5 fois pour chaque individu de la cohorte de posttransplantation pr coce 3 mois apr s la transplantation n 64 chantillons M Les pr l vements d chantillons ont t effectu s 1 fois pour chaque individu de la cohorte de posttransplantation tardive n 12 chantillons M Les pr l vements d chantillons ont t effectu s 1 fois pour chaque individu de la cohorte d individus apparemment sains n 114 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 27 Les r ponses QFM taient comprises entre faible et mod r e pour les chantillons des cohortes de posttransplantation pr coce et tardive Dans la cohorte de post transplantation pr coce le pourcentage de r ponses comprises dans l intervalle de r ponses faibles tait plus lev 93 8 que le pourcen tage de r ponses comprises dans l intervalle de r ponses mod r es 6 3 alors que dans la cohorte de p
3. se peut que les r sultats de QFM ne quantifient pas directement le niveau d immunod pression Important lors de l tablissement du statut immunitaire d un patient le niveau d IFN y mesur doit tre utilis conjointement avec la pr sentation clinique les ant c dents m dicaux et d autres valuations diagnostiques tableau 2 Le seuil du test QFM peut varier selon le niveau d immunod pression du sujet et les param tres de transplantation individuels Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 25 Tableau 2 Interpr tation des r sultats R sultat QFM d IFN y Classification Interpr tation UI mIl lt 15 Faible Le sujet a une faible r ponse d IFN y aux stimulants immunitaires inn s et adaptatifs 15 1000 Mod r e Le sujet a une r ponse mod r e d IFN y aux stimulants immunitaires inn s et adaptatifs gt 1000 lev e Le sujet a une r ponse lev e d IFN y aux stimulants immunitaires inn s et adaptatifs Si le niveau d IFN y mesur d un chantillon de plasma non dilu est inf rieur O 1 Ul ml M S assurer que le QFM LyoSphere a t ajout l chantillon sanguin et que le tube a t incub conform ment cette notice M Veiller ce que le r sultat d IFN y corresponde ou statut clinique actuel du sujet Si des probl mes techniques sont suspect s avec le pr l vement ou la manipu lation des chantillons sanguins r p ter tout le test QFM avec un nouvel chantillon
4. tre ouvert Important ne pas laisser le flacon QFM LyoSphere ouvert pendant une p riode prolong e Le QFM LyoSphere doit tre ajout au sang d s que le flacon est d bouch Si les QFM LyoSpheres sont ajout s au sang pr lev dans un tube de pr l vement sanguin QFM veiller ce que les bouchons des tubes soient remis sur les chantillons correspondants Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 15 I eg E Figure 1 Ajout de QFM LyoSphere n Tube de pr l vement sanguin QFM et flacon QFM LyoSphere Retirer le bouchon du tube de pr l vement sanguin QFM ainsi que la capsule m tallique et le bouchon de caoutchouc du flacon QFM LyoSphere l Ajouter imm diatement le QFM LyoSphere au sang en alignant le bord du flacon de verre celui du tube de pr l vement D Retourner ensuite le flacon avec pr caution pour transf rer le LyoSphere dans le tube de pr l vement E Remettre le bouchon sur le tube de pr l vement sanguin QFM et agiter 5 10 fois 6 Mettre le bouchon sur le tube de pr l vement sanguin QFM et agiter 5 10 fois suffisamment fort pour s assurer que le QFM LyoSphere est compl tement dissous Si un QFM LyoSphere adh re la surface interne du tube il est possible de le dissoudre en recouvrant le LyoSphere de sang lorsque le tube est retourn S assurer que le tube est bouch une fois que le QFM LyoSphere a t ajout pour emp cher l ajout accidentel d
5. 1 Tous les chantillons de plasma et r actifs sauf le concentr de conjugu 100x doivent tre amen s temp rature ambiante 22 C 5 C avant d tre utilis s Attendre au moins 60 minutes pour l quilibration 2 Retirer du cadre de microplaque les bandelettes superflues les resceller dans la poche en aluminium et les replacer au r frig rateur o elles seront stock es jusqu utilisation Pr voir au moins une bandelette pour les standards QFM et suffisamment de bandelettes pour le nombre de sujets test s Apr s utilisation conserver le cadre et le couvercle pour un emploi ult rieur avec les bandelettes restantes 3 Reconstituer le standard IFN y lyophilis avec le volume d eau d ionis e ou distill e indiqu sur l tiquette du flacon du standard M langer doucement pour r duire la formation de mousse et pour garantir une solubilisation compl te La reconstitution du standard au volume indiqu produira une solution une concentration de 8 0 Ul ml Important le volume de reconstitution du standard IER a diff re selon les lots Consulter l tiquette du flacon du standard pour veiller utiliser le volume ad quat d eau d ionis e ou distill e Utiliser le standard du kit reconstitu pour produire une s rie de dilution pour 2 suivie d une s rie de dilution 1 pour 4 de l IFN dans le diluant vert DV voir figure 2 Le S1 standard 1 contient 4 0 Ul ml le S2 standard 2 1 0 Ul ml l
6. Kumar D and Humar A 2014 Clinical immune monitoring strategies for predicting infection risk in solid organ transplantation Clin Transl Immunol 3 e12 Sood S and Testro A G 2014 Immune monitoring post liver transplant World J Transplant 4 30 Sood S 2014 A novel biomarker of immune function and initial experience in a transplant population Transpl J 97 e50 CD Symboles lt 2 x 96 Suffisant pour 2 x 96 pr parations d chantillons Fabricant autoris Symbole de la certification CE IVD Utilisation pr vue pour le diagnostic in vitro Code de lot Num ro de r f rence A utiliser avant le Limite de temp rature Consulter les instructions d utilisation 5 oJ B 2 L Ne pas r utiliser e D E D SN AN Conserver l abri des rayons du soleil EC REP Repr sentant autoris dans l Union europ enne Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 37 Coordonn es Pour une assistance technique ou pour de plus amples informations appeler le num ro gratuit 00800 22 44 6000 consulter notre Centre d assistance technique l adresse www qiagen com contact ou contacter l un des d partements d assistance technique voir quatri me de couverture ou visiter le site www qiagen com 38 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 R sum de la proc dure du test tape 1 incubation du sang 1 Pr lever le sang du patient dans un tube de pr
7. chaque kit QIAGEN et chaque composant Avertissements QFM est un test offrant une mesure qualitative et quantitative de la fonction immunitaire l se peut que les r sultats de QFM ne quantifient pas directement le niveau d immunod pression Les r sultats des tests QFM doivent tre utilis s conjointement avec la pr sentation clinique les ant c dents m dicaux et d autres indicateurs cliniques lors de l tablissement du statut immunitaire d un patient Le seuil du test QFM peut varier selon le niveau d immunod pression du sujet et les param tres de transplantation individuels 10 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Pr cautions Utilisation pr vue uniquement pour le diagnostic in vitro AVERTISSEMENT le sang et le plasma humains doivent tre A manipul s comme s ils taient potentiellement infectieux Observer les directives de manipulation du sang et des produits sanguins en vigueur Mettre au rebut les chantillons et le mat riel en contact avec le sang ou les produits sanguins conform ment aux r glemen tations nationales r gionales et locales en vigueur Les mentions de danger et conseils de prudence suivants s appliquent aux composants du QuantiFERON Monitor ELISA Mentions de danger QuantiFERON Conjugate Conjugu QuantiFERON Contient boric acid Danger Peut nuire la fertilit ou au foetus liminer le contenu r cipient dans une installation d limination des d
8. de 14 sujets Le coefficient moyen de variation observ chez les 14 sujets test s tait de 14 7 IC 95 10 2 19 2 Le CV des sujets individuels tait inf rieur 30 32 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 La reproductibilit du test QFM ELISA tape 2 a t estim e Pour ce faire 3 op rateurs ont test 20 chantillons de plasma pr sentant diff rentes concen trations d IFN y dans des r plicats de 3 dans 3 laboratoires et pendant 3 jours non cons cutifs Chaque chantillon a ainsi t test 27 fois dans le cadre de 9 analyses ind pendantes L un des chantillons tait un contr le z ro pr sen tant une concentration IFN y calcul e de 0 08 Ul ml IC 95 0 07 0 09 Sur les 19 chantillons de plasma restants les concentrations taient comprises entre 0 33 IC 95 0 31 0 34 et 7 7 Ul ml IC 95 7 48 7 92 L impr cision intratest au sein d une m me analyse a t estim e au moyen du calcul de la moyenne des coefficients de variation DCH de chaque plasma de test contenant de l IFN y issu de chaque analyse de microplaque n 9 L impr cision est comprise entre 4 1 et 9 1 CV Le CV intratest moyen IC 95 tait de 6 6 0 6 La moyenne du plasma IFN y z ro tait de 14 1 XCV L impr cision totale ou intertest a t d termin e par comparaison des 27 concentrations calcul es d IFN y pour chaque chantillon de plasma L impr cision intertest tait compris
9. l vement QFM ou un tube de pr l vement sanguin Sre contenant de l h parine de lithium tiqueter les tubes N a en incluant les informations sur le patient et l heure du pr l vement sanguin avant de les transporter vers le laboratoire temp rature ambiante dans les 8 heures suivant le pr l vement a Si le sang a t pr lev dans un tube de pr l vement sanguin contenant de l h parine de lithium aliquoter 1 ml de sang dans le tube de pr l vement sanguin QFM puis l tiqueter en incluant les informations sur le patient et l heure du pr l vement sanguin 2 Ajouter 1 QFM LyoSphere chaque tube de pr l vement sanguin QFM contenant 1 ml de sang dissoudre le LyoSphere puis incuber les tubes d s que possible dans les 8 heures suivant le pr l vement sanguin debout pendant 16 24 heures 37 C 3 Apr s l incubation centrifuger les tubes pendant 15 minutes de 2 000 3 000 x g FCR pour s parer le plasma et les globules rouges 4 Apr s la centrifugation viter le pipetage r p t ou le m lange du plasma par d autres moyens avant de le pr lever Prendre garde ne pas perturber la mati re sur la surface du gel quelle que soit l tape Z Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 39 tape 2 IFN y ELISA 1 10 11 12 40 Amener les composants ELISA l exception du concentr de conjugu 100x temp rature ambiante pendant au moins 60 minutes
10. plasma ou 1 100 Pr parer une dilution au 1 10 voir l tape ci dessus Ajouter 90 pl de diluant vert dans un tube dont l tiquette pr sente les informations sur le patient et 1 100 Ajouter 10 pl de dilution au 1 10 M langer soigneusement l aide d une pipette pour r duire la formation de mousse Recommandation tester les chantillons suivants en parall le et dans l ordre suivant Non dilu 1 10 1 100 Les options suivantes li es aux chantillons de sujets sont galement prises en charge par le logiciel d analyse QFM Non dilu 1 10 1 100 1 10 1 100 Non dilu 1 10 8 Ajouter 50 pl du conjugu concentr pr t l emploi fra chement pr par dans les puits ELISA requis l aide d une pipette multicanaux 9 Ajouter 50 pl d chantillon de plasma de test dans les puits appropri s l aide d une pipette multicanaux Ajouter ensuite 50 pl de chacun des standards 1 4 Tester les standards en double 10 Couvrir chaque microplaque avec un couvercle et m langer le conjugu et les chantillons standards de plasma soigneusement en utilisant un agitateur de microplaque pendant 1 minute viter les projections 11 Incuber temp rature ambiante 22 C 5 C pendant 120 5 minutes Les microplaques ne doivent pas tre expos es la lumi re directe du soleil pendant l incubation 12 Au cours de l incubation diluer 1 mesure du concentr du tampon de lav
11. sanguin R p ter le test ELISA d chantillons de plasma stimul s il semble possible que le test original ait d vi de la proc dure d crite dans cette notice voir la section Contr le qualit du test pour plus d informations Le m decin peut souhaiter r p ter le test si les r sultats ne concordent pas avec le statut clinique actuel du sujet 26 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Limites Les r sultats du test QFM doivent tre utilis s en combinaison avec les ant c dents cliniques le statut m dical actuel et d autres valuations diagnostiques de chaque individu Les laboratoires peuvent choisir d tablir leurs propres intervalles pour le test Les laboratoires peuvent galement choisir d analyser un chantillon de contr le externe pr lev sur un sujet sain parall lement aux chantillons de patients Les r sultats non fiables ou inexacts peuvent survenir dans les cas suivants M Anticoagulant sanguin incorrect utiliser uniquement l h parine de lithium car les autres anticoagulants interf rent avec le test M D viations par rapport la proc dure d crite dans cette notice Niveaux excessifs d IFN y circulant ou pr sence d anticorps h t rophiles M Plus de 8 heures entre le pr l vement de l chantillon sanguin et l incubation 37 C M Remplissage excessif ou insuffisant des tubes de sang QFM en dehors de l intervalle de 0 9 1 1 ml Caract ristiques des performances
12. un second LyoSphere dans le m me tube Remarque le QFM LyoSphere tant blanc il ne sera plus visible dans le sang une fois dissous Important le secouement trop nergique des tubes peut provoquer une perturbation du gel et entra ner des r sultats aberrants 7 la suite de l ajout et de la dissolution du QFM LyoSphere les tubes de pr l vement sanguin QFM doivent tre transf r s dans un incubateur 37 C 1 C d s que possible et dans les 8 heures suivant le pr l vement sanguin ER 16 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Instructions d utilisation tape 1 incubation du sang et pr l vement du plasma Mat riel fourni M Tubes de pr l vement sanguin QFM se r f rer lt Composants et stockage gt page Mat riel n cessaire mais non fourni M Voir lt Mat riel n cessaire mais non fourni gt page 8 Proc dure 1 Incuber les tubes de pr l vement sanguin QFM contenant des aliquots d 1 ml de sang avec le QFM LyoSphere DEBOUT 37 C 1 C de 16 24 heures Remarque l incubateur ne n cessite pas de CO2 ou d humidification Apr s l incubation les tubes de pr l vement sanguin QFM peuvent rester entre 4 C et 27 C jusqu 3 jours avant d tre centrifug s 2 Apr s l incubation le pr l vement du plasma est facilit par la centrifu gation des tubes de pr l vement sanguin pendant 15 minutes de 2 000 3 000 x g FCR Le module de gel s pa
13. 072 3 3 5 5 t tram thylbenzidine Enzyme Stopping Solution solution de blocage d enzyme contient 0 5 M H2SO Notice QuantiFERON Monitor ELISA si reconstitu 1 x 30 ml flacon 1 x 0 3 ml si reconstitu 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1x15ml Contient de l acide sulfurique Voir page 11 pour les pr cautions d emploi Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Mat riel n cessaire mais non fourni Incubateur 37 C CO2 non requis Pipettes volume variable calibr es Pipettes multicanaux calibr es 50 ul et 100 pl avec embouts jetables Agitateur de microplaque Eau d ionis e ou distill e 2 litres Laveur de microplaque laveur automatique recommand Laveur de microplaque quip d un filtre de 450 nm et d un filtre de r f rence de 620 nm 650 nm Cylindre gradu prouvette gradu e Serviette absorbante faible peluchage Stockage et manipulation Tubes de pr l vement sanguin Stocker les tubes de pr l vement sanguin une temp rature comprise entre 4 C et 25 C Les tubes de pr l vement QFM doivent tre une temp rature comprise entre 17 C et 25 C au moment du remplissage et du m lange LyoSpheres Stocker les QFM LyoSpheres entre 2 C et 8 C R actifs de kit ELISA Stocker les r actifs de kit ELISA entre 2 C et 8 C Toujours prot ger la solution de substrat enzymatique de la lumi re directe du soleil S assurer que les instrume
14. 15 Apr s l incubation ajouter 50 pl de solution de blocage d enzyme dans chaque puits et m langer soigneusement l aide d un agitateur de microplaque La solution de blocage d enzyme doit tre ajout e aux puits dans le m me ordre et environ la m me vitesse utilis e lors de l ajout de la solution de substrat enzymatique l tape 13 16 Mesurer la densit optique DO dans les 5 minutes de blocage de la r action l aide d un lecteur de microplaque quip d un filtre 450 nm ainsi que d un filtre de r f rence de 620 nm 650 nm Les valeurs DO sont utilis es pour calculer les r sultats Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 23 Calculs et interpr tation du test Le logiciel d analyse QuantiFERON Monitor permet d analyser les donn es brutes et de calculer les r sultats Il est disponible sur www QuantiFERON com S assurer que la version la plus r cente du logiciel d analyse QuantiFERON Monitor est utilis e Le logiciel effectue une valuation de contr le qualit du test g n re une courbe de standard et fournit un r sultat de test pour chaque sujet comme d taill dans la section Interpr tation des r sultats Si le plasma non dilu d passe la limite sup rieure 10 Ul ml du QFM ELISA le logiciel d analyse QuantiFERON Monitor rapporte la dilution la plus faible g n rant un r sultat compris dans l intervalle du QFM ELISA en prenant en compte le facteur de dilution En al
15. Novembre 2014 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA N 2 x 96 Test de sang total IFN y mesurant les r ponses aux stimulants immunitaires inn s et adaptatifs Version Utilisation pr vue pour le diagnostic in vitro CE 0650 0201 gw QIAGEN 19300 Germantown Road Germantown MD 20874 TATS UNIS QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden ALLEMAGNE 1079024FR R v 01 60060 Ci www QuantiFERON com 66066 QIAGEN www QuantiFERON com Sommaire Utilisation pr vue 4 R sum et explication du test 4 Principes du test 5 Temps requis pour effectuer le test 6 Composants et stockage 6 Mat riel n cessaire mais non fourni 8 Stockage et manipulation 8 Avertissements et pr cautions 10 Avertissements 10 Pr cautions 11 Pr l vement et manipulation des chantillons 13 Instructions d utilisation 17 Calculs et interpr tation du test 24 G n ration de la courbe de standard 24 Contr le qualit du test 25 Interpr tation des r sultats 25 Limites 27 Caract ristiques des performances 27 tudes cliniques 27 Caract ristiques des performances du test 32 Informations techniques 33 chontillons de plasma coagul 33 Guide de d pannage 34 R f rences 37 Symboles 37 Coordonn es 38 R sum de la proc dure du test 39 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 3 Utilisation pr vue Le test QuantiFERON Monitor QFM est un test de diagnostic in vitro destin la d tection de la fonction immunit
16. age 20x avec 19 mesures d eau d ionis e ou distill e et m langer soigneuse ment Une quantit suffisante de concentr de tampon de lavage 20x est fournie pour pr parer 2 litres de tampon de lavage concentr pr t l emploi Laver les puits avec 400 pl de tampon de lavage concentr pr t l emploi pendant au moins 6 cycles dans un laveur de microplaque Un laveur de microplaque automatique est recommand 22 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Il est essentiel de proc der soigneusement au lavage avant d ex cuter le test Veiller ce que chaque puits soit compl tement rempli de tampon de lavage pour chaque cycle de lavage Recommandation faire tremper les puits pendant au moins 5 secondes entre chaque cycle pour un meilleur r sultat Ajouter du d sinfectant de laboratoire standard au r servoir d effluent et suivre les proc dures tablies pour la d contamination de mat riel potentiellement infectieux 13 Placer les microplaques face vers le bas sur une serviette absorbante faible peluchage pour liminer tout r sidu de tampon de lavage Ajouter 100 pl de solution de substrat enzymatique dans chaque puits couvrir chaque microplaque avec un couvercle et m langer soigneusement l aide d un agitateur de microplaque 14 Incuber temp rature ambiante 22 C 5 C pendant 30 minutes Les microplaques ne doivent pas tre expos es la lumi re directe du soleil pendant l incubation
17. aire m diation cellulaire par la mesure de l interf ron gamma DER Al dans le plasma au moyen du dosage d immuno absorption par enzyme li e ELISA enzyme linked immunosorbent assay apr s l incubation de sang total h parinis l aide de stimulants de la r ponse immunitaire inn s et adaptatifs Le test sert d tecter la r ponse immunitaire m diation cellulaire chez les personnes immunod prim es ayant subi une transplantation d organes solides GEM est destin tre utilis en combinaison avec une valuation des risques ainsi que d autres valuations m dicales et diagnostiques R sum et explication du test L immunod ficience est caract ris e par une capacit r duite d velopper efficacement une r ponse immunitaire Cette r ponse compromise ou absente peut r sulter d une immunod ficience primaire ou acquise secondaire 1 Les immunod ficiences primaires sont g n ralement h r ditaires et elles sont caract ris es par des d ficiences de composants distincts du syst me immuni taire adaptatif ou inn 1 N anmoins la plupart des immunod ficiences sont acquises secondaires et peuvent tre induites par des agents pathog nes des m dicaments un traitement immunosuppresseur apr s une transplantation d organes par exemple des tats pathologiques un cancer une leuc mie ou un lymphome par exemple ou par des polluants environnementaux 1 La base mol culaire de l immunod ficie
18. antation d organes solides QFM a t valu dans le cadre d une tude d observotion transversale chez les patients ayant subi une transplantation d organes solides 4 L tude com prenait 212 sujets sains incluant un sous groupe de 30 contr les de m me sexe et de m me ge 30 patients en pr transplantation 18 patients en post transplantation pr coce 66 chantillons dur e m diane post transplan tation 21 jours et 1 1 patients en posttransplantation tardive dur e m diane posttransplantation 2 290 jours La production d IFN y moyenne tait de 555 2 Ul ml chez les contr les sains et de 614 6 Ul ml chez les contr les de m me sexe et de m me ge La production moyenne d IFN y s est r v l e consid rablement moins lev e chez les patients en pr transplantation IFN y 89 3 Ul ml et en post transplantation pr coce IFNN 3 76 Ul ml que chez les contr les de m me sexe et de m me ge p lt 0 001 La restauration de la fonction immunitaire chez les patients en post transplantation tardive IFN y moyen 256 1 Ul ml a t observ e et s est av r e consid rablement sup rieure celle des patients en posttransplantation pr coce p lt 0 05 Cette tude montre que QFM peut tre utilis pour valuer la fonction immunitaire m diation cellulaire chez les personnes immuno d prim es ayant subi une transplantation d organes solides Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 31 C
19. aract ristiques des performances du test Il a t d montr que le test QFM ELISA est lin aire Pour ce faire 5 r plicats de 11 pools de plasma de concentrations IFN y connues ont t plac s de mani re al atoire sur la microplaque ELISA La droite de r gression lin aire pr sente une pente de 1 002 0 011 et un coefficient de corr lation de 0 99 figure La limite de d tection du test QFM ELISA est de 0 05 Ul ml et il n existe aucune preuve d un effet crochet haute dose prozone avec les concentrations d IFN y jusqu 10 000 UI ml 11 1 Niveau d termin d IFN y UI ml 0123456 7 8 9 10 11 Niveau attendu d IFN y UI ml Figure 6 Profil de lin arit du test QFM ELISA d termin partir de l analyse de 5 r plicats de 11 chantillons de plasma de concentrations IEN connues La reproductibilit du test QFM tape 1 a t d termin e l aide d chan tillons sanguins de 20 sujets sains Trois op rateurs lots QFM LyoSphere et ensembles d quipement diff rents ont t valu s Le coefficient moyen de variation des niveaux de r ponse IFN y d termin l aide du test QFM ELISA sur l ensemble des trois lots de QFM LyoSpheres et dans toutes les conditions test es tait de 22 22 IC 95 17 20 27 25 La r p tabilit du test QFM tape 1 a t valu e en mesurant la variabilit de 5 stimulations de sang QFM LyoSphere r p t es partir du m me donneur aupr s
20. chets agr e EN CAS d exposition prouv e ou suspect e consulter un m decin Se procurer les instructions avant utilisation Garder sous clef Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage QuantiFERON Enzyme Stopping Solution A gt Solution de blocage d enzyme QuantiFERON Contient sulfuric acid Danger Provoque des br lures de la peau et des l sions oculaires graves Peut tre corrosif pour les m taux liminer le contenu r cipient dans une installation d limination des d chets agr e EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU ou les cheveux enlever imm diatement les v tements contamin s Rincer la peau l eau se doucher Appeler imm diatement un CENTRE ANTIPOISON ou un m decin Garder sous clef Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage QuantiFERON Enzyme Substrate Solution Solution de substrat enzymatique QuantiFERON Attention Provoque une l g re irritation cutan e En cas d irritation cutan e consulter un m decin Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 11 QuantiFERON Green Diluent Diluant vert QuantiFERON Contient trisodium 5 hydroxy 1 4 sulpho
21. chservice ch qiagen com O O CH UK techservice uk qiagen com QIAGEN www QuantiFERON com
22. du retrait du bouchon du tube de pr l vement sanguin QFM et de l ajout Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 d 1 ml de sang jusqu la marque noire situ e sur le c t de l tiquette du tube Replacer correctement les bouchons des tubes et m langer comme d crit ci dessous 3 Imm diatement apr s avoir rempli les tubes retourner le tube plusieurs fois pour dissoudre l h parine Important le secouement trop nergique des tubes peut provoquer une perturbation du gel et entra ner des r sultats aberrants 4 Juste avant l utilisation amener les QFM LyoSpheres temp rature ambiante 22 C 5 C 5 Dans des conditions d asepsie ajouter un QFM LyoSphere 1 ml de sang D boucher le tube de pr l vement sanguin Tapoter l g rement le flacon GEM LyoSphere sur une surface dure pour s assurer que le QFM LyoSphere est situ au fond du flacon D boucher le flacon QFM LyoSphere en commen ant par retirer la capsule m tallique puis le bouchon de caoutchouc Verser soigneusement le QFM LyoSphere dans l chantillon de sang d 1 ml en alignant le bord du flacon de verre celui du tube de pr l vement sanguin QFM puis retourner le flacon avec pr caution pour transf rer le GEM LyoSphere dans le tube de pr l vement sanguin QFM voir figure 1 Important si le QFM LyoSphere est vers en dehors du tube de pr l ve ment sanguin QFM celui ci doit tre jet et un autre flacon GEM LyoSphere doit
23. e S3 standard 3 0 25 Ul ml et le S4 standard 4 O Ul ml DV seul Les standards doivent tre test s en duplicats Pr parer des dilutions fra ches du standard de kit pour chaque session ELISA Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 19 Proc dure recommand e pour les standards dupliqu s a tiqueter les 4 tubes lt S1 gt lt S2 gt lt S3 gt lt S4 b Ajouter 150 pl de DV S1 S2 S3 et S4 c Ajouter 150 pl du standard du kit S1 et m langer soigneusement d Transf rer 50 pl de S1 S2 et m langer soigneusement e Transf rer 50 pl de S2 S3 et m langer soigneusement f Le Diluant vert DV seul sert de standard z ro S4 kA k sscsczd 150 pl 50 pl 50 pl gt E gt Standard de kit Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 reconstitu 4 0 Ul ml 1 0 Ul ml 0 25 Ul ml O Ul ml diluant vert Figure 2 Pr paration de la courbe de standard 4 Reconstituer le concentr de conjugu 100x lyophilis avec 0 3 ml d eau d ionis e ou distill e M langer doucement pour r duire la formation de mousse et pour garantir une solubilisation compl te du conjugu Le conjugu concentr pr t l emploi est pr par en diluant la quantit requise de concentr de conjugu 100 reconstitu dans le diluant vert tableau 1 Pr paration du conjugu Ramener tout concentr de conjugu 100x non utilis une temp rature comprise entre 2 C et 8 C imm dia
24. e entre 6 6 et 12 3 CV Le CV moyen global IC 95 tait de 8 7 0 7 Le plasma IFN y z ro pr sentait un CV de 26 1 Ce niveau de variation est pr visible car la concentration calcul e d IFN y est faible et la variation pour une estimation de concentration faible est sup rieure celle pour des concentrations plus lev es Informations techniques Echantillons de plasma coagul Si des caillots de fibrine apparaissent avec le stockage long terme des chantillons de plasma centrifuger les chantillons pour s dimenter la mati re coagul e et faciliter le pipetage du plasma Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 33 Guide de d pannage Ce guide de d pannage peut vous aider r soudre les probl mes qui pourraient se poser Pour de plus amples informations voir galement les informations techniques fournies sur www QuantiFERON com Pour les coordonn es voir la quatri me de couverture D pannage ELISA D veloppement de couleur non sp cifique Cause possible Solution a Lavage incomplet de la Laver la microplaque au moins 6 fois avec microplaque 400 pl puits de tampon de lavage Plus de 6 cycles de lavage peuvent tre requis en fonction du laveur utilis Une p riode de trempage d au moins 5 secondes doit tre effectu e entre chaque cycle b Contamination crois e Prendre garde lors du pipetage et du m lange des puits ELISA des chantillons pour r duire les risques c Kit compo
25. ilu est situ au dessus de l intervalle du QFM ELISA 24 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Contr le qualit du test L exactitude des r sultats du test d pend de l exactitude de la g n ration de la courbe de standard Ainsi il convient d examiner les r sultats d riv s des standards avant d interpr ter les r sultats des chantillons du test Pour que le dosage ELISA soit valide M La valeur DO moyenne du standard 1 doit tre gt 0 600 M Le CV des valeurs DO des r plicats du standard 1 et du standard 2 doit tre lt 15 M Les valeurs DO des r plicats pour les standards 3 et 4 ne doivent pas varier de plus de 0 040 unit de densit optique par rapport leur moyenne M le coefficient de corr lation r calcul partir des valeurs d absorbance moyennes des standards doit tre gt 0 98 Le logiciel d analyse QuantiFERON Monitor calcule et rapporte ces param tres de contr le qualit Si les crit res ci dessus ne sont pas respect s l analyse est invalide et doit tre r p t e La valeur DO moyenne du standard z ro diluont vert doit tre lt 0 150 Si la valeur DO moyenne est gt 0 150 la proc dure de lavage de microplaque doit tre examin e Interpr tation des r sultats Les r sultats QFM sont interpr t s selon la r ponse IER a aux stimulants immunitaires inn s et adaptatifs Le test QFM offre une mesure qualitative et quantitative de la fonction immunitaire l
26. it QuantiFERON Monitor En utilisant ce produit l acheteur ou l utilisateur accepte les conditions suivantes 1 Le produit ne doit tre utilis que conform ment aux protocoles fournis et ce manuel et uniquement avec les composants contenus dans ce kit QIAGEN n accorde aucune licence sous sa propri t intellectuelle pour utiliser ou int grer les composants fournis dans ce kit avec tout autre composant non fourni dans ce kit l exception de ce qui est stipul dans les protocoles fournis avec le produit dans ce manuel et dans d autres protocoles disponibles sur le site www qiagen com Parmi ces protocoles suppl mentaires certains ont t fournis par des utilisateurs QIAGEN pour des utilisateurs QIAGEN Ces protocoles n ont pas t rigoureusement test s ou optimis s par QIAGEN QIAGEN ne saurait tre tenu responsable de leur utilisation et n offre aucune garantie que ces protocoles ne portent pas atteinte aux droits de tiers En dehors des licences nonc es express ment QIAGEN n offre aucune garantie indiquant que ce kit et ou son ou ses utilisations ne violent pas les droits de tiers Ce kit et ses composants sont sous licence pour une utilisation unique et ne peuvent pas tre r utilis s remis neuf ou revendus QIAGEN rejette notamment toutes les autres licences expresses ou tacites autres que celles nonc es express ment L acheteur et l utilisateur du kit consentent ne pas prendre ni autoriser quiconque
27. la seringue en respectant les proc dures de s curit ad quates retirer le bouchon du tube de pr l vement sanguin QFM et ajouter 1 ml de sang jusqu au centre du marquage noir situ sur le c t de l tiquette du tube Replacer correctement le bouchon et m langer comme d crit ci dessous En cas d utilisation d un garrot celui ci doit tre desserr d s que l aiguille p n tre dans la veine pour viter les variations de pression qui pourraient affecter le volume de sang Le sang peut aussi tre pr lev dans un tube de pr l vement sanguin g n rique contenant de l h parine de lithium comme anticoagulant avant d tre transf r dans un tube de pr l vement sanguin GEM Utiliser uniquement l h parine de lithium comme anticoagulant car les autres anticoagulants interf rent avec le test Remplir un tube de pr l vement sanguin volume minimal 3 ml et m langer doucement en retournant le tube plusieurs fois pour dissoudre l h parine Maintenir le sang temp rature ambiante 22 C 5 C avant de le transf rer dans les tubes de pr l ve ment sanguin QFM pour une stimulation l aide d un QFM LyoSphere S assurer que le sang est bien m lang en retournant doucement le tube juste avant de r partir les chantillons Distribuer un aliquot d 1 ml de sang dans un tube de pr l vement sanguin QFM R aliser la distribution dans des conditions d asepsie en respectant les proc dures de s curit ad quates lors
28. n unit s internationales par ml Ul ml est mesur e par ELISA et compar e un intervalle de valeurs attendues pour d finir la r ponse immunitaire du sujet QFM est un test offrant une mesure qualitative et quantitative de la fonction immunitaire l se peut que les r sultats de QFM ne quantifient pas directement le niveau d immunod pression La quantit d IFN y dans les chantillons de plasma peut souvent d passer les limites sup rieures de la plupart des lecteurs ELISA m me lorsque les individus sont moyennement immunod prim s Il est recommand de diluer les chan tilons de plasma au 1 pour 10 et ou au 1 pour 100 dans le diluant vert et de r aliser un test ELISA l aide de plasma non dilu Remarque le seuil du test QFM peut varier selon le niveau d immuno d pression du sujet et les param tres de transplantation individuels Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 5 Voir lt Interpr tation des r sultats gt la page 25 de cette notice pour obtenir un aper u de l interpr tation des r sultats QFM Temps requis pour effectuer le test Le temps requis pour effectuer le test QFM est estim ci dessous Le temps requis pour tester plusieurs chantillons en lots est aussi indiqu Incubation 37 C des tubes de sang 16 24 heures ELISA Environ 3 heures pour une microplaque ELISA jusqu 88 chantillons lt heure de travail Ajouter 10 15 minutes pour chaque microplaque
29. nce est vari e Toutefois l immunit m diation cellulaire joue un r le cl dans l induction de nombreuses manifestations cliniques observ es Actuellement le diagnostic et la gestion des syndromes d immunod ficience d pendent de l agent responsable 2 3 Par exemple la gestion ad hoc repr sente la norme dans le cadre du suivi du statut de l immunod ficience cellulaire des sujets ayant subi une transplantation d organes solides et suivant un traitement m dicamenteux immunosuppresseur Le statut de la r ponse immunitaire du sujet est g n ralement mesur gr ce au suivi des taux de m dicaments pharmacologiques et l valuation clinique pathologique du fonctionnement de la greffe 2 3 Un certain nombre de tests du fonctionnement des lymphocytes T mesurent l immunit m diation cellulaire aux mitog nes tels que la phytoh magglutinine PHA le mitog ne de la phytolaque et la concanavaline A ConA Cependant ces derniers mesurent uniquement la capacit fonctionnelle des lymphocytes T et constituent un sous ensemble des cellules impliqu es dans l immunit 4 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 m diation cellulaire l est de plus en plus vident que les m canismes immuni taires inn s contribuent fortement la d fense de l h te que ce soit en agissant seuls ou en am liorant les r ponses des lymphocytes T sp cifiques Par cons quent les r ponses fonctionnelles des cellules immunitai
30. nts ont t v rifi s et calibr s conform ment aux recommandations du fabricant 8 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 R actifs ELISA reconstitu s et inutilis s Pour obtenir des instructions sur la reconstitution des r actifs ELISA voir lt Etape 2 IFN y ELISA gt la page 18 Le standard de kit reconstitu peut tre conserv jusqu 3 mois s il est stock entre 2 C et 8 C Noter la date laquelle le standard de kit a t reconstitu Une fois reconstitu le concentr de conjugu 100 inutilis doit tre stock entre 2 C et 8 C et utilis dans les 3 mois Noter la date laquelle le conjugu a t reconstitu Le conjugu concentr pr t l emploi doit tre utilis dans les 6 heures suivant sa pr paration voir tableau 1 Le tampon de lavage concentr pr t l emploi peut tre stock temp rature ambiante 22 C 5 C jusqu 2 semaines Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 9 Avertissements et pr cautions Utilisation pr vue pour le diagnostic in vitro Lors de la manipulation des produits chimiques toujours porter une blouse de laboratoire des gants jetables et des lunettes de protection ad quats Pour plus d informations consulter les fiches de donn es de s curit FDS appropri es Celles ci sont disponibles en ligne dans un format PDF pratique et compact sur le site www qiagen com safety r pertoriant les FDS imprimables pour
31. ost transplantation tardive les r ponses comprises dans l intervalle de r ponses faibles taient de 25 et celles comprises dans l intervalle de r ponses mod r es de 66 7 tableau 3 Aucune r ponse de la cohorte de post transplantation pr coce ne figurait dans l intervalle de r ponses lev es et seulement 1 8 3 r ponse parmi les chantillons de la cohorte de posttransplantation tardive figurait dans l intervalle de r ponses lev es Les r ponses QFM de la cohorte d individus apparemment sains figuraient principalement dans l intervalle de r ponses mod r es 83 3 et dans l intervalle de r ponses lev es 15 8 tableau 3 Tableau 3 Intervalle de r ponse QFM chez les sujets apparemment sains en comparaison des receveurs de greffe IFN y Cat gorie post x postTx sujets R sultats UI mIl de r sultats pr coce tardive apparem totaux ICa95 IC 95 ment sains n n IC 95 n lt 15 Faible 93 8 25 0 0 9 64 85 0 97 5 8 9 53 2 0 2 4 8 n 60 n 3 n 15 1000 Mod r e 6 3 66 7 83 3 107 2 5 15 0 39 1 86 2 75 4 89 1 n 4 n 8 n 95 gt 1000 lev e 0 0 8 3 15 8 19 0 5 7 1 5 35 4 10 2 23 6 n 0 n 1 n 18 chantillons 64 12 114 190 totaux Les pourcentages indiquent la proportion des chantillons au sein de chaque cohorte de donneurs compris dans l intervalle de r ponse particulier pu s S E S Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 28 11 2014 Valeur
32. phenyl 4 4 sulphophenylazo pyrazole 3 carboxylate Attention Peut provoquer une allergie cutan e liminer le contenu r cipient dans une installation d limination des d chets agr e Enlever les v tements contamin s et les laver avant r utilisation En cas d irritation ou d ruption cutan e consulter un m decin Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage QuantiFERON IFN y Standard Standard IFN y QuantiFERON Contient boric acid Danger Peut nuire la fertilit ou au foetus liminer le contenu r cipient dans une installation d limination des d chets agr e EN CAS d exposition prouv e ou suspect e consulter un m decin Se procurer les instructions avant utilisation Garder sous clef Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage QuantiFERON Wash Buffer 20x Concentrate Concentr de tampon de lavage 20x QuantiFERON Contient Mixture of 5 Chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one and 2 Methyl 2H isothiazol 3 one 3 1 Attention Peut provoquer une allergie cutan e Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage Autres informations Fiches de donn es de s curit www qiagen com safety Tout cart par rapport la notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA peut entra ner des r sultats erron s Lire attenti
33. prendre de quelconques mesures pouvant entra ner ou faciliter la r alisation d actes interdits par les conditions pr c dentes QIAGEN peut faire appliquer les interdictions de cet Accord de licence limit e par tout tribunal et pourra recouvrir tous ses frais de recherche et de justice y compris les frais d avocats en cas d action en application de cet Accord de licence limit e ou de tous ses droits de propri t intellectuelle li s au kit et ou ses composants Pour consulter les mises jour de la licence voir le site www giagen com 2014 GIAGEN tous droits r serv s www qiagen com Australia techservice qu qiogen com Austria techservice at qiagen com Belgium techservice bnl qiagen com Brazil suportetecnico brasil qiagen com Canada techservice ca qiagen com China techservice cn qiagen com Denmark techservice nordic qiagen com Finland techservice nordic qiagen com France techservicefr qiagen com Germany techservice de qiagen com Hong Kong techservice hk qiagen com India techservice india qiagen com Ireland techservice uk qiagen com Italy techservice it giagen com Japan techservice p qiagen com Korea South techservice kr qiagen com Luxembourg techservice bnl qiagen com Mexico techservice mx qiagen com The Netherlands techservice bnl qiagen com Norway s techservice nordic qiagen com Singapore techservice sg qiagen com Sweden s techservice nordic qiagen com Switzerland te
34. ration S assurer que l quipement de laboratoire a t calibr valid pour utilisation Pr l vement et manipulation des chantillons Le test QFM doit tre effectu uniquement l aide de sang total pr lev dans un tube de pr l vement sanguin contenant de l h parine de lithium ou directement dans un tube de pr l vement sanguin QFM 1 ml de sang total est requis par test Les tubes de pr l vement sanguin doivent tre tiquet s de mani re appropri e et l heure du pr l vement sanguin doit tre indiqu e Important la stimulation des chantillons sanguins QFM p ex l ajout d un GEM LyoSphere un aliquot sanguin d 1 ml et leur incubation ult rieure 37 C doivent avoir lieu dans les 8 heures suivant le pr l vement sanguin Avant l incubation maintenir les chantillons sanguins temp rature ambiante 22 C 5 C Pour des r sultats optimaux respecter les proc dures suivantes 1 tiqueter correctement les tubes S assurer que le tube de pr l vement sanguin QFM est tiquet de mani re appropri e savoir qu il pr sente les informations sur le sujet et l heure du pr l vement sanguin 2 Pour chaque sujet pr lever 1 ml de sang par ponction veineuse directement dans un tube de pr l vement sanguin QFM Cette proc dure doit tre effectu e par un phl botomiste exp riment Remarque importante les tubes doivent tre une temp rature comprise entre 17 C et 25 C a
35. re de La microplaque doit tre lue 450 nm avec un lecteur de microplaque filtre de r f rence de 620 650 nm utilis H Les r actifs sont trop Tous les r actifs l exception du concentr froids de conjugu 100x doivent tre amen s temp rature ambiante avant le d but du test ce qui prend environ une heure g Kit composants S assurer que le kit est utilis avant la date de p rim s p remption S assurer que le standard reconstitu et le concentr de conjugu 100 sont utilis s dans les 3 mois suivant la date de reconstitution Bruit de fond lev Cause possible Solution a Lavage incomplet de Laver la microplaque au moins 6 fois avec la microplaque 400 pl puits de tampon de lavage Plus de 6 cycles de lavage peuvent tre requis en fonction du laveur utilis Une p riode de trempage d au moins 5 secondes doit tre effectu e entre chaque cycle b Temp rature L incubation d EUSA doit tre effectu e d incubation trop temp rature ambiante de 17 C 27 C lev e Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 35 D pannoge ELISA c Kit composants S assurer que le kit est utilis avant la date de p rim s p remption S assurer que le standard reconstitu et le concentr de conjugu 100 sont utilis s dans les trois mois suivant la date de reconstitution d Solution de substrat Rejeter le substrat en cas de coloration bleue enzymatique S assurer que les r servoirs de r ac
36. rera les cellules du plasma Si cela ne se produit pas recentrifuger les tubes Il est possible de pr lever le plasma sans centrifugation mais il faudra faire particuli rement attention le retirer sans perturber les cellules 3 Les chantillons de plasma doivent tre pr lev s uniquement l aide d une pipette Important apr s la centrifugation viter le pipetage r p t ou le m lange du plasma par d autres moyens avant de le pr lever Prendre garde ne pas perturber la mati re sur la surface du gel quelle que soit l tape Les chantillons de plasma peuvent tre charg s directement depuis les tubes de pr l vement sanguin QFM centrifug s vers la microplaque GEM ELISA y compris lorsque des stations de travail ELISA automatiques sont utilis es Les chantillons de plasma peuvent tre stock s jusqu 28 jours entre 2 C et 8 C ou s ils sont pr lev s au dessous de 20 C pendant des p riodes prolong es Les aliquots des chantillons de plasma pr lev s doivent tre scell s avant d tre stock s Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 17 En cas de pr l vement d chantillons de plasma pr lever au moins 150 yl de plasma pour permettre une r p tition des tests si n cessaire La quantit d IFN y dans les chantillons de plasma peut souvent d passer les limites sup rieures de la plupart des lecteurs ELISA m me lorsque les individus sont moyennement immunod prim s l es
37. res inn es lymphocytes NNK et adaptatives lymphocytes T forment une analyse plus compl te de l immunit m diation cellulaire 2 3 QFM est un test de diagnostic in vitro utilisant une combinaison de stimulants sous la forme d un culot LyoSphere qui stimule sp cifiquement diff rents types de cellules impliqu es dans les syst mes immunitaires inn s et adaptatifs On mesure le statut immunitaire fonctionnel d un sujet en mesurant la r ponse la stimulation du syst me immunitaire inn et adaptatif l aide d agonistes de r cepteurs de type Toll TLR et de r cepteurs des cellules T TCR respecti vement La d tection d interf ron gamma IFIN y par ELISA offre une mesure qualitative et quantitative de la fonction immunitaire m diation cellulaire Principes du test Le test QFM utilise des stimulants lyophilis s QFM LyoSpheres qui sont ajout s au sang total h parinis L incubation du sang dure 16 24 heures avant le pr l vement de plasma et la recherche d IFN y produit en r ponse aux stimulants Le test QFM s effectue par tapes Tout d abord le sang total est pr lev dans le tube de pr l vement sanguin QFM Puis un QFM LyoSphere est ajout au tube qui sera ensuite incub 37 C d s que possible et dans les 8 heures suivant le pr l vement la suite d une p riode d incubation de 16 24 heures les tubes sont centrifug s le plasma est retir et la quantit d IFN y report e e
38. s attendues La r partition des r ponses IFN y QFM chez les patients en posttransplan tation pr coce jusqu 3 mois apr s la transplantation a t d termin e partir de 64 chantillons pr lev s partir de 18 receveurs de greffe au moyen du test QFM ELISA figure 3 Nombre d chantillons 40 30 20 10 0 Ee By 2 a P IFN y IU ml Figure 3 R partition des r ponses IFN y QFM chez les patients en post transplantation pr coce n 64 m diane 1 5 UI ml La r partition des r ponses IFN y QFM chez les patients en post transplan tation tardive gt 12 mois apr s la transplantation a t d termin e partir de 12 chantillons au moyen du test QFM ELISA Figure 4 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 29 Nombre d chantillons O NS G E On Oo IFNy IU ml Figure 4 R partition des r ponses IFN y QFM chez les patients en post transplantation tardive n 12 m diane 98 8 Ul ml La r partition des r ponses IFN y QuantiFERON Monitor chez les sujets apparemment sains a t d termin e partir de 114 chantillons au moyen du test QFM ELISA figure 5 Nombre d chantillons 40 ch 30 20 10 IFN y IU ml Figure 5 R partition des r ponses IFN QFM chez les sujets apparemment sains n 114 m diane 400 5 UI ml 30 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 R ponses QFM chez les patients ayant subi une transpl
39. sants S assurer que le kit est utilis avant la date de p rim s p remption S assurer que le standard reconstitu et le concentr de conjugu 100 sont utilis s dans les 3 mois suivant la date de reconstitution d Solution de substrat Rejeter le substrat en cas de coloration bleue enzymatique S assurer que les r servoirs de r actif sont contamin e propres e M lange du plasma Apr s la centrifugation viter le pipetage r p t dans les tubes QFM ou le m lange du plasma par d autres moyens avant le pr l vement avant de le pr lever Prendre garde ne pas perturber la mati re sur la surface du gel quelle que soit l tape Lectures de faible densit optique pour les standards Cause possible Solution a Erreur de dilution du S assurer que les dilutions du standard de kit sont standard pr par es correctement conform ment la pr sente notice 34 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 D pannoge ELISA b Erreur de pipetage S assurer que les pipettes sont calibr es et utilis es conform ment aux instructions du fabricant c Temp rature L incubation d ELISA doit tre effectu e d incubation trop faible temp rature ambiante de 17 C 27 C d P riode d incubation Incuber la microplaque avec le conjugu les trop courte standards et les chantillons pendant 120 5 minutes Incuber la solution de substrat enzymatique sur la microplaque pendant 30 minutes e Mauvais filt
40. suppl mentaire Composants et stockage QuantiFERON Monitor LyoSpheres N de r f rence 0650 0701 Nombre de pr parations 10 QuantiFERON Monitor LyoSpheres 10 flacons Notice QuantiFERON Monitor LyoSpheres 1 Tubes de pr l vement sanguin QuantiFERON Monitor N de r f rence 0650 0101 Nombre de pr parations 100 Tubes de pr l vement sanguin QuantiFERON Monitor 100 tubes bouchon blanc anneau blanc Notice des tubes de pr l vement QuantiFERON Monitor 1 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Composants du kit 2 plaques ELISA QuantiFERON Monitor Kit 2 plaques ELISA N de r f rence 0650 0201 Bandelettes pour microplaques 12 x 8 puits 2 jeux enduites d anticorps monoclonaux IFN y murins anti de bandelettes humains pour microplaques 12 x 8 puits IFN y Standard lyophilized 1 x flacon standard IFN y lyophilis contient de l IFN y humain 8 UI ml recombinant de la cas ine bovine du thim rosal 0 01 m v Green Diluent diluant vert contient de la cas ine bovine du s rum normal de souris du thim rosal 0 01 m v Conjugate 100x Concentrate lyophilized concentr de conjugu 100x lyophilis IFN y HRP murin anti humain contient du thim rosal 0 01 m v Wash Buffer 20x Concentrate concentr de tampon de lavage 20x pH 7 2 contient du ProClin 300 0 05 v v Enzyme Substrate Solution solution de substrat enzymatique contient du H2
41. t recommand de diluer les chantillons de plasma au 1 10 et ou au 1 100 dans le diluant vert et de r aliser un test ELISA l aide de plasma non dilu voir tape 2 IFN y ELISA tape 2 IFN y ELISA Mat riel fourni M Composants du kit 2 plaques ELISA QuantiFERON Monitor se r f rer lt Composants et stockage gt page Mat riel n cessaire mais non fourni M Voir lt Mat riel n cessaire mais non fourni gt page 8 Pr paration L IFN y dans le plasma peut souvent d passer les limites sup rieures de la plupart des lecteurs ELISA m me lorsque les individus sont moyennement immunod prim s Recommandation diluer les chantillons de plasma au 1 10 et ou ou 1 100 dans le diluant vert et r aliser un test ELISA l aide de plasma non dilu Si le patient est gravement immunod prim la pr paration et le test d un seul chantillon de plasma non dilu peut suffire obtenir un r sultat quantitatif Remarque les r sultats des chantillons se trouvant dans l intervalle du QFM ELISA jusqu 10 Ul ml doivent tre utilis s pour l interpr tation des r sultats La dilution la plus faible g n rant un r sultat compris dans l intervalle du QFM ELISA doit tre utilis e en tant que r sultat report en prenant en compte le facteur de dilution si le plasma non dilu est situ au dessus de l intervalle du QFM ELISA 18 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Proc dure
42. tement apr s emploi Utiliser uniquement du diluant vert 20 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA Tableau 1 Pr paration du conjugu de conjugu 100x Nombre de bandelettes Volume du concentr Volume de diluant vert 10 pl 15 pl 20 yl 25 yl 30 pl 35 yl 40 pl 45 yl 50 pl 55 pl 60 yl O OO d O O RA O N N RN 1 0 ml 1 5 ml 2 0 ml 2 5 ml 3 0 ml 3 5 ml 4 0 ml 4 5 ml 5 0 ml 5 5 ml 6 0 ml 5 Pour les chantillons de plasma pr lev s dans les tubes de pr l vement sanguin puis stock s ou congel s m langer les chantillons avant de les ajouter au puits ELISA Important si les chantillons de plasma sont ajout s directement depuis les tubes QFM centrifug s tout m lange du plasma doit tre vit Prendre garde ne pas perturber la mati re sur la surface du gel quelle que soit l tape 6 Recommandation diluer les chantillons de plasma au 1 10 Ajouter 90 pl de diluant vert DV dans un tube dont l tiquette pr sente les informations sur le patient et 1 10 Ajouter ensuite 10 pl des chantillons de plasma m lang s voir l tape 5 pour distinguer les chantillons de plasma m lang s de ceux ajout s directement partir de tubes QFM centrifug s M langer soigneusement l aide d une pipette pour r duire la formation de mousse Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 21 7 Recommandation diluer les chantillons de
43. ternative l utilisation du logiciel d analyse QuantiFERON Monitor les r sultats peuvent aussi tre d termin s selon la m thode suivante G n ration de la courbe de standard si le logiciel d analyse QuantiFERON Monitor n est pas utilis D terminer les valeurs DO moyennes des r plicats du standard du kit sur chaque microplaque Construire une courbe de standard logie logie en tra ant le logie de la DO moyenne axe y par rapport au log de la concentration IFN des standards en Ul ml axe x en omettant le standard z ro dans ces calculs Calculer la ligne de meilleur ajustement pour la courbe de standard par analyse de r gression Utiliser la courbe de standard pour d terminer la concentration IFN y UI ml de chacun des chantillons de plasma de test l aide de la valeur DO de chaque chantillon Ces calculs peuvent tre effectu s l aide des packs logiciels disponibles avec p p g p les lecteurs de microplaque ainsi qu avec les tableurs standards ou logiciels p aq q g statistiques comme Microsoft Excel l est recommand d utiliser ces logiciels pour calculer l analyse de r gression le coefficient de variation CV pour les standards ainsi que le coefficient de corr lation r de la courbe de standard Le r sultat rapport doit provenir de la dilution la plus faible g n rant un r sultat compris dans l intervalle du QFM ELISA en prenant en compte le facteur de dilution si le plasma non d
44. tif sont contamin e propres Courbe de standard non lin aire et variabilit des duplicats Cause possible Solution a Lavage incomplet de la Laver la microplaque au moins 6 fois avec microplaque 400 pl puits de tampon de lavage Plus de 6 cycles de lavage peuvent tre requis en fonction du laveur utilis Une p riode de trempage d au moins 5 secondes doit tre effectu e entre chaque cycle b Erreur de dilution du S assurer que les dilutions du standard sont standard pr par es correctement conform ment la pr sente notice c M lange insuffisant M langer soigneusement les r actifs par inversion ou en les vortexant doucement avant de les ajouter la microplaque d Technique de pipetage L ajout des chantillons et des standards doit tre incoh rente ou effectu de mani re continue Tous les r actifs interruption pendant la doivent tre pr par s avant le d but du test mise en place du test Les informations produit et les guides techniques sont disponibles gratuitement aupr s de QIAGEN via votre distributeur ou sur le site www QuantiFERON com 36 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 R f rences Une liste compl te de r f rences QFM est disponible sur Gnowee la biblioth que de r f rence QuantiFERON accessible sur www gnowee net 1 Abbas A K Lichtman A H and Pillai S 2012 Cellular and Molecular Immunology 7 ed Philadelphia Elsevier Sanders 2 Fern ndez Ruiz M
45. u moment du remplissage Les tubes de pr l vement sanguin QFM peuvent tre utilis s une altitude maximale de 810 m tres au dessus du niveau de la mer Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 13 Comme le pr l vement sanguin pour des tubes d 1 ml est relativement lent conserver le tube sur l aiguille pendant 2 3 secondes une fois qu il semble s tre rempli la hauteur souhait e Cela permet de s assurer que le bon volume est pr lev La marque noire situ e sur le c t des tubes de pr l vement sanguin QFM indique un volume de remplissage 1 ml Les tubes de pr l vement sanguin QFM sont fabriqu s pour aspirer 1 ml 10 et leurs performances sont optimales dans cet intervalle Si le niveau de sang obtenu d passe les limites d finies par la ligne d indication un nouvel chantillon sanguin doit tre pr lev Si une aiguille papillon est utilis e pour le pr l vement sanguin utiliser un tube de purge pour veiller ce que la tubulure soit remplie de sang avant que les tubes de pr l vement sanguin QFM ne soient employ s Dans le cas d une utilisation des tubes de pr l vement sanguin QFM une altitude sup rieure 810 m tres ou si le volume de sang est trop faible pr lever le sang l aide d une seringue avant d en transf rer imm diate ment 1 ml dans le tube de pr l vement sanguin QFM Pour des raisons de s curit la meilleure m thode consiste retirer l aiguille de
46. vement les instructions avant toute utilisation Inspecter les flacons QFM LyoSphere avant de les utiliser Ne pas utiliser le LyoSphere si le flacon pr sente des signes d endommagement ou que l tanch it du joint en caoutchouc a t affect e Manipuler soigneusement les flacons cass s et prendre les pr cautions de s curit n cessaires pour les liminer en toute s curit Afin de r duire le risque de blessures caus es par les capsules m talliques pr sentes sur les couvercles QFM LyoSphere utiliser une pince dessertir pour ouvrir les flacons Ne pas utiliser le kit ELISA si un flacon de r actif pr sente des signes d endommagement ou de fuite avant son utilisation 12 Notice QuantiFERON Monitor QFM ELISA 11 2014 Ne pas m langer ou utiliser les bandelettes pour microplaque le standard IFN y le diluant vert ou le concentr conjugu 100x de diff rents lots de kit QFM ELISA Les autres r actifs concentr de tampon de lavage 20x solution de substrat enzymatique et solution de blocage d enzyme peuvent tre interchang s entre les kits si les r actifs ne sont pas p rim s et que les d tails du lot sont enregistr s liminer les r actifs inutilis s et chantillons biologiques conform ment aux r glementations s curitaires et environnementales en vigueur au niveau local et national Ne pas utiliser les tubes de pr l vement sanguin QFM les QFM LyoSpheres ou le QFM ELISA apr s la date d expi
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