Amersham™ ECL Select™ Réactif de détection pour transfert de
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1. V rifiez l absence de r actif de d tection libre dans la cassette le film ne doit pas tre mouill Cette tape doit tre r alis e dans une pi ce sombre l aide de lampes inactiniques rouges Ne pas d placer le film pendant l exposition 8 Informations suppl mentaires 8 1 D collement et r hybridation des membranes L limination compl te des anticorps primaire et secondaire de la membrane est possible en suivant le protocole indiqu ci dessous Les membranes peuvent tre d coll es et r hybrid es plusieurs reprises tape Action Remarques 1 Placez la membrane dans Si des conditions plus exigeantes le tampon de d collement sont n cessaires l incubation 2 mercapto thanol 100 mM peut tre r alis e 70 C ou SDS 2 Tris HCI 62 5 mM pendant une dur e prolong e pH 6 7 et incubez 50 C pendant 30 minutes avec une agitation ponctuelle 2 Lavez la membrane Les membranes peuvent tre pendant 3 x 10 minutes incub es avec le r actif de dans du PBS T ou du TBS T d tection Amersham ECL Select temp rature ambiante et expos es au film afin de avec de grands volumes s assurer de l limination des de tampon de lavage anticorps La membrane peut tre utilis e imm diatement ou conserv e dans du PBS T ou du TBS T entre 2 et 8 C 3 Bloquez la membrane dans une solution de saturation convenable pendant 1 heure temp rature ambiante 4 R p tez le protocole d2. 9068 38 ECL 8x10 po 10 11 Syst mes d imagerie Produit Quantit N de code ImageQuant LAS 500 1 29 0050 63 10 12 Logiciel et accessoires Produit Quantit N de code CD et Guide de d marrage Progiciels ImageQuant TL et IQTL SecuriTy avec 28 9380 94 Guide de d marrage Licences pour ImageQuant TL uniquement ImageQuant TL licence ia 28 9236 62 utilisateur unique Licences pour ImageQuant TL et IQTL SecurlTy ImageQuant TL et HA ImageQuant TL SecuriTy 1 utilisateur 28 9332 73 35 29 0142 86 AB 01 2014 GE Healthcare offices GE Healthcare Bio Sciences AB Bj rkgatan 30 751 84 Uppsala Sweden GE Healthcare Europe GmbH Munzinger Strasse 5 D 79111 Freiburg Germany GE Healthcare Bio Sciences Corp 800 Centennial Avenue PO Box 1327 Piscataway NJ 08855 1327 USA GE Healthcare Japan Corporation Sanken Bldg 3 25 1 Hyakunincho Shinjuku ku Tokyo 169 0073 Japon Pour obtenir des informations sur les personnes contacter en cas de besoin consultez le site www gelifesciences com contact GE Healthcare UK Limited Amersham Place Little Chalfont Buckinghamshire HP7 9NA UK http www gelifesciences com imagination at work 29 0142 86FR AB 01 2014
3. R actifs de saturation Les r actifs de saturation sont en g n ral dilu s de 2 5 v v dans un tampon PBS T ou TBS T Les r actifs de saturation suivants sont recommand s e Amersham ECL Prime Agent de saturation e Amersham ECL Agent de saturation e Extrait sec d graiss de lait e Albumine s rique bovine BSA 29 0142 86 AB 01 2014 5 5 R actifs d immunod tection e Anticorps primaire sp cifique de la des prot inel s cible s e Anticorps secondaire conjugu la HRP sp cifique de l anticorps primaire Voir les anticorps secondaires li s la HRP pour ECL en page 33 Diluez les anticorps dans du PBS T ou du TBS T selon les recommandations de Gammes de dilution en page 22 6 Optimisation du transfert de type Western Introduction Pour obtenir des r sultats optimaux lors d un transfert de type Western avec un un rapport signal bruit lev et la meilleure sensibilit et lin arit possible il est important d optimiser la m thode et de s lectionner les produits compatibles Consid rez les l ments suivants e Qualit de l chantillon et quantit en chargement est important que l chantillon soit de bonne qualit et que des niveaux d tectables de la prot ine cible soient pr sents e Membrane et saturation S lectionnez des membranes et des agents de saturation compatibles avec l chantillon et les anticorps e Anticorps primaire et secondaire S lectionnez toujours des ant
4. dans une solution de saturation pour emp cher la liaison non sp cifique d anticorps susceptible tre responsable de l apparition d un arri re plan et de bandes non sp cifiques sur le buvard L agent de saturation doit tre optimis pour obtenir les meilleurs r sultats aucun agent de saturation seul ne peut tre optimal pour toutes les prot ines et tous les anticorps GE Healthcare recommande les agents de saturation suivants compatibles avec Amersham ECL Amersham ECL Prime et Amersham ECL Select e Amersham ECL Prime Agent de saturation e Amersham ECL Agent de saturation e Agent de saturation BSA e Extrait sec d graiss de lait 12 29 0142 86 AB 01 2014 6 5 Imageurs et films Les syst mes ImageQuant LAS sont des syst mes flexibles qui couvrent une vaste gamme d applications d imagerie Ces imageurs bas s sur des CCD constituent une option abordable pour la d tection des prot ines avec de v ritables avantages en mati re de quantification haute sensibilit donn es pr tes la publication et archivage des donn es ImageQuant LAS 500 La gamme de produits Amersham Hyperfilm est constitu e de produits faibles pour une d tection par chimiluminescence sensible et qualitative lors des transferts de type Western 6 6 Manuel du transfert de type Western Vous trouverez plus d aide technique de conseils et de bonnes pratiques dans le manuel Principes et m thodes du transfert de type Western de GE He
5. des quantit s moindres de prot ine Diluez plus les anticorps primaire et secondaire Arri re plan tachet irr gulier e Les zones de taches peuvent avoir s ch pendant certaines incubations e Une manipulation incorrecte peut conduire la contamination des taches et ou endommager la membrane ce qui peut provoquer un signal non sp cifique e L agent de saturation n est pas compl tement dissous dans le tampon e Lavage insuffisant Ajoutez des tapes de lavage suppl mentaires 29 0142 86 AB 01 2014 26 Probl mes Causes possibles Solutions Arri re plans importants e Concentrations trop lev es d anticorps primaire et secondaire une optimisation est n cessaire e Lavage insuffisant Utilisez une quantit suffisante de tampon de lavage et ajoutez des tapes de lavage suppl mentaires e Les tampons de transfert et d incubation peuvent avoir t contamin s et doivent tre remplac s Utilisez toujours des solutions fra ches e Saturation insuffisante L agent de saturation utilis n tait pas ra chement pr par ou tait trop dilu ou tait incompatible avec l application La concentration en Tween utilis e dans agent de saturation n tait pas suffisante pour application r alis e La membrane a pu s cher pendant certaines des incubations auvaise qualit du gel Anticorps non sp cifiques et de mauvaise qualit Le
6. l activit du r actif de d tection dans une chambre noire pr parez 1 2 ml de solution de travail du r actif de d tection dans un tube essai transparent Ajoutez 1 yul de solution d anticorps conjugu la HRP non dilu e La solution doit mettre imm diatement une lumi re visible bleue qui s att nue au cours des minutes suivantes e Une conservation incorrecte du r actif de d tection Amersham ECL Select peut causer une perte du signal Une croissance bact rienne inhibe le r actif 25 29 0142 86 AB 01 2014 Probl mes Causes possibles Solutions Signal e L efficacit du transfert peut avoir t mauvaise faible e Une quantit insuffisante de prot ine a t charg e sur le gel e La concentration des anticorps primaire et secondaires peut tre trop faible une optimisation est n cessaire e Anticorps primaire de mauvaise qualit et ou non sp cifique e La dur e d exposition peut avoir t trop courte Signal e Une quantit trop importante de prot ine a t excessif charg e sur le gel diffus e La concentration des anticorps primaire et secondaires peut tre trop lev e une optimisation est n cessaire Bandes e En g n ral des bandes n gatives se produisent blanches quand la cible prot ique est en quantit excessive n gatives et que les concentrations en anticorps sont trop sur le film lev es Cet effet est d une d pl tion du substrat Chargez
7. lt O N 0 mission N O lumineuse luminol endoperoxyde 29 0142 86 AB 01 2014 2 2 Conception et caract ristiques Le r actif de d tection Amersham ECL Select est con u pour fournir une mission lumineuse tr s lev e Cela signifie que des quantit s de prot ines moyennes tr s faibles faibles concentrations de l ordre du picogramme peuvent tre d tect es l aide d anticorps hautement dilu s Ceci fait du Amersham ECL Select un produit adapt aux transferts de type Western les plus exigeants en mati re de sensibilit L intensit lev e du signal peut totalement b n ficier des avantages de l quipement d imagerie bas sur une cam ra CCD et fait de Amersham ECL Select un outil optimal de d tection sur les syst mes ImageQuant LAS de GE Healthcare L mission lumineuse peut aussi tre d tect e l aide d un film radiographique gamme de produits Amersham HyperfilmTM 2 3 Compatibilit Le r actif de d tection Amersham ECL Select est compatible avec les membranes en PVDF et en nitrocellulose comme les gammes de produits Amersham Hybond et Amersham Protran l agent de saturation Amersham ECL Prime l agent de saturation Amersham ECL et les autres agents de saturation couramment utilis s comme le BSA et l extrait sec d graiss de lait 29 0142 86 AB 01 2014 3 Informations importantes pour l utilisateur 3 1 Domaine d utilisation Le r actif de d tection Amersham ECL Select e
8. une s rie de dilutions sur une membrane en PVF ou en nitrocellulose et laissez s cher l air libre Sinon utilisez un collecteur de transfert de taches ou de transfert dans des puits R alisez une s rie d chantillons pour chaque dilution tester Remarque Les membranes en PVDF doivent tre mouill es au pr alable de m thanol 22 29 0142 86 AB 01 2014 tape Action 2 ncubez dans la solution de saturation pendant 1 heure temp rature ambiante sous agitation Rincez bri vement les membranes avec deux passages de tampon de lavage D coupez la membrane pour obtenir chaque s rie d chantillons sur une bande de membrane distincte Pr parez diff rentes solutions d anticorps primaire dans a gamme recommand e Incubez chaque bande de membrane dans la solution d anticorps pendant 1 heure temp rature ambiante sous agitation Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Lavez la membrane par remise en suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant 5 minutes temp rature ambiante Renouvelez le tampon de lavage 4 ou 6 reprises au moins Diluez l anticorps secondaire en utilisant une seule concentration et incubez les membranes pendant 1 heure temp rature ambiante sous agitation Rincez les taches par deux passages de tampon de lavage puis avez 4 6 reprises par passage de tampon de lavage frais D tectez l aide du r actif de d tection Amers
9. 1 06 Amersham de ch vre souris IgG Cy3 ECL Plex 50 Hg PA43009 Amersham ch vre lapin IgG Cy5 ECL Plex 50 Hg PA45011 Amersham IgG Cy5 ECL Plex ch vre souris 50 Hg PA45010 33 29 0142 86 AB 01 2014 10 8 R actifs de d tection Produit Quantit N de code R actif de d tection Amersham ECL Select pour pour 1000 cm transfert de type Western RPN2235 R actif de d tection Amersham ECL Prime pour pour 1000 cm ransfert de type Western RPN2232 R actifs de d tection Amersham ECL pour pour 1000 cm ransfert de type Western RPN2109 R actifs de d tection Amersham ECL pour pour 4000 cm ransfert de type Western RPN2106 R actifs de d tection Amersham ECL pour pour 6000 cm ransfert de type Western RPN2134 10 9 Anticorps conjugu s ECL Plex CyDye Produit Quantit N de code Pack combin Amersham ECL Plex pour transfert de type Western 1 Cy3 Cy5 Hybond ECL RPN998 Pack combin Amersham ECL Plex pour transfert de type Western 1 Cy3 Cy5 Hybond LFP pour deux plaques de gel RPN999 34 29 0142 86 AB 01 2014 10 10 Films radiographiques Produit Quantit N de code Amersham Hyperfilm ECL 5x7 po 50 feuilles 28 9068 35 Amersham Hyperfilm ECL 18x24 cm 50 feuilles 28 9068 36 Amersnam Hypertim 50 feuilles 28
10. 9906 08 nn a 10 28 9898 04 eN z 10 28 9898 05 camente o ET cent o 250 cent 0 mous a an 10 28 9901 55 a a 10 28 9901 56 nes o ora cent 0 mous cent o mous nn 10 28 9901 60 cei 10 28 9901 61 29 29 0142 86 AB 01 2014 EPS 2A201 Produit Quantit N de code lectrophor se sur gel do gt 10 28 9901 62 2 n _ 10 28 9901 63 a os 10 28 9901 64 0 sus 2 28 9898 08 un POL 2 28 9898 09 os TE 8 16 3 10 puts 2 28 9901 52 amem 2 eons Alimentations lectriques e lectrique 1 18 1130 01 Alimentation lectrique 1 28 9202 14 29 0142 86 AB 01 2014 30 10 4 quipement de transfert Produit Quantit N de code Unit s de transfert de r servoir Unit de transfert de mini a r servoir TE 22 PU GENA Buvards semi secs ECL Unit de transfert semi sec s p TE 70 14x16 cm 906e 105a Unit de transfert semi sec p p TE 70 PWR 14x16 cm HEOL Unit de transfert semi sec TE 77 21x16 cm 9076211786 Unit de transfert semi sec A a TE 77 PWR 21x16 cm 11700 de 10 5 Equipement de buvardage Produit Quantit N de code Papier de buvardage Papier de buvardage Hybond 20x20 cm 100 feuilles RPN6101M 3MM Chr 20x20 cm 100 feuilles 3030 861 31 29 0142 86 AB 01 2014 Agen
11. AmershamT ECL Select R actif de d tection pour transfert de type Western Brochure du produit Code RPN2235 Sommaire 1 2 Mentions l gales Description 21 vod 2 2 Conception et caract ristiques 2 3 Compatibilit Informations importantes pour l utilisateur 3 1 Domaine d utilisation 3 2 Avis de s curit 3 3 Contr le qualit Manipulation 41 Pr cautions de s curit 4 2 Stockage 43 P remption Composants requis 5 1 Composants du kit 5 2 Solutions 5 3 Membrane 5 4 R actifs de saturation 5 5 R actifs d immunod tection Optimisation du transfert de type Western 6 1 Marqueurs de masse mol culaire 6 2 Membranes 6 3 Transfert 6 4 Saturation 65 Imageurs et films 6 6 Manuel du transfert de type Western Protocole 7 1 lectrophor se et transfert O O O O LO OO OO D D HN NM NM N AONA e Eee EE Nero 12 10 7 2 Saturation 15 7 3 Hybridation des anticorps 15 7 4 Gammes de dilution 16 7 5 Incubation de l anticorps primaire 16 7 6 Incubation de l anticorps secondaire 17 7 7 Incubation du pont streptavidine 18 7 8 D tection 18 7 9 Analyse des images 19 7 10 Cam ra CCD 19 7 11 Film radiographique 20 Informations suppl mentaires 21 8 1 D collement et r hybridation des membranes 21 8 2 D termination de la concentration optimale en anticorps 22 8 3 Gammes de dilution 22 8 4 Optimisation de l anticorps primaire 22 8 5 Optimisation de l anticorps secon
12. Une copie des ces conditions g n rales est disponible sur demande Contactez votre repr sentant local GE Healthcare pour obtenir les informations les plus r centes http www gelifesciences com ecl GE Healthcare UK Limited Amersham Place Little Chalfont Buckinghamshire HP7 9NA UK 29 0142 86 AB 01 2014 2 Description Amersham ECL Select Le r actif de d tection pour transfert de type Western de GE Healthcare apporte une sensibilit tr s lev e la d tection par chimiluminescence des antig nes sp cifiques immobilis s conjugu s des anticorps marqu s par la peroxydase de raifort HRP 2 1 Introduction La chimiluminescence est d finie comme une mission lumineuses produite lors d une r action tapes multiples dans laquelle la peroxydase catalyse l oxydation du luminol En pr sence d amplificateurs chimiques et de catalyseurs l intensit du rayonnement et la dur e de l mission lumineuse sont fortement accrus par un processus appel chimiluminescence am lior e ECL L ECL bas e sur des anticorps secondaires conjugu s la peroxydase de raifort HRP et une m thode de d tection sensible dans laquelle l mission lumineuse est proportionnelle la quantit de prot ine La r action tapes multiples est pr sent e ci dessous N P peroxyde y x D sl P N Sy N HRP amplificateur N luminol anion du radical luminol peroxyde N 5 N Aminophtalate N72
13. alis es par analyse par transfert de taches voir D termination de la concentration optimale en anticorps en page 22 15 29 0142 86 AB 01 2014 7 4 Gammes de dilution Les gammes de dilution suivantes sont recommand es Anticorps Gamme de dilution partir d une solution m re 1 mg ml Primaire 1 5000 1 30000 Secondaire 1 100000 1 300000 Le tableau ci dessous pr sente des suggestions de dilutions de d part d anticorps primaires ayant des niveaux d affinit diff rents moyenne faible Type d anticorps Anticorps primaire Anticorps secondaire dilution dilution Anticorps primaires ayant une affinit 1 10000 1 150000 lev e Anticorps primaires ayant une affinit 1 5000 1 100000 7 5 Incubation de l anticorps primaire tape Action 1 Diluez l anticorps primaire dans du PBS T ou du TBS T 2 Incubez la membrane dans la solution d anticorps primaire sur un agitateur orbital pendant 1 heure temp rature ambiante ou toute une nuit entre 2 et 8 C 3 Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage 4 Lavez la membrane 4 ou 6 reprises pendant 5 minutes dans du tampon de lavage temp rature ambiante sur un agitateur orbital Remarque L exposition au film radiographique n cessite 6 tapes de lavage pour viter l arri re plan 29 0142 86 AB 01 2014 16 7 6 Incubation de l anticorps secondaire tape Action Re
14. althcare n de code 28 9998 97 13 29 0142 86 AB 01 2014 7 Protocole Pr sentation du protocole Ci dessous une pr sentation du protocole de d tection d un transfert de type Western lectrophor se sur gel Transfert Blocage Hybridation de l anticorps D tection Analyse des images 14 29 0142 86 AB 01 2014 7 1 lectrophor se et transfert tape Action 1 Effectuez l lectrophor se et transf rez les prot ines vers une membrane convenable selon les protocoles de transfert Les buvards peuvent tre utilis s imm diatement ou conserv s dans du PBS T ou du TBS T entre 2 et 8 C Remarque La membrane Amersham Hybond doit tre mouill e au pr alable de m thanol 100 avant quilibration dans le tampon de transfert 7 2 Saturation tape Action 1 Incubez la membrane dans une solution de saturation convenable sur un agitateur orbital pendant 1 heure temp rature ambiante ou toute une nuit entre 2 et 8 C 2 Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Remarque Pour la pr paration du tampon de lavage voir Solutions en page 9 7 3 Hybridation de l anticorps Le r actif de d tection Amersham ECL Select permet une mission lumineuse tr s lev e et de ce fait des dilutions d anticorps lev es La dilution optimale varie entre les anticorps selon leur affinit et leur qualit L optimisation de la dilution de l anticorps peut tre r
15. daire 24 Guide de d pannage 25 Produits connexes 27 10 1 Pr paration de l chantillon 28 10 2 Marqueurs de masse mol culaire 28 10 3 quipement ou lectrophor se sur gel 29 10 4 quipement de transfert 31 10 5 quipement de buvardage 31 10 6 Agents de saturation 32 10 7 Anticorps secondaires ECL HRP li s 33 10 8 R actifs de d tection 34 10 9 Anticorps ECL Plex CyDye conjugu s 34 10 10 Films radiographiques 35 10 11 Syst mes d imagerie 35 10 12 Logiciel et accessoires 35 29 0142 86 AB 01 2014 1 Mentions l gales GE imagination at work et GE monogram sont des marques commerciales de General Electric Company Amersham ECL ECL DualVue ECL Select ECL Prime Hybond Hyperfilm ImageQuant Protran et Rainbow sont des marques commerciales des entreprises GE Healthcare Amersham ECL Select est fabriqu et vendu sous licence Cyanagen Srl et fait l objet des demandes de brevets aux tats Unis au Canada et dans l Union Europ enne sous les num ros US7803573 EP1962095 US7855287 EP1950207 US2012009603 A1 CA2742025 EP2405016 ainsi que d autres brevets d livr s et demandes de brevets quivalents dans d autres pays Tween est une marque commerciale de ICI Americas Inc 2006 2014 General Electric Company Tous droits r serv s Premi re publication f vrier 2006 Tous les biens et les services sont vendus selon les conditions g n rales de vente de l entreprise de GE Healthcare qui les fournit
16. e temp rature ambiante sous agitation Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Lavez la membrane par remise en suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant 5 minutes temp rature ambiante Renouvelez le tampon de lavage 4 ou 6 reprises au moins D tectez l aide du r actif de d tection Amersham ECL Select d taill dans D tection en page 18 du protocole La dilution d anticorps qui donne le meilleur signal avec l arri re plan minimum doit tre s lectionn e 24 29 0142 86 AB 01 2014 9 Guide de d pannage Probl mes Causes possibles Solutions Pas de e Quantit s non d tectables de la prot ine cible signal e L anticorps primaire ne se lie pas la prot ine cible ce qui peut tre d un anticorps primaire de mauvaise qualit et ou non sp cifique e Une esp ce incorrecte d anticorps secondaire a t utilis e e La membrane en PVDF n pas t mouill e au pr alable de m thanol e V rifiez que l quipement de transfert fonctionne correctement et que la proc dure correcte a t suivie e V rifiez le transfert de la prot ine en colorant la membrane et ou le gel e Confirmez l efficacit du transfert l aide d un marqueur Rainbow pr color e Certaines prot ines peuvent tre affect es par les traitements n cessaires l lectrophor se e Les r actifs de d tection ne fonctionnent pas correctement Pour tester
17. er le haut sur un plateau d chantillons 2 Placez le plateau d chantillons dans le compartiment de la cam ra CCD et s lectionnez une dur e d exposition et ou fonction convenable Le buvardage peut tre plac sur un pi ce de film plastique c t prot ines orient vers le haut afin de faciliter un d placement facile du film sur le plateau d chantillons Utilisez la fonction d exposition automatique ou s lectionnez manuellement la dur e d exposition Le dur e d exposition de d marrage recommand e est de 60 secondes Augmentez ou diminuez la dur e d exposition en fonction de l intensit du signal obtenu 29 0142 86 AB 01 2014 7 11 Film radiographique tape Action Remarques 1 Placez le buvardage c t prot ines orient vers le haut sur un pi ce de film plastique neuve enveloppez les buvardages et liminez d licatement toutes les bulles d air 2 Placez le buvardage envelopp c t prot ines orient vers le haut dans une cassette de film radiographique 3 Placez un feuillet de film radiographique gamme de produits Amersham Hyperfilm au dessus de la membrane Fermez la cassette et proc dez l exposition Le d lai d exposition de d marrage convenable est de 1 minute 4 D veloppez le film imm diatement et sur la base de l intensit du signal obtenu estimez la dur e d exposition pour un deuxi me feuillet de film 29 0142 86 AB 01 2014
18. film de d tection du signal a t surexpos Le niveau du signal est si lev que le film a t otalement surcharg Produits non compatibles 10 Produits connexes Ce chapitre pr sente un sous ensemble de produits connexes Pour plus d informations consultez www gelifesciences com ecl 27 29 0142 86 AB 01 2014 10 1 Pr paration de l chantillon Produit Quantit N de code Kit de nettoyage SDS PAGE 50 chantillons 80 6484 70 Tarpon a extraction des 1 x 500 ml 28 9412 79 prot ines de mammif res Kit Quant 2 D 500 dosages 80 6483 56 10 2 Marqueurs de masse mol culaire Produit Quantit N de code Marqueurs de masse mol culaire Amersham Gamme basse Rainbow arqueurs de masse mol culaire Amersham Gamme haute Rainbow 250 pl 250 yl RPN755E RPN756E Marqueurs de masse mol culaire Amersham Gamme compl te Rainbow 250 il RPN800E arqueurs pour transferts de type Western mersham ECL DualVue A Marqueurs Amersham ECL Plex fluorescents Rainbow 1 bo te 25 chargements 120 ul RPN810 RPN850E arqueurs Amersham ECL ex fluorescents Rainbow D 500 pl RPN851E 29 0142 86 AB 01 2014 28 10 3 quipement pour lectrophor se sur gel Produit Quantit N de code lectrophor se sur gel de gel Amersham 1 28
19. ham ECL Select d taill dans D tection en page 18 du protocole La dilution d anticorps qui donne le meilleur signal avec arri re plan minimum doit tre s lectionn e 23 29 0142 86 AB 01 2014 8 5 Optimisation de l anticorps secondaire tape Action 1 D posez diff rentes quantit s de l chantillon prot ique de pr f rence selon une s rie de dilutions sur une membrane en PVF ou en nitrocellulose et laissez s cher l air libre Sinon utilisez un collecteur de transfert de taches ou de transfert dans des puits R alisez une s rie d chantillons pour chaque dilution tester Remarque Les membranes en PVDF doivent tre mouill es au pr alable de m thanol Incubez dans la solution de saturation pendant 1 heure temp rature ambiante sous agitation Incubez dans la solution d anticorps primaire dilu concentration optimis e pendant 1 heure temp rature ambiante sous agitation Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Lavez la membrane par remise en suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant 5 minutes temp rature ambiante Renouvelez le tampon de lavage 4 ou 6 reprises au moins D coupez la membrane pour obtenir chaque s rie d chantillons sur une bande de membrane distincte Pr parez diff rentes solutions d anticorps secondaire dans la gamme recommand e Incubez chaque bande de membrane dans la solution d anticorps pendant 1 heur
20. icacit du transfert et la d termination de la masse mol culaire des prot ines transf r es sans coloration sur le gel et la membrane ainsi que la d tection par chimiluminescence 6 2 Membranes e Amersham Hybond est une membrane en PVDF dot e de capacit de liaison aux prot ines et d une r sistance m canique lev es qui en font l outil id al pour les applications de transfert de type Western quand d collement et r hybridation sont n cessaires L utilisation de la membrane est optimale avec les r actifs de d tection Amersham ECL Prime et ECL Select Amersham Protran est une membrane en nitrocellulose compatible avec tous les substrats de transfert de type Western chimiluminescents Son principalement avantage r side dans son arri re plan normalement faible 11 29 0142 86 AB 01 2014 6 3 Transfert e Le transfert humide Unit de transfert TE 22 est la m thode de transfert la plus couramment utilis e Elle permet le transfert efficace de prot ines petites ou grosses e Le transfert semi humide Unit s de transfert TE 70 et TE 77 est plus rapide que le transfert humide et consomme moins de tampon Le transfert semi humide fonctionne bien pour la plupart des prot ines mais il peut tre moins efficace pour les grosses prot ines Il est susceptible d avoir une sensibilit r duire pour les tr s faibles abondances prot iques 6 4 Saturation Apr s transfert des prot ines la membrane doit tre incub e
21. icorps sp cifiques de grande qualit et optimisez la dilution de l anticorps e D tection et imagerie S lectionnez le r actif de d tection en fonction des besoins de votre application Un imageur CCD offre une sensibilit lev e et une vaste plage dynamique il permet une meilleure quantification qu un film radiographique Ce chapitre d crit les produits dont l utilisation est recommand e avec le r actif de d tection Amersham ECL Select Pour plus d informations concernant ces produits consultez www gelifesciences com ecl 10 29 0142 86 AB 01 2014 6 1 Marqueurs de masse mol culaire Les marqueurs de masse mol culaire sont utilis s pour d terminer la taille des prot ines De plus les marqueurs pr color s permettent la confirmation du transfert et de l orientation des prot ines par le transfert des bandes color es vers la membrane e Les marqueurs Amersham Rainbow sont des marqueurs multicolores pr color s pour la surveillance de la progression de l lectrophor se des prot ines la confirmation de l efficacit du transfert et la d termination de la masse mol culaire des prot ines transf r es e Les marqueurs Amersham ECL DualVue sont optimis s pour une utilisation avec Amersham ECL Amersham ECL Prime et Amersham ECL Select et contiennent une combinaison de marqueurs prot iques marqu s et pr color s Ces marqueurs permettent la surveillance de l lectrophor se la confirmation de l eff
22. immunod tection du Chapitre 7 Protocole d hybridation de l anticorps pour analyse des images 21 29 0142 86 AB 01 2014 8 2 D termination de la concentration optimale en anticorps En raison de l intensit lev e du signal du r actif de d tection Amersham ECL Select l optimisation des concentrations en anticorps est recommand e afin de garantir les meilleurs r sultats En g n ral des anticorps primaire et secondaire extr mement dilu s sont n cessaires avec le r actif de d tection Amersham ECL Select par rapport aux substrats chimiluminescents standard Les protocoles de d terminations des concentrations optimales en anticorps sont indiqu s ci dessous 8 3 Gammes de dilution Les gammes de dilution suivantes sont recommand es Anticorps Gamme de dilution partir d une solution m re 1 mg ml Primaire 1 5000 1 30000 Secondaire 1 100000 1 300000 8 4 Optimisation de l anticorps primaire Le transfert de taches constitue une m thode rapide et efficace de d termination de la dilution optimale d une anticorps primaire de concentration inconnue Sinon un transfert de type Western peut tre pr par et d coup en plusieurs bandes Il faut remarquer que certains anticorps peuvent n cessiter des tapes de saturation et de lavage en sus de celles qui sont sugg r es ci dessous tape Action 1 D posez diff rentes quantit s de l chantillon prot ique de pr f rence selon
23. ire la Fiche technique sant s curit SDS avant utilisation R actif de d tection Amersham ECL Select 4 2 Stockage r ception tous les composants doivent tre conserv s au r frig rateur entre 2 et 8 C Le r actif de d tection Amersham ECL Select est sensible une exposition prolong e la lumi re Stockez toujours les r actifs individuels dans les r cipients tanches la lumi re dans lesquels ils ont t fournis 4 3 P remption Les composants sont stables pendant au moins 3 mois quand ils sont stock s dans les conditions recommand es Voir la date de p remption inscrite sur le conditionnement 29 0142 86 AB 01 2014 5 Composants requis 5 1 Composants du kit Les composants suivants sont inclus dans le kit du r actif de d tection Amersham ECL Select Produit Contenu RPN2235 e Solution A Solution de luminol 50 ml e Solution B Solution de peroxyde 50 ml Suffisante pour 1000 cm de membrane 5 2 Solutions Les solutions requises sont r pertori es ci dessous e Tampon phosphate salin PBS pH 7 5 e Tampon Tris PBS pH 7 6 e Tampons de dilution et de lavage PBS Tween PBS T et TBS Tween TBS T Une concentration de 0 1 de Tween 20 convient la plupart des applications de buvardage 5 3 Membrane Utilisez un protocole convenable pour s parer les prot ines par lectrophor se et les transf rer vers une membrane en PVDF ou en nitrocellulose 5 4
24. marques 1 Diluez l anticorps secondaire anticorps biotinyl ou conjugu la HRP dans du PBS T ou du TBS T Incubez la membrane dans la solution d anticorps secondaire pendant 1 heure temp rature ambiante sur un agitateur orbital Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Lavez la membrane 4 ou 6 reprises pendant 5 minutes dans du tampon de lavage temp rature ambiante sur un agitateur orbital Augmentez l mission lumineuse en construisant un sandwich trois couches l aide d anticorps secondaires biotinyl s et de streptavidine conjugu es la HRP L exposition au film n cessite 6 tapes de lavage pour viter l arri re plan En cas d utilisation d un anticorps secondaire conjugu la HRP passez directement l tape de D tection en page 18 En cas d utilisation d un anticorps biotinyl passez au protocole d incubationdu pont streptavidine au verso 29 0142 86 AB 01 2014 7 7 Incubation du pont streptavidine tape Action 1 Diluez le conjugu Streptavidine HRP ou le complexe Streptavidine biotinyl e HRP dans du PBS T ou du TBS T ncubez la membrane dans la solution dilu e pendant 1 heure temp rature ambiante sur un agitateur orbital Rincez bri vement la membrane avec deux passages de tampon de lavage Lavez la membrane en la remettant en suspension dans une quantit de tampon de lavage suffisante pour recouvri
25. r la membrane et agitez pendant 5 minutes temp rature ambiante Renouvelez le tampon de lavage 4 ou 6 reprises au minimum 7 8 D tection tape Action 1 F Laissez les solutions de d tection s quilibrer temp rature ambiante pendant 20 min M langez les solutions de d tection A luminol et B peroxyde dans un rapport de 1 1 pour donner une solution de travail Le volume final de r actif de d tection requis est de 0 1 ml cm de membrane Remarque Si le r actif m lang n est pas utilis imm diatement tenez le l abri de l exposition la lumi re en l enveloppant dans une feuille ou en le conservant dans un lieu sombre liminez le tampon de lavage en exc s de la membrane lav e et placez la c t prot ines orient vers le haut dans une bo te appropri e ou sur un feuillet de film en plastique ou toute autre surface propre convenable Ajoutez le r actif de d tection sur la membrane et v rifiez qu il la recouvre compl tement Incubez pendant 5 minutes temp rature ambiante liminez le tampon de d tection en exc s en tenant d licatement la membrane par les bords contre un tissu 18 D 29 0142 86 AB 01 2014 7 9 Analyse de l image Deux protocoles d analyse d image sont d crits un pour l imagerie fond e sur la cam ra CCD et l autre employant un film radiographique 7 10 Cam ra CCD tape Action Remarques 1 Placez le buvardage c t prot ines orient v
26. st destin la d tection par chimiluminescence lors des transferts de type Western Le r actif de d tection Amersham ECL Select est uniquement destin la recherche et ne peut tre utilis dans le cadre d interventions cliniques ou des fins de diagnostic 3 2 Avis de s curit Cette documentation de l utilisateur contient des MISES EN GARDE concernant l utilisation du r actif de d tection Amersham ECL Select en toute s curit Voir les d finitions ci dessous Mises en garde MISE EN GARDE MISE EN GARDE Indique une situation dangereuse qui si elle n est pas vit e pourrait provoquer des blessures mineures ou mod r es I est important de ne rien entreprendre tant que toutes les conditions indiqu es ne sont pas remplies ni clairement comprises 3 3 Contr le qualit Le r actif de d tection Amersham ECL Select est fabriqu conform ment notre syst me de gestion de la qualit certifi ISO 9001 et il est conforme aux crit res d acceptation d finis pour le produit 29 0142 86 AB 01 2014 4 Manipulation 4 1 Pr cautions de s curit MISE EN GARDE Substances dangereuses Lors de l utilisation de produits chimiques dangereux prenez toutes les mesures de protection convenables comme le port de lunettes et de gants de protection r sistants aux substances utilis es Respectez les r glementations locales et ou nationales pour un fonctionnement s r l est recommand de l
27. t de saturation Produit Quantit N de code Membranes 0 2 NC support es Amersham Protran 20x20 cm ER TOUTES 10609033 0 2 NC support es Amersham 25 feuilles 10600099 Protran 8x9 cm Amersham Hybond LFP 0 2 PVDF 10 feuilles 10600060 20x20 cm LFP 0 2 PVDF Amersham Hybond 25 feuilles 10600102 8x9 cm 0 2 PVDF Amersham Hybond 25 feuilles 10600057 20x20 cm 0 2 PVDF Amersham Hybond 25 feuilles 10600101 8x9 cm 10 6 Agents de saturation Produit Quantit N de code Amersham ECL Agent 40g RPN2125 de saturation Amersham ECL Prime 40g RPN418 32 29 0142 86 AB 01 2014 10 7 Anticorps secondaires li s la HRP Am ersham ECL Produit Quantit N de code IgG de souris Amersham ECL anticorps totaux de mouton s la HR p 1ml NA931 1ML Amersham i s la HR gG humaines ECL anticorps totaux de mouton p 1ml NA933 1ML Amersham i s la HR gG de lapin ECL anticorps totaux de singe p 1ml NA934 1ML Amersham ragment F i la HRP gG de souris ECL ab 2 de mouton 1ml NA9310 1ML Amersham gG de lapin ECL ragment F i la HRP ab 2 de singe 1ml NA9340 1ML Amersham de ch vre a souris gG Cy2 ECL Plex 50 Hg 28 9011 08 Amersham de ch vre a lapin IgG Cy2 ECL Plex 50 Hg 28 9011 10 Amersham de ch vre a lapin IgG Cy3 ECL Plex 50 Hg 28 901
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