C. difficile Tox A/B
Contents
1. tre utilis s 13 S cher les barrettes et le portoir en les tapotant sur du papier absorbant D Incubation du substrat TMB 14 Distribuer 100UL de substrat TMB dans chaque puits recouvrir les barrettes avec le couvercle et incuber temp rature ambiante pendant 15 minutes 15 Arr ter la r action en ajoutant dans chaque puits 100uL de solution d arr t 1M H2801 F Lecture 16 Lire la densit optique de chaque puits 450nm 620nm au cours des 10 minutes suivant l arr t de la r action puis enregistrer les r sultats Le conjugu HRP peut provoquer des pr cipit s de prot ines prot ines bloquantes qui n ont aucune incidence sur les r sultats du test Les bulles d air doivent tre retir es avant la lecture Le fond de la plaque doit tre soigneusement essuy Proc dure pour une utilisation sur automate A Pr paration des r actifs 1 Ramener tous les composants et les chantillons tester temp rature ambiante D terminer le nombre total d chantillons analyser Outre les chantillons inclure les r actifs suivants dans chaque analyse un puits de contr le n gatif utiliser le Diluant Echantillon et un puits de contr le positif 2 Retirer la microplaque de son sachet d aluminium en coupant l extr mit du sachet au niveau de la partie scell e Pr lever le nombre de barrettes n cessaires au test les placer sur le support de 96 puits 3 Diluer le tampon de lavage concent2. m langer vortex le tube pour assurer chantillonnage ad quat 6 Echantillons solides Utiliser un b tonnet en bois ou une spatule jetable pour transf rer approximativement 0 05 0 1g de selle peu pr s 3mm de diam tre dans le Diluant Echantillon Enlever autant de mati re possible de la spatule ou du b tonnet en m langeant le Diluant Echantillon presser le b tonnet contre la paroi du tube pour r cup rer le liquide r siduel Echantillons liquides transf rer 50uL de selle dans le tube S assurer que l chantillon est m lang de mani re homog ne vortex 7 Bien m langer vortex l chantillon de selle pour assurer l chantillonnage ad quat Conserver l chantillon dilu entre 2 C et 8 C jusqu analyse C Incubation des chantillons et contr les 8 Vortexer le flacon de conjugu HRP et distribuer 50uL dans chaque puits 9 D poser 100UL de contr le positif bouchon bleu et 100 uL de contr le n gatif Diluant Echantillon dans des puits s par s 10 D poser 100uL d chantillons dilu s dans des puits s par s gr ce aux pipettes jetables fournies marque la plus basse sur la pipette 11 Recouvrir les barrettes avec le couvercle de microplaque et incuber 50 min 37 C dans une tuve 12 Etape de lavage Vider les puits Remplir chaque puits au maximum avec du Tampon de Lavage 300uL R p ter cette tape 4 fois pour un total de CINQ lavages Les laveurs automatiques peuvent
3. CE CoproELISA C difficile Tox A B Test ELISA pour la d tection des toxines A et B de Clostridium difficile dans les chantillons de selles humaines Manuel d instructions Coffret de 96 tests R f rence catalogue 794 01 R serv au Diagnostic n Vitro A usage professionnel A conserver entre 2 C et 8 C Ne pas congeler 3 Habosem St Ashdod 7761003 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Savyon Diagnostics Ltd Utilisation Le coffret Savyon CoproELISA C difficile Tox A B est un test ELISA qui permet de d tecter les toxines A et B de C difficile dans les chantillons de selles humaines pr lev s chez des patients suspect s d tre infect s par C difficile Les r sultats du test combin s l historique m dical du patient contribuent au diagnostic des infections C difficile ICD R serv au diagnostic In Vitro Introduction Clostridium difficile bact rie ana robie gram positive est le principal agent responsable des diarrh es et colites pseudomembranaires associ es aux traitements antibiotiques 1 Ce pathog ne peut tre l origine d une maladie grave voire fatale si elle n est pas diagnostiqu e et trait e temps Le traitement aux antibiotiques repr sente le principal facteur de risque des infections C difficile L infection peut se d velopper si la flore gastro intestinale est perturb e par un traitement a
4. De m me ce test n est pas compatible avec des chantillons conserv s dans l Alcool Polyvinyle PVA Les chantillons doivent tre conserv s entre 2C et 8C et analys s dans les 48 heures apr s recueil Si le test ne peut pas tre ex cut dans les 48 heures conserver les chantillons 20 C ou moins Eviter les cong lations d cong lations qui peuvent causer la d gradation prot olyse des toxines et par cons quent leur perte d activit Proc dure manuelle du test A Pr paration des r actifs 1 Ramener tous les composants et les chantillons cliniques tester temp rature ambiante D terminer le nombre total d chantillons analyser Outre les chantillons inclure les r actifs suivants dans chaque analyse un puits de contr le n gatif utiliser le Diluant Echantillon et un puits de contr le positif Retirer la microplaque de son sachet d aluminium en coupant l extr mit du sachet au niveau de la partie scell e Pr lever le nombre de barrettes n cessaires au test les placer sur le support de 96 puits Diluer le tampon de lavage concentr au 1 20 avec de l eau distill e Exemple pour 1L de tampon de lavage 50 mi de tampon de lavage concentr 950 ml d eau distill e B Traitement des chantillons 4 Pr parer une dilution pour chaque chantillon analyser Utiliser des tubes Eppendorf de 1 5 ml Ajouter 200 ul de Diluant Echantillon Identifier le tube 5 Bien
5. HRP et immobilis es par les anticorps fix s sur la microplaque e Les conjugu s non fix s sont limin s par lavage e Apr s ajout du substrat TMB ce dernier est hydrolys par la peroxydase donnant une solution bleue de substrat r duit e La solution d arr t est ensuite ajout e la couleur bleue devient jaune Les puits sont lus l aide d un lecteur ELISA une longueur d onde de 450nm 620nm e L absorbance est proportionnelle la quantit de toxines de C difficile pr sente dans l chantillon R sum de la proc dure manuelle Automatis e Ajouter 50uL de conjugu HRP Pr t l emploi Ajouter 100UL de contr le n gatif diluant chantillon 100 ul de contr le positif et 100uL d chantillons dilu s Couvrir la plaque et laisser incuber 50 min 37 C un taux d humidit de 100 Laver 5 fois avec le tampon de lavage 300 ul Ajouter 100uL de substrat TMB 4 Couvrir la plaque et laisser incuber 15 minutes temp rature ambiante Ajouter 100uL de solution d arr t Lire l absorbance 450nm 620nm Interpr ter les r sultats Proc dure automatis e Veuillez suivre les recommandations suivantes afin d assurer la qualit des r sultats du test lors d une proc dure automatis e e Remplir la plaque en 3 tapes maximum 4 barrettes la fois Ajouter le conjugu HRP sur 4 barrettes puis les chantillons correspondant Recommencer pour les 4 barrettes s
6. aque 4 barrettes maximum Proc der comme suit 9 Distribuer 50uL de conjugu pr t l emploi dans chaque puits 4 barrettes maximum 10 D poser 100uL de contr le positif et 100uL de contr le n gatif Diluant Echantillon dans des puits diff rents contenant le conjugu 11 D poser 100uL d chantillon dilu dans des puits diff rents parmi les barrettes du groupe 4 barrettes max 12 R p ter la distribution de conjugu et le d p t des chantillons sur les 4 barrettes suivantes puis nouveau sur les 4 derni res barrettes voir tapes 9 11 13 Incuber la plaque 30 minutes 37 C 14 Effectuer 5 X 300UL cycles de lavage avec le tampon de lavage pr dilu 15 Effectuer deux cycles d aspiration circulaire D Incubation du substrat TMB 16 Distribuer 100uL de substrat TMB dans chaque puits Incuber temp rature ambiante pendant 15 minutes 17 Arr ter la r action en ajoutant 100uL de solution d arr t 1M H2SOa4 dans chaque puits E Lecture 18 Lire la densit optique de chaque puits 450nm 620nm puis enregistrer les r sultats Noter que chaque automate poss de des sp cifications techniques propres Pour l utilisation de ce coffret avec votre automate veuillez adapter cette proc dure de test sur votre instrument Crit res d acceptabilit du test Pour que le test soit valide les crit res ci dessous doivent tre remplis Si ces conditions ne sont pas retrouv es le te
7. laque non utilis es doivent tre replac es dans le sachet en aluminium refermable avec un d shydratant pour les prot ger de l humidit La solution de substrat TMB est une substance irritante pour la peau et les muqueuses Eviter tout contact direct L acide sulfurique dilu 1M H2804 est un agent irritant pour les yeux et la peau En cas de contact avec les yeux laver imm diatement et abondamment avec de l eau et consulter un sp cialiste Conservation et stabilit des r actifs 1 La date d expiration des kits est indiqu e sur l tiquette du coffret Les dates d expiration de chaque composant sont indiqu es sur leurs propres tiquettes Le kit doit tre conserv entre 2 C et 8C et replac rapidement au r frig rateur apr s utilisation L exposition des composants du kit pendant quelques heures temp rature ambiante n alt re pas les r actifs s ils sont munis de leur bouchon d origine ou rest s scell s NE PAS CONGELER Le sachet d aluminium contenant les barrettes de puits doit tre soigneusement referm avec le d shydratant et scell avec du ruban adh sif sur toute la longueur de l ouverture Recueil des selles 1 2 Recueillir et manipuler les chantillons selon les proc dures standards de collecte et de culture des selles Conservation des selles Le test n est pas compatible avec des chantillons conserv s dans 10 de formol ou dans de l ac tate de sodium formol SAF
8. ntibiotique et si le patient est expos C difficile habituellement par voie f co orale 2 Les facteurs de virulence du C difficile sont les toxines A et B 3 4 Ces toxines pr sentent une forte homologie fonctionnelle et s quentielle La toxine A a t d crite comme une ent rotoxine qui endommage les tissus intestinaux ce qui attire les cellules neutrophiles et monocytes et la toxine B est une puissante cytotoxine qui d grade les cellules pith liales du c lon 5 La plupart des souches virulentes produisent les deux toxines cependant les souches toxine n gative et toxine B positive provoquent galement le d veloppement de la maladie M794 01F 02 07 15 6 7 La d tection immunologique des toxines A et B dans les chantillons de selles est fr quemment utilis e comme aide au diagnostic Principe du Test CoproELISA Ca fficile Tox A B est un test immunoenzymatique pour le d pistage des toxines A et B dans les selles humaines e Les puits de barrettes s cables de la microplaque sont sensibilis s par des anticorps polyclonaux dirig s contre les toxines de C difficile e Un m lange d anticorps polyclonaux anti toxine A et anti toxine B coupl s la peroxydase de raifort HRP est ensuite ajout dans les puits e Les chantillons de selles sont dilu s dans le tampon chantillon et ajouter dans les micropuits A cette tape les toxines de C difficile sont marqu es par les conjugu s
9. r au 1 20 avec de l eau distill e Par exemple pour 1L de tampon de M794 01F 02 07 15 lavage 50 ml de tampon de lavage concentr 950 ml d eau distill e B Traitement des chantilllons 4 Pr parer un tube de dilution pour chaque chantillon tester utiliser des tubes compatibles avec l instrument Ajouter 800UL de Diluant Echantillon dans chaque tube Identifier les tubes 5 Echantillons solides Utiliser un b tonnet en bois ou une spatule jetable pour transf rer approximativement 0 2 0 3g de selle peu pr s la taille de 2 petits pois dans le Diluant Echantillon Enlever autant de mati re possible de la spatule ou du b tonnet en m langeant le Diluant Echantillon presser l couvillon contre la paroi du tube pour r cup rer le liquide r siduel Echantillons liquides transf rer 300 uL d chantillon dans le tube S assurer que l chantillon est m lang de mani re homog ne 6 Bien m langer vortex le tube pour assurer chantillonnage ad quat 7 Laisser le tube reposer pendant au moins 10 minutes d cantation S assurer que le surnageant ainsi form ne contienne aucune particule de grande taille Centrifuger les tubes 1000 g pendant 30 secondes si n cessaire 8 Transf rer les tubes sur leurs racks respectifs sur l automate C Incubation du conjugu avec les chantillons de selles et les contr les D poser le conjugu pr t l emploi et les chantillons sur la pl
10. r t l emploi Contient de l acide sulfurique 1M H2S0O4 1 Flacon 16 ml 8 Pipettes jetables en plastique 100 pc 9 Couvercle de microplaque 1 unit 10 Notice technique 1 unit Mat riel n cessaire non fourni 1 Tubes h molyse et portoirs pour pr parer les dilutions de selles de patients Micropipettes ou pipettes multicanaux 50 200 et 200 1000UL avec embouts jetables 3 B tonnets jetables en bois plastique ou spatules 4 Eprouvette volum trique d un litre 5 Eprouvette volum trique de 50mL 6 7 8 A Bouteille pour la solution de lavage Papier absorbant Agitateur vortex 9 Bain marie 37 C avec couvercle ou une tuve 37 C 10 Lecteur ELISA quip de filtres 450nm et 620nm 11 Eau distill e ou d ionis e 12 Pour l utilisation sur automate Utiliser une centrifugeuse poss dant un rotor compatible avec les tubes d chantillons Pr cautions d emploi 1 Les r actifs doivent tre ramen s temp rature ambiante avant utilisation 2 Lors de la manipulation des barrettes viter de rayer le fond des puits ceci pourrait se traduire par une augmentation de l absorbance 3 Apr s utilisation les chantillons de selles les microplaques les c nes de pipettes les spatules et les tubes doivent tre manipul s et limin s comme des M794 01F 02 07 15 d chets biologiques potentiellement contamin s Porter des gants lors du test Les barrettes de la microp
11. st doit tre consid r comme non conforme et renouvel Contr le n gatif La valeur d absorbance doit tre lt 0 07 450 620 nm Contr le positif La valeur d absorbance doit tre gt 0 5 450 620 nm Interpr tation des r sultats Lecture au spectrophotom tre Echantillons Echantillons n gatifs positifs DO Limitations 1 CoproELISA C difficile Tox A B permet la d tection des toxines de C difficile dans les selles Cette d tection doit tre prise en compte par le m decin en plus de l historique m dical du patient avant d effectuer tout diagnostic L incapacit d tecter les toxines A et B dans les chantillons de selles ne doit pas exclure un diagnostic de cette maladie ceci peut tre d un mauvais traitement des chantillons ou de conservation des chantillons Il est aussi possible que le taux de toxine soit en dessous de la limite de d tection du kit Le kit CoproELISA C difficile Tox A B permet une d tection des toxines A et B une concentration 2 3 ng ml 2 La stabilit des toxines de C difficile dans les chantillons de selles peut tre alt r e particuli rement faible concentrations Pour cette raison il est important de conserver les chantillons entre 2 C et 8 C apr s le recueil Les chantillons qui ne peuvent tre analys s dans les 48 heures doivent tre congel s 3 Certains chantillons peuvent donn s des r sultats faibles Ceci pe
12. tes selles positives de nombreux pathog nes gastrointestinaux Aucune r action crois e ou interf rence due des infections mixtes avec les pathog nes suivant n a t identifi Blastocystis Campylobacter Cryptosporidium parvum Dientamoeba fragilis Escherichia coli Entamoeba histolitica Enterococcus faecali Enterococcus faesium Enterococcus avium Enterococcus aerogenes Enterococcus cloacae Enterococcus gallinarum Enterococcus durans Giardia lamblia Helicobacter pylori Klebsiella pneumonia Salmonella enterica and Shigella Bibliographie 1 Cloud J Kelly CP Update on Clostridium difficile associated disease Curr Opin Gastroenterol 2007 Jan 23 1 4 9 2 Owens RC Jr Donskey CJ Gaynes RP Loo VG Muto CA Antimicrobial associated risk factors for Clostridium difficile infection Clin Infect Dis 2008 Jan 15 46 Suppl 1 819 31 3 Kelly CP Pothoulakis C LaMont JT Clostridium difficile colitis N Engl J Med 1994 Jan 27 330 4 257 62 4 Voth DE Ballard JD Clostridium difficile toxins mechanism of action and role in disease Clin Microbiol Rev 2005 Apr 18 2 247 63 5 Savidge TC Pan WH Newman P O brien M Anton PM Pothoulakis C Clostridium difficile toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine Gastroenterology 2003 Aug 125 2 413 20 6 Pituch H van den Braak N van Leeuwen W van Belkum A Martirosian G Obuch Woszczaty ski P uczak M Meisel Miko ajc
13. uivantes puis les 4 derni res e Incubation des chantillons 30 minutes 37 C Composition du coffret pour une utilisation manuelle pour une utilisation sur automate Coffret pour 96 d terminations 1 Microplaque sensibilis e par des anticorps polyclonaux dirig s contre les toxines A et B de C difficile 96 puits s cables 8x12 sensibilis s par des anticorps polyclonaux dirig s contre les toxines A et B de C difficile et conserv s dans un sachet alluminium avec un d shydratant 1 microplaque 2 Tampon de lavage concentr 20x Tampon PBS Tween 1 Flacon 100 ml 3 Diluant chantillon Pr t l emploi Contient du Proclin lt 0 05 utilis comme conservateur Ce diluant est galement utiliser comme contr le n gatif voir Proc dure 1 Flacon 50 ml 4 Conjugu HRP vert Pr t l emploi Contient des anticorps polyclonaux anti toxine A et anti toxine B coupl s la peroxydase de raifort HRP Contient du Proclin lt 0 05 comme conservateur Peut provoquer des pr cipit s de prot ines prot ines bloquantes qui n ont aucune incidence sur les r sultats du test 1 Flacon 7 mi 5 Contr le positif bleu Pr t l emploi Contient des toxines A et B inactiv es Contient du Proclin lt 0 05 comme conservateur 1 Flacon 2 5 mi 6 Substrat TMB Pr t l emploi Contient 3 3 5 5 Tetramethylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 Flacon 16 ml 7 Solution d arr t P
14. ut tre d notamment la pr sence d une souche faiblement toxinog ne une concentration faible en bact ries produisant des toxines ou certains facteurs dans les selles qui interf rent avec les toxines ou le test Dans ce cas renouveler l analyse partir d un chantillon frais 4 Quelques souches de Clostridium sordellii produisent des toxines similaires aux toxines et B de C difficile cependant Clostridium sordelli n a pas t d tect e dans les selles de patients souffrant de diarrh es li es un traitement antibiotique Performance du test Etude Des chantillons de selles ont t valu s par le kit CoproELISA C difficile Tox A B L tude portait sur 86 chantillons d un site A tableau 1 et sur 56 chantillons d un site B tableau 2 Les r sultats ci dessous ont t compar s un kit ELISA de r f rence valid par la FDA Tableau 1 Site A CoproELISA C difficile Tox A B Sensibilit 95 7 Sp cificit 97 4 Valeur Pr dictive Positive VPP 97 8 Valeur Pr dictive N gative VPN 95 M794 01F 02 07 15 positif n gatif Tableau 2 Site B positif n gatit totai A SE C difficile n gatif o as o far s Tox A B Sensibilit 100 Sp cificit 97 9 VPP 90 VPN 100 R actions crois es et interf rences dues des infections mixtes Le kit CoproELISA C difficile Tox A B a t valu sur diff ren
15. zyk F Clonal dissemination of a toxin A negative toxin B positive Clostridium difficile strain from patients with antibiotic associated diarrhea in Poland Clin Microbiol Infect 2001 Aug 7 8 442 6 7 Shin BM Kuak EY Yoo SJ Shin WC Yoo HM Emerging toxin A B variant strain of Clostridium difficile responsible for pseudomembranous colitis at a tertiary care hospital in Korea Diagn Microbiol Infect Dis 2008 Apr 60 4 333 7 Des pre Repr sant agr europ en Obelis s a Boulevard G n ral Wahis 53 1030 Brussels BELGIUM Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 E Mail mail obelis net Distribu par i Theradiag e Theradag 14 Rue ambrioise Croizat 77183 Crossy Beaubourg Tel 33 1 64 62 10 12 Fax 33 1 64 62 09 66 info theradiag com Limites de temp rature Consulter les instructions d utilisation Dispositif m dical de MYD Fe e in vitro m T Repr sentant M794 01F 02 07 15
Download Pdf Manuals
Related Search