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05_035 GMO - Bio-Rad

1. Biotechnology Explorer Kit GMO Investigator R f rence 166 2500EDU http explorer bio rad fr Remarque Ce kit contient des r actifs sensibles la temp rature A l arriv e ouvrez imm diatement et stockez les composants 20 C ou 4 C comme il est indiqu La duplication de toute partie de ce document n est autoris e que pour l usage en classe Pour le service technique composez le 01 47 95 69 64 10002155 A l attention de l enseignant Vos aliments pr f r s sont ils g n tiquement modifi s Actuellement les aliments g n tiquement modifi s GM n ont pas tre tiquet s en tant que tels aux Etats Unis et les aliments avec une teneur g n tiquement modifi e inf rieure 5 peuvent tre tiquet s sans OGM En Europe et en Asie les aliments g n tiquement modifi s ne n cessitent un tiquetage que s ils contiennent une teneur GM gt 1 L objectif de ce kit est que les l ves testent leurs produits alimentaires pr f r s achet s en magasin par exemple des chips de ma s et des sandwiches aux l gumes pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s OGM En outre les l ves s engagent dans une exp rience de recherche scientifique o ils regroupent des aliments provenant d un magasin extraient l ADN des aliments amplifient l ADN en utilisant la r action en cha ne de la polym rase PCR et utilisent l lectrophor se sur gel pour identifier la pr sence ou l a
2. Aucune conclusion ne peut tre tir e ar l tat d OGM de l allments tenter parce que la PCR d OGM n fonctionne pas correctement Paut 28 l tape 6 Lertpounbl de faire certaines conclunons mals pas d rer d s conclusions d finitive L allm nt sat probablement non OGM Fig 4 Guide tape par tape de l analyse des r sultats Remarque ce kit d tecte approximativement 85 des aliments GM Par cons quent vous ne pouvez pas conclure de mani re d finitive qu un aliment est non OGM 25 Conseils et questions fr quemment pos es Cours 1 Extraction de l ADN d chantillons d aliments Aliment de contr le non OGM certifi par Bio Rad Le broyage des graines enti res prend un peu de temps mais un broyage total n est pas n cessaire Vous d couvrirez que l eau aidera ramollir les graines et facilitera le broyage e l est important de traiter l chantillon non OGM certifi par Bio Rad en premier parce que la PCR est tr s sensible et tout ADN OGM positif peut contaminer votre quipement e Pour r duire le risque de contamination ou pour gagner du temps vous pouvez souhaiter pr parer ceci l avance et faire que vos l ves ne pr parent que leurs chantillons tester Quels aliments dois je choisir pour les TP Les aliments OGM actuellement approuv s pour la vente aux Etats Unis comprennent le ma s le soja la papaye la pomme de terre le colza le riz la courge la bettera
3. Surnageant m 5 Lorsqu on vous le demande placez les tubes de PCR dans le thermocycler 31 Jour 3 Electrophor se des produits de PCR 1 Pr parez votre appareil d lectrophor se sur gel selon les instructions 2 Reprenez votre tube de PCR du thermocycler et placez le dans l adaptateur de microtube sans ER bouchon Centrifugez le tube pendant 3 secondes 3 En utilisant un c ne neuf chaque fois ajoutez 10 ul de tampon de charge Orange G TC chaque chantillon et m langez bien Ponte r 4 ange 4 Chargez 20 pl de marqueur de poids mol culaire Ts et 20 ul de chaque chantillon dans votre gel comme indiqu ci dessous Couloir Echantillon Volume charg 1 Echantillon 1 Aliment de contr le non 20 pl OGM avec amorces de plante s 2 Echantillon 2 Aliment de contr le non 20 pl Gel de polyacrylamide OGM avec amorces d OGM a Polyacrylamide Gel 3 Echantillon 3 Aliment tester avec 20 pl d amorces de plante agarose 4 Echantillon 4 Aliment tester avec 20 pl amorces d OGM 5 Echantillon 5 ADN OGM positif 20 pl avec amorces de plante 6 Echantillon 6 ADN OGM positif 20 pl avec amorces d OGM i Marqueur de poids mol culaire pour PCR 20 pl 8 Laissez vide 5 Le temps de migration et le voltage d pendront du type de gel que vous utilisez Traitez un gel d agarose pendant 30 min 100 V et un gel de 4 polyacrylamide 200 V pendant 20 min PL 74 j 9 ks i Electrophor
4. 70 pour liminer le Fast Blast de la plupart des surfaces V rifiez que ces solutions ne sont pas nocives pour la surface avant de les utiliser Pr paration pour le mode op ratoire de la coloration Pour pr parer du colorant 1X diluez 1 ml de Fast Blast 500X avec 499 ml d eau distil e ou d min ralis e dans un ballon ou une bouteille de taille appropri e et m langez Couvrez le ballon et stockez le temp rature ambiante jusqu ce que vous soyez pr t l utiliser 22 Cours 4 S chage des gels et analyse des r sultats Pour un enregistrement permanent de l exp rience les gels peuvent tre s ch s entre des feuilles de cellophane et incorpor s dans les cahiers de TP voir ci dessous les modes op ratoires pour ces deux m thodes de s chage Pour documenter les gels humides ils peuvent tre scann s photocopi s un fond jaune fournit un contraste optimal ou trac s sur un film d ac tate Remarque les gels d agarose 3 n adh rent pas bien au film de support des gels d agarose M thode de s chage GelAir Mat riaux n cessaires pour s cher 8 Gels En utilisant le syst me de s chage de gel r f 165 1771EDU Quantit Cellophane GelAir r f 165 1779EDU 4 feuilles Table d assemblage GelAir r f 165 1776EDU 1 Cadres de s chage GelAir r f 165 1775EDU 2 Attaches GelAir r f 165 1780EDU 16 Four de s chage GelAir facultatif r f 165 1777EDU 1 Eau distill e 500 ml En variante
5. Couloir 7 Marqueurs de poids mol culaires de PCR 1000 700 500 200 100 pb 24 Etape 1 v rifier Que la PCR de plants fonctionne Y a HI une bande de 455 pb de la matrice OGM postive et des amorcer de plants couloir y 1 tn us 7 Oui 4 Etape 2 v rifier que la PCR d OGM fonctionn Ya HI un bande d 205 pb de la matrice OGM poultivs st des amorcer d plante couloir 6 y Etape 3 v rifier que l ADN a 606 etrait d allment non OGM Ya HI une bande de 455 pb de la matrice OGM poutive et der amorcer de plants couloir 1y Oui 4 Etape 4 V rifier que leu r actions d PCR n sont pas contamin s Y a HI une bande d 200 pb d aliment Etape 5 v rifier que l ADN a t etralt de l allments tester Y a HI une bande de 455 pb de l aliment a tenter st des amorces d plante couloir 3y non OGM et des amorcer d OGM couloir 27 Etape 6 L allment4 tenter eati OGMpontt Y a HI une bande d 200 pb de l aliment a tortor st d s amorcer d OGM couloir 4y L allment contient d s OGM Paut 28 l tape 2 Ieitponble d faire certaines conclu ons mala pas d trer d s conclusions d finitives Aucune concluson ne peut tre tir e aur l tat d OG M de l aliment 4 tester parce que la PCR d OGM n fonctionne pas correctement Pau 24 l tape 4 I eitponlble d falre certaines concluson mala pas d tirer des conclusions d finitives
6. chantillon donne un r sultat OGM positif cela indique une contamination de la r action Si votre aliment tester donne galement un r sultat OGM positif vous ne pouvez pas faire confiance ce r sultat Veuillez noter qu une contamination est tr s courante en PCR cause de sa sensibilit tr s lev e et des garanties doivent tre prises pour viter toute contamination S assurer que la r action de PCR fonctionne comme attendu Le kit contient galement de l ADN matrice qui code pour les s quences de la plante et de l OGM Celui ci sert de contr le contre des faux n gatifs Si ces s quences contr les ne sont pas amplifi es il y a un probl me avec la r action de PCR et vous ne pouvez pas faire confiance un r sultat OGM n gatif de votre aliment tester Ceci vous donne galement de bandes de r f rence pour celles produites par les chantillons tester Tester un large ventail d aliments GM Ce kit utilise la PCR duplex ce qui signifie que deux s quences cibles sont amplifi es simultan ment Les deux paires d amorces dans la r action de PCR amplifieront deux s quences d ADN un fragment de 203 pb du promoteur CaMV 35S et un fragment de 225 pb du terminateur NOS Ces amorces ont t incluses de mani re pouvoir d tecter un plus large ventail d aliments GM puisque certains aliments contiennent juste le promoteur CaMV 35S certains juste le terminateur NOS et certains les deux En utilisant ces deux
7. gatif La pr sence ou l absence d une bande de 200 pb dans le couloir 5 indique si l aliment tester contient ou non des OGM Toutefois la validit de ce r sultat d pend des r sultats des autres r actions de PCR Les amorces de plante d terminent si l ADN v g tal a t extrait avec succ s de l chantillon L aliment contr le non OGM est un indicateur de r sultats faux positifs s il y en a Si l aliment contr le non OGM sort en OGM positif montrant une bande dans le couloir 2 cela signifie que la PCR a t contamin e un moment quelconque au cours du traitement Si votre aliment tester est galement OGM positif vous ne pouvez pas faire confiance ce r sultat Le contr le matrice OGM positif est un indicateur de faux n gatifs Si le contr le matrice OGM positif ne s amplifie pas il y a un probl me avec la r action de PCR et vous ne pouvez pas faire confiance un r sultat OGM n gatif pour votre aliment tester L organigramme sur la page suivante montre comment valuer ces contr les tape par tape Echantillon de PCR Taille de bande Couloir 1 Aliment non OGM avec amorces de plante 455 pb Couloir 2 Aliment non OGM avec amorces d OGM Aucune bande Couloir 3 Aliment tester avec amorces de plante 455 pb Couloir 4 Aliment tester avec amorces d OGM 200 pb ou aucune bande Couloir 5 Matrice OGM positive avec amorces de plante 455 pb Couloir 6 Matrice OGM positive avec amorces d OGM 200 pb
8. gion codante d un g ne puisse avoir une longueur de juste quelques centaines ou milliers de paires de bases le g ne lui m me peut avoir une longueur de dizaines de milliers de paires de bases cause de ses introns s quences non codantes Le clonage d un g ne entier peut tre tr s laborieux et peut prendre plusieurs ann es Les g nes contiennent des signaux qui r gulent leur expression dans les cellules de l h te mais ces signaux ne sont souvent pas compris par les cellules d un autre organisme Ainsi la troisi me tape consiste modifier le g ne de mani re ce que les cellules de la plante le lisent correctement et fabriquent la prot ine qui nous int resse Ceci est r alis en rationalisant le g ne pour liminer les introns qui ne sont pas n cessaires et en ajoutant ou en modifiant des s quences qui permettront au g ne d tre exprim au sein des cellules de la plante y compris un promoteur et un terminateur voir la Figure 1 Le promoteur sert de site d arrimage pour l ARN polym rase et de signal pour o d marrer la transcription d un g ne Le terminateur est le signal pour stopper la transcription Les promoteurs et les terminateurs natifs des g nes non modifi s interagissent avec d autres composants d une cellule h te pour activer ou d sactiver des g nes selon le type cellulaire et la situation mais les scientifiques peuvent modifier les produits de construction pour les OGM de mani re ce que le g ne
9. se r v lent ils OGM positifs D abord v rifiez vos contr les Est ce que le r sultat de votre aliment de contr le non OGM pour ce test est n gatif pour les OGM Si la r ponse est oui vous pouvez encore avoir une contamination dans juste cet chantillon plut t que dans toutes les r actions aussi le meilleur moyen de confirmer votre r sultat est de r p ter le test Toutefois il peut bien y avoir des OGM dans l aliment tiquet non OGM Diff rents pays ont des r glementations diff rentes pour l tiquetage des aliments La plupart des pays permette d tiqueter les aliment non OGM ou en variante non tiquet s OGM lorsque le pourcentage de substances d riv es d OGM dans l aliment est inf rieur un taux l gif r g n ralement 1 5 Le test par PCR est assez sensible pour d tecter ces taux bas Des tests quantitatifs de d tection du pourcentage d OGM dans des aliments peuvent tre r alis s par un laboratoire d analyse des OGM utilisant la PCR en temps r el Pourquoi mes contr les non OGM sont ils OGM positifs A un certain point du traitement les chantillons ont t contamin s avec de l ADN OGM positif Pourquoi n aije pas obtenu de l ADN v g tal viable Des erreurs peuvent tre faites au cours de l extraction de l ADN lesquelles peuvent tre v rifi es en r p tant le test Toutefois certains aliments ne produisent pas de l ADN pouvant tre amplifi par PCR Ce kit a t optimis pou
10. tranger soit continuellement transcrit et que la prot ine trang re soit produite dans toute la plante Le promoteur le plus courant utilis dans les r coltes GM est le promoteur 35S partir du virus de la mosa que du chou fleur CaMV 35S Ce promoteur est choisi parce qu il est d j con u par nature pour activer la transcription dans tous les types de cellules v g tales Le terminateur le plus courant utilis dans les r coltes GM est le terminateur de la nopaline synthase NOS provenant de Agrobacterium tumefaciens Le kit GMO Investigator peut identifier ces deux modifications g n tiques dans des produits alimentaires vendus en magasin L un ou les deux de ces l ments g n tiques sont pr sents dans 85 de toutes les r coltes GM actuellement approuv es dans le monde entier Promoteur G ne Terminateur MIN IN IN IN INIAAMININN ARN polym rase Fig 1 Structure d un g ne Une fois que le g ne est modifi avec le promoteur et le terminateur appropri s il doit tre introduit dans la plante voir la Figure 2 Le g ne ne peut pas tre ins r dans toutes les cellules d une plante existante la place des cellules v g tales individuelles sont transform es avec le g ne modifi et ensuite de nouvelles plantes sont d velopp es partir de ces cellules uniques Les cellules sont d abord pr lev es de la plante m re puis cultiv es sur un milieu sp cial qui fait qu elles vont former un agr ga
11. vous pouvez utiliser la m thode avec un sandwich de cellophane et un r cipient en plastique Mat riaux n cessaires pour s cher 8 Gels en utilisant des r cipients en plastique Quantit Cellophane GelAir r f 165 1779EDU 16 feuilles R cipient en plastique 8 Elastiques 16 Eau distill e 500 ml Proc dure 1 Pr humidifiez 2 feuilles de cellophane dans un r cipient d eau pendant 15 20 secondes 2 Placez une feuille de cellophane sur un r cipient en plastique Tendez la cellophane de mani re ce qu elle forme une surface plane sur le dessus du r cipient et utilisez un lastique pour maintenir la feuille en place 3 Placez un gel sur la cellophane L inondation de la surface de la cellophane autour du gel avec de l eau aidera liminer les bulles 4 Placez la seconde feuille de cellophane humidifi e sur le gel cause de leur paisseur vous ne pouvez pas viter les bulles sur les bords des gels d agarose mais vitez les bulles entre la cellophane et le gel S curisez la seconde feuille sur la bo te avec un second lastique 5 Laissez le gel s cher pendant plusieurs jours dans une zone bien ventil e 6 Le contraste sur les gels d agarose peut tre am lior en enlevant la cellophane une fois que les gels d agarose ont s ch Ceci n est pas possible avec les gels de polyacrylamide 23 R sultats typiques de classe 1000 pb R sultat pour aliment OGM positif R sultat pour aliment OGM n
12. Avant les TP e Lire le manuel 2 h Acheter des chantillons d aliments en magasin selon les besoins Inventorier les accessoires n cessaires 1 h Effectuer la pr paration pr alable par l enseignant 30 min 3 h pour chaque TP Pr parer les postes de travail des l ves 30 min 1 h pour chaque TP Cours de 50 minutes e Cours 1 Extraction de l ADN 50 min Cours 2 Pr paration des r actions de PCR 50 min Ex cution des r actions de PCR 4 h g n ralement la nuit Cours 3 Electrophor se de l ADN et coloration des gels 50 min Cours 4 Analyse des r sultats 50 min Blocs de cours de 90 minutes e Cours 1 2 Extraction de l ADN et pr paration des r actions de PCR 90 min e Ex cution des r actions de PCR 4 h e Cours 3 4 Electrophor se de l ADN coloration des gels et analyse des r sultats 90 min Probl mes de s curit Il est interdit de manger boire fumer et de s appliquer des cosm tiques dans la zone de travail Le port de lunettes et de gants de protection est fortement recommand Les l ves doivent se laver les mains avec du savon avant et apr s cet exercice Si un l ve re oit une solution quelconque dans les yeux rincez avec de l eau pendant 15 minutes Bien que le colorant d ADN Fast Blast ne soit pas toxique vous devez porter des gants en latex ou en vinyle lors de la manipulation du colorant pour viter que vos mains soient color es Il faut porter des blouses de
13. Des directions s par es sont fournies ci dessous pour chaque m thode d lectrophor se apr s les directions communes aux deux Mat riaux n cessaires Quantit Tampon de charge orange G 1 flacon Marqueurs de poids mol culaires pour la PCR 1 flacon Microtubes essai avec bouchons attach s 16 tubes Micropipette volume ajustable de 20 200 yl 1 Micropipettes volume ajustable de 2 20 ul ou micropipettes volume fixe de 20 Hi 8 C nes de 20 200 yl filtre ou standards 1 portoir C nes de 2 20 yl filtre 8 portoir Alimentation lectrique 2 4 Colorant d ADN Fast Blast 1 bouteille Ballon ou bouteille de 500 ml pour stocker le colorant Fast Blast dilu 1 Eau distill e 3 51 Plateaux de coloration des gels 1 8 Mat riaux et instrument pour l lectrophor se Voir ci dessous Mode op ratoire temps estim 1 3h 1 D congelez le tampon de charge Orange G et les marqueurs de poids mol culaires pour la PCR et centrifugez les tubes pour entra ner les composants au fond 2 Ajoutez 40 Hl de tampon de charge Orange G au flacon des marqueurs de poids mol culaires pour PCR M langez bien et centrifugez 3 Etiquetez les microtubes essai avec bouchons attach s e Etiquetez 8 tubes TC e Etiquetez 8 tubes MPM 4 Ajoutez 70 ul de tampon de charge Orange G chacun des 8 tubes marqu s TC Ceci peut tre pr par l avance et stock 4 C pendant 1 2 mois 5 Ajoutez 25 ul de marqueurs de
14. Ready Gel utilis s pour l lectrophor se de l ADN pour ces travaux pratiques sont diff rents des gels contenant du SDS 15 utilis s pour les prot ines dans les travaux pratiques des empreintes prot iques et les deux types ne doivent pas tre substitu s l un l autre Remarque Les enseignants peuvent choisir d assembler les cuves 1 heure avant les travaux pratiques Pr parez les chambres d lectrophor se Mini PROTEAN 3 1 Retirez le peigne du gel pr coul Ready Gel et coupez et enlevez la bande le long du bas de la cassette comme il a t d crit ci dessus 2 Si deux gels doivent tre trait s dans une chambre d lectrophor se placez une cassette de chaque c t de l assemblage des lectrodes avec les plaques courtes tourn es vers l int rieur de l assemblage Si vous ne traitez qu un seul gel placez une cassette Ready Gel sur un c t de l assemblage des lectrodes et un barrage de tampon de l autre c t Assurez vous de placer le c t du barrage de tampon sur lequel est inscrit BUFFER DAM dirig vers l int rieur 3 Ouvrez les barri res cames sur le devant du cadre d immobilisation Maintenez les deux cassettes Ready Gel ou le gel Ready Gel et le barrage de tampon contre l assemblage des lectrodes et glissez l assemblage des lectrodes dans le cadre d immobilisation 4 Appuyez sur le bord externe de l assemblage des lectrodes pas sur les gels tout en fermant les cames du cadre d immobilisation
15. apprendre le sujet dans le contexte de la recherche et d appliquer les r sultats des exp riences des arguments et des explications scientifiques Le kit Biotechnology Explorer GMO Investigator suit cette approche Il fournit une tude guid e dans laquelle les l ves r unissent des aliments courants extraient l ADN de l chantillon amplifient des s quences g n tiques en utilisant la PCR et utilisent l lectrophor se sur gel pour identifier la pr sence ou l absence des s quences marqueurs amplifi es Les l ves sont encourag s analyser leurs r sultats dans le contexte des contr les exp rimentaux pour estimer s ils peuvent d terminer si les aliments qu ils consomment couramment ont t g n tiquement modifi s GM Le kit peut tre utilis pour couvrir les domaines suivants Recherche scientifique Utilisation de techniques sophistiqu es pour d tecter des OGM Utilisation de contr les exp rimentaux positifs et n gatifs multiples Analyse et interpr tation des r sultats exp rimentaux Biochimie Propri t s chimiques des composants cellulaires Techniques d extraction de l ADN R plication de l ADN et PCR Electrophor se sur gel de l ADN H r dit et biologie mol culaire Transformation g n tique pour cr er des OGM Contr le de l expression g nique Techniques de profilage de l ADN Cultures traditionnelles par rapport GM Expression et r gulation des g nes dans des h tes trangers Structure et f
16. d veloppement et permettre aux r coltes de se d velopper sur des terres pr c demment inexploitables Identification des r coltes GM Comment tester des aliments et des r coltes pour identifier ceux qui contiennent des g nomes GM voir la Figure 3 Deux m thodes sont actuellement utilis es La premi re la technique ELISA enzyme linked immunosorbent assay identifie les prot ines Il s agit d un test bas sur des anticorps et il identifie les prot ines sp cifiques produites par les plantes GM La technique ELISA ne peut tester que des produits frais cause de la d gradation des prot ines survenant au cours du traitement des aliments En outre puisque la technique ELISA identifie les prot ines produites dans les r coltes d OGM les tests doivent tre individualis s selon le type de r colte Par exemple une test ELISA Bt ne peut d tecter que du ma s Bt et non pas du ma s GM r sistant aux herbicides Toutefois la technique ELISA est peu co teuse et exacte et elle peut tre r alis e sur le terrain avec peu de savoir faire Le second test utilisant la r action en cha ne de la polym rase PCR identifie des s quences d ADN qui ont t ins r es dans la plante GM Au contraire des prot ines l ADN est une mol cule relativement stable ainsi des fragments d ADN peuvent tre isol s partir d aliments hautement trait s et ils sont suffisamment intacts pour tre amplifi s par PCR Une version modifi e de la PCR
17. la PCR en temps r el peut galement quantifier le pourcentage de mat riau GM dans l chantillon d aliment Au contraire d un test ELISA qui est sp cifique d une r colte unique un simple test de PCR comme celui ci peut d tecter 85 de la totalit des r coltes Ceci parce que les ing nieurs du g nie g n tique n utilisent qu un petit nombre de s quences r gulatrices s quences promoteurs et terminateurs pour contr ler l expression des g nes ins r s et ainsi ces s quences sont communes la majorit des r coltes GM Deux des s quences r gulatrices les plus courantes sont le promoteur 35S du virus de la mosa que du chou fleur et le terminateur de la nopaline synthase NOS de Agrobacterium tumefaciens qui sont les s quences d tect es par ce kit Broyage de l chantillon d aliment D tection des OGM par PCR D tection des OGM par ELISA Avez vous obtenu de l ADN v g tal Recherchez le g ne du chloroplaste du PSII par PCR Oui ADN v g tal viable Non ADN v g tal non viable Pas de conclusions possibles r p tez le test L ADN est il GM Recherchez le promoteur 35S et le terminateur NOS par PCR Oui ADN d OGM pr sent Non ADN d OGM non pr sent L aliment contient des OGM L aliment ne contient pas d OGM Quantification de la teneur GM par PCR en temps r el Fig 3 Comment d tecter des OGM dans un aliment 10 Exp rience de recherche guid e Ce kit est un TP avanc cau
18. laboratoire ou d autres v tements protecteurs pour viter la coloration des v tements 12 Mesures des volumes La pr paration avanc e de l enseignant n cessite une pipette volume ajustable de 2 20 lil de 20 200 ul et de 100 1000 ul et des c nes filtre des c nes filtre sont n cessaires pour emp cher la contamination des r actifs et de vos pipettes Des pipettes de transfert en plastique jetables gradu es st riles sont fournies et peuvent tre utilis es pour des volumes de 50 100 250 500 750 et 1000 pl L illustration montre les marques sur la pipette de transfert en plastique jetable correspondant aux volumes mesurer Les volumes sup rieurs 1 ml n cessiteront des additions multiples Pour chaque tape de la pr paration des travaux pratiques utilisez une nouvelle pipette de transfert en plastique jetable ou un nouveau c ne de pipette Mortiers et pilons Ces travaux pratiques n cessitent que les aliments soient broy s l aide d un mortier et d un pilon Veuillez vous assurer qu ils ont t bien lav s afin d liminer tous les produits chimiques r siduels qui peuvent interf rer avec les r actions de PCR En outre rincez les mortiers et les pilons avec de l eau de Javel 10 qui d truit tout ADN r siduel et ensuite rincez avec de l eau pour liminer l eau de Javel Le mode op ratoire demande aux l ves de pr parer un chantillon d aliment non OGM puis de laver le mortier et le p
19. m C nes de 2 20 yl filtre 8 portoirs J r f 211 2006EDU C nes de 20 200 ll filtre 1 portoir m r f 211 2016EDU C nes de 200 1000 ui filtre 1 portoir m r f 211 2021EDU Mortier et pilon 8 m Marqueurs 8 u Aliment tester provenant d un magasin 1 8 u Eau distill e 3 51 u Bain marie r f 166 0524EDU 1 u Microcentrifugeuse r f 166 0612EDU ou minicentrifugeuse r f 166 0613EDU 1 4 m Balance avec une plage de 0 5 2 g et poids ou papier de pes e 1 m Thermocycler MyCycler r f 170 9703EDU 1 u Alimentation lectrique PowerPac Basic r f 164 5050EDU 2 4 u 2 Si vous utilisez une lectrophor se sur gel d agarose Accessoires requis Nombre Kit 4 Chambres horizontales d lectrophor se avec plateaux de coulage de gel et peignes r f 166 4000EDU 4 8 Q Mini module d lectrophor se sur gel d agarose r f 166 0450EDU contenant 25 g d agarose 100 ml de TAE 50X 100 mi de colorant d ADN Fast Blast 1 Q Si vous utilisez une lectrophor se sur gel de polyacrylamide Accessoires requis Nombre Kit 4 3 chambres verticales d lectrophor se Mini PROTEAN r f 165 3302EDU 4 a Gels pr coul s 10 de TBE ReadyGel r f 161 1110EDU 8 m Tampon Tris borate EDTA 10X TBE 10X r f 161 0733 11 Q Colorant d ADN Fast Blast r f 166 0420 100 ml m C nes Prot Elec 8 portoirs a Remarque les gels de polyacrylamide ont une dur e de conservation de 3 mo
20. pour assurer un joint sur le bord inf rieur de chaque cassette 5 Placez le cadre d immobilisation assembl contenant le s gel s dans le r servoir de la cuve Remplir la chambre sup rieure de tampon l espace entre les deux gels avec 150 ml de tampon de migration TBE 1X de sorte que le niveau du tampon soit au dessus des plaques courtes internes V rifiez l absence de fuites Si l assemblage fuit retirez le cadre d immobilisation assembl videz le tampon rouvrez les cames et appuyez de nouveau sur l assemblage des lectrodes tout en fermant les cames avant de remplir nouveau avec du tampon 21 6 Versez 200 ml de tampon de migration TBE 1X dans la chambre inf rieure de tampon ou r servoir V rifiez par deux fois le niveau de remplissage du tampon dans la chambre sup rieure de tampon le niveau du tampon doit tre au dessus des plaques courtes internes Si les fuites de la chambre sup rieure de tampon ne peuvent pas tre corrig es en r assemblant le cadre d immobilisation dans l tape 5 il est possible de remplir la chambre inf rieure r servoir au dessus des petites plaques internes pour galiser les niveaux de tampon dans les deux r servoirs Ceci n cessite approximativement 900 mI de tampon de migration TBE 1X be et migration des gels de polyacrylamide Sidisponible placez un guide jaune de charge des chantillons sur le haut de l assemblage des lectrodes Le guide dirigera le c ne de la pipette vers l
21. qu il existe un potentiel de cr er des super mauvaises herbes par l interm diaire d une pollinisation crois e avec des r coltes r sistantes aux herbicides ou que des super insectes volueront et ne seront plus r sistants aux toxines contenues dans les r coltes r sistantes aux parasites De nombreuses personnes sont concern es par les r actions allergiques potentielles aux nouvelles prot ines ou par la r sistance aux antibiotiques surgissant des marqueurs s lectionnables utilis s pour d velopper les r coltes ou par d autres effets impr vus sur la sant publique Les partisans des aliments g n tiquement modifi s soutiennent que ces r coltes sont vraiment meilleures pour l environnement Moins de produits chimiques toxiques sont r pandus dans l environnement et ainsi moins de produits chimiques toxiques peuvent nuire l environnement et la sant de l homme En outre ces r coltes peuvent prot ger des terres arables en r duisant le stress sur les terres am liorer la Valeur nutritionnelle des aliments dans les pays en d veloppement et permettre aux r coltes de se d velopper sur des terres pr c demment inexploitables Ce manuel peut tre t l charg sur Internet Visitez nous sur le Web http explorer bio rad fr ou appelez nous Nous nous effor ons d am liorer continuellement nos cours et nos produits et vos histoires id es et suggestions sont les bienvenues L quipe Bio Education Bio Rad division Bio Rech
22. sont disponibles chez Bio Rad Mat riaux n cessaires en plus de ceux indiqu s pour le cours 3 Quantit Agarose 105g TAE 50X 60 ml Eprouvettes gradu es 3 et 500 ml 2 Micro ondes ou plaque br lante magn tique et b ton d agitation 1 Bouteille ou ballon d Erlenmeyer 1 1 Ballon 50 ml facultatif 1 Bain marie 60 C facultatif 1 Plateaux de coulage des gels 4 8 Peignes pour les gels 8 Scotch autoclave facultatif 1 rouleau Chambre horizontale d lectrophor se 4 8 1 Pr parez le tampon d lectrophor se Le tampon d lectrophor se est fourni concentr 50X Du tampon TAE 1X est n cessaire pour fabriquer le gel d agarose et il est galement n cessaire pour chaque chambre d lectrophor se Trois litres de tampon TAE 1X suffiront pour faire fonctionner 8 chambres d lectrophor se et pour 8 gels d agarose Pour fabriquer 31 de TAE 1X partir de concentr de TAE 50 X ajoutez 60 ml de concentr 50X 2 94 d eau distill e 18 2 Fabriquez la solution d agarose La concentration du gel recommand e pour cette application est de 3 en agarose Cette concentration d agarose fournit une excellente r solution et minimise le temps de migration pour la s paration lectrophor tique des fragments de PCR Pour fabriquer une solution 3 ajoutez 3 g d agarose en poudre 100 ml de tampon d lectrophor se TAE 1X dans un r cipient appropri r sistant la chaleur qui est assez grand pour p
23. une pipette de transfert ou une micropipette volume ajustable de 200 1000 yl Remarque La matrice requiert un m lange constant pour distribuer uniform ment les billes microscopiques Ceci est facilement r alis par aspiration et rejet avec la pipette entre chaque aliquot 2 Versez au moins 25 ml d eau distill e dans les b chers ou r cipients propres et tiquetez les eau distill e 3 R glez le bain marie 95 100 C au moins 30 min avant les TP 4 Facultatif Pr parez le contr le d aliment certifi non OGM par Bio Rad Pour gagner du temps vous pouvez souhaiter pr parer le contr le d aliment non OGM l avance si c est le cas nous recommandons de pr parer l chantillon avant l tape de centrifugation voir le mode op ratoire des l ves 5 Pr parez les postes de travail des l ves 6 Pr parez le poste de travail en commun Mat riel des postes de travail des l ves Quantit Tube avec bouchon vis avec 500 yul de matrice InstaGene 2 B cher d eau distill e 1 Pipettes de transfert 2 Mortier et pilon 1 Aliments tester 1 8 Marqueur 1 Se reporter au tableau page 26 pour des suggestions d aliments utiliser Mat riel du poste de travail en commun Quantit Bain marie r gl 95 100 C 1 Microcentrifugeuse ou 1 minicentrifugeuses 3 4 Balance et poids 1 14 Cours 2 Pr paration des r actions de PCR Mat riaux n cessaires pour la pr paration labor e Quantit T
24. Les gels d agarose peuvent tre stock s envelopp s dans un film de plastique scell s dans des sachets en plastique ou immerg s dans du tampon TAE 1X pendant 2 semaines 4 C et migration des gels d agarose Placez le plateau de gel sur une chambre d lectrophor se d ADN uniformis e de mani re ce que les puits des chantillons soient l extr mit de la cathode noire de la base Les chantillons d ADN migreront vers l extr mit de l anode rouge de la base au cours de l lectrophor se 2 Remplissez la chambre d lectrophor se avec du tampon de migration TAE 1X jusqu environ 2 mm au dessus de la surface du gel 3 Chargez les gels comme il est indiqu dans le mode op ratoire de l l ve 4 Faites migrer les gels 100 V pendant 30 min On peut obtenir une plus grande r solution en utilisant un temps de migration plus long par exemple 45 min mais si vous utilisez des gels doubles ne faites migrer les gels qu 100 V pendant 30 min parce que l ADN du gel sup rieur pourrait migrer dans le gel inf rieur Ne laissez pas le colorant orange migrer hors du gel 5 Colorez les gels dans du colorant d ADN Fast Blast voir ci dessous Pr paration pour colorer les gels d agarose Le colorant d ADN Fast Blast est fourni sous la forme d un concentr 500X qui doit tre dilu avant utilisation Le colorant peut tre utilis comme un colorant rapide lorsqu il est dilu 100X pour permettre la visualisati
25. a position correcte pour charger chaque chantillon dans un puits 2 Utilisez des c nes Prot Elec pour charger les chantillons dans les puits Ces c nes tr s troits peuvent passer entre les deux plaques de gel et d livrer les chantillons directement dans les puits Si vous ne disposez pas de c nes Prot Elec ou similaires placez le c ne directement au dessus du puits et entre les deux plaques de gel et laissez l chantillon tomber doucement dans le puits 3 Apr s le d p t r aliser la migration des gels de polyacrylamide 200 V pendant 30 min II est acceptable que le front du colorant orange migre en dehors mais stoppez l lectrophor se si le colorant rouge arrive 2 cm du bas du gel 4 Lorsque les gels ont fini de migrer teignez l alimentation lectrique et d branchez les c bles Retirez le couvercle et sortez l assemblage des lectrodes et le cadre d immobilisation 5 D versez le tampon de migration de l assemblage des lectrodes Ouvrez les cames et retirez les cassettes de gel 6 Pour que le gel ne soit pas contamin par vos doigts portez des gants pour manipuler les gels partir de maintenant Posez une cassette de gel plat sur la paillasse avec la plaque courte tourn e vers le haut Coupez la bande le long des bords de la cassette de gel S parez soigneusement les plaques de gel avec une spatule ou vos doigts Normalement le gel adh re l une des plaques Transf rez la plaque avec le gel qui lu
26. ad Sub Cell GT Les plateaux de gel de 7 x 7 cm permettent de couler un seul gel Les plateaux de gel de 7 x 10 cm gel permettent de couler un gel double c est dire un gel avec deux rang es de puits qui peuvent tre charg s avec les chantillons de deux quipes d l ves Ces gels plus longs ne s adaptent pas aux barri res de coul es et doivent tre trait s par la m thode du scotch autoclave 1 Scellez bien les extr mit s du plateau de gels avec des morceaux de scotch autoclave Pressez fermement sur le scotch autoclave aux bords du plateau de gels pour former un joint tanche aux liquides et laissez le plateau de gels plat 2 Pr parez une solution d agarose de la concentration et de la quantit souhait es dans du tampon d lectrophor se TAE 1X 3 Refroidissez l agarose au moins 60 C avant de verser un bain marie est utile pour cette tape 4 Alors que l agarose refroidit 60 C placez le peigne dans les fentes appropri es du plateau de gels Les peignes de gel doivent tre plac s 2 cm de l extr mit du plateau de coulage des gels 5 Versez 30 50 ml d agarose fondu dans le plateau sur une paisseur d approximativement 0 5 cm 6 Laissez le gel se solidifier temp rature ambiante pendant 10 20 minutes il est translucide lorsqu il est pr t l emploi 19 7 Retirez le peigne avec pr caution du gel solidifi Retirez le scotch autoclave des bords du plateau de gels
27. ape Fonction Temp rature Dur e Cycles D naturation initiale D naturation 94 C 2 min 1 Amplification par PCR D naturation 94 C 1 min 40 Hybridation 59 C 1 min longation 72 C 2 min longation finale longation 72 C 10 min 1 Maintien Maintien 4 C Ind finie L option de maintenir la temp rature 4 C n est pas disponible avec certains thermocyclers 16 Cours 3 Electrophor se des produits de PCR Les fragments d ADN amplifi s partir du promoteur 35S et du terminateur NOS sont respectivement de 203 et 225 paires de bases pb Le produit de PCR g n r partir du g ne du photosyst me Il est de 455 pb La s paration des bandes dans cette plage de tailles n cessite soit un gel d agarose 3 soit un gel de polyacrylamide 10 Les deux techniques de gel donnent des r sultats excellents Votre choix de la technique sur gel d pendra des instruments dont vous disposez et des techniques que vous souhaitez enseigner vos l ves Les gels de polyacrylamide sont beaucoup plus fragiles que les gels d agarose 3 et par cons quent ils peuvent n tre appropri s que pour des l ves plus exp riment s Toutefois les gels de polyacrylamide s parent les bandes un degr sup rieur ce qui permet la s paration des bandes d ADN de taille similaire g n r es partir d un aliment tester qui contient la fois le promoteur CaMV 35S et le terminateur NOS tel que la papaye g n tiquement modifi e
28. ast 500X avec 499 ml d eau distil e ou d min ralis e dans un ballon ou une bouteille de taille appropri e et m langez Couvrez le ballon et stockez le temp rature ambiante jusqu ce que vous soyez pr t l utiliser Pr paration pour le mode op ratoire de coloration rapide Pour pr parer du colorant 100X pour la coloration rapide diluez 100 ml de Fast Blast 500X avec 400 ml d eau distill e ou d min ralis e dans un ballon ou une bouteille de taille appropri e et m langez Couvrez le ballon et stockeze temp rature ambiante jusqu ce que vous soyez pr t l utiliser La d coloration pour le mode op ratoire de la coloration rapide n cessite l utilisation d au moins un r cipient de grand volume pouvant contenir au moins 500 ml chaque poste de travail des l ves Le Fast Blast 100X peut tre r utilis au moins 7 fois Veuillez noter qu au contraire des gels d agarose 1 les gels d agarose 3 n cessitent 5 min de coloration avant la d coloration dans de l eau chaude A cause du pourcentage lev d agarose les gels color s par cette m thode rapide prennent plus de temps pour se d colorer un niveau satisfaisant que les gels d agarose 1 Des lavages multiples avec de l eau du robinet chaude aideront la d coloration de ces gels 20 Electrophor se sur gel de polyacrylamide PAGE Pr paration des gels de polyacrylamide et du tampon de migration TBE Mat riaux n cessaires en plus de c
29. ations bivalents lib r s des cellules se fixent aux billes et la chaleur inactive les enzymes de d gradation de l ADN Les billes sont ensuite transform es en culot par centrifugation Le surnageant qui contient l ADN g nomique intact propre peut tre utilis comme matrice dans les r actions de PCR Les billes de la matrice InstaGene se d posent rapidement dans la solution Il est extr mement important que le flacon de matrice soit parfaitement homog n is avant de pipeter des aliquots pour chaque poste de travail des l ves de mani re ce que les aliquots contiennent des quantit s quivalentes de billes Si les chantillons d ADN ne sont pas amplifi s dans les 24 heures vous pouvez les stocker dans le r frig rateur dans la matrice InstaGene pendant 1 semaine Pour un stockage plus long d posez les chantillons dans le cong lateur pour emp cher la d gradation de l ADN Avant d utiliser les chantillons dans la PCR les billes doivent tre remises en culot par centrifugation juste avant de constituer les r actions de PCR Cours 2 Pr paration des r actions de PCR De nouveau les l ves doivent se souvenir de se pr server contre une contamination d utiliser des nouveaux c nes qui filtrent les a rosols chaque tape et de garder les tubes bouch s sauf lorsqu ils y ajoutent imm diatement un r actif Dois je retirer la matrice InstaGene avant la PCR Il est extr mement important de transformer en culot
30. bsence de s quences d OGM amplii es Dans cette activit les l ves emploient des techniques de biologie mol culaire la pointe de l art pour tester des aliments familiers Le kit fonctionnera mieux avec des l ves qui ont une certaine compr hension de base de la biologie mol culaire et une exp rience pr alable avec certaines des techniques impliqu es L exercice couvre une large diversit de domaines y compris le g nie et les transformations g n tiques la transcription et la traduction de l ADN la r gulation g nique la r plication de l ADN et la PCR le d veloppement et la physiologie des v g taux la science de l agriculture et de l environnement Strat gie d enseignement Etude guid e fond e sur des recherches Le kit GMO Investigator permet une approche de cet exercice par des recherches guid es Les l ves conduisent des proc dures scientifiques sophistiqu es qui ont des niveaux multiples de contr les Ceci leur permet d estimer la validit de leurs r sultats Ainsi non seulement ils d terminent la pr sence ou l absence de s quences d OGM dans les aliments qu ils testent mais ils se posent les questions suivantes et y r pondent avons nous r ussi extraire l ADN est ce que notre PCR a fonctionn comme on s y attendait et sommes nous en pr sence d une contamination Les r coltes GM sont elles une bonne chose De nombreuses personnes s opposent l utilisation de plantes GM Ils soutiennent
31. des hormones v g tales pour se diff rencier et se d velopper en plantes compl tes L insertion viable du g ne modifi dans le g nome d une plante est appel v nement Le processus de transformation est tr s d licat aussi les souches v g tales qui ont t optimis es pour la transformation sont rarement les m mes souches v g tales que celles utilis es dans les champs La cinqui me et derni re tape de la fabrication de r colte GM est de r trocroiser la r colte g n tiquement modifi e dans les souches v g tales produisant actuellement les rendements les plus lev s qui sont utilis es dans les champs Ceci peut prendre des ann es puisque seulement 50 du g nome de la r colte haut rendement est transf r dans la r colte g n tiquement modifi e chaque croisement Le processus de modification g n tique est tr s inefficace co teux et prend du temps il n y a habituellement qu une poign e d v nements qui r ussissent pour chaque r colte GM et cela n cessite des millions de dollars et six quinze ans pour amener chaque r colte sur le march D veloppement du callus indiff renci A Isolement des cellules v g tales Transformation du callus S lection des cellules Rediff renciation du callus D veloppement de la plante transg nique Fig 2 Comment fabriquer une r colte GM Les r coltes GM sont elles une bonne chose De nombreuses pers
32. e par exemple animal fongique bact rien Le mat riau g n tique tranger est habituellement un g ne qui code pour une prot ine qui procure la plante un avantage sur des plantes similaires Les exemples de traits conf r s comprennent la r sistance aux parasites la tol rance aux herbicides une maturation retard e des fruits une production am lior e des fruits une teneur nutritionnelle accrue etc Comment modifier g n tiquement une r colte La premi re tape du proc d de modification g n tique est d identifier une prot ine qui a le potentiel d am liorer une r colte Une classe populaire de r coltes GM a un g ne provenant de la bact rie du sol Bacillus thuringiensis Bt ins r dans leurs g nomes Les r coltes Bt produisent une prot ine appel e la delta endotoxine qui est l tale pour la pyrale du ma s un parasite courant des plants de ma s Les fermiers qui plantent des r coltes Bt n ont pas appliquer de pesticides parce que les plantes produisent la prot ine toxique dans leurs cellules La toxine Bt a t d abord identifi e dans les magnaneries comme une toxine qui tue les vers soie qui sont du m me genre que la pyrale du ma s La deuxi me tape est d isoler cloner le g ne qui code pour la prot ine Le g ne entier doit tre d abord localis au sein du g nome d un organisme puis il doit tre copi de mani re pouvoir l isoler ou le cloner partir de l organisme Bien qu une r
33. ec des bouchons vis et surmont es d une goutte d huile min rale pour emp cher l vaporation Les tubes sont d pos s dans un bloc thermique ou dans un bain marie r gl 95 C pendant 1 minute puis ils sont transf r s manuellement dans un bloc thermique ou un bain marie r gl 59 C pendant 1 minute et finalement ils sont transf r s dans un bloc thermique ou dans un bain marie r gl 72 C pendant 2 minutes Quarante cycles de PCR manuelle doivent prendre 3 heures C est fastidieux mais cela fonctionne Bonne chance Cours 3 Electrophor se des produits de PCR Electrophor se sur gel d agarose ou de polyacrylamide Les fragments d ADN amplifi s partir du promoteur 35S et du terminateur NOS sont respectivement de 203 et 225 paires de bases pb Le produit de PCR g n r partir du g ne du photosyst me Il est de 455 pb La s paration des bandes dans cette plage de tailles n cessite soit un gel d agarose 3 soit un gel de polyacrylamide 10 Les deux techniques sur gel donnent d excellents r sultats Votre choix de la technique sur gel d pendra des instruments dont vous disposez et des techniques que vous souhaitez enseigner vos l ves Les gels de polyacrylamide sont beaucoup plus fragiles que les gels d agarose 3 et par cons quent ils peuvent n tre appropri s que pour des l ves plus exp riment s Toutefois les gels de polyacrylamide s parent les bandes un degr sup rieur ce q
34. entrifugez pendant 5 min vitesse maximale 11 Stockez les tubes dans un r frig rateur jusqu au cours suivant A PC A j T NS A oe j 50 pl Bain marie 30 Jour 2 Pr paration des r actions de PCR 1 Num rotez les tubes de PCR de 1 6 et apposez vos initiales Les num ros doivent correspondre la teneur de tube suivante pe Solution d amplification ADN 1 20 yul de SA de plante vert 20 ul d ADN d aliment de contr le non OGM 2 20 ul de SA d OGM rouge 20 ul d ADN d aliment de contr le non OGM 3 20 yl de SA de plante vert 20 ul d ADN d aliment tester 4 20 ul de SA d OGM rouge 20 pl d ADN d aliment tester 5 20 yl de SA de plante vert 20 ul d ADN de contr le OGM positif 6 20 ul de SA d OGM rouge 20 ul d ADN de contr le OGM positif 2 Placez chaque tube dans un adaptateur de microtube sans bouchon sur le support en 1 j P U U mousse sur la glace 3 En vous reportant au tableau et en utilisant un c ne neuf pour chaque addition ajoutez 20 ul de solution d amplification indiqu e dans chaque tube de PCR bouchez les tubes Tube de PCR Tube sans Bain de bouchon glace y Solution d amplification 4 En vous reportant au tableau et en utilisant un c ne neuf pour chaque tube ajoutez 20 ul de l ADN indiqu assurez vous d viter le culot Matrice d InstaGene au fond des tubes M langez par ADN matrice pipetage rebouchez les tubes
35. erche 3 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette Sommaire Page G n ralit s S r le Kit singe tuent ga tn he tm et da anne 1 Liste de contr le de la composition du kit o000nnneeee oenen reee ornnes esee tnnns reenn nnnsrennnneeeeenne 2 Conformit au programme sise 4 Contexte pour les enseignants sine 6 Pr paration pr alable par l enseignant nnn0eoonenneeeo eene neee o eenre reto rnnrnesern nanesen renne renne 12 Cours 1 Extraction de l ADN des chantillons d aliments neseneeeee nanen eneee eeen 14 Cours 2 Pr paration des r actions de PCR ssssssnnnnesnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsnsrnnnnnnnnnennn 15 Cours 3 Electrophor se des produits de PCR ss ssssssnsssenssinerinrertnrnrtr tnter rnrerrnnre nenne 17 Cours 4 S chage des gels et analyse des r sultats nnnnosnneeeneeeee eneee neee eeneee eeen 23 R sultats typiques de classe 0n00neeneooe onnee eene nnee sernnr tese rrnrer een rnnnsnernnnnneeen ennenen 24 Conseils et questions fr quemment pos es ssseeneeene seene eene eetnretttrt attnr erenn nrern nne enre ee 26 MOde Gp raAlOIr 5 1 e E ea ee a TE Ei 30 Liste de contr le de la composition du kit Cette section liste les composants fournis dans le kit GMO Investigator Elle liste galement les accessoires n cessaires Chaque kit contient suffisamment de mat riaux pour 32 l ves r partis en 8 postes de travail avec 4 l ves chaque
36. ermettre une bullition vigoureuse par exemple un ballon d Erlenmeyer de 1000 mi une bouteille de Wheaton etc Pour 8 gels vous aurez besoin d approximativement de 350 ml d agarose fondu 10 5 g d agarose plus 350 ml de tampon TAE 1X L agarose doit tre fabriqu en utilisant du tampon d lectrophor se pas de l eau Faites tournoyer pour mettre l agarose en poudre en suspension dans le tampon Si vous utilisez un ballon d Edenmeyer retourner une fiole d Erlenmeyer de 50 ml dans l extr mit ouverte du ballon d Erlenmeyer de 1000 ml contenant l agarose La petite fiole agit comme une chambre de reflux permettant une bullition sans trop de perte de volume de tampon par vaporation L agarose peut tre fondu pour le coulage des gels sur une plaque br lante magn tique ou dans un four micro ondes Pr caution Utilisez des gants de protection des gants four des lunettes et des blouses de laboratoire comme il est appropri lors de la pr paration et du coulage des gels d agarose Un contact avec de l agarose fondu en bullition ou avec les r cipients contenant de l agarose br lant peut provoquer des br lures s v res M thode de la plaque br lante magn tique Ajoutez un barreau aimant dans le ballon contenant l agarose et le tampon Chauffez le m lange jusqu bullition tout en agitant sur une plaque br lante magn tique Les bulles ou la mousse doivent se rompre avant de s lever vers le col du ballon Portez la solut
37. eux indiqu s pour le cours 3 ___ Quantit Gels pr coul s avec TBE 10 Ready Gel r f 161 1110EDU 8 TBE 10X r f 161 0733EDU 300 ml Eprouvette gradu e 3 1 Chambre verticale d lectrophor se Mini PROTEAN 3 4 8 C nes Prot Elec 8 portoirs Couteau aiguis ou rasoir 1 Gels de polyacrylamide pr coul s avec TBE 10 Ready Gel Les gels de polyacrylamide doivent tre conserv s dans un r frig rateur jusqu au moment de l utilisation Ne commandez les gels que 2 3 semaines avant les TP pour obtenir des r sultats optimaux Ne les congelez pas Pour pr parer les gels pour les travaux pratiques ouvrez les emballages des gels en les d coupant au dessus d un vier ou d un r cipient laissez l exc s de tampon s goutter et jetez le papier filtre et l emballage en plastique Retirez le peigne plac entre les plaques en poussant doucement dessus du bout des doigts vers le haut Utilisez une lame de rasoir pour d couper le long de la ligne noire imprim e sur la bande situ e au bas devant la cassette de gel et d collez la bandelette de plastique couvrant le bas devant le gel comme il est indiqu sur la cassette de gel Assurez vous que toute la bande est enti rement retir e pour permettre la longueur enti re du bas du gel d tre expos e au courant lectrique Pour de meilleurs r sultats utilisez une pipette de transfert et du tampon de migration TBE 1X pour rincer les puits de tous d bris Remarque Les gels TBE
38. hermocyclers de Bio Rad ont t d velopp s pour fonctionner sans huile De l huile n est pas n cessaire dans les puits des blocs thermiques ou dans les tubes des chantillons Les puits des chantillons ont une certaine forme permettant un contact uniforme avec la plupart des tubes de PCR paroi fine de 200 pl N utilisez pas des microtubes essai paroi fine de 500 pl avec ces thermocyclers Le couvercle chauff du bloc des chantillons maintient une temp rature sup rieure au bloc des chantillons tout moment au cours d un programme de cycles thermiques Ceci emp che la vapeur d eau de se condenser sous le bouchon du tube chantillon r duisant de cette mani re l vaporation des chantillons et liminant le besoin de surcouches d huile dans les tubes Quelle est la stabilit des r actions de PCR nouvellement pr par es Une incubation tendue de la solution d amplification et de l ADN g nomique diminue l efficacit de l amplification Ainsi si vous souhaitez d poser deux classes dans une machine de PCR ou si vous avez plus de r actions de PCR que d espace dans votre thermocycler nous vous sugg rons de ne pas incuber les r actions pendant plus d une heure avant les cycles La PCR manuelle ll est possible de r aliser manuellement la PCR sans un thermocycler automatis bien que la PCR ne soit pas aussi efficace Pour une amplification par PCR manuelle les r actions doivent tre r alis es dans des tubes av
39. hons vis SAO solution d amplification d OGM 4 Ajoutez 600 yl de solution d amplification un tube SAP et un tube SAO Avant de distribuer les amorces dans les tapes 5 et 6 centrifugez de nouveau les tubes des amorces si n cessaire pour vous assurer que les composants ne sont pas pi g s dans le bouchon du tube 5 Ajoutez 12 ul des amorces vertes la solution d amplification dans le tube SAP et m langez Stockez sur glace M lange Solution des amorces d amplification 15 6 Ajoutez 12 ul des amorces rouges la solution d amplification dans le tube SAO et m langez Stockez sur glace 7 Ajoutez 70 yl de solution d amplification de plante aux amorces nouvellement ajout es dans chacun des 8 tubes restants tiquet s SAP 8 Ajoutez 70 yl de solution d amplification d OGM aux amorces nouvellement ajout es dans chacun des 8 tubes restants tiquet s SAO 9 D posez un tube SAP un tube SAO et un tube OGM dans un bain de glace pour chaque poste de travail 10 Pr parez les postes de travail des l ves Postes de travail des l ves Mat riel Quantit Bain de glace contenant des chantillons d ADN et des tubes SAO SAP et OGM 1 Tubes de PCR 6 Adaptateurs de PCR 6 Support de microtubes en mousse 1 Marqueur 1 Micropipette volume ajustable de 2 20 pl ou micropipette volume fixe de 20 pl 1 C nes de 2 20 ll filtre 1 portoir 11 Programmez le thermocycler Et
40. i adh re dans un plateau contenant du colorant Fast Blast 1X voir ci dessous en laissant le liquide d tacher le gel de la plaque Le gel peut tre soulev directement tr s doucement de la plaque et plac dans le colorant Pr paration pour la coloration des gels de polyacrylamide Le colorant d ADN Fast Blast est fourni sous la forme d un concentr 500X qui doit tre dilu 1X avant utilisation et qui colore l ADN dans le polyacrylamide en environ 30 minutes C est une alternative pratique sans risque et non toxique au bromure d thidium pour la d tection de l ADN Fast Blast contient un compos cationique qui appartient la famille de colorants des thiazines Les mol cules de colorant charg es positivement sont attir es par et se lient aux groupes phosphates charg s n gativement sur l ADN La formule d pos e du colorant colore l ADN en bleu profond dans les gels d agarose et fournit des r sultats tr s nets et coh rents WARNING Bien que le colorant d ADN Fast Blast soit non toxique et non canc rig ne vous devez porter des gants en latex ou en vinyle lors de la manipulation du colorant ou des gels color s pour emp cher vos mains de devenir bleues Vous devez porter des blouses de laboratoire ou d autres v tements de protection pour viter de colorer vos v tements Eliminez les solutions colorantes selon les modes op ratoires suivis sur votre site Utilisez soit de l eau de Javel 10 soit une solution d alcool
41. ible utile de l lectrophor se Puis je utiliser du bromure d thidium pour colorer mes gels Ce TP a t optimis pour l utilisation de colorant d ADN Fast Blast un colorant d ADN sans risque et non toxique Le bromure d thidium EtBr est le colorant traditionnel utilis pour visualiser l ADN et il est plus sensible que le Fast Blast et il fonctionnera bien pour colorer les gels pour ce TP Toutefois EtBr est un agent mutag ne connu et on le suspecte d tre canc rig ne et il n cessite l utilisation de lumi re UV pour visualiser l ADN Un d savantage de l utilisation d EtBr est que cause de sa sensibilit sup rieure les bandes de dim res des amorces peuvent tre plus visibles avec l EtBr qu avec le Fast Blast et cela peut entra ner une certaine confusion au niveau de l interpr tation des r sultats par les l ves moins exp riment s Si de l EtBr est utilis comme colorant pour les gels d agarose les gels doivent contenir 0 05 ug ml d EtBr dans l agarose Cette concentration produit un contraste maximal de bandes amplifi es Remarque le colorant d ADN Fast Blast stoppe la coloration de l EtBr aussi visualisez avec l EtBr avant le colorant Fast Blast Les gels de polyacrylamide doivent tre color s apr s l lectrophor se Colorez les gels dans 0 05 ug ml d EtBr et d colorez dans de l eau au moins 2 fois pendant 20 min Cours 4 Analyse des r sultats Pourquoi les aliments tiquet s non OGM ou organiques
42. ilon avec du d tergent et ensuite de pr parer leur chantillon d aliment tester Puisque l aliment non OGM est pr par en premier il ne devrait pas y avoir de risque de contamination de l aliment tester C est vous de d cider si vos l ves utilisent de l eau de Javel entre les chantillons Toutefois les mortiers et les pilons doivent tre rinc s avec de l eau de Javel 10 entre les diff rentes classes 13 Cours 1 Extraction de l ADN des chantillons d aliments Le c ur de ce TP est la qualit et la quantit d ADN extrait de votre aliment Le tableau page 26 liste la fiabilit de diff rents aliments en ce qui concerne l extraction d ADN et les r sultats de PCR les aliments les moins fiables peuvent produire des bandes plus faibles Si vous souhaitez que vos l ves d couvrent des aliments contenant des OGM vous pouvez vouloir viter les produits base de bl et de riz les fruits et les l gumes frais qui sont presque certainement OGM n gatifs et choisir des produits base de papaye de soja et de ma s Mat riaux n cessaire pour la pr paration avanc e Quantit Tubes avec bouchons vis 16 B chers ou r cipients pour eau distill e 8 Matrice InstaGene 1 bouteille Pipettes de transfert en plastique jetables 8 16 Bain marie r gl sur 95 100 C 1 Mode op ratoire temps estim 35 min 1 Ajoutez 500 yul de matrice InstaGene dans chacun des 16 tubes avec bouchons vis en utilisant
43. ion bullition jusqu la dissolution de toutes les petites particules transparentes d agarose Avec la petite fiole toujours en place mettez l agarose de c t pour refroidir 60 C avant de couler les gels un bain marie r gl 60 C est utile pour cette tape M thode du four micro ondes Placez le ballon ou la bouteille contenant la solution d agarose dans le four micro ondes Desserrez le bouchon de la bouteille s il y en a un Utilisez une puissance moyenne et r glez sur 3 minutes Arr tez le four micro ondes toutes les 30 secondes et faites tourner le ballon pour mettre en suspension l agarose non dissous Cette technique est le moyen le plus efficace pour dissoudre l agarose Alternez l bullition et les rotations de la solution jusqu la dissolution de toutes les petites particules transparentes d agarose Avec la petite fiole toujours en place mettez l agarose de c t pour refroidir 60 C avant de couler les gels un bain marie r gl 60 C est utile pour cette tape Coulage des gels d agarose En utilisant le syst me Mini Sub Cell GT de Bio Rad les gels peuvent tre coul s directement dans la cuve en utilisant des barri res de coul es avec le plateau de gels Si vous ne disposez pas de barri res de coul es utilisez la m thode avec du scotch autoclave pour le coulage des gels telle que pr sent e ci dessous D autres m thodes sont d taill es dans le manuel d instructions du Bio R
44. is ainsi ne commandez les gels que lorsque les TP sont programm s Accessoires facultatifs Nombre Kit 4 Syst me de s chage GelAir r f 165 177 1EDU 1 a Cellophane si vous n utilisez pas le syst me de s chage Gel Air r f 165 1779EDU 1 a Composants disponibles s par ment Matrice InstaGene r f 732 6030EDU Sachet de r actifs contenant la solution d amplification les amorces d OGM les amorces de PSII de plante les marqueurs de poids mol culaire de PCR le tampon de charge orange G r f 166 2501EDU Midi module d lectrophor se sur agarose comprend 125 g d agarose 1 de TAE 50X 100 mi de colorant d ADN Fast Blast r f 166 0455 Maxi module d lectrophor se sur agarose comprend 500 g d agarose 5 de TAE 50X 100 mi de colorant d ADN Fast Blast r f 166 0460 Tubes de PCR de 200 ll paroi fine 1000 r f 223 9473EDU Conformit au programme En 1996 la US National Academy of Sciences et ses groupes de travail conjointement avec la National Research Council ont publi les National Science Education Standards Ces standards r clament un changement par rapport l enseignement scientifique traditionnel qui comprend la m morisation de faits et d informations scientifiques couvrant de nombreux domaines et la conclusion des recherches avec le r sultat d une exp rience A la place les enseignants sont encourag s impliquer les l ves dans des tudes sur de longues p riodes de temps d
45. it de l aliment de contr le non OGM n est pas amplifi avec les amorces d OGM Si cet chantillon est contamin avec de l ADN OGM positif en produisant une bande sur le gel les r sultats de tout le TP ne seront pas concluants parce que tous les chantillons ont pu aussi tre contamin s et vous ne pouvez pas faire confiance un r sultat OGM positif pour vos chantillons d aliments tester Par cons quent il est imp ratif que vous et vos l ves preniez les bonnes mesures pour vous sauvegarder de toute contamination Souvenez vous que l ADN peut tre transform en a rosol se trouver dans les c nes des pipettes et flotter dans l air Le maintien des tubes bouch s sauf pendant l utilisation imm diate l utilisation de c nes filtre tous les stades du TP le nettoyage des surfaces de travail et des instruments et le rin age c nes des pipettes avec de l eau de Javel 10 pour d truire l ADN vous aideront r duire le risque de contamination 26 Matrice InstaGene Quelle est sa fonction La matrice InstaGene est constitu e d une suspension de billes microscopiques charg es n gativement qui fixent les cations bivalents comme le magn sium Mg Il est important d liminer les cations bivalents des chantillons d ADN extrait parce que les cations aident les enzymes qui d gradent l ADN matrice Lorsque des cellules v g tales sont lys es et port es bullition en pr sence de matrice InstaGene les c
46. les billes de InstaGene compl tement au fond du tube avant de pr lever un aliquot du lysat pour la r action de PCR Les billes se fixent aux cations bivalents tels que Mg qui sont essentiels la fonction de la Taq polym rase Ainsi si des billes sont transport es dans la r action de PCR celle ci pourrait tre inhib e La matrice InstaGene peut tre transform e en culot de mani re efficace par centrifugation 6000 x g pendant 5 min Lorsque vous transf rez les chantillons d ADN des chantillons d InstaGene pr levez soigneusement 20 pl du surnageant au dessus des billes qui contient l ADN g nomique Solution d amplification Qu est ce que c est La solution d amplification contient un m lange de nucl otides ou dNTP dATP dTTP dCTP et dGTP du tampon et de la Tag ADN polym rase La solution d amplification compl te est pr par e en ajoutant des amorces la solution d amplification juste avant la p riode de travaux pratiques Ainsi lorsque 20 pl de l ADN matrice sont ajout s 20 ul de solution d amplification compl te tous les composants n cessaires pour une r action de PCR de 40 pl sont pr sents Remarque Une fois que la solution d amplification et les amorces ont t m lang es elles doivent tre conserv es sur de la glace et utilis es dans les 30 minutes 1 h Ces r actifs sont extr mement sensibles Pourquoi les amorces sont elles rouges et vertes Les m lange des amorces contiennent un co
47. lorant compatible avec la PCR qui permettent de visualiser facilement et de distinguer les diff rentes solutions d amplifications Les colorants migrent galement dans le gel en mettant en vidence visuellement l lectrophor se 27 La PCR dans un thermocycler L amplification par PCR a lieu dans un thermocycler qui effectue des cycles d tapes de chauffage et de refroidissement en alternance Ces TP utilisent un cycle trois tapes l ADN subit une d naturation 94 C pendant 1 minute une hybridation 59 C pendant 1 minute et une longation 72 C pendant 2 minutes Ce cycle est r p t 40 fois au cours de la progression de l amplification par PCR Au cours de la d naturation les deux brins de l ADN matrice sont s par s pour donner acc s aux amorces de la PCR Au cours de l tape d hybridation les amorces de la PCR reconnaissent et se lient l ADN matrice Une fois que les amorces sont li es la Tag ADN polym rase tend les amorces pour r pliquer le segment d ADN au cours de l tape d longation La r action de PCR prendra approximativement 3 5 heures pour tre compl te Les tubes de PCR sont tr s petits et demandent des pr cautions lorsqu ils sont manipul s Il est important de boucher soigneusement et compl tement les tubes avant de les d poser dans le thermocycler Si les tubes ne sont pas compl tement ferm s une vaporation substantielle peut avoir lieu et l amplification par PCR sera inhib e Les t
48. on de l ADN en 12 15 minutes ou il peut tre utilis comme un colorant pendant une nuit lorsqu il est dilu 1X Le colorant d ADN Fast Blast est une alternative pratique sans risque et non toxique au bromure d thidium pour la d tection de l ADN Fast Blast contient un compos cationique qui appartient la famille de colorants des thiazines Les mol cules de colorant charg es positivement sont attir es par et se lient aux groupes phosphates charg s n gativement sur l ADN La formule d pos e du colorant colore l ADN en bleu profond dans les gels d agarose et fournit des r sultats tr s nets et coh rents AVERTISSEMENT Bien que le colorant d ADN Fast Blast soit non toxique et non canc rig ne vous devez porter des gants en latex ou en vinyle lors de la manipulation du colorant ou des gels color s pour emp cher vos mains de devenir bleues Vous devez porter des blouses de laboratoire ou d autres v tements de protection pour viter de colorer vos v tements Eliminez les solutions colorantes selon les modes op ratoires suivis sur votre site Utilisez soit de l eau de Javel 10 soit une solution d alcool 70 pour liminer le Fast Blast de la plupart des surfaces V rifiez que ces solutions ne sont pas nocives pour la surface avant de les utiliser Pr paration pour le mode op ratoire de la coloration pendant une nuit Recommand Pour pr parer du colorant 1X pour la coloration pendant une nuit diluez 1 ml de Fast Bl
49. onction des organismes Transformation et r g n ration des v g taux Structure cellulaire Biologie de l volution Implications des manipulations g n tiques Implications de l alt ration de la biodiversit v g tale et des cosyst mes Evolution des races entre les parasites et les v g taux Sciences de l environnement et de la sant Pesticides et herbicides Croissance des populations qualit de l environnement et d fis globaux R le place limites et possibilit s de la science et des technologies Plus sp cifiquement aux USA le kit couvre les standards suivants Standards Standard A Les l ves d velopperont des Conformit au standard Les l ves r aliseront une exp rience en utilisant des aptitudes r aliser des recherches proc dures sophistiqu es et des contr les multiples scientifiques Les l ves d velopperont une compr hension des recherches scientifiques Standard B Les l ves d velopperont une compr hension de la cellule Les l ves d velopperont une compr hension de la base mol culaire de l h r dit Les l ves d velopperont une compr hension de l vali tian hioloaiariea Les l ves d velopperont une comprehension de l interd pendance des organismes Standard F Les l ves d velopperont une compr hension de la croissance des populations de la qualit environnementale et des d fis nationaux et globaux Les l ves appliqueront les r
50. onnes s opposent l utilisation de plantes GM lls soutiennent qu il existe un potentiel que des super mauvaises herbes apparaissent par l interm diaire d une pollinisation crois e d esp ces de mauvaises herbes naturelles avec des r coltes r sistantes aux herbicides ou que des super insectes volueront et ne seront plus sensibles aux toxines contenues dans les r coltes r sistantes aux parasites De nombreuses personnes sont concern es par les r actions allergiques potentielles aux nouvelles prot ines ou par la r sistance aux antibiotiques surgissant des marqueurs s lectionnables utilis s pour d velopper les r coltes ou par d autres effets impr vus sur la sant publique D autres expriment des inqui tudes quant l insuffisance de recherche pour parfaitement comprendre les implications de l alt ration de toute une diversit de v g taux Certaines personnes expriment galement leurs inqui tudes sur le manque d exigences de la part du gouvernement quant l tiquetage des aliments aux Etats Unis Les partisans des aliments GM soutiennent que ces r coltes sont b n fiques pour l environnement parce qu elles r duisent l utilisation d herbicides de pesticides et de produits chimiques qui sont potentiellement toxiques pour l environnement et la sant de l homme En outre ces r coltes peuvent prot ger des terres arables en r duisant le stress sur les terres am liorer la valeur nutritionnelle des aliments dans les pays en
51. poids mol culaires pour PCR chacun des 8 tubes marqu s MPM Ceci peut tre pr par l avance et stock 4 C pendant 1 2 mois 6 Pr parez les gels le tampon de migration et l appareil d lectrophor se Reportez vous aux instructions ci dessous pour les gels d agarose ou les gels de polyacrylamide 7 Pr parez le colorant d ADN Fast Blast Reportez vous aux instructions ci dessous pour la technique de coloration que vous choisissez 8 Pr parez les postes de travail des l ves 17 Postes de travail des l ves Mat riaux Quantit Gel voir ci dessous 1 Echantillons de TP pr c dents 6 Tampon de migration voir ci dessous 300 350 ml Tampon de charge Orange 1 flacon Marqueurs de poids mol culaire pour PCR 1 flacon Pipette volume ajustable de 2 20 ul ou micropipette volume fixe de 20 pi 1 C nes de 1 20 yl filtre 1 portoir Chambre d lectrophor se sur gel peut tre partag e par 2 postes de travail 1 Alimentation lectrique peut tre partag e par plusieurs postes de travail 1 Colorant d ADN Fast Blast au poste de travail en commun 1 Plateau de coloration des gels 1 Electrophor se sur gel d agarose Pr paration des gels d agarose et du tampon de migration TAE Ces proc dures peuvent tre r alis es 1 2 jours l avance par l enseignant ou pendant le cours par des quipes individuelles d l ves Remarque des gels d agarose 3 pr coul s pratiques r f 161 3017EDU
52. poste D s que votre kit arrive ouvrez le et v rifiez le contenu en cochant la liste pour vous familiariser avec le kit Placez imm diatement le sachet contenant la solution d amplification et les amorces dans le cong lateur 20 C et le flacon d InstaGene dans le r frig rateur 4 C Le nombre de cuves et de pipettes dont vous aurez besoin d pend du nombre d l ves travaillant chaque poste Composants du kit Nombre Kit 4 Aliment contr le certifi sans OGM par Bio Rad 1 paquet m ADN de contr le OGM positif 0 5 ml 1 tube u Solution d amplification 1 2 ml 1 tube m Amorces d OGM rouges 15 yl 1 tube u Amorces de PSII de plante vertes 15 yl 1 tube m Marqueurs de poids mol culaire de PCR 200 pi 1 tube m Tampon de charge orange G 1 ml 1 tube u Matrice InstaGene 20 ml 1 bouteille u Pipettes de transfert en plastique jetables 2 paquets u Tubes avec bouchons attach s 1 5 ml 2 paquets m Tubes avec bouchons vis 1 5 ml 1 paquet m Tubes de PCR 0 2 ml 1 paquet u Adaptateurs de tubes de PCR sans bouchon 1 5 ml 1 paquet m Supports de microtubes essai en mousse 8 u Manuel 1 m Accessoires requis Nombre Kit 4 Micropipettes volume ajustable de 2 20 ul r f 166 0506 EDU ou pipettes volume fixe de 10 ul et 20 pl r f 166 0512EDU et 166 0513EDU 8 a Micropipette volume ajustable de 20 200 Hi r f 166 0507EDU 1 u Micropipette volume ajustable de 200 10000 ul r f 166 0508EDU 1
53. r tester des aliments base de ma s de soja et de papaye Reportez vous au tableau de la page 26 pour les aliments fiables recommand s 29 Mode op ratoire Jour un Extraction de l ADN des chantillons d aliments 1 Prenez vos tubes avec bouchons vis et tiquetez en un non OGM et un test Pesez 0 5 2 g d aliment certifi non OGM et d posez les dans le mortier Ajoutez 5 ml d eau distill e par gramme d aliment Pour calculer les volumes d eau dont vous avez besoin multipliez la masse en grammes de l aliment pes par 5 et ajoutez ces millilitres Masse d aliment gx5 mi Broyez avec le pilon pendant au moins 2 min pour former une suspension paisse Ajoutez de nouveau 5 volumes d eau et m langez ou broyez encore pour obtenir un m lange assez lisse pour la pipette Pipetez 50 ul de suspension broy e dans le tube avec bouchon vis contenant 500 yl d InstaGene tiquet non OGM en utilisant la marque 50 pl sur une pipette gradu e Rebouchez le tube R p tez les tapes 2 5 pour pr parer l chantillon d aliment tester Pipetez 50 ul de la suspension paisse d aliment tester broy dans le tube avec bouchon vis tiquet test Rebouchez le tube Agitez ou tapotez les tubes d instaGene d aliment non OGM et d aliment tester et placez les tubes dans un bain marie 95 C pendant 5 min 10 Placez les tubes dans une centrifugeuse de mani re quilibr e et c
54. s quences environ 85 des aliments GM actuellement disponibles sont d tectables avec ce kit alors que les amorces CaMV 35S seules ne d tectent que 70 des aliments GM II n est pas n cessaire que vos l ves comprennent la PCR duplex pour parfaitement comprendre les principes de ces travaux pratiques et dans le manuel des l ves le texte fait r f rence l amplification de s quences d OGM sans explication d taill e de ces diff rentes s quences Toutefois si un aliment contient les deux s quences CaMV 35S et NOS tel qu une papaye GM une bande double peut appara tre dans le couloir des OGM o les deux produits de PCR de 203 et de 225 pb ont t g n r s Ceci sera sp cialement visible sur un gel de polyacrylamide 11 Pr paration pr alable par l enseignant Cette section d crit la pr paration qui doit tre r alis e par l enseignant avant chaque p riode de travaux pratiques Si des p riodes en bloc sont programm es pr parez pour les cours 1 2 et les cours 3 4 en m me temps Une estimation du temps de pr paration est incluse Emploi du temps L tude enti re n cessite un minimum de quatre p riodes de travaux pratiques de 50 minutes ou deux blocs de cours de 90 minutes Soyez conscient qu il faut 4 heures suppl mentaires pour les cycles en dehors des heures de cours Nous recommandons galement 2 3 jours de r vision du contexte et d expos s pour pr parer vos l ves l exercice
55. se de son utilisation de contr les multiples Vos l ves doivent savoir que ceux ci sont les types de contr les utilis s par les scientifiques dans les vrais laboratoires et que si des erreurs se produisent que ces contr les identifient alors les scientifiques r p teront le test Ces contr les permettent aux l ves de V rifier que l extraction de l ADN est r ussie Le kit contient un jeu d amorces de couleur rouge pour d tecter des s quences sp cifiques des OGM mais il contient galement un second jeu d amorces de couleur verte qui identifient l ADN v g tal qu il soit ou non d riv d OGM Le second jeu d amorces vous permet de dire si un r sultat n gatif pour les OGM est d au manque de mat riau d OGM ou simplement une extraction d ADN rat e Ces amorces amplifient une r gion de 455 pb du g ne du chloroplaste du photosyst me II PSII qui est commun la plupart des v g taux Veuillez noter que de l ADN viable n est pas toujours extrait de tous les aliments Nous fournissons une liste la page 26 des aliments recommand s qui donnent de l ADN v g tal viable Le kit a t optimis pour tester des aliments base de ma s et de soja Se garantir contre toute contamination Le kit contient un chantillon d aliment certifi non OGM par Bio Rad qui doit tre trait comme l chantillon d aliment tester que vous avez choisi Cet chantillon sert de contr le contre les r sultats faux positifs Si cet
56. se du gel S d agarose Electrophor se du gel de polyacrylamide 6 Colorez dans du colorant d ADN Fast Blast Reportez vous aux instructions sp cifiques selon le type de gel 32
57. sultats de cette exp rience des arguments scientifiques Les l ves comprendront comment la structure cellulaire affecte l extraction de l ADN et pourquoi la compr hension de la r plication de l ADN est n cessaire pour comprendre la PCR Les l ves comprendront comment le g nie g n tique suppl mente les m thodes traditionnelles des cultures pour g n rer de nouveaux traits dans les plantes des r coltes Les l ves r fl chiront comment le changement du g nome d un organisme peut affecter son aptitude survivre dans des environnements diff rents Les l ves r fl chiront comment des r coltes GM interagiront avec d autres v g taux et insectes dans l environnement Les l ves comprendront comment la technologie des aliments GM est propos e comme une solution aux probl mes de croissance des populations et d endommagement de l environnement Contexte pour les enseignants Depuis la sortie de la premi re r colte g n tiquement modifi e GM aux Etats Unis en 1996 les scientifiques ont d battu sur l utilisation de ces r coltes cause des risques potentiels sur la sant et l environnement Les aliments GM sont des aliments qui contiennent des composants de r coltes GM des v g taux qui ont t g n tiquement modifi s par l insertion de mat riau g n tique tranger Le mat riau g n tique modifi ne provient pas seulement d une autre plante mais ventuellement d une esp ce d un autre r gn
58. t de cellules indiff renci es appel callus Le g ne modifi est ensuite transf r dans les cellules du callus par toute une diversit de m thodes dont chacune doit faire que l ADN passe la paroi cellulaire la membrane plasmatique et les membranes nucl aires de la plante Une m thode consiste utiliser une version GM de la bact rie du sol Agrobacterium tumefaciens Cette bact rie provoque la gale du collet en ins rant une partie de son ADN dans le g nome de la plante h te cette propri t naturelle inhabituelle est exploit e pour transf rer le g ne modifi dans le g nome de la plante Une deuxi me m thode est l lectroporation dans laquelle un courant lectrique cr e des pores dans les membranes cellulaires et permet l entr e de l ADN modifi Une troisi me m thode utilise un dispositif appel canon g nes qui tire physiquement des particules d or rev tues de l ADN modifi dans les cellules v g tales Aucune de ces m thodes n est tr s efficace et les quelques cellules qui ont t transform es doivent tre identifi es et s lectionn es parmi celles qui ne l ont pas t Pour aider ce processus des marqueurs s lectionnables sont ins r s dans les cellules avec le g ne modifi Ceux ci peuvent tre des marqueurs de r sistance un antibiotique ou des marqueurs visuels comme le g ne de la Green Fluorescent Protein Une fois que les cellules transform es ont t isol es elles sont induites avec
59. ubes avec bouchons vis 26 Tubes de PCR 48 Adaptateurs de tubes de PCR 48 Solution d amplification 1 flacon Amorces d OGM rouges 1 flacon Amorces de PSII de plante vertes 1 flacon ADN matrice OGM positif 1 flacon Echantillons d l ves de TP pr c dents 16 tubes Micropipettes volume ajustable de 2 20 ul ou micropipettes volume fixe de 20 pl 8 C nes de 2 20 lil filtre 8 portoirs B chers avec de la glace ou bains de glace 8 Supports de microtubes en mousse 8 Marqueurs 8 Mode op ratoire temps estim 45 min Remarque ajoutez seulement les amorces la solution d amplification et distribuez 30 min avant le d but du cours et stockez la solution d amplification pr par e sur de la glace 1 D congelez l ADN matrice OGM positif et centrifugez les tubes dans une centrifugeuse pour entra ner tous les composants vers le fond Ajoutez 50 ul d ADN matrice OGM positif dans les 8 tubes avec bouchons vis tiquet s OGM Ceci peut tre pr par l avance et stock 20 C pendant 1 2 mois si n cessaire 2 R alisez cette tape 30 min 1 h avant les TP D congelez la solution d amplification et les amorces et centrifugez les tubes dans une centrifugeuse pour entra ner tous les composants vers le fond Gardez les tubes sur de la glace 3 Etiquetez les tubes avec bouchons vis a Etiquetez 9 tubes avec bouchons vis SAP solution d amplification de plante b Etiquetez 9 tubes avec bouc
60. ui permet la s paration de bandes d ADN de taille similaire g n r es partir d un aliment tester qui contient la fois le promoteur CaMV 35S 203 pb et le terminateur NOS 225 pb tels que la papaye g n tiquement modifi e Reportez vous la page 3 pour les accessoires dont vous aurez besoin selon si vous choisissez l lectrophor se sur gel d agarose ou de polyacrylamide 28 Tampon de charge orange G Avant l lectrophor se des chantillons amplii s les l ves doivent ajouter 10 ul de tampon de charge orange G 5X dans chacun de leurs tubes de PCR Le tampon de charge contient du glyc rol qui augmente la densit de l chantillon et assure qu il sombre dans le puits du gel d agarose En outre le tampon de charge contient un colorant appel orange G qui co migre avec l ADN de 50 pb dans un gel d agarose 3 ou avec 20 pb dans un gel d acrylamide 10 Migration du colorant Gels d agarose II ne faut pas laisser le colorant orange du tampon de charge migrer hors du gel d agarose autrement certains chantillons peuvent tre perdus Gels de polyacrylamide Le front du colorant orange peut migrer hors du gel de polyacrylamide II ne faut pas laisser le colorant rouge de l amorce d OGM migrer hors des gels de polyacrylamide En outre les diff rents colorants utilis pour colorer les amorces migrent des vitesses diff rentes cause de diff rences de charges et ils fournissent une d monstration vis
61. ve sucre la tomate pour plus d informations voir www agbios com Toutefois l approbation ne signifie pas n cessairement que ces aliments sont distribu s Les principales r coltes d aliments OGM distribu es aux Etats Unis sont le ma s le soja et la papaye Le c ur de ce TP est la qualit et la quantit d ADN extrait de votre aliment Le tableau ci dessous liste la fiabilit de diff rents aliments en ce qui concerne l extraction d ADN et les r sultats de PCR les aliments les moins fiables peuvent produire des bandes plus faibles Si vous souhaitez que vos l ves d couvrent des aliments contenant des OGM vous pouvez vouloir viter les produits base de bl et de riz les fruits et les l gumes frais qui sont presque certainement OGM n gatifs et choisir des produits base de papaye de soja et de ma s Tr s fiables Fiables Moins fiables Tr s difficiles Impossibles Ma s frais Saucisses aux l gumes Burgers aux l gumes Huile Papaye fra che Chips de ma s B tonnets de ma s Sauce salade M lange de pain g teau Chips de ma s aromatis es Popcorn C r ales ex au ma s Beignets de ma s Frites cornflakes Plat au ma s Boulettes de viande et Chips de pomme de terre Farine de froment Farine de soja burgers contenant des prot ines de soja Boissons poudres de prot ines de soja Pr vention de contamination Une partie de ce TP implique la recherche d un r sultat n gatif c est dire que l ADN extra

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