08.03.009 f2.0 Dérivés de tissu – Extraction d`ARN
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1. RIEL QUIPEMENT ET FORMULAIRES 6 0 7 0 Le mat riel l quipement et les formulaires inscrits sur la liste suivante ne sont que recommand s et peuvent tre substitu s par des produits alternatifs quivalents plus appropri s aux t ches ou aux proc dures sp cifiques aux sites Mat riel et quipement Mat riel et quipement sp cifiques au site Marqueurs encre et crayons tiquettes appropri es pour les tubes Tubes microcentrifugeuse Support pour tubes microcentrifugeuse Homog n isateur de tissu comme le TissueRuptor ou un homog n isateur verre Teflon Extracteur automatique Qiacube Microcentrifugeuse r frig r e Cryotome Micropipetteurs Embouts de pipettes st riles et exempts d ARNase RNeasy Mini Kit RNeasy Micro Kit 14 3M RB Mercapto thanol R Me ou 2 M dithiothreitol DTT thanol 96 100 Gants jetables thanol 70 Cong lateur 80 C ou 20 C Glace pour refroidir les tubes et l eau Glace s che pour le transport des blocs d OCT et des tissus congel s D FINITIONS Voir le glossaire du programme du RCBT http www ctrnet ca glossary PROC DURES Cette proc dure a t d velopp e pour s assurer que ARN est extrait des chantillons de tissus de mani re s curitaire et constante tout en liminant les risques de contamination et la perte de l int grit mol cul2. CANADIAN TUMOUR REPOSITORY NETWORK 08 03 009 f2 0 R SEAU CANADIEN DE lt Q BANQUE DE TUMEURS D riv s de tissu Extraction d ARN Proc dure normalis e de fonctionnement du RCBT D riv s de tissus Extraction d ARN Num ro de PNF 08 03 009 Version f2 0 Manipulation et documentation du PA jee Cat gorie nat riel Tissu solide Le groupe administratif du RCBT 01 juin 2012 Approuv e par 7 5 Par Brent Schacter A SAE 28 juin 2012 1 0 INTENTION Les chantillons de tissus sont pr lev s de patients qui ont accept de participer au programme de banque de tumeurs apr s avoir pass travers le processus de consentement clair Les tudes g nomiques utilisent souvent les acides nucl iques ADN et ARN d riv s de ces chantillons Pendant l extraction et lentreposage de l ARN partir des sp cimens de tissus tous les efforts doivent tre faits pour viter la contamination et pr server l int grit mol culaire 2 0 PORT E Cette proc dure normalis e de fonctionnement PNF d crit comment l ARN doit tre extrait des tissus congel s dans les tubes et ceux dans l OCT Cette PNF ne couvre pas les proc dures de s curit d taill es pour la manipulation du mat riel biologique humain MBH et il est recommand que le personnel suive les guides de biorisques des institutions 3 0 R F RENCES D AUTRES PNFs ET POLITIQUES DU RCBT Rema
3. aire et structurale La constance dans la proc dure est importante pour obtenir des r sultats de tests comparables et fiables Les tapes suivantes sont bas es sur les protocoles d extraction pour le contr le qualit effectu par le RCBT Copyright 2012 R seau canadien de banques de tumeurs RCBT Page 2 de 5 CANADIAN TUMOUR REPOSITORY NETWORK 08 03 009 f2 0 R SEAU CANADIEN DE BANQUE DE TUMEURS D riv s de tissu Extraction d ARN 7 1 Extraction d ARN partir de tissu congel NOTE Les volumes indiqu s sont uniquement recommand s et doivent tre mis l chelle selon le volume de l chantillon de tissu S assurer que tous les tubes homog n isateurs etc utilis s dans le processus d extraction d ARN sont exempts de RNases ou trait s avec des inhibiteurs de RNases Ce protocole est bas sur celui du RNeasy Mini kit 7 1 1 Traiter tous les tissus comme potentiellement infectieux 7 1 2 L extraction d ARN est effectu e par un technicien de laboratoire ou un membre du personnel form et d sign par la banque de tumeurs 7 1 3 Avoir le mat riel et l quipement pr ts Avoir la quantit de tubes et de cryotubes n cessaires tiquet s et pr ts Tout l quipement et les r actifs qui viennent en contact avec l chantillon devraient tre exempts de RNases 7 1 4 Homog n isation Les tissus sont gard s congel s 80 C jusqu homog n isation 7 1 5 Homog n iser les ch
4. antillons de tissus maximum 30 mg dans 600 uL de tampon RLT en utilisant un homog n isateur verre Teflon ou lectrique D autres m thodes peuvent tre utilis es pour homog n iser le tissu si un homog n isateur n est pas disponible Se r f rer l tape 3 du manuel d instructions du RNeasy Mini dans la section intitul e Tissus animaux 7 1 6 Centrifuger le lysat pendant 3 min vitesse maximum gt 18 000 x g Enlever soigneusement le surnageant l aide d une pipette et le transf rer dans un nouveau tube microcentrifugeuse 7 1 7 Proc der avec le protocole ou le manuel d instructions du Rneasy Mini Qiacube pour les tapes 5 12 qui y sont d crites 7 1 8 Entreposer l ARN dissout 80 C ou plus basse temp rature 7 1 9 Enregistrer l emplacement de l entreposage 7 2 Extraction d ARN partir du tissu congel dans OCT NOTE Ce protocole est bas sur celui du kit RNeasy Mini il est favoris lorsque les chantillons sont petits Toutefois pour les chantillons plus gros utiliser le kit RNeasy Mini tel que d crit ci dessus 7 2 1 Traiter tous les tissus comme potentiellement infectieux 7 2 2 L extraction d ARN partir de tissu enrob dans l OCT est effectu e par un technicien de laboratoire ou un membre du personnel form et d sign par la banque de tumeurs 7 2 3 Avoir le mat riel et l quipement pr ts Avoir la quantit de tubes et de tubes cong lation n cessaire
5. der aspx id 352 8 12 Rneasy Mini Qiacube Handbook http www qiagen com literature render aspx id 200915 8 13 RNeasy Micro Handbook http www qiagen com 9 0 ANNEXE Aucune 10 0 HISTORIQUE DES R VISIONS Ne mienime Auteurs R sum des modifications LP 002 001 2005 JdSH PNF g n rique du RCBT pour la collecte et le traitement des tissus 8 3 009 2008 JdSH R vis e pour couvrir l extraction d ARN seulement 8 3 009 f1 0 Mai 2012 CMG e Grammaire et mise en page e Historique des r visions d plac au bas du document e Mise jour des liens pour les r f rences e Mise jour des r f rences aux PNFs e __ Section 1 0 Suppression de Le but de cette e Section 5 0 Mise jour du tableau e Section 7 0 Modification des proc dures Copyright 2012 R seau canadien de banques de tumeurs RCBT Page 5 de 5
6. edical Research Council Ethics http www mrc ac uk Utilities Documentrecord index htm d MRC002420 Best Practices for Repositories Collection Storage and Retrieval of Human Biological Materials for Research International Society for Biological and Environmental Repositories ISBER http www isber org Search search asp zoom query best practices for repositories US National Biospecimen Network Blueprint http biospecimens cancer gov resources publications reports nbn asp Jewell S et al 2002 Analysis of the Molecular Quality of Human Tissues an experience from the Cooperative Human Tissue Network Am J Clin Pathol 118 733 741 Guideline Fresh Tissue Working Group of BIG and NCI breast cancer Cooperative Groups http ctep cancer gov forms guidelines_ fresh _tissue pdf Copyright 2012 R seau canadien de banques de tumeurs RCBT Page 4 de 5 CANADIAN TUMOUR N REPOSITORY NETWORS 08 03 009 f2 0 R SEAU CANADIEN DE BANQUE DE TUMEURS D riv s de tissu Extraction d ARN 8 8 Snell L and P H Watson 2006 Breast Tissue Banking Collection Handling Storage and Release of Tissue for Breast Cancer Research Methods Mol Med 120 3 24 89 RNA Extraction procedure from Fonds de la recherche en sant du Qu bec FRSQ 8 10 Procedure for the RNA Extraction from tissues in OCT from Fonds de la recherche en sant du Qu bec FRSQ 8 11 Rneasy Mini Handbook http www qiagen com literature ren
7. rque Lors de l adoption de cette PNF pour un usage local s il vous pla t faire r f rence au RCBT 3 1 Politique du RCBT POL 005 001 Registres et documentation 3 2 Politique du RCBT POL 002 001 thique 3 3 Politique du RCBT POL 004 001 Vie priv e et s curit 3 4 Politique du RCBT POL 007 001 Manipulation du mat riel et de l information 3 5 Proc dure normalis e de fonctionnement du RCBT PNF 08 03 003 Cong lation en tubes du tissu 3 6 Proc dure normalis e de fonctionnement du RCBT PNF 08 03 004 Cong lation du tissu dans lOCT 3 7 Proc dure normalis e de fonctionnement du RCB PNF 08 03 006 Sectionnement des tissus enrob s de paraffine et d OCT 3 8 Proc dure normalis e de fonctionnement du RCBT PNF 06 002 Gestion des d chets biorisques 4 0 R LES ET RESPONSABILIT S Cette politique s adresse tout le personnel des banques membres du RCBT qui est responsable de l extraction d ARN partir de tissus Personnel de la banque de tumeurs Responsabilit r le Technicien de laboratoire Responsable de l tiquetage des tubes de l extraction de l ARN partir du tissu de l entreposage des chantillons et de la documentation de l entreposage de l ARN Copyright 2012 R seau canadien de banques de tumeurs RCBT Page 1 de 5 CANADIAN TUMOUR REPOSITORY NETWORK R SEAU CANADIEN DE lt Q BANQUE DE TUMEURS 08 03 009 f2 0 D riv s de tissu Extraction d ARN 5 0 MAT
8. s tiquet s et pr ts Tout l quipement et les r actifs qui viennent en contact avec l chantillon devraient tre exempts de RNases 7 2 4 Utiliser le kit d extraction Qiagen s RNeasy Micro pour l isolement de l ARN partir du tissu enrob dans l OCT 7 2 5 Prendre quelques 5 10 sections d OCT de 3um en utilisant un cryostat et les placer dans un tube microcentrifugeuse pr refroidi S assurer que les sections ne d cong lent pas avant la prochaine tape 7 2 6 Ajouter 600ul de tampon RLT et ramener la temp rature de la pi ce 7 2 7 Centrifuger pendant 12 minutes vitesse maximum gt 18 0000 x g 7 2 8 Enlever le surnageant fluide mais pas la couche de surface et le placer dans un nouveau tube Se d barrasser du reste Copyright 2012 R seau canadien de banques de tumeurs RCBT Page 3 de 5 CANADIAN TUMOUR REPOSITORY NETWORK 08 03 009 f2 0 R SEAU CANADIEN DE BANQUE DE TUMEURS D riv s de tissu Extraction d ARN 7 2 9 Ajouter 600l d thanol 70 m langer en utilisant une pipette 7 2 10 Prendre 700u l of cette solution et passer travers une mini colonne fournie dans le kit centrifuger pendant 15 secondes 8 000 x g 7 2 11 R p ter cette derni re tape jusqu ce que toute la solution ait pass travers la mini colonne 7 2 12 Passer 700 l de tampon RW1 travers la mini colonne centrifuger 15 secondes 8 000 x g 7 2 13 Changer le tube de collec
9. te sous la mini colonne 7 2 14 Passer 500 de tampon RPE travers la mini colonne centrifuger 15 secondes 8 000 x g 7 2 15 Centrifuger un autre 500ul de tampon RPE travers la colonne mais cette fois pendant 2 minutes vitesse maximum 7 2 16 Changer le tube de collecte centrifuger pendant 1 minute ou plus vitesse maximum pour s assurer que la colonne soit s che Si du liquide se retrouve dans le tube centrifuger pour une autre minute ou deux 7 2 17 Ajouter 30pI d H20 exempte de RNases directement sur le filtre de la colonne laisser incuber pendant 5 10 minutes et centrifuger pendant 1 minute 8 000 x g 7 2 18 Entreposer l ARN dissout 80 C ou plus basse temp rature Les r actifs RLT RW1 et RPE sont tous fournis dans le kit RNeasy voir les r f 8 11 8 12 et 8 13 pour les d tails 8 0 R F RENCES R GLEMENTS ET LIGNES DIRECTRICES 8 1 8 2 8 3 8 4 8 5 8 6 8 7 D claration d Helsinki http www wma net en 30publications 10policies b3 index html Tri Council Policy Statement 2 Ethical Conduct for Research Involving Humans Medical Research Council of Canada Natural Sciences and Engineering Council of Canada Social Sciences and Humanities Research Council of Canada December 2010 http www pre ethics gc ca eng policy politique initiatives teps2 eptc2 Default Human Tissue and Biological Samples for use in Research Operational and Ethical Guidelines M
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