Biotechnology Explorer - Bio-Rad
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1. transf rez 4 ml de tampon de colonne dans le tube tiquet Tampon de colonne 2 Retirez le bouchon et brisez l extr mit de la U colonne d exclusion Laissez la totalit du tampon s couler dans le tube des d chets Observez la surface sup rieure de la matrice et assurez vous que la totalit du tampon a p n tr dans la colonne En regardant directement au dessus et dans la colonne vous devriez voir l aspect granuleux de la matrice de la colonne Bouchez le bas de la colonne Ins rez soigneusement la colonne dans le tube 1 Vous tes pr sent pr t charger ou l enseignant peut charger l chantillon de prot ines sur la colonne Lorsque vous tes pr t charger le m lange de prot ines d bouchez la colonne Il est important de ne d boucher la colonne que lorsque vous tes pr t charger vos prot ines sinon elle risquerait de s cher A l aide d une pipette ajoutez une goutte de m lange de prot ines sur le dessus du lit de la colonne votre enseignant peut r aliser le chargement pour vous La pipette doit tre ins r e dans la colonne et la goutte doit tre charg e juste au dessus du haut de la colonne de mani re perturber le lit de la colonne au minimum N l M lange de prot ines 13 Bulletin n 4006103FR 5 D s que la goutte de m lange de prot ines p n tre dans le lit de la colonne e ajoutez soigneusement 250 ul de tampon de col2. TP contient des remarques d taill es et des astuces pour pr parer et ex cuter les TP Techniques rappeler Pipetage Avant de commencer l exp rience faites remarquer aux l ves les graduations pr sentes sur la pipette Les marques de 250 ul et de 1 ml seront utilis es pour les mesures dans cet exercice Faites les l ves s entra ner avec des volumes d eau pour qu ils s habituent au pipetage de pr cision 750 pi 500 pl 250 pi 100 pi Chromatographie Soulignez aussi qu il est important de ne pas remuer le lit de la colonne Lors du chargement de l chantillon ou du tampon sur le lit de la colonne la pipette doit tre ins r e pr s du lit contre la paroi de la colonne Le liquide doit tre expuls en douceur de la pipette le long de la paroi de la colonne pour le tampon ou sur le dessus du lit pour le m lange de prot ines a Tampon 3 Fi M lange de prot ines Points importants pour r ussir une chromatographie 1 Brisez ne tordez pas la languette en bas de la colonne pr remplie 2 Placez doucement la colonne dans les tubes de recueil Si vous enfoncez fermement la colonne dans les tubes de recueil cela cr era un joint tanche l air et l chantillon ne circulera pas Vous pouvez fabriquer un support en papier en pliant un petit morceau de papier peu pr s de la taille d une allumette et le coincer entre la colonne et le tube de recueil Ce support emp chera la formation d un joint tanche
3. ainsi augmenter leur capacit en oxyg ne ce qui est n cessaire pour des exercices rigoureux La dr panocytose est une maladie mol culaire de l h moglobine Un simple changement ou mutation dans le g ne qui code pour l h moglobine produit une mutation de la s quence des acides amin s Cette mutation modifie la structure tridimensionnelle des polypeptides de l h moglobine ce qui les fait se coller ensemble sous la forme de structures en b tonnets Les mol cules anormales en forme de b tonnets de l h moglobine d forment la structure des rythrocytes les faisant avoir une forme de faucille A la diff rence de leurs contre parties rondes les rythrocytes falciformes ne peuvent pas traverser librement les lits de capillaires et en cons quence les lits de capillaires se retrouvent bloqu s Les lits de capillaires bloqu s des organes et des tissus rendent difficile la d livrance de l oxyg ne entra nant une fatigue extr me et m me la mort Parce que la dr panocytose est un trouble g n tique qui provient d une s quence g n tique mut e il n existe actuellement aucun traitement Cependant les effets secondaires de la dr panocytose peuvent tre att nu s par des transfusions fr quentes de sang provenant de personnes qui ont une h moglobine et des rythrocytes normaux La dr panocytose est une maladie g n tique dans laquelle l individu a h rit d un g ne de l h moglobine mutant d fectueux de ses deux parents
4. l air et assurera la circulation de la colonne 3 Les colonnes sont con ues pour s couler lentement La technique compl te de la chromatographie doit durer 20 30 minutes Il est important de ne pas retirer la colonne plus que n cessaire du recueil au tube de recueil car tout mouvement peut gravement perturber le lit de la colonne 10 Bulletin n 4006103FR Pr paration et ex cution des TP J Chaque groupe d l ves aura besoin de 12 tubes de recueil Chaque groupe d l ves doit num roter s quentiellement 10 tubes de recueil de 1 10 Les deux derniers tubes sont tiquet s d chets et tampon de colonne Placez les tubes sur le portoir Inscrivez votre nom et la p riode des TP soit sur le portoir soit sur les tubes Pipetez 4 ml de Tampon de colonne dans le tube tiquet tampon de colonne Une seule bouteille de stock de tampon de colonne est fournie dans ce kit L enseignant peut aliquoter les 4 ml dans chacun des tubes tiquet s recueil ou un l ve de chaque groupe peut aliquoter les 4 ml de tampon de colonne pour le groupe Les l ves doivent retirer le bouchon du dessus et briser l extr mit de leur colonne d exclusion Poly Prep Egouttez le tampon dans le tube de recueil d chets Puis rebouchez le bas de la colonne avec le bouchon de colonne Placez la colonne sur le tube 1 Les l ves sont maintenant pr ts charger ou l enseignant peut choisir de charger l chantillon de prot
5. les grosses mol cules passent rapidement autour des billes tandis que les mol cules plus petites p n trent dans les petits trous des billes et traversent la colonne plus lentement Selon les mol cules les prot ines peuvent tre s par es seulement d apr s leur taille et les fractions contenant les prot ines isol es peuvent tre recueillies Dans la chromatographie d affinit une biomol cule souvent un anticorps qui se liera la prot ine purifier est fix e sur les billes Un m lange de prot ines est ajout la colonne et la totalit traverse sauf la prot ine d int r t qui se lie l anticorps et est retenue sur le support solide Pour que la prot ine s lue de la colonne un autre tampon est utilis pour rompre la liaison entre la prot ine d int r t et l anticorps Souvent ce tampon d lution contient de fortes concentrations de sel ou d acide Dans la chromatographie sur changeur d ions les billes de verre de la colonne poss dent une charge soit soit Un m lange de prot ines est ajout la colonne et la totalit traverse sauf la prot ine d int r t Ceci est d au fait que la charge des billes est choisie pour avoir la charge oppos e la prot ine d int r t Si la charge des billes est positive celles ci se lieront des mol cules charg es n gativement Cette technique est appel e l change d anions Si les billes sont charg es n gativement elles se lient des mol cules charg
6. travail Utilisez ceci comme une liste de contr le pour r capituler vos besoins avant de commencer les exp riences Composition du coffret Nombre coffret v M lange de prot ines 1 flacon m H moglobine Vitamine B12 Colonnes d exclusion Poly Prep 8 m Bouchons de colonne 25 m Tampon de colonne 50 ml m Pipettes 1 ml 10 m Tubes de pr l vement 100 m Manuel et mode op ratoire 1 m Des bouchons suppl mentaires sont fournis dans le coffret Accessoires n cessaires Support de tubes pour 12 tubes 8 m Marqueur noir 8 m Bulletin n 4006103FR D roulement du TP La session de ce TP est con ue pour tre r alis e en une seule p riode de 50 minutes Cours 1 Cours sur la chromatographie Cours sur l h moglobine les rythrocytes la vitamine B12 la biochimie des prot ines Analyse et questions de r flexion Cours 2 Ex cution des travaux pratiques Cours3 Analyse des r sultats Questions sur l analyse Bulletin n 4006103FR Cours 1 Introduction la chromatographie Cette tude est destin e enseigner les techniques de base de la chromatographie d exclusion Cette activit de TP s int gre bien dans les cours de biologie basiques et sup rieurs Les deux mol cules utilis es dans cette activit l h moglobine et la vitamine B12 sont des compos s essentiels certaines fonctions du corps humain ainsi cette activit de TP peut tre li e aux cours de base en biologie physiologi
7. Biotechnology Explorer Chromatographie d exclusion Manuel d instructions R f rence 166 0008 EDU http explorer bio rad fr Pour le service technique composez le 01 47 95 69 64 Bulletin n 4006103FR A l attention de l enseignant L un des plus grands d fis pour ceux tudiant les biotechnologies pour la premi re fois est que nombre des v nements et des processus qu ils tudient sont invisibles Les produits Explorer de Bio Rad offrent une solution unique L ensemble de nos kits ducatifs utilisent des mol cules color es ou fluorescentes de sorte que les processus biologiques qui sont tudi s sont clairement et facilement visualis s Le kit de Chromatographie d exclusion SEC est con u pour enseigner les techniques de base de la chromatographie par filtration sur gel Ce kit utilise les mol cules color es d h moglobine et de vitamine B12 pour illustrer les principes de la SEC Les l ves peuvent facilement visualiser la s paration de ces mol cules lorsqu elles traversent la colonne chromatographique Un guide d enseignement complet D velopp s sur cinq ann es les kits Biotechnology Explorer ont t crits pour des enseignants par des enseignants et ils ont t intensivement test s sur le terrain dans un large ventail de salles de cours du lyc e la facult Les kits Biotechnology Explorer qui sont faciles utiliser sont un moyen parfait d introduire l exaltation de la biotechnologie dans la
8. C est l enseignant de d cider si les l ves peuvent acc der aux solutions communes ou s il doit aliquoter les solutions El ments des postes de travail des l ves Nombre requis v Tubes de recueil 12 Q Colonne de chromatographie d exclusion 1 m Bouchon de colonne 1 m Pipette 1 m Marqueur 1 m Portoir de tubes essai 1 m El ments du poste de travail de l enseignant Nombre requis M lange de prot ines 1 flacon m Tampon de colonne 1 bouteille m Bulletin n 4006103FR Pr paration pr alable des travaux pratiques Cette partie d crit la pr paration qui doit tre r alis e par l enseignant avant les travaux pratiques Une estimation du temps de pr paration est indiqu e dans chaque partie Pr paration pr alable Objectifs R hydrater le m lange de prot ines Pr parer les postes de travail des l ves et de l enseignant Photocopier les modes op ratoires pour les l ves Temps requis Vingt minutes 1 heure Technique Approximativement 15 minutes avant le d but des travaux pratiques utilisez l une des pipettes fournies dans le kit et ajoutez 0 5 ml d eau distill e dans le flacon du m lange de prot ines M langez doucement plusieurs fois au cours des 15 minutes qui suivent Conservez le flacon sur de la glace ou dans le r frig rateur jusqu au d but de l exp rience Bulletin n 4006103FR Cours 2 Travaux pratiques Manuel de TP pour les enseignants Cette version du mode op ratoire des
9. Les individus souffrant du trait dr panocytaire ont re u un g ne anormal d un seul de ses parents et l anomalie simple conf re vraiment un avantage volutif En Afrique l expression du g ne de la dr panocytose est en corr lation positive avec les infections paludiques Le paludisme est une maladie mortelle provoqu e par un parasite port par un moustique 6 Bulletin n 4006103FR Le parasite infecte et finalement tue les rythrocytes Le parasite peut infecter des rythrocytes normaux mais 1l ne peut pas infecter des rythrocytes falciformes Ainsi le trait dr panocytaire aide conf rer une r sistance au paludisme et produit une adaptation volutive positive Malheureusement l expression de deux copies du g ne est d l t re Vitamine B12 La vitamine B12 est une vitamine qui est essentielle aux hommes et d autres vert br s La vitamine B12 est un cofacteur essentiel de plusieurs r actions biochimiques qui se produisent dans le corps humain Une fonction de la vitamine B12 est la rupture des graisses Les sources riches en vitamine B12 comprennent les oeufs les produits laitiers et les viandes Il n y a pas de vitamine B12 dans les plantes et les aliments base de v g taux Ainsi les personnes qui suivent un r gime v g tarien strict pr sentent souvent des d ficits en vitamine B12 moins qu ils prennent un compl ment vitaminique Les mol cules pures de vitamine B12 ne peuvent pas tre absorb es par les in
10. e humaine et biochimie Cette partie d crit les points exp rimentaux et conceptuels qui peuvent se r v ler tre des d fis pour des l ves Ces points sont extr mement importants pour le r sultat global de cette activit Les enseignants devront attirer l attention de leurs l ves sur ces points et lorsque c est possible faire une d monstration de la technique avant que les l ves commencent la manipulation La chromatographie est couramment utilis e en biotechnologie pour la purification de mol cules biologiques comme les prot ines pour un usage m dical ou autre La chromatographie s pare des composants individuels partir de m langes complexes La chromatographie est constitu e d une phase mobile le solvant et les mol cules s parer et d une phase stationnaire soit en papier chromatographie sur papier soit en billes de verre appel e r sine dans la chromatographie sur colonne travers laquelle la phase mobile progresse Les mol cules progressent travers la phase stationnaire des vitesses diff rentes selon leur chimie Quelques types courants de chromatographie Dans la chromatographie par filtration sur gel couramment appel e la chromatographie d exclusion SEC des billes microscopiques qui contiennent des petits trous sont tass es dans une colonne Lorsqu un m lange de mol cules est dissous dans un liquide et ensuite appliqu sur une colonne de chromatographie qui contient des billes poreuses
11. es positivement change de cations Ainsi un scientifique choisit la r sine utiliser d apr s les propri t s de la prot ine d int r t Au cours de la chromatographie la prot ine se lie aux billes de charge oppos e Apr s la s paration du contaminant de la prot ine d int r t un tampon tr s concentr en sel est utilis pour que la prot ine souhait e s lue de la colonne Ce kit est con u pour enseigner les principes de base de la chromatographie d exclusion SEC une technique qui permet la s paration de mol cules d apr s leur taille Le kit utilise les mol cules color es d h moglobine et de vitamine B12 pour illustrer les principes de la SEC L h moglobine brun rouge tre est beaucoup plus grosse que la vitamine B12 rose et ainsi elle traverse la colonne plus rapidement que la vitamine B12 Les l ves peuvent facilement visualiser la s paration de ces mol cules alors qu elles traversent la colonne et passent dans des tubes de recueil Bulletin n 4006103FR Principes de la chromatographie d exclusion SEC La masse des billes au sein de la colonne est souvent appel e le lit de la colonne Les billes agissent comme des pi ges ou des tamis et ils fonctionnent pour filtrer les petites mol cules qui sont temporairement emprisonn es au sein des pores Les mol cules plus grosses passent autour ou sont exclues des billes Ce kit contient huit colonnes qui sont pr remplies de billes qui s pare
12. h moglobine adulte Parce que les f tus d pendent de leur m re pour l alimentation en oxyg ne il est important que l h moglobine maternelle puisse abandonner facilement son oxyg ne l h moglobine f tale Pour cette raison les obst triciens conseillent leurs patientes d viter tout exercice intensif au cours de leur grossesse Les exercices intensifs appauvrissent les tissus en oxyg ne ce qui entra ne une comp tition entre le transfert d oxyg ne vers les tissus de la m re ou vers l h moglobine f tale En plus de l oxyg ne l h moglobine peut galement fixer le monoxyde de carbone En fait l h moglobine pr sente une affinit plus grande pour le monoxyde de carbone que pour l oxyg ne Une suffocation par le monoxyde de carbone survient lorsque l oxyg ne li l h moglobine est d plac par le monoxyde de carbone qui son tour prive les tissus corporels d oxyg ne Le corps peut s adapter des variations de l environnement qui r clament des quantit s accrues d oxyg ne d livr es aux tissus A haute altitude o la quantit d oxyg ne de l air est diminu e le corps r pond en augmentant la production des rythrocytes Ceci augmente efficacement le nombre de mol cules d h moglobine pr sentes dans la circulation sanguine ce qui a pour effet d accro tre l alimentation en oxyg ne des tissus Pour cette raison les athl tes s entra nent haute altitude pour augmenter la quantit de leurs rythrocytes et
13. haque tube de recueil Lorsque vous avez recueilli 5 gouttes dans un tube sortez et transf rez la colonne dans le tube suivant 9 Continuez recueillir 5 gouttes dans chaque tube Lorsque vous parvenez au tube 10 recueillez un total de 10 gouttes Bouchez la colonne et si votre enseignant vous le demande scellez avec un parafilm ou couvrez vos fractions jusqu aux TP suivants Stockez les fractions dans le r frig rateur R sumez vos r sultats CD D N C 0 D o D a _D a doD 14 Bulletin n 4006103FR
14. ines sur la colonne Il y a un flacon de m lange de prot ines dans le kit le plus pratique peut tre d aborder chaque groupe d l ves avec le flacon et de charger une goutte sur la colonne Les l ves doivent retirer le bouchon de la colonne Observez le haut du lit de la colonne la totalit du tampon doit s tre coul e de la colonne Ceci s observe mieux en regardant directement au dessus de la colonne l aspect granuleux des billes de la colonne doit tre visible Si du tampon r siduel demeure en haut de la colonne l chantillon de prot ines sera dilu lors de l application d une goutte ce qui provoquera une s paration m diocre Chargez soigneusement une goutte du m lange de prot ines sur le haut du lit de la colonne La pipette doit tre ins r e dans la colonne et la goutte doit tre charg e juste au dessus du haut du lit de la colonne de mani re ce que l application de l chantillon de prot ines perturbe le lit de la colonne au minimum Laissez le m lange de prot ines p n trer dans le lit de la colonne Ceci s observe mieux en regardant directement au dessus de la colonne Puis ajoutez soigneusement 250 ul de tampon de colonne sur le haut de la colonne Ceci s effectue mieux en ins rant l embout de la pipette dans la colonne de mani re ce qu il repose juste au dessus du lit de la colonne Laissez soigneusement le tampon descendre le long du tube et sur le haut du lit Commencez recueillir les g
15. nt efficacement ou fractionnent les mol cules qui sont inf rieures 60000 daltons Alors que le liquide circule travers la colonne les mol cules inf rieures 60000 daltons p n trent dans les billes et traversent la colonne plus lentement Plus les mol cules sont petites plus elles traversent lentement la colonne Les mol cules sup rieures 60000 daltons passent autour des billes et sont exclues de la colonne ce qui est galement appel la limite d exclusion de la colonne Le liquide utilis pour dissoudre les biomol cules pour constituer la phase mobile est g n ralement appel un tampon Le m lange des biomol cules dissoutes dans le tampon est appel l chantillon L chantillon est d pos sur le lit de la colonne et les biomol cules dans le tampon p n trent par le haut du lit de la colonne filtrent travers et autour des billes poreuses et finalement passent travers une petite ouverture au bas de la colonne Pour compl ter ce processus du tampon suppl mentaire est d pos sur le lit de la colonne apr s que l chantillon a p n tr dans le lit Le liquide de la phase mobile est recueilli sous la forme de gouttes dans des tubes de recueil qui sont plac s dans un ordre s quentiel Un nombre fix de gouttes est habituellement recueilli dans chaque tube Les mol cules plus grosses qui traversent rapidement la colonne finiront dans les premiers tubes ou fractions Les mol cules plus petites
16. onne sur le haut de la colonne Ceci 250 s effectue mieux en ins rant l embout de Hl la pipette dans la colonne de mani re ce qu il repose au dessus de la surface de la matrice de la colonne Laissez soigneusement le tampon descendre le long du tube et sur le haut du lit Remarque la s paration par taille 1 fonctionnera mieux lorsque le lit de la colonne n est pas perturb Commencez recueillir les gouttes dans le tube 1 Tampon de colonne 250 e pi 6 Ajoutez encore 250 ul de tampon de colonne sur le haut de la colonne Ajoutez le tampon comme pr c demment en pla ant la pipette juste au dessus du haut de la colonne et en laissant le tampon descendre le long du tube Continuez recueillir les gouttes dans le tube 1 Tampon de colonne 1 4 1 ml trois fois 7 Ajoutez 3 ml de tampon de colonne sur le haut de la matrice de la colonne Ceci peut s effectuer en ajoutant 1 ml trois fois avec la pipette ce moment l le m lange de prot ines a p n tr assez loin dans la colonne pour que de l g res perturbations du lit de la colonne n affectent pas la 5 gouttes s paration Transf rez la colonne dans le a tube 2 et commencez compter les z 1 Recueillez 5 gouttes de tampon dans le Tampon de colonne 2 1 2 3 gouttes qui p n trent dans chaque tube 3 tube 2 8 Lorsque vous avez recueilli 5 gouttes dans le tube 2 transf rez la colonne dans le tube 3 Recueillez 5 gouttes de tampon dans c
17. outtes dans le tube n 1 Lorsque la totalit du liquide s est coul e de la colonne ajoutez encore 250 ul de tampon de colonne sur le haut de la colonne Ajoutez le tampon comme pr c demment en pla ant la pipette juste au dessus du haut de la colonne et laissez le tampon descendre le long du tube Continuez recueillir les gouttes dans le tube 1 Vous n avez pas besoin de compter le nombre de gouttes qui sont recueillies dans le tube 1 Lorsque la totalit du liquide s est coul e de la colonne ajoutez 3 ml de tampon de colonne sur le haut de la colonne Ceci peut s effectuer en ajoutant 1 ml trois fois avec la pipette A ce moment l le m lange de prot ines a p n tr assez loin dans la colonne pour que de l g res perturbations du lit de la colonne n affectent pas la s paration Transf rez la colonne dans le tube 2 et commencez compter les gouttes qui p n trent dans chaque tube Recueillez 5 gouttes de tampon dans le tube 2 Recueillez 5 gouttes dans chaque tube l exception du tube 10 dans lequel 10 gouttes seront recueillies L enseignant peut signaler que lorsqu un l ve charge la colonne un autre l ve peut compter les gouttes qui s gouttent dans les tubes de recueil 11 Bulletin n 4006103FR 10 11 12 Lorsque 5 gouttes ont t recueillies dans le tube 2 transf rez la colonne dans le tube 3 Recueillez 5 gouttes de tampon dans chaque tube de recueil Lorsque 5 gouttes ont t recueillie
18. qui p n trent dans les pores de la phase stationnaire finiront dans les derni res fractions L h moglobine et la vitamine B12 sont les deux mol cules qui sont s par es dans cette activit de TP L h moglobine qui est brune a une masse mol culaire de 65000 daltons et ainsi elles est exclue de la colonne L h moglobine traversera plus rapidement la colonne et appara tra dans les premiers tubes de recueil ou les premi res fractions La vitamine B12 qui est rose a une masse mol culaire de 1350 daltons et ainsi elles est fractionn e par la colonne Les mol cules de vitamine B12 p n trent dans les pores des billes et sont temporairement emprisonn es Il en r sulte qu elles traversent beaucoup plus lentement la colonne et apparaissent dans les derni res fractions Le sch ma ci dessous illustre le fractionnement diff rentiel des grosses et des petites mol cules sur une colonne d exclusion Un m lange de grosses et de petites prot ines est appliqu sur une colonne de billes poreuses Alors que le tampon circule vers le bas de la colonne les petites mol cules de prot ines p n trent dans les billes et sont ralenties Les plus grosses mol cules de prot ines mergent en premier de la colonne Bulletin n 4006103FR L chantillon H moglobine et Vitamine B12 H moglobine L h moglobine une prot ine qui se trouve dans les rythrocytes a pour fonction de transporter l oxyg ne vers les tissus du corp
19. s L h moglobine utilis e dans cette exp rience est de l h moglobine bovine L utilisation d h moglobine bovine plut t que la contre partie humaine vite le risque sanitaire potentiel pr sent lors de l utilisation de produits sanguins humains L h moglobine est constitu e de quatre polypeptides petites prot ines qui s associent pour former une grosse prot ine globulaire L h moglobine tire son nom du groupe de l h me le composant de l h moglobine qui contient du fer et qui fixe physiquement l oxyg ne Le groupe de l h me qui contient du fer est responsable de la couleur brun rouge tre de l h moglobine La prot ine troitement apparent e la myoglobine se trouve dans les muscles et est responsable de la d livrance de l oxyg ne dans les tissus musculaires Les muscles qui sont tr s actifs et qui n cessitent beaucoup d oxyg ne sont de couleur sombre cause de leur teneur lev e en myoglobine Comme exemple on peut citer la couleur brun rouge de la viande fonc e du poulet L h moglobine est le composant principal des rythrocytes les cellules du corps qui portent l oxyg ne De nouveau c est le groupe de l h me de l h moglobine qui donne aux rythrocytes leur couleur rouge distinctive Diff rentes formes d h moglobine sont produites au cours des diff rents stades du d veloppement Les f tus produisent une forme d h moglobine qui poss de une affinit plus grande liaison plus troite pour l oxyg ne que l
20. s dans un tube sortez et transf rez la colonne dans le tube suivant Continuez recueillir 5 gouttes dans chaque tube Lorsque vous parvenez au tube 10 recueillez un total de 10 gouttes Apr s le recueil des 10 derni res gouttes bouchez la colonne Les tubes de recueil contenant les fractions de la colonne peuvent tre scell s avec un parafilm ou couverts et stock s dans le r frig rateur Si les tubes sont bien scell s les fractions peuvent tre stock es pendant 1 semaine pour des observations discussions ult rieures La colonne peut tre aussi bouch e avec les bouchons en haut et en bas et stock e dans le r frig rateur pendant 1 semaine Il peut tre int ressant pour les l ves de comparer le m lange de d part aux fractions individuelles Vous pouvez prendre le tampon de colonne restant et ajouter 5 gouttes de m lange de prot ines la bouteille Vous pouvez ensuite aliquoter 5 gouttes de ce m lange de d part dans chacun des tubes d chets des l ves Les groupes d l ves peuvent alors comparer le m lange de d part avec les chantillons fractionn s par taille 12 Bulletin n 4006103FR Mode op ratoire du TP Kit de chromatographie d exclusion I Prenez 12 tubes de recueil et tiquetez les s quentiellement de 1 10 Inscrivez votre nom et la p riode des TP sur les tubes Etiquetez les deux derniers tubes D chets et Tampon de colonne A l aide d une pipette propre
21. s prot ines concernent la purification l aide de la chromatographie sur colonne e Appliquer la m thode scientifique pour r soudre un probl me Probl me Est ce que l h moglobine masse mol culaire de 65000 daltons peut tre s par e de la vitamine B12 masse mol culaire de 1350 daltons par chromatographie par filtration sur gel Activit s pr alables aux travaux pratiques Les activit s suivantes sont recommand es avant de conduire une chromatographie 1 Parcourir le cours de Biologie sur la structure des prot ines 2 Revoir la structure et la fonction de l ADN ainsi que la synth se des prot ines 3 Effectuer des recherches la biblioth que et en ligne sur les fonctions de quelques prot ines courantes Expos de faits dans le contexte Notre corps contient des milliers de prot ines diff rentes qui effectuent de nombreuses t ches diff rentes Les enzymes digestives sont des prot ines certains des signaux hormonaux qui circulent dans notre corps et les anticorps qui nous prot gent contre des maladies sont des prot ines Les informations pour l assemblage d une prot ine sont port es sous forme de code dans notre ADN La partie de l ADN qui contient le code pour fabriquer une prot ine est appel e g ne Il y a des milliers de g nes sur chaque chromosome Chaque g ne code pour une prot ine unique Le g ne qui fabrique une enzyme digestive dans votre bouche est diff rent de celui qui fabrique un an
22. salle de cours Chaque kit contient un mode op ratoire innovant tape par tape qui fait des kits le choix parfait pour des enseignants aussi bien exp riment s que d butants Le Guide de l enseignant est divis en trois parties Une partie contient des informations sur le contexte des sujets d expos s et des suggestions d expos s qui permettront tout enseignant qu il soit exp riment ou nouveau venu en terme de biotechnologie de pr parer et concevoir des expos s et des cours pouvant pr c der les v ritables travaux pratiques Cette pr paration pr alable assurera virtuellement que les travaux pratiques fonctionneront en douceur et que les l ves comprendront les concepts inclus dans chaque TP Il y a une partie d taill e qui porte sur la pr paration d un TP compl t e par des techniques simples qui contiennent des graphiques d taillant la pr paration l avance des TP Ceci permet de simplifier la pr paration de chaque TP En outre cette partie contient des calendriers qui vous aideront planifier votre emploi du temps Chaque TP peut tre r alis pendant un cours de 50 minutes ce qui devrait convenir la plupart des emplois du temps Nous nous effor ons d am liorer continuellement nos programmes de cours et nos produits Votre contribution est tr s importante pour nous L incorporation de vos id es commentaires critiques et suggestions permettront de faire voluer les produits Explorer en des aides ducati
23. testins La vitamine B12 doit se lier une prot ine vectrice dans le tractus intestinal Lorsque la vitamine B12 se lie cette prot ine vectrice le complexe est capable de traverser les intestins et de p n trer dans la circulation sanguine o il est ventuellement absorb par le foie Parce que les besoins en vitamine B12 sont minimes l homme a besoin de 3 ug jour les d ficits en vitamine B12 sont extr mement rares Cependant certains individus souffrent d un trouble g n tique dans lequel le g ne qui code pour la prot ine vectrice est mut Les individus portant cette mutation ne synth tisent pas la prot ine vectrice n cessaire l absorption dans la circulation sanguine Ainsi m me si ces personnes ing rent des quantit s ad quates de vitamine B12 ils pr sentent tout de m me des signes de d ficit parce qu ils manquent de la prot me vectrice requise Bulletin n 4006103FR Liste de contr le V des postes de travail des travaux pratiques Postes de travail des l ves La liste indique le mat riel et les consommables qui doivent tre pr sents chaque poste de travail des l ves avant de commencer toute exp rience de TP Les composants fournis dans ce kit sont suffisants pour 8 postes de travail d l ve Poste de travail commun de l enseignant La liste indique le mat riel les consommables et les instruments qui doivent tre pr sents en un endroit commun accessible tous les groupes d l ves
24. ticorps Les prot ines sont souvent des produits recherch s pour une utilisation dans un but m dical Certaines de ces prot ines sont purifi es en grandes quantit s partir d une source naturelle R cemment de nombreuses prot ines destin es un but m dical ont t fabriqu es par la technologie des modifications g n tiques et de l ADN recombin Quelle que soit la source une prot ine d int r t se trouve dans un m lange d autres prot ines de la cellule Certaines cellules telles que les bact ries produisent de grandes quantit s allant jusqu deux mille sortes diff rentes de prot ines Du fait que 75 de la mati re s che des organismes vivants est constitu de prot ines les biologistes doivent souvent purifier une prot ine d int r t parmi les autres prot ines dans une cellule La d termination des techniques de purification d une prot ine particuli re repr sente un d fi pour l industrie biotechnologique Pour s parer une macromol cule quelconque les scientifiques utilisent leurs connaissances de la chimie de ces mol cules y compris la masse mol culaire de la prot ine taille sa charge et sa forme 1 Bulletin n 4006103FR Guide de l enseignant Liste de contr le pour l inventaire du kit Cette partie liste les composants fournis dans le kit de chromatographie d exclusion Elle liste aussi les accessoires n cessaires Chaque kit contient le mat riel n cessaire pour quiper huit postes de
25. ves encore meilleures Vous pouvez trouver le catalogue et le manuel sur internet Consultez notre page d accueil http explorer bio rad fr ou appelez nous au 01 47 95 69 65 L quipe Bio Education Bio Rad division Bio Recherche 3 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette Bulletin n 4006103FR Sommaire Page Guide de l enseignant Liste de contr le pour l inventaire du kit EE ED EE ENT ES 2 D roulement du TP recie 2808808 run UE aeaa daoa Sia ae e a ETa SARE 3 Introduction la chromatographie 4 Principes d la SE G 222 rm Penn bAa aea a Aarra E ARAA 5 L chantillon H moglobine et Vitamine B12 ieeeseeeeseereseerrsseerrsserrssena 6 Liste de contr le des postes de travail nnnenseeee senere neeeertt er trnsetesttnrrn nereste rnrn 8 Pr paration pr alable de travaux pratiques ssssnneneneseereer te nsrertttnr rererere rnrn 9 Manuel de TP pour les enseignants seeeeeeeeeeeeeerreserrettterrtttrnsstrnnsttnnssree nne 10 Guide rapide de travaux pratiques Sch ma du mode op ratoire des TP 13 Bulletin n 4006103FR Objectifs de l l ve e Comparer et opposer l utilisation de diff rents types de chromatographie sur colonne dans la purification des prot ines e Expliquer comment des prot ines naturelles ou recombin es sont s par es et purifi es l aide de la chromatographie sur colonne e Discuter comment la structure et les propri t s chimiques de
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