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Développement de modèles standardisés pour l`étude des aérosols

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1. XV Figure 2 D placement du diam tre limite en fonction de l humidit relative 4 Figure 3 Sch matisation du comportement des particules dans Pair 6 Figure 4 Virus de l Influenza ennnen 8 Figure 5 Diff rents type de chambres dynamiques 11 Figure 6 Trajectoire des particules l int rieur dune chambre rotative 12 Figure 7 Fraction du nombre initial de particules en fonction du temps selon la grosseur des particules qui reste en suspension dans la chambre rotative 13 Figure 8 Distribution des particules produites par le Collison selon leur diam tre a rodynamique NM lan eons 15 Figure 9 Transmission courte et longue distance 18 Figure 10 Parcours a robiologique des maladies transmissibles pas l air 22 Figure 11 Virus de l Influenza par microscopie lectronique 35 Figure 12 Graphique du pourcentage du contenu de la chambre r colt par le SKC Biosampler selon le temps d chantillonnage 42 Figure 13 Chambre environnementale rotative 46 Figure 14 Chambre environnementale rotative 47 Figure 15 Sch ma du test d h magglutination ccccccccececeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeees 51 Figure 16 Modulation de la temp rature dans la CER 0 0 0 0 eee e eee 54 Figure 17 volution du nombre de particul
2. 1 B 20 HR Gs 50 HR GS 380 HR 0 1 0 01 0 001 0 0001 Pourcentage d infectivit 0 00001 6 Temps d exposition heures 1000 b 100 10 1 20 HR G amp S 50 HR G3 80 HR 0 1 0 01 0 001 0 0001 Pourcentage d infectivit 0 00001 6 Temps d exposition heures PR772 1000 100 10 1 m 20 HR E 50 HR D 80 HR 0 1 0 01 0 001 0 0001 Pourcentage d infectivit 0 00001 6 Temps d exposition heures Phi 6 1000 100 10 1 m 20 HR E 50 HR Gs 80 HR 0 1 0 04 b 0 004 0 0001 Pourcentage d infectivit 0 00001 0 6 14 Temps d exposition heures Figure 19 Effet de l humidit sur l infectivit des phages en fonction du temps de suspension 18 C Chaque motif de bande du graphique repr sente une humidit diff rente 20 50 et 80 Les lettres au dessus des colonnes permettent d indiquer s il y a une diff rence significative de l infectivit entre les humidit s pour un m me temps Les symboles indiquent s il y a un effet significatif du temps sur la l infectivit pour une m me humidit Pourcentage d infectivit Pourcentage d infectivit 0 00001 1000 100 10 0 1 0 01 0 001 0 0001 1000 100 10 0 1 0 01 0 001 0 0001 0 00001 PhiX174 6 Temps d exposition heures MS2 6 Temps d exposition heures 14
3. cccccesseseseseeseseeessesseeeeeeenseeeessneneeeesneneeeseneneeetes 98 Supports pour le dM siccensncs SacaakecpsctsancaSSechichapaieaiencceteamedednsatavaasataa eae degh aline RANE 99 Trouble SOS eV eevPnTS tet cyrner ear E seanidsensd i nnda e k enne dinn en n idrendds aniei Pere 101 Il ny a rien qui ARR ts 101 FES A ea NE EEE ES AEE EEE EEEE eae era arena eee ana 101 Eau dans Ie drU eeren anea ei E eE A EES 101 Stabilit temp rature et humidit 102 La sonde Kilog ne fonctionne plUS snc cess ee cateacihapiaBachctacke chase aihad ten baie ne ance aeneae hdd ant 102 Pas de particule dans le drum 102 Nombre plus bas de particules qu l habitude 102 M usse da s N bDUISeNT warden cee omic zs aac ee sees we eee 102 85 Cette chambre environnementale a t con ue pour l tude du vieillissement des a rosols et les effets sur leur infectivit On peut y moduler plusieurs param tres dont la temp rature l humidit relative la vitesse de rotation et la pr sence d UV La chambre a un volume de 55 litres et pr sente l avantage de pouvoir tourner ind pendamment de ses ports d chantillonnage ce qui permet d chantillonner tout en continuant faire tourner la chambre La section qui suit d crit en d tail les diff rentes parties de la chambre 86 Composantes Le panneau de contr le nmo oO Description Ce cadran indique la pression l int rieur du drum Cela est possible gr ce au tuyau blanc
4. 0 heure il y a une diff rence entre 20 et les deux autres conditions d humidit s relatives mais pas entre 50 et 80 Les symboles quant a eux indiquent s il y a un effet significatif du temps sur la persistance pour une m me humidit Par exemple pour phiX174 il y a un effet du temps 20 et 50 mais aucun 80 HR Le phage phiX174 pr f re de mani re significative p lt 0 05 des humidit s relatives de 80 lorsque compar 20 et 50 d humidit Il n y pas de diff rences significatives entre les deux plus basses valeurs d humidit mais une tendance est visible sur le graphique pour une augmentation de la r sistance en fonction de l humidit Pour ce m me phage il y a un effet du temps sur la survie pour les humidit s de 20 et 50 mais aucun 80 Le phage PR772 pr f re aussi de mani re significative p lt 0 05 des valeurs d humidit s relatives plus lev es On remarque un effet plus marqu de l effet de l humidit par une augmentation plus abrupte de la persistance en fonction de l humidit PR772 est aussi affect par de longs temps de suspension p lt 0 001 tous les niveaux d humidit MS2 est stable a tous les niveaux d humidit relative avec une l g re pr f rence pour 50 et 80 au temps 0 On observe aussi un l ger effet du temps 96 apres 14 heures de suspension mais beaucoup moins notable que pour les deux phages pr c dents avec une pente moins abrupte de l a
5. la conception d une de ces chambres Cette derni re est arriv e dans nos installations l t 2011 Le premier objectif de ce projet tait la mise en route et la caract risation de ce prototype de chambre environnementale Une des premi res tapes a t l laboration des montages exp rimentaux Dans le choix des mat riaux le diam tre ext rieur le diam tre int rieur la souplesse un mat riau trop souple absorbe la pression et biaise la vitesse de n bulisation par exemple communication personnelle Nathalie Turgeon et la neutralit lectrique un mat riel charg lectriquement peut attirer les particules et les faire impacter sa surface taient des caract ristiques prises en consid ration Pour relier les tubes de dessicant entre eux le cuivre a t choisi pour sa souplesse en comparaison avec l aluminium car une courbe tr s prononc e devait tre donn e aux tuyaux figure en annexe dans le manuel d instruction C est aussi un mat riel relativement neutre et qui n attire pas trop les particules C est une constatation qui a t faite par Nathalie Turgeon lors d un stage chez 65 TSI Pour la tres grande majorit de la tubulure des autres montages Collison SKC Biosampler APS un mat riau de type Tygon a t utilis ll a ensuite t v rifi que la chambre tait en mesure d accomplir ses fonctions modulation et maintien de la temp rature stabilit de la temp rat
6. 14 Gs 18 C 30 C PR772 1000 o oOo o 2 0 001 0 0001 Pourcentage d infectivit o 0 00001 0 6 14 Temps d exposition heures Phi 6 0 1 0 01 0 001 0 0001 Pourcentage d infectivit 0 00001 0 6 Temps d exposition heures Figure 20 Effet de la temp rature sur l infectivit des phages en fonction du temps de suspension 80 HR Chaque motif de bande du graphique repr sente une temp rature diff rente 18 C et 30 C Les lettres au dessus des colonnes permettent d indiquer s il y a une diff rence significative de l infectivit entre les temp ratures l int rieur d un m me temps Les symboles indiquent s il y a un effet significatif du temps sur la l infectivit pour une m me temp rature 59 3 4 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux U V La r sistance des phages aux UV a t valu e en exposant ceux ci a diff rentes doses allant de 0 6000 uJ cm La dose d ultraviolets a t suivie grace a une sonde situ e l int rieur de la chambre Une valeur tait enregistr e toutes les demi secondes La dose totale d exposition a t obtenue en faisant la somme sous la courbe La figure 21 illustre la dose d UV en mW cm en fonction du temps en secondes En faisant laire sous la courbe on obtient des valeurs de 3 18 et 3 51 mW s cm En observant le graphique de la figure 22 le phag
7. haut Sous cette forme le virus peut tre inhal et ensuite aval Sawyer et al ont tudi une pid mie de gastroent rite dans un h pital de Toronto Ils ont conclu que la transmission a rienne du virus a jou un grand r le en raison du tr s grand pourcentage de personnes infect es 33 qui se sont retrouv es l urgence en m me temps que le cas num ro 1 et de l augmentation du pourcentage de malades en fonction du temps pass l urgences 54 23 Kimura et al ont tudi une pid mie de gastroent rite dans un h tel Une femme a vomi dans un couloir de l tage 25 et de nombreux participants a un mariage se d roulant sur le m me tage ont rapport des sympt mes de gastroent rite La nourriture ne semble pas en cause car tous les tages ont mang de la nourriture des m mes cuisines De plus on a retrouv par couvillonnage de surface du virus a des endroits qui ne peuvent avoir t touch s 55 Une autre tude de Marks et al sur une pid mie de gastroent rite qui a clat dans un h tel restaurant sugg re fortement que les a rosols en sont galement responsables Pendant le repas une femme a vomi Les d g ts ont t rapidement ramass s mais 24 48 heures plus tard de nombreux clients ont rapport des sympt mes de gastroent rite En analysant la position des malades durant le souper on a d montr que la probabilit d tre malade tait inversement proportionnelle la
8. t choisie car elle repr sentait la condition la moins stressant pour la majorit des phages tudi s chaque condition test e la condition ne variant pas ici l humidit relative tait choisie de mani re a ne pas faire subir trop de stress aux phages Les exp rimentations se sont d roul es telles que d crites dans la section 2 13 Pour obtenir une humidit relative de 80 30 C un humidificateur contenant de l eau autoclav e a t utilis en m me temps que le Collison Le Collison lui seul ne permettait pas d atteindre une aussi haute humidit L air permettant la n bulisation de l eau passait priori au travers d un filtre HEPA Toutes les conditions ont t faites en triplicata ou plus 2 16 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux U V Pour valuer la r sistance des quatre phages aux UV ils ont t n bulis s dans la chambre a 20 d humidit relative La temp rature tait maintenue a 18 C temp rature la moins stressant pour les phages Les phages ont t n bulis s pendant 10 minutes laiss s en suspension pendant 15 minutes pour stabiliser les a rosols et permettre une distribution uniforme de ceux ci dans la chambre puis expos s aux ultraviolets pour une p riode de 0 3 6 et 10 secondes Finalement 48 les a rosols taient chantillonn s pendant 20 minutes avec le SKC Biosampler L exposition aux UV tait suivie grace une sonde UV instal
9. 2 17 tude pilote validation des mod les avec virus eucaryote sscssssssssscssssssssecsssssesecasssseseecansseeeeee 49 CMe DINGS RES ANS e EN a entente 53 3 1 valuation de la performance de la CER nes 53 3 2 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes humidit s relatives 56 3 3 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes temp ratures 57 3 4 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux U V ssssssssssssssssessssssssseeseesnseeees 60 3 5 tude pilote Validation des mod les avec un virus eucaryote sscssssssssssccssssseescsssssseesesssssseeseessseeees 62 Pepi DISCUSSION ER Re ere nn 65 4 1 valuation de la performance de la CER nn 65 4 2 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les a diff rentes humidit s relatives 67 4 3 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les a diff rentes temp ratures 69 4 4 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux UV ss 71 4 5 Etude pilote Validation des mod les avec virus eucaryote ccsssssssssessccssssssessecsssssesscassssessecansseeeeeen 72 D Conclusion et DETSPOCIVES ca castes SL R SR RTE nd een 75 BE VES HCI DAN ES ae eae wet E re ea tek et ce ek a Pa Cie 77 viii Liste des figures Figure 1 Formation d un noyau de gouttelette
10. Harley and D Klein Microbiologie de Boeck ed2003 Bruxelle Mcgraw Hill 1137 Evans A S and R A Kaslow Viral infection of humans Epidemiology and control Plenum Medical ed1997 New York 1081 Marks P J et al Evidence for airborne transmission of Norwalk like virus NLV in a hotel restaurant Epidemiology and Infection 2000 124 3 p 481 487 Verreault D Aerovirology and th detection of airborne viruses in biochemistry and microbiology2010 Laval Quebec p 242 Asgharian B and OR Moss Particle Suspension in a Rotating Drum Chamber When the Influence of Gravity and Rotation Are Both Significant Aerosol Science and Technology 1992 17 4 p 263 277 Gruel R L C R Reid and R T Allemann The Optimum Rate of Drum Rotation for Aerosol Aging Journal of Aerosol Science 1987 18 1 p 17 22 Barlow D F and A I Donaldson Comparison of the aerosol stabilities of foot and mouth disease virus suspended in cell culture fluid or natural fluids J Gen Virol 1973 20 3 p 311 8 Donaldso Ai Influence of relative humidity on aerosol stability of different strains of foot and mouth disease virus suspended in saliva Journal of General Virology 1972 15 APR p 25 amp Akers T G S Bond and L J Goldberg Effect of temperature and relative humidity on survival of airborne Columbia SK group viruses Appl Microbiol 1966 14 3 p 361 4 Ijaz M K et al Development of methods to study the survival of airborn
11. Une fois dans lair ambiant les a rosols entrent en contact avec la muqueuse oro nasale et sont susceptibles de causer une infection 40 Il a aussi t prouv que le virus de l Influenza peut se transmettre via la muqueuse des yeux 41 La mise en place de l infection va aussi d pendre de la stabilit du virus de sa r sistance aux diff rentes temp ratures la dessiccation et aux radiations de la quantit de virus qui peut tre expuls e du v hicule de transmission et de la virulence de celui ci 10 La variabilit de la r ponse du syst me immunitaire de chaque individu d pendant de son historique d exposition a diff rents pathog nes est un autre facteur influen ant l tablissement d une infection 10 Il est important de mentionner la difficult de prouver qu un virus peut se transmettre via les a rosols Contrairement la transmission via des surfaces contamin es par exemple o l on peut chantillonner l aide d un couvillon une partie de la surface o a pu se d poser du mucus charg de pathog ne l tude des a rosols est plus ardue En effet une fois mis hors de l h te les virus se diluent dans l air ambiant rendant leur d tection difficile d autant plus que les m thodes de d tection par cultures ne sont souvent pas assez sensibles et que les chantillonneurs ont souvent des effets n fastes sur l int grit des virus 3 Avec le d veloppement des technologies en biologie mo
12. aide de la trousse Quiagen s QlAamp Viral RNA La manipulation a t faite suivant les 42 directives du manufacturier except pour l ajout RNA carrier au tampon AVL qui diminuait l efficacit d extraction 89 2 9 Synth se de l ADN compl mentaire Avant la synth se d ADN compl mentaire les chantillons taient soumis a un traitement choc la chaleur soit 5 minutes 110 C suivi 5 minutes sur la glace La synth se d ADNc a t faite avec la trousse iScript cDNA Synthesis Bio Rad Laboratories Hercules CA Le m lange r actionnel final tait comme suit 5 ul d chantillon 4 ul de mix de r action iScript 5X 1 ul de transcriptase inverse iScript et 10 pl d eau sans nucl ase La r action PCR tait faite selon les recommandations du manufacturier 2 10 Amorces et sondes Les amorces et les sondes utilis es sont d crites dans les tableaux 3 et 4 Pour MS2 et phi6 elles sont tir es de Gendron et al 2010 94 pour phiX174 de Verreault et al 2010 117 et pour PR772 de Turgeon et al 2013 en pr paration 2 11 R action en chaine de polym risation quantitative qPCR Toutes les qPCR ont t faits avec le DNA Engine Opticon 2 Real Time PCR Detection System Bio Rad Laboratories Les chantillons ont t analys s avec l Opticon Monitor Software version 2 02 24 Les m langes de r action PCR avaient une concentration finale de 1X de iQ Supermix Bio Rad Laboratories Les concentra
13. d montrant le grand r le de la rotation 10 Figure tir e de 10 Avec l apparition des chambres environnementales rotatives plusieurs autres quipes ont utilis cette technologie pour l tude des a rosols On a entre autres fait des exp riences sur les virus suivants Food and Mouth virus FMDV 15 16 Colombia SK Group virus 17 Rotavirus 18 19 bact riophages S 13 MS2 20 et T3 21 Adenovirus 22 Poliovirus 18 NDV Newcastle Disease Virus IBR rhinotrach ite infectieuse bovine et VSV Vesicular stomatitis Virus 21 Dans la plupart de ces exp riences on a utilis un appareil de type Collison voir section 1 1 7 3 pour la n bulisation de virus a l int rieur de la chambre on a chantillonn avec un all glass impinger AGI 30 et fait des tests d infectivit Le liquide de n bulisation et d chantillonnage tait souvent le milieu de culture additionn d anti mousse 1 1 7 3 Les n buliseurs Le n buliseur le plus populaire pour l tude des a rosols viraux est le Collison 23 Les a rosols sont produits par un jet d air charg de liquide orient perpendiculairement aux parois du contenant Les plus grosses gouttelettes vont s impacter sur la paroi tandis que les a rosols suivent le flot d air Ce n buliseur produit une grande quantit de particules de moins de 1 uM et suivant une distribution normale tel qu illustr sur la figure 8 La constance dans le nombre et la taille de
14. me t estim que plus de 30 millions de virus peuvent tre lib r s pendant un vomissement 11 1 1 6 L a rovirologie L a rovirologie est un domaine qui consiste tudier le comportement des virus dans l air que ce soit leur transport leur survie leur concentration ou leur diversit Si cette science en est encore a ses d buts c est que l tude de la transmission a rienne des virus ou des bact ries est tr s ardue En effet les microorganismes et les virus se retrouvant dans l air subissent un tr s grand stress temp rature humidit UV pouvant affecter leur infectivit Ils sont aussi tr s dilu s rendant leur d tection difficile par des techniques de culture dont la sensibilit n est pas assez lev e De plus l chantillonnage tant in vitable un stress suppl mentaire est impos aux virus captur s ce qui rend encore plus difficile leur tude Il n existe toujours pas de m thodes standardis es pour la collecte d a rosols viraux rendant la comparaison des tudes ardue La m connaissance de la distribution a rodynamique des virus dans l air taille des particules qui transportent les virus nuit la mise au point de m thodes standardis es Il est primordial d approfondir nos connaissances dans le domaine de l a rovirologie et de mieux caract riser les environnements susceptibles d tre fortement contamin s 1 1 7 Les chambres de g n ration L tude des a rosols
15. teux et relativement facile de manipulation les exp rimentations en seront all g es et surtout moins contraignantes 76 Bibliographie 1 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Verreault D S Moineau and C Duchaine Methods for sampling of airborne viruses Microbiol Mol Biol Rev 2008 72 3 p 413 44 Goldberg L J et al The use of a rotating drum for the study of aerosols over extended periods of time American Journal of Hygiene 1958 68 1 Caroline Duchaine L T Val rie L tourneau Bioa rosols et a robiologie MCB 6003 U Laval Editor 2011 Qu bec p 33 Wilson J C Aerosol Technology Properties Behavior and Measurement of Airborne Particles Hinds Wc American Scientist 1983 71 4 p 430 431 Xie X et al How far droplets can move in indoor environments revisiting the Wells evaporation falling curve Indoor Air 2007 17 3 p 211 225 Hogan C J et al Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles Journal of Applied Microbiology 2005 99 6 p 1422 1434 Hinds W C Aerosol technology properties behavior and measurement of airborne particles second edition John Wiley and son ed1999 483 Roy C J and D K Milton Airborne transmission of communicable infection The elusive pathway New England Journal of Medicine 2004 350 17 Prescott L J
16. 1 2 m tres est tr s pr sente 8 C est d ailleurs sur cette th orie que se basent les pratiques sanitaires dans le contr le et la pr vention des infections Les noyaux de gouttelettes quant eux pouvant parcourir de plus grandes distances ne sont pris en consid ration dans les mesures sanitaires que pour les maladies o il a t prouv hors de tous doutes qu ils sont responsables de la transmission soit pour la tuberculose la rub ole et la varicelle 8 Pourtant leur pouvoir de transmission pourrait tre grandement sous estim 1 2 2 G n ralit s On consid re qu il existe trois voies de transmission des virus le contact direct avec une personne infect e ou le contact indirect via des surfaces contamin es l exposition des gouttelettes lors de toux ou d ternuement et l inhalation d a rosols On peut aussi nommer ces deux derniers modes de transmission transmission courte distance et transmission longue distance On mentionne dans la section 1 1 3 la diff rence entre gouttelette et noyau de gouttelette a rosol La capacit de diff rencier ces types de particules permet d tablir le mode de transmission d une maladie et ainsi tablir des mesures de protection ad quates Pour la plupart des pathog nes respiratoires la contribution relative de chacune de ces voies de transmission n a pas t clairement tablie 26 27 Chaque ann e des virus tels que l nfluenza le virus respiratoire s
17. 113 120 Henningson E W and M S Ahlberg Evaluation of Microbiological Aerosol Samplers a Review Journal of Aerosol Science 1994 25 8 p 1459 1492 Zimmerman J J et al Optimization of a sampling system for recovery and detection of airborne porcine reproductive and respiratory syndrome virus and swine influenza virus Applied and Environmental Microbiology 2006 72 7 p 4811 4818 Ackermann H W 5500 Phages examined in the electron microscope Archives of Virology 2007 152 2 p 227 243 Grabow W O K Bacteriophages Update on application as models for viruses in water Water Sa 2001 27 2 p 251 268 Laurila MR S P Stuart DI Grimes JM Bamford DH Back priming mode of phi6 RNA dependent RNA polymerase J Gen Virol 2005 86 p 521 526 Ehrlich R S Miller and L S Idoine Effects of environnemental factors on survival of airborne T 3 coliphage Applied Microbiology 1964 12 6 Coetzee J N et al Properties of r plasmid r772 and the corresponding oilus specific phage PR772 Journal of General Microbiology 1979 110 FEB Lute S et al Characterization of coliphage PR772 and evaluation of its use for virus filter performance testing Appl Environ Microbiol 2004 70 8 p 4864 71 McAlister M H Aranha and R Larson Use of bacteriophages as surrogates for mammalian viruses in Pda Emea European Virus Safety Forum J S Robertson Editor 2004 Karger Basel p 89 98 Oshima K H T T Evans
18. 201 Ijaz M K et al Comparison of the airborne survival pf calf rotavirus and poliovirus type 1 sabin aerosolized as a mixture Applied and Environmental Microbiology 1985 49 2 81 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 82 Hoelzer K F W Pouillot R Van Doren JM Dennis S Virus inactivation on hard surfaces or in suspension by chemical disinfectants systematic review and meta analysis of norovirus surrogates J Food Prot 2013 6 p 928 1108 Dawson D J et al Survival of viruses on fresh produce using MS2 as a surrogate for norovirus J Appl Microbiol 2005 98 1 p 203 209 Huertas A et al Evaluation of Bacillus subtilis and coliphage MS2 as indicators of advanced water treatment efficiency Water Science and Technology 2003 47 3 p 255 259 Park G W and M D Sobsey Simultaneous Comparison of Murine Norovirus Feline Calicivirus Coliphage MS2 and Gll 4 Norovirus to Evaluate the Efficacy of Sodium Hypochlorite Against Human Norovirus on a Fecally Soiled Stainless Steel Surface Foodborne Pathogens and Disease 2011 8 9 p 1005 1010 Dubovi E J Biological activity of nucleic acid extracted from 2 aerosolized bacterial viruses Applied Microbiology 1971 21 4 p 761 amp Daugelavicius R et al Penetration of enveloped double stranded RNA bacteriophages phi 13 and phi 6 into Pseudomo
19. 531 117 For ACAAAGTTTGGATTGCTACTGACC 3 Prim phiX174 Rev 5 CGGCAGCAATAAACTCAACAG 630 609 117 Rev G 3 Probe 5 56 533 556 117 FAM CTCTCGTGCTCGTCGCTGCGTTGA 3BHQ_1 3 PR772 For For 5 CCTGAATCCGCCTATTATGTTGC 4538 4560 Non publi 3 PR772 Rev Rev 5 TTTTAACGCATCGCCAATTTCAC 4663 4641 Non publi 3 Probe 5 FAM 4639 4614 Non publi CGCATACCAGCCAGCACCATTACGCA 3I ABIk_FQ 3 44 2 12 Analyse des r sultats la suite de I chantillonnage la proportion de phages infectieux tait d termin e par compte de plages de lyse sur tapis bact rien Le reste de l chantillon tait gard a 4 C jusqu au lendemain puis mis a 20 C jusqu au analyses subs quentes extraction d ARN RT cDNA qPCR Une fois la qPCR faite pour obtenir la quantit totale de phages infectieux et non infectieux le pourcentage d infectivit tait calcul comme suit UFP ml SX I SOEN mol cules d ADNou ARN ml 100 pourcentage d infectivit 2 13 Evaluation des performances de la CER Un des objectifs du projet tant la mise en route de la chambre rotative voir figure 13 et 14 plusieurs modifications ont d tre apport es entre autres pour r pondre aux normes CSA Canadian Standards Association ou pour am liorer la m canique L laboration de montages exp rimentaux a ensuite t entreprise tubes de dess chants tubes de cuivre reliant les dess chants tubulure pour relier dess chants a
20. 70 3 p 820 867 publique S d l f Infections associ es aux soins de sant 2009 p 39 Fernstrom A and M Goldblatt Aerobiology and its role in the transmission of infectious diseases J Pathog 2013 2013 p 493960 Horsfall F L Viral and rickettsial infections of man Viral and rickettsial infections of man ed T Igor1965 4th ed xvi 1282p Illus 4th ed xvi 1282p Illus Steinhauer DA H J Rapid evolution of RNA viruses Annu Rev Microbiol 1987 41 p 409 433 Tang J W et al Factors involved in the aerosol transmission of infection and control of ventilation in healthcare premises Journal of Hospital Infection 2006 64 2 p 100 114 Knight V Viruses as agents of airborne contagion Annals of the New York Academy of Sciences 1980 353 p 147 56 Edwards D A et al Inhaling to mitigate exhaled bioaerosols Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004 101 50 p 17383 17388 GL Mandell R D J JE Bennett Eds Principles and practices of infectious diseases 3 ed1990 New York Churchill Livingston Cox C S The aerobiological pathway of microorganisms1987 New York Wiley 293 Chikasue K et al Detection of Torque Teno Virus DNA in Exhaled Breath by Polymerase Chain Reaction Acta Medica Okayama 2012 66 5 p 387 397 Xu Z et al Molecular and microscopic analysis of bacteria and viruses in exhaled breath collected using a simple impactio
21. Ensuite j ai t bahie par l tendue de tes connaissances tu as d ailleurs remarqu quel point je buvais tes paroles Et finalement ton humilit a fait en sorte que je t ai plac e a un endroit bien sp cial dans mon c ur celui des gens extraordinaires qu on croise que tr s rarement dans une vie et qui nous marquent jamais Merci Caro Merci Marc mon premier mentor La scientifique que je suis aujourd hui c est en grande partie gr ce toi Et peut tre aussi quelques cheveux blancs force de me faire faire des sauts Merci pour tout et m me plus Merci Nathalie de m avoir tout appris de l a rovirologie et qui au final m a aussi permis de d velopper mes aptitudes poser les p les rideau changer la tuyauterie refaire des scellants etc Ta g n rosit est ternelle merci pour tout Merci Pascale une belle surprise dans ma ma trise Je tai tout dit tu m as tout dit Merci d avoir t toi et merci de m avoir laiss tre moi Je taime et bient t Merci mon siamois pour toutes les raisons que tu sais d j et qui seraient trop longues num rer ici Je te rends visite Montr al t inqui tes Merci aussi Val rie Laetitia Anne Phillipa ric Martyne et L a ainsi que les membres de mon comit Sylvain et Steve qui ont fait de ma ma trise une aventure des plus agr ables XV Un merci bien sp cial a mon amour de toujours Mathieu qui
22. Strickfaden and A K Highsmith Comparison of filtration properties of hepatitis B virus hepatitis C virus and simian virus 40 using a polyvinylidene fluoride membrane filter Vox Sanguinis 1998 75 3 p 181 188 Vidaver A K R K Koski and J L Ven Etten Bacteriophage Phi 6 a lipid containing virus of pseudomonas phaseolicola J Virol 1973 11 5 p 799 805 Tseng C C and C S Li Collection efficiencies of aerosol samplers for virus containing aerosols Journal of Aerosol Science 2005 36 5 6 p 593 607 Gendron L et al Evaluation of Filters for the Sampling and Quantification of RNA Phage Aerosols Aerosol Science and Technology 2010 44 10 p 893 901 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 Phillpotts R J et al The Cystovirus phi6 as a simulant for Venezuelan equine encephalitis virus Aerobiologia 2010 26 4 p 301 309 Tseng C C and C S Li Inactivation of Virus Containing Aerosols by Ultraviolet Germicidal Irradiation Aerosol Science and Technology 2005 39 12 p 1136 1142 Tseng C C and C S Li Ozone for inactivation of aerosolized bacteriophages Aerosol Science and Technology 2006 40 9 p 683 689 Michel A et al Bacteriophage PhiX174 s Ecological Niche and the Flexibility of Its Escherichia coli Lipopolysaccharide Receptor Appl Environ Microbiol 2010 76 2
23. avec l tanch it v rifier les fuites revisser les jonctions Cependant l hiver dans la pi ce d a rovirologie l humidit relative est tr s basse 20 Si vous devez travailler tr s haute humidit je vous conseille de d poser des linges humides l int rieur de la bo te de plastique du drum cela permettra d augmenter l humidit ext rieure au drum et de la rapprocher de celle du drum Bien entendu faire attention ce que le linge soit seulement humide on ne veut pas une flaque d eau La sonde Kilog ne fonctionne plus 99 du temps c est parce que les piles ne fonctionnent plus changer aux 6 mois Pas de particule dans le drum V rifier que tous les ports sont ouverts V rifier qu il n y a rien qui obstrue les connexions Nombre plus bas de particules qu l habitude V rifier qu il n y a pas de fuites V rifier que c est le bon facteur de dilution sur APS Mousse dans n buliseur Mettre de l antifoam A 102
24. by indirect contact via contaminated surfaces has been widely documented but the literature on viral aerosols remains poor Because the aerosolization of pathogenic viruses requiring significant biosecurity measures the availability of non pathogenic viral models would be a valuable tool in the study of viral aerosols The aim of this project is to develop standardized models for the study of viral aerosols Consequently phages were tested as models for eukaryotic viruses To evaluate their resistance to environmental stresses and to different exposure times these phages were aerosolized in a rotating chamber where they were exposed to various environmental conditions relative humidity RH temperature UV and time The results suggest that the selected phages could be good models for studying the behavior of the virus in the air Table des mati res R SUM sr et rar tirer tenter dur nr adress te ntm pe ra sn nr nn E il PSU ACE nr A a estate ne ne telus there inerte re Pts der esta v Tabledes mati re Si perese E A Ae E E R EO E Ea eE aT vii Liste d s TUR S iisi a a aa a E iix Liste des tableaux ss xi Liste des abr viations sas tinea are bola en RAR aad de OR Sia ates xiiii R merciemMents orner ed savcsasesdevaasocatuestvesses a A a a ennemies XW Ghapitre 1 IMEROUICHION Sissel beatae atau caarcoce ca aeiee tre aen ERE ER E ER tha E EREE ANA 1 1 1 Ves actosolS i a a e a aa M nat na Aah ens 1 1 1 1 D finitions g n rales Unes e
25. cessaire De ce fait PR772 serait peut tre un bon mod le pour les virus eucaryotes ayant cette m me caract ristique MS2 est un particuli rement r sistant Il a une capside tr s tanche 119 Il est r guli rement utilis comme mod le de virus ent rique pour l valuation des techniques de d sinfection des surfaces ou de l eau par exemple 120 122 en raison de sa grande r sistance Deux autres tudes ont aussi d montr une r sistance de MS2 a toutes humidit s l tat d a rosols lorsque le m lange du n buliseur contenait des peptones 20 123 Dans cette derni re tude on a aussi tudi le phage phiX174 qui s est av r plus stable hautes humidit s toujours en pr sence de peptones 123 Selon Daugelavicius et al 124 phi6 entre dans sa bact rie h te par fusion de sa membrane la membrane externe de Pseudomonas syringae La prot ine P3 attache phi6 au pilus et la prot ine P6 sert la fusion avec la membrane externe 124 Tel que vu dans la section 1 2 3 3 l humidit pourrait affecter l infectivit des virus en modulant le pH des a rosols et induire des changements de conformation chez certaines prot ines impliqu es dans le processus infectieux Il a aussi t mentionn que les virus entrant dans leur cellule h te autrement que par fusion ex endocytose ont moins tendance tre affect s par l humidit La r ponse de phi6 l humidit ainsi que son mode d entr e semble
26. dans leur environnement naturel peut tre riche d informations mais les confiner dans un environnement contr l permet d arriver des conclusions plus solides sachant quoi ils ont t r ellement expos s Pour se faire on confine les a rosols dans des chambres de g n ration On entend par chambre de g n ration une enceinte dans laquelle des a rosols peuvent tre produits confin s et tudi s 3 Ces chambres sont tr s souvent faites sur mesure pour r pondre sp cifiquement aux besoins des laboratoires Dans leur fabrication plusieurs l ments doivent tre pris en consid ration On peut entre autres citer le mat riau de la chambre qui doit tre exempt d lectricit statique pour emp cher les particules de s y coller Ainsi le plastique est proscrire et l acier inoxydable est souvent le meilleur choix La tubulure connect e aux chambres doit aussi tre sans lectricit statique et on privil gie une tubulure courte plus gros diam tre qui diminue les pertes de particules lors de l chantillonnage Il y a deux types de chambre de g n ration statique et dynamique 12 1 1 7 1 Les chambres statiques Dans les chambres statiques une fois les a rosols produits il ny a plus aucun mouvement de l air Dans ce type de chambre les particules sont soumises a la force gravitationnelle a la force lectrostatique et au processus de diffusion qui vont entra ner une diminution du nombre de particules Cec
27. de la brancher aussi l ext rieur Une fois la lampe install e manipuler le drum avec tr s grande pr caution pour ne pas la faire tomber et clater l int rieur du drum d autant plus que ces lampes sont dispendieuses Lorsque la lampe n est pas install e il est pr f rable de bouche la prise pour viter l accumulation de salet s Lors de l utilisation de la lampe UV il est primordial d installer un compteur de lux pour savoir quelle dose nos a rosols ont t expos s mais aussi pour voir la performance de la lampe UV dans le temps baisse d intensit La sonde est install e dans ce port et ne peut tre que dans ce port car c est le seul qui a la bonne dimension 90 La photo ci contre illustre le montage en coupe transversale Le fil USB de la sonde passe au travers un bouchon de silicone de taille 6 A la sortie du bouchon du ZIP a t ajout autour du fil pour viter les fuites Le fil passe ensuite au travers du port Directement a l entr e dans le drum un crou fix sur la sonde est accot sur le bering de mani re garder la sonde fixe et toujours dans la m me position Le logiciel utilis pour l analyse de la lecture de la sonde oak DAT est de base II fournit des donn es en amp res et pour savoir la dose en mW cm il faut utiliser la formule suivante y 0 625x 2 5 O y est exprim en mW cm et x en mA Pour ouvrir le drum pendant que la lam
28. des a rosols viraux Les grosses particules sont impact es dans le liquide tandis que la formation de bulles aide trapper les plus petites particules par diffusion Ces bulles peuvent aussi avoir le d savantage de r a rosoliser les particules en particulier celles qui sont hydrophobes Les chantillonneurs liquides pr sentent le grand avantage de pr venir la dessiccation et de faciliter l extraction de l ADN ou de l ARN 82 Cependant chantillonner dans un liquide dilue beaucoup notre chantillon Ces types d chantillonneurs sont ceux qui permettent d obtenir les meilleurs pourcentages de d infectivit malgr le fait qu ils puissent perdre jusqu 48 de l chantillon 83 Comme mentionn plus haut on ne peut chantillonner longtemps avec des impacteurs liquide en raison de l vaporation Dans la famille des AGI on retrouve maintenant le Biosampler qui est encore moins destructif et plus efficace pour r colter les a rosols que l AGI 30 83 29 1 3 Les bacteriophages comme mod les viraux 1 3 1 G n ralit s Les phages ont t cod couverts par Twort 1915 et d H relle 1917 22 Il est assez surprenant que leur d couverte soit arriv e aussi tardivement soit 40 ans apr s le d but des recherches d envergure en bact riologie mais sans microscope lectronique la preuve de leur existence tait plus ardue On note cependant des textes de 1896 qui mentionnent l effet antiseptique de l eau
29. donc concorder 68 4 3 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes temp ratures Afin de v rifier l effet de la temp rature sur la stabilit des phages mod les ceux ci ont t expos s 18 C et 30 C une humidit relative constante de 80 Encore ici l effet du temps a t valu par des temps d exposition ces conditions de 0 6 et 14 heures Une l vation de la temp rature a eu un effet significatif sur les phages phiX174 et MS2 On observe une baisse de 2 log et plus avec une augmentation de la temp rature PR772 ne semble pas affect par la hausse de temp rature Aucun phage phi6 infectieux n a t d tect 30 C par culture mais autant qu l habitude en qPCR d montrant que l absence de d tection n est pas due l absence de phages ll est aussi int ressant de constater que pour les phages phiX174 et MS2 on observe exactement le m me effet du temps peu importe la temp rature Pour le phage PR772 le temps a sensiblement le m me effet peu importe la temp rature Phi6 d tient une enzyme lytique thermosensible impliqu e dans la p n tration du peptidoglycane 125 La temp rature lev e en plus des autres stress humidit lev e non favorable a la stabilit de phi6 ont pu rendre cette enzyme inapte a infecter leur h te MS2 et phiX174 se sont montr s particuli rement stables 18 C et 80 d humidit relative De plus MS2
30. du Gange qui se perd en filtrant ou chauffant l eau 22 Les gens de l poque n ont pas pouss l tude se disant qu il s agissait de compos s chimiques volatils D H relle quelles ann es plus tard s est aussi retrouv face a un compos qui lysait des bact ries mais a pouss beaucoup plus loin son questionnement Il a permis de grandes avanc es m dicales en soignant des gens avec des phages avant l re des antibiotiques 22 Les phages ont t utilis s dans plusieurs domaines mais leur potentiel reste peu exploit en a rovirologie Pourtant ils sont une avenue tr s int ressante en tant que mod le viraux Ce sont des virus qui n infectent que les organismes procaryotes Ils ont beaucoup de points en commun avec les virus eucaryotes ils peuvent tre envelopp s ou non ARN ou ADN double ou simple brin segment s ou lin aires ou circulaires d une multitude de formes caud s ou non etc 9 Leur manipulation est tr s s curitaire niveau de bios curit 1 et relativement facile on peut ais ment en obtenir de fortes concentrations ils ont une grande diversit environ 10 familles et sont peu dispendieux a produire De plus la Food and Drug Administration FDA a d ja reconnu et accept les phages comme standard de r f rence dans l industrie pharmaceutique II est particuli rement important de mentionner que 96 des phages sont caud s 84 alors qu aucun virus eucaryote ne poss de cette carac
31. intuitif 95 Montages possibles Voici un aper u des montages possibles avec le rotating drum Collison Le Collison peut tre mis plusieurs endroits tout d pendant de l humidit de l a rosol voulu Il suffit de d placer le raccord de couleur or sp cialement con u pour le Collison Lorsque mis sur les dess chants A et B il a besoin d une extension voir photo Il est TR S important d ouvrir la valve avant d envoyer de l air dans le Collison II tol re tr s mal de hautes pressions et pourrait CLATER Aeroneb Avec l aeroneb il est important de faire passer l a rosol dans un erlenmeyer avant de le faire entrer dans le drum Cela emp che l accumulation d eau dans les ports ou directement dans le drum Pour savoir s il y a de l eau dans le drum il suffit de suivre l humidit Si elle augmente toujours m me apr s une purge il y a de l eau 96 Biosampler Le montage du Biosampler est tr s simple Celui ci est reli a une pompe pour faire le vide et aspirer le contenu de la chambre II est important de changer le filtre HEPA de sens et ouvrir la valve du filtre HEPA Photo extr mit gauche du drum Ici le Biosampler est soutenu par un support universel la tubulure de gauche est reli e la pompe APS Le montage de l APS est aussi tr s simple Il est important de ne pas oublier d ouvrir la valve de L APS changer le filtre HEPA de sens et ouvrir la valve du filtre
32. l air que nous respirons parce qu il s est d pos sur une quelconque surface nous avons moins de chance de le respirer Effet de l chantillonnage Les m thodes d chantillonnage sont aussi a consid rer avec beaucoup d attention Elles peuvent tre tres dommageables pour l int grit des virus et fortement affecter l infectivit Si on ne fait pas attention on peut se retrouver avec de faux n gatifs quant a la pr sence de virus et penser qu on se trouve dans un environnement s curitaire alors que c est le contraire Plusieurs tudes ont t men es quant aux meilleurs chantillonneurs utiliser une des tapes pr liminaires du pr sent projet avait justement ce but mais il en ressort tr s souvent que cela d pend de ce qu on veut faire de notre chantillon Les filtres de polyt trafluoro thyl ne PTFE sont tr s efficaces pour trapper une tr s grande quantit de virus et ce nombre augmente en fonction du temps Ceci est un avantage comparativement au Biosampler impacteur liquide qui n est efficace que pour un temps chantillonnage de moins de 30 minutes en raison de l vaporation du liquide 77 Duchaine et al ont d montr que les filtres de polycarbonate taient plus appropri s lorsqu on veut r colter ce qui se trouve sur le filtre En effet en raison de leur structure les filtres de PTFE endommagent beaucoup plus les virus et les gardent pi g s dans les fibres 78 Les fil
33. le drum Il faut s armer de patience La plupart des fuites proviennent de deux endroits pr cis D abord les pi ces A B et C de la figure ci dessus ne sont pas soud es ensemble Nous avons souvent observ des fuites entre les pi ces A et B fuite 1 et entre les pi ces C et le cylindre du drum fuite 2 La fuite 1 a t r gl e en ajoutant du Mono entre les pi ces A et B La fuite 2 a finalement t r gl e en ajoutant du RightStuff entre la pi ce C et le cylindre du drum II faut se calculer une demi journ e de nettoyage lorsqu on ouvre le drum pour enlever les deux scellants Pour tester s il y a des fuites ne pas envoyer directement l air m dical dans le drum 52 PSI la pression est trop grande et si elle ne fait pas d coller le scellant elle fera exploser les bouchons Eau dans le drum Si apr s purge du drum humidit remise 0 elle ne cesse d augmenter nouveau il y a probablement de l eau dans le drum trop de condensation D abord purger pendant une longue p riode de temps en prenant soin de faire entrer l air gauche puis ensuite droite pour ass cher les deux extr mit s Si l eau est toujours pr sente il sera s rement n cessaire d ouvrir le drum 101 Stabilit temp rature et humidit Le drum est capable de garder tr s stable l humidit plus ou moins 7 en 24H et la temp rature plus ou moins 1 C Si l humidit n est pas stable c est qu il y a probablement des probl mes
34. ou tomber et tout le dess chants va se retrouver au sol De plus toujours avec les bouchons aux extr mit s des tubes il faut faire tr s attention ne pas ouvrir l air dans les tubes sans ouvrir une sortie d air Presqu aussit6t le bouchon va tre propuls et tout le dess chants va se d verser une fois encore Cela peut sembler anodin mais il est tr s facile d oublier d ouvrir une valve tant donn la quantit qu il y a g rer VERIFIER TROIS FOIS PLUT T QUE DEUX QUE TOUT VOTRE MONTAGE EST PR T 94 Sondes de temp rature ll y a 3 sondes de temp rature 2 USB pour prendre la temp rature dans le drum et dans la boite de plastique et une reli e au contr leur de temp rature tel que mentionn plus haut Les deux sondes USB sont contr l es par le logiciel TRH Central qui est tr s facile d utilisation Une fois le logiciel install ro EE sur un ordinateur il faut File View Tools Help i nfigurer n i Channels Chart Data Log configurer les sondes qu sont les channels dans le logiciel Donc il suffit de er QUE pes QUES ris cliquer sur Tools ensuite e Configure et puis le Channel de votre choix 1 2 3 Donnez lui un nom dans Description C est aussi dans ce menu que vous pourrez Serial No Temperature Units F arranger votre sonde si jamais elle est d calibr e comme cela nous est arriv Nous n tions plus capables de descendre l humidit du e E drum moins de 2
35. production des a rosols que ce soit par ternuement ou par mouvement des vagues la surface des oc ans par exemple les particules produites vont se transformer au contact de l atmosph re La figure 1 illustre bien ce ph nom ne La particule de d part que l on va souvent nommer gouttelette voit ses liquides s vaporer au contact de l atmosph re pour voluer jusqu au noyau de gouttelette constitu de particules solides sels bact ries virus moisissures pollen etc Mais ce ne sont pas toutes les gouttelettes qui deviennent des noyaux de gouttelette Pour ce faire il faut que l eau ou autre solvant liquide puisse s vaporer avant que la particule entre en contact avec une surface Plusieurs facteurs vont influencer la vitesse laquelle une gouttelette se transforme en noyau de gouttelette On peut entre autres citer l humidit relative la temp rature ou la vitesse du vent de l environnement en question 5 Xie et al 2007 ont men des travaux tr s int ressants sur le comportement des gouttelettes dans diff rents environnements Dans la figure 2 A les plus petites gouttelettes moins de 125 um ont un temps d vaporation plus court courbe AB ainsi qu un temps de s dimentation plus court courbe BC La jonction entre les deux courbes indiqu e par le point B repr sente la taille de particules limite qui peut s vaporer avant d entrer en contact avec le sol hauteur de 2 m tres dans les condit
36. roso lignes d coulement de air surface de d position Figure 3 Sch matisation du comportement des particules dans l air A Impaction par inertie B s dimentation C interception D diffusion et E attraction lectrostatique Figure adapt e de 3 1 1 4 Les bioa rosols Les bioa rosols sont aussi des particules en suspension mais compos es de mat riels biologiques Par exemple ils sont compos s de microorganismes entiers morts ou vivants de leurs fragments toxines prot ines ou acides nucl iques de fragments d autres organismes animaux et plantes de compos s chimiques et de min raux Etant de tr s petite taille les bioa rosols peuvent rester en suspension dans l air pour de longues p riodes de temps et parcourir de longues distances en fonction des courants d air 3 Il existe des exemples ou il semble vident que la transmission d infections ce soit faite sur plusieurs m tres voire des kilom tres voir section 1 2 3 2 Leur petite taille leur permet aussi de p n trer facilement les voies respiratoires 8 tant donn leurs caract ristiques les bioa rosols peuvent tre de puissants vecteurs de transmission de pathog nes 1 1 5 Les virus Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires Ils ne peuvent pas se multiplier l ext rieur d une cellule car ils ne poss dent pas d enzymes leur permettant de produire de l nergie Ils empruntent donc celles de leur h
37. s curitaires et efficaces pour l tude du comportement des virus dans l air Cela permettra de mieux comprendre la survie des virus dans lair sur de courtes et longues distances mim par un court et un long temps de suspension leur r sistance diff rents stress environnementaux et leur niveau d infectivit afin de mieux pr dire les risques associ s leur inhalation En utilisant des mod les s curitaires non pathog nes pour les mammif res on diminue fortement la complexit des exp rimentations Cela permet de tester plus de conditions en moins de temps et m me d tudier la propagation des virus l ext rieur du laboratoire tels qu en chambre d h pital salle de classe tablissement d levage etc 1 5 1 Objectifs sp cifiques Une chambre environnementale rotative a t utilis e pour caract riser le comportement des phages dans diff rentes conditions Cet appareil a t construit par Daniel Verreault et l quipe technique de g nie m canique de l Universit de Tulane en Louisiane sous la supervision des Drs Chad Roy et Caroline Duchaine Cette chambre est un prototype unique car les extr mit s du cylindre la composant sont ind pendantes de celui ci Cela offre l avantage de n buliser d chantillonner et d exposer aux UV sans devoir arr ter la rotation 36 La combinaison de techniques de culture traditionnelle et de biologie mol culaire a t utilis e pour les diff rents aspects de notre
38. te en d tournant le m tabolisme de la cellule vers la synth se de composantes virales 9 Les virus sont constitu s d acides nucl iques ADN ou ARN entour s d une capside prot ique et sont parfois envelopp s d une membrane lls sont g n ralement tr s petits 20 300 nm quoiqu on ait d couvert le Mimivirus qui mesure 400 nm 9 Parmi les caract ristiques essentielles pour qu un virus provoque une infection chez l homme il y a la capacit de se transmettre efficacement dans l environnement avoir une ou plusieurs portes d entr e chez l homme tre capable de s attacher une cellule et de se multiplier pouvoir tre excr t dans l environnement et finalement tre capable de d velopper des m canismes alternatifs face au syst me immunitaire 10 G nome Enveloppe lipidique Capside Figure 4 Virus de I Influenza Les trois composantes principales d un virus de I Influenza sont repr sent es le g nome la capside et l enveloppe lipidique Source http www medliorate com Plusieurs virus peuvent facilement se retrouver dans l environnement Dans le cas des virus respiratoires par exemple ils sont relargu s en toussant en ternuant en parlant ou simplement en respirant Les gens infect s par des virus ent riques ont quant eux des pisodes tr s aigus de diarrh es et de vomissements souvent sous forme de jet qui m nent une production de bioa rosols charg s de virus Il a m
39. tre utilis comme indicateur de contaminations f cales 98 Il a t utilis comme mod le viral pour l tude de l effet de l ozone 97 et des UV 96 1 3 6 MS2 MS2 est un phage ARN simple brin lin aire d environ 3600 nucl otides de la famille Leviviridae 99 Il est aussi de forme icosa dre non caud et d environ 27 nm 100 Il a pour souche h te E coli Le phage MS2 a largement t utilis comme mod le dans l tude des a rosols On l a utilis pour tudier la stabilit des a rosols 20 pour tester l efficacit de capture de filtres pour les a rosols viraux 80 pour voir l effet de facteurs tels l ozone 97 le milieu de suspension ou l humidit relative 101 sur leur infectivit les performances de purificateur d air 102 ou pour tudier la production d a rosol par les toilettes 103 32 Tableau 1 Ensemble des caract ristiques des quatre phages mod les choisis Phages Famille de phage Capside Enveloppe Souche h te Temp rature d incubation Virus eucaryotes avec similitudes MS2 Leviviridae Une prot ine structurale lcosa dre 27 nm non Simple brin ARN Lin aire Non segment 3569 nt E coli 37 C Picornaviridae Caliciviridae Phi6 Cystoviridae lcosa dre 86 nm oui Double brin ARN Lin aire 3 segments 13 385 pb Pseudomonas syringae 25 C Reoviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Retrov
40. tude Suite a l exposition des phages aux conditions environnementales des essais sur plaque taient faits pour d terminer la quantit de phages infectieux dans l chantillon Ensuite par technique de qPCR le nombre total de g nomes de phages pr sents phages infectieux et non infectieux tait d termin afin d tablir des ratios infectieux nombre total Les objectifs sp cifiques de recherche consistaient donc 1 Mise en route de la chambre environnementale rotative montage performance et criture d un manuel d instructions 2 valuer la r sistance de quatre phages l humidit relative 20 50 et 80 basse temp rature 18 C 3 valuer la r sistance de quatre phages deux temp ratures 18 et 30 C haute humidit relative 80 4 valuer l effet des UV sur les phages 18C 20 5 Valider nos mod les avec un virus eucaryote nfluenza 37 Chapitre 2 Mat riel et m thodes 2 1 Bact riophages Quatre bact riophages ont t utilis s dans ce projet voir tableau 1 Les phages phi 6 HER 102 phi X174 HER 36 PR772 HER 221 et leur souche h te respective Pseudomonas syringae HER 1102 Escherichia coli HER 1036 et Escherichia coli HER 1221 ont t fournis par le centre de r f rence des virus bact riens F lix d H relle www phage ulaval ca Le phage MS2 ATCC 15597 B1 et son h te Escherichia coli ATCC 15597 a t obtenu de l American Type Cultu
41. vomissements des pisodes aigus de diarrh e ou la remise en suspension de virus d pos e sur des surfaces via les gouttelettes marche mouvement des v tements entretien m nag changement des draps de lit etc On d tient peu d information sur la quantit de virus que peut excr ter une personne infect e ainsi que sur le diam tre des particules produites Lindsley Pearce et al 2012 Ceci est en partie d au manque d instruments de mesure ainsi qu la grande variation entre les tudes Cette variation peut tre due aux diff rences dans le taux d humidit et la temp rature du laboratoire dans la vitesse du vent et aux diff rences interindividu 34 On approxime toutefois que la toux peut produire environ 3000 noyaux de gouttelettes tout comme parler pendant 5 minutes 35 et qu un ternuement produit plus de 40 000 particules qui en s vaporant au contact de l atmosph re ont un diam tre de 0 5 12 um 36 Des tudes ont aussi d montr la pr sence de virus dans l air expir par des patients 37 38 On mentionne aussi que la toux excr te des organismes qui se d veloppent dans les voies respiratoires inf rieures et que l ternuement et la parole expulsent des organismes des voies sup rieures 39 La figure 9 permet de bien visualiser la grosseur des particules produites selon le m canisme de production ainsi que l endroit de d position dans les poumons en fonction du diam tre de la particule
42. 0 mais EEE lorsque nous avons v rifi l humidit avec une autre sonde elle tait 0 Donc il y avait un offset de 20 pour le Process Le Ambient temp rature tait rest calibr Ensuite il tait important de v rifier que m me si nous avions chang le offset la courbe de changement de la temp rature n avait pas chang Pour ce faire nous avons mis c te a c te notre sonde et _ anor une autre que nous savions calibr e et avons a re observ leur comportement lorsque nous avons a fait monter la temp rature de la bo te i E Interieur Drum Serial No 1010337 Unit ID Interieur Drum Interieur boite Description Untitled Untitled 5 Serial No Unit ID Process Alarms Offset Calibration Maintenant pour commencer un rotors enregistrement il suivit d aller dans File Star Tata Loggng Piating Tie Petod recording data Vous allez obtenir la fen tre Days Hours Minutes Seconds a Sea suivante Il suffit de s lectionner les channels tony Soo Mc Pete Has Banned que vous voulez enregistrer ainsi que l intervalle des mesures Plus l intervalle est court moins il Process enregistre longtemps donc s assurer qu il va enregistrer aussi longtemps que vous le voulez Plot Process on Left Axis Plot Process on Right Axis Serial No Unit ID a Il y a aussi la sonde kilog qui peut tre utilis e avec un logiciel tr s
43. 1 p 7310 7313 van Duin J T N The Bacteriophages second ed2006 New York Oxford University Press 768 Strauss J H and R L Sinsheimer Purification and properties of bacteriophage MS2 and its ribonucleic acid Journal of Molecular Biology 1963 7 1 p 43 amp Trouwbor T and J C Dejong Interaction of some factors in mechanism of inactivation of bacteriophage MS2 in aerosols Applied Microbiology 1973 26 3 p 252 257 Griffiths W D et al Determining the performance of a commercial air purification system for reducing airborne contamination using model micro organisms a new test methodology Journal of Hospital Infection 2005 61 3 p 242 247 Barker J and M V Jones The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet J Appl Microbiol 2005 99 2 p 339 347 Moselio Schaechter G M Barry Eisenstein Mechanisms of Microbial Disease second ed1993 Etats Unies Williams and Wilkins 973 Sorrell E M et al Predicting airborne influenza viruses trans mission impossible Curr Opin Virol 2011 1 6 p 635 42 Brankston G et al Transmission of influenza A in human beings Lancet Infectious Diseases 2007 7 4 p 257 265 Lindsley W G et al Quantity and Size Distribution of Cough Generated Aerosol Particles Produced by Influenza Patients During and After Illness J Occup Environ Hyg 2012 9 7 p 443 449 Tellier R Review o
44. HEPA Autrement on peut briser l APS Filtre HEPA Changer lorsqu il commence changer de couleur ou si la pression est plus lev e quand on envoie de l air Ne pas oublier de le changer de sens tout d pendant de si on aspire ou envoi de l air C est une manipulation tr s simple surtout avec des jonctions quicklock voir photo 97 Humidificateur de la chambre environnementale On a eu recours a cet appareil pour obtenir 80 humidit relative a 30 C Nous avions essay une multitude de montages Collison 6 jets aeroneb Collison 6 jets Collison 24 jets erlenmeyer avec eau en bullition mais aucun ne montait plus de 65 d humidit Ce n est qu avec cet humidificateur que l on peut atteindre cette humidit Son fonctionnement est assez simple une fois qu on a saisi comment installer la tubulure Sur le c t droit de la bo te noire ce qui contr le l humidificateur il y a trois tubes To The Nebulizer tube reli au n buliseur vis sur le dessus To The Chamber il s agit d une entr e d air pour faire fonctionner l humidificateur Branchez un filtre HEPA quicklock au bout de ce tube To The Train normalement reli a trois dess chants Simplement s assurer que l air peut circuler dans ce tube Pour actionner l humidificateur actionner le contr leur power l arri re indiquer quelle humidit on d sire avec les fl ches de l interface chiffre du bas est humidit d sir e et ch
45. Mob UNIVERSIT my LAVAL D veloppement de mod les standardis s pour l tude des a rosols viraux M moire M lissa Marcoux Voiselle Ma trise en microbiologie Ma tre s sciences M Sc Qu bec Canada M lissa Marcoux Voiselle 2014 R sum La dispersion des virus dans l air est un ph nom ne encore mal compris La transmission par contact direct avec une personne infect e ou indirecte via des surfaces contamin es a t largement document e mais la litt rature sur les a rosols viraux reste pauvre L a rosolisation de virus pathog nes requ rant d importantes mesures de bios curit des mod les de virus non pathog nes constitueraient des outils pr cieux dans l tude des a rosols viraux Ce projet vise le d veloppement de mod les standardis s pour l tude des a rosols viraux Ainsi des phages ont t test s comme mod les de virus eucaryotes Pour valuer leur r sistance aux stress environnementaux et aux diff rents temps d exposition ces phages ont t a rosolis s dans une chambre rotative o ils ont t expos s diverses conditions environnementales humidit relative HR temp rature UV et temps Les r sultats obtenus sugg rent que les phages choisis pourraient tre de bons mod les pour l tude du comportement des virus dans l air Abstract The spread of virus in the air is a poorly understood phenomenon Transmission by direct contact with an infected person or
46. ajout a du tampon de phage pour un volume final d environ 50 ml La concentration des phages dans le n bulisat variait de 10 10 pfu ml Des essais ont t faits afin de verifier si diff rentes concentrations de chaque phage pouvaient influencer les r sultats De l anti mousse A de Sigma Aldrich tait ajout au m lange pour viter la formation de mousse dans le n buliseur L anti mousse n avait aucun effet sur l infectivit des bact riophages et sur la performance des r actions PCR r sultats non montr s 2 3 G n ration d a rosols Pour l ensemble des exp rimentations les a rosols ont t g n r s avec un Collison 6 jets BGI Inc Walthman Mass aliment avec de lair m dical une pression de 20 psi ce qui quivaut une vitesse de 12 L minute L a rosolisation du m lange de phages durait 10 minutes dans le but de g n rer assez d a rosols pour remplir la chambre environnementale rotative CER 2 4 Contr le de l humidit et de la temp rature la sortie du Collison l a rosol passe au travers d une s rie de tubes de dess chants sous forme de billes afin d atteindre une humidit relative donn e soit 20 50 ou 80 A chaque changement de condition diff rents montages taient test s afin d obtenir la bonne humidit relative La stabilit des conditions jusqu une dur e de 14 heures tait aussi test e avant d entamer les exp rimentations Pour la condition enviro
47. aut garder en t te qu il s agit de mod les et que leur r le est de nous aider mieux comprendre le comportement des virus dans l air et nous aider pr dire la r ponse exacte d un virus eucaryote 73 5 Conclusion et perspectives Le projet avait pour but de d velopper des mod les pour mieux comprendre le comportement des virus dans l air Pour ce faire nous avons s lectionn quatre phages en fonction des diff rences qu ils pr sentaient au niveau de leur g nome et de leur structure afin de les associer au plus grand nombre de virus eucaryotes possible En les exposant sous forme d a rosols diff rentes temp ratures humidit s et au rayonnement des UV il a t d montr que 1 les phages non envelopp s semblent mieux persister de haut taux d humidit et que le phage envelopp pr f re de bas taux 2 qu une augmentation de la temp rature diminue le taux de survie des phages envelopp s et emp che la d tection de phages envelopp s infectieux et 3 qu une augmentation des UV diminue de fa on exponentielle la quantit de phages infectieux Le plus int ressant des r sultats est le fait que nos phages r pondent tous de mani re diff rente aux conditions environnementales auxquels ils ont t soumis Cette vari t de r ponses en fait d excellents mod les car a eux quatre ils permettent l approfondissement de la compr hension du comportement des virus dans lair Il serait int ressant de tes
48. c NAA LA PA ON NL eR A RCS A ee 1 1 1 2 Le diam tre a rodynamique Qi an nan date da eck Seana atthe nd Secale eked 2 1 1 3 Le comportement des particules dans Pair 2 1 14 Les bina rosois ns NRA net E AAE 6 Au RS ESS VITUS RE EE LR DR EE 7 TTC LD AGROVINOIOGIGs EL ner alia ie M at re a acres 8 1 1 7 Les chambres de NEA Len HA en a ns en eae Gala 9 1t Les CHAMDIES StALIQUES 55 0 scassvnssdatiiacunei vhsck avabeddeuobos ten a a a E Ra 10 1 1 7 2 Les chambres rotatives oiae e e A I E EEA 10 1 1 7 3 Les n buliseurs sienne 14 1 21La transmission Miraleses anni annaba Maine atlas ani dele 16 1 2 1 volution des CrOyances U tesa AN en 16 1 2 SONO ge ch eeeeeepe meme cree ee A dt lt 2 17 1 2 3 Transmission via les a rosols 19 12 20 MEM ALS S sai at Sd Ne ns ue 19 1 2 3 2 Cas possibles de transmission par l air aa 22 1 2 3 3 Effet de diff rents facteurs sur la persistance des virus dans l air 24 1 3 Les bacteriophages comme mod les viraux s auiien de inuinieiiines 30 131 G n rales oine d se den od eo ES aa Shon Sha bata dre En 30 1 3 2 Leur utilisation en tant que mod les esc cceceeeseseeeeeeeeeesesesessneneacacececeeeceusececeeeteceneessessnensnsneneneass 31 MIE PT Re tee et ete nee in nl ee ral NO EE AU seal 31 PRIOR ent ane HG ns ion 32 LS a D IM a a a a a a dasha da adabhd deta eaba coradaneadmnsatanapsiaty 32 ASS LS oe seca PS a a ER dE I 32 1 4 Virus e caryote t t de I AUC menaren inion
49. d ensemble sur le contr leur de temp rature Arri re du contr leur de temp rature De gauche droite prise de courant reli e la barre d alimentation interrupteur on off en jaune il s agit de la connexion pour la sonde de temp rature le fil avec du rouge est reli aux fours Pelletier 92 ue mm Ji jm a IcMPEKALURKE COIN IROL Vue rapproch e de l interface situ l avant du contr leur de temp rature Le chiffre du haut indique la temp rature actuelle et le chiffre du bas la temp rature voulue On augmente ou diminue la temp rature avec les fl ches rouges Les inscriptions OP1 et OP 2 vont appara tre gauche du 21 C sur la photo Les autres boutons servent se d placer dans le menu Le manuel d instruction du contr leur et sur le groupe Duchaine Fours Pelletier Faire attention de ne pas les obstruer 93 Tubes de dess chants La chambre environnementale est munie de trois tubes de dess chants qui permettent de moduler l humidit des a rosols produits Diff rents accessoires sont disponibles pour faire les montages tout d pendant de l humidit d sir e Les tubes de dess chants sont ferm s l aide de bouchons blancs mais qui ne sont pas vis s et donc peuvent facilement se d placer Lors de la mise en place de diff rents montages il est important de faire attention ne pas mettre trop de force sur ces bouchons autrement ils pourraient soit se briser
50. de suspension minutes Figure 16 Modulation de la temp rature dans la CER volution de la temp rature de la bo te de polycarbonate courbe rouge et de la chambre rotative courbe bleue dans le temps minutes Les lignes noires indiquent l intervalle de temps n cessaire la chambre pour atteindre la temp rature de la bo te 45 C Cet intervalle est d environ 40 minutes Pour tudier le comportement des a rosols dans la chambre rotative la concentration de particules et la variation du diam tre a rodynamique de la masse m diane MMAD ont t enregistr es sur une p riode de 5 heures une rotation de 1 et O rpm La temp rature tait de 21 C et l humidit relative 30 pour l ensemble des exp rimentations En moyenne le nombre initial de particules par litre d air tait de 2E 06 dans la chambre rotative Le MMAD initial tait de 1 36 0 03 um et 1 28 0 02 um pour des vitesses de rotation de 1 et O rpm respectivement Le MMAD augmentait 1 42 0 05 um apr s 5 heures de rotation 1 rpm et diminuait 0 96 0 01 um apr s 5 heures sans rotation 0 rpm voir figure 17 La concentration des particules diminue de 31 96 0 84 1 rpm et de 58 02 2 98 0 rpm voir figure 18 2Le MMAD est le diam tre de particules qui divise la fr quence de distribution en deux 50 de la masse des a rosols a un diam tre plus grand que le MMAD et le 50 restant a un diam tre plus petit que le MMAD 54 No
51. des maladies via les a rosols qui en est encore ses d buts mais en plein essor depuis quelques ann es L tude des a rosols est aussi une science multidisciplinaire Elle fait appel autant aux microbiologistes biochimistes qu aux physiciens et ing nieurs 1 1 2 Le diam tre a rodynamique da Dans l tude du comportement des particules dans lair le terme diam tre a rodynamique est couramment utilis En effet les particules en suspension dans l air peuvent tre de diff rentes formes telles que sph riques cubiques fibreuses en agr gats en plaque ou irr guli res 3 Le diam tre a rodynamique de ces particules correspond au diam tre d une particule sph rique homog ne telle une goutte d eau ayant la m me vitesse de d position Donc peu importe la forme des particules en suspension si leur da est le m me elles auront sensiblement le m me comportement dans un environnement donn temps de suspension et site de d position dans les poumons par exemple Cette propri t est mise profit dans plusieurs techniques d chantillonnage de l air afin de s parer les a rosols ou dans des appareils de mesure tel le mesureur a rodynamique de particules En effet le diam tre a rodynamique aura un impact direct sur le transport des particules dans un flot d air et donc dans un chantillonneur ou un appareil de mesure 1 1 3 Le comportement des particules dans l air Peu importe le m canisme de
52. distance de la table o a eu lieu l incident Finalement toutes les autres salles manger n ont rapport aucun cas de gastroent rite et toute la nourriture a t pr par e ensemble 11 1 2 3 3 Effet de diff rents facteurs sur la persistance des virus dans l air Tel que mentionn plus haut les virus qui se retrouvent en suspension dans l air sont affect s par les conditions environnementales Voici un aper u de l effet de ces conditions Effet de l humidit L humidit de lair est l un des plus importants facteurs affectant la persistance de virus infectieux dans l air On affirme que les virus envelopp s sont plus r sistants bas pourcentage d humidit 20 30 56 Parmi les virus envelopp s on retrouve plusieurs virus respiratoires tel que l nfluenza Coronavirus VRS Parainfluenza etc il existe cependant des exceptions Le virus 24 du sarcome de Rous VSR et le virus de la rhinotrach ite infectieuse bovine VRIB tous deux envelopp s r sistent mieux a de hauts taux d humidit s et le virus de la variole du pigeon serait insensible aux modulations d humidit 56 Parmi les virus non envelopp s les Rhinovirus et Adenovirus par exemple des pourcentages d humidit de 70 a 90 seraient plus favorables a leur r sistance 57 Arundel et a ont d couvert que pour ces virus des pourcentages moyens d humidit de 40 a 70 taient les plus n fastes 58 Dans un graphique du pourcentag
53. e 18 C pour une p riode d exposition de 0 6 et 14 heures 72 Il est int ressant de constater que le Flumist r agit en plusieurs points comme le phage phi6 le seul phage envelopp et ARN segment de nos mod les En effet l Influenza a eu une meilleure r sistance bas taux d humidit Cette corr lation entre un bas taux d humidit et une meilleure r sistance a aussi t observ e par Lowen et Hemme 56 112 L effet de l humidit semble plus marqu a partir de 6 heures d exposition tout comme phi6 De plus on peut observer un effet du temps 80 de HR sur le virus de I nfluenza tout comme on l a not pour le phage phi6 L effet de la temp rature n a pas t test dans la pr sente exp rience pour le Flumist mais Lowen a d montr que I nfluenza ne se transmet pas par a rosol 30 C 68 Phi6 a aussi d montr son incapacit persister 30 C lors de nos exp riences Il a cependant t observ que le Flumist semble plus r sistant au processus de n bulisation que le phage phi6 Il ne faut pas oublier que ces virus sont diff rents en de nombreux points entre autres la nature des membranes lipidiques des deux virus est diff rente L une provient de cellules de mammif re tandis que l autre de paroi bact rienne Donc on voit qu en plusieurs points phi6 semble pouvoir tre le phage mod le pour l Influenza parmi les quatre test s dans notre projet Il est vident cependant qu il f
54. e Rte 34 vii 1 5 Objectif des travaux de reche rele sante nt nat at MAR ne fetrtan nan dde Eden te 36 15A ODI CUS SH CIIQU SES RS ne Sr en tn Se 36 Ch pite 2 Mal nele Mens Len han nm nn in n a a apte 39 2 4 Bact nophage S Lt Cas etal eae rerien aiaee aaia kadaa urea ia Pe raana ar eaka orne 39 PAPAN A TE EEE AE EAEE A A AET E A 40 2 3 G n ration ATOS DIS SAS MS net saan ada Se a E ee a naine 40 2 4 Contr le de l humidit et de la temp rature cc cesecsesccessssessesessesseesssessscscensessnsneeseeeesecsnsesesenseeeeeeees 40 2 5 Exposition aux stress environnementaux 41 2 6 Echantillonnage des particules virales 41 2 1 Essais de Plaques Ken A nl Te E een 42 2 8 Extraction de l ARN ceesre annes eneee irea aaant ea aaaea taa ens raean Eaha AESA TEE E ER KEEA 42 2 9 Synth se de l ADN Complementaitess ic cdsaie i cosajucegeiet wesgagecdestivecsde meet urine fertiles 43 2 10 Amorces et sondes ss 43 2 11 R action en cha ne de polym risation quantitative PCR 43 2 12 Analyse des r sultats rss anne dre ner de Tee 45 2 13 Evaluation des performances de la CER een 45 2 14 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes humidit s relatives 47 2 15 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes temp ratures 48 2 16 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux U V sssssesssssessssssesssssseesesseees 48
55. e d infectivit en fonction du pourcentage d humidit on observerait donc une courbe en forme de V figure 11 On peut expliquer ces r sultats par le fait qu un haut niveau d humidit relative la quantit d eau dans a rosol est plus grande donc la concentration de sel est faible et l activit de l eau grande Ces deux conditions seraient favorables leur persistance moyenne humidit relative la concentration de sel est plus grande et l activit de l eau plus faible donc plus stressant pour les virus La persistance de certains virus un faible taux d humidit pourrait tre expliqu e par le fait que dans ces conditions les sels sont sous forme davantage solide et donc peu toxique pour les virus 59 Il est noter qu une r cente tude men e par Shaman et Kohn d montre que ce serait davantage l humidit absolue qui aurait un r el impact sur la viabilit du virus 60 Donaldson et Ferris 61 proposent que la tension de surface puisse tre responsable de la baisse d infectivit des virus envelopp s En effet l hydrophobicit des virus envelopp s ferait en sorte qu ils se retrouveraient la surface des a rosols et seraient soumis aux tensions de surface Cette derni re pourrait provoquer des changements de conformation chez le virus de hautes humidit s la surface de l a rosol est plus grande par la pr sence de plus de liquide augmentant ainsi la tension et expliquant peut tre une pl
56. e le plus sensible aux U V est phix174 suivi de phi6 PR772 et MS2 ont une survie semblable Les donn es ont t analys es avec une fonction de d croissance exponentielle a une phase exponential one phase decay Le tableau 5 contient les valeurs des constantes K qui est une constante de vitesse qui nous informe de la rapidit a laquelle le processus de perte d infectivit se fait exprim e en cm uJ et R qui indique la qualit de l ajustement de la courbe goodness of fit 0 8 0 6 mW cm2 o A 0 2 0 0 Temps sec Figure 21 Exposition des phages aux U V 60 Tableau 5 Constantes K et R pour les quatre phages pour les exp rimentations avec les UV Phages Constante K phix174 0 00164 PR772 0 00041 Constante R 0 90 phi6 0 00092 0 77 MS2 0 00055 0 95 100 904 AN N CN 80 i 4 1 AJ amn lt gt 70 CR i ros N Z 60 Le MS2 D T m PhiX174 T L ds k PR772 5 50 a ne IK j i s Ne 7 PRES S 4 NS R2 0 9481 5 40 R2 0 9744 2 i R X R2 0 9046 5 4 30 a R 07772 0 2000 4000 Dose UV J cm Figure 102 Pourcentage d infectivit des quatre phages en fonction de la dose d exposition aux UV 3 5 tude pilote Validation des mod les avec un virus eucaryote La validation des mod les a t faite en co n bulisant ceux ci en pr sence du virus de l Influenza Ce virus eucaryote tait att nu et
57. e plus de 1 pm sont particuli rement influenc es par ce m canisme 3 Le m canisme d interception Figure 3C est en jeu lorsqu une particule est assez l g re pour suivre le courant d air mais qui en raison de sa forme elle va entrer en contact avec une surface et s y d poser Par exemple les fibres d amiante voir figure 4 qui malgr un faible da peuvent facilement s accrocher aux obstacles en raison de leur forme fine et longue Les particules de petit diam tre soit moins de 0 5 um ob issent au m canisme de diffusion Figure 3D Les particules sont en constante agitation en raison du mouvement brownien plus pr cis ment en raison de la collision continuelle avec les mol cules de gaz qui entourent la particule En s agitant ainsi la particule augmente ses chances d entrer en collision avec une surface Finalement l attraction lectrostatique Figure 3E est la d position d une particule charg e sur une surface de charge oppos e La particule peut aussi tre entrain e vers une surface par r pulsion de charges identiques a particules de articules de l a rosol l a lignes a rosol d coulement de lignes d coulement de air surface de d position surface de d position V ticules di lignes particules de lignes parricules de d coulement de l a rosol d coulement de l n roso l air l air C surface de d position surface de d position SE mn particules de l a
58. e sant et l absent isme au travail Les modes de transmission de I nfluenza ne sont pas encore clairement tablis et de vifs d bats sur la question ont lieu 106 Il est accept que le contact direct et l exposition aux gouttelettes soient responsables de nombreux cas de transmission mais la voie des bioa rosols est fortement controvers e On n en connait peu sur la quantit de virus mise par les patients et le diam tre des a rosols produits contribuant ainsi au questionnement sur le mode de transmission 107 Une excellente revue de litt rature r sume les vidences pid miologiques et exp rimentales sur le r le des a rosols 108 On mentionne entre autres une tude o l on a expos des humains des a rosols d nfluenza et remarqu que la dose infectieuse est beaucoup plus faible que par inoculation intranasale 109 Une autre tude faite avec deux groupes de patients tuberculeux o l un des groupes tait dans une chambre avec des lampes UV d montre clairement que les UV diminuaient la transmission de I nfluenza 110 Une autre revue de litt rature sur I nfluenza conclut que ce virus peut rester 34 infectieux des heures sous forme d a rosols contrairement a quelques minutes sur les mains 111 Quelques tudes d crivent l effet de diff rents facteurs environnementaux sur l infectivit du virus de l Influenza semblerait que le virus de la grippe soit n gativement aff
59. e viruses J Virol Methods 1987 18 2 3 p 87 106 Ijaz M K et al Studies on the survival of aerosolized bovine rotavirus UK and a murine rotavirus Comp Immunol Microbiol Infect Dis 1994 17 2 p 91 8 Dubovi E J and T G Akers Airborne stability of tailless bacterial viruses S 13 and MS 2 Appl Microbiol 1970 19 4 p 624 8 Songer J R Influence of relative humidity on survival of some airborne viruses Applied Microbiology 1967 15 1 p 35 amp Elizabeth K and S Alexander Bacteriophages biology and applications CRC press ed2005 Florida 510 Sattar S A M K Ijaz and C P Gerba Spread of viral infections by aerosols Critical Reviews in Environmental Control 1987 17 2 p 89 131 77 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 78 Bloom B L The Medical Model Miasma Theory and Community Mental Health Community Mental Health Journal 1965 1 4 p 333 338 JM E The changing assessments of John Snow s and William Farr s cholera studies Soz Praventivmed 2001 46 p 225 232 Yu I T S et al Evidence of airborne transmission of the severe acute respiratory syndrome virus New England Journal of Medicine 2004 350 17 p 1731 1739 Atkinson M P and L M Wein Quantifying the routes of transmission for pandemic influenza Bulletin of Mathematical Biology 2008
60. ect par de hautes humidit s relatives 112 113 56 114 On a d ailleurs observ dans les r gions temp r es que lorsque l humidit absolue diminue environ 4 semaines plus tard on observe une recrudescence d nfluenza au sein de la population 115 La concentration de Influenza A est 2 4 fois plus importante 10 d humidit qu 90 d humidit Pour consulter les caract ristiques du virus de Influenza voir le tableau 2 Une image repr sentant le virus de I Influenza est pr sent e la figure 11 Tableau 2 Caract ristiques du virus de l nfluenza Nom virus Famille Capside G nome ARN sb Influenza Orthomixoviridae 80 120 nm oui Segment Enveloppe 8 segments Figure 11 Virus de l Influenza Photo prise en microscopie lectronique transmission Source CDC 35 1 5 Objectif des travaux de recherche Tel que mentionn plus haut l tude des a rosols viraux est complexe La faible concentration de virus les dommages caus s par les techniques d chantillonnage ainsi que l absence de techniques standardis es en a rovirologie font en sorte que la transmission par les a rosols est difficilement d montrable Pourtant plusieurs tudes pid miologiques ou de m canique des fluides ainsi que des travaux en laboratoire abondent en ce sens C est devant cette probl matique que le pr sent projet a t mis sur pied Il vise le d veloppement de mod les standardis s
61. effect of ultraviolet irradiation on detection by a semi nested RT PCR assay Bmc Public Health 2003 3 Myatt T A et al Detection of airborne rhinovirus and its relation to outdoor air supply in office environments Am J Respir Crit Care Med 2004 169 11 p 1187 90 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 Sawyer M H et al Detection of varicella zoster virus DNA in air samples from hospital rooms J Infect Dis 1994 169 1 p 91 4 Suzuki K et al Detection of varicella zoster virus DNA in throat swabs of patients with herpes zoster and on air purifier filters J Med Virol 2002 66 4 p 567 70 Yu I T S et al Temporal spatial analysis of severe acute respiratory syndrome among hospital inpatients Clinical Infectious Diseases 2005 40 9 p 1237 1243 Donaldson A I and S Alexandersen Predicting the spread of foot and mouth disease by airborne virus Revue Scientifique Et Technique De L Office International Des Epizooties 2002 21 3 p 569 575 Moser M R et al Outbreak of influenza aboard a commercial airliner American Journal of Epidemiology 1979 110 1 p 1 6 Sawyer L A et al 25 Nm to 30 Nm Virus Particle Associated with a Hospital Outbreak of Acute Gastroenteritis with Evidence for Airborne Transmission American Journal of Epidemiology 1988 127 6 p 1261 1271 Kimura H
62. en tudiant le comportement des particules dans le temps Un Collison 6 jets a t utilis pour n buliser du tampon de phage 12 L min Pour atteindre la bonne humidit les a rosols traversaient une s rie de dess chants La temp rature de la chambre tait modul e par la bo te de polycarbonate entourant Pour augmenter la temp rature de 8 C 45 C cela prend environ 40 minutes de plus la chambre pour atteindre la m me temp rature que la bo te de polycarbonate figure 16 La temp rature reste stable dans une fourchette de 0 5 C de la valeur de base pour une longue p riode de temps le temps test dans les exp rimentations tait de 48 heures L ouverture de la lampe UV pour une courte p riode de temps 5 minutes n a pas d impact sur la temp rature de la chambre Une fois l humidit relative d sir e est atteinte la chambre tait scell e et laiss e en rotation pour une p riode de 14 heures puis les humidit s initiale et finale taient compar es 18 C avec une rotation de 1 rpm l humidit relative diminu e de 2 2 0 2 3 6 0 4 et 3 3 0 6 en 14 heures pour des humidit s initiales de 20 50 et 80 respectivement 93 Evolution de la temp rature gt uuu no wm T mperature C e e N NY WwW WwW f OU A oN OW OR TA 0 I ON AOM OR si 0 I ON OO MmOR si 0 M ON DAD LO ANNmMT SUN OR R D nn OO Ai A NN M SH OO NOON 00 00 Oo M dd A A A A A A A A aa a temps
63. ent plusieurs dilutions du liquide allantoique de chaque uf sont faites dans du tampon PBS phosphate buffer saline du sang de poule est ajout et apr s 30 minutes d attente on v rifie s il y a h magglutination des globules rouges Le virus de l Influenza a une prot ine de son enveloppe appel e h magglutinine ou HA qui se lie aux r cepteurs de l acide sialique sur les cellules Le virus se lie aussi aux rythrocytes causant la formation d un treillis qui va tapisser le puits de la plaque plaques transparentes 96 puits fond en U non trait es et st riles costar 2797 C est ce qu on appelle h magglutination Les globules rouges qui ne sont pas li s l Influenza vont former un point rouge dans le fond du puits voir figure 16 Finalement les chantillons sont aussi analys s en qPCR pour d terminer la quantit totale de virus nfluenza ainsi que de chaque phage 90 1 20 1 40 1 80 1 160 1 320 1 640 Control mr OOO a 27 N Enlarged photo of wells Side view of wells b Agglutinated c Nonagglutinated Figure 15 Sch ma du test d h magglutination Le puits contr le est un contr le n gatif copyright 2007 Pearson Education Inc publishing as Benjamin Cummings 51 Chapitre 3 R sultats 3 1 Evaluation de la performance de la CER La performance de la chambre a t valu e en observant la stabilit de la temp rature et de l humidit relative et
64. ent un et les autres tait inversement proportionnelle au risque d infection En effet le 2 3 des patients de la m me salle ont t infect s la moiti des patients de la salle adjacente et 18 des patients d une salle plus loin 51 La fi vre aphteuse FMDV peut aussi se transmettre via les a rosols lorsque les conditions environnementales et pid miologiques y sont propices On rapporte un cas en Angleterre en 1967 ou en trois semaines le virus s est diss min d une ferme vers 300 autres dont certaines taient situ es plus de 60 km 52 Un article de Moser largement cit d taille une pid mie d nfluenza qui a eu lieu a bord d un avion en Alaska L avion en question faisait plusieurs arr ts ou des passagers descendaient et montaient A bord une personne d montrait des sympt mes grippaux Au cours du trajet l avion a eu des probl mes m caniques et a d rester au sol 3 heures avec les passagers a bord sans ventilation En 72 heures 72 des passagers ont eu des signes d infection a l Influenza Les probabilit s d tre malade taient proportionnelles au temps rest bord et aucune personne descendue avant l arr t de la ventilation n est tomb e malade Ceci d montre le r le de la ventilation dans le contr le des infections 53 Il existe aussi des cas avec des virus ent riques 54 Norovirus peut facilement se retrouver dans l air sous forme d a rosol tel que mentionn plus
65. erait possible de garder en suspension des particules de moins de 1 pm pendant un an Dans les m mes conditions 50 des particules de 1 a 2 um restent en suspension pour une p riode de 6 mois 13 La figure 7 toujours tir e des travaux d Asgharian et al d montre que plus le diam tre des particules est lev moins elles restent en suspension longtemps Elle met aussi en vidence le r le de la rotation dans le maintien en suspension des particules car en absence de rotation les particules de 0 5 um s dimentent en moins de 2 jours 12 On mentionne aussi que pour maintenir en suspension les particules de gros diam tre plus de 20 um il faut une vitesse de rotation tr s faible soit environ 0 4 rpm Il existe donc une relation inversement proportionnelle entre le diam tre des particules cibl es et la vitesse de rotation Il existe la m me relation entre le temps de s jour dans la chambre rotative et la vitesse de rotation 13 m n v ii y 07 ae 19 he s 0 6 1 D ne D ie 8 05 E 0 4 S u 05 um E 0 3 t stationary drum 2 i E x 0 2 H Li i OOo _ 0 2 4 6 8 10 12 14 Suspension Time days Figure 7 Fraction du nombre initial de particules en fonction du temps selon la grosseur des particules qui reste en suspension dans la chambre rotative La ligne hachur e repr sente le comportement des particules de 0 5 um en absence de rotation
66. es dans la CER 55 Figure 18 Evolution du MMAD dans la CER en fonction du temps 55 Figure 19 Effet de l humidit sur l infectivite des phages en fonction du temps de SUSPENSION A TO Gen ere ne atacand andthe vats te tee ee haies 58 Figure 20 Effet de la temp rature sur l infectivit des phages en fonction du temps de suspension 80 ARE san A ie epee we cimstarn waicinrse 59 Figure 21 Exposition des phages aux UV Figure 22 Pourcentage d infectivit des quatre phages en fonction de la dose d exposition QUI oes se scene secte rccaxane stan EOK EE EKSTE SEKTE Figure 23 Pourcentage d infectivit du virus de l Influenza Flumist en fonction du temps deux humidit s relatives 20 et 80 Figure 24 Contribution relative de l attachement l injection et la r plication dans la perte d infectivit selon le mode de d sinfection choisi Liste des tableaux Tableau 1 Ensemble des caract ristiques des quatre phages mod les choisis 33 Tableau 2 Caract ristiques du virus de l Influenza 35 Tableau 3 Les concentrations des sondes et amorces pour les r actions des quatre phages et volumes d chantillon ajout s au mix 44 Tableau 4 Amorces et sondes utilis es pour les r actions PCR 44 Tableau 5 Constante K et R pour les quatre pha
67. est reconnu pour sa capside tres tanche le rendant plus r sistant que la moyenne des virus Une hausse de temp rature a pourtant eu un effet significatif sur leur infectivit mais le phage PR772 moins stable aux variations d humidit n a pas t affect Une diff rence notable entre la composition de la capside de PR772 et les phages phiX174 et MS2 est la 69 pr sence de lipide dans l paisse membrane interne de PR772 126 La chaleur affecte les prot ines en les d naturant En perdant leur structure elles perdent aussi leur fonction Dans le cas des virus la d naturation des prot ines emp che souvent la reconnaissance de l h te et ou son attachement D ailleurs dans une tude sur l effet de diff rentes m thodes de d sinfection sur les virus pr sents dans l eau o on a utilis MS2 comme mod le de virus on a d montr que la chaleur affectait particuli rement l attachement voir figure 24 127 Dans une autre tude on a tudi l effet de la chaleur et du NaCl sur MS2 et Norovirus murin On a d montr que la chaleur avait un plus grand effet sur l infectivit de MS2 que le NaCl 128 Il a t mentionn dans l introduction que la concentration de NaCl varie dans un a rosol avec la modulation de l humidit tant donn que MS2 semble moins affect par le NaCl que par la chaleur cela pourrait expliquer la plus grande perte d infectivit avec une modulation de la temp rature comparativemen
68. et al A norovirus outbreak associated with environmental contamination at a hotel Epidemiology and Infection 2011 139 2 p 317 325 Hemmes J H K C Winkler and S M Kool Virus survival as a seasonal factor in influenza and poliomyelitis Nature 1960 188 4748 p 430 431 Karim Y G et al Effect of relative humidity on the airborne survival of rhinovirus 14 Can J Microbiol 1985 31 11 p 1058 61 Arundel A V et al Indirect health effects of relative humidity in indoor environments Environ Health Perspect 1986 65 p 351 61 Benbough J E Some factors affecting the survival of airborne viruses J Gen Virol 1971 10 3 p 209 20 Shaman J and M Kohn Absolute humidity modulates influenza survival transmission and seasonality Proc Natl Acad Sci U S A 2009 106 9 p 3243 8 Donaldson A l and N P Ferris Survival of Some Air Borne Animal Viruses in Relation to Relative Humidity Vet Microbiol 1976 1 4 p 413 420 Yang W and L C Marr Mechanisms by which ambient humidity may affect viruses in aerosols Appl Environ Microbiol 2012 78 19 p 6781 8 Tang J W The effect of environmental parameters on the survival of airborne infectious agents JR Soc Interface 2009 6 Suppl 6 p S737 46 Harper G J Airborne Micro Organisms Survival Tests with 4 Viruses Journal of Hygiene 1961 59 4 p 479 amp Ehrlich R and S Miller Effect of relative humidity and temperature on airborne Venezuela
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70. fections seraient transmis via les a rosols 29 Finalement on sait depuis longtemps qu un grand nombre d infections sont d origine virale estimation 60 en 1965 30 et puisque les virus se r pliquent l int rieur des cellules de l h te on peut difficilement les combattre sans affecter le patient Il existe tout de m me des antiviraux qui peuvent affecter le cycle de r plication des virus On peut s en prot ger par la vaccination mais la cr ation d un vaccin est ardue particuli rement pour les virus ARN qui mutent rapidement 31 Bref la protection de la population repose grandement sur des mesures pr ventives et de protection qui ne sont ad quates que si nous avons une bonne compr hension des m canismes de transmission 18 1 2 3 Transmission via les a rosols 1 2 3 1 G n ralit s On parle de transmission via les a rosols lorsque les gouttelettes charg es de pathog nes form es par diff rents m canismes sont suffisamment petites pour rester en suspension pour une p riode prolong e et parcourir de longues distances 32 Par exemple on estime que des particules d un diam tre de 1 3 um peuvent rester en suspension presque ind finiment Les particules de 10 pm 20 um et 100 um prennent 17 minutes 4 minutes et 10 secondes respectivement pour s dimenter d une hauteur de 3 m tres 33 Ces a rosols infectieux peuvent tre produits entre autres par la toux l ternuement la respiration les
71. font plus rapidement des dim res que l uracile 136 Selon nos r sultats PR772 ADN double brin se retrouve devant phi6 ARN double brin malgr le fait que l ADN serait plus sensible aux UV Phi6 s est aussi av r tre plus variable que les autres phages dans sa r ponse aux UV Cette variabilit peut tre due au fait que les g loses n ont pas t mises assez rapidement la noirceur pour emp cher la r paration du g nome catalys par la lumi re et que les enzymes r paratrices de la cellule h te ont pu agir 97 Selon la litt rature les doubles h lices d ADN absorberaient moins que les g nomes simple brin les rendant moins sensibles aux UV 137 C est effectivement ce qui a t observ pour PR772 et phiX174 En r sum MS2 r pond tel qu attendu c est dire qu il est le plus r sistant des phages test s Phi6 se retrouve derri re PR772 alors qu on aurait pu s attendre ce qu il soit plus r sistant en raison de son g nome a ARN et finalement phiX174 avec son g nome simple brin ADN se retrouve dernier tel qu attendu selon la litt rature 4 5 tude pilote Validation des mod les avec virus eucaryote La validation des mod les a t faite en co n bulisant ceux ci en pr sence du virus de l Influenza Ce virus eucaryote tait att nu et provenait du vaccin saisonnier Flumist Le m lange des quatre phages avec I nfluenza a t expos a 20 et 80 HR une temp rature constante d
72. ges pour les exp rimentations Avec l s UV ries a Care tere oes Jalal ne M TR M pe date ease aed Tue Lt 61 xi xii Liste des abr viations Degr Celsius Pourcent Polymerase Chain Reaction Quantitative Polymerase Chain Reaction Microlitre Micrometre Micromolaire Millimolaire Millilitre Nanom tre Acide d soxyribonucl ique ADN double brin ADN simple brin Acide ribonucl ique Paire de bases Rotation par minute Food and Mouth virus Newcastle Disease Virus rhinotrach ite infectieuse bovine Vesicular stomatitis Virus Virus sarcome de Rous Severe acute respiratory syndrome Enc phalomyocardite Diam tre a rodynamique Ultraviolets Organisation mondiale de la sant polyt trafluoro thyl ne Diam tre a rodynamique de la masse m diane Milliwatt H magjlutinine Chambre environnementale rotative xiii Remerciements A ma deuxi me ann e de baccalaur at j avais mon horaire le cours Isolement et Culture des Microorganismes D s les premi res heures il n a suffit que d un regard entre mon complice et moi pour comprendre que nous avions devant nous quelqu un d extraordinaire C est d abord ta fa on d enseigner qui m a attir tellement nergique et entrecoup e de il faut que je vous raconte mon r ve d hier ou de c est comme la fois o de mes tudiants mis quelque chose l autoclave et qu on ne l a jamais retrouv ce n tait pas Marc a en plus finalement
73. i a pour d savantage la perte des particules et ainsi emp cher l tude d effets a long terme sur les a rosols Cependant la conception de ce genre de chambre est tr s simple ce qui offre un avantage consid rable 3 Dans les chambres statiques on peut faire l tude de lefficacit d chantillonneurs de filtres et la perte d a rosols sur les parois de diff rents mat riaux par exemple 3 Ce genre d tudes peut aussi tre fait dans les chambres dynamiques 1 1 7 2 Les chambres rotatives Dans les chambres de g n ration dynamique l air est continuellement en mouvement Le mouvement de l air peut tre g n r par des ventilateurs l int rieur de la chambre par des courants de convection dus la chaleur par un apport continuel d a rosols ou par la rotation de la chambre autour d un axe horizontal La figure 5 pr sente differents mod les de chambres dynamiques C est Goldberg en 1958 qui fut le premier a mettre au point une chambre environnementale rotative plus commun ment appel e rotating drum dans la litt rature voir figure en annexe 2 Les tudes faites avant 1958 ne pouvaient pas caract riser l effet de diff rents facteurs environnementaux ou simplement l effet du temps sur l int grit des particules en suspension 10 En effet sous l effet de la force gravitationnelle les particules n bulis es dans une chambre statique peuvent se d poser tres rapidement et ainsi emp che
74. iffre du haut est celle actuelle Important de mettre la sonde de cet humidificateur dans le drum pour qu il sache quelle humidit il est rendu Lors d une exp rimentation on peut ajuster l humidit avant d envoyer notre chantillon on peut aussi les envoyer en m me temps pour tre certain que l humidit ne baisse pas mais il est tr s important de fermer la valve de l humidificateur s il est l arr t et que notre autre n buliseur fonctionne toujours Autrement il y a un retour d air dans l humidificateur ce qui le fait d border et pourrait le briser et on perd une partie de l chantillon Puisque l humidificateur produit beaucoup d eau il est pr f rable que les a rosols montent dans le tube de silicone avant d entrer dans le drum Ainsi les plus grosses gouttelettes restent prises en bas voir photo 98 Supports pour le drum Support vertical et horizontal al Important de ne pas laisser le drum dans sa position verticale trop longtemps Important de bien attacher le drum avec des sangles car a cause de la roue a dent de scie qui permette de faire tourner le drum l un des c t s est plus lourd que l autre et pourrait faire basculer le drum 99 Trouble shooting Il n y a rien qui allume Le drum est il branch La barre d alimentation est elle ON L interrupteur du drum est il ON Fuites Les fuites sont l un des plus gros probl mes que l on peut rencontrer avec
75. iolet light UV irradiation on RNA pahge in H20 and in D20 Virology 1971 46 1 p 171 amp Meng Q S and C P Gerba Comparative inactivation of enteric adenoviruses poliovirus and coliphages by ultraviolet irradiation Water Research 1996 30 11 p 2665 2668 Rauth A M Physical State of Viral Nucleic Acid and Sensitivity of Viruses to Ultraviolet Light Biophysical Journal 1965 5 3 p 257 amp Jagger J Introduction to research in ultraviolet photobiology Introduction to research in ultraviolet photobiology1967 Prentice Hall Inc Englewood Cliffs N J x 164p Illus Patrick M H and R O Rahn Photochemistry of DNA and polynucleotides photo products Wang Shih Yi1976 35 95 Annexe Manuel d utilisation de la chambre environnementale 83 Pierre Lasou Universit Laval Biblioth que Table des mati res Composante Spir na E cn end ere 87 Le panneau de contr le sn 87 OR Neeser tye wees er eee Poe Sere A ever E eee eS ern rye eee eee eee ET 89 kampe UN cazssss cecctecscasteas E E 90 Contr le de la temp rature nn 92 DOS SR erry nr yen eee een perme ery er rr 94 Sondes de EMPIRE en ne cn ns R 95 Montages POSSIDlES ieai entasen ee senaera E a adsain aE A TEE 7 fortes aana aerae E A ERNE ter oe erent 96 Collison es a E eer re rere a 96 PTOI Daien A a 96 BORN nn 97 RS edo ete ED Pee TONE Ze E ree eee ee eee 97 SIU a gy Done Preece a POT esa 97 Humidificateur de la chambre environnementale
76. ion est moins grande et permet l a rosol de garder une fine couche d eau sa surface 71 72 La m me relation a t remarqu e avec le virus de la Vaccine expos aux UVC des humidit s de 20 60 et 80 P lt 0 0001 en plus d un effet protecteur d un fluide respiratoire synth tique P 0 014 73 Effet de la pr sence de mati re organique La pr sence de mat riel organique le sang le mucus la salive les f ces etc peut faire varier la persistance des virus car ce mat riel peut prot ger ces derniers des conditions environnementales 63 Il a t d montr que le virus de l enc phalomyocardite EMC le virus de la rhinotrach ite infectieuse bovine IBR et le rotavirus sont plus stables lorsqu a rosolis s en pr sence de salive de s cr tions nasales et mati re f cale respectivement 74 76 L effet de la poussi re sur la viabilit des virus na pas t test ce jour au meilleur de notre connaissance La co a rosolisation de poussi res et de virus pourrait amener un effet protecteur aux virus ou aussi faire en sorte qu ils sont moins longtemps en suspension dans l air En effet les virus ont une tendance naturelle s agr ger aux autres particules et restent ainsi moins longtemps en suspension 7 Cet 27 aspect pourrait ne pas avoir d impact sur la persistance des virus mais est tout de m me important pour la sant humaine et animale En effet si un virus ne se retrouve pas dans
77. ions environnementales de l exp rimentation 5 De plus sur la section B de la figure on voit a quel point l humidit relative de l environnement a un impact sur la grosseur limite de particules pouvant tre transform es en noyaux de gouttelettes Par exemple pour des humidit s relatives de 0 et 90 la limite est 125 et 60 um respectivement L importance de la diff renciation entre ces deux types de particules gouttelette et noyau de gouttelette sera discut e la section 1 2 2 Figure 1 Formation d un noyau de gouttelette Le noyau se forme droite partir d une gouttelette gauche par vaporation du liquide et concentration des solides 1 Figure tir e de 1 Droplet diameter u m n 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time s To evaporate A To ground 2m o Evaporation time Falling time Droplet diameter um 100 120 140 160 180 200 o RH 0 o RH 30 RH 50 4 RH 70 o RH 90 Time s Figure 2 D placement du diam tre limite en fonction de l humidit relative En A la vitesse d vaporation et de s dimentation selon le diam tre des particules um En B il s agit des m mes courbes mais sous diff rentes conditions d humidit s relatives 5 Figure tir e de 5 Une fois sous forme de noyaux de gouttelettes les a rosols vont se d placer suivant les courants d air vent ext rieur ventilation courant de convection mou
78. iridae PR772 Tectiviradae Double capside lcosa dre 53 nm non Double brin ADN Lin aire Non segment 14 492 pb E coli 37 C Adenoviridae PhiX174 Microviridae Icosa dre 25 nm non Simple brin ADN circulaire Non segment 5386 nt E coli 37 C Circoviridae 33 1 4 Virus eucaryote a l tude l Influenza Le virus de I nfluenza est un virus pouvant infecter les mammif res et les oiseaux Son g nome est compos d ARN simple brin segment et il est envelopp d une couche lipidique Il est de la famille des Orthomyxoviridae et comprend trois types A B et C Le type A est celui qui cause la plupart des pid mies et pand mies le type B peut aussi se propager chez l humain et le type C a beaucoup moins d int r t en pathologie humaine la surface des virus de type A et B il y a deux prot ines soit l h maggjlutinine et la neuraminidase qui permettent de diviser les virus en s rotype 104 En raison de la nature de son g nome ARN simple brin et segment et de la faible fid lit des prot ines de r plication le virus mute et r arrange ses segments rapidement Il est donc en constant changement au niveau g n tique et ph notypique lors de sa circulation au sein d une population 105 L nfluenza est tr s tudi e en raison des dommages qu il peut causer dans une population et les r percussions conomiques qu il engendre soit les soins d
79. itm tre Le port restant l extr mit droite peut tre utilis pour le vide 88 Ports A B OnmoOouQ e cie Description Reli la chambre rotative pour la pression Port qui ne doit JAMAIS tre branch Permet d viter l explosion du panneau de contr le si jamais la pression augmentait Port 4A fonctionne par d bit d air Port 4B fonctionne par d bit d air Port 1 fonctionne par pression d air Port 2 fonctionne par pression d air Port 3A fonctionne par pression d air Port 3B fonctionne par d bit d air Moteur Panneau de contr le du moteur Au maximum de sa vitesse le moteur peut faire tourner la chambre 1 rpm Cependant le moteur peut tre modifi pour augmenter sa vitesse On contr le la vitesse l aide de l interface sur la photo de gauche Il est primordial que le speed soit 0 avant d allumer le bouton POWER Il faut aussi que le POWER soit OFF avant d allumer la barre d alimentation En date de f vrier 2012 le moteur fait beaucoup de bruit lorsqu il fonctionne II s agit peut tre des balais de charbon qui frottent ensemble car le drum ne tourne pas assez vite compar ce qu il pourrait faire Le bruit pourrait aussi provenir de la rotation de la fane mais somme toute il ny a pas s inqui ter pour le moment Lorsque le moteur sera changer Daniel Verreault propose un moteur moins puissant Lien entre moteur et engrenage ll est aussi
80. l culaire beaucoup d quipes se sont tourn es vers ces m thodes pour l analyse des a rosols Plusieurs tudes ont d montr l efficacit de la qPCR dans la d tection des virus dans l air 42 45 46 47 50 Cette technique est beaucoup plus sensible que les m thodes traditionnelles d chantillonnage et permet la d tection de virus m me si leur concentration est tr s faible Elle permet aussi de savoir rapidement si un environnement est contamin contrairement la culture qui peut prendre des jours voire des semaines Cette m thode permet d chantillonner un tr s grand volume d air puisque notre chantillon est tr s dilu dans l air sans r ellement se soucier 20 des dommages caus s par ces techniques sur la structure du virus Le principal est d avoir de l ADN ou ARN intact Ceci est prometteur car on ne peut pas a coup s r se fier au pourcentage d infectivit d un virus dans l tude des a rosols En effet les m thodes actuelles d chantillonnage endommagent les virus amenant tr s probablement de faux n gatifs La qPCR quant a elle permet de d terminer s il y a pr sence du virus en question Cependant il reste difficile d affirmer que la pr sence d ADN ou d ARN soit associ e a un risque d infection Il se pourrait que tous les virus soient non infectieux Cette question d coule directement du manque d information quant a la propagation et la survie des virus dans lair et du manque de
81. l e l int rieur de la chambre Les donn es taient fournies en amp res par le logiciel d analyse et devaient tre converties en mW cm La formule suivante tait utilis e y 0 625x 2 5 O x est exprim en milliamp res et y en mW cm 2 17 tude pilote validation des mod les avec virus eucaryote Pour valider nos mod les de phages ceux ci ont t co n bulis s en pr sence du virus de I nfluenza att nu le Flumist Le Flumist est un vaccin nasal qui permet l immunisation contre l Influenza des sous types A et B contenus dans le vaccin tout d pendant des souches pr valentes de l ann e La co n bulisation permet d exposer nos mod les et le virus eucaryotes exactement aux m mes conditions Autrement une variation dans les conditions pourrait engendrer diff rentes r ponses de nos virus et amener conclure de fa on erron e qu ils se comportent diff remment La s quence de manipulations tait la m me que pour l valuation de la r sistance l humidit et a la temp rature Le m me m lange de phages tait fait mais 1 ml de Flumist tait ajout celui ci et le tout mis dans le n buliseur Une partie de l chantillon r colt par le SKC Biosampler tait utilis e pour les tests d infectivit des phages sur tapis bact rien tandis que l autre partie tait filtr e sur 0 45 pm pour s assurer qu il n y avait pas de contamination bact rienne et utilis e pour tester l i
82. la CER tubulures pour Collison tubulures pour SKC Biosampler filtre HEPA sondes d humidit de temp rature et d ultraviolets ainsi que leur logiciel La description de l ensemble des montages est disponible dans le manuel d instruction r dig par moi m me annex a ce m moire Par la suite il a t v rifi que le prototype de chambre r pondait bien aux attentes maintien de la temp rature et de l humidit relative sur de longues p riodes capacit de maintenir la rotation sur de longues p riodes maintien de la temp rature et de l humidit relative en pr sence d ultraviolets L tancheit de l ensemble du dispositif a aussi t v rifi e 45 Finalement le comportement des particules a t tudi Il a d abord t v rifi que la rotation de la chambre environnementale avait r ellement un impact sur le maintien en suspension des particules Trois vitesses de rotation ont t test es soit 1 rpm 0 47 rpm et aucune rotation Du tampon de phage 1X a t n bulis avec le Collison 6 jets L humidit relative de l a rosol tait de 30 suite un passage dans les tubes de dess chants intervalles r guliers de 30 minutes pour une p riode de 5 heures un chantillon d air de 20 secondes de la chambre environnementale rotative tait pris avec un APS Le facteur de dilution des chantillons pris avec l APS tout au long de l exp rimentation a t pris en consid ration A
83. les savants de l poque avaient tout de m me une th orie les miasmes Ce terme vient de miasma qui signifie pollution en grec En effet on croyait que les maladies se transmettaient par le biais de vapeurs ou nuages nocturnes naus abonds Ces vapeurs manaient souvent des marais ou des sols nocturnes emplacement o les habitants jetaient leurs d chets et d jections 24 On incrimina donc les odeurs naus abondes pour plusieurs maladies dont les trois grandes pid mies de peste ainsi que pour plusieurs pid mies de chol ra Pour s en prot ger on pouvait porter un mouchoir imbib de vinaigre et d pices coupant les mauvaises odeurs Les gens de l poque sont m me all s jusqu vider des marais John Snow 1815 1858 est l un des pionniers a avoir mis en doute cette th orie depuis longtemps tablie avec ses travaux sur le chol ra 25 Les travaux de Louis Pasteur 1822 1895 scientifique fran ais mirent en lumi re l omnipr sence des germes dans lair ambiant En effet il d montra l aide d un ballon col de cygne et d un autre muni d une ouverture standard qu aucune croissance n apparaissait dans le premier en raison de l incapacit des particules de l air remonter le col La th orie des germes tait maintenant la pr f r e 3 16 Par la suite et aujourd hui encore la th orie des gouttelettes particules charg es de pathog nes produites lors de la toux ou ternuement pouvant parcourir
84. m a toujours soutenue dans les hauts comme dans les creux Sans ton amour je n y serais pas arrive Xvi On passe une moiti de la vie attendre ceux que l on aimera et l autre moiti quitter ceux qu on aime Victor Hugo Tas de pierres 1901 xvii Chapitre 1 Introduction 1 1 Les a rosols 1 1 1 D finitions g n rales On entend par a rosols toutes particules solides ou liquides pouvant tre organiques ou inorganiques qui se retrouvent en suspension dans l air Ces particules sont soit produites de fa on naturelle par les volcans les feux de for t ou l rosion olienne des sols ou de fa on artificielle par l action de l homme telles que par les voitures ou les activit s industrielles 3 G n ralement les a rosols ont un diam tre a rodynamique compris entre 0 002 et 100 um 4 Des particules de plus gros diam tre peuvent se retrouver en suspension dans l air mais vont s dimenter trop rapidement pour tre consid r es comme des a rosols Les particules de moins de 0 002 pm quant elles se comportent plus tels des gaz que comme des particules 3 L tude des a rosols est tr s large Pour ne nommer que quelques domaines il y a l tude de la pollution atmosph rique de la qualit de l air ambiant des ph nom nes atmosph riques comme la formation des nuages de la combustion et de l instrumentation reli e ce domaine On peut aussi nommer l tude de la transmission
85. m thodes d chantillonnage douces et conservant l infectivit des virus chantillonn s Les connaissances sur la transmission des virus via les a rosols s accumulent mais les tudes sont difficilement comparables entre elles en raison de la divergence de techniques utilis es ou les diff rences dans la pr sentation des r sultats d un laboratoire l autre 23 Ce manque de standardisation entre les tudes emp che de voir s il est possible de tirer des conclusions pour l ensemble des familles de virus En effet le changement d une seule variable par exemple le liquide de n bulisation dans des conditions aussi stressantes que la n bulisation et l chantillonnage peut amener des r sultats forts divergents d une quipe l autre 21 Physical Direct Dynamic Decay Upper r ry tract gt pper te 9 se Expelledfrom particle size infectious host 4 1 byviolent ey Density expiration gt r respiratory tract cough sneeze settling i i veloc or simply Temperature ny exhalation and relative kw humidity Indirect Particle Aerosolization omposiuon of infectious Virus particle s agent from genetic environmentally vulnerability Ultraviolet contaminated radiation 2 sources fomites pe sewage Biologic Decay Particle size um Particle size um Figure 10 Parcours a robiologique des maladies transmissibles pas l air En A on voit la grosseur de particule
86. mbre relative de particules 100 1 rpm lt Orpm mek 50 Temps heures Figure 87 Evolution du nombre de particules dans la CER Evolution du nombre de particules en pourcentage du nombre de d part dans le temps heures en fonction de la vitesse de rotation rpm soit de 1 rpm ligne hachur e et O rpm ligne pleine 21 C et 30 d humidit relative MMAD um 1 rpm 0 rpm 0 5 Temps heures Figure 98 volution du MMAD dans la CER en fonction du temps volution du MMAD dans le temps heures en fonction de la vitesse de rotation rpm soit de 1 rpm ligne hachur e et 0 rpm ligne pleine 21 C et 30 d humidit relative 95 3 2 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les a diff rentes humidit s relatives L effet de l humidit sur la r sistance des bact riophages a t valu en exposant ceux ci a 20 50 et 80 d humidit relative a une temp rature constante de 18 C Les a rosols sont rest s en suspension pour des p riodes de 0 a 14 heures Les r sultats sont pr sent s a la figure 19 Des analyses statistiques ont t faites afin de v rifier si l humidit et le temps avaient un effet significatif sur la persistance des phages Les lettres au dessus des colonnes permettent d indiquer s il y a une diff rence significative de la survie entre les humidit s a l int rieur d un m me temps Par exemple pour PR772
87. n equine encephalitis virus Appl Microbiol 1971 22 2 p 194 9 Zimmerman J et al Effect of temperature and relative humidity on the stability of infectious porcine reproductive and respiratory syndrome virus in aerosols Veterinary Research 2007 38 1 p 81 93 Ijaz M K et al Survival Characteristics of Airborne Human Coronavirus 229e Journal of General Virology 1985 66 p 2743 2748 Lowen A C et al High temperature 30 degrees C blocks aerosol but not contact transmission of influenza virus J Virol 2008 82 11 p 5650 5652 Larry S and C Wendy Molecular genetics of bacteria Third edition ASM press ed2007 Washington 735 Ko G and C M Walker Effect of ultraviolet germicidal irradiation on viral aerosols Environmental Science amp Technology 2007 41 15 p 5460 5465 Ko G M W First and H A Burge Influence of relative humidity on particle size and UV sensitivity of Serratia marcescens and Mycobacterium bovis BCG aerosols Tubercle and Lung Disease 2000 80 4 5 p 217 228 79 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 80 Riley R L and J E Kaufman Effect of relative humidity on the inactivation of airborne Serratia marcescens by ultraviolet radiation Appl Microbiol 1972 23 6 p 1113 20 McDevitt J J et al Characterization of UVC light sensitivity of vaccinia vi
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89. n fonction de l augmentation de la dose d UV a t observ e En ordre d croissant de r sistance aux UV on retrouve MS2 gt PR772 gt phi6 gt phiX174 MS2 a d j prouv sa plus grande r sistance aux UV entre autres dans des tudes sur le traitement des eaux us es o il s est montr de loin plus r sistant que phiX174 130 131 MS2 s est aussi montr plus r sistant que phix174 lorsqu expos d autres types de rayonnement comme aux rayons gamma 132 Une tr s grande sensibilit de phix174 aux UV a aussi t observ e par d autres chercheurs 133 Il existe peu d tude sur le phage PR772 et encore moins sur l effet des UV sur son infectivit mais le phage PRD1 qui a 97 2 de son g nome identique PR772 89 s est r v l deux fois moins r sistant aux UV que MS2 sur une tude du traitement de l eau aux UV 134 Plusieurs facteurs peuvent influencer l effet des UV sur un virus le type de virus sa taille ainsi que le type d acide nucl ique La tr s grande r sistance de MS2 aux UV peut s expliquer par la tr s petite taille de son g nome soit seulement 3 57 kb En effet ce petit ARN est tres compact a cause de la 71 pr sence d un tr s grand nombre de liens hydrog ne 100 et de beaucoup de structures secondaires 100 ceci pouvant prot ger les acides nucl iques des UV L ADN serait possiblement plus sensible aux UV que l ARN 135 Ceci est peut tre d au fait que les thymines
90. n phage a ADN double brin lin aire d environ 14 500 paires de base de la famille des Tectiviridae Il est de forme icosa dre avec un diam tre de 53 nm Il est compos d une paisse membrane interne et ne poss de pas de queue PR772 a pour h te Escherichia coli mais peut aussi se d velopper sur Salmonella typhimurium et Proteus morganii 88 PR772 a t utilis comme mod le pour l valuation de l efficacit de filtres 89 90 91 31 1 3 4 Phi6 Phi6 est un phage a ARN double brin lin aire et segment d environ 13 400 paires de base de la famille des Cystoviridae Il s agit d un phage envelopp d une couche lipidique laquelle est probablement essentielle pour infecter son h te et ne poss de pas de queue Il est de forme icosa dre et poss de un diam tre de 60 nm excluant la couche lipidique 92 Phi6 a pour h te Pseudomonas syringae Phi 6 a d j t utilis comme mod le entre autres pour valuer l efficacit de capture d chantillonneurs comme le Biosampler 93 ou des filtres 94 comme analogue du virus de l enc phalite equine 95 pour tudier l inactivation des a rosols viraux par les UV 96 ou par l ozone 97 1 3 5 PhiX174 Phi X174 est un phage a ADN simple brin circulaire d environ 5400 nucl otides de la famille de Microviridae Il est de forme icosa dre non caud et d un diam tre d environ 25 nm Il a pour souche h te E coli tant un coliphage Phi X174 peut
91. nas syringae cells J Virol 2005 79 8 p 5017 5026 Caldentey J and D H Bamford The Lytic Enzyme of the Pseudomonas Phage Phi 6 Purification and Biochemical Characterization Biochimica Et Biophysica Acta 1992 1159 1 p 44 50 Coetzee J N et al Properties of R plasmid R772 and the corresponding pilus specific phage PR772 J Gen Microbiol 1979 110 2 p 263 73 Wigginton K R et al Virus Inactivation Mechanisms Impact of Disinfectants on Virus Function and Structural Integrity Environmental Science amp Technology 2012 46 21 p 12069 12078 Seo K et al Effect of Temperature pH and NaCl on the Inactivation Kinetics of Murine Norovirus Journal of Food Protection 2012 75 3 p 533 540 Bertrand l et al The impact of temperature on the inactivation of enteric viruses in food and water a review J Appl Microbiol 2012 112 6 p 1059 1074 Battigelli D A M D Sobsey and D C Lobe The Inactivation of Hepatitis a Virus and Other Model Viruses by Uv Irradiation Water Science and Technology 1993 27 3 4 p 339 342 Timchak E and V Gitis A combined degradation of dyes and inactivation of viruses by UV and UV H202 Chemical Engineering Journal 2012 192 p 164 170 Chen Z B H Y Huang and C W Zhang Comparative study of the resistance of bacteriophageT4 PhiX174D MS2 and f2 to gamma radiation Zhonghua yi xue za zhi 2008 88 3 p 198 201 Furuse K and Watanabe Effects of ultrav
92. nfectivit de l nfluenza Les tests d infectivit de l nfluenza ont t faits sur ufs embryonn s de poule Bri vement les ufs sont re us et incub s 10 jours pr c dant l exp rimentation 37 C Pendant ces 10 jours les ufs sont r guli rement examin s pour d celer des d fauts dans la coquille v rifier la bonne croissance des embryons et rep rer les early death Pour ce faire on d pose une lampe sur 49 les ufs qui nous permet de voir s il y a du mouvement l int rieur embryon vivant et la grosseur de celui ci croissance normale La journ e de l exp rimentation plusieurs dilutions de l chantillon du Biosampler sont faites et 5 ufs sont utilis s par dilution Au moment de l infection un minuscule trou est fait dans la coquille juste au dessus de la poche d air et 200 ul de la bonne dilution sont inject s dans l uf l aide d une seringue Covidien monoject 1 mL insulin seringue 1188100777 Finalement le trou est recouvert de colle et les ufs sont incub s a 33 C pour permettre la croissance de l embryon mais aussi celle du virus de I Influenza modifi qui ne cro t qu cette temp rature Les ufs sont incub s 2 jours en pr sence de virus et mis a 4 C pour la nuit Le lendemain le liquide allantoique est r colt et gard a 4 C Afin de v rifier la pr sence de virus dans le liquide allantoique un test d h emagglutinine est fait voir figure 15 Bri vem
93. nnementale de 30 C et 80 d humidit relative un humidificateur tait connect a la CER en m me temps que le Collison pour atteindre l humidit voulue 40 Deux fours Pelletier ont t utilis s pour augmenter ou diminuer la temp rature de la CER a 18 et 30 C L volution de Il humidit et la temp rature taient suivies l aide d une sonde Omega directement ins r e dans un port de la CER et avec son logiciel TRH Central 2 5 Exposition aux stress environnementaux Apr s les dix minutes de n bulisation la CER tait scell e et les a rosols produits taient maintenus en suspension pour 0 6 ou 14 heures Un chantillon du contenu de la chambre tait pris au d but et a la fin de la p riode d exposition avec un Aerodynamic Particles Sizer APS model 3321 TSI Inc Cette mesure permettait de v rifier si le nombre et la taille des a rosols taient semblables d une exp rience l autre LAPS fonctionnait a une vitesse de 5 litres min pendant 20 secondes 2 6 Echantillonnage des particules virales Un SKC Biosampler contenant 20 ml de tampon de phage a t utilis pour l chantillonnage des particules virales La vitesse d aspiration tait de 12 5 L min Cet appareil a t choisi car c est celui qui endommage le moins les virus selon les r sultats des exp rimentations de Nathalie Turgeon non publi s Le projet consistant v rifier l effet des conditions environnementale
94. p rimentations et r sultats d crits plus hauts ne viennent que confirmer le bon fonctionnement de notre syst me 4 2 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes humidit s relatives Afin de v rifier l effet de l humidit relative sur nos quatre phages mod les ils ont t n bulis s dans la CER des humidit s de 20 50 et 80 L effet du temps a aussi pu tre tudi par des temps d exposition de 0 6 et 14 heures l int rieur de la chambre Les phages phiX174 et PR772 sont significativement plus stables hautes humidit s p lt 0 05 le phage phi6 est plus stable a basses humidit s p lt 0 05 et finalement MS2 est stable toutes les humidit s Phi6 a t particuli rement plus difficile a travailler que les autres et les carts types plus lev s en sont la preuve L enveloppe lipidique de celui ci pourrait faire qu il a tendance a s agglom rer nature hydrophobe et former des amas Cette caract ristique engendrerait plus 67 de variabilit dans le compte des plages de lyse tout d pendant si une plage correspond a un amas de phages ou a un seul phage Le temps peut avoir un effet sur l ensemble des phages mais est particuli rement plus n faste pour le phage PR772 De ce r sultat on peut conclure que c est probablement un phage qui aurait de la difficult faire de la transmission sur de longues distances en raison du long temps de suspension n
95. pe UV est a l int rieur on conseille de faire passer un tuyau d un diam tre assez grand pour que la lampe UV puisse tre gliss e l int rieur par l un des ports du c t oppo la lampe ss CET Tf SE O a Cela vitera que la lampe bouge trop lors de l ouverture car possibilit d tre pas mal brass e Lampe UV 91 Contr le de la temp rature Le contr le de la temp rature se fait grace a l interface situ e sous les dess chants et reli e des fours Pelletier situ s derri re la chambre Le bouton Power est situ l arri re du bo tier On peut autant r chauffer que refroidir Lorsque les fours sont en mode refroidissement l inscription OP2 doit tre allum e et lors du chauffage c est l inscription OP1 qui doit tre allum e Lorsqu on change la temp rature il est important de v rifier que le nouveau chiffre a clignot d montrant qu il a bel et bien enregistr cette nouvelle donn e Le bo tier d origine a t remplac pour celui pr sent en ce moment lors de la certification de la chambre Le nouveau est conforme et certifi CSA Une sonde de temp rature situ e dans la bo te de plastique est reli e au contr leur de temp rature afin de donner la temp rature en temps r el et la moduler si elle n est pas correcte Si cette sonde n est pas connect e au contr leur de temp rature il ne fonctionnera pas et affichera le message d erreur suivant 5 br Vue
96. provenait du vaccin saisonnier Flumist Le m lange des quatre phages avec I nfluenza a t expos a 20 et 80 HR a une temp rature constante de 18 C pour une p riode d exposition de 0 6 et 14 heures Les r sultats pr sent s la figure 23 illustrent l volution de l infectivit de Influenza dans le temps 20 et 80 HR Les r sultats sont rapport s au ratio d infectivit de d part expliquant un pourcentage de 100 au temps 0 Donc pour une humidit relative de 20 on observe une baisse de 90 de l infectivit entre 0 et 6 heures et une stabilit de l infectivit par la suite Pour une humidit relative de 80 on observe une baisse de 99 6 de l infectivit entre 0 et 6 heures et une diminution beaucoup moins abrupte entre 6 et 14 heures Ces exp riences ont t faites en un r plicat expliquant l absence d analyses statistiques et les r sultats sont donc tr s pr liminaires Lors de ces exp riences les phages ont r pondu de la m me mani re que lors des exp riences pour valuation la r sistance de ceux ci diff rentes humidit s relatives voir r sultats figure 19 d montrant la validit de l exp rimentation r sultats non montr s ll a aussi t observ que le processus de n bulisation ne semble pas endommager le virus de nfluenza de m me que le passage dans le syst me de la chambre environnementale L tape critique de la manipulation semble tre l chantillonnage q
97. qui relie le panneau de contr le la chambre Lors de la n bulisation l aiguille va vers les positifs droite et lors de l chantillonnage elle va vers les n gatifs gauche Il est important de v rifier ce cadran lors des exp rimentations des pressions trop lev es vont mener des fuites un bris du filtre HEPA ou l expulsion des bouchons de silicone Ce cadran indique la pression de l air m dicale Lorsqu aucun port n est ouvert elle indique environ 52 PSI Si des ports sont en fonction elle indiquera 52 la pression d air utilis e par le n buliseur Ces 4 cadrans indiquent la pression de l air m dicale dans chacun des ports Avec ces valves on peut ajuster la pression voulue dans chacun des ports Ce sont des valves on off pour faire entrer l air m dical dans les ports Cette valve permet de changer le mode de fonctionnement du port 3 En effet il peut soit fonctionner avec la pression de l air ou avec le d bit de l air Lorsque la fl che pointe vers le haut il fonctionne par pression et lorsqu elle pointe vers le bas il fonctionne par d bit d air 87 H J Il s agit d une needle valve pour l ajustement de d bit de l air du port 3 Lorsqu en fonction on peut lire le d bit sur le d bitm tre situ juste au dessus Le port 4 ne fonctionne que par d bit d air La needle valve H est plus sensible que la Le d bitm tre situ au dessus indique la somme des deux valves Needle valve D b
98. r leur r colte Cependant pour r ellement caract riser l effet de diff rents facteurs sur les a rosols ils doivent avoir t en contact avec cette condition pendant un certain laps de temps Figure 5 Diff rents types de chambres dynamiques A tunnel de vent B premi re chambre rotative figure modifi e de 2 C chambre rotative moderne D chambre dynamique Genamini faite sur mesure pour l valuation des performances de diff rents chantillonneurs Lorsque la rotation est ajout e il se produit une comp tition entre les forces gravitationnelle et centrifuge 13 Cependant la vitesse de rotation ne doit pas tre trop lev e autrement les particules en suspension se d poseront sur les parois de la chambre par inertie 14 Les vitesses de rotation sugg r es se trouvent entre O et 10 rpm La trajectoire des particules l int rieur d une chambre rotative suit une spirale qui d rive lentement vers l ext rieur en fonction du temps Figure 6 Particle Path Exaggerated Denotes Particle a Suspension Volume m R ro L Figure 6 Trajectoire des particules l int rieur d une chambre rotative Lorsque la rotation est ajout e les particules sont soumises aux forces centrifuge et gravitationnelle leur donnant une trajectoire en spirale d rivant lentement vers la p riph rie 13 Figure tir e de 13 Selon les travaux d Asgharian et al avec une faible vitesse de rotation il s
99. re Collection ATCC Pour la culture des phages MS2 PR772 et phi X174 3 ml d une culture de la bact rie h te incub e toute la nuit ON ont t ajout s 30 ml de milieu Tryptic Soy Broth TSB jusqu l obtention d une densit optique 600nm de 0 1 Ensuite 300 ul de lysat de phages sont ajout s a la culture bact rienne correspondante et mis sous agitation 37 C Les cultures sont surveill es jusqu la lyse compl te ou partiellement compl te des bact ries Les d bris cellulaires sont limin s par centrifugation 3500 rotations par minute rpm pendant 10 minutes et filtration sur 0 45 um du lysat La solution de phages finale est entrepos e a 4 C jusqu a utilisation Pour le phage phi6 100 ul de plusieurs dilutions du phage sont m lang s a 100 ul de culture ON de Pseudomonas syringae dans 3 ml de TSB 0 75 agar Le tout est coul sur bo tes de P tri de TSB 1 5 agar et incub 25 C pour la nuit Le lendemain la couche d agar du dessus contenant les phages est racl e et mise dans un tube avec 5 ml de tampon de phage Tris HCL 10 mM pH 7 4 NaCl 100 mM MgSO 10 mM Le tout est mis a agitation lente pour 6 heures et les d bris cellulaires sont limin s par centrifugation et filtration Le titre des phages a t d termin par culture de dilutions s ri es et compte de plages de lyse 116 39 2 2 N bulisat Avant chaque n bulisation un m lange des quatre bact riophages tait
100. rus Appl Environ Microbiol 2007 73 18 p 5760 6 de Jong J C M Harmsen and T Trouwborst Factors in the inactivation of Encephalomyocarditis virus in aerosols Infection and Immunity 1975 12 1 p 29 35 Elazhary M and J B Derbyshire Effect of temperature relative humidity and medium on the aerosol stability of infectious bovine rhinotracheitis Canadian Journal of Comparative Medicine Revue Canadienne De Medecine Comparee 1979 43 2 p 158 167 Ijaz M K Studies on the airborne survival of rotavirus and human coronavirus 1985 University of Ottawa Ottawa Canada Willeke K X J Lin and S A Grinshpun Improved aerosol collection by combined impaction and centrifugal motion Aerosol Science and Technology 1998 28 5 p 439 456 Duchaine C et al Comparison of Polycarbonate and Polytetrafluoroethylene Filters for Sampling of Airborne Bacteriophages Aerosol Science and Technology 2010 44 3 p 197 201 Yao M S Y Wu and F X Shen Use of gelatin filter and BioSampler in detecting airborne H5N1 nucleotides bacteria and allergens Journal of Aerosol Science 2010 41 9 p 869 879 Clark Burton N S A Grinshpun and T Reponen Physical collection efficiency of filter materials for bacteria and viruses Annals of Occupational Hygiene 2007 51 2 p 143 151 Blachere F M et al Bioaerosol sampling for the detection of aerosolized influenza virus Influenza and Other Respiratory Viruses 2007 1 3 p
101. s s dans la CER des humidit s de 20 50 ou 80 Dans toutes les conditions la temp rature tait maintenue 18 C Bri vement le m lange de phages tait n bulis une premi re fois 10 minutes 12 L minute correspondant une pression de 20 psig Ensuite un chantillon des a rosols pr sents tait pris avec IAPS afin de v rifier la concentration et le diam tre des particules pr sentes Finalement le SKC Biosampler tait activ pendant 20 minutes pour r colter le contenu de la chambre environ 98 du contenu L ensemble de lair de la chambre tait r colt afin de s assurer de d tecter les phages par culture Cette manipulation consistait en notre temps 0 heure La chambre tait ensuite purg e pendant environ 30 minutes avec de Pair m dical La m me manipulation tait refaite une deuxi me fois mais avec 6 heures d attente entre la fin de la n bulisation et l chantillonnage avec le SKC 47 Biosampler Finalement on r p ta une troisieme fois mais avec un temps de suspension de 14 heures Chaque condition 20 50 et 80 HR a 18 C a t faite en triplicata ou plus 2 15 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes temp ratures Pour tester la r sistance des quatre phages diff rentes temp ratures ceux ci ont t a rosolis s 18 C et 30 C Dans toutes les conditions une humidit relative de 80 a t maintenue L humidit relative de 80 a
102. s particules est un avantage majeur du Collison car cela emp che qu il y ait trop de variabilit dans les r sultats En effet si dans une exp rience les particules sont beaucoup plus grosses que dans une autre les conditions environnementales peuvent avoir moins d impact sur les virus Un type de n buliseur qui offre une distribution tr s variable de particules est le bubbling aerosol disperser 3 Il cr e des a rosols par clatement de bulles la surface du liquide et donc la grosseur et la quantit de bulles form es sont tr s variables 14 dN dlogDp cm e3 gt lt 523 5 ate 1 5 i 10 20 Aerodyn mic Diam ter um Figure 8 Distribution des particules produites par le Collison selon leur diam tre a rodynamique um Le diam tre moyen des particules tait d environ 0 8 um et la chambre contenait environ 10 particules cm apr s 10 minutes de n bulisation L appareil n est pas en mesure de mesurer les particules de moins de 0 5um de diam tre a rodynamique 1 2 La transmission virale 1 2 1 Evolution des croyances Il est mentionn plus haut que la transmission des maladies via les a rosols est un ph nom ne encore mal compris mais comparativement aux croyances d antan nous avons fait des avanc es consid rables Bien avant J sus Christ il tait connu que la maladie pouvait se rependre a grande vitesse au sein d une population Les causes de ces pid mies taient inconnues mais
103. s produites selon diff rents m canismes En B les diff rents facteurs qui peuvent avoir un impact sur la grosseur d une particule ainsi que sur l int grit des virus qui la compose sont pr sent s Finalement en C on voit l endroit de d position des particules dans le poumon selon leur diam tre 8 Figure tir e de 8 1 2 3 2 Cas possibles de transmission par l air Malgr la difficult de prouver la transmission via les a rosols plusieurs cas de transmission de maladies nous laissent croire que ce mode est bel et bien pr sent et qu il devrait tre pris en consid ration dans les mesures de protection On peut entre autres citer la pand mie de SARS CV qui a s v rement touch Hong Kong en 2003 Il s agit d un v nement o l on soup onne fortement les bioa rosols comme v hicule de transmission En effet le cas num ro un aurait vacu des feces et de l urine contamin es par ce coronavirus puis les conduits de drainage tant mal scell s des bioa rosols ont pu s en chapper et se retrouver dans les conduits de ventilation L air contamin est sorti sur le toit de l difice logement et grace aux vents dominants a contamin des difices plus de 60 m tres de distance 26 Ce patient num ro un s est rendu l urgence d un h pital et 41 des patients qui ont attendu dans la m me salle ont t contamin s 22 au SARS Il a aussi t d montr que la distance entre le lit de ce pati
104. s sur la persistance des virus nous devions ajouter le moins de stress possible par les techniques d chantillonnage pour d montrer les risques potentiels du transport des a rosols L chantillonneur tait connect a une pompe GILAIR 5 Sensidyne Inc Clearwater FL calibr e avec un Dry cal DC 1 Bios International Corporation Butler NJ L chantillonnage durait 20 minutes pour collecter environ 98 du contenu de la chambre voir figure 12 Le liquide de collection tait gard a 4 C jusqu aux tests d infectivit par compte de plages de lyse Les tests taient faits dans les 3 heures suivant l chantillonnage 41 150 100 50 Pourcentage de la chambre r colt 0 10 20 30 40 Temps minutes Figure 12 Graphique du pourcentage du contenu de la chambre r colt par le SKC Biosampler selon le temps d chantillonnage 2 7 Essais de plaques Pour calculer la proportion de phages toujours infectieux apr s exposition aux stress 100 ul du liquide de collection du Biosampler taient m lang s a 100 ul de culture ON de la souche h te dans 3 ml de TSB 0 75 agar Le tout est coul sur boite de P tri de TSB additionn de 1 5 agar et incub a 37 C ou 25 C selon la souche pour la nuit La manipulation tait refaite avec plusieurs dilutions du liquide de collection et chacune des souches bact riennes 2 8 Extraction de PARN L extraction de l ARN pour les phages MS2 et phi 6 a t faite l
105. t une modulation de l humidit E Binding Fc Eee E Replication clo Heat ee o 0 20 40 60 80 100 Figure 24 Contribution relative de l attachement l injection et la r plication dans la perte d infectivit selon le mode de d sinfection choisi Lors de la d sinfection par la chaleur 100 de la perte d infectivit est due une alt ration au niveau de l attachement la cellule h te On remarque aussi que les UV ont influenc les tapes d injection et de r plication de MS2 Dans cette tude MS2 a t expos 72 C 127 Figure tir e de 126 70 PhiX174 semble tre un phage qui dans l eau est particuli rement r sistant la temp rature Il est m me utilis en cas de extr me dans les tudes de traitement des eaux us es 129 notre connaissance aucune tude sur l effet de la temp rature sur les a rosols de phiX174 n a t faite Il se pourrait que la modulation de la temp rature ait plus d impact sur ce virus lorsqu il est l tat d a rosols 4 4 Evaluation de la r sistance de quatre bact riophages mod les aux UV Afin de v rifier l effet des UV sur la stabilit des phages mod les ceux ci ont t expos s diff rentes doses allant de 0 6000 uJ cm La temp rature et l humidit sont rest es constantes soit 18 C et 20 d humidit relative Une diminution de l infectivit de l ensemble des phages e
106. t ristique Dans le pr sent projet quatre phages non caud s ont t choisis Ils sont tous diff rents au niveau g n tique et l un d eux est aussi envelopp Il tait important de s lectionner des phages tr s diff rents pour pouvoir les associ s au plus grand nombre de virus eucaryotes possible tant 30 donn que la structure et le g nome des virus peuvent fortement influencer leur persistance dans l environnement n utiliser qu un seul type de virus comme mod le viral serait bien loin de repr senter la r alit 1 3 2 Leur utilisation en tant que mod les Les phages sont d j utilis s comme mod les dans plusieurs domaines Dans l industrie pharmaceutique et alimentaire la Food and Drug Administration FDA recommande leur utilisation utilise pour tester l efficacit de capture des filtres Ils sont aussi utilis s comme mod les de virus ent riques pour le traitement des eaux us es 85 On les tudie aussi pour mieux comprendre comment fonctionnent les virus eucaryotes Par exemple l ARN polym rase ARN d pendante de phi 6 est particuli rement tudi e pour mieux comprendre les R ovirus 86 Leur potentiel en a rovirologie reste peu exploit et beaucoup d tudes ont utilis des phages caud s 87 Les prochaines sections ainsi que le tableau 1 pr sentent les quatre phages qui ont t choisis en tant que mod les pour notre tude du comportement des virus dans l air 1 3 3 PR772 PR772 est u
107. ter d autres phages pour chacune des cat gories test es type de g nome envelopp ou non De plus il pourrait tre int ressant de v rifier si ce ne serait pas l humidit absolue qui aurait un plus grand impact sur la persistance des virus dans l air Ayant d montr leur potentiel en tant que mod le de virus eucaryote en laboratoire la prochaine tape du projet sera de transf rer nos exp riences dans un milieu r el telles qu une salle de classe ou une chambre d h pital Cela nous permettra de voir comment se d placer et se comportent les virus lorsque soumis d autres facteurs tels que la ventilation et la pr sence d humain 75 Une autre suite du projet sera de tester l effet de la pr sence de poussi re sur le comportement des phages mod les autant au niveau de leur d placement ex s dimentation plus rapide qu au niveau de leur infectivit En somme les r sultats de ce projet ouvrent une multitude de portes de nouvelles exp riences En se retrouvant avec quatre mod les qui r pondent de mani res diff rentes aux stress auxquels ils ont t soumis on obtient un tableau tr s int ressant des comportements possibles des virus eucaryotes On r pond donc l objectif principal que nous nous tions donn offrir a la communaut scientifique de meilleurs outils pour approfondir nos connaissances du comportement des virus dans l air Ces mod les tant non pathog ne pour l homme peu co
108. tions des sondes et d amorces pour les r actions des quatre phages ainsi que le volume d chantillon ajout au m lange sont d crits dans le tableau 3 Le volume final de chaque r action tait de 25 ul Une courbe standard tait faite a chaque gPCR en utilisant des dilutions de 10 a 10 copies de plasmides contenant un g ne de r f rence de chaque phage Les protocoles qPCR taient tel 43 que suit 94 C pour 3 min hot start suivie de 40 cycles de 95 C pour 15 sec et 60 C pour 60 sec phiX174 PR772 et MS2 Pour phi6 la d naturation dure 20 secondes Les essais qPCR ont t faits en duplicata Tableau 3 Les concentrations des sondes et amorces pour les r actions des quatre phages et volumes d chantillon ajout s au m lange r actionnel Phages Sonde Amorces F R chantillon ul Phi6 300150 nm MS2 150300 nm 1 uM 2 PhiX174 200 uM 1 uM 5 PR772 200 uM 5 Tableau 4 Amorces et sondes utilis es pour les r actions PCR Phage Nom de S quences Position sur R f rences l amorce le g nom phi6 phi6T For For 5 TGGCGGCGGTCAAGAGC 3 430 446 94 phi6T Rev Rev 5 530 506 94 GGATGATTCTCCAGAAGCTGCTG 3 Probe 5 450 475 94 HEX CGGTCGTCGCAGGTCTGACACTC GC 3BH 3 MS2 1 For For 5 GTCCATACCTTAGATGCGTTAGC 1261 1284 94 3 MS2 1 Rev Rev 5 CCGTTAGCGAAGTTGCTT GG 3 1420 1401 94 Probe 5 1391 1367 94 FAM ACGTCGCCAGTTCCGCCATTGTC G 3BHQ_1 3 Prim phiX174 For 5 508
109. tr s important de souvent jeter un coup d il au shaft qui relie le moteur a la chambre environnementale S il devait se bloquer cela pourrait faire norm ment de d g ts Donc v rifier qu il tourne bien que engrenage de plastique voir photo reste bien en place lorsqu on le bouge l g rement de gauche droite que les dents de l engrenage sont bien emboit es dans la cha ne par exemple Engrenage Cha ne Pour sortir le drum de sa bo te il faut d faire la cha ne qui le relie l engrenage Il suffit de faire tourner le drum jusqu ce qu on aper oive une goupille telle que sur la photo Il s agit de l endroit o la cha ne est coup e en deux Il ne reste qu enlever la goupille avec des pinces pour pouvoir enlever la chaine 89 Lampe UV Le contr le des U est tr s simple Il suffit de mettre le bouton ON ou OFF Avant d allumer les UV il est pr f rable d attendre que les a rosols ce soient stabilis s La lampe UV se situe l int rieur de la chambre du c t gauche Il est possible de la retirer tr s facilement simplement en tirant doucement dessus Lorsqu elle n est pas en position il faut mettre quelque chose par exemple un carr de ruban lectrique pour prot ger la prise lectrique des a rosols Pour installer la lampe UV dans le drum il suffit simplement de la brancher la prise pr vue cet effet l int rieur 4 trous pour les 4 dents de la lampe et de ne pas oublier
110. tres de g latine sont souvent efficaces pour r colter des particules virales 79 mais leur composition pose souvent probl me En effet ils ne r sistent pas bien aux chantillonnages prolong s car ils se dess chent et se brisent affectant l efficacit de r colte des virus Ces filtres peuvent aussi se liqu fier lorsque l humidit est trop lev e 80 Ils peuvent aussi interf rer avec la r action de PCR 81 28 Le NIOSH 2 stage cyclone aerosol sampler est un chantillonneur qui semble plus appropri pour l chantillonnage de virus Le premier tage collecte les particules de taille sup rieure a 1 8 um le deuxi me tage entre 1 1 8 um et le filtre r colte les particules submicroniques La plupart des particules virales se retrouvent dans le tube 2 et sur le filtre mais cela d pend de l environnement chantillonn La quantit de particules r colt es augmente avec le temps d chantillonnage 81 Le NIOSH 2 stage cyclone aerosol sampler est un chantillonneur tr s int ressant pour la d tection de virus par biologie mol culaire qPCR En effet il a t possible de d tecter de l nfluenza dans les urgences d h pital l aide de cet chantillonneur 43 Cependant pour l tude de l infectivit des virus c est un appareil plus stressant qu un impacteur liquide Nathalie Turgeon r sultats non publi s Les impacteurs liquides du genre AGI Al Glass impinger sont souvent utilis s dans l tude
111. ue de basses temp ratures 7 8 C taient optimales pour la persistance du virus de l Influenza 64 Ehrlich et Miller ont aussi obtenu les m mes r sultats pour le virus Venezuela Equine Encephalitis 65 ainsi que Zimmerman et al pour le PRRSV 66 et ljaz pour le coronavirus 67 ljaz sugg re que de basses temp ratures diminuent la fluidit de la membrane lipidique du coronavirus ce qui r duirait l acces aux facteurs d inactivation 67 Lowen et al ont fait des exp rimentations avec le virus de nfluenza et des cobayes et en sont arrives a la conclusion qu aucune transmission de la grippe par les a rosols n est possible a plus de 30 C 68 26 Effet des rayons ultraviolets UV Les UV sont aussi n fastes pour les virus tout comme pour les bact ries Sous l effet de radiations non ionisantes UV solaires la thymine et la cytosine peuvent former des dim res covalents Un dim re consiste en deux bases adjacentes qui sur le m me brin d ADN forment une double liaison Une double liaison covalente emp che l ADN polym rase d effectuer la r plication de l ADN 69 Walker et Ko ont d montr que les Adenovirus sont tr s r sistants aux UVC 254 nm tout comme le phage MS2 mais que les Coronavirus sont beaucoup moins r sistants 70 71 Des tudes faites avec Serratia marcescens ont d montr qu un haut niveau d humidit diminuait les effets des UV Il est sugg r que dans ces conditions l vaporat
112. ugmentation de la survie en fonction de l humidit Phi 6 r agit de mani re tout a fait diff rente que les trois premiers phages tant plus r sistant a de faibles taux d humidit Cette pr f rence est significative pour le temps de suspension de 6 p lt 0 001 et 14 heures p lt 0 01 20 et 50 d humidit il n y a aucun effet du temps mais a 80 il y a un effet significatif 3 3 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes temp ratures L effet de la temp rature sur la r sistance des bact riophages a t valu en exposant ceux ci 18 C et 30 C une humidit relative constante de 80 Les a rosols sont rest s en suspension pour des p riodes de 0 6 et 14 heures Les r sultats sont pr sent s la figure 20 Les lettres et les symboles ont la m me signification que sur la figure 19 Il y a un effet significatif de la temp rature sur la survie du phage phiX174 avec une meilleure r sistance basse temp rature Il n y a aucun effet du temps 30 C et 80 HR tel qu observ 18 C et 80 Il y a aussi un effet n gatif lors d une hausse de la temp rature pour le phage MS2 On observe aussi le m me effet du temps pour les deux temp ratures 80 HR PR772 n est pas affect par des hausses de temp ratures de 18 30 C Finalement pour le phage phi 6 aucun phage infectieux n a t d tect 30 C 57 98 PhiX174 1000 100 10
113. ui a t fait avec un SKC Biosampler Ce r sultat a pu tre obtenu par une exp rience de Marie Jos e Toulouse r sultats non publi s Elle a inocul le liquide de collection d un SKC Biosampler avec de l Influenza et observ la m me baisse d infectivit que jai pu observer en faisant subir la n bulisation l exposition 0 heure et l chantillonnage I nfluenza 62 100 z z 10 a 20 HR 80 HR o D lao os lt b 2 5 1 ou 0 1 0 5 10 15 Temps heures Figure 23 Pourcentage d infectivit du virus de I Influenza Flumist en fonction du temps deux humidit s relatives 20 et 80 63 Chapitre 4 Discussion 4 1 Evaluation de la performance de la CER Depuis que Goldberg en 1958 a proposer le premier mod le de chambre rotative 11 l tude des stress environnementaux sur la survie des a rosols a pris son envol En effet avant cette avanc e technologique les temps d exposition devaient tre de tr s courtes dur es pour emp cher la s dimentation des particules et par le fait m me leur perte sur les parois d une quelconque chambre Ces courts temps d exposition ne pouvaient fournir que tr s peu d informations sur l effet que pouvaient avoir l humidit la temp rature ou la pr sence de rayons ultraviolets par exemple Afin d tudier les effets long terme de diff rentes conditions environnementales le laboratoire de Caroline Duchaine a travaill
114. ure en pr sence d UV tanch it maintien des particules en suspension et modulation de la vitesse Il a t d montr que la chambre pouvait atteindre des temp ratures allant de 10 C 45 C Au del de 45 C les risques de faire fondre les scellants servant l tanch it sont trop lev s Il a t impossible de descendre en de de 10 C mais des modifications la chambre pourraient tre apport es telles qu une meilleure isolation de la bo te de polycarbonate l ajout de plus de climatiseurs et dans le cas d une exp rience de courte dur e l ajout d un banc de glace Il a t possible de maintenir des temp ratures de 18 C et 30 C pour des p riodes de 24 heures avec des variations de moins de 0 5 C Il a aussi t d montr que la mise en marche de la lampe UV pour une courte p riode de temps soit de moins de 5 minutes n avait pas d effet sur le maintien de la temp rature L tanch it de la chambre a t obtenue par l ajout de scellant the Right Stuff entre les pi ces d tachables particuli rement entre le cylindre central et les extr mit s maintenues par des loquets La pr sence de fuites a d abord t v rifi e de fa on manuelle sensation de vent sur les mains et ensuite par la capacit de la chambre maintenir une pression positive suite la fermeture de tous les ports Finalement l tanch it tait valid e par la capacit maintenir une humidit relati
115. us faible stabilit 61 25 Dans une r cente revue de la litt rature sur l effet de l humidit sur les a rosols viraux il est propos que ce serait davantage le pH qui jouerait un r le dans l inactivation des virus 62 En effet lors de l vaporation des liquides d un a rosol la concentration des ions H augmente abaissant ainsi le pH Cette baisse engendrerait des changements de conformation des glycoprot ines de la capside de certain virus essentielles au processus d infection Si un virus passe par une tape d acidification dans l endosome par exemple pour infecter une cellule de basses humidit s vont induire un changement de conformation irr versible et emp cher l infection Les virus qui ne requi rent pas de changement de pH pour l infection seraient moins affect s par l humidit En r sum des virus affect s par de bas pH ex Influenza A SARS et virus de l enc phalite Equine du Venezuela par exemple sont affect s par des humidit s de 50 90 Les virus qui fusionnent pH neutre ex VRS seront plus stables des humidit s comprises en 50 et 90 tandis que les virus pouvant entrer dans la cellule par plus d un m canisme ont tendance tre r sistants toutes humidit s Effet de la temp rature La temp rature joue un r le particuli rement important Elle peut affecter les prot ines virales par exemple les enzymes et le g nome ADN ARN 63 Harper et al ont d montr q
116. ve constante apr s fermeture de tous les ports 18 C l humidit relative diminue de 2 2 0 2 3 6 0 4 et 3 3 0 6 sur une p riode de 14 heures pour des humidit s relatives initiales de 20 50 et 80 respectivement ll a finalement t v rifi que la chambre tait en mesure d accomplir sa principale t che celle de maintenir des particules en suspension sous l effet de la 66 rotation La chambre a t remplie d a rosols les ports ont t ferm s et le nombre et la quantit de particules pr sentes ont t suivis sur une p riode de 5 heures avec un APS L exp rience a t faite en pr sence et absence de rotation Il a t d montr que la rotation tait en mesure de garder un plus grand pourcentage de particules en suspension 58 et 32 pour 1 rpm et O rpm respectivement La baisse du nombre de particule peut tre due a la s dimentation de celles ci sur les parois ou due l agglom ration de plus petites particules ensemble La capacit de la chambre maintenir les particules en suspension a aussi t prouv e par le maintien du MMAD 1 rpm O rpm une d croissance tait observ e 1 28 um 0 96 pm laissant croire une perte des plus grosses particules par s dimentation L efficacit des chambres rotatives a d j t prouv e 2 13 14 et leur utilisation pour tudier l effet des conditions environnementales sur les virus est bien document e 15 20 57 75 118 Les ex
117. vec les r sultats de l APS la quantit et la grosseur des particules dans le temps ont t valu es Figure 13 Chambre environnementale rotative Visualisation 3D des composantes Le syst me de rotation n est pas identique au produit final On peut voir la lampe UV l int rieur ainsi que les ports aux extr mit s Les cubes bleu royal repr sentent les fours pelletier servant chauffer ou climatiser l air de la bo te entourant la chambre Une partie du bo tier est non illustr e 46 Figure 14 Chambre environnementale rotative A vue de la largeur B vue de la longueur Un cylindre d aluminium de 55L C est plac l int rieur d une boite de polycarbonate D dont la temp rature est contr l e par des appareils thermo lectriques F Les extr mit s de la chambre G et H sont maintenues au cylindre par des loquets et gardent la chambre tanche La lampe UV est situ e l int rieur de la chambre L La rotation est assur e par un moteur vitesse contr l situ l ext rieur de la boite de polycarbonate Ce moteur est reli la chambre par une chaine qui elle est reli e une roue dentel e M L isolation est faite avec des feuilles de styromousse E 2 14 valuation de la r sistance de quatre bact riophages mod les diff rentes humidit s relatives Pour valuer la r sistance des quatre phages diff rentes humidit s relatives ces derniers ont t n buli
118. vement humain etc Le comportement des particules en suspension dans lair d pend fortement de leur diam tre a rodynamique et plusieurs param tres peuvent moduler la taille des a rosols Ces derniers sont compos s de sels de prot ines de mati re organique et inorganique en plus de mat riel biologique Dans le cas d un bioa rosol provenant d une personne infect e par un virus responsable du rhume ou de la grippe les particules produites lors de la toux par exemple contiendront des virus mais la taille du virion en tant que tel n influencera pas la grosseur de l a rosol 6 L intensit de l a rosolisation ex vitesse laquelle un liquide est projet sur la paroi d un n buliseur la concentration du milieu a rosolis 7 l humidit du milieu o se retrouve l a rosol sont tous des param tres affectant sa grosseur et ainsi son parcours Les particules peuvent tre influenc es par diverses forces tels que l inertie la s dimentation la diffusion l interception et l attraction lectrostatique 3 La figure 3 pr sente tous ces m canismes En A l impaction par inertie est illustr e Plus une particule a un gros diam tre plus il est difficile de la faire d vier de sa trajectoire initiale et donc d viter les obstacles Dans le cas de la s dimentation Figure 3B les particules sont tir es vers le bas par l attraction gravitationnelle et finissent par se d poser sur une surface Les particules d
119. yncytial VRS le coronavirus causant le syndrome respiratoire aigu s v re SARS causent des pid mies travers le monde elle seule la grippe nfluenza co te de 71 167 millions par ann e aux tats Unis et cause de 250 000 500 000 d c s par ann e travers le monde Toujours aux Etats Unis plus de 1 5 million 1 http www who int mediacentre factsheets 2003 fs21 1 en d enfants infect s par le VRS sont admis l h pital chaque ann e OMS Les a rosols pourraient largement contribuer la propagation de ces infections y e e ee sf 8 fee Noyaux de gouttelettes a rosols lt 10 microns e e 4 Pay a Gouttelettes lt 200 microns gt Gouttelettes gt 200 microns a o coe Figure 9 Transmission courte et longue distance Les gouttelettes produites lors de la toux par exemple sont responsables de la transmission courte distance jusqu a 5 m tres Les noyaux de gouttelettes par leur petit diam tre a rodynamique vont pouvoir rester en suspension plus longtemps et parcourir de longues distances On parle alors de transmission longue distance Figure tir e de 3 L incidence des infections nosocomiales est aussi a mentionner Dans les h pitaux canadiens un patient sur neuf contracte une infection associ e aux soins de sant Ces infections sont la quatri me cause de mortalit au pays 28 Il a t estim que 10 33 de ces in

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