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Mesure en continu des nutriments en Seine

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1. l suivre la concentration en nitrite au cours de temps de plusieurs chantillons dop s plusieurs concentrations de substrats Ainsi la repr sentation des courbes de Michaelis Menten vitesse en fonction de la concentration en substrat conduira obtenir ces deux r sultats importants Une vitesse maximale d oxydation in situ pour la nitrosation et nitratation Les constantes de Michaelis Menten Km in situ d crivant l affinit du milieu pour le substrat 2 suivre l influence de la temp rature sur la nitrosation et la nitratation Ainsi la repr sentation de la courbe vmax en fonction de la temp rature permettra de trouver une quation sous la forme pmax T umax 20 C 6 Cette quation r git ce ph nom ne pour des temp ratures inf rieures la temp rature optimum de r action Elle conduira d terminer la valeur de facteur de correction 14 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine III MATERIEL ET METHODE II 1 Sites de pr l vement Les pr l vements ont t effectu s sur la Seine Poissy et Asni res L eau de rejet de Seine Aval a aussi t pr lev e Trois milieux sont tudi s un en amont de Seine Aval Asni res avec une communaut bact rienne diff rente de celle des eaux de rejet de station d puration un au niveau de la station d puration avec une communaut bact rie
2. 10 20 Temp rature C Figure 3 Influence de la temp rature sur la nitrification Henze et al 1997 Dans la litt rature de nombreuses valeurs pour le facteur de correction de temp rature sont utilis es Elle vont de 1 02 Oleszkiewicz et Berquist 1988 1 103 Lessouef et al 1992 Queinnec et al 2006 11 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine 1 1 2 5 Evolution de la recherche scientifique sur les cin tiques de nitrification Plusieurs tudes ont d ja t faites sur la dynamique du nitrite dans les milieux aquatiques depuis le milieu du 20 si cle Des tudes ont d abord t r alis es pour d terminer les communaut s bact riennes mises en jeux lors de la nitrification dans la Seine Deux communaut s ont t identifi es et isol es en 1890 Winogradsky 1890 les Nitrobacter oxydateurs du nitrite et les Nitrospira oxydateurs d ammonium Ces bact ries sont aujourd hui tudi es par la m thode de R action en cha ne par polym rase PCR et tr s bien connues C bron et Garnier 2005 Ces Communaut s mises en jeux dans la nitrification tant fortement tudi es des inhibiteurs ont t d termin s pour la nitrosation et la nitratation permettant ainsi l tude s par e des deux r actions l allylthiour e pour la nitrosation et le chlorate de sodium pour la nitratation Brion et Billen 1998 Ces e
3. 288 uM a y 2 1735In x 8 0915 R 0 9315 y 0 7878In x 3 8161 R 0 2236 500 1000 1500 nitrosation Mnitratation Concentration initiale en nitrite nitrosation ou en ammonium nitratation uM Figure 25 Activit en fonction de la concentration SAV IV 3 2 R sultats Poissy Par le m me calcul qu SAV ona Activit uM h Km exp vmax 2 16 115 3 502 446 uM Km exp vmax 2 1 9318 0 7438 164 uM Figure 26 y 3 502In x 16 115 R 0 9631 y 0 7438In x 1 9318 R 0 6341 1000 nitrosation Mnitratation Concentration initiale en nitrite nitrosation ou en ammonium nitratation uM Figure 26 Activit en fonction de la concentration 4 Poissy 29 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 3 3 R sultats Asni res Les courbes de Michaelis Menten permettent comme a Poissy et SAV de d terminer les Km Figure 27 avec les formules suivantes Km nitrosation exp vmax 2 0 3649 0 1447 158 uM Km nitratation exp vmax 2 6 7707 1 5162 391uM y 1 5162In x 6 7707 R 0 915 y 0 1447In x 0 3649 R 0 7454 Activit uM h 500 1000 1500 2000 2500 nitrosation Wnitratation Concentration initiale en nitrite nitrosation ou en ammonium nitratation uM Figure 27 Activit en fonction de la concentration Asni res IV 3 4 Bilan des diff
4. 30 C Poissy vmax 5 89 0 73 5 58 10 50 0 72 8 30 nitrosation vmax 15 19 0 14 1 62 3 72 0 48 5 17 nitratation temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C SAV vmax 14 83 22 14 8 77 2 17 18 26 6 53 nitrosation vmax 26 85 9 80 13 69 8 43 4 02 14 80 nitratation Les vitesse vmax varient de 0 73 22 06 uM h 1 Les vitesses pour le site d Asni res varient peu entre 0 73 et 4 13 uM h 1 Figure 30 Les valeurs de vmax pour la nitrosation sont globalement plus lev es par rapport la litt rture 0 72 22 14 pour 0 06 0 14 Raimonet et al 2014 5 15 asnieres E poissy Vitesse maximale de nitrosation uM h Temp rature C Figure 30 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitrosation pour les diff rents sites La vitesse vmax augmente de 0 14 4 92 uM h 1 avec la temp rature sur le site de Poissy de 10 20 C Ces valeurs sont tr s semblables aux valeurs trouv es par Raimonet et al 2014 1 4 7 5 uM h 1 Les valeurs Asni res sont plus lev es que dans la litt rature 3 80 1 08 uM h 1 Raimonet et al 2014 Figure 31 32 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine 10 15 20 asnieres poissy Asav Vitesse maximale de nitratation umax uM h Temp rature C F
5. Formule m NO2 M NO m N M N car les coefficients stoechiom triques sont gaux 1 Nous obtenons m NO2 46 156 25 14 La masse de NO est donc de 513 39 mg Nous faisons de m me avec la formule NO Na NaNO Nous obtenons de la m me fa on m NaNO 69 513 39 46 La masse de NaNO pr lever est donc de 770 mg pour obtenir une concentration de 625 mg de N L 44 Annexes Annexe 2 Protocole du dosage des nitrites par colorim trie Dosage des nitrites par colorimetrie 1 R alisation d une gamme talon 1 Mat riel n cessaire La premi re tape du dosage des nitrites est la r alisation de la gamme talon Elle est compos e de 5 talons respectivement a 1 5 10 20 et 30 uM umol L Mat riel n cessaire Eau milliQ 60mL 6 Tubes de 15 mL Une fiole jaug e de 10 mL ars Tyme 10 mL verte du labo de BM Se ee pe a LE embouts correspondants a a epa Rainin de 50 uL embouts sp ciaux dans les boites vertes rainin sur l tag re au dessus du en BM Une balance de pr cision balance ferm e gauche dans la salle des balances de chimie La solution stock de nitrite NOy stabilis e 1000 mg L Une plaque 96 puits Un lecteur de plaque 96 puits pour nous spectrostar nano Un r actif de dosage du nitrite dans le r frig rateur au fond droite en salle de chimie le r actif de Griess Cf fiche Promega dans le dossier dropbox protocols mamip batch _mitrif R
6. tudes que j ai r alis es et qui m a particuli rement aid e sur la sonde WIZ C line Briand technicienne de recherche pour son aide lors de mes filtrations au laboratoire Au personnel du laboratoire de la DDP qui a r alis mes analyses nitrites nitrates et ammonium Thibaud Cazier en th se au laboratoire M tis UPMC ainsi que le personnel du laboratoire avec qui j ai r alis les tudes cin tiques Jean Bernier en post doc au SIAAP qui a contribu au traitement des donn es cin tiques Erwan Garcia Gonzalez technicien de recherche pour les sorties sur le terrain sur le r seau ODES Valentine Grandclerc stagiaire et Claire Plessis apprentie pour les moments de pauses pass s ensemble Introduction g n rale INTRODUCTION GENERALE La Directive Cadre sur l Eau de 2000 2000 60 CE impose d atteindre a horizon 2015 le bon tat cologique des masses d eau superficielles sur l ensemble du territoire europ en et donc sur la Seine Le bassin de la Seine est class en zone sensible selon la l gislation europ enne et est menac d eutrophisation terme d signant une pollution naturelle de certains cosyst mes aquatiques qui se produit lorsque les nutriments assimilables par les algues sont en trop grande quantit Les principaux nutriments l origine de ce ph nom ne sont le phosphore principalement dans sa forme soluble le phosphate et l azote principalement sous forme
7. 20 C x 6 Equation 2 L tude ici permettra alors de d terminer la constante th orique facteur de correction En utilisant une r gression exponentielle l quation de la courbe observ e s crit sous la forme y a x e Equation 3 Gr ce cette quation on peut calculer le vmax deux temp ratures diff rentes T et 20 C En rempla ant les vmax dans l quation 2 on peut d terminer vmax T C T ax 20 09 quation 4 Avec vmax T C a e T et vmax 20 C a x e On prendra ici T 21 C pour simplifier la formule vmax 21 C vmax 20 C Equation 5 18 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV INTERPRETATION DES RESULTATS IV 1 Strat gie de l analyse des r sultats Les r sultats bruts pr sentent des concentrations en nitrites a trois temps diff rents pour trois sites de pr l vement et 5 temp ratures diff rentes Ces r sultats permettent d aborder trois axes de recherche de tude Figure 11 Dans un premier axe le traitement des donn es permettra une tude des cin tiques de nitrosation et nitratation Des taux maximum pour chaque site et temp rature pourront tre calcul s Pour cela les concentrations sont trac es en fonction du temps La pente permet d obtenir le dS dt taux de production ou de consommation des nitrites La courbe dS dt en fonction du temps p
8. Axe 3 6 Poissy 1 05 1 39 Asni res 1 03 1 01 Tableau 16 Valeurs de constantes vmax et Km d termin es sur des eaux de Seine dans la litt rature Communaut nitrosante communaut nitratante km vmax vmax eau de Seine Asni res 1 20 C 3 8 uM h 10 13 uM 0 06 uM h Raimonet et al 2014 eau de Seine Poissy 20 C 5 03 uM h 0 14 uM h 10 13 uM 36 Conclusion g n rale CONCLUSION GENERALE La nitrification est depuis la fin du 19 si cle une r action biog ochimique connue et tudi e Cependant les tudes cin tiques in situ pour la nitrosation et la nitratation sont r centes sur des eaux de rivi res ann es 2000 sauf rares exceptions et les temp ratures tudi es tait relativement restreintes T ambiante 4 C et parfois 30 C Cette tude a tudi ces cin tiques pour cinq temp ratures diff rentes et pour trois sites diff rents Le mode op ratoire mis au point permet de traiter une quantit importante d chantillon en m me temps 63 chantillons dans cette tude avec une analyse rapide moins de 2 minutes pour analyser la plaque en colorim trie Cependant cette analyse n cessite une dilution des chantillons pour rentrer dans la gamme talon 1uM 30uM Or cette dilution peut tre source d impr cision sur la mesure finale Il serait donc int ressant d valuer l erreur engendr e de la dilution sur la mes
9. pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Ainsi il existe une relation entre la vitesse d oxydation et la concentration en substrat On peut alors en tra ant le graphe v en fonction de S d terminer vmax et Km Figure 2 V uM h Vmax Vmax 2 Km S uM Figure 2 Courbe de Michaelis Menten vitesse d oxydation en fonction de la concentration en substrat Les cin tiques de diminution de l ammonium suivent une loi d ordre z ro c est dire que la concentration en NH diminue lin airement au cours du temps Martin 1979 Les vitesses d oxydation de l ammonium et du nitrite sont en effet lin aires jusqu 24h C bron 2004 gt Influence de la Temp rature Les cin tiques sont d pendantes de la temp rature La vitesse de croissance des bact ries augmente avec la temp rature de 10 22 C reste constantes de 30 a 35 C et diminue partir de 35 C Il existe donc une temp rature optimum pour la vitesse de croissance des bact ries mise en jeu lors de la nitrification qui est autour de 25 30 C th oriquement Henze et al 1997 L volution de la vitesse de croissance bact rienne umax en fonction de la temp rature est d crite par une loi de type Arrhenius pour des temp ratures inf rieures a la temp rature optimum Vigne 2007 Figure 3 L quation s crit ymax T pmax 20 C 0 Equation 2 pmax T Th orique I I I 1 Observ e
10. rents Km d termin s 4 diff rentes temp ratures Les constantes Km ont t d termin es par r gression logarithmique pour les diff rentes temp ratures Tableau 12 Les constantes Km varient en fonction de la temp rature Tableau 12 Tableau bilan des param tres Km d termin s pour les diff rentes temp ratures temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C Asni res Km 523 465 335 158 505 282 nitrosation Km 444 220 421 391 446 456 nitratation temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C Poissy Km 517 307 490 446 89 497 nitrosation Km 523 295 234 164 147 488 nitratation temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C SAV Km 556 602 659 504 816 734 nitrosation Km 784 469 321 288 508 718 nitratation Les constantes Km pour la nitrosation sont tr s diff rentes selon les sites et la temp rature A 20 C la valeur des Km est tr s diff rente entre les deux exp riences Le Km semble relativement peu influenc par la temp rature Il n y a pas de tendance particuli re qui se d gage Figure 28 30 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Km uM 10 15 20 25 asnieres Mpoissy Asav Temp rature C Figure 28 Variation de la constante de Michaelis de nitrosation le long de la Seine en fonction de la temp rature Les constantes de Michaelis Menten pou
11. une des pollutions probl matiques majeures de ces derni res ann es le SIAAP r alise des exp riences pour mieux comprendre la dynamique du nitrite et la nitrification en Seine Ce stage a permis d appr hender les diff rentes missions de la DDP vis vis du milieu naturel d une part la surveillance avec les travaux sur la sonde WIZ qui permet de mesurer les diff rents compos s azot s d autre part la prospective avec l tude des cin tiques de la nitrification Pr sentation du stage PRESENTATION DU STAGE I MISSIONS TECHNIQUES I 1 Maintenances des stations de mesures L acquisition de donn es de qualit s haute fr quence n cessite un suivi des diff rents capteurs d ploy s sur la Seine Des interventions ont donc t faites pour maintenir le bon fonctionnement des stations ODES et CarboSeine Ces interventions consistaient faire l entretien et la calibration si besoin de ces capteurs oxyg ne I 2Mise jour du guide technique CarboSeine Le guide technique est un manuel d utilisation des stations CarboSeine Il d crit chaque capteur avec les diff rentes op rations de nettoyages de calibrations et de mesures contradictoires a r aliser L tude du nouveau capteur la sonde WIZ Systea a permis de mettre en vidence plusieurs probl mes et leurs solutions associ es Ce capteur a t ajout au guide technique II MISSIONS SCIENTIFIQUES IL1 Validation de la sonde WIZ en laborato
12. 3 33 Asni res nitratation 5 10 2 36 3 73 1 94 nitrosation 10 50 0 72 5 61 6 92 Poissy nitratation 3 72 0 48 2 10 3 14 nitrosation 2 17 18 26 10 22 11 38 SAV nitratation 8 43 4 02 6 22 3 12 La vitesse de nitrosation est plus faible Asni res qu Poissy et Sav Les vitesses de nitrosation sont plus importantes que les vitesses de nitratation Poissy et SAV A Asni res la vitesse de nitratation est l g rement plus lev e que la vitesse de nitrosation Le profil observ Poissy semble donc tre influenc par les rejets de SAV Figure 24 Ces observations sont tout de m me a prendre avec pr cautions car les cart types sont tr s importants Vmax moyen uM h 1 Asni res Poissy E nitrosation Mnitratation Sites de pr l vement Figure 24 Variation spatiale de la vitesse maximale de nitrosation et de nitratation le long de la Seine 20 C 28 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 3 Axe2 D termination des constantes de Michaelis Menten IV 3 1 R sultats 4 SAV Les courbes de Michaelis Menten permettent par r gression logarithmique de d terminer les Km On r sout ainsi le calcul en prenant l quation de la r gression et en rempla ant y par vmax 2 On a donc Activit uM h Km nitrosation exp vmax 2 3 8161 0 7878 504 uM Km nitratation exp vmax 2 8 0915 2 1735
13. abscisse du point de l ordonn e vmax 2 Figure 2 Deux m thodes ont t utilis es pour d terminer ces constances La premi re m thode a consist tracer une r gression logarithmique L quation de la courbe va permettre de d terminer vmax x 2000 gt plateau atteint et Km y vmax 2 Une deuxi me m thode consistait utiliser le solveur Excel apr s avoir d terminer Km et vmax avec la premi re m thode pour affiner les r sultats trouv s Avec les valeurs de Km et vmax calcul es par r gression logarithmique les vitesses th oriques en fonction du temps sont calcul es par la formule suivante _ vmax x S Km S Equation 1 La somme des diff rences vitesse observ e vitesse th orique au carr correspond l objectif d finir du solveur C est la pr cision laquelle il doit chercher les nouvelles constantes Km et umax sont rentr s comme cellules variables Le solveur calcule alors de nouveau les Km et umax en utilisant une r gression non lin aire On peut alors choisir de conserver les nouvelles valeurs ou de garder les pr c dentes valeurs trouv es par r gression logarithmique La m thode utilis e sera la r gression logarithmique car le solveur donne des r sultats tr s proches de celle ci et n arrive pas trouver des valeurs de Km et max pour tous les cas Les vmax en fonction de la temp rature entre 0 et 25 C suivent l quation th orique vmax T vmax
14. celle ci est cens e tre stable car les deux tapes de la nitrification sont inhib es Cette diminution peut tre due des changes avec l atmosph re et ou la fixation des nitrites aux parois de l erlenmeyer y 6 7686x 1641 6 10 Concentration en nitrites uM temoin Temps h Figure 12 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin A La vitesse t moin est pour une concentration 1600uUM et une temp rature de 20 C de 6 7686 uM h Si nous ramenons cette vitesse aux concentrations des chantillons B G nous obtenons les vitesses suivantes Tableau 2 Vitesses t moins pour les diff rents dopages SAV Concentration initiale Vitesse t moin correspondante uM uM h 384 51 1 55 920 11 3 70 1680 80 6 77 Les chantillons B C et D sont les chantillons o le nitrite est consomm nitrosation bloqu e On observe bien cette consommation les pentes des droites concentrations en nitrites en fonction du temps sont n gatives Figure 13 Ces pentes correspondent aux vitesses avec l inhibition de l allylthiour e 20 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine y 9 5429x 1632 8 y 4 0153x 883 74 y 0 165x 387 25 10 15 Concentration en nitrites uM B EC AD Temps h Figure 13 Concentration en fonction du temps des chant
15. de Seine Poissy 20 C eau de Seine 20 C 1071UM 10 13 UM 0 14 uM h 5 03 uM h Vilmin et al 2013 eau de rejet Seine Aval 20 C Knowles et eau de la Tamise al 1965 15 C Jim nez et al 2011 Ciudad et biomasse d un al 2006 r acteur nitrifiant Hunik et al 1993 28uM 34uM boues activ es 5 6uM 122 uM h 0 0046uM 0 01uM h culture cellulaire 12 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine L2Premiers essais faits au Siaap Une tude consistant suivre l volution de la concentration en nitrates nitrites et ammonium sur diff rentes eaux a t r alis e en 2010 la DDP Le Roch 2010 Il s agissait d tudier l volution des 3 concentrations sur un chantillon dop en nitrite Cet chantillon est mis dans un r acteur gard l obscurit sous agitation avec une sonde pH et une sonde de conductivit Figure 4 Annexe 1 sonde pH et conductivit bulleur pr leveur magn tique Figure 4 Sch ma exp rimental L enjeu de cette analyse tait de d terminer la capacit nitrifiante de la Seine Ainsi des vitesses de consommation des nitrites et des vitesses de production de nitrates ont t calcul es L effet de la temp rature a pu tre mis en vidence avec une activit nitrifiante qui diminue avec la temp rature Les concentrations en nit
16. des chantillons dop s en ammonium Asni res ER PE CE CU UT 26 Figure 23 Activit en fonction de la concentration Asni res 27 Figure 24 Variation spatiale de la vitesse maximale de nitrosation et de nitratation le long de la Seme a20 ne Ant nid 28 Figure 25 Activit en fonction de la concentration SAV 29 182 Sommaire Figure 26 Activit en fonction de la concentration Poissy 00 eeeeeeceeeeeereeeneeeneeeees 29 Figure 27 Activit en fonction de la concentration Asni res 30 Figure 28 Variation de la constante de Michaelis de nitrosation le long de la Seine en fonction de TA t mp ratute San ns tnt nent ns enr atteste 31 Figure 29 Variation de la constante de Michaelis de nitratation le long de la Seine en fonction de la temp ratute sessie TR D dunes ages awa ar SEANS 31 Figure 30 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitrosation p r TES diff rents SISTER nd tete ease 32 Figure 31 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitratation DOUTE l s diff rents SUES nine ee A re R E tie eee 33 Figure 32 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitrosation pour les diff rents sites 10 15 20 C us scssnecescesevesdeaeteassedeshcvsnnshoenseadguds dgintgesanteabedactes 33 Figure 33 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d ox
17. donc Vmax 21 C 1 6051 x e 7 21 Vmax 20 C 1 6051 x e 2 7 20 D apr s l quation 2 on a vmax T C __ 1 O __ T 20 vmax 20 C Equation 4 En utilisant les quations 10 et 11 dans l quation 12 le facteur de correction peut donc tre calculer avec la formule suivante 1 6051 x g 047x21 3 94 Oasniares 1 6051 x 60047 x20 20 047 X20 3 72 1 06 Les facteurs de corrections Poissy et SAV sont d termin s de la m me fa on Pour la nitratation les donn es a Poissy permettent de faire une r gression exponentielle Le point a 20 C pour Asni res et SAV est trop bas et est surement incorrect Les points 4 20 C n ont donc pas t pris en compte Figure 33 Le point 5 C Asni res n est pas aberrant et a donc t gard pour la r gression exponentielle y 5 0197e9 0669x R 1 y 0 0069e0228 R 0 9248 y 1047260007 R 0 2008 Vmax uM h 1 10 15 20 asnieres poissy Asav Temp rature C Figure 33 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitratation pour les diff rents sites 10 15 20 C 34 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Les facteurs de correction pour la nitrosation et nitratation sur les trois sites diff rents ont t d termin s Ces facteurs varient de 1 01 1 39 Les de la nitrosation trouv s Asni
18. donne les vitesses t moins des trois dopages faits Tableau 5 Vitesses t moins pour les diff rents dopages Poissy Concentration initiale uM Vitesse t moin correspondante uM h 162 45 0 13 601 99 0 48 1247 18 0 99 Les chantillons B C et D sont les chantillons o le nitrite est consomm nitrosation bloqu e On observe bien cette consommation les pentes des droites concentrations en nitrite en fonction du temps sont n gatives Figure 17 y 8 375x 1267 3 y 5 0127x 604 76 y 1 8706x 170 24 10 B gC ABO Concentration en nitrites uM Temps h Figure 17 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en nitrites Poissy Les concentrations en E F et G sont normalement cens es augmenter dans le temps nitratation bloqu e Cependant on observe une diminution de la concentration assez forte sur le dernier point Tous les triplicats des chantillons diminuent 4 T22 Figure 18 Il ne peut donc pas s agir d une erreur ponctuelle lors des dilutions Il peut y avoir eu une erreur lors de la lecture de plaques par le spectrom tre pour le point T22 23 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine y 1 8491x 70 568 y 2 4189x 89 988 y 4 7244x 80 007 10 15 Concentration en nitrites uM E HF AG Temps h Figure 18 Concentration en fonc
19. laisser reposer 10 minutes et mesurer Nitrite attention la limite de quantification est de 0 7 mg L Il faut donc faire une dilution par 10 mettre 1mL d eau filtr e dans 9mL d eau distill e pr lever 5mL de la dilution avec une micropipette de 5000 uL placer l eau dans le tube essai boucher le tube et agiter vigoureusement jusqu dissolution totale du r actif laisser reposer 10 minutes et mesurer pour avoir le r sultat nous multiplions par 10 dilution au dixi me Ecrire toute les mesures sur la feuille de r sultats Nous voulons une concentration de 5 mg de N L Nous savons que nous ajoutons 20mL de solution m re aux 2 5 L d eau analyser Dans le r acteur nous avons donc C r 5 mg de N L et V r 2 5L 43 Annexes Le volume de solution m re ajout dans le r acteur est de V s 20 mL 0 02L A l quilibre nous avons C r V r C s V s C s C r V r V s 625 mg de N L Pour l exp rience nous avons besoin au maximum de 180 mL de solution m re 9 analyses Nous choisissons de faire la solution m re dans une fiole jaug e de 250mL Nous pr parons la solution m re partir d une poudre de NaNO pure Nous voulons obtenir 625 mg de N L Pour 250 ml nous obtenons 156 25 mg de N Nous avons N O2 NO La masse molaire de N est de 14 g mol et celle de NO de 46 g mol Nous voulons 156 25 mg de N L Nous calculons la masse de NO n cessaire
20. parisienne un en amont de SAV Asni res les rejets de SAV et en aval de SAV Poissy Les donn es ne donnent pas des r sultats tr s probants Les cin tiques de nitrosation et nitratation tant faibles la variation de concentration en nitrites sur 24h est peu marqu e alors que l erreur de la mesure de concentration peut tre importante Cependant cette tude a permis d tablir un mode op ratoire qui permettra un traitements de donn es futures et de d terminer plusieurs param tres importants pour mieux comprendre la dynamique des compos s azot s et leur devenir en Seine Cela sera utile et contribuera am liorer la pr diction des concentrations en nitrites nitrates et ammonium en Seine Mots cl s Qualit de l eau Seine Azote Sonde Mesure en continu Cin tiques Nitrification 49
21. pour la nitrosation sont plus lev s que dans la litt rature d au moins un facteur 10 par exemple vmax Asni res est de 0 73uM h 1 pour 0 06uM h 1 dans l article de Raimonet et al 2014 Les valeurs trouv es pour la nitratation 20 C sont relativement proches Asni res Km de 391 446 uM pour un Km de 355 uM dans l article Tableau 16 La r p tabilit de l exp rience n est pas tr s fiable Deux exp riences 20 C ont trouv des constantes parfois tr s diff rentes exemple Asni res Km nitrosation a 157 uM et Km nitrosation b 506uM Tableau 15 Tableau bilan des constantes d termin es Nitrosation Nitratation temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C SAV 14 83 22 14 8 77 2 17 18 26 6 53 26 85 9 80 13 69 8 43 4 02 14 80 Axe 1 vmax Poissy 5 89 0 73 5 58 10 50 0 72 8 30 15 19 0 14 1 62 3 72 0 48 5 17 Asni res 2 47 2 30 2 25 0 73 5 45 1 62 11 41 10 35 12 35 5 10 2 36 12 01 temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C SAV 556 602 659 504 816 734 784 469 321 288 508 718 Axe 2 Km Poissy 517 307 490 446 89 497 523 295 234 164 147 488 Asni res 523 465 335 158 506 282 444 220 421 391 446 456 SAV 1 16 1 07
22. r actions d oxydation Ainsi la nitrosation s crit en quation de la mani re suivante NH4 aq 3 2 O2 H2O NO7 2 H30 Et la nitratation est crite par cette quation NO gt 1 2 O2NO3 Ces deux quations produisent de l nergie entre 276 et 351 kJ pour la nitrosation et entre 64 4 et 87 5 pour la nitratation Martin 1979 1 1 2 3 Synth se cellulaire Grace l nergie produite lors de l oxydation de l ammonium en nitrate la synth se de nouvelles bact ries est possible Il est alors possible de prendre en compte cette synth se dans les quations pr c dentes de nitrosation et nitratation Martin 1979 Les quations globales prenant en compte l oxydation et la synth se sont donc 55 NH4 76 O2 109 HCO C5H7NO3 vitrosomas 54 NOx 57 H20 104 H CO 400 NO gt NH 4 H2CO HCO 195 H20 CsH7NO gt d Nitrobacte 3 H2O 400 NO3 L quation globale pour la nitrification est la suivante NH4 1 8302 1 98HCO 0 021 CsH7NO gt 1 041 H20 0 98NO3 1 88H2CO 1 1 2 4 Influence des substrats et de la temp rature sure les cin tiques gt Influence des Substrats L volution de la vitesse d oxydation de l ammonium et du nitrite suit la loi de Michaelis Menten qui d pend de la concentration en substrat Les cin tiques sont donc d crites par l quation suivante __ vmax x S Km S quation 1 10 D termination des cin tiques in situ
23. res et a Poissy et le de la nitratation 4 SAV sont coh rents et dans la gamme recens e dans la litt rature 1 02 1 103 Oleszkiewicz et Berquist 1988 Lessouef et al 1992 Queinnec et al 2006 Les autres valeurs ne sont pas aberrantes mais l g rement plus lev es de 0 057 pour la nitrosation a SAV de 0 287 pour la nitratation Poissy et l g rement plus faible de 0 01 pour la nitratation Asni res Tableau 14 Tableau 14 Facteurs de correction pour la nitrosation et la nitratation sur les trois sites Nitrosation vmax 21 C vmax 20 C 6 SAV 21 13 18 25 1 16 Asni res 4 31 4 11 1 05 Poissy 8 99 8 71 1 03 Nitratation vmax 21 C vmax 20 C 6 SAV 20 46 19 13 1 07 Poissy 6 77 4 87 1 39 Asni res 12 36 12 26 1 01 35 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 5 Bilan g n ral des r sultats obtenus Les diff rents r sultats obtenus sont r capitul s dans le Tableau 15 Les donn es obtenues lors de l exp rience ne sont pas forc ment tr s fiables Il se peut qu il y ait des impr cisions cons quentes au niveau des mesures en nitrite par colorim trie alors que les cin tiques en seine pour le nitrite sont relativement lentes Les valeurs obtenues pour les diff rents param tres ne sont donc pas forc ment tr s coh rentes par rapport a la th orie Les r sultats obtenus
24. tr s satisfaisants pour les nitrites et nitrates avec une surestimation moyenne de 13 et une sous estimation moyenne de 15 respectivement permettant de garantir l valuation du bon tat des cours d eau DCE L ammonium semble sensible pour les concentrations inf rieures 1 mg NH4 L avec une sous estimation de 33 mais globalement la mesure reste correcte avec 13 de sous estimation moyenne sur toute la gamme pouvant atteindre 4 mg NH4 L Les pics en ammonium sont tr s bien mesur s Plusieurs probl mes techniques et de conception de la sonde ont t observ s lors de ces tests Des fuites ont t constat es avec l utilisation du f t de r actifs obligatoire sur le terrain Les poches de d chets et de r serves en eau ultra pure sont mal con ues au niveau de leur volume et de leur syst me de fixation Des solutions ont t apport es lors du d ploiement en hall d essai mais elles ne sont que provisoires et ne peuvent pas tre envisag es long terme La sonde donnant des r sultats globalement satisfaisant en hall d essai va tre d ploy e sur une des stations CarboSeine Bougival Ce d ploiement pourra permettre de voir la robustesse de la Te Pr sentation du stage sonde en milieu r el o les conditions sont plus difficiles courant objets flottant Des solutions devront tre trouv es pour la mise en place de la sonde sur la station En effet les diff rentes solutions apport es aux p
25. trois sites et variations spatiale de vmax Les chantillons permettant d valuer la consommation de nitrites montrent des r sultats coh rents La concentration diminue au cours du temps et cette diminution est plus prononc e avec l augmentation du dopage Les chantillons permettant d valuer la production de nitrites pr sentent des r sultats moins attendus Les concentrations n augmentent pas forc ment suivant les chantillons L augmentation en nitrites ne suit pas la concentration du dopage Il y a donc un probl me au niveau de la mesure pour les chantillons dop s en ammonium En effet ceux ci sont moins concentr s en nitrites La variation alors observ e au cours du temps n est peut tre pas assez forte l erreur de la mesure est sup rieure la production de nitrite L exp rience 20 C a t faite deux fois et a permis de recalculer des vmax de nitrosation et de nitratation avec une semaine d cart entre les deux exp riences Les valeurs trouv es sont tr s diff rentes La r p tabilit n est pas observ e Cela peut tre d un mode op ratoire qui manque de pr cision au niveau de la mesure ou alors l eau de Seine qui a une cin tique fortement diff rente d une semaine une autre peu probable Tableau 11 Tableau 11 Tableau r capitulatif des vitesses maximales 20 C temp rature 20 C a 20 C b moyenne cart type nitrosation 0 73 5 45 3 09
26. 1992 Optimizing nitrogen removal reactor configurations by on site calibration of the IAWPRC activated sludge model Water Science and Technology 25 6 105 123 Lewis W M and Morris D P 1986 Toxicity of Nitrite to Fish a review Transactions of the American Fisheries Society 115 183 195 Martin G 1979 Le probl me de l azote dans les eaux Technique et documentation ISBN 2 85206 047 7 Oleszkiewicz J A and Berquist S A 1988 Low temperature nitrogen removal in sequencing batch reactors Water Research 22 9 1163 1171 OMS 2014 Eau assainissement et sant Les maladies li es a l eau M th moglobin mie http www who int water_sanitation_health diseases methaemoglob fr Philips S Laanbroek H J Verstraete W 2002 Origin causes and effects of increased nitrite concentrations in aqutic environments Reviews in Environmental Science and biotechnology 1 p115 141 Queinnec I Ochoa J C Vande Wouwer A and Paul E 2006 Development and calibration of a nitrification PDE model based on experimental data issued from biofilter treating drinking water Biotechnology and Bioengineering 94 2 209 222 Raimonet M Cazier T Rocher V Laverman A M 2014 Nitrifying kinetics and persistence of nitrite in human impacted riverine waters en cours de parution Rocher V Garcia Gonzales E Paffoni C Thomas W 2011 La production de nitrites lors des la d nitrification des eaux us es un sujet sensib
27. 2 3 Eau de Seine Asni res Le t moin a une pente n gative Il y a donc des interactions autres que bact riennes qui se produisent Figure 20 y 4 1285x 1103 5 10 temoin Concentration en nitrites uM Temps h Figure 20 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin Asni res Le Tableau 8 donne les vitesses t moins des trois dopages faits Tableau 8 Vitesses t moins pour les diff rents dopages Asni res Concentration initiale uM Vitesse t moin correspondante uM h 106 06 0 39 543 60 2 02 1112 33 4 13 25 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Les concentrations des chantillons bloqu s pour la nitrosation diminuent Les nitrites sont bien consomm s et oxyd s pour donner des nitrates Figure 21 y 3 5585x 1149 7 y 2 6785x 510 77 y 0 1188x 111 15 Concentration en nitrites uM 10 B mc a Temps h Figure 21 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en nitrite Asni res Les chantillons bloqu s pour la nitratation accumulent bien les nitrites pente positive mais a de tr s faibles vitesse valeur faible de la pente Figure 22 y 0 0198x 2 3018 0 0037x 2 297 y 0 0029x 2 2703 Concentration en nitrites uM temps Figure 22 Concentration en fonction du temps des chantillons
28. Universit Pierre et Marie Curie Ecole des Mines de Paris amp Ecole Nationale du G nie Rural des Eaux et des For ts Master 2 Sciences de l Univers Environnement Ecologie Parcours Hydrologie Hydrog ologie Mesure en continu des nutriments en Seine Suivi et pr diction des compos s azot s en Seine Cl lie Braouezec Directeurs de recherche Catherine Paffoni Vincent Rocher Encadrant Julien Pouillaude SIAAP DDP Direction du D veloppement et de la Prospective Service Expertise et Prospective 82 av Kl ber 92 700 Colombes Service public de l assainissement francilien Mars Ao t 2014 MINES 2 IAAI PARIS Tech Abstract ABSTRACT The Seine River is highly anthropic and is directly impacted by the greater Paris Aware of its fragility and the necessary return to good ecological status SIAAP has been doing weekly monitoring of the water physico chemical quality for over 20 years In addition to this self monitoring they have a close cooperation with the LGE as part of the research program PIREN Seine to monitor the high frequency of the Seine This project named CarboSeine has three in situ multi parameter autonomous stations downstream from the Paris area Andr sy Bougival and Suresnes This will allow continuous monitoring of the parameters involved in the biogeochemical processes This information will help to better understand these processes A probe measuring nitrogen compounds ammonia
29. actif dangereux viter tout contact avec la peau et toute ingestion Une cuve a pr lever pour pipette multicanal premier placard en haut a droite en BM 2 Pr paration de la solution m re Inscrire sur 1 tube de 15 mL Solution m re 1mM avec la date du jour Pr paration de la solution m re 1 mM mmol L qui servira cr er la gamme talon Placer la fiole jaug e de 10 ml sur la balance et taser Pu lever 460 pil de La solution stock de nitrite et verser dans la fiole jaugie Noter le poids en grammes Compl ter 10 mi puis noter le poids final en grammes Les poids not s permettent de calculer pr cis ment la concentration de la solution fille Le nitrite a une masse molaire de 46 g mole Poids des 460 uL a Conc r elle de la solution m re Masse molaire du nitrite frz Le r sultat devrait approcher 0 001 M si la pr paration et le dosage ont t bien fait donc 1 mM Bien homog n iser la solution dans la fiole jaug e avant de la transf rer dans le tube de 15 mL pr par cet effet 45 Annexes x tion de la talon Notes sur les 5 tubes restant les concentrations des solutions de la gamme talon avec la date du jour Volumes pour pr paration de la gamme talon 9990 uL d eau MQ 10pldesolutionm realmM talona 1pM 9950 uL 50 pL a 5 uM 9900 uL 100 pL 2 10 uM 9800 uL 200 pl gt 20 uM 9700 uL 300 uL 30 uM D poser le tube ouvert dans un b cher vide pour l
30. antillons partir de B1 raison de 300 uL d chantillon par puits Aller chercher le r actif de dosage de nitrite et en verser dans la cuve pr lever pour pipette multicanal D poser 30 uL de r actif nitrite dans chaque puits de la plaque 96 puits l aide de la pipette multicanal Placer la plaque l obscurit dans un tiroir et attendre les 20 minutes de coloration 6 Lecture des concentrations La plaque 96 puits est dispos e sur le lecteur de plaque le com Al et haut gauche Ouvrir le logiciel control du spectrostar nano Ensuite ex cuter le protocole nitrites sans avoir oubli de v rifier le layout et de changer le nom de la manip et du manipulateur click droit edit protocol amp change IDs La lecture de l absorbance se fait 540 nm Les r sultats sortent sur le logiciel Mars qui sert analyser les r sultats du spectrostar Cliquer sur l onglet table view puis exporter vers excel onglet pr sent pour l export Ajouter les concentrations r elles des talons cot de leur absorbance Tracer la courbe de calibration nuage de point puis click droit ajouter une courbe de tendance Forcer le passage par 0 ajouter l quation de la droite et le coefficient de d termination Se servir 47 Annexes ensuite de l quation de la droite pour faire la relation entre l absorbance de chaque chantillon et sa concentration Attention ne pas oublier l
31. besabstuksccioavibe 2 REMERCIEMENTS sisssies soviensessasinieonsnevasooucanassvssnnedbonstvde ben ensssnaseoucsossenesbiviesSoutpsesdeoaisenassos 5 INTRODUCTION GENERALE piicccsisttevascsssccsssontavsidscscacepstsevacsosseucopontedsidavacdussdedvecsonideoss 6 PRESENTATION DUSTAGE issusiscsscconscniscescvesdsonsssenssseisscapneuassessacenctonustussnosdosedsesunschesend 7 Lx MISSIONS TECHNIQUES te ee a ne UN dense 7 Il Maintenances des stations de mesures 7 12 Mise jour du guide technique CarboSeine ss 7 T MISSIONS SCIEN FIBIQUES 46 same num he net sf riad Eana 7 IL Validation de la sonde WIZ en laboratoire et en milieu naturel 7 112 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans TG Seine one AT axa hoe wean dyes Ten RE acta SP EE E Re ne 8 DETERMINATION DES CINETIQUES IN SITU POUR LES REACTIONS DE NITROSATION ET NITRATATION DANS LA SEINE senesnsnsnsese 9 I RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 38h080 drama nse near dan ie en anne ane l nes dite 9 TI TOUTE AGT GV Oris elec address nes 9 I 1 1 Rappel sur le cycle de Pazote sag catia Bice Da ins vases nt SR pt A anise 9 LL2 Focus sur l tape de AMACAUON 5e an nn enter 10 L12 1 Les microorganismes mis en jeu ss nine ati nt saes 10 1 1 2 2 Les m canismes biog ochimiques ee eeeceeeeeceeeeceeeeeceeceeceeeeeenteeeenaeees 10 112 Synthese CUITS TE esac uaa ee A ee Lee 10 1 2 4 Influence
32. c barreau aimant parafilm enceinte r frig r e kits d analyses pour NO3 NO7 NH seringues 20mL et cartouches filtrantes 0 45 um micropipettes de 5000 uL et 1000 uL serre joint tuyau avec une pince servant pour le pr l vement 41 Annexes gac plastique pour les chantillons temp rature ambiante Boucher le trou du bas du r acteur en verre Mettre 2 5L d eau analyser dans le r acteur Mettre en place les sondes le bulleur le barreau aimant et le tuyau servant pour le pr l vement Doper le milieu en nitrites en ajoutant 20 mL de solution 625 mg de N L Mettre agiter et mettre le bullage Nous les laisserons en permanence jusqu la fin des analyses Mettre le serre joint apr s avoir v rifi l tanch it du syst me Si l exp rience se fait basse temp rature le r acteur est plac dans le frigo Mettre l chantillon dans le noir r frig rateur ou sac plastique suivant la temp rature Une fois cette tape finie pr lever de l eau pour faire les analyses de NO3 NO7 NH4 Les analyses se feront 10h 14h et 16h pendant 48h Nous commencerons le premier suivi de la concentration en nitrites le lundi 10h Ce suivi se finira le mercredi 10h inclus Un deuxi me suivi sera lanc vers 10h le mercredi pour se terminer par l analyse du vendredi 10h Trois volutions des nitrites en Seine seront faites temp
33. ct riennes et l accumulation du CI branchial chez les poissons Philips et al 2002 Les compos s azot s peuvent aussi tre responsables de d veloppement d algues provoquant l eutrophisation des cours d eau Les algues prolif rent en utilisant des nutriments ainsi la quantit d azote en Seine va impacter directement la production algale Billen et Garnier 2009 Soucieux de la population et du milieu naturel le devenir du nitrite en Seine est donc une question de premier ordre pour le SIAAP D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine 1 1 2 Focus sur l tape de nitrification 1 1 2 1 Les microorganismes mis en jeu La nitrification se d roule en deux tapes et met en jeu des bact ries diff rentes pour chaque tape La nitrosation qui est la premi re tape de la nitrification est produite par les bact ries nitreuses Nitrosomonas europaea Nitrosococcus et Nitrosospira La nitratation deuxi me tape de la nitrification est effectu e par les bact ries nitriques Nitrobacter winogradskyi Ces bact ries sont a robies strictes et chimiolithotrophes obligatoires Elles utilisent l oxydation de leurs substrats min raux comme seule source d nergie et le gaz carbonique comme source exclusive de carbone Martin 1979 1 1 2 2 Les m canismes biog ochimiques Les deux m canismes biog ochimiques mis en jeu lors de la nitrification sont des
34. d ammonium de nitrate et de nitrite Ces pollutions sont majoritairement dues aux rejets urbains des effluents domestiques des stations d purations aux rejets industriels lessivage des sols Or cette eutrophisation entra ne une d gradation des milieux aquatiques et une r duction de la biodiversit Gr ce des moyens techniques humains et financiers importants le Syndicat Interd partemental de l Assainissement de l Agglom ration Parisienne SIA AP v rifie depuis plus de vingt ans que les moyens mis en uvre pour r pondre aux attentes de cette directive sont suffisants en r alisant le suivi gr ce son r seau d auto surveillance de l volution de la qualit des eaux de surface recevant les rejets de ses installations savoir la Seine et la Marne Ce contr le se fait par des pr l vements et analyses hebdomadaires au laboratoire de la Direction du D veloppement et de la Prospective DDP accr dit COFRAC sur un certain nombre de param tres physico chimiques tels que la conductivit le pH ou encore les nutriments carbon s azot s et phosphor s En parall le le SIAAP a d velopp un r seau de mesure en continu de l oxyg ne dissous sur 9 stations r parties entre Alfortville l amont de Paris et M ricourt tr s l aval du dernier point de rejet du SIAAP Ce r seau d Oxyg ne dissous en Seine ODES constitue un outil de surveillance tr s efficace et permet d appr cier l impact posit
35. des substrats et de la temp rature sure les cin tiques 10 1 1 2 5 Evolution de la recherche scientifique sur les cin tiques de nitrification 12 I 2 Premiers essais faits au SIGGD audi latins addresses 13 M OBJECTIFS DEL ETUDE 250 lo eeu nn nr era 14 IT MATERIEL ET METHODE ae dns ER ee eee A t a eae 15 LILA Sites d pr l vementssss aude 15 H2 Sch ma exp rimental sel dense sante dr Al edt laa e TRE ee 15 II 3 Dosage des nitrites par COLOTIINCIT Es oS dense tte sida PNR idee 16 I4 Traitement des donn es brutes Rene innn en teste 17 IV INTERPRETATION DES RESULTATS en nent un at ra nt 19 IVE Strat gie de lanalyse des r sultats s oats anne in en a daadeanaceebiens 19 IV 2 Axe 1 Etude des cin tiques 20 C d termination des taux maximum de nitrosation et HUFOIAHON nan etre van tae se nn a a nt a tte ann cr tente 20 EVE RSS SA Vis RE A E E er Vesaues 20 IV 227 Eat deSeine POSER ventas An Part ee 23 IV2 3 Eau de Seine Asnieres 4 asss ccsscsssieccs sieves aicen a 25 IV 2 4 Bilan des r sultats pour les trois sites et variations spatiale de vmax 28 IV 3 Axe 2 D termination des constantes de Michaelis Menten ccccccceseeeees 29 EVGSeIY R SISTER er Sen ee ec ee 29 TV9325 R sultats a BOISSY SN ANR cet dees Ar A Re en nn 29 IV 3 3 R sultats ASni res issues nella 30 IV 3 4 Bilan des diff rents Km d termin s a diff rentes t
36. dop s en ammonium Asni res Le Tableau 9 r capitule les valeurs de vitesses observ es pour les echantillon B G Tableau 9 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins Asni res Dopage uM Activit nitrosante Activit nitratante uM h uM h 100 0 1188 0 0029 500 2 6785 0 0198 1000 3 5585 0 0037 26 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Les activit s nitrosante et nitratante sont calcul es comme pour SAV et Poissy Tableau 10 Tableau 10 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons Asni res Activit nitrosante Activit nitratante Dopage WM uM h uM h 100 0 29 0 42 500 0 61 2 08 1000 0 57 4 13 Les courbes de Michaelis Menten permettent de d terminer les vmax comme pr c demment Figure 23 vmax nitrosation 0 73 pM h vmax nitratation 5 10 uM h y 1 5162In x 6 7707 R 0 915 y 0 1447In x 0 3649 R 0 7454 Activit uM h ji e nit on miee Btion du 2500 Concentration initiale en nitrite nitrosation ou en ammonium nitratation uM Figure 23 Activit en fonction de la concentration Asni res D D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 2 4 Bilan des r sultats pour les
37. e facteur de dilution ventuel 48 R sum RESUME La Seine est un fleuve fortement anthropis et est directement impact par l agglom ration parisienne Conscient de la fragilit de ce fleuve le SIAAP r alise depuis plus de 20 ans le suivi hebdomadaire de la qualit physico chimique de l eau le long de la Seine En parall le de cette auto surveillance il a mis en place une troite collaboration avec le LGE dans le cadre du programme de recherche PIREN Seine o il s agit d exercer un suivi haute fr quence de la Seine Ce projet nomm CarboSeine compte aujourd hui trois stations in situ autonomes multi param tres l aval de l agglom ration parisienne Andr sy Bougival et Suresnes Ce suivi va permettre de suivre en continu des param tres mis en jeu lors des processus biog ochimique Ces informations vont donc permettre de mieux comprendre ces processus Une sonde mesurant les compos s azot s ammonium nitrites nitrates a t test e en laboratoire et en reconstituant des conditions r elles avant d envisager de la d ployer en Seine Les tests ont montr que cette sonde tait fonctionnelle et sera test e en Seine en fin d ann e 2014 Une deuxi me tude en collaboration avec le PIREN Seine a permis d tudier les cin tiques in situ de la nitrification en Seine Cette tude a permis de d terminer ces cin tiques sur 3 sites diff rents en aval de l agglom ration
38. e maintenir droit puis tarer la balance Verser le volume d eau MQ correspondant l talon pr parer gr ce la pipette de 10 mL Noter le poids initial Bien agiter la solution m re avant de pr lever dedans Pr lever le volume de solution m re correspondant l talon en cours de pr paration Noter le poids final Calculer la concentration r elle de l talon ce calcul pourra tre fait la fin pour tous les talons en m me temps Ce calcul sera effectu en 2 tapes massique de solution m re dans l talon IR ae gee Ce calcul doit donner un r sultat de l ordre de 0 001 0 005 0 01 0 02 et 0 03 pour les talons respectivement 1 uM 5 pM 10 uM 20 pM et 30 uM Conc r elle de l talon mM massique de l talon conc r elle de la sol m re mM Si la concentration de la solution m re est proche de 1 mM ce r sultat doit tre proche de celui obtenu pour la premi re tape Ce r sultat est obtenu en mM donc pour le convertir en pM il faut multiplier par 10 La gamme doit tre refaite tous les jours et conserv e 4 C 4 Pr paration du r actif de dosage Ce r actif est dangereux il faut viter tout contact avec la peau et toute ingestion Ce r actif est pr par par les techniciens du laboratoire de chimie donc il est peu probable qu il soit faire Il est dans le r frig rateur au fond droite dans le labo de chimie Dans une fiole jaug e de 1000mL mettre succ
39. emp ratures 30 Sommaire IV 4 Axe 3 Influence de la Temp rature sur les taux MAXIMAUX ccccccesseeeeesteeeees 32 IV 4 1 Profils des Vitesses maximales en fonction de la temp rature 00 32 IV 4 2 D termination du facteur de Correction O 0 ce eeesseeseeeseceneceeeeneeeneeeeees 33 IV 5 Bilan g n ral des r sultats ObIENUS isc ccsiescs bavscsicenciledecasiasnsadbergcatovsesotdtabatariaaws 36 CONCLUSION GENERALE ii sisicnscsiecdeveadecsdvccsstsabscdesdestosadsbveddeccaveaidstetscdecdeudssadessescsecasts 37 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES e sesseseesosseseesossessosoesoesossesossossesossoesessossesossossee 38 ANNEXES renunsia nosen raien EA copoetiatoadteaaseunendacendeeas 41 RESUME EA A AR AAE 49 LISTE DES FIGURES Figure 1 sch ma simplifi du cycle de l azote Grouz et al 2013 9 Figure 2 Courbe de Michaelis Menten vitesse d oxydation en fonction de la concentration en SUDSTTAL 55 TM caen RS ES RO MES EE D nn ns nets 11 Figure 3 Influence de la temp rature sur la nitrification Henze et al 1997 11 Figure 4 Sch ma exp rimental sisis senina n a a nn Rte 13 Figure 5 Vitesse de consommation des nitrites et de production des nitrates sur diff rentes eaux RGO OO asta CR cha R esd la ee A A E aS 13 Figure 6 Lieux de pr l vements le long de la Seine Siaap 2014 modifi e 0 0 15 Figure 7 R action mise en jeu lo
40. ermet de d terminer le taux maximal ordonn e du plateau de saturation Le deuxi me axe repose sur la d termination des constantes de Michaelis Menten Le troisi me axe porte sur l influence de la temp rature sur les taux maximum d termin s dans l axe 1 Pour cela une courbe taux maximal en fonction de la temp rature sera trac e La courbe obtenue devrait th oriquement tre de la forme suivante pour des temp ratures comprises entre 0 et 25 C vmax T vmax 20 C 97 Equation 2 Les r sultats observ s permettront donc de d terminer un qui d apr s la litt rature est compris entre 1 02 1 103 Oleszkiewicz et Berquist 1988 Lessouef et al 1992 Queinnec et al 2006 R sultats Donn es Brutes Axe 1 Etude des Cin tiques Fee Axe 3 D termination des ee Influence de la Determination Temp rature sur Vitesses maximales des Km les Vitesses maximales Pente dS dt vmax S uM dS dt K vmax Temps s vmax vmax 2 Km S dS dt S Figure 11 Sch ma r capitulatif des 3 axes d interpr tation des r sultats 19 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 2 Axe 1 Etude des cin tiques 20 C d termination des taux maximum de nitrosation et nitratation IV 2 1 Rejets SAV La concentration en nitrites de l chantillon t moin diminue au cours du temps Figure 12 Dans l id al
41. es nitrites sont ils directement nitrifi s une fois le rejet de la STEP ait t oxyg n ou sont ils nitrifi s bien plus loin en Seine Nous allons pr lever deux types d eau de l eau de Seine l aval de la station Seine Centre et de l eau de sortie de d nitrification sortie du troisi me tage de la station Seine Centre Lors de l intervention sur station il faut imp rativement pr venir le PC au 2 12 31 avant de faire le pr l vement II Pr l vement Pr lever 5L d eau Pour l eau de Seine se mettre dans l axe au centre du pont et pr lever l eau l aide d un sceau Attention le sceau ne doit pas pr lever juste l eau de surface l eau du fond ou l eau des c t s Il faut arriver immerger suffisamment le sceau pour faire un pr l vement repr sentatif Pour l eau de la STEP pr lever la sortie du 3eme tage sortie de d nitrification Une fois le pr l vement effectu il faut tiqueter l chantillon Nous appellerons ESE l eau de la Seine et EDN l eau de sortie de d nitrification Il ne faut pas oublier de dater les chantillons Ex eau de seine pr lev e le 06 03 2010 sera nomm e ESE 06 03 10 2L d eau sont envoy s au laboratoire DDP pour analyses DCO DCOs DBO MES NTK NO3 NO7 NH Pt et PO 7 III Protocole un r acteur en verre de 2 5L une sonde pH O J issouss temp rature un bulleur un agitateur magn tique ave
42. essivement 10 g de sulfanilamide amino 4 benz ne sulfonamide CsHsN202S 1g de N naphthyl 1 thylenediamide dichlorohydrate NED CioH7NH CH2 CH2 NHo 2HCI 800 mL d eau milliQ 100 mL d acide phosphorique 85 Apr s dissolution compl ter 1000 mL avec de l eau milliQ 46 Annexes Ce r actif se conserve dans un flacon de verre brun obscurit et au froid 4 C il est stable plusieurs mois 5 Pr paration des chantillons la concentration des chantillons doit tre comprise entre 1 et 30 uM Pour le cas des concentrations plus faibles il est difficile de faire quoi que ce soit mais pour les chantillons dont la concentration est plus forte il convient de les diluer dans de l eau MQ L id al est de pouvoir diluer de fa on tre au milieu de la gamme au cas o la concentration de l chantillon est l g rement diff rente Pour le cas o la concentration de l chantillon est inconnue mais attendue lev e il pourra tre d pos plusieurs fois avec des facteurs de dilution diff rents Les chantillons pr ts on les d pose dans la plaque 96 puits D marche suivre 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 at of tT tT tC RE EE EE Faire le plan de la plaque sur le cahier de labo avant de commencer d poser D poser 300 uL d eau MQ en Al et A2 pour faire le blanc D poser 300 uL de chaque talon en duplicat la suite des blancs d A3 A12 Commencer d poser les ch
43. if des am nagements r alis s ces derni res ann es sur les stations d puration et les r seaux d assainissement L tude prospective men e par le SIAAP dans le but de d velopper des r seaux de mesures en continu constitue l un des grands enjeux de demain Dans ce contexte la Direction du D veloppement et de la Prospective du SIAAP a engag en 2010 en troite collaboration avec ses partenaires du PIREN Seine notamment le Laboratoire de G ochimie des Eaux Institut de Physique du Globe de Paris un projet visant d velopper des stations de mesures multi param tres Ces stations sont d velopp es dans le cadre du projet CarboSeine et permettront de suivre en continu la conductivit la turbidit la temp rature le pH les algues phyto planctoniques le phosphate l azote sous ses diff rentes formes et diff rents param tres m t o L objectif est de d velopper partir de mesures de terrain et de mod lisations une vision d ensemble du fonctionnement du syst me form par le r seau hydrographique de la Seine son bassin versant et la soci t humaine qui l investit Pour mieux conna tre les processus existants sur le milieu naturel ou l impact des stations sur celui ci des tudes en laboratoires sont aussi men es la DDP ce qui permet d avoir une expertise sur l efficacit des stations et sur l impact des STEP sur la Seine pour garantir le bon tat du milieu naturel Les compos s azot s tant l
44. igure 31 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitratation pour les diff rents sites IV 4 2 D termination du facteur de correction O Les vmax en fonction de la temp rature entre 0 et 25 C doivent normalement suivre l quation th orique vmax T vmax 20 C x er Equation 2 Cependant ce n est pas tout a fait le cas ici Le calcul de est impossible en prenant en compte toutes les donn es Si on ne prend pas en compte le point 5 C qui est plus lev que ce qui est attendu th oriquement les courbes peuvent suivre cette quation th orique pour la nitrosation a Poissy et Asni res Figure 32 Le point a 10 C a SAV est tr s lev et n a pas t pris en compte pour la r gression exponentielle y 0 9706e0 1467 R y 4 5638e0 032 0 047x y ieee R 0 4944 R 0 5088 Vmax uM h 1 5 10 15 asnieres E poissy Temp rature C Figure 32 Influence de la temp rature sur les vitesses maximales d oxydation pour la nitrosation pour les diff rents sites 10 15 20 C 33 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Les quations trouv es grace aux r gressions exponentielles permettent de calculer les vitesses maximales th oriques pour 20 et 21 C Par exemple Asni res l quation est la suivante Vmax T 1 6051 x e 47 T Avec T 21 C et 20 C On a
45. illons dop s en nitrite SAV Les chantillons E F et G sont les chantillons ot le nitrite est accumul nitratation bloqu e On observe bien cette production les pentes des droites concentrations en nitrite en fonction du temps sont positives Figure 14 Ces pentes correspondent aux vitesses avec l inhibition par le sodium chlorate y 0 9271x 273 92 y 0 6053x 278 92 y 0 7016x 276 82 Concentration en nitrites uM 10 15 E BF AG Temps h Figure 14 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en ammonium SAV Le Tableau 3 r capitule les valeurs de vitesses observ es pour les echantillon B G Tableau 3 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins SAV Dopage Activit nitrosante Activit nitratante uM uM h uM h 100 0 165 0 6053 500 4 0153 0 9271 1000 9 5429 0 7016 21 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Les formules vues pr c dement pour calculer les activit s nitrosante et nitratante ont t utilis es Les valeurs du Tableau 4 ont ainsi t obtenues en soustrayant le Tableau 2 du Tableau 3 Tableau 4 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons SAV Dopage 1M D prt a 100 1 38 2 15 500 0 31 4 63 1000 2 77 7 47 Les courbes de Michaelis Men
46. ion sur les trois sites 35 Tableau 15 Tableau bilan des constantes d termin es 0 eee ee cess cee ceecsseeeteeeeeenaee 36 Tableau 16 Valeurs de constantes vmax et Km d termin es sur des eaux de Seine dans la litt rat re 2 0 i ices Se fhe ah al Bde ST nn ent te la Se ian Get ASS nr assise 36 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 Mode op ratoire des exp riences r alis es en 2010 Le Roch 2010 4 Annexe 2 Protocole du dosage des nitrites par colorim trie 45 Remerciements REMERCIEMENTS Je souhaite remercier Monsieur Olivier Rousselot Directeur de la DDP pour m avoir permis de r aliser mon stage au sein de sa Direction Je remercie Madame Catherine Paffoni Ing nieur Hydrologue Divisionnaire et responsable du service expertise et prospective process et milieu naturel pour m avoir accueillie dans son quipe Je remercie galement Monsieur Vincent Rocher Ing nieur de Recherche pour son implication et son aide dans mes diff rentes tudes faites au sein de son quipe Je tiens remercier tout particuli rement Julien Pouillaude technicien de recherche et encadrant de mon stage J ai pu effectuer un stage dans de tr s bonnes conditions Son implication et ses conseils m ont norm ment aid e tout au long de mon stage Merci galement Anthony Aug ing nieur au LGE IPGP qui s est beaucoup int ress aux
47. ire et en milieu naturel La mise en service d une nouvelle sonde de mesure haute fr quence n cessite plusieurs phases de test et de validation avant d tre plac e en Seine La sonde WIZ permettant de mesurer les compos s azot s est donc en phase de test depuis 2013 Celle ci a t corrig e en octobre 2013 par le constructeur suite des disfonctionnements observ s lors des premiers tests en laboratoire La phase en laboratoire 2014 a montr des r sultats tr s satisfaisants La sonde permet de mesurer des concentrations jusqu 2 mg NO L avec une surestimation moyenne de 4 50 mgNO3 L avec une sous estimation moyenne de 15 et 4 mg NH4 L avec une sous estimation moyenne de 9 soit la gamme maximale susceptible d tre rencontr e en Seine Ces bon r sultats sont obtenus condition qu chaque changement de r actifs pr par s par nos soins la calibration soit v rifi e et si besoin corrig e Pour cela on analyse deux solutions talons pour chaque param tre un blanc et une concentration connue La nouvelle densit optique moyenne des triplicatas est alors rentr e Cependant il faut s assurer que la pr cision soit de 10 entre les trois triplicatas et que la justesse soit comprise dans l intervalle 20 avec le pr c dent talonnage La sonde a ensuite t test e en hall d essai qui permet de s approcher des conditions en Seine Ces tests ont t concluants en donnant des r sultats
48. le et complexe L Eau I Industrie les Nuissances 344 80 83 SIAAP 2014 Tableau de bord La qualit de la Seine aujourd hui http www siaap fr tableau de bord 39 R f rences bibliographiques Stein L Y Arp D J 1998 Loss of ammonia monooxygenase activity in nitrosomonas europaea upon exposure to nitrite Appl Environ Microbiol 64 p4098 4102 Van Leeuwen F X 2000 Safe drinking water the toxicologist s approach Food and Chemical Toxicology 38 Supplement 1 S51 S58 Vigne E 2007 Etude et mod lisation dynamique d un proc d par biofiltration en nitrification tertiaire Th se de doctorat en g nie civil l universit de Laval Vilmin L Raimonet M Flipo N Poulin M Cazier T Laverman A 2013 Determination de param tres de croissance et de biomasses de communaut s microbiennes nitrifiantes Mod lisation pluri annuelle de la dynamique des nitrites en Seine rapport PIREN Seine phase 6 29 pages Winogradsky S 1890 Recherches sur les organismes de la nitrification Ann Inst Pasteur 1 213 231 40 Annexes ANNEXES Annexe 1 Mode op ratoire des exp riences r alis es en 2010 Le Roch 2010 I Descriptif L enjeu de cette analyse est la d termination de la capacit nitrifiante de la Seine Nous voulons connaitre le devenir des nitrites dans la Seine En effet les STEP rejettent des nitrites produits lors d une d nitrification partielle C
49. nitrites nitrates was tested in the laboratory and in recreated real conditions before considering deploying it in the Seine Tests showed that this probe was functional and will be tested in the Seine in 2015 A second collaboration with the PIREN Seine made possible to study the kinetics in situ of nitrification in Seine This study focused on three different sites downstream from Paris one upstream from the wastewater of Seine Aval SAV Asni res at the wastewater of SAV and downstream from SAV Poissy The data does not give very good results The rates of nitritation and nitratation are low the difference of nitrite concentration during 24h is not very high and the error in the concentration measurement could be important However this study establishes a procedure that will allow future data study and determine several important parameters to better understand the dynamics of nitrogen compounds and their future in the Seine This will be useful and it will help to improve the prediction of concentrations of nitrite nitrate and ammonium in Seine Keywords Water quality Seine Nitrogen probe Continuous measurement kinetics Nitrification Sommaire SOMMAIRE TABLE DES MATIERES ABSTRACT sadveisestivincasecisdsnosecsedssedasasucsdvindedsiacisvetcvsedscsdsdeysstciibdesoluvivaule tubseucucspassbsedesoaveass 1 SOMMAIRE cisccsskscnstvickdanessscuietunvanshwovsssbsdviesscahasbessbocnstsnshgndkashsSuieksesnubecganeanseassase
50. nne particuli re et un en aval de Seine Aval Cela permet d valuer l impact de la station sur la communaut bact rienne de la Seine Figure 6 Sur chaque site 15L d eau ont t pr lev s et conserv s 4 C jusqu l exp rimentation Cou EN A Seine centre S La Briche Poissy Seine Gr sillons Seine Mor e SS A USINES DE DEPOLLUTION EMISSAIRES us RETRAITEMENT BASSINS DE STOCKAGE TUNNELS RESERVOIRS POINTS DE PRELEVEMENT Figure 6 Lieux de pr l vements le long de la Seine Siaap 2014 modifi e IIL2 Sch ma exp rimental L exp rience consiste d terminer des activit s potentielles de nitrosation et nitratation Pour cela on suit la concentration en nitrites dans des chantillons enrichis soit en nitrite soit en ammonium Le sch ma exp rimental suivi pour les diff rentes temp ratures est le suivant Ech A 1000 uM de KNO 100 uM d allylthiour e 500 uM de sodium chlorate gt t moin Ech B 100 uM de KNO 100 uM d allylthiour e Ech C 500 uM de KNO 100 uM d allylthiour e Ech D 1000 de KNO 100 uM d allylthiour e Ech E 100 uM de NHCI 800 uM de sodium chlorate Ech F 500 uM de NHCI 500 uM de sodium chlorate Ech G 1000 uM de NHACI 500 uM de sodium chlorate Chaque chantillon est fait en triplicat et ceux ci sont nomm s avec les indices 1 2 et 3 15 D termination des cin tiques in situ p
51. nts types d eau en Seine ainsi que de calculer les constantes de Michaelis Km Cette tude a fait l objet d un rapport technique interne au SIAAP d un poster et d un mode op ratoire allant du pr l vement jusqu l exploitation et le traitement des donn es Ce rapport se concentrera par la suite sur cette tude qui a permis d obtenir une m thode de mesure des constantes Km et vmax de nitrosation et de nitratation en les d terminant pour diff rents sites en Seine et diff rentes temp ratures D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine DETERMINATION DES CINETIQUES IN SITU POUR LES REACTIONS DE NITROSATION ET NITRATATION DANS LA SEINE I RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE L1Etat de l art 1 1 1 Rappel sur le cycle de l azote Le cycle de l azote est un cycle biog ochimique important dans l environnement Il est particuli rement tudi car le nitrite toxique pour les esp ces aquatiques faibles concentrations intervient dans ce cycle Lewis et Morris 1986 Le devenir des compos s azot s est donc un probl me environnemental majeur Les deux r actions principales mises en jeux sont la d nitrification et la nitrification La colonne d eau tant le plus souvent en a robiose la nitrification est le principal processus impliqu dans la dynamique du nitrite dans la Seine Figure 1 Cazier et al 2014 En a robi
52. ose nitrification AN nitrosation mN __nitratation TN gt NH NOs ora NO ee ae mr N a d nitrification En ana robiose 5 w20 D 77 N Na QS Figure 1 sch ma simplifi du cycle de l azote Grouz et al 2013 Les compos s azot s en Seine proviennent de deux sources industrielle et agricole Les nitrates sont majoritairement issus de l agriculture et migrent des sols vers les eaux Les compos s azot s r duits tels que l ammonium et les nitrites proviennent majoritairement des rejets d eaux domestiques La station d puration du SIAAP Seine Aval SAV avec une capacit puratoire de 1 500 000 m j traite la charge ammoniacale d abord par nitrification puis d nitrification Cette charge a consid rablement diminu la concentration en ammonium depuis 2007 Cependant la concentration en nitrites apport e par SAV reste lev e ce qui pose un probl me majeur le nitrite tant toxique Rocher et al 2011 En effet le nitrite est responsable de formations mutag nes et canc rig nes lors de la digestion et provoque des d ficiences respiratoires chez les tres vivants Stein and Arp 1998 Van Leeuwen 2000 Par exemple la maladie M th moglobin mie est caus e par une forte consommation de nitrates et de nitrites dans les eaux de boisson Les nouveaux n s y sont particuli rement sensibles Syndrome du b b bleu OMS 2014 Il peut aussi inhiber certaines activit s ba
53. our les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine L allylthiour e permet d observer le potentiel de consommation des nitrites en bloquant la r action de nitrosation Le sodium chlorate permet d observer le potentiel de production des nitrites en bloquant la r action de nitratation Figure 7 Allylthiour e Sodium Chlorate Nitrosation Nitratation NH 2 NO 36 gt NO Figure 7 R action mise en jeu lors de l exp rience Les chantillons sont incub s sous agitation l obscurit et temp rature constante jusqu 24h Figure 8 Pour chaque site de pr l vement l exp rience est r p t e pour des temp ratures de 5 C 10 C 15 C 20 C et 30 C pour pouvoir valuer l influence de la temp rature sur les cin tiques Figure 8 Photo des chantillons incub s sous agitation obscurit temp rature ambiante II 3 Dosage des nitrites par colorim trie On pr l ve 5 mL d chantillon que l on filtre 0 45 um Une dilution est n cessaire pour le dosage colorim trique suivant le dopage de l chantillon Ces facteurs ont t d termin s en prenant en compte la concentration du dopage et la concentration initiale en nitrite qui a t estim e grossi rement L objectif de ces dilutions est donc de faire retomber les concentrations de nos chantillons dans notre gamme de mesure situ e entre 1 et 30 uM AetD dilution 1 100 eau de rejet SAV 1 50 eau de seine Poi
54. r la nitratation sont l g rement diff rentes selon les sites En effet on observe la m me tendance pour les trois sites le Km diminue avec l augmentation de la temp rature puis r augmente Cependant le km le plus faible est aux alentours de 20 C pour Poissy et SAV alors qu il est aux alentours de 10 C pour Asni res Une faible valeur de Km signifie une plus grande affinit avec le substrat Ainsi les temp ratures les plus propices au processus de nitrification seraient 20 C pour Poissy et SAV et 10 C pour Asni res Figure 29 Km uM 10 15 20 asnieres poissy Asav Temp rature C Figure 29 Variation de la constante de Michaelis de nitratation le long de la Seine en fonction de la temp rature 31 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 4 Axe3 Influence de la Temp rature sur les taux maximaux IV 4 1 Profils des Vitesses maximales en fonction de la temp rature Les constantes vmax ont t d termin es par r gression logarithmique pour les diff rentes temp ratures Tableau 13 Tableau 13 Tableau bilan des param tres vmax d termin s pour les diff rentes temp ratures temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b 30 C Asni res vmax 2 47 2 30 2 25 0 73 5 45 1 62 nitrosation vmax 11 41 10 35 12 35 5 10 2 36 12 01 nitratation temp rature 5 C 10 C 15 C 20 C a 20 C b
55. r un plateau Changer de m thode de mesure pour les nitrites pourrait tre utile pour diminuer les dilutions n cessaires Ce stage s est donc concentr sur l tude des compos s azot s en Seine dans un premier temps sur la mise en uvre de sonde in situ permettant le suivi de la concentration en nitrite nitrate et ammonium pas de temps fin et dans un deuxi me temps sur l tude des cin tiques de la nitrification qui permettent de mieux conna tre le devenir de l azote en Seine 37 R f rences bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Billen G Garnier J 2009 Eutrophisation des cours d eau du bassin de la Seine Programme PIREN Seine 6 44 pages ISBN 978 2 918251 05 7 Brion N Billen G 1998 Une r evaluation de la m thode d incorporation de H14CO3 pour mesurer la nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bact ries nitrifiantes Rev Sci Eau 11 283 302 Cazier T Raimonet M Rocher V Viollier Eric Roose Amsaleg C Garnier J Laverman A 2014 Impact de l agglom ration Parisienne sur la communaut nitrifiante et la dynamique du nitrite de la Seine Rapport PIREN Seine phase 6 19 pages C bron A 2004 Nitrification Bact ries Nirifiantes et mission de N20 Th se de doctorat l universit Pierre et Marie Curie sp cialit Ecologie Microbienne Sciences de l eau C bron A Garnier J 2005 Nitrobacter and Nitrospira gene
56. ra as representatives of nitrite oxidizing bacteria Detection quantification and growth along the lower Seine River France Water Research 39 4979 4992 Ciudad G Werner A Bornhardt C Munoz C Antileo C 2006 Differential kinetics of ammonia and nitrite oxidizing bacteria A simple kinetic study based on oxygen affinity and proton release during nitrification Process Biochemistry 41 1764 1772 Grouz N A Billen G Garnier J Mercier B Martinez A 2013 Nitrification et dynamique des formes de l azote dans la Seine et son estuaire suite aux changements du traitement des eaux us es a Paris comparaison entre les p riodes 2001 2003 et 2011 2013 rapport PIREN Seine phase 6 19 pages Henze M Harremo s P La Cour Jansen J Arvin E Wastewater treatment biological and chemical processes 1997 Springer ISBN 3 540 62702 2 Jim nez E Gim nez J B Ruano M V Ferrer J Serralta J 2011 Effect of pH and nitrite concentration on nitrite oxidation rate Bioresource Technology 102 8741 8747 Knowles G Downing A L Barrett M J 1965 Determination of kinetic constants for nitrifying bacteria in mixed culture with the aid of an electronic computer J gen Microbiol 38 268 278 38 R f rences bibliographiques Le Roch C 2010 Probl matique nitrites de la station d puration au milieu naturel rapport master SAGE SIAAP 102 pages Lesouef A Payraudeau M Rogalla F and Kleiber B
57. rature ambiante et trois seront faites basse temp rature Pour l eau en sortie de d nitrification nous ferons trois suivis temp rature ambiante sonde pH et bulleur conductivit Sch ma de la manipulation pr leveur temp rature ambiante magn tique 42 Annexes sonde pH et bulleur conductivit pr leveur Sch ma de la manipulation basse temp rature enceinte r frig r e 4 C magnetique Avant de pr lever nous relevons la temp rature le pH et la concentration en oxyg ne dissous dans le r acteur Nous pr levons 10mL 15mL dans la jarre l aide du tuyau Pour cela mettre la seringue au bout ouvrir la pince et faire un vas et viens avec la seringue pour chasser l eau stagnante dans le tuyau Pr lever l eau La filtrer l aide des cartouches filtrantes Verser l eau filtr e dans un b cher Ammonium pr lever 0 5 mL de l eau filtr e avec une micropipette de 1000 uL placer l eau dans le tube essai ajouter une dose de r actif fermer le tube et agiter vigoureusement jusqu dissolution totale du r actif laisser reposer 15 minutes et mesurer Nitrate pr lever 0 5mL de l eau filtr e avec une micropipette de 1000 uL placer l eau dans le tube essai ajouter 1ImL de r actif NO3 1K boucher le tube et m langer Attention la r action est exothermique
58. rites et nitrates dans les eaux de rejet ne varient presque pas Cela s explique par les bio filtres qui retiennent les communaut s bact riennes qui se situent avant le rejet en seine Figure 5 Boerte NO2 Maain NO3 O1 Eau de Eau de Eau de rejet Eau de rejet blanc Seine 4 C Seine 20 C Seine Centre Pilbio pente mg L 1 j on Figure 5 Vitesse de consommation des nitrites et de production des nitrates sur diff rentes eaux Le Roch 2010 Cette tude permet d avoir une vision globale sur le devenir des nitrites en Seine Mais elle ne permet pas une tude pr cise des deux tapes de la nitrification Les deux tapes de la nitrification sont consid r es en m me temps L identification des diff rentes bact ries responsables de la nitrosation et la nitratation ont permis d apporter des connaissances plus sp cifiques sur les cin tiques mises en jeu lors de la nitrosation et la nitratation en Seine En effet les nouveaux protocoles utilis s permettent d inhiber les r actions voulues pour tudier les deux r actions s par ment 13 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine II OBJECTIFS DE L ETUDE L tude a pour objectif principal de suivre les 2 tapes de la nitrification s par ment le long de la Seine en inhibant une des deux r actions Pour ceci un mode op ratoire a t mis en place
59. robl mes dus a la conception de la sonde et rencontr s lors de la phase en hall d essai devront tre adapt es pour le site CarboSeine de Bougival Cette tude a fait l objet d un poster et d un rapport technique interne au SIAAP II 2 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Le cycle de l azote est un cycle biog ochimique majeur dans l environnement en partie r gi par l activit bact rienne Ce cycle dans les eaux de surface est perturb par les pollutions domestiques malgr les traitements subis par les eaux us es en station d puration Ces pollutions sont d autant plus importantes en milieu fortement anthropis comme le bassin de la Seine Deux r actions principales interviennent dans le cycle de l azote la nitrification et d nitrification milieu anoxique La nitrification est donc la principale r action en Seine milieu oxyg n sauf rares exceptions Cette r action transforme l ammonium en nitrates avec en interm diaire le nitrite qui est une forme toxique de l azote Les communaut s bact riennes produisant du nitrite sont diff rentes des communaut s bact riennes qui en consomment La cin tique de ces r actions est d pendante de la temp rature et des communaut s bact riennes pr sentes L tude de la cin tique des nitrites permettra donc de mieux comprendre le milieu naturel et l impact de la temp rature sur diff re
60. rs de l exp rience 0 cee ceeceesceesseceeeceneceeeeeeseeenseeneenees 16 Figure 8 Photo des chantillons incub s sous agitation l obscurit temp rature ambiante 16 Figure 9 Sch ma de la microplaque 96 puits analyser 17 Figure 10 Courbe de calibration de la gamme d talonnage eeceeeeeeeeeeteeeeteeeteeeees 17 Figure 11 Sch ma r capitulatif des 3 axes d interpr tation des r sultats 10 0 0 eee 19 Figure 12 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin A 20 Figure 13 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en nitrite SAV 21 Figure 14 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en ammonium SAV 21 Figure 15 Activit en fonction de la concentration SAV 22 Figure 16 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin Poissy 23 Figure 17 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en nitrites Poissy 23 Figure 18 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en ammonium Poissy 24 Figure 19 Activit en fonction de la concentration Poissy 0 eeeeeeeeeeeereeeeeeeeeeeees 25 Figure 20 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin Asni res 25 Figure 21 Concentration en fonction du temps des chantillons dop s en nitrite Asni res 26 Figure 22 Concentration en fonction du temps
61. s d termin es 3 temps diff rents Oh t0 4h t4 22h t22 permettent de calculer les cin tiques de nitrosation et nitratation Pour cela les concentrations moyennes des triplicats ont t trac es en fonction du temps La pente des droites obtenues par r gression lin aire correspond a la vitesse de consommation ou de production de nitrite Ces vitesses vont permettre de calculer les activit s nitrosantes et nitratantes grace aux formules suivantes C bron 2004 Activit nitrosante lvitesse t moin vitesse inhibition avec l allylthiour e Activit nitratante lvitesse inhibition avec le sodium chlorate vitesse t moin 17 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine La vitesse t moin est tablie gr ce l chantillon A pour un dopage en de nitrite de 1000uM Elle est ensuite recalcul e pour les diff rents chantillons B a G en supposant que la vitesse t moin est proportionnelle au dopage Les activit s nitrosante et nitratante peuvent tre trac es en fonction de la concentration initiale de substrat Pour tracer ces courbes chaque point repr sente la moyenne des triplicats Ces courbes sont les courbes de Michaelis Menten Elles permettent de d terminer Km et vmax La vitesse vmax est d termin e par le plateau que l on observe sur la courbe C est la vitesse maximale d oxydation atteinte Le Km se trouve en lisant l
62. ssy Asni res B dilution 1 20 eau de rejet SAV 1 10 eau de seine Poissy Asni res C dilution 1 40 eau de rejet SAV 1 20 eau de seine Poissy Asni res E Fet G dilution 1 20 eau de rejet SAV 1 10 eau de seine Poissy pas de dilution a Asni res 16 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine Le dosage des nitrites par colorim trie se fait suivant un protocole avec la pr paration d une gamme talon et de r actifs NED et SAA Annexe 2 Une microplaque est alors remplie avec 300 uL d chantillon 30uL de r actif pour tre analys e Figure 9 BI BI Etl Etl T A sim ID Oo w gt Figure 9 Sch ma de la microplaque 96 puits analyser L analyse se fait par le logiciel control du spectrostar nano Le r sultat est en absorbance La courbe de calibration est trac e avec la gamme d talonnage concentration en fonction de l absorbance Figure 10 La r gression lin aire avec for age par O permet de calculer la concentration des chantillons par la formule suivante Concentration de l chantillon Absorbance x pente de la courbe d talonnage x facteur de dilution y 24 356x R 0 9983 Concentration en nitrite uM Absorbance Figure 10 Courbe de calibration de la gamme d talonnage II 4 Traitement des donn es brutes Les concentration
63. ten ont t trac es en prenant en abscisse la concentration initiale en nitrite ou le dopage en ammonium la concentration initiale en ammonium n tant pas connue et en ordonn e la valeur absolue de l activit e nitrosante ou nitratante ce qui permettra d avoir les deux courbes sur un m me graphique avec une chelle positive Une regression logarithmique a t trac e pour les courbes de Michaelis Menten Cependant le coefficient de corr lation pour la nitrosation est tr s faible Figure 15 Les vitesses maximales de nitrosation est de nitratation sont d termin e par les formules suivantes vmax nitrosation 0 7878 x In 2000 3 8161 2 17 uM h vmax nitratation 2 1735 x In 2000 8 0915 8 43 uM h y 2 1735In x 8 0915 y 0 7878In x 3 8161 R 0 2236 9 ass 1000 1500 Activit uM h nitrosation Mnitratation Concentration initiale en nitrites nitrosation ou en ammoniums nitratation uM Figure 15 Activit en fonction de la concentration SAV 9 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine IV 2 2 Eau de Seine Poissy Le T moin ici est relativement stable dans le temps a avec une pente positive tr s faible Figure 16 uM y 0 993x 997 44 Concentration en nitrites Temps h Figure 16 Concentration en fonction du temps de l chantillon t moin Poissy Le Tableau 5
64. tion du temps des chantillons dop s en ammonium Poissy Le Tableau 6 r capitule les valeurs de vitesses observ es pour les chantillons B G Tableau 6 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins Poissy Dopage activit nitrosante activit nitratante uM uM h uM h 100 1 8706 1 8491 500 5 0127 2 4189 1000 8 375 4 7244 Tableau 7 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons Poissy Les activit s nitrosante et nitratante sont calcul es comme pour SAV Tableau 7 Dopage uM activit nitrosante activit nitratante uM h uM h 100 1 97 1 72 500 5 51 1 94 1000 9 37 3 73 Les courbes de Michaelis Menten pour la nitrosation et la nitratation ont un coefficient de corr lation correcte Figure 19 Les vmax ont t d termin s avec la m me m thode que SAV vmax nitrosation 3 502 x In 2000 16 115 10 50 uM h vmax nitratation 0 7668 x In 2000 2 0837 3 74 uM h 24 D termination des cin tiques in situ pour les r actions de nitrosation et nitratation dans la Seine y 3 502In x 16 115 WM y 0 7668In x 2 0837 R 0 6538 Activit uM h 500 1000 nitrosation Mnitratation Concentration initiale en nitrite nitrosation ou en ammonium nitratation uM Figure 19 Activit en fonction de la concentration Poissy IV
65. ure en r alisant par exemple des triplicats pour les dilutions et en analysant trois fois l chantillon sur trois microplaques diff rentes Il serait alors possible d valuer l erreur sur la dilution et sur la lecture de la microplaque Les r sultats ne sont pas coh rents pour tous les chantillons Les chantillons ont pr sent des r sultats qui semblent corrects et proches des r sultats trouv s dans la litt rature pour la nitratation en particulier Poissy Les r sultats de la nitrosation taient plus lev s que dans la litt rature Cette tude a permis au SIAAP de se familiariser aux techniques de d termination des constantes cin tique Elles permettent d avoir une premi re approche tr s int ressante du devenir des nitrites compos sensible actuellement en Seine Ces constantes telles que Km vmax et alimentent tr s souvent des mod les de pr diction du devenir de l azote Ces mod les de pr diction sont tr s utiles au SIAAP pour am liorer la gestion des stations d puration qui permettent de limiter l impact des rejets domestiques sur la Seine et de garantir le bon tat du cours d eau Cette tude a aussi permis d appr cier la difficult de ce type de manipulation Des travaux sont encore r aliser afin d am liorer la robustesse et la r p tabilit de l exp rience Il serait par exemple possible de faire durer l exp rience un peu plus longtemps sur 48h ou 72h pour bien observe
66. xp riences ont permis d avoir une premi re approche sur la cin tique du nitrite en milieu aquatique faibles concentration en substrat et bacteries En effet de nombreuses tudes existent sur des matrices ayant de fortes populations bact riennes nitrosante et nitratante Par exemple l tude de Ciudad et al 2006 d termine les param tres umax et Km par les diff rences d affinit pour l oxyg ne lors de la nitrosation et la nitratation sur de la biomasse Une tude a aussi tudi les cin tiques du nitrite en fonction du pH sur des boues activ es Jim nez et al 2011 Plusieurs articles r cents ont pu d terminer des max et Km Tableau 1 Les publications sur l tude des cin tiques en milieu naturel sont plus rares Une tude a cependant t faite en 1965 par Knowles et al sur des eaux de la Tamise Elle a permis par suivi de la concentration en nitrite et traitement informatique de calculer des constantes Km et vmax Les tudes r centes de Vilmin et al 2013 et Raimonet et al 2014 d terminent les activit s potentielles de nitrosation et nitratation en fonction de concentration initiales diff rentes ce qui permet d obtenir des Km et vmax sur des eaux de Seine du bassin parisien Tableau 1 Valeurs de Km et umax trouv es dans la litt rature Communaut nitrosante communaut nitratante km vmax vmax eau de Seine Asni res 4 4 10 13 uM 0 06 uM h 3 8 uM h Raimonet 20 C H H et al 2014 eau
67. ydation pour la nitratation pour les diff rents sites 10 15 20 Chanel dia atout aires 34 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 Valeurs de Km et umax trouv es dans la litt rature ee eee eeeeeeeeteeeeeteeeees 12 Tableau 2 Vitesses t moins pour les diff rents dopages SAV 20 Tableau 3 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins SAV 21 Tableau 4 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons SAV 22 Tableau 5 Vitesses t moins pour les diff rents dopages Poissy sseeeeeeeeteeeeteeeees 23 Tableau 6 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins Poissy 24 Tableau 7 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons Poissy 24 Tableau 8 Vitesses t moins pour les diff rents dopages Asni res 25 Tableau 9 Activit s nitrosantes et nitratantes sans prendre en compte les t moins Asni res 26 Tableau 10 Activit s nitrosantes et nitratantes pour les diff rents chantillons Asni res 27 Tableau 11 Tableau r capitulatif des vitesses maximales 20 C oo eeeeeeeeseeeeeeeteeeees 28 Tableau 12 Tableau bilan des param tres Km d termin s pour les diff rentes temp ratures 30 Tableau 13 Tableau bilan des param tres vmax d termin s pour les diff rentes temp ratures 32 Tableau 14 Facteurs de correction pour la nitrosation et la nitratat

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