Détection quantitative du soja Roundup Ready® par ELISA
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1. ES JRC jp EUROPEAN COMMISSION er n and Consumer Protection Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA F Eyquem WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALB RO F R EUROPA BCEMUPHAS OPTAHU3ALUS 3JPABOOXPAHEHUS EBPOTIE CKOE PETHOHAJBHOE BIOPO D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 2 Table des mati res Session 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA INTRODUCTION 3 LA TECHNIQUE ELISA 8 EXPERIMENTATIONS 11 REFERENCES 22 Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 3 Introduction La d tection immunologique sp cifique d une nouvelle prot ine synth tis e par un g ne introduit au cours d une transformation constitue une approche alternative pour l identification de plantes g n tiquement modifi es Il est noter toutefois qu une modification g n tique n est pas toujours sp cifiquement ax e sur la production d une nouvelle prot ine et ne g n re pas syst matiquement des niveaux d expression prot inique suffisants pour tre d tect s Par ailleurs certaines prot ines peuvent tre exprim es un2. une solution d arr t A la fin de la p riode d incubation ajouter 100 ul de solution d arr t chaque cupule pipeter la solution d arr t dans la m me s quence que l ajout du r actif de couleur L ajout d une solution d arr t doit tre effectu sans interruption Prot ger la plaque de microtitration contre les rayons du soleil sans quoi cela influerait sur l intensit de la couleur Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 20 Lecture de l absorbance A laide d un lecteur de plaque de microtitration quip d un filtre permettant d effectuer une lecture 450 nm mesurer l absorbance de chaque cupule d essai Tous les relev s doivent tre effectu s dans un d lai de 30 minutes suivant l ajout de la solution d arr t Enregistrer les r sultats obtenus et calculer les valeurs d absorbance moyennes ou utiliser un programme informatique cet effet Evaluation Les valeurs des talons doivent tre utilis es pour r aliser la courbe d talonnage La valeur du blanc doit tre t e de l ensemble des valeurs pour les chantillons et talons de r f rence Les valeurs corrig es moyennes de chaque point de r f rence en double doivent tre utilis es pour r aliser la courbe d talonnage Les donn es moyennes de chaque chantillon en dupliqu t doivent ensuite tre utilis
3. IgG sont bivalents dans leurs r actions avec les antig nes et ont la capacit de ponter ces derniers e les antig nes sont souvent multivalents dans leurs interactions avec les anticorps e les anticorps s riques sont g n ralement polyclonaux et e les anticorps sont extr mement sp cifiques en termes de structures qu ils reconnaissent au niveau des mol cules antig niques Figure 1 Courbe de pr cipitation d un syst me comprenant un antig ne et ses anticorps a b ANTISERUM POLYCLONAL na ANN n a D r K G Myoglobine yogro i AN at 4 S D S GA de th f Zone d exc s Zone Zone d exc s SS 3 C gt S D d anticorps d quivalence d antig nes Exc s d anticorps ce US SR E Surnageants lt NC re Exc s d antig nes ANTICORPS MONOCLONAL Pii Anticorps pr cipit Z Po 7 N A m Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 5 La repr sentation graphique de la quantit d anticorps pr cipit s par rapport la concentration croissante d antig nes pour un total d anticorps constant r v le trois zones Une zone d exc s d anticorps dans laquelle la pr cipitation est inhib e et l exc s anticorps peut tre d tect dans le surnageant Une zone d quivalence de pr cipitation maximale dan
4. chantillon Pour le contr le n gatif extrait pour chaque contr le positif extrait et pour chaque chantillon deux tubes essai de 12 X 75 mm sont n cessaires pour effectuer la dilution Pipeter 280 ul du tampon d essai de soja dans l un des tubes essai de 12 x 75 mm Pipeter 380 ul du tampon d essai de soja dans l autre tube essai de 12 x 75 mm Etiqueter le tube de 280 ul tube 1 15 et celui de 380 ul 1 300 Pipeter 20 ul de chaque extrait d chantillon dans le tube tiquet 1 15 et vortexer Transf rer 20 ul du tube 1 15 m lang vers celui tiquet 1 300 et vortexer Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 18 R p ter ces tapes pour le contr le n gatif chaque r f rence positive et les extraits d chantillon Proc dure d immuno essai ELISA G n ralit s Le kit d essai ELISA peut tre op r dans diff rents formats en utilisant n importe quel num ro de bandes de 8 cupules Il est recommand de suivre un plan de chargement al atoire Deux exemplaires sont n cessaires pour l ensemble des cupules de r action et la valeur d absorbance moyenne de chaque cupule est calcul e Chaque op ration comprend le blanc tampon d essai le contr le n gatif et les talons de r f rence positifs Lorsqu un essai est entam toutes les tapes
5. doivent tre effectu es sans interruption Ajout d chantillon Ajouter 100 lil d extraits dilu s ainsi que le blanc aux cupules appropri es Utiliser des pointes jetables s par es pour chaque tape de pipetage afin d viter toute contamination crois e Couvrir la plaque avec un film en plastique ou une feuille d aluminium afin d viter toute contamination ou vaporation Incubation de l chantillon Incuber la plaque de microtitration 37 C pendant 1 heure Lavage Laver 3 fois l aide de 300 yl de tampon de lavage Lavage manuel Vider les cupules en les retournant au dessus d un vier ou d un r cipient appropri A l aide d une pissette de 500 mi contenant une solution de lavage de travail remplir chaque cupule ras bord laisser reposer pendant 60 secondes puis vider la plaque comme d crit ci dessus R p ter l tape de lavage 3 fois Eliminer le liquide r siduel ainsi que les bulles en tapotant l envers sur plusieurs couches de papier Eviter toute chute des bandes hors du cadre en utilisant du ruban adh sif Lavage automatique A la fin de la p riode d incubation aspirer le contenu de l ensemble des cupules l aide d un nettoyeur de microcupule puis remplir les Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 19 cupules avec du tampon de lavage R p t
6. laboration de m thodes de d tection immunologiques est de disposer d anticorps extr mement sp cifiques dirig s contre la nouvelle prot ine d tecter Par ailleurs l chantillon ou les prot ines d int r t ne doivent pas tre d grad s de fa on significative Les anticorps sont des outils puissants qui permettent aux biologistes de d tecter et de quantifier les antig nes dans des m langes complexes Tous les immuno essais sont bas s sur la fixation sp cifique d un anticorps un antig ne Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 4 Interactions anticorps antig ne Lorsque les immunologistes d crivent les propri t s des anticorps en tant prot ines la plupart incluent une description de la capacit de ces mol cules pr cipiter des antig nes dans une solution m me si la pr cipitation d anticorps n est d sormais que rarement utilis e pour isoler ou d tecter des antig nes exp rimentalement et les anticorps pr cipitent rarement les antig nes in vivo except dans certaines maladies auto immunes La valeur p dagogique de la r action de pr cipitation des anticorps comme illustr la Figure 1 est qu elle refl te parfaitement un grand nombre de propri t s fondamentales et universelles des anticorps Cette technique d montre entre autres que e les anticorps s riques
7. prot ines Les donn es indiquent que des 1 Le kit d crit dans ce module tait le seul protocole homologu disponible dans le commerce au moment o les formations taient organis es et ce Manuel pr par Le CCR et l OMS ne promeuvent en aucun cas une marque sp cifique de kits disponibles dans le commerce Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 12 temp ratures de traitement ne d passant pas 65 C pendant au maximum 60 minutes permettent une d tection fiable des prot ines Cette m thode a t valid e pour la d tection de la prot ine CP4 EPSPS et peut tre mise en uvre afin de d terminer la concentration de la prot ine dans l chantillon dans une gamme allant de 0 3 5 pds pds en utilisant des mat riaux de r f rence sp cifiques Le kit peut galement tre op r des niveaux de d tection plus bas de 0 05 0 3 en utilisant un protocole modifi Equipement Tubes centrifuges coniques de 15 ml en polypropyl ne Eprouvettes en verre de 12 X 75 mm Film en plastique ou feuille d aluminium Bande de plastique ou nettoyeur de plaque manuel Pissettes par ex 500 ml Pipettes de pr cision capables de fournir de 20 ul 500 HI Agitateur vortex Coupelles ou quivalents Spatules Balance capable d effectuer des mesures de 0 01 g Centrifugeuse avec une capacit de 5000 1
8. 0000 tr mn Lecteur de plaque de microtitration capable de relever l absorbance 450 nm Incubateur capable de maintenir une temp rature de 37 C Tamis avec ouverture de 450 um ou quivalent Tamis avec ouverture de 150 um maille 100 ou quivalent Pipette multicanaux par ex de 50 pl 300 pl en option R servoirs r actif pour distribution multicanaux en option Nettoyeur de plaque automatique en option Portoirs pour tubes centrifuges de 15 ml en option Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 13 R actifs G n ralit s Sauf sp cification contraire utiliser exclusivement durant l analyse des r actifs de cat gorie analytique convenable et de l eau d ionis e ou distill e Toute d viation par rapport aux crit res de performance d finis peut indiquer un manque de stabilit des r actifs Si les composants du substrat ont d j chang de couleur passant de clair bleu ce r actif doit tre limin N utiliser en aucun cas de solution tampon trouble Tous les composants du kit doivent tre stock s une temp rature comprise entre 2 C et 8 C La dur e de vie des composants du kit est indiqu e cf la date limite En fonction des essais de stabilit dans des conditions de d gradation acc l r e la date d expiration du kit d essai a t fix e 9 mois une temp rat
9. aract ristique d immortalit et la capacit de produire la substance souhait e nous disposons de fait d un syst me capable de produire des anticorps en permanence Dans la technologie des anticorps monoclonaux des cellules tumorales pouvant se reproduire continuellement sont fusionn es avec des cellules de mammif res produisant des anticorps Cette fusion cellulaire engendre un hybridome qui produira continuellement des anticorps Ces anticorps sont qualifi s de monoclonaux parce qu ils proviennent d un seul type de cellule la cellule hybridome en revanche les anticorps produits par les m thodes conventionnelles d coulent de pr parations contenant de nombreux types de cellules c est la raison pour laquelle on les qualifie de polyclonaux Un exemple d obtention d anticorps monoclonaux est d crit ci dessous Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 7 Production d anticorps monoclonaux Un my lome est une tumeur de la moelle osseuse qui peut tre adapt e de mani re se d velopper continuellement en culture cellulaire Lorsque des cellules my lomateuses ont t fusionn es avec des cellules spl niques de mammif res produisant des anticorps on a constat que les cellules hybrides r sultantes ou hybridomes produisent de grandes quantit s d anticorps monoclonaux Ce produit
10. ction sp cifique du soja Roundup Ready a t mise au point test e et valid e par Lipp et al 2000 Cette m thode repose sur l utilisation d anticorps sp cifiques dirig s contre la prot ine CP4 EPSPS 5 nolpyruvyl shikimate 3 phosphate synthase enzyme issue de la souche CP4 de l Agrobacterium sp Padgette et al 1995 la prot ine qui conf re la tol rance l herbicide Roundup du soja Roundup Ready Les r sultats pr liminaires indiquent que cette m thode qui consiste utiliser un kit ELISA disponible dans le commerce est capable de d tecter la pr sence d OGM dans le soja brut des concentrations comprises entre 0 3 et 5 Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 10 Principe La technique ELISA directe en sandwich permet de d tecter la prot ine CP4 EPSPS comme illustr sur les figures ci dessous Y Anticorps Surface couverte monoclonaux La surface d une plaque de microtitration est recouverte d un anticorps de capture monoclonal sp cifique Antig ne Lorsque l chantillon consid r est ajout l anticorps de capture fixe l antig ne Les composants libres de l chantillon sont limin s par lavage HRP Anticorps d tecteur Surface couverte Apr s le lavage un anticorps polyclonal li par covalence la peroxydase de raifo
11. de fusion cellulaire allie les qualit s souhait es des deux diff rents types de cellules la capacit de se d velopper continuellement et la capacit de produire de grandes quantit s d anticorps purs Etant donn que les cellules hybrides s lectionn es ne produisent qu un anticorps sp cifique les anticorps sont plus purs que les anticorps polyclonaux produits l aide de techniques conventionnelles Ils sont potentiellement plus efficaces que les m dicaments traditionnels utilis s pour lutter contre les maladies tant donn que ces derniers attaquent non seulement la substance trang re mais galement les propres cellules de l organisme ce qui entra ne parfois des effets secondaires ind sirables comme par exemple des r actions allergiques Les anticorps monoclonaux attaquent uniquement la mol cule cible et entra nent peu voire aucun effet secondaire Production d anticorps monoclonaux Immunisation d une souris pour stimuler la production d anticorps Les cellules tumorales se d veloppent en culture tissulaire Cellules g n rant des anticorps isol es de la rate Les cellules g n rant des anticorps sont fusionn es avec les cellules tumorales cultiv es afin de former des hybridomes Hybridomes prot g s en vue TL de la production d anticorps J Hybridomes g n rant des anticorps clon s i PEET Anticorps monoclonaux isol s destin s tre cultiv s Analyse d chantillons alimen
12. du soja Roundup Ready par ELISA 17 Extraction d chantillons et talons de r f rence Les chantillons et les talons de r f rence n gatifs et positifs sont extraits dans les m mes conditions en deux exemplaires comme d crit ci apr s Lors du pesage des chantillons peser chaque talon de r f rence par ordre croissant de concentration puis les chantillons Peser 0 5 g 0 01 g de chaque talon de r f rence et l chantillon dans des tubes individuels de 15 ml en polypropyl ne Afin d viter toute contamination nettoyer la spatule avant toute nouvelle pes e Ajouter 4 5 ml de tampon d extraction de soja dans chaque tube contenant 0 5 g d chantillon et vortexer pendant 10 secondes Centrifuger les m langes environ 5000 tr mn pendant 15 minutes A l aide d une pipette de transfert retirer soigneusement le surnageant sans aspirer les particules et placer le surnageant dans un tube propre de 15 ml tiquet Avant de proc der l essai diluer les extraits d chantillon et d talon de r f rence avec le tampon d essai de soja conform ment au Tableau 1 Les extraits de prot ine doivent tre stock s une temp rature comprise entre 2 C et 8 C pendant une journ e au maximum Tableau 1 Plages de dilution en fonction de la matrice Matrice Dilution Soja 1 300 Farine de soja 1 300 Farine de soja d graiss e 1 300 Isolat de prot ine 1 10 Dilution des extraits d
13. e de l chantillon avec le tampon d extraction jusqu ce qu il soit homog ne Centrifuger l chantillon 5000 tr mn pendant 15 minutes Eliminer le surnageant et le placer dans un tube propre Diluer les chantillons et les talons de r f rence Etablissement d un sch ma de fonctionnement de la proc dure d immuno essai ELISA Proc dure Ajout Incubation Lavage Ajout Incubation Lavage Ajout Incubation Ajout Mesure de l absorbance Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Volume 100 pl Description Pipeter les extraits d chantillons dilu s talons de r f rence et tare d essai dans une cupule d essai appropri e Incuber pendant 1 heure 37 C Laver 3 fois l aide du tampon de lavage 100 pl Ajouter le conjugu d anticorps dans chaque cupule d essai Incuber pendant 1 heure 37 C Laver 3 fois l aide du tampon de lavage 100 pl Ajouter la solution de couleur dans chaque cupule Incuber pendant 10 minutes temp rature ambiante 100 pl Ajouter la solution d arr t dans chaque cupule d essai Mesurer la valeur de l absorbance de chaque cupule d essai dans le lecteur de plaque 450 nm Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 22 R f rences Clark M F amp Adams A N 1977 Caract ristiques de la m thode de dosage immunoenzymatique avec microplaque en vue de
14. ement refermer herm tiquement le sac en aluminium apr s avoir retir le nombre de bandes appropri Dix cupules sont n cessaires pour les talons de r f rence et les blancs Chaque plaque aura ses propres talons et contr les En cas de nettoyage manuel sceller l aide d un ruban adh sif les bords de l ensemble des bandes requises pour une op ration au support de bandes afin d viter toute chute accidentelle des bandes hors du support pendant les tapes de nettoyage Pr paration du conjugu d anticorps Solution m re de conjugu d anticorps Pipeter 1 ml de diluant de conjugu de soja de la bouteille dans le tube correspondant Vortexer pendant environ 10 secondes Solution de travail de conjugu d anticorps Transf rer nouveau 240 pl de conjugu de soja reconstitu dans le flacon de diluant de conjugu de soja Etiqueter le flacon en indiquant la date et m langer en le retournant 20 fois Pr paration du tampon de lavage Laisser le concentr de tampon de lavage 10X atteindre la temp rature ambiante Diluer le concentr de tampon de lavage 10X dans de l eau d ionis e pour pr parer le tampon de lavage de travail par ex 50 ml de concentr de tampon de lavage 10X dans 450 ml d eau d ionis e Ajouter au nettoyeur de plaque automatique ou la pissette Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative
15. er l tape d aspiration remplissage 3 fois Enfin utiliser le nettoyeur de microcupule pour aspirer l ensemble des cupules puis tapoter la plaque l envers sur une pile de serviettes en papier afin d liminer toute goutte r siduelle ainsi que les bulles du tampon de lavage Ne pas laisser s cher la cupule cela risquerait d affecter les performances de l essai Un lavage insuffisant entra nera des r sultats erron s Quel que soit le type de nettoyeur utilis manuel ou automatique veiller imp rativement ce que chaque cupule d essai soit nettoy e avec des volumes identiques toutes les autres cupules Ajout d un conjugu d anticorps Ajouter 100 ll de solution de travail de conjugu d anticorps chaque cupule Couvrir la plaque afin d viter toute contamination ou vaporation Incubation Incuber la plaque de microtitration 37 C pendant 1 heure Lavage A la fin de la p riode d incubation r p ter les tapes de lavage comme d crit ci dessus Ajout de substrat Ajouter 100 ll de la solution color e chaque cupule M langer doucement la plaque et incuber pendant 10 minutes temp rature ambiante L ajout de substrat chromog ne doit tre effectu sans interruption Conserver la m me s quence et le m me intervalle de temps l tape de pipetage Prot ger la plaque de microtitration contre les rayons du soleil sans quoi cela influerait sur l intensit de la couleur Ajout d
16. es pour d terminer leur concentration sur la base de cette courbe Application des crit res d admissibilit de rejet Chaque op ration devra respecter les crit res d admissibilit de rejet dans le cadre de la proc dure pour tre valable L op ration comprend les l ments suivants tare d essai blanc extraction de chaque talon OGM de r f rence contr le n gatif et chaque chantillon inconnu Tous les extraits de prot ine ainsi que la tare d essai seront trait s en deux exemplaires Si une proc dure n observe pas les crit res d admissibilit de l essai l op ration tout enti re sera renouvel e Op ration Crit res Tare de tampon d essai A450nm lt 0 30 0 norme GM A450nm lt 0 30 2 5 R f rence A450nm gt 0 8 Toutes les normes positives CV des doubles lt 15 Echantillons inconnus CV des doubles lt 20 Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 21 Sch ma de fonctionnement Etablissement d un sch ma de fonctionnement de l extraction d chantillon et de la r f rence standard Proc dure Pesage Ajout M lange Centrifugation Dilution Volume poids 0 5 g 4 5 ml 5000 tr mn 1 300 ou 1 10 en fonction de la mati re examin e Description Pesage des chantillons tare d essai talons de r f rence Ajout du tampon d extraction M lang
17. ffon doux Laisser tremper dans de l alcool pendant au moins 5 minutes et rincer soigneusement l eau S cher l air en cas de r utilisation rapide s cher l aide d un s che cheveux disponible dans le commerce M thode alternative utiliser un bain ultrasons suivi par un s chage lair Propret de la zone de travail La propret de la zone de travail est galement capitale Etant donn que l essai est extr mement sensible la moindre contamination du tube par une faible quantit de poussi re OGM pourrait entra ner un r sultat positif erron Eviter toute contamination la poussi re de soja dans la zone de travail Ne pas laisser de la poussi re de soja contaminer l quipement devant tre utilis dans le cadre d une op ration ult rieure Pour des performances optimales effectuer l essai dans une salle s par e de l installation de broyage et de pr paration de l chantillon afin d viter toute contamination de poussi re ventuelle Pr paration de l chantillon Un sous chantillon homog ne repr sentatif doit tre pr lev sur l chantillon de laboratoire Si l chantillon est du soja brut placer au moins 500 g dans un broyeur appropri et broyer pendant environ 3 minutes ou jusqu ce qu il soit suffisamment fin pour traverser les tamis Pour l analyse quantitative une dimension de particule inf rieure 150 um doit tre obtenue et moins de 450 pm pour l analyse qualitative Af
18. fiques dirig s contre les prot ines r sultant des transg nes utilis s dans les cultures g n tiquement modifi es autoris es sont disponibles dans le commerce quelques exemples sont les anticorps contre le produit du g ne nptll NPTII ou APH 3 II et contre le produit du g ne gus Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 9 Il existe 3 mani res diff rentes d effectuer un Test ELISA a Technique ELISA indirecte A EN POETER 1 E ARE Pad Lavage Lavage N au Lavage Cupule couverte Ajout d un anticorps Ajout d un anticorps secondaire Ajout d un substrat S et d antig nes sp cifique avec conjugu enzymatique relev de la couleur b Technique du sandwich ER CS ES Sa E je He J Lavage GS Qip Lavage 4 S T Lavage Cupule couverte Ajout d un Ajout d un anticorps secondaire Ajout d un substrat et d anticorps antig ne avec conjugu enzymatique relev de la couleur c Technique ELISA comp titive eei n A 7 a U SS z J aga AN A9 W V4 E a ER Toan Pa AE ss 5S 5 Aikor k Lavage J Lavage J l anticorps LR ns 2 U r r Cae a avec l antig ne TIENEN ep PTER Ajouter Ag Ab la Ajout d un anticorps secondaire Ajout d un substrat cupule couverte avec conjugu enzymatique Aucune couleur d antig nes Une m thode ELISA permettant la d te
19. in d viter toute contamination proc der en faisant preuve de la plus grande vigilance durant l tape de tamisage Veiller galement viter tout chauffage excessif L chantillon sera m lang et broy par le broyeur Pr lever de la mati re broy e un sous chantillon d environ 100 g et le passer travers un tamis avec des pores de 450 pm maille 40 Faire passer au moins 90 de ce sous chantillon travers le tamis de 450 um Pour un essai qualitatif cette mati re peut tre utilis e imm diatement pour un essai quantitatif la mati re tamis e doit l tre davantage l aide d un tamis ayant des pores de 150 um Il a t d montr que la mati re traversant le tamis de 450 pm est homog ne il est donc n cessaire de tamiser juste Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 16 assez de mati re pour obtenir un chantillon final travers le tamis de 150 pm Il suffit de passer la quantit de mati re requise pour l chantillon final D autres types d chantillons peuvent tre trait s de la m me mani re bien que des tailles d chantillons plus petites puissent tre utilis s Proc dure d essai Laisser l ensemble des r actifs atteindre la temp rature ambiante avant toute utilisation Oter les bandes enduites et retirer le support du sac en aluminium Veiller syst matiqu
20. iquement dans certaines parties de la plante des promoteurs sp cificit tissulaire sont d j utilis s des fins sp cifiques ou exprim es diff rents niveaux dans diverses parties ou au cours de diff rentes phases du d veloppement physiologique On a constat que les niveaux d expression des produits transg niques se situent dans une fourchette de 0 2 de la prot ine soluble totale m me lorsque de puissants promoteurs constitutifs ont t utilis s pour activer l expression Longstaff 1995 Dans la plupart des cas cependant les niveaux d expression signal s par ex pour les cultures GM approuv es sont inf rieurs la limite sup rieure de 2 Hemmer 1997 Les immuno essais sont des syst mes de mesure analytiques dans lesquels des anticorps sont utilis s comme r actifs Les anticorps sont des prot ines sp cifiques isol es du s rum d animaux qui ne se lient physiquement qu la substance ayant d clench leur production Les anticorps sont g n r s en injectant la substance d tecter par ex CP4 EPSPS la prot ine qui conf re la r sistance l herbicide Roundup des animaux tels que des lapins et des souris dont les cellules reconnaissent la substance comme tant trang re et r pondent en produisant des anticorps Les anticorps sont purifi s li s un marqueur d tectable puis utilis s en tant que r actifs pour d tecter la substance d int r t Une condition requise pour l
21. la d tection de phytovirus Journal of General Virology 34 475 483 Hemmer W 1997 Aliments d riv s d organismes g n tiquement modifi s et m thodes de d tection Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology Rapport 2 97 61 pages http www bats ch bats publikationen 1997 2 gmo index php Derni re connection Janvier 2010 Lipp M Anklam E amp Stave J W 2000 Validation d un immuno essai en vue de la d tection et de la quantification de soja g n tiquement modifi dans des aliments et fractions de denr es alimentaires l aide de mati res de r f rence Journal of AOAC International 83 919 927 Longstaff M Edmonds H S amp Newell C A 1995 M thode am lior e pour la d tection et la quantification de prot ine recombinante dans les plantes transg niques Plant Molecular Biology Reporter 13 363 368 Mohapatra U Mccabe M S Power J B Schepers F Vanderarend A amp Davey M R 1999 L expression du g ne bar conf re la laitue transg nique une r sistance l herbicide Transgenic Research 8 33 44 Padgette S R Kolacz K H Delannay X Re D B LaVallee B J Tinius C N Rhodes W K Otero Y I Barry G F Eichholtz D A Peschke V M Nida D L Taylor N B amp Kishore G M 1995 Mise au point identification et caract risation d une lign e de soja tol rante au glyphosate Crop Scie
22. m de particules La seconde tape un nettoyage l alcool permet de d naturer l chantillon et de le rendre non r actif dans le cadre de l essai toute prot ine GM ayant pu demeurer sur l quipement Nettoyage du broyeur ou du m langeur Nettoyer de fa on p riodique l aide d une brosse souple et laisser tremper dans une solution alcoolis e S cher la brosse avant toute utilisation ult rieure en l essuyant l aide d un chiffon doux ou d une serviette de laboratoire Rincer avec de l alcool qui peut tre stock et pulv ris l aide d un flacon de pulv risation ou d injection Deux rin ages ou pulv risations sont recommand s Ensuite rincer minutieusement l eau S cher l air en cas de r utilisation rapide s cher l aide d un s che cheveux disponible dans le commerce Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 15 Nettoyage du tamis La poudre de soja a tendance s cher et se coller sur le tamis Tapoter nergiquement le tamis contre une surface dure afin d liminer toute mati re s che coll e dessus Brosser l aide d une brosse souple et propre Nettoyer la brosse de fa on p riodique et laisser tremper dans une solution alcoolis e pendant au moins 1 minute S cher la brosse avant toute utilisation ult rieure en l essuyant avec un chi
23. nce 35 1451 1461 Autres r f rences Brett G M Chambers S J Huang L amp Morgan M R A 1999 Conception et mise au point d immuno essais en vue de la d tection de prot ines Food Control 10 401 406 Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 23 directive 79 700 CEE de la Commission du 24 juillet 1979 fixant des m thodes communautaires de pr l vement d chantillons pour le contr le officiel des r sidus de pesticides sur et dans les fruits et l gumes JO L 239 22 9 1979 p 24 Rogan G J Dudin Y A Lee T C Magin K M Astwood J D Bhakta N S Leach J N Sanders P R amp Fuchs R L 1999 M thodes immunodiagnostiques en vue de la d tection de la 5 nolpyruvyl shikimate 3 phosphate synthase dans le soja Roundup Ready Food Control 10 407 414 Stave J W 1999 D tection de prot ines nouvelles ou modifi es dans les nouveaux aliments issus d OGM besoins futurs Food Control 10 367 374 Van der Hoeven C Dietz A amp Landsmann J 1994 Variabilit de l expression g nique sp cifique aux organes des plantes de tabac transg niques Transgenic Research 3 159 165 Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12
24. nticorps contre les antig nes qu ils contiennent C est dans la premi re propri t des anticorps leur sp cificit que r side toute l importance de la technologie des anticorps monoclonaux Non seulement les anticorps peuvent tre utilis s des fins th rapeutiques pour prot ger contre les maladies mais ils peuvent galement contribuer d celer toute une palette de maladies ainsi que la pr sence de drogues produits virologiques et bact riologiques ainsi que d autres substances inhabituelles ou anormales dans le sang Etant donn la diversit des utilisations de ces substances de lutte contre les maladies leur production en quantit s pures est depuis longtemps le centre de mire d enqu tes scientifiques La m thode conventionnelle consistait injecter un antig ne un animal de laboratoire puis apr s la formation des anticorps recueillir ces anticorps dans le s rum un s rum contenant des anticorps est appel antis rum Cette m thode pr sente deux inconv nients elle g n re de l antis rum contenant des substances ind sirables et fournit une quantit tr s limit e d anticorps utilisables La technologie des anticorps monoclonaux permet de produire des quantit s importantes d anticorps purs en utilisant des cellules qui produisent des anticorps naturellement ainsi qu une cat gorie de cellules pouvant se d velopper sans interruption en culture cellulaire Si nous constituons un hybride combinant la c
25. roc dure Ce syst me d essai ELISA se limite aux chantillons pour lesquels l expression de la prot ine CP4 EPSPS peut tre mise en corr lation avec le niveau de mati re GM pr sente dans les talons de r f rence utilis s Le kit d essai ELISA est con u de mani re fournir des performances optimales des temp ratures ambiantes comprises entre 15 C et 30 C L absorbance de l talon de r f rence le plus lev doit tre sup rieure 0 8 et ne doit pas d passer la plage lin aire du spectrom tre la limite sup rieure varie en fonction des diff rents spectrom tres Il est important de tenir compte du fait que les valeurs OD augmentent plus rapidement lorsque les temp ratures sont sup rieures 30 C Par cons quent si les temp ratures sont lev es un temps d incubation r duit du substrat s av rera n cessaire Lorsque les temp ratures sont basses moins de 15 C le temps d incubation du substrat doit tre augment Mesures permettant d viter toute contamination durant la pr paration des chantillons G n ralit s Le test OGM ELISA est une technique extr mement sensible qui est capable de d tecter des quantit s infimes de contamination GM Il est donc imp ratif de nettoyer minutieusement l ensemble du mat riel utilis pour traiter les chantillons de soja entre les diff rents lots d chantillons La proc dure suivante implique une premi re tape d limination physique d un maximu
26. rt HRP est ajout et est sp cifique pour un second site antig nique sur la prot ine CP4 EPSPS li e Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 11 Surface couverte Apr s le lavage un chromog ne est ajout savoir de la t tram thylbenzidine pour peroxydase de raifort La peroxydase de raifort g n re un signal de couleur qui est proportionnel la concentration d antig nes dans une plage lin aire Pour arr ter le d veloppement de la couleur une solution d arr t est ajout e Le degr de couleur g n r est mesur une longueur d onde de 450 nm Exp rimentation Analyse des ingr dients alimentaires g n tiquement modifi s Manuel d utilisation du Kit Soja 1999 Strategic Diagnostics Inc R v 052099 Vers 1 8 Introduction Le protocole suivant expose une m thode ELISA permettant de d terminer la pr sence de la prot ine CP4 EPSPS exprim e dans le soja Roundup Ready dans les produits agricoles bruts tels que les farines de soja et les isolats de prot ine de soja Cette m thode s applique aux chantillons pour lesquels peu voire aucun traitement n a t effectu et la prot ine CP4 EPSPS n est ainsi pas d natur e Par exemple la temp rature laquelle les ingr dients alimentaires sont transform s peut avoir un impact sur la capacit de d tection des
27. s laquelle les anticorps et les antig nes constituent de grands complexes insolubles et ni les anticorps ni les antig nes ne peuvent tre d tect s dans le surnageant Une zone d exc s d antig nes dans laquelle la pr cipitation est inhib e et l exc s d antig nes peut tre d tect dans le surnageant Bien que la r action de pr cipitation soit particuli rement appropri e pour caract riser les interactions entre les anticorps polyclonaux et les antig nes multivalents elle ne s av re g n ralement pas tr s utile pour caract riser les interactions entre les antig nes et les anticorps monoclonaux moins que les antig nes ne pr sentent des pitopes identiques multiples comme structures glucidiques r p titives pr sentes dans les polysaccharides Ce n est que dans ces conditions qu un anticorps monoclonal monosp cifique pourra ponter et pr cipiter un antig ne Toutefois les anticorps monoclonaux sont g n ralement caract ris s par des types de mesures plus affin s fournissant des informations d taill es sur l interaction anticorps antig ne comme la constante d quilibre et les taux cin tiques L utilit des anticorps dans la d tection et l isolation des antig nes est d montr e par le large ventail d applications extr mement puissantes mises au point au fil des ann es L utilit des anticorps est aussi consid rablement am lior e par leur relative stabilit dans diverses r actions de modifica
28. taires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 8 La technique ELISA D finition Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay essai d immunoabsorption enzymatique tout essai immunoenzymatique utilisant un immunor actif enzymatique antig ne ou anticorps et un immunoadsorbant antig ne ou anticorps li un support solide Il existe toute une s rie de m thodes par ex liaison comp titive entre le r actif marqu et l inconnu non marqu permettant de mesurer la concentration inconnue La technique ELISA Clark amp Adams 1977 repose sur les interactions sp cifiques entre les anticorps et les antig nes Les r actifs cl s dans le cadre des tests ELISA sont les anticorps des prot ines solubles produites par le syst me immunitaire en r ponse une infection engendr e par une substance trang re appel e antig ne Dans le cas de la d tection des OGM l antig ne peut tre la prot ine r cemment synth tis e La technique ELISA a souvent t mise en uvre pour valuer un stade exp rimental le niveau d expression des prot ines synth tis es par le g ne r cemment introduit Des informations concernant la production et l utilisation d anticorps sp cifiques peuvent ainsi tre trouv es dans de nombreux articles d crivant les d veloppements de plantes transg niques Mohapatra et al 1999 Seuls quelques anticorps sp ci
29. tion chimique qui modifient la structure des anticorps sans d truire leur capacit fixer les antig nes On a utilis des anticorps marqu s chimiquement par des composants fluorescents magn tiques radioactifs et autres afin de faciliter la d tection ou l isolement d antig nes dans diverses conditions exp rimentales Pr paration d anticorps monoclonaux Les substances trang res l organisme comme les bact ries et virus d autres agents infectieux appel s antig nes sont identifi es par le syst me immunitaire du corps comme tant ind sirables Nos d fenses naturelles contre ces agents infectieux sont les anticorps des prot ines qui recherchent les antig nes et contribuent leur destruction Les anticorps pr sentent deux caract ristiques tr s utiles Premi rement ils sont extr mement sp cifiques plus pr cis ment chaque anticorps se fixe et s attaque Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 6 un antig ne particulier Deuxi mement une fois activ s par l apparition d une maladie certains anticorps continuent conf rer une r sistance contre cette maladie La seconde caract ristique des anticorps permet d laborer des vaccins Un vaccin est une pr paration de bact ries ou de virus tu s ou att nu s qui une fois introduits dans l organisme stimulent la production d a
30. ure comprise entre 2 C et 8 C La solution m re de conjugu d anticorps conjugu de soja ainsi que la solution de travail de conjugu d anticorps doivent tre conserv es une temp rature comprise entre 2 C et 8 C jusqu la date de p remption du kit Le tampon de lavage dilu doit tre stock une temp rature comprise entre 2 C et 8 C au plus tard jusqu la date d expiration du kit R actifs g n ralement fournis avec le kit d essai Tampon d extraction de soja tampon de borate de sodium pH 7 5 Tampon d essai de soja solution saline tamponn e au phosphate Tween 20 s rum albumine bovine pH 7 4 Cupules bande enduite 12 bandes contenant chacune 8 cupules enduites avec les anticorps de capture monoclonaux et 1 support de bande Conjugu de soja prot ine anti CP4 EPSPS de lapin sous forme lyophilis e Support de conjugu de soja 10 de s rum de souris inactiv thermiquement Substrat chromog ne K Blue t tram thylbenzidine TMB peroxyde d hydrog ne 5 de dim thylformamide en tant que solvant de base Solution d arr t 0 5 d acide sulfurique Concentr de tampon de lavage 10x solution saline tamponn e au phosphate Tween 20 pH 7 1 Etalons de r f rence n gatifs et positifs Analyse d chantillons alimentaires pour la pr sence d organismes g n tiquement modifi s Module 12 D tection quantitative du soja Roundup Ready par ELISA 14 Proc dure Limitation de la p
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