GenoType BC grampositive
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1. qui peuvent galement tre t l charg es l adresse suivante www hain lifescience com products msds html Contr le de Qualit Afin de contr ler le bon d roulement du test et le bon fonctionnement des r actifs chaque bandelette comporte 2 zones de contr le une zone de Contr le Conjugu pour contr ler la fixation du conjugu sur la bandelette et le bon d roulement de la r v lation chromog nique une zone de Contr le Universel qui d tecte au vue des connaissances actuelles toutes les esp ces bact riennes Pr lever de l ADN et Amplification Le mat riel de d part du test consiste en des chantillons d hemoculture positive Le test est valid uniquement lorsqu il est utilis en combinaison avec le protocole d extraction d ADN suivant Le test ne doit pas tre utilise pour la detection di recte des bact ries dans les chantillons de sang Pr parer les chantillons dans une pi ce d nu e d ADN amplifi D p t des chantillons 1 D poser d licatement approximativement 15 pl ou une goutte d h moculture au milieu du champ rond de la GENOeCARD et identifier le d p t dans le champ Texte correspondant 2 S cher la GENOeCARD ouverte pendant 15 minutes si possible dans une tuve s che 37 40 C Les chantillons ainsi pr par s peuvent tre conserv s tem p rature ambiante dans un endroit sec l abri de la lumi re pendant au moins 3 mois Mix d amplification Deux amplificati2. amplification Le test fonctionne dans les limites de la r gion du g nome choisie pour les amorces et les sondes Un s quencage potentiel doit tre r alis s par ment La pr sence de diff rentes esp ces bact riennes dans un m me chantillon peut entrav e l interpr tation du test Comme dans tout systeme de detection bas sur l hybridation il existe la possibi lit que des variations situ es dans la s quence d ADN g nomique cible partir de laquelle les amorces et les sondes ont t choisies et pour lesquelles le test n a pas t concu entra nent un r sultat erron En raison de la grande variabilit des g nomes bact riens il est possible qu un certain nombre de variants ne puisse pas tre d tect Le test refl te l tat actuel des connaissances de la soci t Hain Life science L utilisation de ce kit est r serv e un personnel qualifi d j form et rod aux techniques de biologie mol culaire Les performances du test ont t valid es l aide du syst me d extraction d ADN GENOeCARD Aucune d claration sur la compatibilit du test avec d autres m tho des d extraction de l ADN ne peut tre affirm e L valuation des performances du test a t r alis e l aide de la Taq DNA Polyme rase fournie par la soci t Eppendorf et de la Taq DNA Polymerase fournie par la soci t Qiagen Les chantillons ont t cultiv s en systeme Bactec H moculture en utilisant les milieux
3. SUB C utilisels trop concentr s Les tapes de lavage n ont pas t correctement effectu es Les solutions de lavage taient trop froides lors de leur utilisation R sultat inattendu Temp rature d incubation trop basse Solution d Hybridation et ou Solution de Lavage Stringent incorrectement qui libr es ou homog n is es Contamination cause par un m lange de deux h mocultures lors du d p t sur la GENOeCARD R p ter le d p t sur un nouveau champ avec un volume d chan tillon r duit Contamination d un disque par un chantillon pr c demment pr lev Proc der aux mesures de lavage d crites dans le chapitre Conservation et Pr cautions Contamination des r actifs d amplification par de l ADN extrait et ou amplifi Dans ce cas un contr le de contamination doit entra ner le m me profil Contamination des puits voisins par des claboussures lors de l addition de la Solution d Hybridation Le disque chantillon a t d pos dans une seule des deux r actions d amplifi cation ou bien une seule des deux r actions d amplification a t utilis e pour Uhybridation Les amplicons sp cifiques d esp ces sont g n r s avec le PNM BC 15 grampositive 1 alors que sont g n r s avec le PNM BC grampositive 2 les am plicons du Contr le Universel et des g nes de r sistance Dans certaines conditions du test une forte concentration d ADN amplifi peut entra ner une r
4. Taq DNA Polymerase non fourni 3 ul d eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire non fourni 5 ul de solution d ADN ajout dans une pi ce s par e La concentration finale du mix r actionnel en MgCl est 2 5 mM D terminer le nombre d chantillons amplifier nombre d chantillons analyser contr les Un contr le de contamination contient un disque pr lev partir du champs ovale de d contamination Pr parer deux master mix contenant tous les r actifs l exception des disques bien homog n iser ne pas vortexer et aliquoter 45 ul des mix dans les tubes de PCR D couper un disque D couper les disques de la GENOeCARD dans une pi ce d nu e de tout ADN ampli fi 1 Ins rer la carte protectrice dans la fente situ e sur le cot de la GENO CARD Retirer le bouchon protecteur de l extr mit de l emporte pi ce 2 Positionner l emporte pi ce voir chapitre Commandes la verticale du d p t s ch de l chantillon tester En imprimant un mouvement de rotation a l em porte pi ce dans le sens des aiguilles d une montre presser fortement jusqu d couper un disque de papier pour qu il se retrouve dans l extr mit de l em porte pi ce 3 Presser le bouton poussoir de l emporte pi ce pour transf rer le disque dans un tube de PCR contenant 45 ul de mix d amplification 4 Decontaminer l extr mit de l emporte pi ce en d coupant trois disques dans le champs idoine situ droi
5. action chromog nique tr s rapide En pareil cas afin de pr venir le d veloppement de bandes dues des r actions d hybridation crois es arr ter la r action chromog nique d s que les premi res lignes color es deviennent visibles La culture de d part n est pas pure L esp ce bact rienne isol e ne peut pas tre identifi e avec ce test Mat riel Requis mais Non Fourni ADN polym rase thermostable avec tampon taux d extension gt 1 kb min demi vie 35 min 95 C fid lit 2 5 3 0 x 10 Bain marie agitateur TwinCubator Chronom tre Eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire Embouts de pipettes st riles avec filtre Emporte pi ce et carte protectrice voir chapitre Commandes Eprouvette gradu e Ethanol p a 99 8 Etuve s che Gants a usage unique Microtubes pour thermocycleur exempts de contamination par DNase et RNase Milieu de culture des bact ries et quipement correspondant Papier absorbant Pincettes Pipettes r glables pour 10 20 200 et 1000 ul Plateau agitateur TwinCubator Solution d hypochlorite de sodium Eau de Javel m nag re exempte de colorant et sans parfum Thermocycleur taux de chauffage 3 C sec taux de refroidissement 2 C sec pr cision 0 2 C Thermom tre calibr Les GENO CARDs n cessaires la r alisation de ce test sont fournies avec le kit 16 Composition du Kit 12 96 Bandelettes sensibili
6. tailles de 65 pb Contr le Universel 141 pb pneumolysine 71 pb mecA 110 pb vanA 51 pb vanB vanC2 C3 et 222 pb vanC1 Hybridation Pr paration Pr chauffer le bain marie agitateur TwinCubator a 45 C d rivation maximum 1 C Pr chauffer les solutions HYB et STR a 37 45 C avant utilisation Les r actifs ne doivent pr senter aucun pr cipit noter cependant que la solution CON D est opaque Si besoin agiter Equilibrer les autres r actifs l exception des solutions CON C et SUB C temp rature ambiante Dans un tube appropri diluer le Conjugu Concentr CON C orange et le Substrat Concentr SUB C jaune au 1 100 dans un volume ad quat du tampon correspondant CON C avec CON D SUB C avec SUB D Bien homog n iser et quilibrer temp rature ambiante Pour chaque chantillon test ajouter 10 pl de concentr 1 ml de tampon Diluer CON C avant chaque utilisation Une fois dilu SUB C reste stable pendant 4 se maines conserv temp rature ambiante et l obscurit Les deux r actions d amplification r alis es pour chaque chantillon sont par la suite hybrid es avec une seule et m me bandelette 1 D poser 40 pl de Solution de D naturation DEN bleu une extr mit de chaque puits utilis 2 Ajouter 20 ul de chacune des r actions d amplification pipeter plusieurs fois afin de bien homog n iser et incuber temp rature ambiante pendant 5 mi nutes Incuber 5
7. 20207 yde s s p w iap da un sna909074yders ose E nn sn22090 Mydejs snaune sna2020 Aydejs aejuownaud nd3090 da 4S 45 40 Sn22020 d81 S s wis nba dss EN aenoejebskp Sn22020 d81jS 2e12e1e6e Sn22020 d21 S sauabo d sn39090 daS V LTET sinbues suejnu pena snsoulbue n320201d813S Streptococcus equi et S canis peuvent d velopper le m me profil mais avec une 12 bande 8 de faible intensit C mm coloration oO C U TN smaeyijassed SN22020J8 U7 wnJeun eb SNn99090 13 UF HEET 10200003 5112292 SN2202018 U7 suejnwis sn2202074ydejs autem Sn22020 4yde S coloration facultative 1 coloration faible facultative 1 absence de coloration kat CC Contr le Conjugu Bande N 2 UC 9 Bande N 16 16 Bande N 1 mmm 20 Bande N 21 7 Contr le Universel mecA vanA vanB Bande N 22 vanC 1 Bande N 23 24 Bande N 24 23 vanC2 C3 13 Limitations Des bandes tr s faibles ne permettent pas de conclusions d finitives LADN cible doit avoir t amplifi efficacement pendant la r action d
8. BACTEC Plus Aerobic F ou BACTEC Plus Anaerobic F Les donn es sur les performances du test peuvent tre t l charg es sur le site internet www hain lifescience com Causes d Erreurs R sultats faibles ou absence de signal incluant la zone de Contr le Conjugu Temp rature ambiante trop basse ou r actifs mal quilibr s CON C et ou SUB C n a pas t ajout ou tait utilis trop dilu R sultats faibles ou absence de signal except dans la zone de Contr le Conjugu Quantit insuffisante d ADN sur le disque pour une amplification efficace Analy ser l ADN amplifi sur un gel En cas d amplicons non visibles r p ter l amplifi 14 cation avec 1 3 nouveaux disques Si besoin utiliser une culture plus dense Alternativement utiliser 2 3 disques pour amplification Lamplification est inhibee en raison d une utilisation incorrecte de l emporte pi ce Avant de d couper un disque ins rer la carte protectrice dans la GENOeCARD Aucun disque dans la r action d amplification V rifier la pr sence d un disque dans chaque tube PCR S assurer que le disque n est pas coll contre la paroi du tube au dessus du niveau du mix d amplification Temp rature d incubation trop lev e Coloration non homog ne Les bandelettes n ont pas t suffisamment immerg es lors des diff rentes in cubations Le bac n a pas t correctement agit Bruit de fond important CON C et ou
9. Genolype BC grampositive VER 3 0 CE 06 2010 H A l N LIFESCIENCE GenoType BC grampositive Test genetique d identification des principales bact ries Gram positive cliniquement importantes partir d h moculture Principe Le test GenoType BC grampositive est bas sur la technologie DNAeSTRIP et permet l identification partir d h moculture positive des bact ries gram positive suivantes Streptococcus anginosus constellatus intermedius mutans sanguis S mitis oralis S pyogenes S agalactiae S dysgalactiae ssp equisimilis S bovis S pneumoniae Sta phylococcus aureus S haemolyticus S epidermidis S hominis S warneri S simulans Enterococcus faecalis E faecium E gallinarum et E casseliflavus Simultan ment sont galement d tect s les genes responsables de la r sistance a la vancomycine vanA vanB vanC1 et vanC2 C3 ainsi que le g ne mecA responsable de la r sistance a la m thicilline La proc dure compl te comporte trois phases Extraction de l ADN partir d hemoculture positive spot de sang s ch les GENO CARDs n cessaires la mise en oeuvre du test sont fournies avec le kit une amplification multiplex l aide d amorces biotinyl es ADN polym rase thermostable non fournie et hybridation inverse Cette derni re phase comporte les tapes suivantes d naturation chimique de l ADN amplifi hybridation des amplicons simples brins biotinyl s aux sondes pr immo bil
10. LIFESCIENCE Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstra e 1 72147 Nehren Germany www hain lifescience de 309 12 30996 309 07 03 00
11. is es sur la membrane lavage stringent et enfin addition d un conjugu strepta vidine phosphatase alcaline suivie d une r v lation chromog nique Les signaux obtenus sont facilement et rapidement interpr t s a l aide d une matrice fournie avec chaque kit Conservation et Pr cautions Conserver les M langes Amorces Nucl otides PNM BC grampositive 1 et PNM BC grampositive 2 2 8 C r ception et l abri de toute source d ADN potentiellement contaminante En cas de conservation sup rieure 4 semaines conserver 20 C Afin d viter les cong lations d cong lations r p t es aliquoter les PNMs Conser ver tous les autres composants du kit 2 8 C Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date de p remption Les chantillons pr lev s sur patient ou a partir de culture doivent toujours tre consid r s comme potentiellement infectieux Les chantillons et les cultures prove nant de patients a risque doivent toujours tre tiquet s et manipul s dans des conditions de s curit adapt es Suivre les recommandations f d rale nationale locale d hygi ne de s curit et d environnement Se prot ger a l aide de v tements ad quats et de gants Le traitement des chantillons y compris le d p t des disques dans les tubes de PCR doivent tre r alis s dans une enceinte confin e de classe Il Observer les pr cautions usuelles pour la pr paration de l amplification Il est es sentiel que le
12. it de fond qui peut g ner l inter pr tation des r sultats 13 Arr ter la r action en rincant bri vement deux fois l eau distillee 14 l aide de pincettes r cup rer Les bandelettes et Les s cher entre deux couches de papier absorbant Evaluation et Interpr tation des R sultats Classer et ranger les bandelettes l abri de la lumi re Une feuille d valuation est fournie avec le kit Utilisation de la feuille d valuation coller les bandelettes dans leur emplacement r serv en alignant les bandes CC et UC des bandelettes avec les bandes CC et UC de la feuille Noter les bandes positives dans l avant derni re colonne et d terminer l esp ce correspondante l aide du tableau d interpr tation Noter le r sultat dans la derni re colonne La matrice permet galement d valuer les r sultats en alignant de la m me facon les bandes CC et UC des bandelettes et de la matrice Chaque bandelette comprend 24 zones r actionnelles voir figure Br 1 Contr le Conjugue CC RE 2 Contr le Universel UC NNNNN FPP PP 5 PP DP 0 00 JO 01001 FON OMONOU EWN O pt marquage color Remarque Cette bandelette n est pas repr sent e dans sa taille originale 10 Contr le Conjugu CC Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone Cette ligne t moigne de la bonne fixation du conjugu et du bon d roulement de la r v lation Contr le Universel UC Cette zone com
13. mat riel et les r actifs utilis s pour l extraction de l ADN et pour la pr paration de l amplification soient exempts de DNases Conserver l emporte pi ce et la carte protectrice dans un endroit sec l abri de la lumi re Lemporte pi ce doit tre mani avec pr caution en raison des risques de blessures pouvant tre occasionn s par son extr mit coupante Apr s utilisation recouvrir l aide du bouchon protecteur Afin d viter les contaminations les mesures de lavage suivantes doivent tre ap pliqu es intervalles r guliers Pour laver l emporte pi ce d visser l extr mit tranchante et laver la dans une solution d hypochlorite de sodium 1 5 puis dans l eau d min ralis e S cher l aide d air compress ou par rin age dans de l thanol 99 8 Laver la surface externe de l emporte pi ce avec de l thanol 70 Apr s utilisation retirer la carte protectrice de la GENO CARD et rincer la abon damment avec une solution d hypochlorite de sodium 1 5 puis dans l eau d mi n ralis e avant s chage l air Lors de la manipulation du kit tenir compte des indications de s curit suivantes La Solution de D naturation DEN contient du NaOH lt 2 et est irritante pour la peau et les yeux R36 38 et S26 37 39 45 Le Substrat Concentr SUB C contient du Dimethyl Sulfoxide et est irritante R36 37 38 S23 26 36 Pour des informations suppl mentaires consulter les fiches de s curit
14. minutes temp rature ambiante Pendant ce temps l aide d une pince sortir du tube le nombre appropri de bandelettes STRIPS et inscrire au crayon leur num ro d identification dans l espace situ sous le marquage color Toujours porter des gants pour manipu ler Les bandelettes 3 Ajouter dans chaque puits 1 ml de Tampon d Hybridation HYB vert pr chauff et homog n is Doucement agiter le bac jusqu ce que le m lange devienne une coloration homog ne Eviter les claboussures vers les autres puits 4 D poser une bandelette dans chaque puits utilis Les bandelettes doivent tre enti rement recouvertes par le liquide avec la face sensibilis e identifiable par le marquage color tourn e vers le haut Les ban delettes mal orient es doivent tre remises en position l aide de pincettes propres Afin d viter toute contamination bien nettoyer les pincettes apr s chaque utilisation Cela vaut aussi pour toutes les tapes suivantes Placer le bac dans bain marie agitateur TwinCubator et incuber 30 minutes a 45 C Pour le bain marie agitateur s lectionner une fr quence d agitation suffisante pour assurer un bon brassage du tampon Ajuster le niveau de l eau dans le bain marie agitateur au moins un tiers de La hauteur du bac de facon assurer un bon transfert de chaleur Cela vaut aussi pour toutes les tapes suivantes Aspirer le Tampon d Hybridation Utiliser par exemple une pipet
15. ons s par es doivent tre r alis es pour chaque chantillon la premi re avec le PNM BC grampositive 1 et la seconde avec le PNM BC gramposi tive 2 Des r sultats interpr tables sont obtenus uniquement lorsque ces deux r actions de PCR sont effectu es Pr parer les m langes r actionnels 45 pl res pectivement dans une pi ce exempte d ADN et physiquement s par e de la pi ce ayant servi pr lever les chantillons Il est imp ratif de ne pas utiliser d ADN po lym rase de type Hot Start R aliser toutes les tapes de pipetage sur de la glace jusqu au transfert final dans le thermocycleur Pr parer le m lange suivant par tube 35 ul de PNM BC grampositive 1 ou PNM BC grampositive 2 5 ul de tampon d incubation de la polymerase 10x non fourni x pl de MgCl non fourni 1 2 unitels d ADN polym rase thermostable se r f rer au manuel non fourni y ul d eau qsp 45 ul hors volume de l enzyme non fourni Selon le syst me tampon enzyme utilis la concentration optimale de MgCl peut varier de 1 5 2 5 mM A noter que certains tampons contiennent d j le MgCl Pour l amplification la Taq DNA Polymerase de Qiagen est recommand e Lors de l utilisation de cette enzyme les volumes r action sont les suivants 35 ul de PNM BC grampositive 1 ou PNM BC grampositive 2 5 pl de tampon de PCR 10x pour Taq DNA Polymerase contient 15 mM MgCL non fourni 2 ul 25 mM de MgCl non fourni 0 2 ul 1 U
16. prend une sonde s hybridant au niveau d une r gion d ADN hautement conserv e au sein de toutes les esp ces bact riennes test es ce jour Le d velop pement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence d ADN bact rien dans l chantillon test ainsi qu une extraction et une amplification de l ADN correc tes Puisque l chantillon de d part tant une culture bact rienne cette zone devrait d velopper un signal positif Lamplification du contr le peut n anmoins tre att nuer par Uamplification du des sequencels sp cifique s Dans de rares cas le signal du Contr le Universel peut appara tre faible bien que le test ait t r alis correc tement et qu aucune autre bande ne soit d tect e Veuillez noter que le Contr le Universel n est pas un contr le de PCR Par exemple cette zone restera n gative avec un contr le de contamination Autres bandes Sondes sp cifiques utiliser le tableau d interpr tation pour l valuation des r sul tats Seules Les lignes color es d intensit environ gale ou sup rieure celle du Contr le Universel doivent tre prises en compte pour l interpr tation Toutes les lignes d une m me bandelette peuvent ne pas pr senter la m me intensit Lorsqu une quantit importante d amplicons a t utilis e pour l hybridation d autres bandes peuvent occasionnellement appara tre voir chapitre Causes d Erreurs 11 Tableau d Interpr tation slurwoy Sn2
17. s es avec des sondes sp cifiques 12 96 PNM BC grampositive 1 contient les amorces sp cifiques nucl otides et colorant 0 5 m 4m PNM BC grampositive 2 contient les amorces sp cifiques nucl otides et colorant 0 5 m 4m Solution de D naturation DEN pr t l emploi contient lt 2 NaOH colorant 0 6 m 48m Solution d Hybridation HYB pr t l emploi contient 8 10 de detergent anionique colorant 20 m 120 m Solution de Lavage Stringent STR pr t l emploi contient gt 25 d un sel d ammonium quaternaire lt 1 detergent anionique colorant 20 m 120 m Solution de Rincage RIN pr t l emploi contient du tampon lt 1 NaCl lt 1 de d tergent anionique 50 m 360 ml Conjugu Concentr CON C concentr contient de la phosphatase alcaline conjugu la streptavidine colorant 0 2m 1 2 ml Tampon Conjugue CON D contient du tampon 1 agent bloquant lt 1 NaCl 20 m 120 ml Substrat Concentr SUB C concentr contient du Dimethyl Sulfoxide solution substrat 0 2m 1 2 ml Tampon Substrat SUB D contient du tampon lt 1 Matt lt 1 NaCl 20m 120 ml bac feuille d valuation 1 de chaque 4 de chaque manuel d utilisation matrice 1 de chaque 1 de chaque Commandes Set de d marrage emporte pi ce 5 cartes protectrices r f 6002 Embout de rechange embout 5 cartes protectrices r f PRO27 GENOeCARD pour 3x 4 chantillons ref 6001 GENOeCARD pour 24x 4 chantillons ref 600196 17 HAIN
18. te du champs chantillon Eliminer chaque disque d coup Remarque Observer les proc dures de lavage d crites au chapitre Conservation et Pr cautions Remplacer la carte protectrice si celle ci montre des signes clairs d usure Veuillez noter que chaque carte poss de 4 champs de d coupage En cas d usure l extr mit de l emporte pi ce peut tre command e Hain Lifescience voir chapitre Commandes Amplification V rifier la pr sence du disque dans chaque tube PCR D coller tout disque de la paroi des tubes en agitant ou en centrifugeant Profil d amplification 5 min 95 C 1 cycle o 30 sec 95 C 10 cycles 2 min 58 C 25 sec 95 C 40 sec 53 C 20 cycles 40 sec 70 C 8 min 70 C 1 cycle 3 S applique a Taq polym rase recommand e En cas d utilisation d autres Taq polym rases la dur e de la premi re tape devra peut tre tre rallong e en cas d utilisation d ADN se r f rer au manuel de l enzyme Les produits d amplification peuvent tre conserv s entre 8 et 20 C La r action d amplification peut tre contr l e par lectrophor se en gel en d posant directement 5 pl de chaque chantillon sans aucun tampon additionnel Les amplicons g n r s avec le PNM BC grampositive 1 pr sentent une taille de 250 pb Staphylo coccus sp Streptococcus sp et Enterococcus sp 132 pb et 80 pb Staphylococcus sp les deux Les amplicons g n r s avec le PNM BC grampositive 2 pr sentent des
19. te pasteur reli e une pompe vide Ajouter chaque puits 1 ml de Solution de Lavage Stringent STR rouge et incuber 15 minutes 45 C dans le bain marie agitateur TwinCubator partir de cette tape travailler temp rature ambiante Eliminer la Solution de Lavage Stringent Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container a d chets Eliminer tout le liquide r siduel en retournant le bac sur du papier absorbant effectuer de m me pour les autres tapes de lavage Laver chaque puits avec 1 ml de Solution de Rincage RIN et incuber pendant 1 minute sous agitation TwinCubator plateau agitateur Vider la Solution de Rincage 10 Ajouter chaque puits 1 ml de Conjugue dilu voir ci dessus et incuber 30 mi nutes sous agitation TwinCubator plateau agitateur Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute a l aide de 1 ml de Solution de Rincage RIN Vider RIN R p ter ce rin age une nouvelle fois puis rincer une fois avec environ 1 ml d eau distill e l aide d une pissette Bien liminer toute trace d eau dans les puits apr s cette derni re tape 12 Ajouter 1 ml de Substrat dilu voir ci dessus dans chaque puits et incuber sans agitation l obscurit Le temps de r v lation peut varier en fonction des conditions de d roulement du test de 3 20 minutes notamment de la temp rature de la pi ce Des temps de r v lation trop longs peuvent entra ner un bru
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