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PeliCluster CD36

1. Paraformalde do 1 em PBS contendo 0 2 BSA pH 7 2 Microplacas 96 po os fundo em V ou tubos em pl stico para citometria de fluxo Cit metro de fluxo O utilizador deve consultar a informa o constante do guia informativo do respectivo instrumento O processo emprega um fixador formalde do Deve se evitar o contacto com a pele ou com as mucosas 5 ESP CIMEN S Podem se preparar as amostras de sangue para a an lise de fluxo citom trico utilizando processos de prepara o PBMC A prepara o PBMC fornece mais resultados dependentes de t cnica 1 Proceder colheita de sangue de forma ass ptica por venopunctura 1 2 para um tubo de colheita de sangue esterilizado com KsEDTA necess rio um m nimo de 1 ml de sangue total para o m todo de sangue total e um m nimo de 2 ml de sangue total para a prepara o PBMC Armazenar temperatura ambiente 18 a 25 C o sangue anticoagulado PRECAU ES Considerar todas as amostras biol gicas e materiais que entrem em contacto com elas como sendo de perigo biol gico As amostras devem ser manipuladas como potencialmente infecciosas 3 4 e eliminadas de acordo com os regulamentos federais estatais e locais N o pipetar com a boca Usar roupas protectoras adequadas e luvas Foi relatado que a fixa o inactiva o VIH 5 6 PROCEDIMENTOS A M todo com c lulas purificadas ficoll 1 Preparar uma suspens o celular mononuclear com uma
2. Per la microscopia in fluorescenza risospendere le cellule in 50 pl di terreno di fissaggio trasferire le cellule su un vetrino da microscopia e coprirle con un coprioggetto In generale si consiglia di utilizzare 5 ul di anticorpo monoclonale non diluito In alternativa possibile determinare una diluizione ottimale Per determinare la fluorescenza di base utilizzare sempre un controllo negativo dallo stesso isotopo Risultati analitici In alcuni stati patologici ci si pu attendere un numero elevato di cellule esprimenti tale antigene o livelli di espressione dell antigene anormale Per effettuare l analisi appropriata importante comprendere il normale pattern di espressione di tale antigene e la sua relazione con l espressione di altri antigeni rilevanti Citometria a flusso Prima di correre le cellule sul citometro a flusso miscelarle accuratamente utilizzando un vortex a bassa velocit per ridurne l aggregazione 6 Acquisire e analizzare i dati in modalit elenco utilizzando il programma adatto Prima di acquisire i campioni aggiustare la soglia per minimizzare i detriti ed assicurarsi che le popolazioni di interesse siano incluse La fig 1 mostra alcuni dati rappresentativi derivanti da linfociti gated L eccitazione laser a 488 nm Fig 1 Profilo di fluorescenza gates di dispersione impostati sulla frazione di monociti R1 O NEG CTRL m FITC NOTA Una impostazione impropria del gate sui
3. une concentration plus lev e refaire la coloration et l analyse Mauvais D panner fonctionneme l instrument nt du cytom tre BIBLIOGRAPHIE 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Nayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC
4. E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 Reactivos monoclonales de rat n antihumanos para la identificaci n de c lulas que expresan el ant geno CD36 Clon CLB IVC7 Forma ITCF M1613 X0033 480spa 1112061612 ivo Ce 1 USO PREVISTO Los anticuerpos PeliCluster son para uso diagn stico in vitro Los reactivos identifican y enumeran las c lulas que expresan el ant geno CD utilizando un cit metro de flujo para el an lisis Para evitar interferencias con los hemat es durante el an lisis se recomienda el tratamiento de la sangre completa con un reactivo de lisis Pelilyse A1 n mero de pedido M7101 6 El cit metro de flujo debe estar equipado para detectar la dispersi n de la luz y la fluorescencia apropiada y debe estar equipado con el software apropiado para la adquisici n y el an lisis de datos Consulte las instrucciones en el manual de uso del instrumento Aplicaciones Estudios funcionales en c lulas 2 COMPOSICI N El clon CLB IVC7 se obtuvo por hibridaci n de c lulas SP2 0 con c lulas de bazo de un rat n BALB c inmunizado con monocitos humanos El anticuerpo fue clasificado como CD36 en el Sexto Taller Internacional sobre Ant genos de Diferenciaci n de Leucocitos Humanos El clon CLB IVC7 pertenece a la subclase IgG1 de rat n El anticuerpo est conjugado con is mero 1 de isotiocianato de fluoresce na ITCF La proporci n de mol cul
5. group moyenne FITC 7 620 16 123 16 19 9 N nombre d chantillons 8 LIMITES Les conjugu s avec des fluorochromes plus brillants PE PE Cy5 donnent une s paration plus importante que les conjugu s avec d autres colorants FITC Lorsque les populations se chevauchent le calcul du pourcentage positif pour les marqueurs peut tre affect par le choix du fluorochrome L utilisation d anticorps monoclonaux dans le cadre du traitement du patient peut interf rer avec la reconnaissance d antig nes cible par ce r actif Cela doit tre pris en compte lors de l analyse d chantillons de patients trait s de cette mani re Sanquin Reagents n a pas caract ris l effet de la pr sence d anticorps th rapeutiques sur les performances de ce r actif Les r actifs uniques ne peuvent fournir que des informations limit es pour l analyse des leuc mies et des lymphomes L utilisation d associations d autres r actifs et l application d autres proc dures diagnostiques peuvent fournir plus d informations que l utilisation de ces r actifs uniquement L analyse multicolore utilisant des associations ad quates de r actifs est fortement recommand e Comme les r actifs peuvent tre utilis s dans diff rentes associations les laboratoires doivent se familiariser avec les propri t s de chaque anticorps en association avec d autres marqueurs dans des chantillons normaux et anormaux Les performances des
6. gt Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 Monoclonal mouse anti human reagent for identification of cells expressing CD36 antigen Clone M1613 CLB IVC7 Form FITC X0033 480eng 1112061612 Ce 1 INTENDED USE The PeliCluster antibodies are intended for in vitro diagnostic use The reagents identify and enumerate cells expressing the CD antigen using a flow cytometer for analysis To prevent interference with red cells during analysis treatment of whole blood with lysing reagent Pelilyse A1 order number M7101 6 is recommended The flow cytometer must be equipped to detect light scatter and the appropriate fluorescence and be equipped with the appropriate software for data acquisition and analysis Refer to your instrument user s guide for instructions Applications Functional studies on cells 2 COMPOSITION Clone CLB IVC7 has been derived from hybridisation of SP2 0 cells with spleen cells of a BALB c mouse immunised with human monocytes The antibody was submitted to CD36 in the Sixth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens Clone CLB IVC7 is of a mouse IgG1 subclass The antibody is conjugated with fluorescein iso thiocyanate isomer 1 FITC The molecular F P ratio is between 5 and 10 The antibody was purified f
7. lise Para a citometria de fluxo resuspender as c lulas adicionando 200 pl Seq microplaca ou aos tubos Se tiver sido utilizada uma microplaca transferir os conte dos para os tubos apropriados Para a microscopia de fluoresc ncia resuspender as c lulas em 50 yl de meio de inclus o transferir as c lulas para uma l mina de microsc pio e cobrir com um vidro Podem ser utilizados duma forma geral 5 ul de anticorpo monoclonal n o dilu do Em alternativa pode se determinar uma dilui o ptima Para determinar a fluoresc ncia de fundo utilizar sempre um controlo negativo para o mesmo is tipo Resultados anal ticos Pode se esperar encontrar nalguns est dios de doen a n meros anormais de c lulas expressando este antig nio ou n veis de express o aberrante do antig nio importante compreender o padr o de express o normal para este antig nio e a sua rela o para a express o de outros antig nios relevantes de forma a efectuar uma an lise adequada Citometria de fluxo Agitar as c lulas energicamente a baixa velocidade a fim de reduzir a agrega o antes de correr as c lulas no cit metro de fluxo 6 Recolha e analise os dados utilizando software apropriado Antes de recolher os dados das amostras ajuste o limiar a fim de minimizar res duos e de assegurar a integra o de popula es de interesse A fig 1 apresenta dados representativos efectuados em linf citos capturados A excita
8. o por laser situa se a 488 nm Fig 1 Perfil de fluoresc ncia gates de dispers o fixados na frac o monocit ria R1 NEG CTRL m FITC NOTA A fixac o inapropriada do gate nos dados da amostra pode originar resultados incorrectos Controlo de qualidade interno Recomenda se o uso dum controlo negativo consultar o cat logo da Sanquin Reagents a fim de determinar a fluoresc ncia de fundo produzida devido s capacidades de ligac o de Fc pelas c lulas mononucleares A concentrac o e o ndice F P destes controlos foram ajustados aos anticorpos monoclonais conjugados da Sanquin Reagents 7 CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Especificidade O anticorpo monoclonal dirigido contra o antig nio CD36 gplV tamb m conhecido como gplllb expresso em tromb citos humanos a massa molecular de 90 kDa Reage com mon citos macr fagos c lulas eritr ides precoces megacari citos e plaquetas e fracamente com c lulas B Em imunohistologia o anticorpo reage com algumas c lulas endoteliais adip citos e com a camada granular da pele 7 10 Sensibilidade A sensibilidade definida como uma resolu o da popula o negativa CD da popula o positiva CD diferente A sensibilidade foi medida por avalia o duma extens o de concentra es de anticorpos Cada concentra o foi testada em sangue total A separa o do CD positivo do CD negativo foi determinada por cada amostra e calibrada em c
9. partir de chaque chantillon et une moyenne a t calcul e pour chaque concentration La concentration d anticorps en flacon pour chaque r actif a fourni une sensibilit optimale pour la distinction entre les cellules CD positives et les cellules CD n gatives Reproductibilit R p tabilit Les CD ont t soumis I un des Ateliers internationaux sur les antig nes de diff renciation des leucocytes humains International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens ou remplissent les sp cifications de l atelier voir composition Pour d terminer la r p tabilit de la coloration avec chaque r actif les chantillons ont t color s avec plusieurs lots de r actifs Les diff rents chantillons utilis s pour l valuation ont donn une valeur d intensit de fluorescence moyenne pr sent e dans le tableau 2 Pour chaque chantillon deux lots diff rents de r actifs ont g n r une paire de r sultats Les carts type individuels ont t d termin s partir des r sultats group s en paire de chaque chantillon Les carts type ont t combin s pour d river un cart type group pour chaque r actif qui fournit une estimation de la reproductibilit intra chantillon Tableau 2 R p tabilit de l intensit de fluorescence moyenne de cellules cibles dans des lots diff rents N et pour des donneurs multiples N Intensit de Ecart type CV fluorescence group
10. r CD36 eingereicht Klon CLB IVC7 geh rt zur Maus IgG1 Subklasse Der Antik rper ist onjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat lsomer 1 FITC Das molekulare F P Fluoreszein Protein Verh ltnis betr gt zwischen 5 und 10 Der Antik rper wurde s ulenchromatografisch lonenaustauschchromatografie aus Aszites gereinigt Bestandteile der Reagenzien Das Reagenz befindet sich in 1 ml 20 mM TRIS plus 150 mM NaCl pH 8 0 mit 1 w v BSA und 0 1 w v NaNs als Konservierungsmittel siehe Tabelle 1 Tabelle 1 Inhalt der Fl schchen FITC 100 Tests pro ml in TRIS Puffer WARNHINWEIS Natriumazid ist bei Verschlucken sch dlich R22 AuRerhalb der Reichweite von Kindern aufbewahren S2 Nicht in Kontakt mit Lebensmitteln Getr nken und Tierfutter bringen S13 Geeignete Schutzkleidung tragen S36 Bei Verschlucken sofort einen Arzt hinzuziehen und diese Verpackung oder dieses Etikett vorzeigen S46 Bei Kontakt mit S uren wird hoch toxisches Gas freigesetzt R32 Bei der Entsorgung von Azidverbindungen in den Abfluss muss mit viel Wasser nachgesp lt werden um mit Explosionsrisiko verbundene Ablagerungen in Blei oder Kupferleitungen zu vermeiden 3 AUFBEWAHRUNG UND HANDHABUNG Das Antik rperreagenz ist bei Lagerung bei 2 bis 8 C bis zum auf dem Etikett aufgedruckten Verfalldatum stabil Nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden Reagenz w hrend der Aufbewahrung oder bei der Inkubation m
11. sobrep em o c lculo da percentagem positiva para os marcadores pode ser afectado pela escolha do fluorocromo A utiliza o de anticorpos monoclonais no tratamento de pacientes pode interferir com o reconhecimento de antig nios alvo por este reagente Isto dever ser tomado em considera o ao analisar amostras de pacientes tratados por este m todo A Sanquin Reagents n o caracterizou o efeito da presen a de anticorpos terap uticos na actua o deste reagente Reagentes nicos podem fornecer unicamente uma informa o limitada na an lise de leucemia e de linfomas A utiliza o duma combina o de outros reagentes e a aplica o de outros processos de diagn stico pode fornecer mais informa o do que apenas a aplica o destes reagentes Recomenda se vivamente a an lise multicolor usando uma combina o relevante de reagentes Dado os reagentes poderem ser utilizados em diferentes combina es os laborat rios precisam de se familiarizar com as propriedades de cada anticorpo em conjunto com outros marcadores em amostras normais e anormais O desempenho dos dados do reagente foi tipicamente recolhido com sangue tratado com EDTA O desempenho do reagente pode ser afectado pelo uso de outros anticoagulantes RESOLU O DE PROBLEMAS Problema Causa Solu o poss vel Baixa Interac o Preparar e resolu o celular com marcar outra entre o ru do outras c lulas amostra de fund
12. concentra o de 1 x 10 c lulas ml 2 Adicionar 40 pl de suspens o celular aos recipientes de microtitulac o ou aos tubos 3 Adicionar 10 pl de anticorpo n o dilu do aos recipientes de microtitula o ou aos tubos e misturar com cuidado 4 Incubar durante 30 minutos entre 2 e 8 C 5 Adicionar 150 ul de tamp o aos recipientes de microtitula o ou 2 ml de tamp o aos tubos e centrifugar a 500 x g durante 5 minutos 6 Aspirar o sobrenadante do pellet celular e resuspender as c lulas 7 Adicionar 200 ul de tamp o aos recipientes de microtitula o ou 2 ml de tamp o aos tubos e centrifugar a 500 x g durante 5 minutos 8 Aspirar o sobrenadante do pellet celular e resuspender as c lulas 9 An lise do cit metro de fluxo Adicionar 200 ul de tamp o aos recipientes de microtitula o e transferir esta suspens o celular final para os tubos apropriados ou adicionar 200 yl de tamp o aos tubos 10Se n o for poss vel efectuar a an lise dentro de 8 horas adicionar no n 9 200 ul PFA 1 em vez de tamp o A Sanquin Reagents recomenda que se proceda ent o an lise nas 24 horas seguintes B M todo de sangue total Colher sangue para um tubo de colheita de sangue contendo EDTA 2 Verter para o fundo do tubo de ensaio 100 ul de sangue total bem misturado 3 Adicionar no fundo do tubo de ensaio 10 ul dos anticorpos n o dilu dos e misturar com firmeza durante 30 segundos 4 Incubar durante 15 a 30 m
13. dati dei campioni pu fornire risultati non corretti Controllo di qualita interno Si consiglia l uso di un controllo negativo consultare il catalogo dei reagenti Sanquin per determinare la fluorescenza di base prodotta dalla capacit di legame delle cellule mononucleari tramite il frammento Fc La concentrazione ed il rapporto F P di questi controlli sono stati aggiustati rispetto agli anticorpi monoclonali coniugati Sanquin Reagents 7 CARATTERISTICHE DI FUNZIONAMENTO Specificit L anticorpo monoclonale diretto contro I antigene CD36 gplV conosciuto anche come gplllb espresso dai trombociti umani peso molecolare 90 kDa Esso reagisce con monociti macrofagi cellule eritroidi early megacariociti piastrine e debolmente con le cellule B In immunoistologia l anticorpo reagisce con alcune cellule endoteliali adipociti e lo strato granulare della cute 7 10 Sensibilit La sensibilit definita dalla separazione della popolazione CD negativa dalla diversa popolazione CD positiva La sensibilit stata misurata valutando un intervallo di concentrazioni dell anticorpo Ogni concentrazione stata analizzata sul sangue intero Per ogni campione stata determinata la separazione delle cellule CD positive da quelle CD negative ed stata calcolata la media per ogni concentrazione La concentrazione dell anticorpo nella bottiglia per ogni reagente garantisce una sensibilit ottimale per la sepa
14. donne des r sultats qui d pendent plus de la technique 1 Pr lever le sang de mani re aseptique par ponction veineuse 1 2 dans des tubes de recueil de sang st riles KsEDTA Au moins 1 ml de sang complet est n cessaire pour la m thode sur sang complet et au moins 2 ml de sang complet sont n cessaires pour la pr paration des CMSP Conserver le sang anti coagul temp rature ambiante 18 25 C AVERTISSEMENT Consid rer tous les chantillons biologiques ainsi que le mat riel qui entre en contact avec eux comme pr sentant un risque biologique Les chantillons doivent tre manipul s comme des chantillons potentiellement infectieux 3 4 et limin s conform ment aux r glementations f d rales d tat et locales Ne pas pipeter la bouche Porter des v tements et des gants de protection adapt s Il a t rapport que la fixation d sactive le VIH 5 6 PROCEDURES A M thode avec cellules purifi es ficoll 1 Pr parer une suspension de cellules mononucl es une concentration de 1 x 10 cellules ml 2 Ajouter 40 ul de suspension de cellules dans des puits de microtitration ou des tubes 3 Ajouter 10 gl de l anticorps non dilu aux puits de microtitration ou aux tubes et m langer doucement 4 Incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C 5 Ajouter 150 ql de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 6 Aspirer le surn
15. n 1 2 en un tubo de muestras est ril con KsEDTA Para el m todo de sangre completa se necesita como m nimo 1 ml de sangre completa y para la preparaci n de PBMC un m nimo de 2 ml de sangre completa Conservar la sangre anticoagulada a temperatura ambiente 18 25 C ADVERTENCIA Todas las muestras biol gicas y los materiales en contacto con ellas deben considerarse como material con riesgo biol gico Las muestras deben tratarse como potencialmente infecciosas 3 4 y desecharse de acuerdo con las normativas federales estatales y locales No pipetear con la boca Llevar ropa y guantes de protecci n adecuados Se ha descrito que la fijaci n inactiva al VIH 5 6 PROCEDIMIENTOS A M todo con c lulas purificadas en Ficoll 1 Preparar una suspensi n de c lulas mononucleares con una concentraci n de 1 x 10 c lulas ml 2 A adir 40 yl de suspensi n celular a los pocillos o tubos de microtitulaci n 3 A adir 10 ul de anticuerpos no diluidos a los pocillos o tubos de microtitulaci n y mezclar con cuidado Incubar durante 30 minutos a 2 8 C A adir 150 ul de tamp n a los pocillos o 2 ml a los tubos y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos 6 Aspirar el sobrenadante de la pastilla de c lulas y resuspender las c lulas 7 A adir 200 ul de tamp n a los pocillos o 2 ml a los tubos y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos 8 Aspirar el sobrenadante de la pastilla de c lulas y resuspender las c lul
16. r actifs ont t classiquement valu es sur sang trait l EDTA Les performances des r actifs peuvent tre affect es par l utilisation d autres anticoagulants DEPANNAGE Probl me Cause Solution possible Faible Interaction Pr parer et distinction avec d autres colorer un entre les cellules et autre d bris et les avec les chantillon lymphocytes plaquettes Mauvaise V rifier la manipulation viabilit amp des de la cellules pr paration de centrifuger cellules les cellules une vitesse plus faible R glage Respecter les inad quat de proc dures l instrument de r glage de l instrument optimiser les r glages de l instrument selon les besoins Coloration Concentration V rifier et faible ou de cellules ajuster la diminuant trop forte lors concentration de l tape de de cellules ou coloration le volume de l chantillon colorer avec de l chantillon frais Quantit Refaire la insuffisante de coloration en r actif utilisant une quantit plus importante d anticorps Cellules non R p ter la analys es coloration dans les 8 avec de heures suivant l chantillon la coloration frais analyser rapidement Pr paration Utiliser du incorrecte du conservateur milieu oubli dans le milieu du de coloration conservateur et lors des tapes de lavage Peu ou pas Concentration Remettre en de cellules de cellules suspension trop faible de l chantillon frais
17. v PBS BSA Wash and dilution buffer for platelets Sequestrine buffer Seq storage 1 month at 2 to 8 C 10 x stock solution dissolve in 1 litre of distilled water Na2HPO4 H20 31 3 g NazEDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0 g Prior to use dilute in distilled water add BSA till final concentration of 0 2 w v Mix and adjust pH to 6 8 Fixation buffer PFA BSA Para Formaldehyde 1 in PBS containing 0 2 BSA pH 7 2 Microwell plates 96 wells V bottom or plastic flow cytometry tubes Flow cytometer Refer to the appropriate instrument user s guide for information The procedure employs a fixative formaldehyde Contact is to be avoided with skin or mucous membranes 5 SPECIMEN S Blood samples can be prepared for flow cytometric analysis by using PBMC preparation procedures PBMC preparation yield more technique dependent results 1 Collect blood aseptically by venipuncture 1 2 into sterile Ks3EDTA blood collection tube A minimum of 1 ml of whole blood is required for the whole blood method and a minimum of 2 ml of whole blood is required for PBMC preparation Store anticoagulated blood at room temperature 18 to 25 C WARNING Consider all biological specimens and materials which come in contact with them as biohazardous Specimens should be handled as potentially infectious 3 4 and disposed in accordance with federal state an local regulations Do not pipet by mouth Wear suitable pro
18. 6 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 R actifs monoclonaux murins anti humains pour l identification des cellules exprimant l antig ne CD36 Clone M1613 CLB IVC7 Forme FITC X0033 480fra 1112061612 IVD CE 1 INDICATION Les anticorps PeliCluster sont con us pour le diagnostic in vitro Les r actifs identifient et num rent les cellules exprimant l antigene CD sur cytom tre de flux Pour viter toute interf rence avec les globules rouges pendant l analyse le traitement du sang complet par r actif de lyse est recommand PeliLyse A1 num ro de commande M7101 6 Le cytom tre de flux doit tre quip pour d tecter la diffusion de la lumi re et la luorescence appropri e et quip du logiciel ad quat d acquisition et d analyse des donn es Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument Applications tudes fonctionnelles des cellules 2 COMPOSITION Le clone CLB IVC7 a t d riv par hybridation de cellules SP2 0 avec des cellules de rate d une souris BALB c immunis e avec des monocytes humains L anticorps a t soumis CD36 lors du 6 Atelier international sur les antig nes de diff renciation des leucocytes humains Sixth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens Le clone CLB IVC7 appartient une sous classe d IgG1 murin
19. 7 deriva dall ibridizzazione di cellule SP2 0 con splenociti di un topo BALB c immunizzato con monociti umani L anticorpo stato presentato come anti CD36 nel corso del Sesto Convegno Internazionale sugli antigeni di differenziazione dei leucociti umani Il clone CLB IVC7 appartiene alla sottoclasse IgG1 delle immunoglobuline murine L anticorpo coniugato con l isomero 1 della fluoresceina isotiocianato FITC Il rapporto molecolare F P compreso tra 5 e 10 L anticorpo stato purificato da asciti con la tecnica cromatografica cromatografia a scambio ionico Contenuto del reagente Il reagente fornito in 1 ml di soluzione composta da TRIS 20 mM e NaCl 150 mM pH 8 0 contenente BSA 1 p v e NaN 0 1 p v come conservante vedi tabella 1 Tabella 1 Contenuto delle bottiglie FITC 100 test per ml in TRIS AVVERTENZE La sodiazide dannosa in caso d ingestione R22 Conservare fuori della portata dei bambini S2 Conservare lontano da alimenti bevande e mangimi per animali S13 Indossare indumenti protettivi idonei S36 In caso d ingestione consultare immediatamente il medico e mostrargli il contenitore o la sua etichetta S46 A contatto con acidi libera gas altamente tossici R32 Durante l eliminazione i composti dell azide devono essere lavati via con grandi volumi di acqua per evitare depositi nei tubi di piombo o di rame in cui possono verificarsi condizioni esplosive 3 CONSERVAZIO
20. 90 minuti Se non possibile effettuare l analisi entro 90 minuti centrifugare le provette a 500x g per 5 minuti Se l analisi effettuata entro 8 ore aspirare il supernatante dal pellet e risospendere le cellule in 1 ml di tampone In caso contrario il pellet va risospeso in 1 ml di PFA 1 Sanquin Reagents consiglia di effettuare l analisi entro 24 ore Questo metodo stato sviluppato per campioni di sangue con un conteggio del bianco normale utilizzando PeliLyse A1 soluzione lisante codice M7101 6 Nel caso di campioni con un conteggio del bianco molto alto o molto basso pu essere necessario aggiustare la quantit di sangue C Citometria a flusso e microscopia della membrana delle piastrine 1 Trasferire 45 ul di una sospensione di piastrine 1 x 10 cellule ml nella piastra Elisa o in provette ed aggiungere 5 ul di anticorpo monoclonale Miscelare delicatamente ed incubare per 30 minuti ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C 2 Lavare miscelando ed aggiungere Seq alla piastra Elisa 1 lavaggio 150 ul 2 lavaggio 200 ul o alle provette 2 ml Centrifugare a 1000 x g per 5 minuti ed aspirare il supernatante ripetere la procedura una seconda volta 3 Preparazione delle cellule per l analisi Per la citometria a flusso risospendere le cellule aggiungendo alla piastra Elisa o alle provette 200 pl di Seq Se si utilizzata una piastra Elisa trasferire il contenuto dei pozzetti in idonee provette
21. American Society for Microbiology 1986 226 235 7 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 8 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 9 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989 gt Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 Reagenti monoclonali murini diretti contro antigeni umani per l identificazione di cellule che esprimono l antigene CD36 Modello FITC M1613 Clone CLB IVC7 X0033 480ita 1112061612 IVD C 1 DESTINAZIONE D USO Gli anticorpi PeliCluster sono stati progettati per l utilizzo nella diagnostica in vitro Il reagente identifica e quantifica le cellule che esprimono l antigene CD utilizzando per l analisi un citometro a flusso Per prevenire l interferenza con gli eritrociti nel corso dell analisi si consiglia di trattare il sangue intero con il reagente lisante PeliLyse A1 codice M7101 6 Il citometro a flusso deve essere in grado di rivelare la dispersione della luce e l appropriata fluorescenza e deve essere dotato del programma adatto per l acquisizione e l analisi dei dati Per le istruzioni fare riferimento al manuale d uso dello strumento Applicazioni Studi funzionali sulle cellule 2 COMPOSIZIONE Il clone CLB IVC
22. NE E MANIPOLAZIONE Se conservato a temperature comprese tra 2 e 8 C l anticorpo stabile fino alla data di scadenza riportata sull etichetta Non utilizzare oltre la data di scadenza Non congelare il reagente o esporlo alla luce diretta del sole durante la conservazione o l incubazione con le cellule Tenere asciutto l esterno del flaconcino contenente il reagente Se si notano segni di deterioramento ad es un aumento di compensazione o una perdita sostanziale di reattivit non utilizzare il reagente 4 REAGENTI O MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI Soluzione lisante PeliLyse codice M7101 6 Tampone di lavaggio e di diluizione per cellule mononucleari tampone fosfato isotonico contenente 0 2 di BSA peso volume PBS BSA Tampone di lavaggio e di diluizione per piastrine Tampone Sequestrine Seq conservazione 1 mese a temperatura compresa tra 2 e 8 C Soluzione stock 10 x dissolvere in 1 litro di acqua distillata NazHPO4 H20 31 39 NazEDTA 2H20 33 3 g NaCl 0 0g Prima dell uso diluire in acqua distillata aggiungere BSA fino alla concentrazione finale di 0 2 peso volume Miscelare e aggiustare il pH a 6 8 Tampone di fissaggio PFA BSA Paraformaldeide 1 in PBS contenente 0 2 di BSA pH 7 2 Piastre Elisa a 96 pozzetti fondo a V o tubi di plastica per citometria a flusso Citometro a flusso Per maggiori informazioni fare riferimento al manuale d uso dello strumento L
23. Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 7 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 8 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 9 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989
24. a procedura prevede l utilizzo di un fissante la formaldeide Evitare il contatto con la pelle o le membrane mucose 5 CAMPIONE I campioni di sangue possono essere preparati per l analisi citometrica utilizzando le procedure di preparazione PBMC La preparazione PBMC da risultati pi dipendenti dalla tecnica Raccogliere il sangue asetticamente con puntura venosa 1 2 in provette sterili con KsEDTA per la raccolta di sangue Per il metodo del sangue intero necessario almeno 1 ml di sangue per la preparazione PBMC sono richiesti almeno 2 ml di sangue intero Conservare il sangue non coagulato a temperatura ambiente da 18 a 25 C AVVERTENZE Considerare tutti i campioni biologici ed i materiali che vengono a contatto con questi come materiale biologico pericoloso campioni devono essere maneggiati come potenzialmente infetti 3 4 ed eliminati secondo le disposizioni federali statali e locali Non pipettare con la bocca Indossare idonei indumenti protettivi e guanti E stato riportato che la fissazione inattiva il virus dell HIV 5 6 PROCEDURE A Metodo delle cellule purificate con ficoll 1 Preparare una sospensione cellulare mononucleare con una concentrazione pari a 1 x 10 cellule ml 2 Dispensare 40 pl di sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra ELISA o nelle provette 3 Aggiungere 10 pl di anticorpo non diluito ai pozzetti di una piastra ELISA o nelle provette e mescolare delicatament
25. ada concentra o A concentra o de anticorpo dos recipientes apresentou para cada um dos reagentes uma sensibilidade ptima na determina o das c lulas CD positivas das negativas Reprodutibilidade Replicabilidade Os CDs foram apresentados num dos Workshops Internacionais acerca da Diferencia o de Antig nios de Leuc citos Humanos ou preenchem as especifica es do workshop vide composi o De forma a determinar a replicabilidade da marca o com cada reagente as amostras foram marcadas com m ltiplos lotes de reagentes As diferentes amostras usadas na avalia o forneceram um valor m dio de intensidade de fluoresc ncia IMF conforme consta no quadro 2 Por cada amostra foi gerado um par de resultados por dois lotes diferentes de reagentes Os SDs individuais foram determinados a partir dos resultados emparelhados para cada amostra Os SDs foram combinados de forma a derivar um SD conjunto por cada reagente que forne a uma estimativa da replicabilidade da amostra Quadro 2 Replicabilidade da intensidade m dia da fluoresc ncia IMF das c lulas alvo nos diferentes lotes N e nos diferentes dadores N M dia da SD pooled CV IMF pooled FITC 7 620 16 123 16 19 9 N n mero de amostras 8 LIMITA ES Os conjugados com fluorocromos mais brilhantes PE PE Cy5 dar o uma maior separa o do que os que utilizam outros corantes FITC Quando as popula es se
26. ageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension 7 Ajouter 200 pl de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 8 Aspirer le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension 9 Analyse sur cytom tre de flux Ajouter 200 ul de tampon aux puits de microtitration et transf rer cette suspension finale de cellules dans des tubes essai appropri s ou ajouter 200 ul de tampon dans les tubes 10 Si l analyse ne peut tre pratiqu e dans les huit heures qui suivent ajouter 200 ql de PFA 1 au lieu de tampon au point 9 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures B M thode sur sang total 1 Pr lever le sang dans un tube de recueil de sang contenant de l EDTA 2 Verser 100 gl de sang complet soigneusement m lang au fond de chaque tube essai 3 Ajouter 10 pl des anticorps non dilu s au fond du tube essai et m langer fermement pendant 30 secondes 4 Incuber pendant 15 30 minutes temp rature ambiante 5 M langer les tubes et ajouter 2 ml de solution de lyse Pelilyse A1 dilu e 10 x 6 Incuber pendant 10 15 minutes temp rature ambiante jusqu ce que la lyse soit termin e 7 Analyser les chantillons dans les 90 minutes qui suivent Si l analyse ne peut tre effectu e dans les 90 minutes centrifuger les tubes 500 x g pendant 5 minutes Aspir
27. ara cada muestra dos lotes distintos de reactivo generaron un par de resultados Se determinaron las desviaciones est ndar DE individuales a partir de los resultados pareados de cada muestra Las DE se combinaron para obtener una DE conjunta para cada reactivo que proporcione una estimaci n de la repetibilidad intramuestra Tabla 2 Repetibilidad de la intensidad de la fluorescencia media IFM de las c lulas diana de diferentes lotes N y varios donantes N Valor Mezcla Mezcla promedio MFI SD CV FITC 7 620 16 123 16 19 9 N n mero de muestras 8 LIMITACIONES Los conjugados con fluorocromos m s brillantes PE PE Cy5 muestran una mayor separaci n que aquellos con otros colorantes ITCF Cuando las poblaciones se superponen el c lculo del porcentaje de positivos para los marcadores puede verse afectado por la elecci n del fluorocromo El tratamiento de los pacientes con anticuerpos monoclonales puede interferir con el reconocimiento de los ant genos diana por este reactivo Esto debe tenerse en cuenta a la hora de analizar muestras de pacientes que han recibido un tratamiento de este tipo Sanquin Reagents no ha caracterizado el efecto de la presencia de anticuerpos terap uticos en la eficacia de este reactivo Los reactivos individuales s lo proporcionan informaci n limitada en el an lisis de leucemia y linfomas Una combinaci n de otros reactivos y la aplicaci n de otros proce
28. as 9 An lisis de citometr a de flujo A adir 200 pl de tamp n a los pocillos de microtitulaci n y transferir la suspensi n final de c lulas a tubos de ensayo apropiados o a adir 200 ul de tamp n a los tubos 10Si no es posible realizar el an lisis en un plazo de 8 horas a adir en el paso 9 200 ul de PFA al 1 en lugar de tamp n En este caso Sanquin Reagents recomienda realizar el an lisis en un plazo de 24 horas ap B M todo de sangre completa 1 Recoger la sangre en un tubo de muestras que contenga EDTA 2 Transferir 100 yl de sangre completa bien mezclada al fondo del tubo de ensayo 3 A adir 10 ql de anticuerpos sin diluir al fondo del tubo de ensayo y agitar bien durante 30 segundos 4 Incubar durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente 5 Agitar los tubos y a adir 2 ml de soluci n de lisis Pelilyse A1 10x diluida 6 Incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente hasta que la lisis est completa 7 Analizar las muestras en un plazo de 90 minutos Si no es posible realizar el an lisis en los siguientes 90 minutos centrifugar los tubos a 500x g durante 5 minutos Aspirar el sobrenadante de la pastilla de c lulas y resuspender las c lulas en 1 ml de tamp n si se van a analizar en un plazo de 8 horas o en 1 ml de PFA al 1 En este caso Sanquin Reagents recomienda realizar el an lisis en un plazo de 24 horas Este m todo se desarroll para muestras de sangre c
29. as F P oscila entre 5 y 10 El anticuerpo se purific del l quido asc tico por cromatograf a en columna cromatograf a de intercambio i nico Contenido de los reactivos El reactivo se suministra en 1 ml de TRIS 20 mM con NaCl 150 mM pH 8 0 con alb mina s rica de bovino BSA al 1 p v y NaNs al 0 1 p v como conservante v ase la tabla 1 Tabla 1 Contenido de los frascos ITCF 100 ensayos ml en TRIS ADVERTENCIA La azida s dica es nociva si se ingiere R22 Mantener fuera del alcance de los ni os S2 Mantener lejos de alimentos bebidas y piensos para animales S13 Llevar ropa protectora adecuada S36 En caso de ingesti n consultar inmediatamente un m dico y mostrar este envase o la etiqueta S46 El contacto con cidos libera un gas muy t xico R32 Los compuestos de azida deben desecharse seguidos de grandes cantidades de agua para evitar su acumulaci n en las tuber as de plomo o cobre donde pueden desarrollarse condiciones explosivas 3 CONSERVACI N Y MANIPULACI N El anticuerpo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta siempre que se conserve a una temperatura de 2 a 8 C No utilizar despu s de la fecha de caducidad No congelar el reactivo ni exponerlo a la luz directa durante su conservaci n o incubaci n con c lulas Mantener seca la parte exterior del vial del reactivo No utilizar el reactivo si muestra se ales de deterioro tales co
30. cal Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J mmunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 7 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 8 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 9 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989 gt A Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 106
31. d 2 ml of lysing solution Pelilyse A1 10x diluted 6 Incubate for 10 to 15 minutes at room temperature until lysing is complete 7 Analyse the samples within 90 minutes If analysis within 90 minutes is not possible centrifuge the tubes at 500x g for 5 minutes Aspirate the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells in 1 ml buffer when analysed within 8 hours or in 1 ml PFA 1 Sanquin Reagents recommends then analysing within 24 hours This method was developed for blood samples with a normal white count with the use of PeliLyse A1 lysing solution order number M7101 6 It may be necessary to adjust the quantity of blood for samples with very high or low white count C Platelet membrane flow cytometry and microscopy 1 Transfer 45 ul of platelet suspension 1x10 cells ml into the microwell plate or tubes and add 5 ul monoclonal antibody Mix gently and incubate for 30 minutes at 2 to 8 C 2 Wash by mixing and adding Seq to the microwell plate 1st wash 150 gl 2nd wash 200 ul or tubes 2 ml Centrifuge at 1000 x g for 5 minutes and aspirate the supernatant repeat this procedure once more 3 Prepare cells for analysis For flow cytometry resuspend the cells by adding 200 ul Seq to the microwell plate or tubes If a microwell plate was used the contents are transferred to appropriate tubes For fluorescence microscopy resuspend the cells in 50 ul embedding medium transfer cells to a microscop
32. der anderer Probe ng zwischen Zellen mit wiederholen Verunreinigun anderen g und Zellen und Lymphozyten Thrombozyte n Zellpr parat Lebensf higk wurde nicht eit der Zellen sorgf ltig berpr fen genug Zellen bei behandelt geringerer Geschwindig keit zentrifugieren Ungeeignete Anleitung zur Ger teeinstel Inbetriebnah lungen me des Ger ts beachten Ger teeinstell ung gegebenenfall s optimieren schwache Zellkonzentra Zellkonzentra oder tion beim tion oder verblassende Anf rbeschrit Probenvolum F rbung t zu hoch en berpr fen und korrigieren F rbung mit neuer Probe wiederholen Reagenzmen F rbung mit ge nicht einer ausreichend gr eren Menge Antik rper wiederholen Zellen F rbung mit wurden nicht frischer Probe innerhalb von wiederholen 8 Stunden sofort nach dem analysieren Anf rben analysiert Falsche Im Pr paration F rbemedium des Mediums und bei den es wurde Waschschritt kein en Konservierun Konservierun gsmit tel gsmit tel verwendet verwenden Wenige oder Zellkonzentra Frische Probe gar keine tion ist zu in einer Zellen gering h heren vorhanden Konzentration resuspendiere n F rbung und Analyse wiederholen Fehlfunktion Fehlersuche des beim Ger t Durchflusszyt durchf hren o meters QUELLENANGABE 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clini
33. dimientos diagn sticos puede proporcionar m s informaci n que el uso de estos reactivos solos Se recomienda el an lisis multicolor con una combinaci n de reactivos apropiada Dado que los reactivos se pueden utilizar en diferentes combinaciones los laboratorios deben familiarizarse con las propiedades de cada anticuerpo en combinaci n con otros marcadores en muestras normales y anormales Los datos de eficacia del reactivo se obtuvieron habitualmente con sangre tratada con EDTA La eficacia del reactivo puede verse afectada por el uso de otros anticoagulantes RESOLUCI N DE PROBLEMAS Problema Causa posible Soluci n Discrimin Interacci n aci n celular con escasa otras c lulas entre y plaquetas residuos y linfocitos Manejo rudo de la preparaci n celular Ajustes incorrectos del instrumento Preparar y te ir otra muestra Comprobar la viabilidad de las c lulas centrifugar las c lulas a una velocidad m s baja Seguir los procedimientos correctos de ajuste del instrumento optimizar los ajustes seg n sea necesario Tinci n Concentraci d bil o n de c lulas que demasiado desaparec alta en la fase e de tinci n paulatina mente Reactivo insuficiente Las c lulas no se analizaron en un plazo de 8 horas despu s de la tinci n Preparaci n incorrecta del medio omisi n del conservante Pocas Concentraci c lulas o n celular ausencia demasiado Contr
34. dung von CD positiven und negativen Zellen Reproduzierbarkeit Wiederholbarkeit Die CDs wurden bei einem der internationalen Workshops ber Differenzierungsantigene von menschlichen Leukozyten International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens eingereicht bzw erf llen die Spezifikationen des Workshops siehe Angaben zur Zusammensetzung Zur Bestimmung der Wiederholbarkeit der F rbung mit jedem Reagenz wurden die Proben jeweils mit mehreren Chargen angef rbt Die unterschiedlichen Proben die bei der Evaluierung verwendet wurden ergaben die in Tabelle 2 gezeigte mittlere Fluoreszenzintensit t MFI F r jede Probe ergaben sich durch Verwendung zweier unterschiedlicher Reagenzchargen zwei Ergebnisse Aus den paarweisen Ergebnissen f r jede Probe wurde die Standardabweichung SD bestimmt Die SDs wurden kombiniert und so f r jedes Reagenz eine gepoolte SD erhalten die einen Sch tzwert f r die Wiederholbarkeit der Messung einer Probe angibt Tabelle 2 Wiederholbarkeit der mittleren Fluoreszenzintensit t MFI von Zielzellen bei Verwendung unterschiedlicher Chargen N und Proben mehrerer Spender N Durch gepoolte gepoolter schnittl MFI SD KV FITC 7 620 16 123 16 19 9 N Anzahl der Proben 8 EINSCHR NKUNGEN Konjugate mit helleren Fluoreszenzfarbstoffen PE PE Cy5 ergeben eine bessere Unterscheidung als beispielsweise bei der Verwendung von FITC Bei be
35. e 4 Incubare per 30 minuti ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C 5 Aggiungere 150 yl di tampone ai pozzetti della piastra ELISA o 2 ml di tampone alle provette e centrifugare a 500 x g per 5 minuti 6 Aspirare il supernatante dal pellet e risospendere le cellule 7 Aggiungere 200 pl di tampone ai pozzetti della piastra ELISA o 2 ml di tampone alle provette e centrifugare a 500 x g per 5 minuti 8 Aspirare il supernatante dal pellet e risospendere le cellule 9 Analisi citometrica Aggiungere 200 pl di tampone ai pozzetti delle piastre ELISA e trasferire la sospensione cellulare finale alle provette appropriate oppure aggiungere 200 pl di tampone direttamente alle provette 10 Se non possibile effettuare l analisi nelle 8 ore successive aggiungere al punto 9 200 ul di PFA 1 al posto del tampone Sanquin Reagents consiglia di effettuare l analisi entro 24 ore B Metodo del sangue intero 1 Prelevare il sangue in una provetta contenente EDTA 2 Dispensare 100 gl di sangue intero ben miscelato sul fondo di una provetta per l analisi 3 Aggiungere 10 wl di anticorpi non diluiti sul fondo della provetta e miscelare fermamente per 30 secondi 4 Incubare da 15 a 30 minuti a temperatura ambiente 5 Miscelare le provette e aggiungere 2 ml di soluzione lisante PeliLyse A1 10x diluita 6 Incubare da 10 a 15 minuti a temperatura ambiente fino alla lisi completa delle cellule 7 Analizzare i campioni entro
36. e slide and place a cover glass In general 5 ul undiluted monoclonal antibody can be used Alternatively an optimal dilution can be determined To determine background fluorescence always use a negative control from the same isotype Analytical Results Abnormal number of cells expressing this antigen or aberrant expression levels of the antigen can be expected in some disease states It is important to understand the normal expression pattern for this antigen and its relationship to expression of other relevant antigens in order to perform appropriate analysis Flow cytometry Vortex the cells thoroughly at low speed to reduce aggregation before running the cells on the flow cytometer 6 Acquire and analyse list mode data using appropriate software Before acquiring samples adjust the threshold to minimise debris and ensure populations of interest are included Fig 1 displays representative data performed on gated Iymphocytes Laser excitation is at 488 nm Fig 1 Fluorescence profile scatter gates set on the monocyte fraction R1 NEG CTRL m FITC NOTE Improper gate setting on the sample data can give incorrect results Internal Quality Control The use of a negative control see Sanquin Reagents catalogue is recommended to determine background fluorescence produced due to Fc binding capacities by mononuclear cells The concentration and F P ratio of these controls have been adjusted to the conjugated mo
37. el ant geno CD36 gplV tambi n conocido como gplllb que se expresa en trombocitos humanos peso molecular 90 kDa Reacciona con monocitos macr fagos las primeras c lulas eritroides megacariocitos y plaquetas y d bilmente con los linfocitos B En inmunohistolog a el anticuerpo reacciona con algunas c lulas endoteliales adipocitos y la capa granular de la piel 7 10 Sensibilidad La sensibilidad se define como la discriminaci n entre la poblaci n negativa para CD y la poblaci n positiva para CD La sensibilidad se determin analizando una serie de concentraciones de anticuerpos Cada concentraci n se analiz con sangre completa En cada muestra se determin la separaci n de positivos y negativos para CD y se calcul la media para cada concentraci n La concentraci n de anticuerpo envasado para cada reactivo proporcion una sensibilidad ptima para discriminar entre las c lulas positivas y negativas para CD Reproducibilidad Repetibilidad La clasificaci n como CD se realiz en uno de los Talleres Internacionales sobre Ant genos de Diferenciaci n de Leucocitos Humanos o cumple con las especificaciones del Taller v ase la composici n Para determinar la repetibilidad de la tinci n con cada reactivo las muestras se ti eron con varios lotes de reactivos Las diferentes muestras utilizadas en la evaluaci n mostraron una intensidad de fluorescencia media MFI tal como se muestra en la tabla 2 P
38. eline Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989 gt gan Reage
39. em ou r tulo S46 O contacto com cidos liberta um g s muito t xico R32 Os compostos az dicos devem ser enxaguados com grandes volumes de gua aquando da sua elimina o a fim de evitar dep sitos nas tubagens de chumbo ou cobre o que pode dar azo a explos es 3 ARMAZENAMENTO E MANUSEAMENTO O reagente anticorpo est vel at expira o do prazo de validade constante do r tulo quando armazenado entre 2 a 8 C N o utilize depois de expirado o prazo de validade N o congele o reagente nem o exponha luz directa durante a armazenagem ou incuba o com c lulas Mantenha seco o exterior do frasco do reagente Os reagentes n o devem ser utilizados caso haja qualquer evid ncia de deteriora o tal como um aumento na compensa o ou perda substancial de reactividade 4 REAGENTES OU MATERIAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS Solu o de lise Pelilyse n mero de encomenda M7101 6 Tamp o lavagem e dilui o para c lulas mononucleares fosfato salino tamponado contendo 0 2 BSA w v PBS BSA Tamp o lavagem e dilui o para plaquetas Tamp o sequestrina Seq 1 m s de armazenagem entre 2 e 8 C 10 x solu o de stock a dissolver em 1 litro de gua destilada Na2HPO H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0g Diluir em gua destilada antes de utilizar juntar BSA at concentra o final de 0 2 w v Misturar e ajustar o pH a 6 8 Tamp o de fixa o PFA BSA
40. enda M7101 6 O cit metro de fluxo deve estar equipado de forma a detectar dispers o ligeira e fluoresc ncia apropriada e possuir software apropriado para a recolha de dados e an lise As instru es constam do folheto informativo que acompanha o instrumento Aplica es Estudos funcionais de c lulas 2 COMPOSI O O clone CLB IVC7 derivou da hibrida o de c lulas SP2 0 com c lulas de ba o de um ratinho BALB c imunizado com mon citos humanos O anticorpo foi submetido ao CD36 no Sexto Workshop Internacional de Antig nios de Diferencia o de Leuc citos Humanos O clone CLB IVC7 duma subclasse de IgG1 de ratinho O anticorpo conjugado com is mero 1 de iso tiocianato de fluoresce na ITCF O ndice molecular F P situa se entre 5 e 10 O anticorpo foi purificado a partir de l quido de ascite utilizando cromatografia de coluna cromatografia por troca de i es Teor dos reagentes O reagente fornecido em 1 ml de 20 mM TRIS mais 150 mM de CINa pH 8 0 contendo ASB 1 w v e NaNs 0 1 w v como conservante ver Quadro 1 Quadro 1 Teor dos frascos FITC 100 testes por ml em TRIS PRECAU ES O azido s dico nocivo se for deglutido R22 Mantenha fora do alcance das crian as S2 Mantenha afastado de alimentos de bebidas e de ra o para animais S13 Use vestu rio protector adequado S36 Se for ingerido recorra de imediato a ajuda m dica e mostre esta embalag
41. eno o niveles aberrantes de expresi n del ant geno Es importante conocer el patr n normal de expresi n de este ant geno y su relaci n con la expresi n de otros ant genos relevantes para poder efectuar un an lisis adecuado Citometr a de flujo Agitar exhaustivamente las c lulas en un Vortex a velocidad baja para reducir la agregaci n antes de analizarlas por citometr a de flujo 6 Adquirir y analizar los datos en modalidad de lista utilizando el software apropiado Antes de adquirir las muestras ajustar el umbral para minimizar los residuos y asegurarse de que se incluyen las poblaciones de inter s La figura 1 muestra los datos representativos obtenidos con los linfocitos seleccionados Excitaci n con l ser a 488 nm Fig 1 Perfil de fluorescencia par metros de dispersi n en la fracci n de monocitos FL NEG CTRL m FITC OBSERVACI N la configuraci n equivocada de los parametros para los datos de la muestra puede dar lugar a resultados incorrectos Control de calidad interno Se recomienda utilizar un control negativo v ase el cat logo de Sanquin Reagents para determinar la fluorescencia de fondo producida por las capacidades de uni n a Fc de las c lulas mononucleares La concentraci n y proporci n F P de estos controles se han ajustado a los anticuerpos monoclonales conjugados de Sanquin Reagents 7 EFICACIA DIAGN STICA Especificidad El anticuerpo monoclonal est dirigido contra
42. er le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension dans 1 ml de tampon pour une analyse dans les 8 heures ou dans 1 ml de PFA 1 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures Cette m thode a t mise au point pour les chantillons sanguins pr sentant une num ration leucocytaire normale et en utilisant Pelilyse A1 solution de lyse num ro de r f rence M7101 6 Il peut tre n cessaire d ajuster la quantit de sang pour des chantillons pr sentant une num ration leucocytaire tr s lev e ou tr s basse C Cytom trie de flux et microscopie de la membrane plaquettaire 1 Transf rer 45 ul de suspension plaquettaire 1 x 10 cellules ml sur la plaque micropuits ou dans des tubes puis ajouter 5 ul d anticorps monoclonal M langer doucement puis incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C 2 Rincer en m langeant puis en ajoutant un tampon Sequestrine Seq la plaque micropuits 150 ul au premier lavage 200 ul au second ou aux tubes 2 ml Centrifuger 1000 x g pendant 5 minutes aspirer le surnageant puis renouveler une fois cette proc dure 3 Pr parer les cellules pour l analyse Pour la cytom trie de flux remettre les cellules en suspension en ajoutant 200 yl de Seq la plaque micropuits ou aux tubes En cas d utilisation d une plaque micropuits le contenu est transf r dans des tubes appropri s Pour une microsc
43. es L anticorps est conjugu l isom re 1 de l isothiocyanate de fluoresc ine FITC Le rapport molaire F P est compris entre Bet 10 L anticorps a t purifi partir d ascites par chromatographie sur colonne chromatographie par change d ions Ingr dients du r actif Le r actif est fourni dans 1 ml de tampon TRIS 20 mM et NaCl 150 mM pH 8 0 contenant de l ASB 1 p v et du NaNs 0 1 p v servant de conservateurs voir le tableau 1 Tableau 1 Contenu des flacons FITC 100 tests par ml dans du TRIS AVERTISSEMENT L azide de sodium est nocif s il est ing r R22 Conserver hors de port e des enfants S2 Conserver l cart de tout aliment boisson et aliment pour animaux S13 Porter des v tements de protection adapt s S36 En cas d ingestion consulter imm diatement un m decin et lui montrer cette boite ou la notice S46 Le contact avec des acides lib re un gaz tr s toxique R32 Les compos s d azide doivent tre limin s avec de grandes quantit s d eau afin d viter des d p ts sur les conduites de plomb ou de cuivre qui constituent des risques d explosion 3 CONSERVATION ET MANIPULATION Le r actif l anticorps est stable jusqu la date de p remption imprim e sur l tiquette lorsqu il est conserv entre 2 et 8 C Ne pas utiliser au del de la date de p remption Ne pas congeler le r actif ni l exposer la lumi re directe lors de son stockage
44. f SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989 gt A Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 Reagentes monoclonais anti humanos de ratinho para a identifica o de c lulas que expressam os antig nios CD36 Clone CLB IVC7 Forma FITC M1613 X0033 480por 1112061612 IVD CE 1 FINALIDADE DA UTILIZA O Os anticorpos PeliCluster destinam se ao diagn stico in vitro Os reagentes identificam e enumeram as c lulas que expressam o antig nio CD utilizando um cit metro de fluxo para an lise A fim de evitar a interfer ncia com os eritr citos durante o tratamento de an lise de sangue total recomenda se o reagente de lise Pelilyse A1 n mero de encom
45. fluorocromo L uso di anticorpi monoclonali nel trattamento di pazienti pu interferire con il riconoscimento degli antigeni bersaglio da parte di questo reagente Di questo bisogna tenere conto quando si analizzano campioni prelevati da pazienti trattati in questo modo Sanquin Reagents non ha caratterizzato l effetto della presenza di anticorpi terapeutici sul funzionamento di questo reagente singoli reagenti possono fornire solo un informazione limitata nell analisi delle leucemie e dei linfomi Utilizzando combinazioni di altri reagenti e applicando altre procedure diagnostiche si possono ottenere maggiori informazioni rispetto a quelle ottenibili impiegando unicamente questi reagenti Si raccomanda vivamente un analisi a pi colori utilizzando adeguate combinazioni di reagenti Tenendo presente che i reagenti possono essere utilizzati in combinazioni diverse necessario che i laboratori familiarizzino con le propriet di ogni anticorpo in associazione con altri marcatori in campioni normali e non dati sull attivit del reagente sono stati raccolti solitamente a partire da sangue trattato con EDTA L attivit del reagente pu essere influenzata dall uso di altri anticoagulanti RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Problema Possibile Soluzione causa Scarsa Interazione Preparare e risoluzione con altre colorare un tra detriti e cellule e con altro linfociti piastrine campione Manipolazion Verificare la e g
46. icherweise nicht korrekt Interne Qualit tskontrolle Zur Bestimmung von Hintergrundfluoreszenz die durch Fc bindende Eigenschaften mononukle rer Zellen hervorgerufen wird wird die Verwendung einer Negativkontrolle siehe die Reagenzien im Sanquin Katalog empfohlen Die Konzentration und das F P Verh ltnis dieser Kontrollen wurde auf die konjugierten monoklonalen Antik rper der Sanquin Reagenzien abgestimmt 7 LEISTUNGSMERKMALE Spezifit t Der monoklonale Antik rper ist gegen das CD36 Antigen gplV bzw gplllb gerichtet das auf menschlichen Thrombozyten exprimiert ist molekulare Masse 90 kDa Er reagiert mit Monozyten Makrophagen fr hen erythroiden Zellen Megakaryozyten und Thrombozyten jedoch nur schwach mit B Zellen In der Immunhistologie reagiert der Antik rper mit manchen Endothelzellen Adipozyten und dem Stratum granulosum der Haut 7 10 Sensitivit t Die Sensitivit t ist definiert als F higkeit zur Unterscheidung der CD negativen Population von der unterschiedlichen CD positiven Population Die Sensitivit t wurde gemessen indem eine Reihe von Antik rperkonzentrationen evaluiert wurde Jede Konzentration wurde an Vollblut gemessen In jeder Probe wurde die CD positive gegen ber der CD negativen Population bestimmt und f r jede Konzentration der Mittelwert dieser Messungen bestimmt Die in den Fl schchen vorhandene Antik rperkonzentration gew hrleistet optimale Sensitivit t zur Unterschei
47. inutos temperatura ambiente 5 Misturar os tubos e adicionar 2 ml de solu o de lise Pelilyse A1 dilu da 10x 6 Incubar durante 10 a 15 minutos temperatura ambiente at a lise estar completa 7 Analisar as amostras nos 90 minutos seguintes gt Se n o for poss vel proceder an lise nos 90 minutos seguintes centrifugar os tubos a 500 x g durante 5 minutos Aspirar o sobrenadante do pellet celular e resuspender as c lulas em 1 ml de tamp o caso a an lise ocorra nas 8 horas seguintes ou em 1 ml PFA 1 A Sanquin Reagents recomenda que se proceda ent o an lise nas 24 horas seguintes Este m todo foi concebido para amostras de sangue com uma contagem normal de leuc citos utilizando o PeliLyse A1 solu o de lise n mero de encomenda M7101 6 Poder ser necess rio ajustar a quantidade de sangue para amostras com uma contagem muito elevada ou muito baixa de leuc citos C Microscopia e citometria de fluxo da membrana plaquet ria 1 Transferir 45 ul de suspens o plaquet ria 1 x 10 c lulas ml para a microplaca ou para tubos e adicionar 5 ul de anticorpo monoclonal Misturar com cuidado e incubar durante 30 minutos entre 2 e 8 C 2 Lavar misturando e adicionando Seq microplaca 1 lavagem 150 pl 2 lavagem 200 ul ou aos tubos 2 ml Centrifugar a 1000 x g durante 5 minutos e aspirar o sobrenadante repetir este processo mais uma vez 3 Preparar as c lulas para an
48. it Zellen nicht einfrieren oder direkter Sonneneinstrahlung aussetzen AuBenseite des Reagenzfl schchens trocken halten Die Reagenzien sollten bei Anzeichen verminderter Qualit t nicht mehr verwendet werden z B wenn eine Erh hung der Kompensation oder ein signifikanter Verlust an Reaktivit t auftreten 4 ERFORDERLICHE ABER NICHT MITGELIEFERTE REAGENZIEN ODER MATERIALIEN Lyse L sung PeliLyse Bestellnummer M7101 6 Wasch und Verd nnungspuffer f r mononukle re Zellen phosphatgepufferte Salzl sung mit 0 2 BSA w v PBS BSA Wasch und Verd nnungspuffer f r Thrombozyten Sequestrine Puffer Seq Lagerung 1 Monat bei 2 bis 8 C 10 x Konzentrat zum Aufl sen in 1 Liter destilliertem Wasser Na2HPO H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0g Vor der Verd nnung in destilliertem Wasser BSA bis zu einer Endkonzentration von 0 2 w v zugeben Mischen und pH Wert auf 6 8 einstellen Fixierungspuffer PFA BSA Paraformaldehyd 1 in PBS enth lt 0 2 BSA pH 7 2 Mikrotiter Platten 96 Vertiefungen V Boden oder Plastikr hrchen f r die Durchflusszytometrie Durchflusszytometer Bitte beachten Sie hierzu die Gebrauchsanweisung Ihres Ger ts Formaldehyd dient als Fixierungsmittel Kontakt mit Haut oder Schleimh uten vermeiden 5 PROBE N Zur Vorbereitung von Blutproben f r die Durchflusszytometrie k nnen Verfahren zur Pr paration von PBMC verwendet werden Bei der Pr pa
49. llection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 7 Asch A S et al J Clin Invest 79 1054 1987 8 Ockenhouse C F et al Science 243 1469 1989 9 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7576 1989 10 Tandon N N et al J Biol Chem 264 7570 1989 gt Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570
50. mo aumento de compensaci n o si se observa una p rdida significativa de reactividad 4 REACTIVOS O MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Soluci n de lisis Pelilyse n mero de pedido M7101 6 Tamp n de lavado y diluci n para c lulas mononucleares soluci n salina tamponada con fosfatos PBS con 0 2 de BSA p v PBS BSA Tamp n de lavado y diluci n para plaquetas Tamp n de sequestrene Seq conservaci n 1 mes a 2 8 C Soluci n concentrada 10 x disolver en 1 litro de agua destilada Na2HPO H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0g Antes de utilizar la diluci n en agua destilada afiadir BSA hasta alcanzar una concentraci n final de 0 2 p v Mezclar y ajustar el pH a 6 8 Tamp n de fijaci n PFA BSA Paraformaldehido al 1 en PBS con 0 2 de BSA pH 7 2 Microplacas 96 pocillos fondo V o tubos de pl stico para citometr a de flujo Cit metro de flujo Consulte las instrucciones en el manual de uso del instrumento El procedimiento emplea una sustancia fijadora formaldeh do Evitar el contacto con la piel o las membranas mucosas 5 MUESTRAS Las muestras de sangre se pueden preparar para el an lisis citom trico de flujo utilizando los procedimientos de preparaci n de c lulas mononucleares de sangre perif rica PBMC La preparaci n de PBMC ofrece resultados m s dependientes de la t cnica 1 Recoger sangre de forma as ptica por venipunci
51. noclonal antibodies of Sanquin Reagents 7 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Specificity The monoclonal antibody is directed against the CD36 antigen gplV also known as gplllb which is expressed on human thrombocytes molecular mass 90 kDa It reacts with monocytes macrophages early erythroid cells megakaryocytes and platelets and weak with B cells In immunohistology the antibody reacts with some endothelial cells adipocytes and the granular layer of the skin 7 10 Sensitivity Sensitivity is defined as a resolution of the CD negative population from the different CD positive population Sensitivity was measured by evaluating a range of antibody concentrations Each concentration was tested on whole blood The separation of CD positive from CD negative was determined from each sample and averaged within each concentration The bottled antibody concentration for each reagent provided optimum sensitivity in resolving the CD positive cells from the negative Reproducibility Repeatability The CDs were submitted in one of the International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens or meet the Workshop specifications see composition To determine the repeatability of staining with each reagent samples were stained with multiple lots of reagents The different samples used in the evaluation provided an average mean fluorescence intensity MFI value as shown in table 2 For each sample two different lots of reage
52. nts Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD36 Mischung aus monoklonalen Maus Anti Human Reagenzien zur Identifizierung von Zellen die das CD36 Antigen exprimieren M1613 Klon CLB IVC7 Form FITC X0033 480dui 1112061612 Wo c 1 VERWENDUNGSZWECK Die PeliCluster Antik rper sind zur Verwendung r die Diagnostik in vitro bestimmt Dieses Reagenz identifiziert und bestimmt CD Antigen exprimierende Zellen in der durchflusszytometrischen Analyse Zur Vermeidung von Wechselwirkungen mit Erythrozyten bei der Analyse wird eine Behandlung mit Lysereagenz PeliLyse A1 Bestellnummer M7101 6 empfohlen Das Durchflusszytometer muss mit einem Detektor f r Erfassung von Lichtbeugung und brechung und zur Messung der entsprechenden Fluoreszenz sowie mit geeigneter Software zur Datenerhebung und analyse ausgestattet sein Bitte beachten Sie hierzu die Gebrauchsanweisung lhres Ger ts Anwendungen Zellfunktionsstudien 2 ZUSAMMENSETZUNG Klon CLB IVC7 wurde durch Hybridisierung von SP2 0 Zellen mit Milzzellen einer BALB c Maus hergestellt die mit menschlichen Monozyten immunisiert wurde Der Antik rper wurde beim sechsten internationalen Workshop ber Differenzierungsantigene menschlicher Leukozyten Sixth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens f
53. nts generated a pair of results Individual SDs were determined from the paired results for each sample The SDs were combined to derive a pooled SD for each reagent that provides an estimate of within sample repeatability Table 2 Repeatability of mean fluorescence intensity MFI of target cells across different lots N and across multiple donors N Average Pooled SD Pooled MEI CV FITC 7 620 16 123 16 19 9 N number of samples 8 LIMITATIONS Conjugates with brighter fluorchromes PE PE Cy5 will give a greater separation then those with other dyes FITC When populations overlap calculation of the percentage positive for the markers can be affected by choice of fluorchrome Use of monoclonal antibodies in patient treatment can interfere with recognition of target antigens by this reagent This should be considered when analysing samples from patients treated in this fashion Sanquin Reagents has not characterised the effect of the presence of therapeutic antibodies on the performance of this reagent Single reagents can provide only limited information in the analysis of leukaemia and lymphomas Using combination of other reagents and application of other diagnostic procedures may provide more information than application of these reagents only Multicolour analysis using relevant combination of reagents is highly recommended As reagents can be used in different combinations laborato
54. o e os e plaquetas linf citos Manipula o Verificar a grosseira da viabilidade prepara o celular de c lulas centrifugar c lulas a uma velocidade baixa Configura o Seguir inapropriada cuidadosame dos nte as Instrumentos instruc es de montagem optimizar a configura o do instrumento conforme solicitado Marca o Concentra o Verifique e fraca ou celular ajuste a desvanecente demasiado concentra o elevada na celular ou o altura da volume da marcac o amostra marque com amostra fresca Reagente Repita a insuficiente marcac o com uma quantidade aumentada de anticorpo C lulas n o Repita a analisadas marcac o nas 8 horas com amostra seguintes fresca marca o analise de imediato Meio de Use prepara o conservante impr prio no meio de omiss o do marca o e conservante nas fases da lavagem Poucas ou Concentra o Resuspender nenhumas celular a amostra c lulas demasiado fresca a uma baixa concentra o mais elevada repetir a marca o e a an lise Mau Resolu o de funcionament problemas do o do Instrumento cit metro BIBLIOGRAFIA 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard
55. olar y ajustar la concentraci n de c lulas o el volumen de la muestra te ir una muestra fresca Repetir la tinci n con una mayor cantidad de anticuerpo Repetir la tinci n con una muestra nueva y analizarla en el plazo estipulado Utilizar conservante en el medio de tinci n y en el paso de lavado Resuspender una muestra nueva a una concentraci n de c lulas baja mayor repetir la tinci n y el an lisis Mal Solucionar el funcionamient problema del o del instrumento cit metro BIBLIOGRAF A 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 Nicholson JK Browning SW Orlof
56. on 8 Stunden stattfindet Ist dies nicht der Fall Zellen in 1 ml PFA 1 resuspendieren Sanquin Reagents empfiehlt die Analyse daraufhin innerhalb von 24 Stunden durchzuf hren Dieses Verfahren wurde f r Blutproben mit normaler Leukozytenzahl und f r die Verwendung von PeliLyse A1 Lyse L sung Bestellnummer M7101 6 entwickelt Bei Proben mit sehr hohen bzw sehr niedrigen Leukozytenzahlen muss die Blutmenge gegebenenfalls entsprechend ver ndert werden C Durchflusszytometrie und Mikroskopie der Thrombozytenmembran 1 Geben Sie 45 ul der Thrombozytensuspension 1 x 10 Zellen ml in die Mikrotiterplatte oder in die R hrchen und geben Sie 5 wl monoklonalen Antik rper dazu Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei 2 bis 8 C inkubieren 2 Das Waschen erfolgt durch Mischen und Zugabe von Sec zu der Mikrotiterplatte erster Waschschritt 150l zweiter Waschschritt 200yl oder zu den R hrchen 2 ml Zentrifugation der Mikrotiterplatten oder R hrchen bei 100 x g f r 5 Minuten und Aspiration des berstands Dieser Vorgang wird noch einmal wiederholt 3 Vorbereitung der Zellen f r die Analyse F r die Durchflusszytometrie werden die Zellen in der Mikrotiterplatte oder in den R hrchen in 200 yl Seg resuspendiert Bei Verwendung einer Mikrotiterplatte werden die Inhalte nun in die entsprechenden R hrchen berf hrt F r die Fluoreszenzmikroskopie werden die Zellen in 50ul Einbettmedium resuspendiert auf einen Objektt
57. on un recuento de leucocitos normal con el uso de PeliLyse A1 soluci n de lisis n mero de pedido M7101 6 Puede ser necesario ajustar la cantidad de sangre en muestras con recuentos muy altos o bajos de leucocitos C Citometr a de flujo y microscop a con membranas de plaquetas 1 Transferir 45 ul de suspensi n de plaquetas 1 x 10 c lulas ml a la microplaca o los tubos y a adir 5 ul de anticuerpo monoclonal Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a 2 8 C 2 Lavar mezclando y a adiendo Seq a la microplaca 1er lavado 150 yl 2 lavado 200 ul o a los tubos 2 ml Centrifugar a 1000 x g durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante repetir este procedimiento una vez m s 3 Preparar las c lulas para el an lisis Para citometr a de flujo resuspender las c lulas a adiendo 200 pl de Seq a la microplaca o a los tubos Si se utiliz una microplaca transferir el contenido a tubos apropiados Para microscop a con fluorescencia resuspender las c lulas en 50 ul de medio de inclusi n transferirlas a un portaobjetos y colocar un cubreobjetos En general se pueden utilizar 5 yl de anticuerpo monoclonal sin diluir O bien se puede determinar una diluci n ptima Para determinar la fluorescencia de fondo se debe utilizar siempre un control negativo del mismo isotipo Resultados del an lisis En determinados estados patol gicos pueden esperarse niveles anormales de c lulas que expresen este ant g
58. opie fluorescence remettre les cellules en suspension dans 50 ul de produit d inclusion transf rer les cellules sur une lame de microscope puis d poser une lame de protection En r gle g n rale il est possible d utiliser 5 ul d anticorps monoclonal non dilu Alternativement il est possible de d terminer une dilution optimale Il est n cessaire de toujours utiliser un contr le n gatif de m me isotype pour d terminer la fluorescence d arri re plan R sultats de l analyse Dans le cadre de certaines maladies on peut s attendre observer des nombres anormaux de cellules exprimant cet antig ne ou des niveaux d expression aberrants de cet antig ne Il est important de comprendre le sch ma d expression normal de cet antig ne et sa relation avec l expression d autres antig nes pertinents afin de r aliser une analyse ad quate Cytom trie de flux Agiter les cellules soigneusement faible vitesse pour limiter l agr gation avant de faire passer les cellules sur le cytom tre de flux 6 Acqu rir et analyser les donn es en mode liste l aide d un logiciel appropri Avant l acquisition des chantillons ajuster le seuil pour minimiser les d bris et assurer que les populations concern es sont incluses La figure 1 pr sente des donn es repr sentatives obtenues sur des lymphocytes tri s Excitation du laser 488 nm Fig 1 Profil de fluorescence canaux de dispersion r gl s sur la fraction monocy
59. ou de l incubation avec des cellules Conserver le flacon de r actif sec Ne pas utiliser les r actifs en cas de signe de d t rioration augmentation de compensation ou perte importante de r activit 4 REACTIFS OU MATERIEL NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS Solution de lyse PeliLyse num ro de commande M7101 6 Tampon de lavage et de dilution pour cellules mononucl es solution saline tamponn e au phosphate contenant 0 2 d ASB p v PBS ASB Tampon de lavage et de dilution pour plaquettes Tampon Sequestrine Seq conservation 1 mois entre 2 et 8 C Solution m re 10 x dissoudre dans un litre d eau distill e Na2HPO H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0g Avant utilisation diluer dans de l eau distill e ajouter de l ASB jusqu une concentration finale de 0 2 p v M langer et ajuster le pH 6 8 Tampon de fixation PFA ASB Paraformald hyde 1 dans PBS contenant 0 2 d ASB pH 7 2 Plaques micropuits 96 puits fond en V ou tubes en plastique pour cytom trie de flux Cytom tre de flux Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument pour plus d informations La proc dure utilise un fixatif le formald hyde Eviter tout contact avec la peau ou les muqueuses 5 ECHANTILLON S Les chantillons de sang peuvent tre pr par s pour l analyse par cytom trie de flux en utilisant des proc dures de pr paration de CMSP La pr paration des CMSP
60. r ger berf hrt und auf diesen ein Deckglas gelegt Generell sind 5yl unverd nnter monoklonaler Antik rper ausreichend Alternativ kann eine optimale Verd nnung bestimmt werden Zur Bestimmung von Hintergrundfluoreszenz muss stets eine Negativkontrolle desselben Isotyps verwendet werden Analyseergebnisse In manchen Krankheitsstadien ist die Anzahl der Zellen die diese Antigene exprimieren bzw berm ig exprimieren krankhaft erh ht F r die Durchf hrung einer angemessenen Analyse ist es daher wichtig das normale Expressionsmuster f r diese Antigene und ihren Zusammenhang mit der Expression anderer relevanter Antigene zu kennen Durchflusszytometrie Die Zellen bei niedriger Geschwindigkeit gr ndlich auf dem Vortex mischen damit sie vor der Analyse im Durchflusszytometer keine Aggregate bilden 6 Daten mit Hilfe geeigneter Software im List mode Verfahren messen und analysieren Vor der Datenerhebung muss der Schwellenwert eingestellt werden damit so wenig Verunreinigungen wie m glich und die gew nschten Populationen in die Messung aufgenommen werden Abb 1 zeigt Beispieldaten nach Einstellung des Analysefenster f r Lymphozyten gating Die Laserexzitation betr gt 488 nm Abb 1 Fluoreszenzprofil Analysefenster eingestellt auf die Monozytenfraktion RT O NEG CTRL m FITC HINWEIS Wird nicht das richtige Analysefenster f r die Probendaten eingestellt sind auch die Ergebnisse m gl
61. r in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten oder 2 ml Puffer in die Testr hrchen geben und bei 500 x g 5 Minuten lang zentrifugieren 8 berstand vom Zellpellet abnehmen und die Zellen resuspendieren 9 Analyse im Durchflusszytometer Jeweils 200 ul Puffer in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte geben und diese Zellsuspension in geeignete Testr hrchen berf hren Alternativ 200 ul Puffer in die Testr hrchen geben 10Kann die Analyse nicht innerhalb von 8 Stunden durchgef hrt werden muss bei Schritt 9 anstelle von Puffer 200 ul PFA 1 zugegeben werden Sanquin Reagents empfiehlt die Analyse daraufhin innerhalb von 24 Stunden durchzuf hren ap B Vollblutverfahren Blut in ein R hrchen mit EDTA abnehmen 2 100 ul des gut durchmischten Vollbluts in den Boden eines Testr hrchens geben 3 10 al der unverd nnten Antik rper in den Boden des Testr hrchens geben und 30 Sekunden lang kr ftig mischen 4 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren 5 R hrcheninhalt mischen und 2 ml Lyse L sung zugeben Pelilyse A1 10x verd nnt 6 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren bis die Lyse abgeschlossen ist 7 Proben innerhalb von 90 Minuten analysieren Kann die Analyse nicht innerhalb von 90 Minuten durchgef hrt werden werden die R hrchen bei 500 x g 5 Minuten lang zentrifugiert berstand von dem Zellpellet abnehmen und die Zellen in 1 ml Puffer resuspendieren wenn die Analyse innerhalb v
62. ration von PBMC sind die Ergebnisse h ufig von der angewandten Technik abh ngig 1 Blut aseptisch durch Venenpunktion 1 2 in sterile KsEDTA Blutabnahmer hrchen abnehmen Wird die Vollblutmethode angewandt ist mindestens 1 ml Vollblut erforderlich Blut das mit Gerinnungshemmern versehen ist bei Raumtemperatur aufbewahren 18 bis 25 C WARNHINWEIS Alle biologischen Proben und Materialien die mit ihnen in Ber hrung kommen sind als biogef hrlich zu betrachten Alle Proben sind als potenziell infekti s zu betrachten 3 4 und entsprechend den geltenden Richtlinien zu entsorgen Nicht mit dem Mund pipettieren Geeignete Schutzkleidung und Handschuhe tragen Berichten zufolge f hrt eine Fixierung zur Inaktivierung von HIV 5 6 Vorgehensweise A Verfahren mit Ficoll gereinigten Zellen 1 Suspension mit mononukle ren Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 Zellen ml herstellen 2 Jeweils 40 ul der Zellsuspension in die Vertiefung von Mikrotiterplatten oder in Testr hrchen geben 3 Jeweils 10 ul der unverd nnten Antik rper zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten oder in die Testr hrchen geben und vorsichtig mischen 30 Minuten bei 2 bis 8 C inkubieren Jeweils 150 ul Puffer in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten oder 2 ml Puffer in die Testr hrchen geben und bei 500 x g 5 Minuten lang zentrifugieren 6 berstand vom Zellpellet abnehmen und die Zellen resuspendieren 7 Jeweils 200 ul Puffe
63. razione delle cellule CD positive da quelle CD negative Riproducibilit Ripetibilit CD sono presentati nel corso di uno dei Convegni Internazionali sugli antigeni di differenziazione dei leucociti umani o soddisfano le indicazioni del Convegno vedi composizione Per determinare la ripetibilit della colorazione con tutti i reagenti i campioni sono stati colorati con diversi lotti di reagenti diversi campioni utilizzati nella valutazione hanno fornito un valore medio di intensit di fluorescenza MFI come riportato nella tabella 2 Per ogni campione due diversi lotti di reagenti hanno generato una coppia di risultati In base alle coppie di risultati sono stati determinati SDs individuali per ogni campione Per ogni reagente gli SDs sono stati raggruppati per dare origine ad un SD congiunto in grado di fornire una stima della ripetibilit all interno del campione Tabella 2 Ripetibilit dell intensit di fluorescenza media MFI di cellule bersaglio con diversi lotti N e molteplici donatori N MFI media SD CV congiunto congiunto FITC 7 620 16 123 16 19 9 N numero di campioni 8 LIMITAZIONI Coniugati con fitocromi pi luminosi PE PE Cy5 forniranno una maggiore separazione rispetto a coniugati con altri coloranti FITC Quando le popolazioni si sovrappongono il calcolo della percentuale positiva per un determinato marker pu essere influenzato dalla scelta del
64. ries need to become familiar with the properties of each antibody in conjunction with other markers in normal and abnormal samples Reagent data performance was collected typically with EDTA treated blood Reagent performance can be affected by the use of other anticoagulants TROUBLESHOOTING Problem Possible Solution Cause Poor Cell Prepare and resolution interaction stain another between with other sample debris and cells and lymphocytes platelets Rough Check cell handling of viability cell centrifuge preparation cells at lower speed Inappropriate Follow proper instrument instrument settings set up procedures optimise instrument settings as required Staining dim Cell Check and or fading concentration adjust cell too high at concentration staining step or sample volume stain with fresh sample Insufficient Repeat reagent staining with increased amount of antibody Cells not Repeat analysed staining with within 8 fresh sample hours of analyse staining promptly Improper Use medium preservative preparation in staining preservative medium and omitted washing steps Few or no Cell Resupend cells concentration fresh sample too low ata higher concentration repeat staining and analysis Cytometer Troubleshoot malfunction instrument REFERENCES 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guid
65. rlappung der Populationen kann die Wahl des Fluoreszenzfarbstoffes Einfluss auf die Berechnung des prozentualen Positivanteils f r die Marker haben Die Verwendung von monoklonalen Antik rpern zur Behandlung von Patienten kann die Erkennung des Zielantigens durch dieses Reagenz beeinflussen Dies muss bei der Analyse entsprechender Patientenproben ber cksichtigt werden Der Einfluss des Vorhandenseins therapeutischer Antik rper auf die Leistung dieses Reagenz wurde von Sanquin Reagents nicht bestimmt Einzelne Reagenzien sind bei der Analyse von Leuk mien und Lymphomen nur von begrenzter Aussagekraft Eine Kombination mit anderen Reagenzien und die Verwendung anderer diagnostischer Verfahren sind m glicherweise informativer als die ausschlieRliche Verwendung dieser Reagenzien Es wird dringend die Mehrfarbenanalyse mit Hilfe einer geeigneten Kombination von Reagenzien empfohlen Da Reagenzien in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden k nnen m ssen die Labors mit den Eigenschaften eines jeden Antik rpers in Verbindung mit anderen Markern bei normalen und anomalen Proben vertraut sein Die Daten ber die Leistung der Reagenzien wurden in der Regel anhand von mit EDTA behandeltem Blut gewonnen Die Verwendung anderer Antikoagulanzien kann die Leistung der Reagenzien beeintr chtigen FEHLERSUCHE Problem M gliche L sung Ursache Schlechte Wechselwirk Farbung mit Unterscheidu ung
66. rom ascites using column chromatography ion exchange chromatography Reagent contents The reagent is supplied in 1 ml of 20 mM TRIS plus 150 mM NaCl pH 8 0 containing BSA 1 w v and NaNs 0 1 w v as preservative see table 1 Table 1 Contents of bottles FITC 100 tests per ml in TRIS WARNING Sodium azide is harmful if swallowed R22 Keep out of reach of children S2 Keep away from food drink and animal feedingstuff S13 Wear suitable protective clothing S36 If swallowed seek medical advice immediately and show this container or label S46 Contact with acids liberates very toxic gas R32 Azide compounds should be flushed with large volumes of water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing where explosive conditions can develop 3 STORAGE AND HANDLING The antibody reagent is stable until the expiration date shown on the label when stored at 2 to 8 C Do not use after the expiration date Do not freeze the reagent or expose it to direct light during storage or incubation with cells Keep the outside of the reagent vial dry Reagents should not be used if any evidence of deterioration such as increase in compensation or substantial loss of reactivity is observed 4 REAGENTS OR MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Lysing solution PeliLyse order number M7101 6 Wash and dilution buffer for mononuclear cells Phosphate Buffered Saline containing 0 2 BSA w
67. rossolana vitalit della cellulare preparazione centrifugare cellulare le cellule a velocit inferiori Impostazione Seguire le dello procedure di strumento impostazione non adatta dello strumento idonee ottimizzare in base alle necessit le impostazioni dello strumento Verificare ed Colorazione Concentrazio buia o ne cellulare aggiustare la affievolita troppo alta al concentrazio momento ne cellulare o della il volume del colorazione campione colorare con campione fresco Reagente Ripetere la insufficiente colorazione con una maggiore quantit di anticorpo Cellule non Ripetere la analizzate colorazione entro 8 ore con dalla campione colorazione fresco analizzare immediatame nte Preparazione Utilizzare il del medium conservante non adatta nel terreno di senza colorazione e conservante durante i lavaggi Poche cellule Concentrazio Risospendere o assenza di ne cellulare il campione fresco ad una concentrazio ne maggiore ripetere la colorazione e l analisi Consultare la sezione Risoluzione problemi dello strumento cellule troppo bassa Cattivo funzionament o del citometro RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Co
68. taire R1 NEG CTRL m FITC REMARQUE Un r glage incorrect du canal sur es donn es d chantillon peut donner des r sultats incorrects Contr le de qualit interne L utilisation d un contr le n gatif consulter le catalogue de Sanquin Reagents est recommand e afin de d terminer la luorescence d arri re plan produite en raison des capacit s de liaison de Fc par les cellules mononucl es La concentration et le rapport F P de ces contr les ont t ajust s selon les anticorps monoclonaux conjugu s de Sanquin Reagents 7 PERFORMANCES Sp cificit L anticorps monoclonal est dirig contre l antig ne CD36 gplV galement connu sous le nom de gplllb qui est exprim sur les thrombocytes humains masse mol culaire de 90 kDa Il r agit avec les monocytes les macrophages les cellules rythroides pr coces les m gacaryocytes et les plaquettes ainsi que faiblement avec les lymphocytes B En immunohistologie l anticorps r agit avec quelques cellules endoth liales des adipocytes et la couche granuleuse de la peau 7 10 Sensibilit La sensibilit est d finie comme une distinction entre la population CD n gative et la population CD positive diff rente La sensibilit a t mesur e en valuant plusieurs concentrations d anticorps Chaque concentration a t test e sur du sang complet La s paration des populations CD positives des populations CD n gatives a t d termin e
69. tective clothing and gloves Fixation has been reported to inactivate HIV 5 6 PROCEDURES A Method with ficoll purified cells 1 Prepare a mononuclear cell suspension with a concentration of 1 x 10 cells ml 2 Ad 40 al of cell suspension to microtiter wells or tubes 3 Add 10 al of the undiluted antibody to the microtiter wells or tubes and mix gently 4 Incubate for 30 minutes at 2 to 8 C 5 Add 150 pl buffer to the microtiter wells or 2 ml buffer to the tubes and centrifuge at 500 x g for 5 minutes 6 Aspirate the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells 7 Add 200 ul buffer to the microtiter wells or 2 ml buffer to the tubes and centrifuge at 500 x g for 5 minutes 8 Aspirate the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells 9 Flowcytometer analysis Add 200 al buffer to the microtiter wells and transfer this final cell suspension to appropriate test tubes or add 200 pl buffer to the tubes 10 If analysis within 8 hours is not possible add at no 9 instead of buffer 200 ul PFA 1 Sanquin Reagents recommends then analysing within 24 hours B Whole blood method 1 Draw blood into a blood collection tube containing EDTA 2 Deliver 100 pl of well mixed whole blood to the bottom of the test tube 3 Add 10 ul of the undiluted antibodies to the bottom of the test tube and mix firmly during 30 seconds 4 Incubate for 15 to 30 minutes at room temperature 5 Mix the tubes and ad

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