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streptococcus pneumoniae culture identification test

1. Todos las cepas de S pneumoniae dieron un resultado positivo y todas los otras cepas clinicas que representaban un corte filogen tico de organismos dieron un resultado negativo con el TEST AccuPROBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO El porcentaje de sensibilidad el porcentaje de especificidad y el porcentaje de concordancia del TEST AccuPRoBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO comparado con otros m todos standard de identificaci n de cultivos es de 100 RESULTADOS ESPERADOS A PRECISION INTRA ENSAYO La precisi n intra ensayo para el TEST AccuProBe DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO fue calculada analizando dos concentraciones de ARN ribos mico aislado de S pneumoniae y utilizando 10 replicaciones en un mismo ensayo Muestra A B N mero de replicaciones 10 10 Respuesta media 101 292 56 025 Desviaci n t pica 4 293 1 743 Coeficiente de variaci n 4 2 3 1 B PRECISION INTER ENSAYO La precisi n inter ensayo fue calculada analizando las mismas dos concentraciones de ARN ribos mico de S pneumoniae utilizando determinaciones nicas en 12 series consecutivas Muestra A B N mero de replicaciones 12 12 Respuesta media 101 322 53 288 Desviaci n tipo 3 660 1 776 Coeficiente de variaci n 3 6 3 3 C ESPECIFICIDAD Un total de 95 cepas de referencia ATCC fueron evaluadas utilizando el TEST AccuPRoBe DE IDENTIFICACION DE STREPT
2. OA oO AA KIT AccuProBe DE REACTIVO DE IDENTIFICACION DE CULTIVO bioM rieux ref 39305 Gen Probe Cat No 102800 2800 KIT GEN PROBE DE REACTIVO DE DETECCION bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 1791 TECNICA A PREPARACION DEL EQUIPO 1 2 Ajustar el ba o mar a o el bloque calefactor a 60 1 C Preparar el lumin metro GEN PROBE para su utilizaci n Verificar que se cuenta con un volumen suficiente de Reactivos de _Detecci n y Il para completar los tests Si no hay suficiente reactivo en los dep sitos llenar los dep sitos siguiendo las instrucciones del Manual de Empleo B CONTROLES Las cepas de control positivo y negativo pueden ser analizadas en forma rutinaria en cada laboratorio conforme a la reglamentaci n en vigor Un cultivo de S pneumoniae p ej American Type Culture Collection ATCC 33400 puede ser utilizado como control positivo mientras que un cultivo de Streptococcus bovis p ej ATCC 33317 puede ser utilizado como control negativo C PREPARACION DE LAS MUESTRAS 1 Abrir la bolsa de aluminio cortando su parte superior Sacar una cantidad suficiente de tubos de Reactivo Prueba para analizar los cultivos aislados y o los controles Volver a cerrar la bolsa doblando varias veces su extremo abierto y fijar con cinta adhesiva o con una pinza Dejar la bolsa desecante dentro de la bolsa Colocar una etiqueta en una cantidad suficiente de tubos de Reactivo Sonda para a
3. O DE CULTURA bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 UTILIZA O _ O AccuProse STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA um teste de identificac o r pida por sonda ADN de S pneumoniae Pneumococcus isolados de uma cultura Este teste utiliza a t cnica de hibridiza o dos cidos nucleicos INTRODU O Nos Estados Unidos o Streptococcus pneumoniae S pneumoniae o principal respons vel pelas pneumopatias bacterianas comunit rias com aproximadamente meio milh o de casos por ano e em 5 desses casos surgem complica es e morte 2 4 igualmente a causa da maior parte das otites e das bacteri mias no rec m nascido e na crian a 2 O S pneumoniae frequentemente respons vel pelas meningites e foi isolado nos pacientes com conjuntivite sinusite mastoidite pericardite bacteri mia latente artrite e endocardite 2 o terceiro germe isolado em hemoculturas 6 Mesmo podendo o S pneumoniae ser considerado como um comensal das vias a reas superiores num sujeito s o os rec m nascidos os idosos e os pacientes fragilizados por outras infec es respirat rias ou imuno deprimidos representam um terreno particularmente favor vel ao desenvolvimento de uma infec o pneumoc cica 2 3 4 Os m todos tradicionais fisiol gicos e bioqu micos permitem fazer identifica es presuntivas Estes incluem o estudo morfol gico da col nia o exame ap s colora o de Gram
4. s apparier de mani re sp cifique pour former des complexes bicat naires stables 5 La m thode AccuPRoBE utilise une sonde ADN monocat naire conjugu e a un marqueur chimiluminescent compl mentaire de ARN ribosomal ARNr de l organisme cible Lorsque l ARNr de l organisme cible est lib r la sonde s hybride avec celui ci pour former un complexe ADN ARN stable Le R actif de S lection 17 i A permet de diff rencier les sondes hybrid es des sondes non hybrid es Le luminom tre GEN PROBE permet de mesurer le signal lumineux mis par les hybrides ADN ARN Le r sultat est positif si le luminom tre indique une valeur sup rieure ou gale la valeur seuil il est n gatif s il indique une valeur inf rieure R ACTIFS Les r actifs utilis s pour le TEST AccuProBe D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE sont fournis dans trois coffrets distincts COFFRET SONDE POUR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AccuProBE R actif Sonde P 10 x 2 tubes Streptococcus pneumoniae COFFRET DE R ACTIFS POUR IDENTIFICATION DE CULTURE AccuProBE R actif 1 R actif de Lyse 1 1x10ml Solution tamponn e contenant 0 04 d azide de sodium R actif 2 Tampon d Hybridation 2 1x10ml Solution tamponn e R actif 3 R actif de S lection 3 1x60ml Solution tamponn e COFFRET DE R ACTIFS DE D TECTION GEN PROBE R actif de Detection RI 1x240 ml 0 1 d eau oxyg n e dans une solution d acide nit
5. A AccuPRroBE CULTURE AccuPROBE Pos Pos Neg Neg Sensibilidade Taxa de Cultura Pos Neg Pos Neg Especificidade Concordancia Local 1 202 0 0 212 100 100 100 Local 2 103 0 0 145 100 100 100 Total 305 0 0 357 100 100 100 Todas as estirpes cepas de S pneumoniae deram resultados positivos e todas as outras estirpes cepas deram resultados negativos com O ACCUPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA A sensibilidade a especificidade e a taxa de concord ncia do teste s o de 100 COMPORTAMENTO FUNCIONAL DO TESTE A PRECIS O INTRA ENSAIO A precis o intra ensaio do AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA foi calculada analisando duas concentra es diferentes de ARN riboss mico de S pneumoniae 10 vezes numa mesma s rie Amostra A B N mero de ensaios 10 10 Resposta m dia RLU 101 292 56 025 Desvio padr o 4 293 1 743 Coeficiente de varia o 4 2 3 1 B PRECIS O INTER ENSAIO A precis o inter ensaio foi calculada analisando duas concentra es diferentes de ARN riboss mico de S pneumoniae ao longo de 12 s ries distintas Amostra A B N mero de ensaios 12 12 Resposta m dia RLU 101 322 53 288 Desvio padr o 3 660 1 776 Coeficiente de varia o 3 6 3 3 C ESPECIFICIDADE Foram testadas 95 estirpes cepas de cultura ATCC com o AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA Estas estirpes cepas compreendiam 78 esp cies
6. GEN PROBE AccuProbe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTEST bioM rieux Best Nr 39204 Gen Probe Kat Nr 102865 2865 TEST D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE bioM rieux r f 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 TEST DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 TEST DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA bioM rieux cod 39204 Gen Probe Cat N 102865 2865 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICACAO DE CULTURA bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 GEN PROBE AccuProbe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST FOR EXPORT USE ONLY bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 INTENDED USE The AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST is a rapid DNA probe test which utilizes the technique of nucleic acid hybridization for the identification of Streptococcus pneumoniae Pneumococcus isolated from culture SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Streptococcus pneumoniae S pneumoniae is the leading cause of community acquired bacterial pneumonia in the United States occurring in approximately one half million cases per year with a complication and death rate of about 5
7. RIl 1x 240 ml 1 N Natriumhydroxyd VORSICHTSMASSNAHMEN A Nur f r die in vitro Diagnostik verwenden Beachten Sie bei der Testdurchf hrung die blichen Vorsichtsma nahmen 1 Verwenden Sie diesen Test nur zur Identifizierung von Streptococcus pneumoniae aus Kulturisolaten Verwenden Sie nur die mitgelieferten oder empfohlenen Einweg Labormaterialien moom Die Reagenzien dieses Kits enthalten Natriumazid das mit Blei oder Kupferrohren zu explosiven Metallaziden reagieren kann Beim Ableiten in die Kanalisation sollten die Reagenzien immer mit reichlich Wasser verd nnt werden F Vermeiden Sie jeden Kontakt der Detektionsreagenzien und Il mit der Haut oder den Schleimh uten Bei eventuellem Kontakt sofort mit Wasser sp len Beim Versch tten einer dieser Reagenzien die Fl ssigkeit vor dem Aufwischen mit Wasser verd nnen LAGERUNG Die Sondenreagenzr hrchen bei 2 8 C in den Aluminiumbeuteln lagern Die original verpackten Sondenreagenzr hrchen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar Nach dem ffnen des Beutels sind die R hrchen 2 Monate l ngstens jedoch bis zum Verfallsdatum haltbar Die Beutel m ssen nach jedem Gebrauch wieder fest verschlossen werden Die brigen Reagenzien des ACCUPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTESTS sind bei 2 25 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar DIE REAGENZIEN NICHT EINFRIEREN 10 A PROBENGEWINNUNG UND VORBEREITUNG Der AccuPRoBE S
8. Streptococcus pneumoniae ATTCC 33400 inferiores a 50 000 RLU no LEADER ou a 1 500 PLU no AccuLDR anteriormente PAL se o n mero de microrganismos for insuficiente ou se o teste tiver sido efectuado com culturas mistas ou antigas ou ainda se as bact rias tiverem sido deixadas no Reagente 1 mais de 30 minutos antes da adi o do Reagente 2 Para verificar se se trata de uma cultura mista repicar uma parte num meio gelosado apropriado e incubar 45 Hod gt Q S 0 O oO A RESULTADOS A INTERPRETA O DOS RESULTADOS Os resultados do AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA s o interpretados em fung o de um valor limiar As amostras que emitam um sinal luminoso de valor superior ou igual a este limiar s o consideradas positivas Os sinais luminosos inferiores a este limiar s o considerados negativos Quando o resultado se situar numa zona duvidosa o teste deve ser repetido AccuLDR LEADER anteriormente PAL Valor limiar 1 500 PLU 50 000 RLU Zona duvidosa 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B CONTROLO DE QUALIDADE E VALIDA O DOS RESULTADOS Os controlos negativos Streptococcus bovis ATCC 33317 e positivos Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 devem estar dentro dos seguintes valores AccuLDR LEADER anteriormente PAL Controlo negativo lt 600 PLU lt 20 000 RLU Controlo positivo gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITES DO TESTE Este m todo foi testado com cultura
9. TECTION GEN PROBE bioM rieux r f 39300 Gen Probe Cat No 201791 1791 MODE OPERATOIRE A PREPARATION DU MATERIEL 1 2 R gler le bain marie ou le bloc chauffant 60 1 C Pr parer le luminom tre GEN PROBE S assurer qu il y ait suffisamment de R actifs de D tection et Il pour pratiquer les tests Dans le cas contraire remplir les r servoirs du luminom tre selon les instructions du manuel d utilisation B CONTR LES Des souches de contr le positif et n gatif doivent tre test es en routine dans chaque laboratoire selon la r glementation en vigueur Une culture de S pneumoniae par ex American Type Culture Collection ATCC 33400 peut tre utilis e comme contr le positif et une culture de Streptococcus bovis par ex ATCC 33317 peut tre utilis e comme contr le n gatif C PR PARATION DES CHANTILLONS 1 D couper horizontalement la partie sup rieure des sachets en aluminium Retirer le nombre n cessaire de Tubes de R actif Sonde pour tester les chantillons et ou les souches de contr le Refermer le sachet herm tiquement en rabattant plusieurs fois son extr mit et en la fixant Paide de ruban adh sif ou d une pince Ne pas retirer le sachet dessicant Identifier un nombre suffisant de tubes de R actif Sonde pour tester les chantillons et ou les souches de contr le Oter et conserver les bouchons Distribuer 50 ul de R actif 1 R actif de Lyse dans tous les tubes d
10. 2 4 It is also the leading cause of otitis media and bacteremia in infants and children 2 S pneumoniae is a common cause of meningitis and has been isolated from patients with conjunctivitis sinusitis mastoiditis pericarditis occult bacteremia arthritis and endocarditis 2 It is the third most common blood culture isolate found 6 S pneumoniae may be considered as part of the normal flora of the upper respiratory tract however infants the elderly and debilitated patients with other compromising medical conditions of the respiratory tract or decreased immunological function are at greatest risk for acquiring pneumococcal disease 2 3 4 Presumptive identification is made by traditional physiological and biochemical methods These include colony morphology Gram stain catalase reaction alpha hemolytic activity on 5 sheep blood agar optochin susceptibility and bile solubility 2 More than 80 serotypes have been identified based on capsular polysaccharides The Quellung test based on apparent capsular swelling in response to treatment with antisera to these polysaccharides is another means of identification All tests mentioned above are subjective and no one by itself provides unequivocal identification of S pneumoniae The AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST offers a rapid nonsubjective method for the definitive identification of S pneumoniae based on the detection of specific ribosomal RN
11. Louis MO Klainer A S 1983 Pneumococcal pneumoniae p 3 9 In L Weinstein and B N Fields ed Seminars in infectious disease V 1 st ed Thieme Statton Inc New York N Y Kohne D E A G Steigerwalt and D J Brenner 1984 Nucleic acid probe specific for members of the genus Legionella p 107 108 In C Thornsberry et al ed Legionella proceedings of the 2 international symposium American Society for Microbiology Washington D C Musher D M 1988 The gram positive cocci Streptococci Hospital practise 23 3 63 76 49 Gen Probe Incorporated San Diego CA 92121 USA CE Authorized Representative EMERGO EUROPE Molenstraat 15 2513 BH The Hague The Netherlands 102946F 01 Rev C 2011 03 1990 2011 Gen Probe Incorporated
12. actif 1 plus 21 oO AA de 30 minutes avant l addition du R actif 2 Pour v rifier s il s agit d une culture mixte on peut en repiquer une partie sur un milieu g los appropri et la mettre incuber R SULTATS A INTERPRETATION DES R SULTATS Les r sultats du TEST AccuProse D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE sont interpr t s en fonction d une valeur seuil Les chantillons produisant un signal lumineux de valeur sup rieure ou gale ce seuil sont consid r s comme positifs Les signaux lumineux inf rieurs ce seuil sont consid r s comme n gatifs Lorsque le r sultat est situ dans la zone d incertitude le test doit tre r p t Si la seconde analyse donne toujours des r sultats quivoques il faut repiquer la souche afin de v rifier sa puret AccuLDR LEADER anciennement PAL Valeur seuil 1 500 PLU 50 000 RLU Zone d Incertitude 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B CONTR LE DE QUALITE ET ACCEPTABILIT DES R SULTATS Les contr les n gatifs Streptococcus bovis ATCC 33317 et positifs Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 doivent satisfaire aux valeurs suivantes AccuLDR LEADER anciennement PAL Contr le n gatif lt 600 PLU lt 20 000 RLU Contr le positif gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITES DU TEST Cette m thode a t test e sur des cultures fra ches r alis es sur milieux solides et sur les types de bouillons de culture cit s dans
13. le paragraphe PRELEVEMENT ET PR PARATION DE L CHANTILLON Les performances de ce test pratiqu directement sur des chantillons cliniques n ont pas t valu es Les r sultats du TEST AccuProse D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE doivent tre interpr t s en fonction des autres donn es du laboratoire et corr l s avec les donn es cliniques VALEURS ATTENDUES Le TEST AccuProse D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE a t compar aux m thodes classiques de culture avec identification biochimique Ces m thodes ont t effectu es sur deux sites diff rents sur un total de 662 souches Ont t test es 305 souches de S pneumoniae 185 souches d autres esp ces de streptocoques et 172 souches issues de 25 genres diff rents Une identification par les m thodes traditionnelles a t r alis e tude de la morphologie des colonies coloration de Gram recherche de catalase analyse de l activit h molytique sur milieu g los 5 de sang de mouton test de sensibilit l optochine et solubilit dans la bile Les souches ont t d termin es soit positives gt 50 0000 RLU soit n gatives lt 50 000 RLU Les observations ont montr que les cultures n gatives avaient une valeur comprise entre 344 et 32 911 RLU et les cultures positives entre 59 223 et 863 193 RLU La comparaison de ces r sultats avec les m thodes classiques d identification figure
14. mill n de casos por a o con una tasa de complicaciones y de muerte de aproximadamente 5 2 4 Tambi n es la principal causa de otitis media y de bacteremia en lactantes y ni os 2 S pneumoniae es una causa com n de meningitis y ha sido aislada en pacientes con conjuntivitis sinusitis mastoiditis pericarditis bacteremia oculta artritis y endocarditis 2 Es el tercer cultivo aislado con mayor frecuencia en hemocultivos 6 S pneumoniae puede ser considerado parte de la flora normal de las v as respiratorias superiores sin embargo los lactantes los ancianos y los pacientes debilitados por otras condiciones m dicas que comprometen las v as respiratorias o con una funci n inmunol gica disminuida presentan alto riesgo de adquirir una enfermedad neumoc cica 2 3 4 La identificaci n presuntiva se realiza mediante m todos fisiol gicos y bioqu micos tradicionales Estos incluyen morfolog a de las colonias tinci n de Gram reacci n de la catalasa actividad alfahemolitica en agar sangre de cordero al 5 susceptibilidad a la optoquina y solubilidad en bilis 2 Han sido identificados m s de 80 serotipos en base a los polisac ridos capsulares Otro medio de identificaci n es el test de Quellung en base a la turgencia capsular aparente como respuesta al tratamiento con antisueros de esos polisac ridos Todos los tests mencionados son subjetivos y ninguno permite la identificaci n formal de S pneumoniae El TEST Acc
15. provenientes de 51 g neros diferentes Foi testado um painel filogen tico de 5 estirpes cepas de S pneumoniae 24 estirpes cepas de 13 outras esp cies de estreptococos e 66 estirpes cepas de 50 outros g neros Apenas as estirpes cepas de S pneumoniae deram um resultado positivo com AccuPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA Com todos os outros microrganismos obt ve se um resultado negativo com este dispositivo 47 Hod gt S Q S 0 O OY D TESTE DE SOBRECARGA Foram testadas sete s ries de dilui es de S pneumoniae de 3 000 a 30 milh es de microrganismos por dilui o na presen a de 30 milh es de microrganismos pertencendo s esp cies n o alvo Streptococcus salivarius e Streptococcus bovis N o foi detectada nenhuma interfer ncia nem reac o cruzada com AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA 48 oO AA BIBLIOGRAPHY BIBLIOGRAPHIE LITERATUR BIBLIOGRAFIA Centers for Disease Control 1988 United States Morbid and Mortal Weekly Rep 37 377 382 387 388 Facklam R R and R B Carey 1985 Streptococci and aerococci p 154 175 In E H Lennette et al ed Manual of Clinical Microbiology 4 ed American Society for Microbiology Washington D C Finegold S M and E J Baron 1986 Streptococci including enterococci and pneumococci and aerococcus p 366 387 In Bailey and Scott s diagnostic microbiology 7 ed C V Mosby Company Saint
16. sin abrir hasta la fecha de caducidad indicada Una vez abiertas las bolsas deben ser cerradas nuevamente y los tubos deben ser utilizados dentro de los dos meses siguientes y antes de la fecha de caducidad Otros reactivos utilizados en el TEST AccuProBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO pueden ser conservados entre 2 y 25 C y son estables hasta la fecha de caducidad indicada 26 D AA NO CONGELAR LOS REACTIVOS TOMA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS El TEST AccuProge DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO est dise ado para identificar S pneumoniae aislado en cultivo A Identificaci n a partir de un cultivo en medio s lido Puede analizarse un cultivo en un medio s lido adecuado tal como agar sangre de cordero al 5 con una morfolog a que sugiera la presencia de S pneumoniae Las muestras pueden ser analizadas apenas sea visible el crecimiento pero antes de 48 horas 1 La muestra puede ser tomada con un asa de pl stico desechable de 1 ul un asa met lica una aguja de pl stico desechable o un bastoncillo No deben usarse torundas dado el escaso volumen de l quido en el cual ser n vueltas a suspender las c lulas 2 Si se analiza una sola colonia debe tener por lo menos 1 mm de di metro Tambi n pueden analizarse varias 3 a 4 colonias m s peque as NO USAR COLONIAS CONFLUENTES Evitar tomar medio de cultivo junto con las c lulas El usuario puede ele
17. uma ansa met lica ou com uma agulha de pl stico descart vel N o utilizar zaragatoas swabs uma vez que as bact rias v o ser colocadas em suspens o numa quantidade m nima de l quido 2 poss vel testar uma nica col nia se tiver pelo menos 1 mm de di metro ou testar v rias col nias 3 ou 4 mais pequenas NAO COLHER COLETAR COLONIAS CONFLUENTES Evitar colher coletar parte do meio s lido de cultura O bacteriologista pode nesta etapa decidir semear outro meio de cultura para confirmar a pureza da amostra isolada B Identifica o a partir de caldo de cultura O teste pode ser efectuado com caldos de cultura apropriados como o caldo trypcase soja ou o caldo coeur cervelle cuja turbidez deve ser superior ou igual a 1 McFarland Podem ser utilizados caldos de cultura incubados a 37 C at um m ximo de 24 h Pipetar uma amostra de 50 ul da suspens o do caldo correctamente homogeneizado para o tubo de Reagente Sonda seguindo as instru es do par grafo PREPARA O DA AMOSTRA MATERIAL FORNECIDO _ O AccuProse STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 20 Testes Reagente Sonda P 10 x 2 tubos MATERIAL NECESSARIO MAS NAO FORNECIDO Ansas de 1 ul de pl stico est ril ansas met licas agulhas de pl stico para colheita coleta das col nias Estirpes cepas de controlo das culturas Banho maria ou bloco de aquecimento 60 1 C
18. uresequenzen spezifisch zu hybridisieren und stabile Doppelstrang Komplexe zu bilden 5 Der AccuPROBE Test enth lt eine einzelstr ngige DNA Sonde an die ein Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist Diese Sonde ist der rRNA der Zielsequenz komplement r Nachdem die rRNA des Zielorganismus freigesetzt ist verbindet sich die Sonde mit dieser und bildet einen stabilen DNA RNA Komplex Ein Selektionsreagenz baut den Chemilumineszenzmarker der ungebundenen Sonde ab w hrend der Marker der gebundenen Sonde intakt bleibt Das GEN PROBE luminometer mi t das von den DNA RNA Hybriden abgegebene Lichtsignal Ein 9 D AA positives Ergebnis liegt vor wenn der vom luminometer angezeigte Wert gleich oder gr er ist als der Grenzwert cut off Liegt der Wert unterhalb dieses Grenzwertes ist das Ergebnis negativ REAGENZIEN Die Reagenzien des AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTESTS werden in drei separaten Kits geliefert AccuProBe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SONDEN TESTKIT Sondenreagenz P 10 x 2 R hrchen Streptococcus pneumoniae AccuProse KULTURBEST TIGUNGS REAGENZIENKIT Reagenz 1 Lysereagenz 1 1x 10 ml Pufferl sung mit 0 04 Natriumazid Reagenz 2 Hybridisierungspuffer 2 1x 10 ml Pufferl sung Reagenz 3 Selektionsreagenz 3 1 x 60 ml Pufferl sung GEN PROBE DETEKTIONSREAGENZIEN KIT Detektionsreagenz RI 1x 240 ml 0 1 Wasserstoffperoxid in 0 001 N Salpeters ure Detektionsreagenz II
19. 20 minutos Incubar los tubos de Reactivo Sonda durante la etapa de SELECCION por lo menos durante 5 minutos pero no m s de 6 minutos E BA O MARIA El nivel de agua en el ba o mar a debe mantenerse para garantizar que todo el volumen del l quido de reacci n de los tubos de Reactivo Sonda se encuentre sumergido pero no debe ser tan alto como para que el agua penetre en los tubos F VORTEX Es cr tico contar con una mezcla homog nea durante la etapa de SELECCI N en particular despu s de a adir el Reactivo 3 G RESOLUCION DE INCIDENTES 1 Valores elevados de control negativo Streptococcus bovis ATCC 33317 superiores a 20 000 RLU Relative Light Units Unidades de Luz Relativas en el LEADER o a 600 PLU Photometric Light Units Unidades Fotom tricas de Luz en el AccuLDR antes PAL pueden ser provocados por una homogeneizaci n insuficiente despu s de incorporar el Reactivo 3 Reactivo de Selecci n o bien si se analizan cultivos mixtos Para verificar si se trata de un cultivo mixto se puede repicar una parte sobre un medio s lido apropiado e incubar 2 Valores bajos de control positivo Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 inferiores a 50 000 RLU o 1 500 PLU en el AccuLDR antes PAL pueden ser causados por un n mero insuficiente de c lulas por analizar cultivos mixtos o envejecidos o por dejar las c lulas en el Reactivo 1 mas de 30 minutos despu s de la incorporaci n del Reactivo 2 Para verificar si se trata d
20. 65 2865 20 Tests Probe Reagent P 10 x 2 tubes MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED 1 uL plastic sterile inoculating loops wire loops plastic needles or applicator sticks for selecting colonies Control culture strains Water bath or Dry Heat Bath 60 1 C Micropipettes 50 uL 300 uL Re pipettor 50 uL 300 uL Vortex mixer Heating blocks in the dry heat bath should have wells that are correctly sized for 12 x 75 mm tubes The use of GEN PROBE dry heat baths is recommended AVAILABLE FROM YOUR GEN PROBE DISTRIBUTOR GEN PROBE LEADER 50i Luminometer bioM rieux ref 39400 Gen Probe Cat No 103100i 3100i Dry Heat Bath 60 1 C bioM rieux ref 39406 Gen Probe Cat No 3397 AccuPRoBE CULTURE IDENTIFICATION REAGENT KIT bioM rieux ref 39305 Gen Probe Cat No 102800 2800 GEN PROBE DETECTION REAGENT KIT bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 1791 TEST PROCEDURE A EQUIPMENT PREPARATION 1 Adjust the water bath or dry heat bath to 60 1 C B i AA 2 Prepare the GEN PROBE luminometer for operation Make sure there is sufficient volume of Detection Reagents and Il to complete the tests If sufficient reagents are not contained in the reservoirs fill the reservoirs according to the instructions in the Operator s Manual CONTROLS Positive and negative control strains should be tested routinely in each laboratory according to local regulations A culture o
21. A Il risultato sar positivo se il luminometro indicher un valore superiore o uguale al valore soglia negativo se mostrer un valore inferiore REAGENTI reagenti impiegati nel TEST AccuProse DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA sono forniti in tre diversi kit KIT SONDA PER STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AccuPROBE Reagente Sonda P 10 x 2 provette Streptococcus pneumoniae KIT DI REAGENTI DI IDENTIFICAZIONE DI COLTURA AccuPRoBE Reagente 1 Reagente di Lisi 1 1x10ml Soluzione tamponata contenente 0 04 di sodio azide Reagente 2 Tampone di Ibridazione 2 1x10ml Soluzione tamponata Reagente 3 Reagente di Selezione 3 1 x 60 ml Soluzione tamponata KIT DI REAGENTI DI RIVELAZIONE GEN PROBE Reagente di Rivelazione RI 1x 240 ml 0 1 di acqua ossigenata in acido nitrico 0 001 N Reagente di Rivelazione Il RII 1x240 ml Idrossido di sodio 1 N PRECAUZIONI D USO A Il test riservato esclusivamente ad un uso diagnostico in vitro B Durante la l esecuzione di questo test adottare le normali precauzioni 1 C Da usarsi esclusivamente per l identificazione delloS pneumoniae isolato a partire da una coltura D Impiegare unicamente il materiale compreso nel kit o materiale monouso E I reagenti di questo kit contengono sodio azide una sostanza che pu reagire con il piombo o il rame delle condutture e formare composti metallici esplosivi Durante l eliminazione di q
22. A sequences that are unique to S pneumoniae PRINCIPLES OF THE PROCEDURE Nucleic acid hybridization tests are based on the ability of complementary nucleic acid strands to specifically align and associate to form stable double stranded complexes 5 The AccuPRoBE SYSTEM uses a single stranded DNA probe with a chemiluminescent label that is complementary to the ribosomal RNA of the target organism After the ribosomal RNA is released from the organism the labeled DNA probe combines with the target organism s ribosomal RNA to form a stable DNA RNA hybrid The Selection Reagent allows for the differentiation of non hybridized and hybridized probe The labeled DNA RNA hybrids are measured in the GEN PROBE luminometer A positive result is a luminometer reading equal to or greater than the cut off A value below this cut off is a negative result i REAGENTS Reagents for the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST are provided in three separate reagent kits AccuProBe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PROBE KIT Probe Reagent P 10 x 2 tubes Streptococcus pneumoniae AccuProse CULTURE IDENTIFICATION REAGENT KIT Reagent 1 Lysis Reagent 1 1x10mL Buffered solution containing 0 04 sodium azide Reagent 2 Hybridization Buffer 2 1x10mL Buffered solution Reagent 3 Selection Reagent 3 1 x 60 mL Buffered solution GEN PROBE DETECTION REAGENT KIT Detection Reagent RI 1x 240 mL 0 1 hydrogen per
23. CCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE Ces souches comprenaient 78 esp ces issues de 51 genres diff rents Un panel phylog n tique 5 souches de S pneumoniae 24 souches de 13 autres esp ces de streptocoques et 66 souches de 50 autres genres a t teste Seules les souches de S pneumoniae ont donn un r sultat positif avec le TEST AccuProBeE D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE Les autres micro organismes ont donn un r sultat n gatif 23 a D TEST DE SURCHARGE Sept s ries de dilutions de S pneumoniae de 3 000 a 30 millions de microorganismes par dilution ont t test es en pr sence de 30 millions de microorganismes appartenant aux esp ces non cibles Streptococcus salivarius et Streptococcus bovis Aucune interf rence ni r action crois e n a t observ e 24 GEN PROBE AccuProbe TEST DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 UTILIZACION El TEST AccuProge DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO es un test de identificaci n r pida de Streptococcus pneumoniae Pneumococcus aislado en un cultivo Este test utiliza la t cnica de hibridaci n de cidos nucleicos RESUMEN Y EXPLICACION DEL TEST Streptococcus pneumoniae S pneumoniae es la principal causa de neumon a bacteriana adquirida entre la comunidad en Estados Unidos donde se producen aproximadamente medio
24. EUMONIAE AISLADO EN CULTIVO deben ser interpretados conjuntamente con otros datos de laboratorio y cl nicos disponibles para el cl nico VALORES ESPERADOS El TEST AccuProge DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO fue comparado con m todos de identificaci n bioqu micos standard en dos sitios utilizando un total de 662 muestras cl nicas De stas 305 fueron cepas de S pneumoniae 185 fueron cepas de otras especies de Streptococcus y 172 fueron otras cepas microbianas que representaban a 25 g neros Los m todos de identificaci n standard incluyeron tinci n de Gram morfolog a de las colonias reacci n de la catalasa actividad hemol tica en agar sangre de cordero al 5 susceptibilidad a la optoquina y solubilidad en bilis Las cepas fueron catalogados ya sea como positivos 50 000 RLU o negativos lt 50 000 RLU Las observaciones demostraron que para los cultivos negativos se obten an valores de 344 a 32 911 RLU y 59 223 a 863 193 RLU para los cultivos positivos Una comparaci n entre el TEST AccuPRoBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO y los m todos standard de identificaci n de cultivos se presenta a continuaci n 30 Zu AccuProse IDENTIFICACION DE CULTIVO AccuPROBE Pos Pos Neg Neg Sensibilidad Porcent Cultivo Pos Neg Pos Neg Especificidad Concordancia Sitio 1 202 0 0 212 100 100 100 Sitio 2 103 0 0 145 100 100 100 Total 305 0 0 357 100 100 100
25. ICACION Reactivo 1 Reactivo de Lisis 1 1x10ml Soluci n tamponada que contiene 0 04 de azida s dica Reactivo 2 Tamp n de Hibridaci n 2 1x10ml Soluci n tamponada Reactivo 3 Reactivo de Selecci n 3 1 x 60 ml Soluci n tamponada KIT GEN PROBE DE REACTIVO DE DETECCION Reactivo de Detecci n RI 1x 240 ml Per xido de hidr geno al 0 1 en cido nitrico 0 001 N Reactivo de Detecci n II RII 1x 240 ml Hidr xido de sodio 1 N PRECAUCIONES DE EMPLEO A S lo para diagn stico in vitro Utilizar las precauciones habituales al realizar este ensayo 1 Utilizar s lo para la identificaci n de Streptococcus pneumoniae aislado en cultivo Utilizar s lo el material de laboratorio suministrado o el material desechable especificado moom Los reactivos de este kit contienen azida s dica que pueden reaccionar con las tuberias de plomo o cobre para formar azidas met licas potencialmente explosivas Al eliminar estos reactivos diluir el material con un gran volumen de agua para prevenir la acumulaci n de azidas en las tuberias F Evitar el contacto de los Reactivos de Detecci n y Il con la piel y las mucosas Lavar con agua si estos reactivos entran en contacto con la piel Si se producen derrames de estos reactivos diluir con agua antes de secar CONSERVACION Los tubos de Reactivo Sonda pueden ser conservados en bolsas de aluminio entre 2 y 8 C Los tubos de Reactivo Sonda son estables en las bolsas
26. IFICATION TEST compared to standard culture identification methods is 100 PERFORMANCE CHARACTERISTICS A WITHIN RUN PRECISION The within run precision of the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST was calculated by assaying two concentrations of ribosomal RNA isolated from S pneumoniae using 10 replicates in a single assay i Sample A B Number of Replicates 10 10 Mean Response 101 292 56 025 Standard Deviation 4 293 1 743 Coefficient of Variation 4 2 3 1 B BETWEEN RUN PRECISION The between run precision was calculated by assaying the same two concentrations of S pneumoniae ribosomal RNA using single determinations in 12 consecutive runs Sample A B Number of Replicates 12 12 Mean Response 101 322 53 288 Standard Deviation 3 660 1 776 Coefficient of Variation 3 6 3 3 C SPECIFICITY A total of 95 ATCC reference isolates were evaluated using the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST These isolates represented a total of 78 species from 51 genera Five isolates of S pneumoniae 24 isolates of 13 other Streptococcus species and 66 isolates of 50 other genera representing a phylogenetic cross section of organisms were evaluated using the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST All S pneumoniae isolates tested produced positive results using the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST Other Streptococcus species and the represen
27. Micropipetas 50 ul 300 ul Pipetas de repeti o 50 ul 300 ul Vortex Os orif cios do bloco de aquecimento devem estar adaptados a tubos de 12 x 75 mm Aconselha se a utiliza o dos blocos de aquecimento GEN PROBE MATERIAL SUPLEMENTAR DISPON VEL NO SEU DISTRIBUIDOR GEN PROBE Lumin metro GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux ref 39400 Gen Probe Cat No 103100i 3100i Bloco de aquecimento 60 1 C bioM rieux ref 39406 Gen Probe Cat No 3397 AccuProBE REAGENTES PARA IDENTIFICA O DE CULTURAS bioM rieux ref 39305 Gen Probe Cat No 102800 2800 43 Hod gt S Q S 0 O i REAGENTES DE DETEC O GEN PROBE bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 1791 PROCEDIMENTO A PREPARAGAO DO MATERIAL 1 Regular o banho maria ou o bloco de aquecimento a 60 1 C 2 Preparar o lumin metro GEN PROBE Assegurar se de que a quantidade de reagentes de Detecc o e Il suficiente para efectuar todos os testes Em caso contrario encher os reservat rios do lumin metro consoante as instru es do Manual de Utiliza o B CONTROLOS As estirpes cepas de controlo positivo e negativo devem ser testadas por rotina em cada laborat rio em conformidade com a regulamentac o em vigor Pode utilizar se uma cultura de S pneumoniae por exemplo American Type Culture Collection ATCC 33400 como controlo positivo e uma cultura de Streptococcus bovis por exemplo ATCC 33317 como
28. OCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO Estas cepas representaban un total de 78 especies de 51 g neros Cinco cepas de S pneumoniae 24 cepas de otras 12 especies de Streptococcus y 66 cepas de otros 50 g neros que representaban un corte filogen tico de organismos fueron evaluados utilizando el TEST AccuPRoge DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO Todos las muestras analizadas de S pneumoniae dieron resultados positivos utilizando el TEST AccuPRose DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO Otras especies de Streptococcus y el corte filogen tico de especies no reaccionaron con este kit 31 i AA D TEST DE SOBRECARGA Siete diluciones en serie de c lulas de S pneumoniae entre 3 mil y 30 millones de c lulas por ensayo fueron analizadas en presencia de 30 millones de c lulas de las siguientes especies no diana Streptococcus salivarius y Streptococcus bovis La presencia de las especies no diana no interfiri con la se al positiva de las diluciones de c lulas de S pneumoniae ni gener una reacci n positiva con el TEST ACCUPROBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO 32 GEN PROBE AccuProbe TEST DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA bioM rieux cod 39204 Gen Probe Cat N 102865 2865 IMPIEGO Il TEST ACCUPROBE PER L IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA un test c
29. RE IDENTIFICATION TEST is designed to determine the identity of S pneumoniae isolated from culture 2 A A Solid Media Method Growth from appropriate solid media such as 5 Sheep Blood Agar with morphology suggestive of S pneumoniae may be tested Samples may be tested as soon as the growth is visible but should be less than 48 hours old 1 Discrete colonies can be taken off the solid media with a 1 uL disposable plastic loop a wire loop a disposable plastic needle or an applicable stick Swabs should not be used due to the small volume of liquid in which the cells are subsequently resuspended 2 fa single colony is to be tested it should be at least 1 mm in diameter Alternatively several 3 to 4 smaller colonies can be tested DO NOT USE CONFLUENT GROWTH Avoid taking any of the solid media with the cells The operator may elect to inoculate another culture plate at this time to confirm the purity of the isolate B Broth Culture Method Appropriate broth cultures such as Trypticase Soy or Brain Heart Infusion with turbidity equivalent to or greater than a McFarland 1 Nephelometer Standard may be tested Broth cultures incubated for up to 24 hours at 37 C may be used Pipette a 50 uL sample from the well mixed broth suspension into the Probe Reagent Tubes as described below MATERIALS PROVIDED The AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 1028
30. TESTDURCHF HRUNG unter VORBEREITUNG DER PROBEN beschrieben MITGELIEFERTE MATERIALIEN AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTEST bioM rieux Best Nr 39204 Gen Probe Kat Nr 102865 2865 20 Tests Sondenreagenz P 10 x 2 R hrchen ERFORDERLICHE MATERIALIEN NICHT IM KIT ENTHALTEN Sterile 1 ul Plastik sen Metall sen oder Plastiknadeln zum Abimpfen der Kolonien Kontroll Kulturst mme Wasserbad oder Heizblock 60 1 C Mikropipetten 50 ul 300 ul Repetierpipetten 50 ul 300 ul Vortex Die Heizbl cke m ssen f r 12 x 75 mm R hrchen geeignet sein Es wird daher empfohlen die Heizblocksysteme von GEN PROBE zu verwenden ZUS TZLICHE VERF GBARE MATERIALIEN GEN PROBE LEADER 50i Luminometer bioM rieux Best Nr 39400 Gen Probe Kat Nr 103100i 3100i Heizblock 60 1 C bioM rieux Best Nr 39406 Gen Probe Kat Nr 3397 ACCUPROBE REAGENZIENKIT KULTURBEST TIGUNG 11 A bioM rieux Best Nr 39305 Gen Probe Kat Nr 102800 2800 GEN PROBE DETEKTIONSREAGENZIEN KIT bioM rieux Best Nr 39300 Gen Probe Kat Nr 201791 1791 TESTDURCHF HRUNG A VORBEREITUNG DER GER TE UND MATERIALIEN 1 2 Stellen Sie das Wasserbad oder den Heizblock auf 60 1 C ein Bereiten Sie das GEN PROBE luminometer f r die Messung vor Vergewissern Sie sich da f r die Durchf hrung der Tests ausreichend Detektionsreagenz und Il vorhanden ist Ist dies nicht der Fall f ll
31. TREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTEST dient zur Identifizierung von S pneumoniae aus Kulturisolaten A Feste Kulturmedien Verwenden Sie Kulturen von geeigneten Festmedien wie 5 iger Hammelblutagar mit S pneumoniae verd chtiger Morphologie Die Kulturen k nnen getestet werden sobald Wachstum sichtbar ist Sie sollten nicht lter als 48 Stunden sein 1 Einzeln liegende Kolonien mit einer 1 ul Einweg Plastik se einer Metall se oder einer Einweg Plastiknadel abnehmen Verwenden Sie wegen des geringen Fl ssigkeitsvolumens in dem die Zellen anschlie end gel st werden keinen Wattetupfer 2 Wird eine einzelne Kolonie getestet sollte diese einen Durchmesser von mindestens 1 mm haben Alternativ k nnen mehrere 3 4 kleinere Kolonien getestet werden VERWENDEN SIE KEINE KONFLUIERENDEN KOLONIEN Achten Sie darauf da beim Abnehmen der Zellen kein N hrboden mit abgenommen wird Zu diesem Zeitpunkt besteht die M glichkeit eine weitere Platte zu beimpfen um die Reinheit der entnommenen Probe zu berpr fen B Fl ssige Kulturmedien Der Test kann mit geeigneten Fl ssigkulturen wie Trypcase Soja oder Hirn Herz Bouillon durchgef hrt werden deren Tr bung gr er oder gleich McFarland Standard 1 ist Es k nnen Bouillonkulturen die bis zu 24 Stunden bei 37 C inkubiert wurden verwendet werden Pipettieren Sie 50 ul Probe aus dem gut gemischten Fl ssigkulturmedium in die Sondenreagenzr hrchen wie im Abschnitt
32. a insufficiente dopo l inoculazione del Reagente 3 Reagente di 37 D AA Selezione o quando siamo in presenza di vari tipi di colonie Per verificare che si tratti di una coltura mista possibile trapiantarne una parte su un adeguato terreno di coltura agar e metterla ad incubare 2 Bassi valori di controllo positivo Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 inferiori a 50 000 RLU sul luminometro LEADER o a 1 500 PLU sul luminometro AccuLDR precedentemente PAL possono essere rilevati quando il numero di germi insufficiente o quando il test viene effettuato su colture miste o invecchiate o quando batteri siano stati lasciati nel Reagente 1 per oltre 30 minuti prima di aggiungere il Reagente 2 Per verificare che si tratti di una coltura mista possibile trapiantarne una parte su un adeguato terreno di coltura agar e metterla ad incubare RISULTATI DEL TEST A INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I risultati del TEST AccuProse DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA vengono interpretati in base ad un valore soglia campioni che originano un segnale superiore o uguale a questa soglia vengono considerati positivi segnali luminosi inferiori a questa soglia sono considerati negativi Quando il risultato si posiziona nell area di incertezza il test deve essere ripetuto Se la seconda analisi fa nuovamente emergere risultati equivoci occorre trapiantare il ceppo per verificarne la purezza Acc
33. a pesquisa de catalase a an lise da actividade a hemol tica em gelose com 5 de sangue de carneiro o estudo da sensibilidade optoquina e da solubilidade na b lis 2 O estudo dos polissacar dios capsulares permitiu identificar mais de 80 serotipos O teste de Quellung outro m todo de identifica o poss vel baseia se na observa o do enchimento capsular aparente em resposta ao tratamento por um antisoro No entanto todos os testes aqui mencionados s o subjectivos e nenhum deles permite uma identifica o inequ voca de S pneumoniae O AccuProse STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA um teste r pido e objectivo que permite a identifica o definitiva de S pneumoniae pela detec o de sequ ncias de ARN riboss mico que lhe s o espec ficas PRINC PIO Os testes por hibridiza o de cidos nucleicos baseiam se na capacidade de cadeias complementares de cidos nucleicos emparelharem de forma espec fica para formar complexos bicaten rios est veis 5 O m todo ACCUPROBE utiliza uma sonda ADN monocaten ria conjugada com um marcador quimioluminescente complementar de ARN riboss mico ARNr do organismo alvo Quando o ARN do organismo alvo libertado a sonda hibridiza com este para formar um complexo ADN ARN est vel O Reagente de Selec o permite diferenciar as sondas hibridizadas das n o hibridizadas O lumin metro 41 Hod gt Q 0 O D AA GEN PROBE mede
34. al des voies a riennes sup rieures chez le sujet sain les nourrissons les sujets g s et les patients fragilis s par d autres affections respiratoires ou immuno d prim s repr sentent un terrain particulierement favorable au d veloppement d une infection pneumococcique 2 3 4 Les m thodes traditionnelles physiologiques et biochimiques permettent de faire des identifications par pr somption Celles ci comprennent l tude morphologique de la colonie l examen apr s coloration de Gram la recherche de catalase l analyse de l activit a h molytique sur g lose 5 de sang de mouton l tude de la sensibilit l optochine et de la solubilit dans la bile 2 L tude des polysaccharides capsulaires a permis d identifier plus de 80 s rotypes Le test de Quellung est une autre m thode possible d identification il repose sur l observation du gonflement capsulaire apparent en r ponse au traitement par un antis rum Toutefois tous les tests mentionn s ici sont subjectifs et aucun d entre eux ne permet une identification formelle de S pneumoniae Le TEST AccuProge D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE est un test rapide et objectif permettant l identification formelle de S pneumoniae grace la d tection de s quences d ARN ribosomal qui lui sont sp cifiques PRINCIPE Les tests par hybridation d acides nucl iques sont bas s sur la capacit de brins compl mentaires d acides nucl iques
35. bles jusqu a la date de p remption 18 AS A NE PAS CONGELER LES R ACTIFS PRELEVEMENT ET PR PARATION DE L CHANTILLON Le TEST AccuProse D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE est con u identifier S pneumoniae isol partir d une culture A Identification partir de culture sur milieu solide Le test peut tre pratiqu sur des cultures r alis es sur un milieu solide appropri comme la g lose au sang de mouton 5 lorsqu on observe une morphologie suggestive de S pneumoniae L chantillon peut tre test d s que la prolif ration est visible et dans les 48h apr s le d but de la culture 1 L echantillon de culture peut tre pr lev l aide d une se en plastique jetable de 1 ul d une se m tallique ou d une aiguille en plastique jetable Ne pas utiliser d couvillon en raison de la faible quantit de liquide dans lequel les bact ries vont tre remises en suspension 2 Il est possible de tester soit plusieurs petites colonies 3 ou 4 soit une seule colonie d un diam tre d au moins 1 mm NE PAS PRELEVER DE COLONIES CONFLUENTES Eviter de pr lever du milieu de culture avec les bact ries Le manipulateur peut ce stade d cider d ensemencer une autre boite de P tri pour confirmer la puret de l chantillon isol B Identification sur bouillon de culture Le test peut tre pratiqu partir de bouillons de culture appropri s comme le bouillo
36. bridazione in ogni provetta di Reagente Sonda Richiudere le provette e agitarle mediante Vortex oppure agitarle manualmente Mettere in incubazione per 15 minuti a 60 1 C in un bagnomaria o in incubatore 36 i E SELEZIONE 1 Prelevare le provette di Reagente Sonda dal bagnomaria o dall incubatore Rimuovere e conservare i tappi Dispensare 300 ul di Reagente 3 Reagente di Selezione in ogni provetta Richiudere le provette e agitarle mediante Vortex per rendere omogenea la miscela 2 Mettere le provette di Reagente Sonda in incubazione per 5 minuti a 60 1 C a bagnomaria o in incubatore 3 Rimuovere le provette di Reagente Sonda dal bagnomaria o dall incubatore e lasciarle a temperatura ambiente almeno per 5 minuti Togliere e gettare i tappi Leggere i risultati sul luminometro nell ora successiva F LETTURA 1 Selezionare il protocollo giusto sul luminometro 2 Per eliminare completamente i residui dalla superficie delle provette asciugare utilizzando un foglio assorbente inumidito Inserire successivamente le provette nel luminometro e seguire attentamente le istruzioni 3 Una volta conclusa l analisi estrarre le provette dal luminometro OSSERVAZIONI A REAGENTI Il Reagente 2 Tampone di Ibridazione pu precipitare Riscaldare a 35 e 60 C e agitarlo mediante Vortex per sciogliere il precipitato B PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE necessario prelevare i campioni provenienti dalla coltura su u
37. bridization Reaction should be started within 30 minutes of adding the cells and Reagent 1 to the Probe Reagent Tubes 2 The Hybridization and Selection reactions are time dependent Hybridize at least 15 minutes but no more than 20 minutes Incubate the Probe Reagent Tubes during the SELECTION Step for at least 5 minutes but no more than 6 minutes WATER BATH The level of water in the water bath should be maintained to ensure that the entire liquid reaction volume in the Probe Reagent Tubes is submerged but should not be so high that the water might enter the tubes VORTEXING It is critical to have a homogeneous mixture during the SELECTION Step specifically after the addition of Reagent 3 TROUBLE SHOOTING 1 Elevated negative control values Streptococcus bovis ATCC 33317 greater than 20 000 RLU Relative Light Units in the LEADER or 600 PLU Photometric Light Units in the AccuLDR formerly PAL can be caused by insufficient mixing after adding Reagent 3 Selection Reagent or by testing mixed cultures Because mixed cultures can occur a portion of the growth may be streaked onto the appropriate agar medium and incubated to check for multiple colony types 2 Low positive control values Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 less than 50 000 RLU or 1 500 PLU in the AccuLDR formerly PAL can be caused by insufficient cell numbers by testing mixed or aged cultures or by leaving cells in Reagent 1 more than 30 minutes before addin
38. controlo negativo C PREPARA O DAS AMOSTRAS 1 Cortar horizontalmente a parte superior das saquetas sachets de alum nio Retirar o n mero necess rio de tubos de Reagente Sonda para analisar as amostras e ou as estirpes cepas de controlo Fechar bem a saqueta sachet dobrando v rias vezes a sua extremidade e fixando a com fita cola ou com um clip N o retirar a saqueta sachet que cont m o dissecante 2 Identificar um n mero suficiente de tubos de Reagente Sonda para testar as amostras e ou as estirpes cepas de controlo Tirar e conservar as tampas 3 Pipetar 50 ul de Reagente 1 Reagente de Lise para os tubos de Reagente Sonda Se o teste for efectuado com estirpes cepas isoladas a partir de caldo de cultura n o adicionar Reagente 1 aos tubos de Reagente Sonda 4 Transferir a amostra proveniente do meio s lido uma col nia de pelo menos 1 mm de di metro ou col nias mais pequenas ou 50 ul de caldo de cultura correctamente homogeneizado para os tubos de Reagente Sonda seguindo as instru es descritas no par grafo COLHEITA COLETA E PREPARA O DA AMOSTRA Se o teste for efectuado com uma cultura em meio s lido agitar a ansa ou agulha no Reagente 1 Reagente de Lise e mexer cuidadosamente para colocar as c lulas em suspens o D HIBRIDIZACAO 1 Pipetar 50 ul de Reagente 2 Tamp o de Hibridiza o para todos os tubos de Reagente Sonda Voltar a tapar os tubos e agit los manualmente ou num Vortex 2 Incubar du
39. dans le tableau ci dessous 22 A AccuPRroBE CULTURE AccuPROBE Pos Pos Neg Neg Sensibilit Taux de Culture Pos Neg Pos Neg Sp cificit Concordance Site 1 202 0 0 212 100 100 100 Site 2 103 0 0 145 100 100 100 Total 305 0 0 357 100 100 100 Toutes les souches de S pneumoniae ont donn des r sultats positifs et toutes les autres souches ont donn des r sultats n gatifs avec le TEST AccuProse D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE La sensibilit la sp cificit et le taux de concordance du test sont de 100 PERFORMANCES DU TEST A PRECISION INTRA ESSAI La pr cision intra essai du TEST ACCUPROBE D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE a t calcul e en analysant deux concentrations diff rentes d ARN ribosomal de S pneumoniae 10 fois dans une m me s rie Echantillon A B Nombre d essais 10 10 Reponse moyenne RLU 101 292 56 025 Ecart type 4 293 1 743 Coefficient de variation 4 2 3 1 B PRECISION INTER ESSAI La precision inter essai a t calcul e en analysant en simple deux concentrations differentes d ARN ribosomal de S pneumoniae au cours de 12 s ries distinctes Echantillon A B Nombre d essais 12 12 R ponse moyenne RLU 101 322 53 288 Ecart type 3 660 1 776 Coefficient de variation 3 6 3 3 C SPECIFICITE Un total de 95 souches de cultures ATCC a t tudi l aide du TEST AccuProBE D IDENTIFICATION DE STREPTOCO
40. della morfologia delle colonie colorazione di Gram ricerca di catalasi analisi dell attivit emolitica su terreno agar sangue di montone al 38 A 5 test di sensibilit all optochina e solubilit nella bile campioni sono stati dichiarati positivi gt 50 000 RLU ovvero negativi lt 50 000 RLU I risultati osservati andavano da 344 a 32 911 RLU per le colture negative e da 59 223 a 863 193 RLU per le colture positive Il raffronto di questo risultato con le metodiche tradizionali di identificazione di seguito indicato AccuProse COLTURA D IDENTIFICAZIONE AccuPROBE Pos Pos Neg Neg Sensibilita Tasso di Coltura Pos Neg Pos Neg Specificita concordanza Centro 1 202 0 0 212 100 100 100 Centro 2 103 0 0 145 100 100 100 Totale 305 0 0 357 100 100 100 Tutti i ceppi di S pneumoniae hanno evidenziato risultati positivi e tutti gli altri ceppi hanno mostrato risultati negativi con il TEST AccuPRoBE DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA La sensibilit la specificita ed il tasso di concordanza del test sono del 100 PERFORMANCE DEL TEST A PRECISIONE INTRA TEST La precisione intra test del TEST AccuPRoBE DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA stata calcolata analizzando tre diverse concentrazioni di RNA ribosomiale di S pneumoniae per 10 volte in una medesima serie Campione A B Numero di test 10 10 Risposta media 101 292 56 025 De
41. e aghi in plastica o bacchette per applicazione allo scopo di prelevare le colonie Ceppi di controllo delle colture Bagnomaria o incubatore 60 1 C Micropipette 50 ul 300 ul Micropipette a volume fisso 50 ul 300 ul Vortex Gli alloggiamenti all interno dell incubatore devono essere perfettamente dimensionati per provette da 12 x 75 mm Si raccomanda l impiego di incubatori GEN PROBE 35 oO A ULTERIORE MATERIALE DISPONIBILE PRESSO IL VOSTRO DISTRIBUTORE GEN PROBE Luminometro GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux cod 39400 Gen Probe Cat N 103100i 3100i Incubatore 60 1 C bioM rieux cod 39406 Gen Probe Cat N 3397 KIT DI REAGENTI DI IDENTIFICAZIONE DI COLTURE ACCUPROBE bioM rieux cod 39305 Gen Probe Cat N 102800 2800 KIT DI REAGENTI DI RIVELAZIONE GEN PROBE bioM rieux cod 39300 Gen Probe Cat N 201791 1791 PROCEDIMENTO A PREPARAZIONE DEL MATERIALE 1 2 Impostare l incubatore o il bagnomaria a 60 1 C Preparare il luminometro GEN PROBE Assicurarsi che la quantit di Reagenti di Rivelazione e Il si sufficiente per condurre i test Se non fosse cosi riempire il serbatoio del luminometro attenendosi alle istruzioni contenute nel manuale d uso B CONTROLLI In ogni laboratorio occorrer testare sistematicamente ceppi come controllo positivo e negativo secondo le normative in vigore E possibile usare una coltura di S pneumoniae ad es American Type C
42. e R actif Sonde Si le test est effectu sur des souches isol es partir de bouillons de culture ne pas ajouter de R actif 1 dans les tubes de R actif Sonde Transferer l chantillon provenant du milieu solide une colonie d au moins 1 mm de diam tre ou plusieurs petites colonies ou 50 ul du bouillon de culture correctement homog n is dans les tubes de R actif Sonde suivant les instructions du paragraphe PRELEVEMENT ET PREPARATION DE L ECHANTILLON Si le test est r alis partir d une culture en milieu solide agiter l se l aiguille ou le b tonnet dans le R actif 1 R actif de Lyse et m langer soigneusement pour remettre les microorganismes en suspension D HYBRIDATION 1 2 Distribuer 50 ul de R actif 2 Tampon d Hybridation dans tous les tubes de R actif Sonde Reboucher les tubes et les agiter l ide d un manuellement ou l aide d un Vortex Faire incuber pendant 15 minutes 60 1 C au bain marie ou dans le bloc chauffant E SELECTION 1 Retirer les tubes de R actif Sonde du bain marie ou du bloc chauffant Oter et conserver les bouchons Distribuer 300 ul de R actif 3 R actif de Selection dans chaque tube Reboucher les tubes et les agiter l aide d un Vortex pour obtenir un m lange homogene 20 e A 2 Faire incuber les tubes de R actif Sonde pendant 5 minutes 60 1 C l ide du bain marie ou dans le bloc chauffant 3 Retirer les tubes de R actif Sond
43. e du bain marie ou du bloc chauffant et les laisser temp rature ambiante pendant au moins 5 minutes Oter et jeter les bouchons Lire les r sultats au luminom tre dans l heure qui suit F DETECTION 1 S lectionner le protocole appropri sur le luminom tre 2 Afin de retirer tout r sidu de la surface des tubes les essuyer l aide de papier absorbant humide Placer ensuite les tubes dans le luminom tre et suivre les instructions 3 Lorsque l analyse est termin e retirer les tubes du luminom tre REMARQUES A REACTIFS Le R actif 2 Tampon d Hybridation peut pr cipiter 2 8 C Le chauffer 35 60 C et l agiter pour dissoudre le pr cipit B PRELEVEMENT ET PR PARATION DE LECHANTILLONS Il est important de pr lever les chantillons provenant de culture sur une partie du milieu solide occup e par des colonies isol es C TEMPERATURE La pr paration de l chantillon ainsi que les r actions d hybridation et de s lection sont thermo d pendantes Par cons quent il est imp ratif que l incubateur le bain marie et le bloc chauffant soient maintenus la temp rature pr conis e D DUR E DES OP RATIONS 1 La r action d hybridation doit tre initi e dans les 30 minutes qui suivent l introduction de P chantillon et du R actif 1 dans les tubes de R actif Sonde 2 Les r actions d hybridation et de s lection sont d pendantes du temps L hybridation doit durer au moins 15 minutes mais pas plu
44. e un cultivo mixto se puede repicar una parte sobre un medio s lido apropiado e incubar 29 oO A RESULTADOS A INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados del TEST AccuProseE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO se basan en los valores umbral que siguen Las muestras que producen se ales iguales o superiores a estos valores umbral son consideradas positivas Las se ales inferiores a estos valores umbral son consideradas negativas Los resultados en la zona de incertidumbre deben ser repetidos Si el segundo an lisis da resultados dudosos se debe repicar la cepa con el fin de verificar su pureza AccuLDR LEADER antes PAL Valor umbral 1 500 PLU 50 000 RLU Zona de incertidumbre 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B CONTROL DE CALIDAD Y ACEPTABILIDAD DE LOS RESULTADOS El control negativo p ej Streptococcus bovis ATCC 33317 y el control positivo p ej Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 deben satisfacer los siguientes valores AccuLDR LEADER antes PAL Control negativo lt 600 PLU lt 20 000 RLU Control positivo gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITES DEL METODO Este m todo ha sido analizado utilizando cultivos frescos usando los medios s lidos y los caldos de cultivo citados en la secci n TOMA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS La eficacia del test no ha sido demostrada en muestras cl nicas directas Los resultados del TEST AccuPRoBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PN
45. el diluir com bastante gua para prevenir a forma o de azidas na canaliza o F Evitar o contacto dos Reagentes de Detec o e Il com a pele os olhos e com as mucosas No caso de contacto lavar com gua Se estes reagentes forem derramados dilu los com gua antes de limpar CONSERVA O Os tubos de Reagente Sonda devem ser conservados nas saquetas sachets de alum nio a 2 8 C Antes da abertura permanecem est veis at data de validade indicada Depois da abertura a saqueta sachet deve ser bem fechada e os tubos devem ser utilizados num prazo de dois meses dentro do prazo de validade Os outros reagentes do AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA podem ser conservados entre 2 e 25 C e permanecem est veis at data de validade N O CONGELAR OS REAGENTES 42 i A COLHEITA COLETA E PREPARA O DA AMOSTRA _ O AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA foi concebido para identificar S pneumoniae isolado de uma cultura A Identifica o a partir de cultura em meio s lido O teste pode ser efectuado em culturas realizadas num meio s lido apropriado por exemplo gelose com 5 sangue de carneiro quando se observar uma morfologia que sugere S pneumoniae A amostra pode ser analisada logo que a prolifera o seja vis vel e durante 48h 1 A amostra de cultura pode ser colhida coletada com uma ansa de pl stico descart vel de 1 ul com
46. ellen in das R hrchen bertragen werden und mischen Sie gr ndlich D HYBRIDISIERUNG 1 2 Pipettieren Sie 50 ul Reagenz 2 Hybridisierungspuffer in alle Sondenreagenzr hrchen Verschlie en Sie die Sondenreagenzr hrchen und mischen Sie den Inhalt durch Sch tteln oder Vortexen Inkubieren Sie f r 15 min bei 60 1 C im Wasserbad oder Heizblock E SELEKTION 1 2 Nehmen Sie die Sondenreagenzr hrchen aus dem Wasserbad oder Heizblock Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Sie diese auf Pipettieren Sie 300 ul Reagenz 3 Selektionsreagenz in jedes R hrchen Verschlie en Sie die R hrchen und vortexen Sie diese um den Inhalt gleichm ig zu durchzumischen Inkubieren Sie die Sondenreagenzr hrchen f r 5 min bei 60 1 C im Wasserbad oder 12 F i A Heizblock 3 Nehmen Sie die Sondenreagenzr hrchen aus dem Wasserbad oder Heizblock und lassen Sie sie f r mindestens 5 min bei Raumtemperatur stehen Entfernen Sie die Stopfen und verwerfen Sie diese Die R hrchen sollten innerhalb 1 Stunde nachdem Sie aus dem Wasserbad oder Heizblock entfernt wurden gemessen werden DETEKTION 1 W hlen Sie auf dem luminometer das geeignete Programm 2 Zur S uberung der R hrchenwand sowie zur Vermeidung von elektrostatischen Einfl ssen w hrend der Messung durch das R hrchenmaterial selbst sollte jedes R hrchen vor der Messung mit einem feuchten Tuch bzw Papier abgewischt werden Stellen Sie die R hrc
47. en Sie die Beh lter gem den Anweisungen im Handbuch B KONTROLLEN In jedem Labor sollten gem den rtlichen Bestimmungen routinem ig positive und negative Kontrollst mme mitgef hrt werden Als Positivkontrolle kann eine Streptococcus pneumoniae Kultur z B American Type Culture Collection ATCC 33400 dienen w hrend eine Streptococcus bovis Kultur z B ATCC 33317 als Negativkontrolle verwendet werden kann C PROBENVORBEREITUNG 1 Die Folienbeutel am oberen Ende aufschneiden Entnehmen Sie die f r die Kulturisolate und oder Kontrollen erforderliche Anzahl an Sondenreagenzr hrchen Den Beutel an der ge ffneten Seite mehrfach umschlagen und mit Klebeband oder einer Klammer wieder dicht verschlie en Den Trockenbeutel nicht herausnehmen Beschriften Sie eine ausreichende Anzahl Sondenreagenzr hrchen f r die Kulturisolate und oder die Kontrollen Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Sie diese auf Pipettieren Sie 50 ul Reagenz 1 Lysereagenz in alle Sondenreagenzr hrchen Geben Sie kein Reagenz 1 in die Sondenreagenzr hrchen wenn Fl ssigkulturen getestet werden berf hren Sie eine 1 mm gro e Kolonie oder mehrere kleinere Kolonien vom festen Medium oder 50 ul einer gut gemischten Fl ssigkultur in die Sondenreagenzr hrchen wie im Abschnitt PROBENGEWINNUNG UND VORBEREITUNG beschrieben Bei Proben von festen Kulturmedien wirbeln Sie die se oder Nadel in Reagenz 1 Lysereagenz so da m glichst viele Z
48. f Streptococcus pneumoniae e g American Type Culture Collection ATCC 33400 may be used as the positive control while a culture of Streptococcus bovis e g ATCC 33317 may be used as the negative control C SAMPLE PREPARATION 1 Open the foil pouch by cutting evenly across the top of the pouch Remove enough Probe Reagent Tubes to test the culture isolates and or controls Reseal the pouch by folding the opened edge over several times and securing with adhesive tape or a clip Leave the desiccant pillow in the pouch 2 Label a sufficient number of Probe Reagent Tubes to test the culture isolates and or controls Remove and retain the caps 3 Pipette 50 uL of Reagent 1 Lysis Reagent into all Probe Reagent Tubes If broth cultures are to be tested do not add Reagent 1 to the Probe Reagent Tubes 4 Transfer a 1 mm colony or several smaller colonies from the solid media or 50 uLof a well mixed broth culture into the Probe Reagent Tubes as described in the SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION Section Twirl the loop needle or stick in Reagent 1 Lysis Reagent to remove the cells if testing growth from solid media and mix thoroughly HYBRIDIZATION 1 Pipette 50 uL of Reagent 2 Hybridization Buffer into all Probe Reagent Tubes Recap the Probe Reagent Tubes and mix by shaking or vortexing 2 Incubate for 15 minutes at 60 1 C in a water bath or dry heat bath SELECTION 1 Remove the Probe Reagent Tubes from the water bat
49. g Reagent 2 Because mixed cultures can occur a portion of the growth may be streaked onto the appropriate agar medium and incubated to check for multiple colony types RESULTS A INTERPRETATION OF RESULTS The results of the AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST are based on the following cut off values Samples producing signals greater than or equal to these cut off values are considered positive Signals less than these cut off values are considered negative Results in repeat ranges should be repeated AccuLDR LEADER formerly PAL Cut off value 1 500 PLU 50 000 RLU Repeat range 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU 5 u AA B QUALITY CONTROL AND ACCEPTABILITY OF RESULTS Negative control e g Streptococcus bovis ATCC 33317 and positive control e g Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 should satisfy the following values AccuLDR LEADER formerly PAL Negative control lt 600 PLU lt 20 000 RLU Positive control gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITATIONS This method has been tested using fresh growth from solid media and from broth cultures listed in the SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION Section The efficacy of this test has not been demonstrated on direct clinical specimens Results from the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST should be interpreted in conjunction with other laboratory and clinical data available to the clinician EXPECTED VALUES The AccuPR
50. gir inocular otra placa de cultivo en este momento con el fin de confirmar la pureza de la colonia B Identificaci n en caldo de cultivo Pueden ser analizados caldos de cultivo apropiados tales como tripcase soja o infusi n de caldo cerebro coraz n con turbidez equivalente o igual a 1 McFarland Pueden utilizarse cultivos en caldo incubados hasta 24 horas a 37 C Pipetear una muestra de 50 ul de una suspensi n de caldo bien homogeneizada dentro de los tubos de Reactivo Sonda como se describe a continuaci n MATERIALES SUMINISTRADOS TEST AccuProBe DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO bioM rieux ref 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 20 Tests Reactivo Sonda P 10 x 2 tubos MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Asas de inoculaci n de pl stico est ril de 1 ul asas met licas agujas de pl stico o bastoncillo para seleccionar las colonias Cepas de cultivo de control Ba o mar a o bloque calefactor 60 1 C Micropipetas 50 ul 300 ul Pipeta de repetici n 50 ul 300 ul Vortex Los emplazamientos del bloque calefactor deben tener pocillos del tama o adecuado para los tubos de 12 x 75 mm Se recomienda utilizar bloques calefactores GEN PROBE DISPONIBLE EN SU DISTRIBUIDOR GEN PROBE Lumin metro GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux ref 39400 Gen Probe Cat No 103100i 3100i Bloque calefactor 60 1 C bioM rieux ref 39406 Gen Probe Cat No 3397 27
51. h or heating block Remove and retain the caps Pipette 300 uL of Reagent 3 Selection Reagent into each tube Recap the tubes and VORTEX them to mix completely Incubate the Probe Reagent Tubes for 5 minutes at 60 1 C in a water bath or dry heat bath Remove the Probe Reagent Tubes from the water bath or heating block and leave them at room temperature for at least 5 minutes Remove and discard the caps Read the results in the luminometer within 1 hour after removing from the water bath or dry heat bath DETECTION 1 Select the appropriate protocol from the menu of the luminometer software 2 Using a damp tissue or paper towel wipe each tube to ensure that no residue is present on the outside of the tube and insert the tube into the luminometer according to the instrument directions 3 When the analysis is complete remove the tube s from the luminometer D AA PROCEDURAL NOTES A B REAGENTS Reagent 2 Hybridization Buffer may precipitate at 2 to 8 C Warming and mixing the solution at 35 to 60 C will dissolve the precipitate SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION It is important to sample growth from an area of the solid media where there are isolated colonies TEMPERATURE The Sample Preparation Hybridization and Selection reactions are temperature dependent Therefore it is imperative that the incubator water bath or dry heat bath is maintained within the specified temperature range TIME 1 The Hy
52. he consente identificazione rapida mediante sonda a DNA dello S pneumoniae Pneumococcus isolato a partire da una coltura Questo test impiega la tecnica di ibridazione degli acidi nucleici INTRODUZIONE Lo Streptococcus pneumoniae S pneumoniae il principale responsabile negli Stati Uniti delle pneumopatie batteriche di comunit Ogni anno vengono registrati all incirca 500 000 casi nel 5 dei quali possono insorgere complicanze anche mortali 2 4 Lo S pneumoniae amp all origine inoltre della maggior parte delle otiti e delle batteriemie nei neonati e nei bambini 2 spesso responsabile di meningiti ed stato isolato in soggetti colpiti da congiuntiviti sinusiti mastoiditi pericarditi batteriemie latenti artriti ed endocarditi 2 Si trova al terzo posto fra i germi isolati tramite emocoltura 6 Sebbene lo S pneumoniae possa essere ritenuto un ospite commensale delle vie respiratorie superiori nel soggetto sano i neonati le persone anziane e i pazienti indeboliti da altre affezioni respiratorie o immunodepressi costituiscono un terreno estremamente favorevole per lo sviluppo di un infezione pneumococcica 2 3 4 Le metodiche tradizionali fisiologiche e biochimiche consentono di effettuare identificazioni per via presuntiva Fra queste metodiche annoveriamo lo studio morfologico della colonia l esame dopo colorazione di Gram la ricerca di catalasi l analisi dell attivit a emolitica su agar sangue d
53. hen gem den Anweisungen im Handbuch in das luminometer 3 Nehmen Sie die R hrchen nach der Messung aus dem luminometer HINWEISE ZUR TESTDURCHF HRUNG A B REAGENZIEN Das Reagenz 2 Hybridisierungspuffer kann bei 2 8 C pr zipitieren Zur Aufl sung des Niederschlags das Reagenz auf 35 60 C erhitzen und mischen PROBENGEWINNUNG UND VORBEREITUNG Es ist wichtig daf die Kultur vom Festmedium an einer Stelle abgenommen wird an der die Kolonien einzeln liegen TEMPERATUR Probenvorbereitung Hybridisierung und Selektion sind temperaturabh ngig Es muB deshalb unbedingt darauf geachtet werden da der Brutschrank das Wasserbad oder der Heizblock im angegebenen Temperaturbereich gehalten werden ZEIT 1 Die Hybridisierungsreaktion sollte innerhalb 30 min nach Zugabe der Zellen und Reagenz 1 in die Sondenreagenzr hrchen gestartet werden 2 Die Hybridisierung und Selektion sind zeitabh ngige Reaktionen Die Hybridisierungsdauer sollte nicht unter 15 min liegen jedoch 20 min nicht berschreiten Die Sondenreagenzr hrchen w hrend des Selektionsschrittes mindestens 5 min jedoch nicht l nger als 6 min inkubieren WASSERBAD Achten Sie darauf da der Wasserstand ausreichend hoch bleibt so da sich die gesamte Reaktionsl sung der Sondenreagenzr hrchen im Wasser befindet aber kein Wasser in die R hrchen gelangen kann VORTEXEN W hrend des Arbeitsschrittes SELEKTION mu besonders darauf geachtet we
54. i Konzentrationen der rRNA von S pneumoniae 10 Mal in einer Testserie bestimmt Probe A B Anzahl Tests 10 10 Mittelwert RLU 101 292 56 025 Standardabweichung 4 293 1 743 Variationskoeffizient 4 2 3 1 B INTER ASSAY PR ZISION Zur Bestimmung der Inter Assay Pr zision wurden die beiden gleichen Konzentrationen der rRNA von S pneumoniae in Einzelbestimmungen in 12 aufeinanderfolgenden Testserien bestimmt Probe A B Anzahl Tests 12 12 Mittelwert RLU 101 322 53 288 Standardabweichung 3 660 1 776 Variationskoeffizient 3 6 3 3 C SPEZIFIT T Insgesamt wurden 95 ATCC Referenzst mme mit dem AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST getestet Bei diesen St mmen handelte es sich um insgesamt 78 Spezies aus 51 Gattungen 5 S pneumoniae St mme 24 St mme von 13 anderen Streptococcus Spezies und 66 St mme von 50 anderen Gattungen die einen phylogenetischen Querschnitt von Organismen darstellten wurden mit dem AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST evaluiert Alle S pneumoniae St mme reagierten mit dem AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST positiv Andere Streptococcus Spezies und die Spezies aus dem repr sentativen phylogenetischen Querschnitt reagierten mit diesem Test nicht 15 a D WIEDERFINDUNG Sieben S pneumoniae Verdiinnungsreihen von 3000 bis 30 Millionen Zellen pro Test wurden in Gegenwart von 30 Millionen Zellen getestet die zu Streptococcus saliva
55. i montone al 5 lo studio della sensibilit alloptochina e della solubilit nella bile 2 Lo studio dei polisaccaridi capsulari ha consentito di individuare oltre 80 sierotipi Il test del Quellung un altra possibile metodica di identificazione si basa sull osservazione del rigonfiamento capsulare prodotto come risposta al trattamento mediante antisiero Comunque tutti i test citati sono soggettivi e nessuno di essi permette un identificazione formale dello S pneumoniae Il TEST AccuProge DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA un test rapido ed obiettivo e permette l identificazione delloS pneumoniae grazie alla rilevazione di specifiche sequenze di RNA ribosomiale PRINCIPIO OPERATIVO test di ibridazione degli acidi nucleici sfruttano la capacit dei filamenti complementari di acidi nucleici di accoppiarsi in maniera specifica per formare composti stabili a doppia catena 5 Il test AccuPROBE impiega una sonda a DNA a catena singola associata ad un marker chemioluminiscente complementare all RNA ribosomiale rRNA dell organismo bersaglio Una volta liberato I rRNA dell organismo bersaglio la sonda si combina con le sue sequenze omologhe formando un complesso DNA RNA stabile Il Reagente di 33 oO A Selezione consente di differenziare le sonde ibridate da quelle non ibridate Il luminometro GEN PROBE permette di misurare il segnale luminoso emesso dagli ibridi DNA RN
56. iologische Spezies aus 25 Gattungen Die klassischen Identifizierungsmethoden umfa ten die Gramf rbung Koloniemorphologie Katalasereaktion H molyse auf 5 igem Hammelblutagar Optochinempfindlichkeit und Gallel slichkeit Die St mme wurden entweder als positiv gt 50 000 RLU oder negativ lt 50 000 RLU bewertet F r die negativen Kulturen wurde ein Bereich von 344 bis 32 911 RLU und f r die positiven Kulturen ein Bereich von 59 223 bis 863 193 RLU ermittelt Ein Vergleich des AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTESTS mit den klassischen Identifizierungsmethoden ist im folgenden angegeben 14 i AccuProse KULTUR AccuPROBE Pos Pos Neg Neg Sensitivitat Proz Kultur Pos Neg Pos Neg Spezifitat Korr Labor 1 202 0 0 212 100 100 100 Labor 2 103 0 0 145 100 100 100 Gesamt 305 0 0 357 100 100 100 Bei der Testung mit dem AccuProse STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST reagierten alle S pneumoniae Isolate positiv und alle anderen klinischen Isolate die einen phylogenetischen Querschnitt der Organismen darstellten negativ Die prozentuale Sensitivit t die prozentuale Spezifit t und die prozentuale Korrelation des AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTESTS im Vergleich zu klassischen Identifizierungsmethoden betr gt 100 PERFORMANCE A INTRA ASSAY PR ZISION Zur Bestimmung der Intra Assay Pr zision des ACCUPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTESTS wurden zwe
57. itis Mastoiditis Pericarditis okkulter Bakteri mie Arthritis und Endokarditis gefunden 2 Es ist der dritth ufigste Erreger der aus Blutkulturen isoliert wird 6 Obwohl S pneumoniae als Teil der Normalflora des oberen Respirationstraktes angesehen werden kann sind S uglinge sowie ltere und geschw chte Patienten mit anderen Erkrankungen des Respirationstrakts oder geschw chtem Immunsystem besonders anf llig f r Pneumokokkenerkrankungen 2 3 4 Eine vorl ufige Identifizierung erfolgt durch klassische physiologische und biochemische Methoden Dazu geh ren Koloniemorphologie Gramf rbung Katalasereaktion a H molyse auf 5 igem Hammelblutagar Empfindlichkeit f r Optochin und Gallel slichkeit 2 Mehr als 80 Serotypen wurden auf der Basis der Kapselpolysaccharide identifiziert Eine weitere Methode der Identifizierung ist die Quellungsreaktion bei der eine Kapselschwellung als Reaktion auf eine Behandlung mit Antiseren sichtbar wird Bei allen genannten Tests handelt es sich um subjektive Methoden von denen keine eine eindeutige Identifizierung von S pneumoniae erm glicht Der AccuProge STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST ist eine schnelle objektive Methode zur sicheren Identifizierung von S pneumoniae Die Identifizierung beruht auf dem Nachweis von rRNA Sequenzen die f r S pneumoniae spezifisch sind PRINZIP Nukleins ure Hybridisierungstests basieren auf der F higkeit komplement rer Nukleins
58. menos durante 5 minutos Retirar y descartar los tapones Leer los resultados en el lumin metro en la hora siguiente a la extracci n de los tubos del ba o mar a o del bloque calefactor F DETECCION 1 Seleccionar el protocolo adecuado en el men del software del lumin metro 2 Utilizando un trapo h medo o una toalla de papel limpiar cada tubo para asegurar que no se encuentran residuos en la parte externa del tubo e insertar el tubo en el lumin metro siguiendo las indicaciones adjuntas al instrumento 3 Una vez completado el an lisis retirar el o los tubos del lumin metro OBSERVACIONES A REACTIVOS El Reactivo 2 Tamp n de Hibridaci n puede precipitar entre 2 y 8 C Calentar y agitar la soluci n entre 35 y 60 C para disolver el precipitado B TOMA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS Es importante que la muestra proceda de un cultivo en medio s lido donde se presenten colonias aisladas C TEMPERATURA Las reacciones de preparaci n de la muestra hibridaci n y selecci n son termodependientes Es imperativo por lo tanto que el incubador ba o mar a o bloque calefactor se mantengan dentro de los l mites de temperatura especificados D TIEMPO 1 La reacci n de hibridaci n debe iniciarse en los 30 minutos siguientes a la incorporaci n de la muestra y del Reactivo 1 a los tubos de Reactivo Sonda 2 Las reacciones de hibridaci n y selecci n son cronodependientes Hibridar por lo menos 15 minutos pero no m s de
59. n entsprechen oder dar ber liegen werden als positiv bewertet Signale unterhalb dieser Grenzwerte werden als negativ bewertet Liegt das Ergebnis im Graubereich sollte der Test wiederholt werden AccuLDR LEADER vormals PAL Grenzwert 1 500 PLU 50 000 RLU Graubereich 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B QUALITATSKONTROLLE UND VALIDIERUNG DER ERGEBNISSE Die Negativkontrolle z B Streptococcus bovis ATCC 33317 und die Positivkontrolle z B Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 m ssen folgenden Sollwerten entsprechen AccuLDR LEADER vormals PAL Negativkontrolle lt 600 PLU lt 20 000 RLU Positivkontrolle gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITIERUNGEN Diese Methode wurde mit frischen Kulturen getestet die auf den im Abschnitt PROBENGEWINNUNG UND VORBEREITUNG angegebenen Festmedien und Fl ssigkulturen angez chtet wurden Die Performance dieses Tests bei direkter Testung von klinischen Proben wurde nicht evaluiert Die Ergebnisse des AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTESTS m ssen in Zusammenhang mit anderen Testergebnissen und klinischen Daten interpretiert werden NORMALWERTE Der AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTEST wurde in 2 Laboratorien mit klassischen Kulturverfahren mit biochemischer Identifizierung verglichen Insgesamt wurden 662 klinische Isolate getestet Dabei handelte es sich um 305 S pneumoniae Isolate 185 Isolate von anderen Streptococcus Spezies und 172 andere mikrob
60. n trypcase soja ou le bouillon coeur cervelle dont la turbidit doit tre sup rieure ou gale 1 McFarland Pr lever la pipette un chantillon de 50 ul de la suspension du bouillon parfaitement homog n is et le verser dans le tube de R actif Sonde en suivant les instructions du paragraphe PREPARATION DE L ECHANTILLON MAT RIEL FOURNI TEST AccuProBE D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE bioM rieux r f 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 20 Tests R actif Sonde P 10 x 2 tubes MAT RIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI ses de 1 ul en plastique st rile ses m talliques aiguilles en plastique ou b tonnets applicateurs pour pr lever les colonies Souches de contr le des cultures Bain marie ou bloc chauffant 60 1 C Micropipettes 50 ul 300 ul Pipettes r p titives 50 ul 300 ul Vortex Les emplacements l int rieur du bloc chauffant doivent tre adapt s des tubes de 12 x 75 mm Lutilisat ion des blocs chauffants GEN PROBE est recommand e MATERIEL SUPPLEMENTAIRE DISPONIBLE CHEZ VOTRE DISTRIBUTEUR GEN PROBE Luminom tre GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux r f 39400 Gen Probe Cat No 103100i 3100i Bloc chauffant 60 1 C bioM rieux r f 39406 Gen Probe Cat No 3397 19 o COFFRET DE R ACTIFS POUR IDENTIFICATION DE CULTURES ACCUPROBE bioM rieux r f 39305 Gen Probe Cat No 102800 2800 COFFRET DE REACTIFS DE D
61. na parte del terreno solido occupata da colonie isolate C TEMPERATURA la preparazione del campione cos come l ibridazione e la selezione sono reazioni temperatura dipendenti Di conseguenza indispensabile mantenere il bagnomaria o l incubatore alla temperatura raccomandata D DURATA DELLE OPERAZIONI 1 La reazione di ibridazione deve essere iniziata nei 30 minuti successivi all introduzione del campione e del Reagente 1 nelle provette del Reagente Sonda 2 Le reazioni di ibridazione e di selezione dipendono dal tempo L Ibridazione deve durare come minimo 15 minuti ma non oltre 20 minuti Durante la SELEZIONE mettere le provette di Reagente Sonda in incubazione almeno per 5 minuti senza superare per il limite dei 6 minuti E BAGNOMARIA il livello d acqua deve essere sufficientemente alto per far s che la totalit del liquido di reazione delle provette di Reagente Sonda sia completamente sommersa evitando comunque la penetrazione dell acqua nelle provette F USO DEL VORTEX fondamentale disporre di una miscela omogenea durante la fase di SELEZIONE in particolare dopo l aggiunta del Reagente 3 G SOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI 1 Alti valori di controllo negativo Streptococcus bovis ATCC 33317 superiori a 20 000 RLU Relative Light Units su luminometro LEADER o a 600 PLU Photometric Light Units sul luminometro AccuLDR precedentemente PAL possono essere riscontrati quando l omogeneizzazione stat
62. nalizar las muestras aisladas y o los controles Retirar y conservar los tapones Pipetear 50 ul de Reactivo 1 Reactivo de Lisis en todos los tubos de Reactivo Sonda Si se estudian cultivos en caldo no a adir Reactivo 1 a los tubos de Reactivo Sonda Transferir una colonia de 1 mm o varias colonias peque as de un medio s lido o 50 ul de un cultivo en caldo bien homogeneizado en los tubos de Reactivo Sonda como se describe en la secci n TOMA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS Agitar el asa aguja o bastoncillo en el Reactivo 1 Reactivo de Lisis para suspender las c lulas si se analizan colonias de un medio s lido y mezclar cuidadosamente D HIBRIDACION 1 2 Pipetear 50 ul de Reactivo 2 Tamp n de Hibridaci n en todos los tubos de Reactivo Sonda Volver a tapar los tubos de Reactivo Sonda y agitar sacudi ndolos o mezcl ndolos en un VORTEX Incubar durante 15 minutos a 60 1 C en un ba o mar a o bloque calefactor E SELECCION 1 Retirar los tubos de Reactivo Sonda del ba o maria o bloque calefactor Retirar y conservar los tapones Pipetear 300 ul del Reactivo 3 Reactivo de Selecci n en cada tubo Volver a tapar los tubos y mezclarlos en VORTEX para homogeneizarlos Incubar los tubos de Reactivo Sonda durante 5 minutos a 60 1 C en ba o mar a o bloque calefactor 28 AS D AA 3 Retirar los tubos de Reactivo Sonda del ba o mar a o bloque calefactor y dejarlos a temperatura ambiente por lo
63. nsare allo S pneumoniae Il campione pu esser testato sin da quando sono visibili le colonie e nelle 48 ore successive 1 Il campione pu essere prelevato mediante un ansa di plastica monouso da 1 ul un ansa metallica o un ago in plastica monouso Data la bassa quantit di liquido in cui i batteri verranno rimessi in sospensione si consiglia di non usare tamponi 2 possibile testare pi colonie piccole 3 o 4 oppure una sola colonia il cui diametro sia almeno di 1 mm NON PRELEVARE COLONIE CONFLUENTI Non effettuare prelievi dal mezzo di coltura con i batteri A questo punto la persona addetta pu decidere di inoculare un altra piastra di Petri per confermare la purezza del campione isolato B Identificazione su brodo di coltura Il test pu essere condotto su adeguati brodi di coltura come il brodo tripticase soia o il brodo cuore cervello la cui torbidit deve essere superiore o uguale a 1 McFarland Prelevare con la pipetta un campione da 50 ul della sospensione del brodo perfettamente omogeneizzato e dispensarlo nella provetta di Reagente Sonda attenendosi alle istruzioni del paragrafo PREPARAZIONE DEL CAMPIONE MATERIALE COMPRESO NEL KIT TEST AccuProse DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA bioM rieux cod 39204 Gen Probe Cat N 102865 2865 20 Test Reagente Sonda P 10 x 2 provette MATERIALE RICHIESTO NON COMPRESO NEL KIT Anse da 1 ul in plastica sterile anse metallich
64. ntemente imperativo manter o banho maria ou o bloco de aquecimento temperatura preconizada D DURA O DAS OPERA ES 1 A reac o de hibridiza o deve ser iniciada nos 30 minutos a seguir introdu o da amostra e do Reagente 1 nos tubos de Reagente Sonda 2 As reac es de hibridiza o e de selec o dependem do tempo A hibridiza o deve durar pelo menos 15 minutos mas n o mais de 20 minutos Durante a etapa de SELEC O incubar os tubos de Reagente Sonda durante pelo menos 5 minutos mas n o mais de 6 minutos E BANHO MARIA a gua deve estar ao n vel do anel de fecho dos tubos de Lise n o acima Certificar se de que a totalidade de l quido reaccional dos tubos de Reagente Sonda est bem imersa F UTILIZAGAO DO VORTEX essencial dispor de uma mistura homog nea durante a etapa de SELEC O especialmente ap s a adi o do Reagente 3 G RESOLU O DE INCIDENTES 1 Podem observar se valores de controlo negativo elevados Streptococcus bovis ATCC 33317 superiores a 20 000 RLU Relative Light Units no LEADER ou a 600 PLU Photometric Light Units no AccuLDR anteriormente PAL se a homogeneiza o tiver sido insuficiente depois da adi o do Reagente 3 Reagente de Selec o ou se estiverem presentes varios tipos de col nias Para verificar se se trata de uma cultura mista repicar uma parte num meio gelosado apropriado e incubar 2 Podem observar se valores de controlo positivo fracos
65. o sinal luminoso emitido pelos h bridos ADN ARN O resultado positivo se o lumin metro indicar um valor superior ou igual ao valor limiar negativo se indicar um valor inferior REAGENTES Os reagentes utilizados para o ACCUPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA s o fornecidos em tr s embalagens distintas AccuProBe SONDA PARA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Reagente Sonda P 10 x 2 tubos Streptococcus pneumoniae AccuProse REAGENTES PARA IDENTIFICA O DE CULTURA Reagente 1 Reagente de Lise 1 1x10ml Solu o tamp o contendo 0 04 de azida s dica Reagente 2 Reagente de Hibridiza o 2 1x10ml Solug o tamp o Reagente 3 Reagente de Selecc o 3 1 x 60 ml Solu o tamp o REAGENTES DE DETEC O GEN PROBE Reagente de Detec o RI 1x 240 ml 1 per xido de hidrog neo em 0 001 N cido n trico Reagente de Detec o II RII 1x 240 ml 1 N hidr xido de s dio PRECAU ES DE UTILIZA O A Unicamente para diagn stico in vitro Usar as precau es habituais quando efectuar este teste 1 Utilizar unicamente para a identifica o de S pneumoniae isoladas de uma cultura Utilizar unicamente o material fornecido ou material de utiliza o nica moom Os reagentes desta embalagem cont amp m azida s dica susceptivel de reagir com as canalizag es de chumbo ou de cobre formando azidas met licas explosivas Quando eliminar estes reagentes amp aconselh v
66. oBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST was compared to standard culture biochemical identification methods at two sites using a total of 662 clinical isolates Of these 305 were S pneumoniae isolates 185 were isolates of other Streptococcus species 172 were other microbial isolates representing 25 genera Standard identification methods included Gram stain colony morphology catalase reaction hemolytic activity on 5 sheep blood agar optochin susceptibility and bile solubility The isolates were categorized as either positive gt 50 000 RLU or negative lt 50 000 RLU The range of observations for negative culture isolates was 344 to 32 911 RLU and 59 223 to 863 193 RLU for positive cultures A comparison of the AccuProBe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST and standard culture identification methods is shown below AccuProse CULTURE IDENTIFICATION AccuPRoBE Pos Pos Neg Neg Sensitivity Percent Culture Pos Neg Pos Neg Specificity Agreement Site 1 202 0 0 212 100 100 100 Site 2 103 0 0 145 100 100 100 Total 305 0 0 357 100 100 100 All S pneumoniae isolates produced a positive result and all other clinical isolates representing a phylogenetic cross section of organisms produced a negative result with the ACCUPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST The percent sensitivity percent specificity and percent agreement for the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENT
67. oxide in 0 001 N nitric acid Detection Reagent II RII 1 x 240 mL 1 N sodium hydroxide WARNINGS AND PRECAUTIONS A For in vitro diagnostic use B Use universal precautions when performing this assay 1 C Use only for the identification of Streptococcus pneumoniae isolated from culture D Use only supplied or specified disposable laboratory ware E Reagents in this kit contain sodium azide which may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides Upon disposal of these reagents always dilute the material with a large volume of water to prevent azide buildup in the plumbing F Avoid contact of Detection Reagents and Il with skin eyes and mucous membranes Wash with water if these reagents come into contact with skin If spills of these reagents occur dilute with water before wiping dry STORAGE AND HANDLING REQUIREMENTS Probe Reagent Tubes must be stored in the foil pouches at 2 to 8 C The Probe Reagent Tubes are stable in the unopened pouches until the expiration date indicated Once opened the pouch should be resealed and the tubes should be used within two months and prior to the expiration date Other reagents used in the AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST may be stored between 2 and 25 C and are stable until the expiration date indicated DO NOT FREEZE THE REAGENTS SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION The AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTU
68. rante 15 minutos a 60 1 C no banho maria ou no bloco de aquecimento E SELEC O 1 Retirar os tubos de Reagente Sonda do banho maria ou do bloco de aquecimento Tirar e conservar as tampas Distribuir 300 ul de Reagente 3 Reagente de Selec o em cada tubo Voltar a tapar os tubos e agit los num Vortex para obter uma mistura homog nea 2 Incubar os tubos de Reagente Sonda durante 5 minutos a 60 1 C em banho maria ou num bloco de aquecimento 44 D AA 3 Retirar os tubos de Reagente Sonda do banho maria ou do bloco de aquecimento e deix los temperatura ambiente durante pelo menos 5 minutos Retirar e eliminar as tampas Ler os resultados no lumin metro durante a hora seguinte F DETEC O 1 Seleccionar o protocolo apropriado no lumin metro 2 Para retirar res duos da superf cie dos tubos limp los com papel absorvente h mido Em seguida coloc los no lumin metro e seguir as instru es 3 Quando a an lise tiver terminado retirar os tubos do lumin metro NOTAS A REAGENTES O Reagente 2 Tamp o de Hibridizac o pode precipitar a 2 8 C Aquec lo a 35 60 C e agit lo para dissolver o precipitado B COLHEITA COLETA E PREPARA O DE AMOSTRAS importante colher coletar as amostras provenientes de cultura em meio s lido numa zona onde haja col nias isoladas C TEMPERATURA A prepara o da amostra a hibridiza o e a selec o s o reac es termodependentes Conseque
69. rden da die Probenmischung absolut homogen ist insbesondere nach Zugabe von Reagenz 3 FEHLERM GLICHKEITEN 1 Bei Messungen mit dem LEADER k nnen erh hte negative Kontrollwerte Streptococcus bovis ATCC 33317 ber 20 000 RLU Relative Light Units durch nicht ausreichendes Mischen nach Zugabe von Reagenz 3 Selektionsreagenz gemessen werden Entsprechendes gilt bei Messungen mit dem AccuLDR vormals PAL wenn dort erh hte negative Kontrollwerte ber 600 PLU Photometric Light Units gemessen werden Ein hnlicher Effekt kann beim Testen von Mischkulturen auftreten Um festzustellen ob eine Mischkultur vorliegt k nnen Sie einen Teil der Kultur auf ein geeignetes Agarmedium berimpfen und inkubieren 2 Schwach positive Kontrollwerte Streptococcus bovis ATCC 33317 unter 50 000 RLU auf dem LEADER oder 1 500 PLU auf dem AccuLDR vormals PAL erh lt man bei zu geringen 13 A Keimzahlen oder durch Testen von Mischkulturen oder zu alter Kulturen oder wenn die Zellen in Reagenz 1 l nger als 30 min stehen bleiben bevor Reagenz 2 zugegeben wird Um festzustellen ob eine Mischkultur vorliegt k nnen Sie einen Teil der Kultur auf ein geeignetes Agarmedium berimpfen und inkubieren ERGEBNISSE A INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Ergebnisse des AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTESTS werden auf der Basis folgender Grenzwerte cut off interpretiert Proben deren Lichtsignale diesen Grenzwerte
70. rique 0 001 N R actif de Detection Il RII 1x 240 ml Hydroxide de sodium 1 N PRECAUTIONS D UTILISATION A Pour diagnostic in vitro uniquement Observer les pr cautions habituelles lors de la r alisation de ce test 1 A utiliser uniquement pour l identification de S pneumoniae isol partir d une culture Utiliser uniquement le mat riel fourni ou du mat riel usage unique moom Les r actifs de ce coffret contiennent de l azide de sodium susceptible de former par r action avec le plomb ou le cuivre des canalisations des azides m talliques explosifs Lors de l evacuation de ces r actifs prendre soin de toujours rincer abondamment l eau pour pr venir la formation d azide dans la plomberie F Eviter le contact des R actifs de D tection et Il avec la peau les yeux et les muqueuses En cas de contact rincer l eau Si ces r actifs sont renvers s les diluer l eau avant d essuyer CONSERVATION Les tubes de R actif Sonde doivent tre conserves dans les sachets en aluminium 2 8 C Ils sont stables avant ouverture jusqu la date de p remption Apr s ouverture le sachet doit tre referm herm tiquement et les tubes doivent tre utilis s dans un d lai de deux mois dans la limite de la date de p remption Les autres r actifs du TEST AccuPRose D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE peuvent tre conserv s entre 2 et 25 C et restent sta
71. rius und Streptococcus bovis geh rten keine Zielspezies Die Anwesenheit dieser Spezies interferierte nicht mit dem positiven Lichtsignal von S pneumoniae Zellverd nnungen und ergaben keine positive Reaktion mit dem AccuPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST 16 GEN PROBE AccuProbe TEST D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE bioM rieux r f 39204 Gen Probe Cat No 102865 2865 UTILISATION Le TEST AccuPROBE D IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLE D UNE CULTURE est un test d identification rapide par sonde ADN de S pneumoniae Pneumococcus isol partir d une culture Ce test utilise la technique d hybridation des acides nucl iques INTRODUCTION Aux Etats Unis Streptococcus pneumoniae S pneumoniae est le principal responsable des pneumopathies bact riennes communautaires avec approximativement un demi million de cas par an des complications et la mort survenant pour environ 5 d entre eux 2 4 Il est galement la cause de la plupart des otites et des bact ri mies chez le nourrisson et l enfant 2 S pneumoniae est fr quemment responsable de m ningites et a t isol chez des patients atteints de conjonctivite de sinusite de mastoidite de p ricardite de bact ri mie latente d arthrite et d endocardite 2 Il est au troisieme rang des germes isol s par h moculture 6 Bien que S pneumoniae puisse tre consid r comme un h te commens
72. s de 20 minutes Pendant l tape de SELECTION faire incuber les tubes de R actif Sonde pendant au moins 5 minutes mais pas plus de 6 minutes E BAIN MARIE Le niveau d eau dans le bain marie doit tre suffisamment lev pour que la totalit du liquide r actionnel des tubes de R actif Sonde soit immerg e mais sans que l eau ne puisse entrer dans les tubes F UTILISATION DU VORTEX Il est essentiel de disposer d un m lange homog ne durant l tape SELECTION plus particuli rement apr s addition du R actif 3 G RESOLUTION D INCIDENTS 1 Des valeurs de contr le n gatif lev es Streptococcus bovis ATCC 33317 sup rieures a 20 000 RLU Relative Light Units sur le LEADER ou a 600 PLU Photometric Light Units sur PAccuLDR anciennement PAL peuvent tre dues soit une homog n isation insuffisante apr s addition du R actif 3 R actif de S lection soit a la pr sence simultan e de plusieurs types de colonies Pour v rifier s il s agit d une culture mixte on peut en repiquer une partie sur un milieu g los appropri et la mettre a incuber 2 Des valeurs de contr le positif faibles Streptococcus pneumoniae ATTCC 33400 inf rieures 50 000 RLU sur le LEADER ou 1 500 PLU sur l AccuLDR anciennement PAL peuvent tre observ es lorsque le nombre de germes est insuffisant lorsque le test est effectu sur des cultures mixtes ou g es ou encore lorsque les bact ries ont t laiss es dans le R
73. s frescas efectuadas em meios s lidos e com os caldos de cultura citados no par grato COLHEITA COLETA E PREPARA O DA AMOSTRA O comportamento funcional deste teste praticado directamente com amostras cl nicas n o foi avaliado Os resultados do AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA devem ser interpretados conjuntamente com outros dados do laborat rio e correlacionados com os dados cl nicos VALORES ESPERADOS O AccuProBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA O DE CULTURA foi comparado com m todos bioqu micos cl ssicos de identifica o de cultura em dois locais utilizando um total de 662 estirpes cepas Foram testadas 305 estirpes cepas de S pneumoniae 185 estirpes cepas de outras esp cies de estreptococos e 172 estirpes cepas provenientes de 25 g neros diferentes Foi efectuada uma identifica o pelos m todos tradicionais estudo da morfologia das col nias colora o de Gram teste da catalase an lise da actividade hemol tica em meio gelosado com 5 de sangue de carneiro teste de sensibilidade optoquina e solubilidade na b lis As estirpes cepas foram consideradas como positivas gt a 50 0000 RLU ou negativas lt a 50 000 RLU As culturas negativas deram resultados compreendidos entre 344 e 32 911 RLU e as culturas positivas deram resultados entre 59 223 e 863 193 RLU A compara o destes resultados com os m todos cl ssicos de identifica o figura abaixo 46
74. tative phylogenetic cross section of species did not react using this kit D RECOVERY Seven serial dilutions of S pneumoniae cells ranging from 3 thousand to 30 million cells per assay were tested in the presence of 30 million cells of the following non target species Streptococcus salivarius and Streptococcus bovis The presence of these non target species did not interfere with the positive signal of the S pneumoniae cell dilutions nor did they generate a positive reaction with the AccuPROBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CULTURE IDENTIFICATION TEST GEN PROBE AccuProbe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBEST TIGUNGSTEST bioM rieux Best Nr 39204 Gen Probe Kat Nr 102865 2865 VERWENDUNGSZWECK Der AccuPRoBE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KULTURBESTATIGUNGSTEST ist ein DNA Sonden Schnelltest der nach dem Prinzip der Nukleins urehybridisierung arbeitet und die Identifizierung von Streptococcus pneumoniae Pneumococcus aus Kulturisolaten erm glicht ZUSAMMENFASSUNG UND TESTERKL RUNG Streptococcus pneumoniae S pneumoniae ist die Hauptursache f r die bakterielle ambulant erworbene Pneumonie in den Vereinigten Staaten mit j hrlich etwa einer halben Million F lle und einer Komplikations und Todesrate von ca 5 2 4 Dieser Keim ist auch die Hauptursache f r Otitis media und Bakteri mie bei S uglingen und Kindern 2 S pneumoniae ist eine h ufige Ursache f r Meningitis und wurde bei Patienten mit Konjunktivitis Sinus
75. uLDR LEADER precedentemente PAL Valore soglia 1 500 PLU 50 000 RLU Area di incertezza 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B CONTROLLO DI QUALIT ED ACCETTABILITA DEI RISULTATI controlli negativi ad es Streptococcus bovis ATCC 33317 e positivi Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 devono soddisfare i seguenti valori AccuLDR LEADER precedentemente PAL Controllo negativo lt 600 PLU lt 20 000 RLU Controllo positivo gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU LIMITI DEL TEST Questo metodo stato tentato su colture fresche realizzate in terreni di coltura solidi e sui tipi di brodo di coltura menzionati nel paragrafo PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Le performance di questo test eseguito direttamente su campioni clinici non sono state valutate I risultati del TEST AccuPRoBE DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA devono essere interpretati in base ad altri dati di laboratorio e correlati ai dati clinici VALORI ATTESI Il TEST AccuProge DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA stato confrontato con le metodiche tradizionali di coltura di identificazione biochimica Queste metodiche sono state applicate su due diversi centri per un totale di 662 ceppi Sono stati testati 305 ceppi di S pneumoniae 185 ceppi di altre specie di streptococchi e 172 ceppi provenienti da 25 generi diversi stata eseguita un identificazione tramite le metodiche tradizionali studio
76. uProse DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO ofrece un m todo r pido y no subjetivo para la identificaci n definitiva de S pneumoniae basado en la detecci n de secuencias de ARN ribos mico espec ficas que son exclusivas de S pneumoniae PRINCIPIO DE LA TECNICA Los tests de hibridaci n de cido nucleico se basan en la capacidad de cadenas complementarias de cido nucleico para combinarse espec ficamente formando complejos bicatenarios estables 5 El SISTEMA ACCUPROBE utiliza una sonda de ADN monocatenaria marcada con quimioluminiscencia complementaria del ARN ribos mico del organismo diana Despu s que el ARN ribos mico ha sido liberado del organismo la sonda de ADN marcado se combina con el ARN ribos mico del organismo diana para formar un h brido ADN ARN estable El Reactivo de Selecci n permite diferenciar las sondas hibridadas de las no hibridadas 25 i A Los h bridos ADN ARN marcados son medidos en el lumin metro GEN PROBE Un resultado positivo es una lectura en el lumin metro igual o superior al umbral Un valor por debajo del umbral es un resultado negativo REACTIVOS Los reactivos para el TEST AccuPRoBE DE IDENTIFICACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AISLADO EN CULTIVO son suministrados en tres kits de reactivos diferentes KIT AccuProBE CON SONDA PARA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Reactivo Sonda P 10 x 2 tubos Streptococcus pneumoniae KIT AccuProBe DE REACTIVO DE IDENTIF
77. uesti reagenti ricordarsi di utilizzare sempre acqua in abbondanza per evitare la formazione di tali composti nelle tubature F Evitare qualsiasi contatto della cute e delle mucose con i Reagenti di Rivelazione e Il In caso di contatto sciacquare accuratamente con acqua le parti interessate Se si verificassero versamenti di reagenti diluirli con acqua prima di asciugare la superficie CONSERVAZIONE Le provette di Reagente Sonda devono essere conservate in confezioni di alluminio a temperature comprese fra 2 e 8 C Prima dell apertura rimangono stabili fino alla data di scadenza Dopo l apertura la confezione deve essere richiusa ermeticamente e le provette devono essere usate nell arco di due mesi entro e non oltre la data di scadenza 34 i Gli altri reagenti del TEST AccuPRose DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA possono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2 e 25 C e rimangono stabili fino alla data di scadenza NON CONGELARE REAGENTI PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il TEST ACCUPROEE per IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA stato progettato per identificare loS pneumoniae isolato a partire da una coltura A Identificazione a partire da coltura solida Il test pu essere condotto su un adeguato terreno solido come un terreno di coltura agar sangue di montone al 5 quando si osserva una morfologia che pu far pe
78. ulture Collection ATCC 33400 come controllo positivo ed una coltura di Streptococcus bovis ad es ATCC 33317 come controllo negativo C PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 1 Tagliare orizzontalmente la parte superiore delle confezioni di alluminio Prelevare il numero necessario di Provette di Reagente Sonda per testare i campioni e o le colture di controllo Richiudere ermeticamente la confezione ripiegando pi volte l estremit e fermandola con nastro adesivo o con una clip Non asportare la confezione di agenti essiccanti Predisporre un numero sufficiente di provette di Reagente Sonda per testare i campioni e o i ceppi di controllo Rimuovere e conservare i tappi Dispensare 50 ul di Reagente 1 Reagente di Lisi in ogni provetta di Reagente Sonda Se il test viene condotto su ceppi isolati a partire da brodi di coltura non aggiungere Reagente 1 nelle provette del Reagente Sonda Trasportare il campione proveniente dal terreno di coltura solido una colonia di almeno 1 mm di diametro o piu colonie piccole o 50 ul del brodo di coltura correttamente omogeneizzato nelle provette di Reagente Sonda attenendosi alle istruzioni fornite nel paragrafo PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Se il test viene eseguito su una coltura solido vortexare Pansa Pago o la bacchetta nel Reagente 1 Reagente di Lisi e mescolare con cura per rimettere i microrganismi in sospensione D IBRIDAZIONE 1 2 Dispensare 50 ul di Reagente 2 Tampone di I
79. viazione standard 4 293 1 743 Coefficiente di variazione 4 2 3 1 B PRECISIONE TRA TEST La precisione tra test stata calcolata analizzando con la modalit della determinazione unica le stesse tre concentrazioni di RNA ribosomiale di S pneumoniae in 12 serie differenti Campione A B Numero di test 12 12 Risposta media 101 322 53 288 Deviazione standard 3 660 1 776 Coefficiente di variazione 3 6 3 9 C SPECIFICIT stato studiato un totale di 95 ceppi ATCC tramite il TEST AccuProse DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA Questi ceppi rappresentavano un totale di 78 specie provenienti da 51 generi diversi stato testato un panello filogenetico di 5 ceppi di S pneumoniae 24 ceppi di altre 13 specie di streptococchi e 66 ceppi di altri 50 generi Unicamente i ceppi di S pneumoniae hanno mostrato risultati postivi con il TEST AccuPRoge DI IDENTIFICAZIONE DELLO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATO DA UNA COLTURA Gli altri microrganismi hanno evidenziato un risultato negativo 39 a D TEST DI SOVRACCARICO Sette serie di diluizioni di S pneumoniae da 3 000 a 30 milioni di microrganismi per diluizione sono state analizzate in presenza di 30 milioni di microrganismi di specie diverse vale a dire Streptococcus salivarius e Streptococcus bovis Non stata rilevata alcuna interferenza n reazione incrociata 40 GEN PROBE AccuProbe STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TESTE DE IDENTIFICA

streptococcus pneumoniae culture identification test

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