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Romain TALON

1. GdHPDO3A HvMalDH M thode trempage 100 mM de complexe 10 minutes Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re ID23 1 MAD non x A 1 711 Gdr Groupe d espace C2 Param tres de maille A a 144 370 b 82 028 c 112 325 B 101 626 Contenu unit asym trique t tram re R solution 48 40 1 95 2 05 1 95 Nombre de r flexions uniques 91862 12805 Rmerge 8 3 36 4 Rpim 6 4 27 8 Sigano XDS 1 20 0 70 Rano 7 3 21 7 at 5 1 2 1 Compl tude 98 0 94 1 Redondance 5 1 5 0 Tableau 7 3 Statistiques d int gration du jeu de donn es de diffraction d un cristal d riv de HvMalDH avec le complexe GGHPDO3A Les indicateurs statistiques calcul s partir des donn es de diffraction enregistr es partir de ces trois cristaux d riv s montrent la qualit g n rale de ces derni res La valeur lev e de l indicateur Rano pour les trois jeux de donn es indique une fixation du complexe dans les cristaux de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH 7 1 3 3 Phasage des donn es de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH avec le GdHPDO3A Un phasage exp rimental a t possible dans le cas de CaMalDH et PtMalDH Le phasage des donn es de CaMalDH a conduit une carte de densit lectronique exp rimentale Figure 7 7 faci lement interpr table par le programme de construction automatique 592 acides amin s sur 618 ont t automatiquement const
2. PtMalDH Cristal obtenu sans sulfate d ammonium Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A M thode Remplacement mol culaire Donn es jeu natif 0 979 Sex Groupe d espace P4 212 Param tres de maille a 81 167 c 395 991 Contenu unit asym trique t tram re complet R solution 46 47 1 81 1 91 1 81 Nombre de r flexions uniques 121716 17271 Rmerge 11 9 67 3 Rpim 3 6 21 1 sm 6 3 1 3 Compl tude 99 8 98 5 Redondance 11 5 10 8 Tableau 7 17 Statistiques d int gration du jeu de donn es de diffraction d un cristal natif obtenu en pr sence de PEG 237 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO 7 2 2 2 Calcul des phases pour les deux types de donn es enregistr es Le phasage s appuyant d une part sur le signal anomal apport par le jeu issu du cristal d riv avec le complexe GdHPDO3A et d autre part sur les diff rences isomorphes a conduit la construction d un premier mod le Tableau 7 18 Une fois ce mod le affin nous l avons utilis pour r aliser un phasage par remplacement mol culaire avec les donn es issues du cristal natif obtenu sans sulfate d ammonium le protocole de remplacement mol culaire qui s en suivit est indiqu dans l introduction Tableau 7 19 PtMalDH SIRAS Avec NH4 2SO4
3. 7 8 jours 2 Cryo protection 25 PEG 400 a Cristaux natifs b Conditions de cristallisation et de d AfUox 480x290 pm cryo protection Figure 4 14 Cristallisation et cryo protection de AfUox 4 2 5 2 Obtention des cristaux d riv s Les essais de co cristallisation avec le Ln HMTDPA 3 se sont tous r v l s infructueux car la pr sence du complexe conduit une absence de cristallisation Seule la m thode de trempage d une dur e inf rieure ou gale 20 minutes et avec une concentration en complexe inf rieure ou gale 10 mM a t possible En effet pour une dur e de trempage sup rieure 20 minutes et ou pour une concentration en complexe sup rieure 15 mM les cristaux se dissolvaient 4 2 5 3 Recherche de conditions de co cristallisation l aide du robot de cristallisation nanogoutte de l EMBL Devant l impossibilit d obtenir des cristaux d riv s par co cristallisation au laboratoire et profitant de l exp rience de co cristallisation automatis e d crite dans le chapitre pr c dent j ai recherch d autres conditions de co cristallisation potentielles pour l chantillon de AfUox 113 4 2 PREPARATION DE CRISTAUX DERIVES AVEC LE COMPLEXE LN HMTDPA 3 EN VUE D UNE EXPERIENCE DE DIFFRACTION DES RAYONS X Trois chantillons ont donc t men s au robot de cristallisation nanogoutte de EMBL 1 90 pL de solution comprenant
4. 111 15 TABLE DES MATI RES 4 2 4 La Prot ine Fluorescente Verte de Aequorea victoria AvEGFP pour Aequorea victoria Enhanced Green Fluorescent Protein 112 4 2 4 1 Cristallisation de la prot ine native 112 4 2 4 2 Obtention de cristaux d riv s 112 42 5 L urate oxydase de Aspergillus flavus AfUox 113 4 2 5 1 Cristallisation de la prot ine native 113 4 2 5 2 Obtention des cristaux d riv s 113 4 2 5 3 Recherche de conditions de co cristallisation l aide du robot de cristal lisation nanogoutte de l EMBL 113 4 2 6 La malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus CaMalDH 114 4 2 6 1 Cristallisation de la prot ine native 114 4 2 6 2 Obtention des cristaux d riv s 115 4 2 7 La malate d shydrog nase de Haloferax volcanii HvMalDH 115 4 2 7 1 Cristallisation de la prot ine native 115 4 2 7 2 Obtention des cristaux d riv s 115 42 8 L aminopeptidase TET1 12s de Pyrococcus horikoshii PhTET1 12s 116 4 2 8 1 Cristallisation de la prot ine native 116 4 2 8 2 Obtention des cristaux d riv s 116 4 2 9 Constats exp rimentaux concernant la pr paration
5. 238 7 2 2 4 Les deux conformations de la boucle catalytique de PtMalDH 240 7 2 3 CaMalDH la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus et la structure de l eau dans son enveloppe de solvatation 241 7 2 3 1 Int gration des donn es utilis es pour le phasage par la m thode SIRAS 241 7 2 3 2 Phasage par la m thode SIRAS 242 7 2 3 3 Affinement de la structure de CaMalDH 242 7 2 3 4 Structuration de l eau la surface de CaMalDH et adaptation halophile 243 7 3 Conclusions et perspectives 256 18 TABLE DES MATI RES 8 AcrB la prot ine mod le membranaire putative 271 8 1 Les deux protagonistes de la courte histoire membranaire 271 8 1 1 La prot ine membranaire EcAcrB 271 8 1 2 Le complexe de lanthanide DTTA BPA 272 8 2 Production purification et cristallisation de EcAcrB 274 8 2 1 Production amp purification de EcAcrB 274 8 2 2 Cristallisation de la prot ine EcAcrB et cryo protection des cristaux 274 8 2 2 1 Cristallisation de la prot ine EcAcrB 274 8 2 2 2 Cryo protection des cristaux avant l tape de diffraction des rayons X 274 8 3 Bref r sum des diverses tentatives d am lioration 275 8 3 1 R sum des modificati
6. Complexe mM 2 7 2 7 Prot ine mM 0 37 0 25 Rapport Qt de complexe 7 3 10 8 Qt de prot ine to M thode d obtention co cristallisation co cristallisation Source synchrotron ESRF SOLEIL Ligne de lumi re FIP BM30A PROXIMAI MAD Oui Non x A 1 649 Tbz 0 749 0 886 Groupe d espace P 43212 P 43212 P 43212 Param tres de maille A a 76 634 c 38 033 a 76 915 c 38 123 a 77 403 c 38 473 Contenu unit asym trique 1 mol cule 1 mol cule R solution A 38 32 1 90 2 01 1 90 38 46 1 57 1 66 1 57 19 24 1 35 1 42 1 35 Nombre de r flexions uniques 9355 1318 16363 2292 26192 3738 Rmerge 6 4 27 0 5 4 27 6 3 6 19 3 Rpim 2 5 11 0 2 1 11 2 2 1 11 9 Sigano XDS 4 23 1 54 1 15 0 78 1 33 0 82 Rano 10 4 15 8 2 3 8 6 2 7 9 4 am 9 7 2 8 10 5 2 8 12 8 3 8 Compl tude 99 9 99 3 99 6 97 6 99 7 99 2 Redondance 13 2 12 9 13 8 12 7 7 5 6 8 Tableau 4 1 Statistiques d int gration de donn es issues de cristaux d riv s HEWL Ln HMTDPA 3 _ 12 partie HEWL 3 Yb Qt de prot ine to Complexe mM 6 0 Prot ine mM 0 37 Rapport Qt de complexe 16 2 M thode d obtention co cristallisation Source synchrotron SOLEIL Ligne de lumi re PROXIMA1 M
7. N a 445 l D 181 PRO 1307 219 LEU 1530 219 LEU C 215 GLU 1307 219 LEU 1362 D 40 GLN lc fD 40 GLN D 61 GLY 920 D 60 THR ch3 D 40 GLN 902 gt D D 60 THR ch3 1757 1 C 40 GLN ic C 40 GLN 1884 D 219 LEL D 215 GLI 01 32 41 1291 D 219 LEL 24 61 D 219 LEI 22 50 A 270 ILE D 160 ALA D 161 GLY A 270 ILE D 291 LEI D 294 ALA D 290 ALA j 85 294 ALA D 294 ALA j 87 7 78 108 05 294 ALA 3 14 4 R 6 207 294 ALA D 177 ASP D 291 LEI x 08 DS 1 107 D 290 ALA gt a ki 3 105 87 x 41 46 107 24 572 D 101 ALA D 65 TYR OH j 103 10 111 95 107 22 886 x D 101 ALA 376 D 112 ASN D 273 ALA D 114 VAL D 112 ASN D 273 ALA 77 87 65 131 05 113 23 334 403 D 208 ARG Ic FD 204 GLN 7 85 29 123 03 106 60 259 D 247 VAL D 248 MET lc i 85 74 119 17 103 52 1124 D 25 GLU 88 29 106 73 100 17 496 D 2 ARG D 70 ASN 100 53 112 61 105 59 215 430 91 08 142 52 115 38 ur Un on WwW OU D wv OU D 5 5 5 5 un un N bo 1 D 1 D D Y Yy Un nN ba gt aw DH Ww N 1360 1884 438 462 438 D 160 ALA 411 479 655 J on 112 64 106 95 124 58 107 20 27 66 118 88 A w w bo CR w KPN NEN yi 107 56 ELLE LL Se N SS 88 799 714 318 D 177 ASP pd uur Tableau 7 26 Cartographie des mol cules d eau la surface du dim re A D de CaMalDH 2 partie 246 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EX
8. ARG 73 be Figure 4 40 Mode de fixation du complexe Ln HETDPA 3 la surface du HEWL Cristal d riv obtenu par co cristallisation 3 ligand 156 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE On constate donc que le mode de fixation du complexe Ln HETDPA 3 ne diff re de celui du Ln HMTDPA 3 que par une seule liaison polaire suppl mentaire La fonction hydroxyethyle du ligand HETDPA plus longue que la fonction hydroxymethyl du HMTDPA permet d atteindre la mol cule sym trique pour y cr er cette liaison suppl mentaire Cependant nous n avons pas pu mettre en vidence le mode de fixation du complexe dans le deuxi me site Trp62 celui ci tant inoccup Ceci peut s expliquer par la faible concentration laquelle le complexe Eu HETDPA 3 a t utilis pour l exp rience de co cristallisation Bien qu il y ait trois fois plus de mol cules de complexe que de mol cules de prot ine dans la goutte cette proportion n est visiblement pas suffisante pour peupler le second site D apr s le m canisme de cristallisation des cristaux d riv s pr c demment propos Figure 4 29 page 142 les mol cules de complexe se fixent en priorit aux sites tryptophane Or si basse concentration il est possible qu il n y ait pas assez de complexes pour saturer tous les sites la surface du lysozyme Comme le site Trp123 est celui qui propose la
9. L i ps aa EEIT SY S be TArt aw f SEE REA RARE D cr AR i 2 2 Figure 1 Carte de densit lectronique exp Aa PDA Ars ASE RER Re SRE ne RATES 2 p ALERT RAC DER SSR Woes Sey RSMA 21 INTRODUCTION GENERALE Cette introduction pr sente les objectifs de mon travail de recherche J en profiterai aussi pour situer ce travail sans pour autant avoir la pr tention de refaire un historique de la biologie structurale ou une num ration de toutes les techniques existantes permettant d aboutir la mod lisation tridimensionnelle d une macromol cule biologique Ce projet de recherche fondamentale est l interface de la physique de la chimie et de la biologie Il appartient au domaine de la biologie structurale domaine que je pourrais d finir par l tude des struc tures de macromol cules biologiques pour la compr hension de leurs fonctions La biologie structurale est ainsi compl mentaire de la biochimie approche qui permet de d duire la fonction de macromol cules bio logiques par l tude de leurs propri t s chimiques observables Or l observation de la structure d une macromol cule biologique n ces site de descendre l chelle atomique chelle qui a pour unit de longueur 10 Eau Basses Fr quences Vangstr m 1 A 1 10710 m Observer un objet cette r solution ato
10. o dans la goutte C lens 4 la concentration en complexes de lanthanide dans la goutte de trempage Cdans le cristal _ z z prot ine NA Vmaille NA a b c y 1 2cosa cosB cosy cos2a cos25 cos2y Viouttes le volume de la goutte de trempage Voristats le volume du cristal en dm utilis pour le trempage d termin partir des dimensions du cristal mesur es au pr alable Par exemple compte tenu des dilutions si la concentration en complexe dans une goutte de trempage de 2 pL 2 1076 dm est de 2 7 107 mol L la quantit de complexe dans la goutte est de 5 4 10 moles Si le cristal utilis pour le trempage est un cristal de lysozyme de blanc d ceuf de poule avec des dimensions de 200x200x200 um la concentration en prot ine dans le cristal est donc de 57 mM et le volume du cristal est de 8 107 dm La quantit de prot ine introduite dans la goutte de trempage est donc de 4 56 10710 moles Le rapport des quantit s de complexe sur quantit de prot ine indique qu il y a donc 11 8 fois plus de complexes que de prot ines pour l obtention d un cristal d riv Pour un m me volume de goutte de trempage de concentration en complexe dans la goutte et un cristal natif de malate d shydrog nase de Haloferax volcaniide m me dimension ce rapport prend une valeur de 66 On peut ainsi savoir si la volume de la goutte de trempage est suffisant par rapport au volume du cristal pour que le complexe ne soit pas en
11. Rmerge 5 9 14 6 5 1 13 9 Rpim 2 4 6 1 2 1 6 1 Sigano XDS 1 59 0 78 1 72 0 92 Rano 3 5 5 4 3 4 5 8 ao 9 8 4 8 10 7 5 0 Compl tude 97 7 95 7 99 6 98 0 Redondance 12 8 12 5 11 9 11 5 Tableau 4 3 Statistiques d int gration de donn es issues de cristaux d riv s HEWL Lna HMTDPA 37 partie Que ce soit par trempage ou en co cristallisation il a t possible d obtenir des cristaux d riv s de lysozyme de blanc d ceuf de poule avec le complexe tris hydroxymethyltriazoledipicolinate de lanthanide en l utilisant de faibles concentrations de 2 7 mM 10 mM Les statistiques d int gration des donn es de diffraction montrent d une part que les cristaux n ont pas t endommag s par l introduction du complexe et d autre part une forte fixation du complexe compte tenu du signal anomal lev que traduit la valeur du facteur Rano m me pour un jeu de donn es enregistr hors seuil L 7 du lanthanide impliqu En outre on remarque que le signal anomal est nettement plus faible pour les cristaux d riv s obtenus par trempage jeux n 4 et5 que pour ceux obtenus par co cristallisation bien que les donn es aient t enregistr es au seuil Ly du lanthanide Cependant contrairement aux cristaux d riv s de HEWL obtenus par co cristallisation avec le tris dipicolinate de lanthanide dont le groupe d espace monoclinique C2 s tait av r diff re
12. 167 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Pour l instant nous ne pouvons expliquer pourquoi l interaction CH n est syst matiquement rem plac e par un empilement x Nous avions envisag que l encombrement st rique induit par la pr sence de la queue choline pouvait contraindre la rotation du noyau triazole Mais la figure 4 48 semble prouver le contraire En effet la position des noyaux triazoles semble toujours conserv e alors que la fonction ethylcholine est assujettie une agitation Le complexe Ln HECTDPA 3 constitue donc une alternative de choix pour l insertion de diffuseurs anomaux dans les prot ines Appartenant la famille des tris triazoledipicolinates il conserve la tr s forte affinit pour les surfaces prot iques mais s affranchit de l effet supramol culaire d la fixation aux acides amin s arginines qui dans le cas de cette famille de complexe conduit aux mauvais cristaux 4 6 1 3 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu CTDPA Cristallisation enregistrement de donn es et tentative de phasage Le complexe Eu CTDPA 3 est le dernier membre de la famille des tris triazoledipicolinates que nous pr sentons dans cette tude Pr par selon le m me protocole que celui du complexe Eu HETDPA 3f nous n avons jamais pu mettre aussi clairement en vidence la fixation de ce nouveau complexe Eu CTDPA 3 dans un cristal de prot ine et ce m me avec le lysozyme et
13. Six prot ines diff rentes ont t choisies pour mener bien cette exp rience 1 L Acriflavine resistance protein B de la bact rie Escherichia coli EcAcrB prot ine membranaire homotrim rique de 341 kDa produite et purifi e par mes soins cf annexes 2 L Enhanced Green Fluorescent Protein de la m duse Aequorea victoria AvVEGFP prot ine cy tosolique monom rique de 24 kDa produite et purifi e par mes soins cf annexes 3 La m talloprot ine CnrXs de la souche CH34 de la bact rie Cupriavidus metallidurans CmCH34CnrXs prot ine p riplasmique de 26 kDa produite et purifi e par le Dr Juliette Tre preau de l quipe M talloprot ines de l institut Pompidor et al 2009 4 La malate d shydrog nase de la bact rie thermophile Chloroflerus aurantiacus CaMalDH pro t ine cytosolique homot tram rique de 131 kDa produite et purifi e par le Dr Dominique Madern membre de notre groupe E L M A cf second chapitre de la deuxi me partie 5 L urate oxydase du champignon Aspergillus flavus AfUox prot ine cytosolique homot tram rique de 135 kDa fournie par le Dr Nathalie Colloc h de l quipe CERVOxy du laboratoire Imagerie et Strat gie Th rapeutiques des pathologies C r brales et Tumorales Caen et par le Pr Thierry Prang du Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques de l Universit Paris V Ren Descartes 4 Paris Bonnete et al 200
14. chapitre de la premi re partie 2 2 2 La d tection de la fixation du complexe Eu DPA 3 avant l exp rience de diffraction Les ligands dipicolinate jouant le r le d antenne la luminescence intrins que des lanthanides terbium et europium dans le visible peut tre facilement caract ris e a Cristal d riv de lysozyme de b Cristal d riv de lysozyme de blanc d ceuf de poule observ en lumi re blanc d uf de poule observ sous UV visible proche Figure 2 5 La luminescence du complexe Eu DPA dans un cristal d riv de lysozyme de blanc d uf de poule Comme le montre la figure 2 5 il est possible de mettre en vidence la fixation du complexe l aide d une simple lampe UV de paillasse Bien que cette m thode permette de r v ler la fixation du complexe dans les cristaux elle ne permet pas d avoir une id e du taux de fixation dans le cristal Cependant Guillaume Pompidor a pu quantifier cette luminescence en menant une exp rience de microscopie deux photons sur des cristaux d riv s de lysozyme avec les complexes Tb DPA 3 et Eu DPA 3 D Al o et al 2007 74 CHAPITRE 2 UTILISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE EN BIO CRISTALLOGRAPHIE 2 2 3 Etat de nos connaissances sur le mode de fixation du complexe Ln DPA Au cours des travaux de recherche de Guillaume Pompidor les structures de six prot ines ont t d termin es suite un phasage exp rimental s appuya
15. la partie imaginaire f du facteur de diffusion de ces atomes Pour obtenir la diff rence anomale la plus importante il faut se placer la longueur d onde o la valeur de f est maximale 1 5 Evaluation du signal anomal et de la qualit des donn es de dif fraction La d termination des phases par les m thodes utilisant la diffusion anomale repose sur la diff rence d intensit entre les r flexions d une paire de Friedel Cette diff rence tant souvent faible il est indis pensable d enregistrer des donn es de diffraction suffisamment pr cises pour que le signal anomal soit significativement sup rieur l impr cision des mesures Lors de l int gration des donn es de diffraction premi re tape qui permet de mesurer toutes les intensit s plusieurs indicateurs statistiques rendent compte de la qualit des donn es de diffraction Hs r v lent en outre importance de certains crit res d crits ci apr s dont il faut tenir compte lors de l enregistrement des donn es 1 5 1 L importance du taux d occupation du diffuseur anomal choisi D apr s la formule du rapport de Bijvoet on voit que le signal anomal est non seulement d pendant de la valeur de f mais il est aussi d pendant du taux d occupation q des sites de fixation des diffuseurs anomaux Girard et al 2003b Danol _ 1 25 7 FI fr Np Il est donc important que les sites de fixation soient fortement occup s et que la lo
16. ligand tant la mol cule chimique qui ch late l ion lanthanide Le mot d riv caract rise l ensemble que forme la prot ine li e au complexe Je l emploierai notamment pour d signer les cristaux de prot ines ayant t mis en pr sence des complexes de lanthanide par opposition aux cristaux dits natifs uniquement constitu s de prot ines Afin de ne froisser aucun chimiste je pr cise que dans le cadre de cette th se le terme supra mol culaire d signe pour un complexe de lanthanide la propri t d tablir une ou plusieurs liaisons avec au moins deux mol cules de prot ine distinctes du cristal Pour la d signation des cartes de densit lectronique Fo et Fe correspondent respectivement aux modules des facteurs de structure observ s et calcul s Les donn es biochimiques th oriques mentionn es dans ce manuscrit telles que les points iso lec triques et les coefficients d extinction molaire ont t d duites de la s quence primaire l aide du pro gramme ProtParam disponible sur le serveur d outil bioinformatique ExPASy http web expasy org protparam Les figures de mod les de macromol cules biologiques et de cartes de densit s lectroniques qui ornent ce manuscrit ont t r alis es l aide des logiciels Coot version 0 6 1 Emsley et al 2010 et Pymol version 1 31 Schrodinger 2010 Les figures qui repr sentent les formules chimiques relatives aux
17. s33 nq TVA Scc A NTIS rl A MTD S919 NSV 02 V LAN 6L1 V NT 0C V Oud 801 V ATI GOL VID CIC 4 HII FE er HO ALL 9 NAT 6IT dSV 007 VTF 0 VIV 06 ATS HHd IHd VIV NTS CFL V NSV 611 V Sai Sap Q D Fed p300 ED SAT V NHT 16 V ED ATS LOZ JHd SEI V ATI 60L TI GIC 4 l WAL S9 V ATL Fe V VIV H VIV I OAT 61Z NAT 617 VTT LGT HT 16c TI 16 Oud 677 V TVA SIL V uano S2Y ade4000e44 40 lt 49900 1214 nvssay 9 S GIC SLT SCT G9LT 068 VTV ELTV NSVCII V DAV CV X L96 WAS CCL V 99 X X NSV 9 V 9Gp 89 CT OIT TOST Sv8 G9Y S8c ceo O G ETO SJURUE SIPPE 19 NEJ P 245 S3N22 0IN 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH RESOLUES PAR PHASAGE DE NOVO Distances A Mol cules d eau et acides amin s Mer Res Couvert cms S a s e A Tord i 1 l 5 2 xX 198 ALA is 13 E YES p PRO VAL Bs 81 A 84 19 13 92 NO 199 PRO l A 006 05 51 p 2 199 PRO J z 202 LEL 4 16 j I 113 YES 203 ALA D 203 ALA 107 NO 203 ALA D 200 ASP a 01 81 j I 00 NO 3 8 NO D 199 PRO 1 E f F 8 38 86 1 NO YES 107 04 NO 106 15 YES 103 63 1 YES 5 102 27 YES 95 40 124 62 110 15 YES 8425 132 40 106 39 NO 98 29 122 52 107 84 97 69 113 52 107 08 84 67 115 87 99 68 81 45 133 24 112 00 115 52 206 VAL 206 VAI D 203 ALA 288 GLL D 181 PRO lv
18. 1 097 Bmoyen prot ine A 17 95 Bmin prot ine A 5 24 Bmax prot ine A 145 18 Bmoyen eau A 31 05 Bmoyen ligands divers A 31 25 Tableau 7 21 R sum des statistiques d affinement de la structure native de PtMalDH sous forme apo 7 2 2 4 Les deux conformations de la boucle catalytique de PtMalDH Le site catalytique des malate et des lactate d shydrog nases se compose d une crevasse catalytique recouverte par une boucle mobile Les acides amin s impliqu s dans la fixation du substrat et la r activit chimique sont tr s conserv s Figure 7 9 page 229 Le site catalytique des malate et des lactate d shydrog nases se compose d une crevasse catalytique recouverte par une boucle mobile Les acides amin s impliqu s dans la fixation du substrat et la r activit chimique sont tr s conserv s La boucle mobile situ e entre les acides amin s 82 et 94 porte l acide amin discriminant la reconnaissance du substrat entre malate et lactate d shydrog nases Dans le cas des MalDH il s agit d une arginine conserv e en position 83 qui tablit une liaison avec une des deux extr mit s carboxyles de l oxaloac tate et stabilise ainsi la liaison du substrat avec l arginine 152 Dans le cas des LacDH on trouve une glutamine en position 83 L absence d une charge positive ne permet pas la stabilisation de l oxaloac tate en revanche cela autorise malgr tout la fixation du pyruvate par l arginine
19. 10 4 2 3 Purification de la prot ine sur colonne d affinit en r sine de nickel Toute la purification se fait en chambre froide 4 C et le d bit impos en sorti de colonne est un 1 goutte goutte lent 1 5 mL min environ Pour 50 150 mg de fractions membranaires 2 mL de 305 10 4 L ACRIFLAVINE RESISTANCE PROTEIN B ECACRB r sine de nickel suffisent J ai utilis la r sine Ni NTA Superfow de la marque Qiagen Pour cette tape de chromatographie d affinit trois tampons sont n cessaires pour fixer la prot ine la r sine puis pour l luer par gradient d imidazole gt Tampon E 20 mM Tris HCl pH 7 1 10 mM imidazole pH 7 0 10 glyc rol 0 2 B DDM gt Tampon F 50 mM Tris HCl pH 7 1 50 mM imidazole pH 7 0 10 glyc rol 0 2 p DDM gt Tampon G 50 mM Tris HCl pH 7 1 200 mM imidazole pH 7 0 10 glyc rol 0 2 B DDM La colonne est quilibr e avec cinq fois son volume en tampon E 10 mL La solution de prot ines membranaires solubilis es est pass e sur la colonne de r sine de nickel Pour fixer un maximum de prot ine EcAcrB pis le non retenu est pass une autre fois sur la colonne Un premier lavage au tampon E 35 mL permet d luer la majeure partie des prot ines membranaires non souhait es Un second lavage au tampon F l g rement plus concentr en imidazole permet d luer un peu plus le non sp cifique Enfin l lution de la prot ine EcA
20. A la fin de cette tape pour 4 L de culture initiaux j ai pu obtenir environ 10 mL de solution de EGFP tiquet e de 3 3 4 5 mg mL soit 33 45 mg de prot ine tiquet e 10 2 2 7 Clivage de l tiquette histidine A la solution de EGFP tiquet e d pourvue d imidazole a t ajout dans un tube Falcon de 15 mL l endopeptidase o chymotrypsine selon le ration 1 50 w w 1 mg d enzyme pour 50 mg de EGFP de prot ine La poudre alors utilis e provient des laboratoires Sigma Aldrich Le tube a t ensuite plac sur une roue toujours en chambre froide pendant 16 heures minimum Pour arr ter d finitivement le clivage 0 5 mM de PMSF ont t ajout s Attention cependant lors de cette tape de clivage bien utiliser le coefficient d extinction molaire th orique 4 488 nm 488 nm 63000 M cm Un aliquot de la solution r sultante a syst matiquement t pr lev 10 2 2 8 Chromatographie sur colonne changeuse de cations Afin d obtenir la prot ine EGFP sans tiquette purifi e nous avons utilis une colonne Q Sepharose changeuse de cations La colonne a t plac e dans un appareil AKTA 4 C avec le programme suivant flux de 2 mL min gradient complet entre le tampon A Q Sepharose et le tampon B Q Sepharose et lution de la prot ine dans des fractions de 3 mL Encore une fois deux pics ont t visibles sur le chromatogramme ce qui confirme la pr sence de deux population
21. Hengstenberg W amp Scheffzek K 2006 J Biol Chem 281 32508 32515 Molina R Gonz lez A Stelter M P rez Dorado I Kahn R Morales M Moscoso M Campuzano S Campillo N E Mobashery S Garc a J L Garc a P amp Hermoso J A 2009 EMBO Rep 10 246 251 Nagem R A P Dauter Z amp Polikarpov I 2001 Acta Cryst D57 996 1002 P rez Dorado I Gonz lez A Morales M Sanles R Striker W Vollmer W Mobashery S Garc a J L Mart nez Ripoll M Garc a P amp Hermoso J A 2010 Nat Struct Mol Biol 17 576 581 P rez Dorado I Sanles R Gonz lez A Garc a P Garcia J L Mart nez Ripoll M amp Hermoso J A 2010 Acta Cryst F66 448 451 Pompidor G D Al o A Vicat J Toupet L Giraud N Kahn R amp Maury O 2008 Angew Chem Int Ed 47 3388 3391 Pompidor G Maury O Vicat J amp Kahn R 2010 Acta Cryst D66 762 769 Porciero S Receveur Br chot V Mori K Franzetti B amp Roussel A 2005 Acta Cryst F61 239 242 Purdy M D Ge P Chen J Selvin P R amp Wiener M C 2002 Acta Cryst D58 1111 1117 Rossmann M G 1990 Acta Cryst A46 73 82 Russo S amp Baumann U 2004 J Biol Chem 279 51275 51281 Schoehn G Vellieux F M D Asunci n Dur M Receveur Br chot V Fabry C M S Ruigrok R W H Ebel C Roussel A amp Franzetti B
22. Le lysozyme muramidase ou encore N acetylmuramide glycanhydrolase est une enzyme globu laire soluble eucaryote qui appartient la famille des O glycosyl hydrolases classification enzymatique E C 3 2 1 17 Son poids mol culaire est de 14 3 kDa pour 129 acides amin s avec un point iso lectrique th orique de 9 32 et un coefficient d extinction molaire th orique 280 nm E280nm 37970 M l cem On la retrouve chez de nombreuses esp ces et notamment en abondance dans les larmes la salive le lait maternel les mucus et dans le blanc d uf Lenka Grunclov et al 2003 La premi re description de cette mol cule revient P Laschtchenko en 1909 mais on doit l attribution du nom lysozyme A Flemming qui en 1922 observe qu une entit pr sente dans les larmes et les s cr tions nasales provoque la lyse des bact ries The Alexander Flemming papers 2006 Premi re enzyme avoir t totalement s quenc e il s agit aussi de la deuxi me structure r solue par diffraction des rayons X a 2 de r solution en 1965 par D C Phillips Cette structure 4 permis de caract riser les acides amin s tryptophane 62 et 63 qui forment une v ritable pince sucre capable d aller fixer le lysozyme sur les parois bact riennes pour hydrolyser la liaison 1 4 entre l acide N acetylmuramique et la partie N acetyl D glucosamine des peptidoglycanes provoquant ainsi la lyse de la bact rie 10 6 La thau
23. Vellieux F M D amp Franzetti B 2009 Mol Microbiol 72 26 40 Emsley P Lohkamp B Scott W G amp Cowtan K 2010 Acta Cryst D66 486 501 Franzetti B Schoehn G Hernandez J F Jaquinod M Ruigrok R W H amp Zaccai G 2002 EMBO J 21 2132 2138 Girard Anelli P L Vicat J amp Kahn R 2003 Acta Cryst D59 1877 1880 Girard Chantalat L Vicat J amp Kahn R 2002 Acta Cryst D58 1 9 Girard Stelter M Vicat J amp Kahn R 2003 Acta Cryst D59 1914 1922 Gras S Chaumont V Fernandez B Carpentier P Charrier Savournin F Schmitt S Pineau C Flament D Hecker A Forterre P Armengaud J amp Housset D 2007 EMBO Rep 8 569 575 Hendrickson W A Horton J R amp Lemaster D M 1990 EMBO J 9 1665 1672 Hermoso J A Lagartera L Gonz lez A Stelter M Garc a P Mart nez Ripoll M Garc a J L amp Men ndez M 2005 Nat Struct Mol Biol 12 533 538 Jeudy S Stelter M Coutard B Kahn R amp Abergel C 2005 Acta Cryst F61 848 851 Kabsch W 2010a Acta Cryst D66 125 132 Kabsch W 2010b Acta Cryst D66 133 144 Kahn R Fourme R Bosshard R Chiadmi M Risler J Dideberg O amp Wery J 1985 FEBS Lett 179 133 137 La Fortelle E de amp Bricogne G 1997 Methods Enzymol 276 412 494 M rquez J Reinelt S Koch B Engelmann R
24. enregistr es au seuil d absorption Ly de europium et au seuil K du s l nium sur des cristaux d riv s de TATHAU avec le Eu HETDPA 3 Les statistiques d int gration de ces donn es sont indiqu es dans le tableau suivant 149 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Eu HETDPA 3 TdTHAU Rapport Scope 2 3 M thode co cristallisation Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD oui x 1 776 Euz 0 979 Groupe d espace P4 1212 Param tres de maille a 57 809 c 150 076 a 57 852 c 150 215 Contenu unit asym trique 1 mol cule R solution A 45 79 1 93 2 04 1 93 45 83 1 20 1 26 1 20 Nombre de r flexions uniques 19052 2614 78373 11008 Rmerge 4 3 5 7 5 1 45 7 Rpim 1 8 2 2 1 9 15 7 Sigano XDS 3 96 3 05 1 03 0 79 Rano 4 9 5 8 2 5 15 6 a0 11 1 11 1 10 4 1 7 Compl tude 96 3 93 4 98 0 95 8 Redondance 13 7 13 4 9 9 10 0 Tableau 4 14 Statistiques d int gration des donn es de diffraction de cristaux d riv s de TdTHAU Eu HETDPA 3 Les statistiques issues de l int gration des donn es mettent en vidence la qualit de ces derni res Tableaux 4 13 et 4 14 Elles montrent aussi qu avec ce type de complexe le signal anomal mesur reste plus lev pour un cristal d riv par co cristallisation que celui provenant d un cr
25. tre utilis s pour obtenir un phasage pr cis m me basse r solution Deuxi mement les complexes de lanthanide issus de l imagerie m dicale ont aussi permis de d terminer la structure de trois nouvelles enzymes homot tram riques de la famille des malate d shydrog nases Ces structures permettent d apporter de nouveaux claircissements sur l adaptation halophile Enfin en utilisant ces enzymes en tant que biblioth que de fonctions chimiques nous avons pu mettre en place une nouvelle approche m thodologique pour comprendre finement les modes d interaction des complexes de lanthanide MOTS CLES biologie structurale cristallographie m thodologie diffraction aux rayons X phasage de novo exp rimental diffusion anomale SAD MAD prot ine multim rique complexe de lanthanide his thesis aims to develop lanthanide complexes for solving biological macromolecular structures especially membrane proteins and large protein complexes Lanthanide complexes are composed of a lanthanide atom and a chemical ligand which provides non covalent binding to protein surfaces Incorporated in protein crystals they make up the substructure determined by the widely used de novo phasing methods needed for solving the whole protein structure The first part of the present work shows a study of the luminescent lanthanide picolinate complexes family easily detectable in protein crystals First we defined the conditions in which the known lanthani
26. tures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism Nature 443 173 179 324 BIBLIOGRAPHIE Murakami S Nakashima R Yamashita E and Yamaguchi A 2002 Crystal structure of bacterial multidrug efflux transporter AcrB Nature 419 587 593 Nagem R A P Dauter Z and Polikarpov I 2001 Protein crystal structure solution by fast incor poration of negatively and positively charged anomalous scatterers Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 57 996 1002 Nakasako M 2004 Water protein interactions from high resolution protein crystallography Philoso phical transactions of the Royal Society of London Series B Biological sciences 359 1191 1204 Nikaido H and Zgurskaya H I 2001 AcrAB and related multidrug efflux pumps of Escherichia coli Journal of molecular microbiology and biotechnology 3 215 218 Okaya Y and Pepinsky R 1956 New formulation and solution of the phase problem in X ray analysis of noncentric crystals containing anomalous scatterers Physical Review 103 1645 1647 Okusu H and Ma D 1996 AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance pheno type of Escherichia coli multiple antibiotic resistance Mar mutants Journal of Bacteriology 178 306 308 Orm M Cubitt A B Kallio K Gross L A Tsien R Y and Remington S J 1996 Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent pro
27. 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE Axe imaginaire Axe r el Figure 1 1 Diagramme de Harker illustrant la d termination de la phase par la m thode MIR 1 2 4 2 Les m thodes exploitant la diffusion anomale SAD et MAD Par rapport aux m thodes de remplacement isomorphe les m thodes SAD et MAD ont l avantage de s affranchir du probl me de non isomorphisme En effet ces m thodes utilisent les donn es de diffraction d un cristal d riv unique Ces deux m thodes utilisent les diff rences anomales pour la d termination des phases La premi re tape du phasage par ces m thodes est la localisation des sites de fixation des diffuseurs anomaux Pour cela il est n cessaire de calculer la carte de Patterson anomale du cristal d riv cf ci dessus Les amplitudes F et F sont connues car d duites des intensit s enregistr es lors de l exp rience de diffraction Si les coordonn es des diffuseurs anomaux sont d termin es on peut non seulement calculer l ampli tude des contributions de ces atomes lourds au facteur de structure mais aussi leur phase Connaissant les positions x des atomes lourds j dans la maille on calcule Fy et F les contributions respectives des parties r elles et imaginaires de la contribution anomale au facteur de structure Fy SCE fi exp i27h x et Fy iX f exp i27h xj J j Comme la contribution des atomes diffusant anomalement peut s crire Fp 5
28. 24 Premi re partie Du cristal biologique la structure de la macromol cule l int r t des complexes de lanthanide en biocristallographie Chapitre 1 Du cristal la structure de la macromol cule biologique Dans ce tout premier chapitre nous allons exposer le probl me des phases en bio cristallographie et les m thodes exp rimentales utilis es pour le r soudre Le but de cette introduction n est pas de d tailler toutes les m thodes de d termination de phase existantes mais plut t de donner les outils n cessaires la compr hension des exp riences de diffraction d crites par la suite Apr s une br ve pr sentation des th ories physiques exploit es lors de nos travaux de recherche nous consacrerons la seconde partie de ce chapitre la description des diff rentes tapes qui conduisent depuis l enregistrement des donn es l obtention d un mod le affin Comme une approche m thodologique requiert aussi une utilisation minutieuse des programmes de bio cristallographie et une r elle reproductibilit je profiterai de cette seconde partie pour consigner l ensemble des protocoles et des m thodes que nous avons choisis pour mener bien chacune de ces tapes 1 1 La diffraction par un cristal et le probl me des phases Comme nous l avons expos au tout d but du manuscrit l interaction entre le rayonnement X et la mati re est la diffusion lastique par les lectrons Si cette mati
29. 251 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO chain A Figure 7 18 Polygone d eau structurant entre les oxyg nes des liaisons peptidiques de deux acides amin s non adjacents Figure 7 19 R seau de polygones d eau a proximit et dans le site actif du monom re D de CaMalDH La poche du site actif est repr sent e en surface de Connolly de couleur beige le monom re D est enti rement color en rouge R le de la structure des mol cules d eau dans l adaptation halophile Dans le but d apporter un nouvel clairage sur l adaptation halophile deux tudes sont men es de conserve au groupe E L M A l tude des substitutions adaptatives de surface chez les prot ines halophiles et non halophiles et l tude de la structuration de l eau leur surface qui en d coule Nous avons compar la structure de CaMalDH non halophile pr sent e dans ce chapitre avec celle de la malate d shydrog nase de Salinibacter ruber SrMalDH halophile r solue par le Dr Nicolas 252 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Coquelle ancien tudiant en th se du Dr Madern et actuellement en post doctorat l Universit d Al berta Edmonton Canada Comme nous l avons vu dans l introduction ces deux prot ines partagent plus de 72 de similarit de s quences mais la surface de SrMalDH est nettement plus polaire o
30. C pour une pr culture sur la nuit jour 0 au soir un incubateur 25 C pour la culture bact rienne jour 1 une centrifugeuse HLA avec les tubes ad quats jour 1 un micro fluidizer ou un sonicateur pour la lyse bact rienne jour 2 une ultracentrifugeuse avec les tubes adequats jour 2 une colonne d affinit au nickel et un appareil AKTA 4 C jour 2 une colonne de d salinisation jour 2 une place sur une roue 4 C pour l tape de clivage jour 2 soir et nuit une colonne changeuse de cations et un appareil AKTA 4 4 C jour 3 une centrifugeuse avec des tubes centricons jour 3 10 2 2 1 Description du milieu de culture et de l ensemble des tampons utilis s Le milieu de culture utilis pour la production de la prot ine est le milieu YT Pr voir 4 litres de milieu pour la production et 500 mL pour la pr culture le tout n cessitant d tre autoclav au pr alable Les tableaux 10 1 10 2 et 10 3 rendent compte de la composition de ce milieu de culture et de l ensemble des tampons requis Attention pour le tampon de lyse le PMSF doit tre ajout au dernier moment car bien qu il inhibe un certain nombre de s rine prot ases il est rapidement d grad En plus du PMSF j ai toujours utilise un cachet du Complete antiprotease cocktail de la marque Roche Milieu YT pour 1 L Tampon de lyse 50 mM HEPES pH 7 9 8 g Tryptone 5 g Extrait de levure 300 mM NaCl 5
31. Cette m thode est avantageuse si on veut travailler avec les concentrations de complexe les plus lev es possibles en particulier si la solubilit du complexe est faible Quelle que soit la m thode employ e il est important d avoir une estimation du rapport des concentra tions complexe introduit sur prot ine pour chaque exp rience afin d estimer la concentration minimum de complexe utiliser pour garantir sa fixation En effet si le complexe est en sous stcechiom trie par rapport la prot ine cela peut entrainer des taux d occupation inf rieurs pour les sites de fixation et faire chouer le phasage Autant il est ais de calculer ce rapport dans le cadre de la co cristallisation au tant il est difficile d avoir une estimation de ce rapport dans le cadre d un trempage On peut cependant toujours estimer la concentration de la prot ine dans le cristal utilis Soit un cristal de param tre de maille a b c B y et z le nombre de mol cules dans la maille __ Mmaille Z Ce iet imale prot ine maille Vmaille NA avec Vinaille a b c y1 2cosa cos cosy cos a cos cos y le volume de la maille qui doit tre en dm pour obtenir la concentration en mol L7 Na le nombre d Avogadro 6 022 107 mol Ainsi z z NA Vmaile N a b c 1 2cosa cosB cosy cos2a cos 8 cos Cprot ine Par exemple dans le cas d un cristal de lysozyme de blanc d
32. DDC H h Fi Rmerge ho gt gt IE h i Avec I h Vintensit de ma mesure pour la r flexion d indice h I h intensit moyenne des r flexions quivalentes cette r flexion h Ainsi ce facteur r siduel donne toujours des valeurs optimistes au d but du traitement de donn es lorsque la redondance n est pas lev e et augmente de mani re asymptotique mesure que le nombre de clich s de diffraction augmente 1 5 6 2 Le facteur Rpim Cet indicateur qui d crit aussi la pr cision des mesures est plus informatif que le Rmerge car il tient compte de la redondance des donn es N Weiss 2001 1 p z El Ze 7 ie h i pim N gt gt h it 1 5 6 3 Le facteur Rano Le facteur Rano indique la pr cision des mesures si on consid re la loi de Fridel bris e jeu anomal Il se d crit ainsi XF T h oh 0 h Rano avec I h et J h intensit s moyennes d une paire de Friedel 1 5 7 Strat gie d enregistrement des donn es de diffraction choisie au cours de ces travaux de th se L ensemble des donn es de diffraction n cessaires ce travail de recherche a t enregistr avec le rayonnement synchrotron sur les lignes de lumi re MAD BM30A FIP French beamline for In vestigation of Proteins ID23 2 et ID29 du centre europ en de rayonnement synchrotron ESRF 51 1 5 EVALUATION DU SIGNAL ANOMAL ET DE LA QUALIT DES DONN ES
33. E Stelter M Anelli P L Vicat J and Kahn R 2003b A new class of gadolinium com plexes employed to obtain high phasing power heavy atom derivatives results from SAD experiments with hen egg white lysozyme and urate oxidase from Aspergillus flavus Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 59 118 126 Glover C A P Postis V L G Charalambous K Tzokov S B Booth W I Deacon S E Wallace B A Baldwin S A and Bullough P A 2011 AcrB contamination in 2 D crystallization of membrane proteins lessons from a sodium channel and a putative monovalent cation proton antiporter Journal Of Structural Biology 176 419 424 Green D W Ingram V M and Perutz M F 1954 The structure of Haemoglobin IV sign deter mination by the isomorphous replacement method Proceedings of the Royal Society A Mathematical Physical and Engineering Sciences 225 287 307 Grosse Kunstleve R W and Adams P D 2003 Substructure search procedures for macromolecular structures Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 59 1966 1973 Grunclov L Fouquier H Hypsa V and Kop cek P 2003 Lysozyme from the gut of the soft tick Ornithodoros moubata the sequence phylogeny and post feeding regulation Developmental and comparative immunology 27 651 660 Hendrickson W A 1979 Phase information from anomalous scattering measurements Acta Crystal logr
34. GdDO3A et GdDTPA BMA Les r sultats pr liminaires obtenus par cette tude indiquent d ores et d j des conditions et des modes de fixation qui diff rent pour les trois complexes IRM test s selon la composition des surfaces des prot ines En comparant les propri t s lec trostatiques de la r gion du premier site de fixation du complexe GdHPDO3A sur CaMaDH avec celles de la r gion correspondante chez PtMalDH et HvMalDH nous avons confirm que la fixation du com plexe GdHPDO3A requiert une zone hydrophobe mais pas n cessairement tr s marqu e Cependant ces observations ont aussi mis en vidence un facteur de forme de surface qui semble avoir une importance dans la fixation de ce complexe Dans la r gion du premier site de CaMaDH o le complexe se fixe la topologie de la surface semble faire apparaitre une pro minence hydrophobe sur laquelle le complexe vient se fixer Dans la r gion correspondante chez PtMalDH o le complexe ne vient pas se fixer alors qu il vient se fixer d autres sites sur cette prot ine on ne retrouve pas cette asp rit au m me endroit que la zone hydrophobe D autre part cette approche a aussi permis de confirmer le mode de fixation 280 CHAPITRE 8 ACRB LA PROT INE MOD LE MEMBRANAIRE PUTATIVE du complexe GdDO3A A la surface de HvMalDH riche en acides amin s aspartate et glutamate il se fixe non pas par l interm diaire du ligand mais en cr ant une liaison ionique entre l ion l
35. LN HMTDPA s UN COMPLEXE MODULABLE Description des interactions impliqu es par le 3 ligand A l instar des ligands HMTDPA et HETDPA le mode de fixation du troisi me ligand HECTDPA la prot ine comprend toujours la liaison hydrog ne entre un de ses groupements carboxylates et le groupement NH de l Arg5 Et cette fois ci nous pouvons confirmer l autre liaison hydrog ne entre son autre fonction carboxylate et le groupement NH1 de l Arg73 de la mol cule sym trique en bleu Une liaison polaire suppl mentaire semble se cr er entre la fonction hydroxyle de la queue choline et l acide amin Glu7 de la mol cule de r f rence Figure 4 47 V Figure 4 47 Mode de fixation du complexe Ln HECTDPA la surface du HEWL Cristal d riv par co cristallisation 3 ligand Si nous r sumons l ensemble des observations recueillies lors de cette tude concernant le complexe Ln HECTDPA s on constate qu il se distingue des complexes Ln HMTDPA 3 et Ln HETDPA 3 sur un certain nombre de points gt Que le complexe ait t introduit dans la goutte une concentration de 2 7 mM ou 10 mM aucun cristal au faci s tortur n est apparu dans la goutte Aucun cristal d riv n a pu tre obtenu par trempage Non pas que les cristaux natifs soient d t rior s par le proc d de trempage mais suite l analyse des donn es de diffraction nous n avons jamais constat de fixation du complexe
36. Running Stacking 55 200 kDa 30 90 kDa 16 68 kDa 14 56 kDa 12 43 kDa kDa Eau MilliQ 5 3 mL 4 6 mL 4 mL 3 3 mL 2 3 mL 630 pL 2 7 mL Acryl 30 2 mL 2 66 mL 3 33 mL 4 mL 5 mL 6 66 mL 670 pL Tris SDS 2 6 mL 2 6 mL 2 6 mL 2 6 mL 2 6 mL 2 6 mL 540 pL APS 10 100 pL 100 uL 100 pL 100 uL 100 pL 100 pL 40 pL Temed 8 pL 6 uL 4 pL 4 uL 4 pL 4 pL 4 yL Tableau 9 1 Composition pour pr paration de 10 mL de gels d naturants en fonction du pourcentage d acrylamide souhait En italique les deux concentrations en polyacrylamide utilis es au cours de cette th se 293 9 2 PR PARATION DU COLORANT AU BLEU DE COOMASSIE 9 2 Pr paration du colorant au bleu de Coomassie Pour colorer les prot ines sur gel de polyacrylamide un colorant au bleu de Coomassie a t syst matiquement utilis Sa composition est dans le tableau 9 2 qui suit Solutions et poudres stock C Finale C stock Qt la pr lever Coomassie G 250 0 2 mg mL 10 mg Tris HCI pH 6 8 0 1M IM 5 mL SDS 8 20 20 mL Glyc rol 24 100 12 mL DTT 0 2 M 1M 10 mL Eau MilliQ q s p 3 mL Tableau 9 2 Composition pour 50 mL de colorant Sample Buffer 5X C Finale est la concentration finale souhait e C stock est la concentration des solutions ou des poudres stock et Qt l pr lever correspond au volume pr lever ou la masse peser pour 50 mL de colorant 9 3 Marqueurs de poids
37. The Sr MalDH sequence was aligned to the sequence from Ca MalDH Accession numbers Coordinates and structure factors have been deposited in the PDB with accession number 3NEP Acknowledgements We thank Dr Giuseppe Zaccai for helpful discus sions and critical reading of the manuscript Finan cial support by the Centre National de la Recherche Scientifique Project EOPV Environnements Pla n taires et Origines de la Vie is acknowledged References 1 Oren A 2002 Halophilic microoganisms and their environments In Cellular Origin and Life in Extreme Environments Kluwer Academic Publishers Dor drecht The Netherlands 2 Anton J Oren A Benlloch S Rodriguez Valera F Amann R amp Rossell Mora R 2002 Salinibacter ruber gen nov sp nov a novel extremely halophilic member of the Bacteria from saltern crystallizer ponds Int J Syst Evol Microbiol 52 485 491 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Timasheff S N 1991 Solvent effect on protein stability Curr Opin Struct Biol 2 35 39 Madern D Ebel C amp Zaccai G 2000 Halophilic adaptation of enzymes Extremophiles 4 91 98 Mevarech M Frolow F amp Gloss L M 2000 Halophilic enzymes proteins with a grain of salt Biophys Chem 86 155 164 Bonnet F Madern D amp Zaccai G 1994 Stability against denaturation mechanisms in halophilic malate dehydrogenase adapt
38. The lack of both bound ions and unfavorable interactions explain why the conformational stability of Sr MalDH at low salt concentrations is similar to that of a non halophilic ortholog Changes in surface properties control solubility Effects of salt on the solubility of proteins are well studied For a protein to be soluble the concentra Fig 3 Graphs Variation of the experimental sedimentation coefficient Sexp at various salt concentrations demonstrating the repulsive nature of protein protein contacts for the halophilic proteins Sr MalDH and Hm MalDH but attractive or neutral interactions for the non halophilic protein Tt LDH and Ca MalDH The slopes were obtained from a linear regression of the Sexp data Pictures Surface representations of the tetrameric LDH and MalDH enzymes Top Electrostatic surface The electrostatic potential was calculated at 300 K and 0 M salt concentration Red corresponds to an electrostatic potential smaller than 517 mV Blue corresponds to a potential greater than 517 mV The calculated charge densities are 0 004 0 006 0 023 and 0 038 e A for Tt LDH Ca MalDH Sr MalDH and Hm MalDH respectively Bottom Hydrophobic surface representation The solvent accessible hydrophobic surface is colored black The calculated values are 16 285 13 811 9487 and 7384 A for Tt LDH Ca MalDH Sr MalDH and Hm MalDH respectively The ribbon drawing green is shown by transparency 498
39. agarose Figure 4 4 Figure 4 4 Photo de tubes eppendorf contenant une solution 50 mM de complexe Tb HMTDPA 3 gauche et d une solution de ligand HMTDPA droite sous exposition aux UV 315 nm et en salle noire 103 4 1 PRESENTATION DU COMPLEXE LUMINESCENT LN HMTDPA 3 5 4 1 2 Caract ristique spectroscopique la luminescence dans le visible par effet d antenne Ce sont les transitions des lectrons de la couche f qui sont responsables de la luminescence naturelle des atomes de lanthanide cf introduction En solution le rendement de luminescence est tr s fortement att nu par la pr sence de mol cules d eau dans la premi re sph re de coordination du lanthanide Le choix de travailler avec les cations Tb et Eu est du au fait que leurs raies d absorption et d mission sont situ es respectivement dans le domaine de l ultraviolet et du visible Comme pour le Tb DPA 3 et le Eu DPA 3 les trois ligands HMTDPA jouent le r le de chromophores ils absorbent la lumi re et transf rent une partie de l nergie par effet d antenne sur Vion qui luminesce alors La luminescence est d autant plus visible que les ligands excluent les mol cules d eau de la sph re de coordination de l ion emp chant ainsi sa d sexcitation non radiative Figure 4 5 De plus l absorption du tris dipicolinate de lanthanide dans le domaine UV est enti rement due la fonction chimique pyridi
40. complexes picolinates luminescents C est la suite des travaux de recherche de Guillaume Pompidor que nous avons voulu v rifier si le tris dipicolinate de lanthanide pouvait tre utilis en tant qu agent de nucl ation En effet seul complexe pour lequel il avait t mis en vidence des propri t s supramol culaires conduisant de nouvelles formes cristallines il semblait prometteur J ai donc soumis le complexe Ln DPA 3 une exp rience de co cristallisation automatis e avec six prot ines clectiques et 576 conditions de cristallisation diff rentes A l issue de cette exp rience nous n avons jamais constat que la pr sence du complexe favorisait la nucl ation et plus g n ralement nous n avons pas constat l apparition de cristaux d riv s De plus l ensemble de nos observations l issue de cette exp rience confirme que le complexe Ln DPA 3 est inutilisable dans les conditions de cristallisation contenant des ions divalents des hautes concentrations en sel ou du 2 methyl 2 4 pentanediol Le complexe Ln DPA 3 est donc un complexe qui doit tre utilis avec circonspection en ayant connaissance au pr alable des conditions de cristallisation de la prot ine Nous avons particip au d veloppement d une nouvelle famille de complexes Ln TDPA 3 d riv s chimiques du Ln DPA 3 Ces nouveaux complexes ont permis l obtention de phases tr s pr cises qui ont permis la r solution de la s
41. culaire qui implique le choix d un grand nombre de param tres pour la mise en place du protocole conception des amorces en fonction des temp ratures d hybridation et des codons rares choix du vecteur d expression choix de l organisme d expression choix de la m thode de transformation choix de la polym rase choix de la dur e et de la temp rature pour chacune des tapes PCR choix des tampons etc Cette investigation peut prendre un certain temps elle est souvent tributaire du d roulement des premi res exp riences Il se pose ensuite le probl me de l insertion m me de cette tiquette dans la prot ine cible En effet le choix le plus vident est d ins rer la s quence d ADN codant l tiquette afin que celle ci une fois transcrite puis traduite soit l extr mit N terminale ou C terminale de la prot ine Or si on s appuie sur les structures disponibles de la Protein Data Bank on constate qu il est tr s fr quent que les extr mit s N terminales et C terminales se replient toutes deux vers l int rieur de la prot ine parfois au point d interagir ensemble De plus la lecture des articles du groupe de B Imperiali Silvaggi et al 2007 sur le lanthanide binding tag montre la difficult de ce type d approche Par cons quent d velopper une tiquette riche en acides amin s aspartate ou glutamate ciblant le complexe LnDO3A ne me para t pas une bonne voie car trop couteuse en terme de d veloppemen
42. cules d eau la fonction carboxylate de ces acides amin s fournit une coordination plus stable au lanthanide qui d s lors devient similaire ce que l on observe avec les autres complexes neutres 4 i Figure 2 3 Mode de fixation du complexe LnDO3A la surface de la prot ine YGGV collaboration avec C Abergel IGS Marseille d apr s Stelter 2005 Du point de vue gain nerg tique le complexe LnDO3A diff re du complexe LnHPDO3A En effet le gain nerg tique est en priorit en faveur du complexe qui par le remplacement d une des mol cules d eau fournit une coordination plus stable au lanthanide sans pour autant d stabiliser la prot ine puisque les acides amin s aspartate et glutamate sont g n ralement impliqu s dans des ponts salins et des liaisons hydrog nes Etant donn que c est lion qui assure l interaction principale avec la prot ine et non plus le ligand on retrouve les statistiques de fixation observ es avec un sel de lanthanide des 70 CHAPITRE 2 UTILISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE EN BIO CRISTALLOGRAPHIE sites de fixation multiples dont le taux de fixation est de l ordre de 50 et une fixation plus ou moins ind pendante des conditions de cristallisation mais suffisante pour un bon phasage 2 1 2 3 Les autres complexes IRM Bien que les grandes lignes des modes de fixation soient comprises pour les complexes LnHPDO3A et LnDO3A il reste parfois des cas de
43. cules d eau du p rim tre d un pentagone 2 11 Dist le ob tre d l cules d eau d tre d Distance maximale observ e entre deux mol cules d eau du p rim tre d un pentagone 4 19 A Distance moyenne entre deux mol cules d eau du p rim tre des pentagones 2 86 istance minimale observ e entre deux mol cules d eau du p rim tre d un hexagone 2 39 Dist inimale ob tre d l cules d g istance maximale observ e entre deux mol cules d eau du p rim tre d un hexagone 3 32 A Dist imale ob tre d l cules d g Distance moyenne entre deux mol cules d eau du p rim tre des hexagones 2 76 Angle minimal observ entre trois mol cules d eau du p rim tre d un pentagone 73 86 Angle maximal observ entre trois mol cules d eau du p rim tre d un pentagone 138 74 Angle moyen observ entre les mol cules d eau du p rim tre des pentagones 107 56 Angle minimal observ entre trois mol cules d eau du p rim tre d un hexagone 81 45 Angle maximal observ entre trois mol cules d eau du p rim tre d un hexagone 142 52 Angle moyen observ entre les mol cules d eau du p rim tre des hexagones 111 72 Tableau 7 27 R sum des caract ristiques structurales des mol cules d eau la surface de CaMalDH La caract ristique principale de ces r seaux de polygones d eau est leur situation dans la premi re couche de solvatation recouvrant exclusivement les acides amin s apol
44. d terminer quels sont alors les crit res physico chimiques requis pour la fixation du complexe Cette tude comprend d abord l obtention des cristaux natifs pour toutes les prot ines la pr para tion des cristaux d riv s puis l acquisition et la r duction des donn es de diffraction la d termination d ventuels sites de fixation et le calcul des phases Dans un deuxi me temps pour les cristaux d riv s pr sentant des sites de fixation suffisamment occup s pour r aliser un phasage dit exp rimental l affinement du mod le structural de la prot ine avec le complexe li doit permettre d identifier et de comprendre son mode de fixation L analyse des r sultats de cette tude concernant la famille des Ln TDPA s et ses d riv s a pour but de comparer leurs modes d interaction avec les prot ines en fonction des donn es physico chimiques et structurales dont on dispose conditions de cristallisation composition en acides amin s de la surface des prot ines mod les empilement cristallin proportion de solvant motifs structuraux particuliers En les comparant aussi au Ln DPA nous devrions tre en mesure de conclure quant aux avantages et aux inconv nients amen s par l ajout des fonctions chimiques suppl mentaires 106 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 4 2 Pr paration de cristaux d riv s avec le complexe Ln HMTDPA en vue d une exp rience de dif
45. eau au dessus de la m me r gion chez SrMalDH bleu Figure 7 23 R seau de polygones non conserv au dessus de la m me r gion chez les deux enzymes CaMalDH non halophile et SrMalDH halophile Les premi res observations issues de cette tude structurale comparative corroborent les diverses analyses en solution men es par les Drs G Zaccai C Ebel et D Madern Madern 2002 Coquelle et al 2010 Ces analyses ont montr que les interactions prot ine solvant sont une composante essentielle des interactions faibles prot ine prot ine Costenaro et al 2002 La diff rence de composition chimique entre la couche d hydratation et le solvant bulk peut induire des interactions prot ine prot ine attractives conduisant la pr cipitation La diff rence de composition entre enveloppe de solvatation et solvant doit donc tre aussi neutre que possible elle doit permettre des interactions prot ine 255 7 3 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES prot ine r pulsives afin d assurer une grande solubilit tout en vitant un enrichissement de la couche d hydratation en eau ou en solvant Les prot ines halophiles ont principalement volu en modifiant leurs surfaces d interaction avec le solvant ce qui se traduit par un enrichissement en acides amin s acides en interactions avec le solvant Ce changement de surface autorise donc une modification de l enveloppe de solvatation des prot ines halop
46. er un complexe de type tris 169 AT LE LN HMTDPA UN COMPLEXE MODULABLE LA COMBINATOIRE dipicolinate non plus avec trois ligands identiques mais avec une combinaison de trois ligands choisis selon ses besoins Cette strat gie exp rimentale peut solliciter la synth se chimique d un tris h t rodipicolinate de lanthanide et elle mane du principe qu il peut y avoir change de ligands autour de l ion lanthanide Au laboratoire de chimie SEESIB une exp rience qui permet de rapidement mettre en vidence ces changes a t r alis e Elle a simplement consist ajouter une solution concentr e de sel de terbium dans une solution concentr e en complexe Eu HMTDPA 3 La luminescence de la solution qui tait alors rouge sous UV est devenue progressivement verte prouvant qu il y a eu change d ions lanthanide au sein de complexes d j form s Nous avons donc aussi envisag de cr er un complexe combin en complexant nous m me un ion lanthanide avec les ligands de type picolinate pr sent s dans la sous section pr c dente Par le terme combinatoire on peut aussi sous entendre l utilisation simultan e de complexes de lanthanide diff rents pour augmenter la probabilit de fixation de diffuseurs anomaux sur la prot ine Nous avons men une exp rience de co cristallisation mettant en pr sence deux complexes de lanthanide tr s diff rents le Eu HMTDPA 3 et le GAHPDO3A Leurs sit
47. est pourquoi pour un phasage utilisant le signal anomal il est essentiel d enregistrer des donn es de diffraction avec une redondance N lev e 1 5 5 La compl tude Elle correspond au nombre de r flexions mesur es par rapport au nombre de r flexions th oriques C AL et Ni ama Nm 3 V avec Ni le nombre de r flexions th oriques Nm le nombre de r flexions uniques mesur es V le volume de la maille et d la distance entre les plans r ticulaires La compl tude est cruciale dans toutes les tapes qui font intervenir des synth ses de Fourier Les r flexions manquantes affectant la qualit de la carte de densit lectronique apr s l tape d affinement il est n cessaire qu elle soit la plus lev e possible La valeur attendue de la compl tude pour l ensemble des donn es est comprise entre 95 et 100 1 5 6 Les facteurs r siduels Pour valuer la qualit des donn es de diffraction enregistr es les programmes d int gration calculent plusieurs indicateurs de qualit 50 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE La description de ces indicateurs de qualit est donn e ici avec hkl h les indices de Miller du r seau r ciproque et N la redondance associ e la r flexion d indice h 1 5 6 1 Le facteur Rmerge Indique l accord entre les intensit s quivalentes par sym trie et leur moyenne Blundell and Johnson 1976 Il se d finit ainsi
48. ici en toute lettre Vous avez tous contribu rendre cette histoire grenobloise si brulante et agr able Richard et Eric mes deux comp res de laboratoires respectivement directeur de th se et codirecteur de th se puis directeur de th se Je souhaite que vous ouvriez le bal Le premier tait un chercheur plu ridisciplinaire infatigable r veur optimiste bon vivant humble et p dagogue incarnation de l poque d une Recherche libre malheureusement r volue Le second est un chercheur plus moderne r aliste plus pragmatique et dont le sens de l observation n a d gal que sa perspicacit M langez le tout au shaker et non la cuiller et vous obtiendrez un des meilleurs encadrements qui soit pour faire une th se un trio o Richard fut l Empereur Eric le Ma tre Jedi et moi J tais le Padawan Merci vous deux pour ces runs synchrotron riches en motions diverses pour ces petits d jeuners ESRF et surtout pour m avoir presque toujours consid r comme un chercheur part enti re et non pas comme un tudiant On s tait dit une fois que pour faire de la bonne Science il tait n cessaire de bien rigoler Alors sans pr tention aucune je crois qu on peut dire qu on se sera globalement bien marr Eric merci pour m avoir redonn de l nergie en baignant la cabine de contr le de ta musique favorite lors des nuits synchrotron les plus difficiles R aliser des phasages aux
49. l utilisation du complexe Ln DPA 3 son auto cristallisation dans certaines conditions de cristallisation Ce d faut avait d j t soulign par Guillaume Pompidor Les observations extraites de cette exp rience font l objet du premier chapitre Au cours de mes travaux de th se nous nous sommes impliqu s dans l laboration de deux nouveaux types de complexes de lanthanide tous deux d riv s du tris dipicolinate de lanthanide Notre implication dans ce d veloppement a bien entendu t cristallographique Dans un second chapitre je pr sente donc la nouvelle famille des complexes tris triazoledipicolinates de lanthanide Ln TDPA 3 Comme l appellation le laisse entendre il s agit de complexes constitu s de ligands dipicolinate auxquels ont t fix s par chimie clic un noyau triazole portant un groupement chimique suppl mentaire qu il est possible de faire varier Cette modification structurale apporte aux nouveaux complexes tris triazoledipicolinates de lanthanide une plus forte affinit pour les macromol cules biologiques et donc un fort pouvoir de phasage une luminescence accrue dans le visible et enfin une versatilit dans leur mode de fixation aux prot ines mod les Cette versatilit est due ce groupe ment chimique suppl mentaire qu il est possible de faire varier Et c est cette variabilit qui permet de faire ainsi un choix parmi diff rents ligands pour composer un complexe tris triazol
50. la constante de Planck h 6 626069 10734J s c la vitesse de la lumi re dans le vide c 299792456 m s A la longueur d onde du rayonnement lectromagn tique Les valeurs calcul es par la m canique quantique pour f et f ne sont valables qu en dehors des seuils d absorption Au voisinage de ces seuils elles doivent tre d termin es de mani re exp rimentale compte tenu de la variation de f en fonction de la longueur d onde f A K Q Bien qu approximatif le mod le de l oscillateur harmonique amorti Figure 1 3 repr sente bien les variations des facteurs de diffusion au seuil d absorption d termin es de mani re exp rimentale Figure 1 4 43 1 3 LA DIFFUSION ANOMALE f et f dans l approximation de l oscillateur harmonique amorti w E ho 1 f 1 f if a z z w iaww w E hog 8 rar 20 45 10 05 00 05 10 15 20 in E E Figure 1 3 Variation des parties r elles et imaginaires f et f du facteur de diffusion en fonction de l nergie d excitation selon le mod le de l oscillateur harmonique amorti D apr s Stelter 2005 Les valeurs de f et f sont donc d termin es partir du spectre d absorption de l l ment d int r t Figure 1 4 en effectuant par exemple une mesure de fluorescence En effet sous l effet du rayonnement incident les lectrons excit s quittent les couches internes pour les couches sup rieure
51. lectroniques d crites avec des atomes ponctuels la densit s crit p t gt Z 5 r rj j o Z est le nombre d lectrons de l atome j de cordonn es r duites r Avec ce mod le la fonction de Patterson s crit alors P u Na Zj r rj 5 Zj u r r dr 5 5 ZjZy je lr ry u r ry dr j 7 Bt ge Plu 5 gt Z Z u ujj d lt 5 Avec ujj r r les vecteurs interatomiques de la maille Ainsi la fonction de Patterson pr sente des pics de hauteur Z Z aux extr mit s des vecteurs interatomiques 1 2 3 2 La fonction de Patterson anomale Lorsque les diff rences anomales sont significatives on peut calculer la fonction de Patterson anomale Pano u avec les coefficients Dix Danosr o Dano F F est la diff rence de Bijvoet Ainsi 1 Panolu FY D ano h exp i2rh u h On peut montrer que Pano u correspond au bruit pr s la fonction de Patterson avec pour coefficients les facteurs de structure des diffuseurs anomaux Pinch R gt gt Fi h exp i2rh u h 32 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Avec F Fp FH o Fp est le facteur de structure de la prot ine native Fy est le facteur de structure des diffuseurs anomaux La fonction de Patterson anomale repr sente alors la carte des vecteurs interatomiques des atomes lourds 1 2 3 3 La fonction de Patterson isomorphe
52. leur haut pouvoir phasant et ce m me avec des donn es a basse r solution De plus les structures des trois malate d shydrog nases d termin es au cours de cette th se montrent qu au moins un complexe de lanthanide a pu se fixer Ce constat confirme notre intuition sur le fait que le nombre de site de fixation ad quat la surface des prot ines est d autant plus lev que la taille de la prot ine est importante Au d but de mon travail de recherche je m tais promis qu en fin de th se je pourrais r pondre avec certitude LA question Quel com plexe dois je utiliser pour r soudre la structure de ma prot ine A Vheure actuelle je ne peux r pondre qu avec circonspection cette question tant les param tres dont il faut tenir compte sont nombreux Cependant on peut gt pr coniser l utilisation du complexe LnDO3A si la surface de la prot ine est tr s acide ou si la s quence primaire pr sente un nombre important d acides amin s aspartate ou glutamate Il est utilisable en trempage ou en co cristallisation dans n importe quelle condition de cristallisation Aussi faut il l utiliser haute concentration plus de 80 mM conseiller le complexe Ln HMTDPA 3 si la s quence primaire pr sente un nombre important d acides amin s tryptophane et si les conditions de cristallisation n impliquent pas l utilisation de sels d ions divalents et ou de fortes concentrations en sels De plus c
53. non halophile et de SrMalDH halophile 253 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO a R seau de polygones dans la poche du site actif surface b R seau de polygones dans la poche du site actif surface de Connolly beige de la chaine D de CaMalDH bordeau de Connolly beige de la chaine D de SrMalDH bleu Figure 7 21 R seau de polygone conserv dans le site actif de la chaine D de CaMalDH non halophile et de SrMalDH halophile chain D chain D LEU 219 LEU 241 chain C GLN 40 H a R seau de polygones recouvrant la leucine 241 linter b R seau de polygones recouvrant la leucine 241 linter face des monom res C et D de CaMalDH bordeaux face des monom res C et D de de SrMalDH bleu Figure 7 22 R seau de polygones conserv au dessus d un site hydrophobe conserv chez les deux enzymes CaMalDH non halophile et SrMalDH halophile Les exemples sont nombreux o des substitutions adaptatives d acides amin s hydrophobes de Ca MalDH en acides amin s hydrophiles chez SrMalDH perturbent l organisation en polygone de l eau la surface de SrMalDH Un seul exemple est donc mis en image dans la figure 7 23 254 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES a Mol cules d eau en r seau de polygones recouvrant une r gion de la chaine D de CaMalDH bordeaux b Mol cules d
54. o le complexe est pr sent 67 de celles ci sont concern es par l apparition de ces cristaux de sel de complexe Figure 3 10 94 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION 3 2 5 Co cristallisation de la prot ine AfUox avec le complexe Eu DPA E Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs E Cristaux de sel de Eu DPA J B Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu pPa D Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 11 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de AfUox avec le complexe Eu DPA 3 Cristaux d riv s le complexe cristallise dans la goutte m contenant la prot ine ET dans la goutte ne contenant que le complexe le complexe ne cristallise qu en pr sence de prot ine le complexe ne cristallise qu en absence de prot ine Pr cipitation ou cristallisation de PhTET2 12s en pr sence de Eu DPA Solubilisation de PhTET2 12s en pr sence de Eu DPA Figure 3 12 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA 3 en co cristallisation avec AfUox En ce qui concerne la pr sence de cristaux d riv s et l auto cristallisation du complexe le constat est le m me qu avec les prot ines pr c dentes Figure 3 11 Dans 47 des gouttes o le complexe E
55. quence primaire t utilis e pour la construction je n ai jamais utilis de mod le ou d une partie de mod le tendre Au d but de ma th se les premi res reconstructions automatiques de mod les ont t r alis es avec le programme Arp Warp C est donc dans un souci de reproductibilit et de comparaison que j ai continu utiliser ce programme tout au long de mes travaux Mais malgr la d tection d un signal anomal prouvant la fixation des complexes elle m me v rifi e par le calcul de la synth se de Fourier utilisant les phases apport es par un pr c dent mod le la qualit des cartes de densit lectronique am lior es obtenues n ont pas toujours permis au programme Arp Warp de construire un premier mod le En cas d chec de la construction automatique avec le programme Arp Warp j ai utilis un autre programme ayant le m me r le le programme Buccaneer de la suite CCP4 Cowtan 2006 La carte de densit lectronique de d part am lior e par aplatissement de solvant et la s quence d acides amin s alors utilis es ont t les m mes que lors de l utilisation du programme Arp Warp Cependant pour le programme Buccaneer seuls 5 cycles de construction automatique ont alors t utilis s sans affinement sur les solutions interm diaires Le temps de calcul de ce programme tant d j extr mement rapide l avantage de l utiliser selon cette proc dure est que la solution peut s o
56. rale et d apr s le r sultat des exp riences r alis es avec le lysozyme lorsque le taux de fixation est lev la densit lec tronique observ e a toujours t sans ambiguit elle montre clairement la fixation de l une ou l autre des formes nantiom res jamais une conformation altern e des ligands La fixation du complexe semble donc nantiosp cifique Bien videmment lorsque les ligands n apparaissent pas dans les cartes de densit lectronique il est impossible de conclure quant l nantiosp cificit de la fixation du complexe 4 5 2 4 Le Ln HMTDPA la surface de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii La structure de la prot ine TdTHAU pr sente un seul site de fixation du complexe Ce site est l interface entre deux mol cules dans le cristal centr sur un axe de sym trie d ordre 2 Pour avoir une estimation r aliste le taux d occupation mesur d apr s la synth se de Fourier 48 doit donc tre multipli par 2 96 A nouveau de par sa fixation l interface entre deux mol cules le complexe Ln HMTDPA 3 conserve l aspect supramol culaire du Ln DPA 3 Le complexe se situe d ailleurs dans la m me cavit que le Ln DPA 3 la surface de la thaumatine mais il est moins enfoui Le centre du complexe Ln HMTDPA s est d cal de 5 0 par rapport celui du Ln DPA 3 Pompidor et al 2010 Un site unique occup 96 par le Eu HMTDPA 3 Les interac
57. re est un cristal de par le motif cristallin c est dire la r p tition p riodique d une maille l mentaire dans les trois directions de l espace l onde est diffus e dans des directions sp cifiques On parle alors de diffraction Les plans d atomes ou plans r ticulaires du cristal vont r fl chir les rayons avec formation d interf rences li es la diff rence de marche des rayons X diffract s par deux plans voisins Chaque fois que la diff rence de marche est gale un multiple de la longueur d onde on observe une interf rence constructive c est la loi de Bragg 2dsind n r Avec d distance inter r ticulaire distance entre deux plans r ticulaires 6 angle de Bragg moiti de l angle entre le faisceau incident et la direction du d tecteur n ordre de diffraction longueur d onde des rayons X 27 1 1 LA DIFFRACTION PAR UN CRISTAL ET LE PROBL ME DES PHASES Chaque rayon X diffract qui a travers le plan vertical que constitue le d tecteur g n re une t che de diffraction ou r flexion L ensemble des t ches de diffraction provenant des rayons X diffract s ayant travers le d tecteur pendant le m me intervalle de temps At est enregistr et constitue le clich de diffraction Seules sont visibles sur les clich s de diffraction les r flexions r sultantes des rayons X ayant interf r de fa on constructive La position de ces r flexions sur les clich s de
58. riv de TATHAU Le phasage exp rimental pour la thaumatine a chou car le centre de l unique complexe fix la prot ine se situe sur un axe de sym trie cristallin d ordre 2 De fait le site principal du diffuseur anomal a une origine glissante sur l axe z Ceci est pr sent sur la carte de Patterson anomale de la Figure 4 17 Les deux autres pics intenses correspondent aux extr mit s des vecteurs inter atomiques entre un atome de lanthanide et un atome de soufre impliqu dans un pont disulfure cass sous l effet des dommages d irradiations Afin d appr hender tout de m me le mode de fixation du complexe Eu HMTDPA 3l j ai donc eu recours au remplacement mol culaire dont les indicateurs statistiques r sultants sont pr sent s dans le tableau 4 7 Les d finitions des indicateurs LLG RFZ et TFZ sont aussi indiqu es dans le premier chapitre 125 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA Anomalous PatLerson Level 1 6 sigma step 0 6 signa Seale 2 0000 mm A Section 112 0 60 THAU_EuDPAp_cc10_Eu Anomalous Patlerson map Figure 4 17 Carte de Patterson anomale section de Harker w 2 du cristal d riv de TdTHAU avec le Eu HMTDPA s3 1 5 o pas 0 5 o 4 5 Affinement des structures et description du mode de fixation du Ln HMTDPA 3 Un premier mod le est obtenu par construction automatique suite au calcul d un jeu de phases exp rime
59. s avoir mod lis le complexe entier atome de lanthanide et ligands dans la carte de densit lectronique 2F F et Fo F second tour d affinement a affinement des coordonn es atomiques b affinement de mani re isotrope des facteurs d agitation thermique des atomes qui constituent c la prot ine et les ligands affinement de mani re anisotrope des facteurs d agitation thermique des atomes de lantha nide La biblioth que des contraintes g om trique correspondant au ligand du complexe a t obtenue avec le serveur Dundee PRODRG2 Sch ttelkopf and van Aalten 2004 ou le programme phenix elbow de la suite Phenix Zwart et al 2008 sans minimisation d nergie int grale 4 Troisi me tour d affinement a ajustement manuel du taux d occupation du complexe entier b affinement des m mes param tres que ceux d cris l tape pr c dente c Si d autres ions ont pu tre mod lis s l affinement des facteurs d agitation thermique de mani re anisotrope peut tre tendu ceux ci d Construction automatis e des mol cules d eau 5 Quatri me tour d affinement a b c d e ajustement manuel du taux d occupation du complexe entier affinement des m mes param tres que ceux d crit l tape pr c dente construction manuelle des mol cules d eau construction des doubles conformations Si l cart entre le Ryree
60. t moin interaction avec lethanolamine La taille du ligand doit tre en de de la taille seuil d une mol cule permettant la mesure d une interaction par exp rience de Biacore La prot ine HEWL est un bon mod le car elle r siste aux multiples protocoles de r g n ration de puce Malgr les mauvais traitements du aux nombreuse tentative de r g n ration que la puce subit les exp riences mettant en vidence l interaction entre le complexe Eu HMTDPA 3 et le HEWL sont reproductibles figures 11 5a et 11 5b En effet pH 4 0 apr s r g n ration le complexe ajout une concentration doublement sup rieure la premi re conduit l observation d un signal deux fois sup rieur celui observ avec la premi re concentration Cependant lors d une m me exp rience pH 7 5 ce facteur 2 entre les unit s de r sonance mesur e et la concentration n est plus respect Il y a donc moins d interaction entre le complexe et la prot ine pH 7 5 qu pH 4 0 Bien qu un signal ait pu tre mesur lors du passage du complexe Eu HMTDPA 3 sur la piste contenant la prot ine CaMalDH il est impossible d affirmer que le complexe se fixe Compte tenu de l extr me difficult pour r g n rer la puce ce qui a tendance d naturer la prot ine fix e ce signal n a pu tre observ qu une seul fois L interaction entre le complexe GdDO3A et les prot ines HEWL et CaMalDH a pu tre mise en vi
61. tion of salt in the solvation shell surrounding the protein should be similar to the bulk solvent High salt strongly modifies the equilibrium between the bulk and the solvation shell promoting either precipitation or dissolution when either a salting out or a salting in salt is added For a given salt concentration the tendency of a protein to precipi tate or to stay soluble is determined by the nature of attractive or repulsive weak protein protein inter actions AUC can be used to determine the dominant regime because the sedimentation profiles are very sensitive to such interactions This method has been used previously with success in the study of halophilic proteins 2 Under high salt conditions in which the enzyme is very soluble the sedimentation coefficient decreases with increasing protein concen tration indicating a repulsive regime On the other hand under salt conditions similar to those that promote crystallization of Hm MalDH the sedimen tation coefficient increases with protein concentra tion indicating that interparticle interactions are under an attractive regime We applied this method to study the behavior of the MalDH and LDH enzymes in various KCl concentrations The experimental sedimentation coefficients were determined using the software SEDFIT Materials and Methods To avoid super imposition we plotted them without correction for density and viscosity which has no effect on the sl
62. to solvent conditions J Mol Biol 244 436 447 Richard S B Madern D Garcin E amp Zaccai G 2000 Halophilic adaptation novel solvent protein interactions observed in the 2 9 and 2 6 A resolu tion structures of the wild type and a mutant of malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui Biochemistry 39 992 1000 Bieger B Essen L O amp Oesterhelt D 2003 Crystal structure of halophilic dodecin A novel dodecameric flavin binding protein from Halobacterium salinarum Structure 4 375 385 Britton K L Baker P J Fisher M Ruzheinikov S Gilmour D J Bonete M J et al 2006 Analysis of protein solvent interactions in glucose dehydrogenase from the extreme halophile Haloferax mediterranei Proc Natl Acad Sci USA 103 4846 4851 Paul S Bag S K Das S Harvill E T amp Dutta C 2008 Molecular signature of hypersaline adaptation insights from genome and proteome composition of halophilic prokaryotes Genome Biol 9 R70 Wende A Johansson P Vollrath R Dyall Smith M Oesterhelt D amp Grininger M 2010 Structural and biochemical characterization of a halophilic archaeal alkaline phosphatase J Mol Biol 400 52 62 Tadeo X L pez M ndez B Trigueros T Lain A Casta o D amp Millet O 2009 Basis for the aminoacid composition of proteins from halophilic archea PLoS Biol 7 e1000257 Madern D 2002 Molecular evolution within the L
63. un cristal natif de CaMalDH 7 2 3 2 Phasage par la m thode SIRAS Les statistiques de phasage par la m thode SIRAS sont r pertori es dans le tableau ci dessous CaMalDH SIRAS R solution 19 70 1 70 FOM harp FOMarp 0 235 0 105 Nombre de sites 8 R solution FOM 0 5 A 4 41 P Zi h x 1 Pees Pers 1366 2672 Solvant 49 5 SIGMAA golomon 49 86 Buccaneer construit total 552 618 Tableau 7 23 Statistiques du phasage SIRAS de CaMalDH avec le complexe GGHPDO3A 7 2 3 3 Affinement de la structure de CaMalDH L affinement a t effectu avec le programme Phenix selon le protocole indiqu dans l introduction de ce manuscrit Les statistiques d affinement sont consign es dans le tableau suivant 242 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Le dim re A D tant le seul contenu dans l unit asym trique la reconstruction du t tram re se fait par op ration de sym trie cristalline Le monom re A devenant alors B et le monom re D devenant alors C CaMalDH Code RCSB PDB 4BGT R solution A 19 70 1 70 Rwork 17 02 Rfree 21 02 Nbre de r flexion utilis es 67827 Composition nbre d atomes Prot ine 4694 H20 946 Ions 12 Ligands 55 Res hors Ramachandran 0 30 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs 0 010 Li
64. un effet salvateur Merci pour avoir donc presque tout f t avec moi que ce soit les plus beaux r sultats scientifique avec Richard que tu appr ciais tout autant ou plus simplement la vie 333 ette th se concerne le d veloppement de complexes de lanthanide et leur utilisation pour r soudre les structures de macromol cules biologiques par diffraction des rayons X en particulier celles de prot ines membranaires et de complexes prot iques de grande taille Les complexes de lanthanide sont form s d un atome de lanthanide et d un ligand chimique qui assure une liaison non covalente avec les surfaces prot iques Introduits dans les cristaux de prot ine ces derniers constituent une sous structure qui d termin e par les m thodes de phasage de novo courantes permet de r soudre la structure de la macromol cule d int r t La premi re partie de ce travail de th se est une tude men e sur la grande famille des complexes picolinates de lanthanide complexes luminescents dont la fixation au sein des cristaux est ais ment d celable En premier lieu nous avons d fini les conditions dans lesquelles le complexe tris dipicolinate de lanthanide peut tre utilis ainsi que ses ventuelles capacit s promouvoir la cristallisation effet supramol culaire En second lieu un nouveau complexe d riv du pr c dent a t d velopp au cours de cette th se le tris hydroxymethyltriazoledipicolinate de lanthanide Ln
65. une puce Biacore Les photons de cette onde vanescente vont en effet entrer en r sonance avec ce nuage lectronique et engendrer un plasmon de surface figure 11 1 C est le ph nom ne de r sonance de plasmon de surface ou r sonance plasmonique de surface De fa on plus g n rale un plasmon de surface se d fini par une onde se propageant dans une densit d lectrons libres situ s l interface entre un milieu conducteur comme le m tal et un milieu di lectrique comme l air ou le verre M HV amp OK k mr Entit n 1 tudier Flux KO k je Entit n 2 tudier K k 4 S dimentation v K xx Onde vanescente Mol cule de prot ine Ethanolamine Dextran Crosslinker EDC NHS Plaque de verre Membrane d or Figure 11 1 Sch ma du fonctionnement du Biacore L apparition de ce plasmon de surface va modifier l angle de r fraction et provoque une chute de l intensit de londe r fl chie ce que l on mesure gr ce une barrette de diodes figure 11 1 et 11 2 La variation d intensit d pend de ce qui se lie aux entit s greff es la taille la forme et la quantit du pH de la solution utilis e ou de la pr sence de certains ions calcium Dans notre cas cette donn e est garder l esprit tant donn que nous utilisons des atomes de lanthanide 310 CHAPITRE 11 EXPLORATION D AUTRES M THODES POUR REVELER LA FIXATION DES COM
66. 1 637 Bmoyen prot ine A 18 38 Bmin prot ine 6 74 Bmax prot ine A 110 57 Bmoyen ions divers A 26 21 Bmoyen ligands divers A 33 35 Bmoyen eau A 33 50 Bmoyen ions lanthanide A 35 21 Bmoyen ligands A 34 04 Site 10cc 53 Site 20cc 51 Site 30cc 32 Site 40cc 29 Site 50cc 26 Site 60cc 24 Site 7occ 14 Site 80cc 11 Tableau 7 7 R sum des statistiques d affinement pour la structure de CaMalDH avec le complexe GGHPDO3A 223 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Affinement de la structure de PtMalDH avec mod lisation du GGHPDO3A La structure de PtMalDH pr sente trois sites de fixation pour le complexe GdHPDO3A Comme cela avait t le cas avec CaMalDH la construction du mod le confirme non seulement le nombre de sites r v l par la synth se de Fourier anomale mais aussi leurs taux d occupation respectifs En effet que ce soit pour CaMalDH ou PtMalDH on remarque que les carts entre les hauteurs des pics calcul es par la synth se de Fourier anomale sont proportionnelles aux carts entre les taux d occupation affin s des sites Tableau 7 7 avec tableau 7 4 tableau 7 8 avec tableau 7 5 GdHPDO3A PtMalDH R solution A 44 48 2 54 Rwork 2 18 78 Rfree 22 39 Nbre de r flexions ut
67. 152 Madern 2002 Depuis le d but de cette section si j ai distingu la structure issue d un cristal ayant t obtenu en pr sence de sulfate d ammonium de celle issue d un cristal obtenu dans des conditions sans sulfate d ammonium c est pour montrer ici une des diff rences structurales laquelle nous a conduit la pr sence ou l absence de sulfate d ammonium En effet dans la premi re structure plusieurs mol cules d ion sulfate charg n gativement en se pla ant dans le site actif ont mim la pr sence du substrat Une mol cule de coenzyme NAD par monom re a conjointement conduit la prot ine se retrouver dans sa conformation active c est dire avec la boucle catalytique refermant le site actif Figure 7 13b L autre structure d pourvue de tout ligand et autre cofacteur se montre dans sa forme apo boucle catalytique en conformation ouverte site actif vide Figure 7 13b 240 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES chain A Conformation due la pr sence de SO dans le site actif en correspondant l enzyme sous forme apo Site actif repr sent surface de Connolly beige et la pr sence du cofacteur NAD en surface de Connolly beige dans son site de liaison en rouge Figure 7 13 Deux conformations de la boucle catalytique du site actif du monom re A de PtMalDH Ferm e en pr sence de SO et de NAD ouverte sous forme
68. AVEC LE TBTNTPA FIXATION DU TBTNTPA Anomalous Pa lerson Level 1 6 sigma step 0 5 sigma Anomalous Patterson Level 1 6 sigma step 0 5 sigma lt gt V v i v gt Q UT PS a vbs WS ps A Seale 2 0000 mm A Section 64 0 25 Scale 2 0000 mm A Section 128 0 50 TATHAU_TACN_Tb Anomalous Patlerscn map TATHAU_TACN_Tb Anomalous Patterson map a Carte de Patterson anomale section de Harker b Carte de Patterson anomale section de Harker Figure 5 5 Deux sections de la carte de Patterson anomale du cristal d riv de TATHAU par co cristallisation avec 31 mM du TbTNTPA jeu de donn es MAD TbTNTPA TdTHAU Type de donn es MAD R solution A 40 83 1 30 Picsra PiCSoufre pk c 58 28 52 75 13 81 Picsra Picgoufre rm o 25 72 21 83 8 89 FOM Porn FOM arp 0 23 0 06 Nombre de sites 2 R solution FOM er 0 5 A 3 35 Pgh eee T 0 00 7 0 40 SIGMAA gotomon 0 52 Arp Warp construit total 171 207 Tableau 5 2 Statistiques du phasage exp rimental de la Td THAU avec le ToTNTPA 186 CHAPITRE 5 UN TRIS DIPICOLINATE CAG LE LNTNTPA ANA tt Al Vs PEER VAA ANA Say VY Figure 5 6 Carte de densit lectronique exp rimentale d un cristal d riv de TdtHAU TbTNTPA contour e 1 0 o am lior e par aplatissement de solvant Phasage MA
69. C est la m thode que j ai le plus employ e car elle m a permis de m affranchir de certains probl mes d interpr tation du Ryfree par phenix refine que j ai pu constater lorsque j ai proc d ainsi c Sile mod le initial a t construit par le programme Buccaneer je l ai utilis sans modification suppl mentaire en g n rant un R free lors du premier tour d affinement par pheniz refine 2 Premier tour d affinement Calcul d un R free avec 5 des r flexions exclues de l affinement pour chaque tranche de r solution si cas 1b ou 1c 56 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE a Recuit simul Permet de sortir du minimum d nergie locale en augmentant virtuellement la temp rature jusqu 5000 K typiquement puis en la diminuant par pas de 100 K jusqu atteindre le seuil de 300 K Affinement en corps rigide s des coordonn es Cet affinement am liore la position dans la densit lectronique de la mol cule prot ine monom re en la consid rant comme un seul bloc un tout rigide Affinement des coordonn es atomiques pour chaque atome Affinement de mani re isotropique des facteurs d agitation thermique caract ris par l cart quadratique moyen Soumis une agitation l atome semble plus grand et la transform e de Fourier qui en r sulte est plus large On mod lise ce ph nom ne avec le facteur d agitation thermique 3 Apr
70. D M F 2004 PRODRG a tool for high throughput crystallo graphy of protein ligand complexes Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 60 1355 1363 Seeger M A Schiefner A Eicher T Verrey F Diederichs K and Pos K M 2006 Structural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism Science 813 1295 1298 Sheldrick G M 2008 A short history of SHELX Acta crystallographica Section A Foundations of crystallography 64 112 122 Silvaggi N R Martin L J Schwalbe H Imperiali B and Allen K N 2007 Double lanthanide binding tags for macromolecular crystallographic structure determination Journal of the American Chemical Society 129 7114 7120 Sterpone F Bertonati C Briganti G and Melchionna S 2010 Water around thermophilic pro teins the role of charged and apolar atoms Journal of physics Condensed matter an Institute of Physics journal 22 284113 Strub M P Hoh F Sanchez J F Strub J M Bock A Aumelas A and Dumas C 2003 Selenomethionine and selenocysteine double labeling strategy for crystallographic phasing Structure 11 1359 1367 Taylor G L 2010 Introduction to phasing Acta Crystallographica Section D Biological Crystallogra phy 66 325 338 Thomas A S and Elcock A H 2006 Direct observation of salt effects on molecular interactions through explicit solvent molecular dynamics simulations diffe
71. De la m me mani re dans le cas d un phasage par remplacement isomorphe la fonction de Patterson ayant alors pour coefficients Diso Fpx Fp correspond au bruit pr s 1 Pso u Pu u 5 X Fy h exp i2rh u h Les fonctions de Patterson anomal et isomorphe pr sentent donc respectivement des pics l extr mit des vecteurs interatomiques des diffuseurs anomaux et des atomes lourds Dans le cas d un cristal natif compte tenu du grand nombre de pics interatomiques la fonction de Patterson n est en g n ral pas interpr table A l inverse la carte de Patterson anomale pr sente des pics beaucoup moins nombreux La pr sence de pics marqu s dans la carte de Patterson anomale indique la fixation de diffuseurs anomaux sur la prot ine A partir de cette carte on peut trouver les positions des atomes lourds dans la maille Les l ments de sym trie impos s par le groupe d espace m nent des concentrations de pics dans certaines r gions de la carte de Patterson appel es sections de Harker Les pics trouv s dans ces sections indiquent les extr mit s de vecteurs interatomiques d atomes anomaux occupant des positions quivalentes Les pics apparaissant en dehors des sections de Harker sont relatifs des diffuseurs anomaux ne se trouvant pas dans des positions quivalentes ce sont des pics crois s de diff rents sites Connaissant les relations qui relient les positions quivalentes le
72. EXTREMOPHILES conditions de cristallisation SrMalDH B sel propri t s de surface NE PI Fis B haute T C QU SA Figure 7 3 Principe de l approche rationalis e utilisant les MalDH pour l tude du mode de fixation des complexes IRM Surfaces lectrostatiques repr sent es du plus lectron ga tif 3 kT e au plus lectropositif 3kT e CaMalDH pour MalDH de la bact rie B thermophile T Chloroflecus aurantiacus SrMalDH pour MalDH de la bact rie halophile Salinibacter ruber PtMalDH pour MalDH de l arch e A hyperthermoacidophile T pH Picrophilus torridus HvMalDH pour MalDH de l arch e halophile Haloferax volcanii et TtLacDH pour LacDH de la bact rie hyperthermophile Thermus thermophilus C est ici que r side l change de bons proc d s En effet ces diff rentes malate d shydrog nases recombinantes nous permettent de mettre en place une m thode d analyse des modes de fixation plus rationalis e que l approche men e jusqu pr sent qui consiste tudier des complexes sur des prot ines tr s diff rentes Mais les nouvelles structures r solues l aide des complexes sont ensuite confi es en retour au Dr Madern pour analyses approfondies Ainsi je pr senterai dans ce chapitre les premiers r sultats relatifs la fixation des complexes IRM GdHPDO3A GdDO3A et GdDTPA BMA sur trois MalDH c
73. Ferguson A D Hofmann E Coulton J W Diederichs K and Welte W 1998 Siderophore mediated iron transport crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide Science 282 2215 2220 Feterman G and Hazan M 2010 La nature au fil des couleurs Dakota Edition Fralick J A 1996 Evidence that TolC is required for functioning of the Mar AcrAB efflux pump of Escherichia coli Journal of Bacteriology 178 5803 5805 Franzetti B Schoehn G Hernandez J F Jaquinod M Ruigrok R W H and Zaccai G 2002 Tetrahedral aminopeptidase a novel large protease complex from archaea The EMBO journal 21 2132 2138 Garman E and Murray J W 2003 Heavy atom derivatization Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 59 1903 1913 Garman E F 2010 Radiation damage in macromolecular crystallography what is it and why should we care Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 339 351 Ginzburg M and Sachs L 1970 Ion Metabolism in a Halobacterium I Influence of age of culture on intracellular concentrations The Journal of General Physiology 55 187 207 Girard E Anelli P L Vicat J and Kahn R 2003a High phasing power lanthanide derivatives taking advantage of ytterbium and lutetium for optimized anomalous diffraction experiments using synchrotron radiation Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 59 1877 1880 Girard
74. ITDPA 3 Il nous a permis de r aliser un phasage de novo tr s pr cis conduisant la d termination des structures du lysozyme de blanc d uf de poule et de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii haute r solution Par ailleurs diff rents ligands pour ce nouveau complexe ont t synth tis s par chimie click nous permettant de cr er une panoplie de complexes uniques et des complexes hybrides Nous avons montr que cette nouvelle famille de complexes pr sente une meilleure affinit pour les prot ines permettant leur utilisation de faibles concentrations Les essais men s avec ces LnTDPA ont aussi permis d entrevoir l importance de la charge globale pour expliquer effet supramol culaire En troisi me lieu un tripicolinate cag le LnoTNTPA a galement t valu Constitu d une cage chimique de charge globale nulle nous avons montr que ce nouveau complexe luminescent est le seul de cette famille picolinate qui puisse tre utilis en pr sence d ions divalents Dans la seconde partie de cette th se nous d crivons l utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de prot ines multim riques de grandes tailles par les m thodes de phasage de novo Premi rement la structure de l aminopeptidase dod cam rique PhTET1 12s de 480 kDa a t d termin e 4 de r solution l aide du tris dipicolinate d europium Ceci nous a permis de d montrer que les complexes de lanthanide peuvent
75. J int raction entre le complexe Eu HMTDPA et la prot ine HEWL par exp rience de Biacore Avec le complexe Eu DPA 3 il n a pas t possible de mesur une interaction avec les prot ines et ce quelle que soit la gamme de concentration en complexe En effet il y a eu davantage d interaction entre le complexe et l ethanolamine de la piste t moin qu avec le lysozyme ou les autres prot ines De plus que ce soit pH 4 0 ou pH 7 0 le signal mesur semble montrer une association et une dissociation trop rapide pour tre cens e 11 1 5 Conclusion De mani re g n rale voici ce qu on peut retenir de ces exp riences au Biacore Bien que les appareils aient volu s depuis les premiers essais effectu s par Meike Stelter il semble que la taille des complexes de lanthanide soit toujours limite pour d tecter une interaction par une telle m thode Il est donc possible de mesurer une interaction avec les complexes complets ligand ion lanthanide mais il semble vain d essayer d observer une interaction avec le ligand seul En outre le signal mesur est proportionnel la masse et la quantit de l entit fix e la puce Ainsi un probl me relatif la greffe de prot ines sur la puce subsiste la quantit parfois trop faible de prot ine fix e sur la puce ne permet pas de mesurer un signal avec des complexes de faibles affinit s Enfin un autre probl me non n gligeable est la r g n ration d
76. Kg n cessite de faire une gamme de concentration pour l entit inject e en flux et une certaine reproductibilit des r sultats 11 1 2 Protocole g n ral Le mod le d appareil Biacore qui a t utilis est le Biacore 3000 le plus sensible de la gamme en 2011 Tous les tampons et toutes les solutions qui ont t utilis s ont t syst matiquement filtr es et d gaz es au pr alable Nous avons utilis une puce CM4 4 pistes figure 11 3 Ce type de puce co te plus de 200 et chaque piste peut recevoir le flux individuellement 1 2 3 ou 4 ou en s rie 1 2 1 2 3 ou 1 2 3 4 Ces pistes peuvent tre fonctionnalis es ind pendamment une 311 11 1 D TECTER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE SUR DES MACROMOL CULES BIOLOGIQUES PAR R SONNANCE PLASMONIQUE DE SURFACE BIACORE mol cule diff rente peut tre greff par piste Nous avons toujours utilis la piste 1 comme piste t moin c a d sans prot ine PISTE 1 PISTE 2 PISTE 3 Figure 11 3 Sch ma d une puce Biacore vue du dessus Le protocole de fonctionnalisation qui a t utilis est le suivant Une prot ine diff rente a t greff sur chacune des piste sauf sur la piste 1 qui nous servi de piste t moin Au dessus de la lame de verre la puce est recouverte d une matrice de dextran polym re de dextrose qui poss de un groupement carboxyle libre Nous avons d abord provoqu une r action chimique vis
77. Molecular Biology 355 684 696 Coquelle N Talon R Juers D H Girard E Kahn R and Madern D 2010 Gradual adaptive changes of a protein facing high salt concentrations Journal of Molecular Biology 404 493 505 Costenaro L Zaccai G and Ebel C 2002 Link between protein solvent and weak protein protein interactions gives insight into halophilic adaptation Biochemistry 41 13245 13252 Cousins K R 2011 Computer review of ChemDraw Ultra 12 0 Journal of the American Chemical Society 133 8388 Cowtan K 2006 The Buccaneer software for automated model building Acta Crystallographica Sec tion D Biological Crystallography 62 1002 1011 Cowtan K D and Main P 1996 Phase combination and cross validation in iterated density modification calculations Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 52 43 48 D Al o A Pompidor G Elena B Vicat J Baldeck P L Toupet L Kahn R Andraud C and Maury O 2007 Two photon microscopy and spectroscopy of lanthanide bioprobes ChemPhysChem 8 2125 2132 Dalhus B Saarinen M Sauer U H Eklund P Johansson K Karlsson A Ramaswamy S Bjork A Synstad B Naterstad K Sirev g R and Eklund H 2002 Structural basis for thermophi lic protein stability structures of thermophilic and mesophilic malate dehydrogenases Journal of Molecular Biology 318 707 721 Dauter Z 2002 New approaches to h
78. NVEHIPL uosrerduos mod arm ap OQE Ua asqear aprrqhy x jdwop aISHHS vaaroan vaG LWH a apugdy sxo duo awa 8r r L1 G LE LL uosteredutoo mod Iwy ap oqe Us FSET oprq y x jdwop 4ISHHS L VaaLo an vaaznmral puqAy sxo duwuor 2AJ9Sqo guIqui0s axorduwuo7 SUOTX9TJOI 2p 9IQN UT eISLIO SILA uoTnu91q0 p IPOY W 9UI9I0I gq Px rdwop 94919993 ing npusne 3939 QuTquIOS exo durog 175 4 7 LE LN HMTDPA UN COMPLEXE MODULABLE LA COMBINATOIRE ie taux o we enus au faci ntique celui des cristaux de eee atifs Es __ gt Run Z LD YY _ ee Tableau 4 26 R capitulatif des r sultats obten mbinatoires 3 et 5 4 7 2 3 Les combinatoires avec m lange de complexes entiers appartenant la grande famille des complexes picolinates Il s agit de deux combinatoires r alis es par m lange de solutions contenant chacune le complexe Eu HMTDPA s et le complexe Eu DPA 3l Combinatoire 6 M lange d une solution de complexe Eu HMTDPA 3 15 mM avec une solution de Eu ie 15 mM Tentative pour cr er un complexe hybride ayant un o ou plasie eurs ligands dipicolinates ave un ou plusieurs ligands HMTDPA Le but tant de voir quel faci s ont les cristaux d riv s obtenus par co cristallisation et d identifier de nouvelles interactions nee 5 mM4 d une solution contenant le m lange de complexes Eu HMTDPA 3 et
79. OT PIEST aE Ott 68 9r 4 09 Lr 6r Spuvsy op Suey INQuIOTYDI0 s vy PIRA V4GLOHH NA 7 sE VAALWH 4 1 9AJ9Sq0 QuIquios oxodurog SUOIX9 J91 op 9IQN 90 L1 OA 86I a LL b 61 86 UMESH SOU uOTHU91q0 p IPOY W UORESHJEISTIO O9 Spuvsy op Suey ajqrssod srojeurquoT VAGLOAHMNAT ape F VaQL4HMAlT 9939 gurquuoo L VAGLNHNAI t axajduio7p 9492194991 ing 173 AT LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE LA COMBINATOIRE la mod lisation du complexe Il occupe 65 un seul site de fixation Comme pour la combinatoire 2 la densit lectronique affin e des ligands 1 et 2 a conduit la mod lisation de ligands HECTDPA la queue choline tant cette fois visible si les contours de la carte taient 0 90 o Concernant la mod lisation du complexe la densit lectronique relative au premier ligand fut plus ambigu elle permit de mod liser la fois une liaison r r et CH x avec le Trp123 Tableau 4 25 Le faci s des cristaux obtenus le taux d occupation de l unique site occup et la faible fixation du complexe sur la TATHAU sont autant de propri t s qui rappellent celles du complexe Ln HECTDPA 3 pr sent pr c demment En effet les ligands du complexe Ln HECTDPA 3 avaient pu tre mod lis s assez facilement la surface de la prot ine HEWL et le taux d occupation observ tait de 62 La synth se en laboratoire a donc p
80. PROTAGONISTES DE LA COURTE HISTOIRE MEMBRANAIRE son extr mit C terminale Elles constituent une tiquette histidine suffisante pour accrocher la pro t ine aux colonnes d affinit en r sine de nickel dont l utilisation est elle aussi tr s largement r pandue Cette prot ine peut donc se retrouver facilement dans les extraits finaux purifi s et cristallisant aussi tr s bien peut conduire la formation de cristaux qui ne sont pas ceux esp r s Veesler et al 2008 Glover et al 2011 La premi re structure d EcAcrB a t r solue par diffraction de rayons X 3 0 de r solution par Klaas M Pos et Kay Diederichs Pos and Diederichs 2002 qui l on doit aussi toute la biochimie et les premi res descriptions structurales La meilleure r solution ayant pu tre obtenue ce jour pour une structure d EcAcrB est de 2 80 A Murakami et al 2006 Figure 8 1 Partie p riplasmique li e AcrA et TolC Partie trans membranaire membrane interne chain A Figure 8 1 EcAcrB structure r solue 2 80 A Le monom re A est en couleurs arc en ciel de l extr mit N terminale en bleu l extr mit C terminale en rouge Les monom res B et C sont color s en cyan et magenta respectivement L analyse de la s quence primaire de la prot ine EcAcrB r v le un poids mol culaire de 341 kDa 3147 acides amin s 1049 par monom re un point iso lectrique th orique de 5 39 et un coef
81. S Vv s G E G E G D A T Y G K L 340 81 370 91 400 101 430 111 CTG AAG TIC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GIG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GIG CAG TGC TIC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TIC L K F I c T pu G K L P T P W p T L ww I L x A G v Q c F s R Y Pp D H M K Q H D F 460 121 490 131 520 141 550 151 TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC F K s A M p E G g v Q E R T E F E K D D G N E K T R A E v K F E G D T L LA N R I 580 161 610 171 640 181 670 191 GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GIG E L K G I D F K E D G N I L G H K L E Y N Y N S H N Y I M A D K Q K N G I K y 700 201 730 211 760 221 790 231 AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC N F K I R H N I E D G S Vv Q L A D H Y Q Q N T P I G D G v L L P D N H Y L S T 820 241 850 251 880 261 910 271 CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TIC GIG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA Q S A L S K D P N E K R D H M v L L E F v T A A G I T L G M D E L Y K 7 Etiquette poly histidine en N terminal de l eGFP Site de clivage ph nylalanine pour l end
82. VESRF La pr sence du robot CATS sur la ligne de lumi re change consid rablement l organisation g n rale d un run synchrotron car tant donn qu il n est plus n cessaire de rentrer dans la cabane d exp rience pour changer soi m me l chantillon avec toute la proc dure que cela implique le gain de temps est appr ciable De cette mani re j ai pu tester la qualit de diffraction de l ensemble des cristaux congel s avant de ne retenir que les meilleurs pour les enregistrements complets En outre lorsque des acquisitions de donn es sur plusieurs cristaux d riv s contenant diff rents atomes de lanthanides sont pr vues impliquant donc l acc s diff rents seuils d absorption le changement d chantillons assur et facilit par le robot permet la manipulation suivante Plut t que de garder un chantillon mont tout en changeant plusieurs fois la longueur d onde il est possible d enregistrer d abord les donn es avec tous les d riv s concern s par une m me longueur d onde avant de changer cette derni re On minimise ainsi le nombre de changements de longueurs d onde qui sont assez longs et quelque peu p rilleux ils peuvent parfois conduire la perte du faisceau ou tre sources de diverses pannes N utilisant pas le processus d acc s automatis aux seuils de la ligne proc der de la sorte m a aussi permis de placer sur le goniom tre alors disponible un cran de fluorescence pour vis
83. an accurate phasing even at low resolution Secondly the lanthanide complexes from medical imaging also helped to solve the structures of three new homotetrameric enzymes from the malate dehydrogenases family Those structures provide new insights into halophilic adaptation Finally by using these enzymes as a library of chemical functions we developed a new methodological approach for a better understanding of the precise binding modes of those lanthanide complexes KEYWORDS structural biology crystallography methodology X ray diffraction de novo experimental phasing anomalous diffraction SAD MAD multimeric protein lanthanide complex
84. apr s adjonction des diff rentes fonctions chimiques par chimie clic savoir les ligands PhOMe PhNO2 et Ph voir la figure 4 2 l absorption dans UV visible est nette ment sup rieure a celle constat e pour les complexes dont les ligands n ont pas subi cette r action a savoir le ligand nomm azide dimethyl 4 azidopyridine 2 6 dicarboxylate En outre cette exp rience montre que la pr sence d un groupement lectro attracteur NO2 provoque un d placement du spectre 105 4 1 PRESENTATION DU COMPLEXE LUMINESCENT LN HMTDPA 5 Abs u a 200 300 400 A nm Figure 4 6 Spectres d absorption des complexes diff rentes tapes de leur synth se par spectroscopie dans l UV Visible Comme nous le verrons par la suite d autres complexes similaires au Ln HMTDPA 3 sont intervenus dans l tude qui est pr sent e ici L ensemble de ces complexes forme la famille des tris triazoledipicolinate de lanthanide ou Ln TDPA 3 o x est la charge des complexes qui varie d un complexe l autre cf 4 6 Nous avons entrepris une tude cristallographique syst matique et comparative de cristaux d riv s de diff rentes prot ines pr par s avec plusieurs concentrations de complexe Ln HMTDPA 3 Ceci pour d une part d terminer si la r solution de la structure de ces prot ines est possible par les m thodes tirant profit de la diffusion anomale et d autre part
85. around polar protein atoms obtained by a database analysis The Journal of Physical Chemistry B 113 11274 11292 McPherson A and Cudney B 2006 Searching for silver bullets an alternative strategy for crystal lizing macromolecules Journal Of Structural Biology 156 387 406 Mie G 1908 Beitr ge zur optik tr ber medien speziell kolloidaler metall sungen Annalen der Physik 330 377 445 Miller R Shah N Green M L Furey W and Weeks C M 2007 Shake and Bakeon the grid Journal Of Applied Crystallography 40 938 944 Molina R Stelter M Kahn R and Hermoso J A 2009 Characterization of gadolinium complexes for SAD phasing in macromolecular crystallography application to CbpF Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 65 823 831 Morales R Berna A Carpentier P Contreras Martel C Renault F Nicodeme M Chesne Seck M L Bernier F Dupuy J Schaeffer C Diemer H Van Dorsselaer A Fontecilla Camps J C Masson P Rochu D and Chabriere E 2006 Serendipitous discovery and X ray structure of a human phosphate binding apolipoprotein Structure 14 601 609 Morris A L MacArthur M W Hutchinson E G and Thornton J M 1992 Stereochemical quality of protein structure coordinates Proteins Structure Function and Genetics 12 345 364 Murakami S Nakashima R Yamashita E Matsumoto T and Yamaguchi A 2006 Crystal struc
86. ation Au cours des travaux de recherche Guillaume Pompidor a mis en vidence l effet supramol cu laire du complexe luminescent tris dipicolinate de lanthanide Ln DPA 3 Dans les conditions de cristallisation conduisant habituellement aux cristaux natifs le complexe Ln DPA introduit par co cristallisation a conduit un empilement cristallin diff rent de celui habituellement observ pour trois prot ines natives le lysozyme de blanc d uf de poule Pompidor et al 2008 la xylanase de Trichoderma reesei et l ubiquitine de c ur de b uf Nous nous sommes alors demand si au del de son utilisation en tant que diffuseur anomal on pouvait utiliser le tris dipicolinate de lanthanide en tant que petite mol cule pouvant favoriser la forma tion de contacts cristallins et ainsi promouvoir la nucl ation L ajout de petites mol cules dans la goutte de cristallisation pour provoquer la nucl ation et am liorer la croissance cristalline avait t propos en 2006 par Mc Pherson et Cudney McPherson and Cudney 2006 Pour ce faire les petites mol cules cr ent des interactions faibles avec les prot ines comme les liaisons hydrog nes les interactions lectro statiques ou hydrophobes Is ont aussi mis en vidence que certaines cat gories de petites mol cules sont particuli rement propices pour tablir ces interactions les acides dicarboxyliques fonction chimique que porte le complexe Ln DPA et les gro
87. atomes lourds sur fond de heavy metal c est tout un concept Un grand merci pour m avoir fait d couvrir le fabuleux monde des Studios Ghibli et du g nial Miyazaki Je te dois quelques moments d vasion t l visuels bien m rit s Enfin je te suis tr s reconnaissant de m avoir consacr un certain nombre de weekends et de jours f ri s pour corriger mon manuscrit lors de ma difficile et stressante p riode de r daction Richard Comme ce petit paragraphe le concernant va tre d licat crire Je vais encore tre tiraill entre l envie d tre un peu trop sinc re et la relative temp rance qu impose des remerciements de th se De la m me fa on que j ai t d boussol au d but entre le fait qu il tait mon directeur de th se alors que nous devenions j ai la pr tention de le croire amis Et encore voil un pr tention de croire qui ressemble typiquement une pincette due au contexte Cependant une chose est sure une chose que personne ne contredira nous tions fait pour nous entendre Comme il le disait si bien certains moments sur mon balcon un verre de mon meilleur rhum la main la vie est douce Ce rhum force il me l a compl tement siffl et symboliquement ou pas je n en ai plus jamais retrouv Alors son philosophe postulat j ajouterai ceci ce lundi 3 octobre 2011 la mort fut rude Malgr les l gantes et r confortantes observations que j ai pu en
88. au long du manuscrit pour justifier la qualit des donn es cristallographiques et dont la description a t consign e dans cette section 1 5 8 3 Estimation de la proportion de solvant dans l unit asym trique En comparant le pourcentage th orique du volume de l unit asym trique occup par les atomes que renvoie le programme TRUNCATE pour un nombre de mol cules dans l unit asym trique impos on peut d terminer la part qu occupent les atomes dans ce volume Cette information sera n cessaire pour am liorer les phases ult rieurement Par it rations successives on cherche a atteindre une valeur de pourcentage de solvant logique pour une unit asym trique de cristal biologique entre 20 et 50 de solvant 1 6 Affinement de la structure et interpr tations L tape de construction conduit un mod le qu il est n cessaire de compl ter et d affiner Le proto cole d affinement repose d une part sur l valuation de l ad quation entre ce qui est construit et la carte de densit lectronique calcul e partir des donn es exp rimentales et d autre part sur l ad quation du mod le construit avec les propri t s physico chimiques connues Le but de tout cristallographe est d obtenir le mod le le plus repr sentatif de la r alit L volution de la qualit du mod le est permise par le calcul de deux facteurs r siduels Le Rwork et le R free 1 6 1 Les facteurs r siduels utilis s l
89. binding sites eight sites per tetramer contribute to the native assembly The role of the chloride binding sites in the stabilization and association of the enzyme has been well established using site directed mutagenesis 7 Table 1 Crystal parameters data collection and refinement statistics Sr MalDH Data collection ESRF beam line BM30 ID29 Wavelength A 0 9797 0 9320 Resolution range A 33 1 55 1 60 1 55 Space group 1222 Cell dimensions A a 76 11 b 87 72 c 100 45 Rmerge 0 083 0 499 I ol 11 4 2 2 Redundancy 6 4 4 0 Completeness 97 5 93 2 Refinement Resolution A 33 1 55 Rwork Rite 0 168 0 192 Number of atoms Protein 2360 Waters 340 Mean B factor Protein 28 9 Water 41 7 RMSD Bond length 0 013 Bond angle 1 33 Ramachandran statistics Favorable 98 7 Allowed 1 3 Values in parentheses correspond to the highest resolution shell 496 100 80 40 20 of folded form Structural Analysis of MalDH from S ruber B la 2 2 Fig 2 Graphs The effect of salt concentration on the conformational stability of Tt LDH a Ca b Sr c and Hm MalDH d Pictures Close up view of structures at positions that allow comparison of the most important amino acid substitutions involved in the salt concentration dependent stability Non halophilic enzymes Tt LDH and Ca MalDH and halophilic Sr MalDH lack the specific ion binding sites that control
90. ceuf de poule de groupe d espace P4212 de param tre de maille a b 78 0 A c 38 0 A a B y 90 0 avec 8 mol cules dans la maille la concentration en prot ine dans le cristal est de 57 mM Pour un cristal natif de malate d shydrog nase de Haloferax volcanii de groupe d espace C2 de param tres de maille a 144 370 A b 82 028 A c 112 32 A B 101 626 avec 2 t tram res dans la maille soit z 8 protom res Cprot ine 10 mM De la m me fa on que pour d terminer la concentration d une prot ine en solution ot seul le poids mol culaire et le coefficient d extinction molaire du protom re sont pris en compte nous prenons comme nombre de mol cules dans la maille le nombre de protom res A z quivalent les param tres de maille conduisent des concentrations tr s diff rentes Cependant cette m thode n est pas valable pour obtenir une estimation du rapport complexe intro duit sur prot ine En effet les volumes finaux correspondent respectivement au volume de la goutte de trempage et au volume du cristal introduit dans cette goutte de trempage Afin de comparer la quantit de complexes de lanthanide introduits par trempage par rapport la quantit de prot ine il faut raisonner en mole Ainsi dans la goutte Ncomplexe __ Ces Vgoutte m dans le cristal Nprot ine C prot ine Veristal 63 1 7 DES CRISTAUX D RIV S PR SENTANT UN SIGNAL ANOMAL POUR UN PHASAGE DE NOVO
91. comparaison on voit Vexacte influence du complexe de lanthanide sur les atomes de la surface prot iques voisins Les exp riences ont t r alis es une fr quence d irradiation de 600 MHz pH 7 2 et 25 C 11 2 3 Type de r sultat observable par RMN La figure 11 6 pr sente le type de r sultat que nous avons pu obtenir par cette m thode Les conditions d obtentions des spectres NOESY compar s ici sont d crites dans la partie sup rieure de la figure HEWL 7 mM pH 3 8 35 C 7 D20 HEWL 7 mM pH 3 8 35 C 7 D20 Yb DPA ppm 6 854 6 904 6 954 Trp ELE NL C2 C7H 7 004 7 054 7 104 j 1 7 154 7 204 1 7 254 ut Te 123 INLH C2H C7H 7 354 1 7 404 7 454 7 504 7 554 1 7 604 7 654 7 704 7 754 1 7 804 j 7 854 j Trp 63 N1H C2H C7H 1 7 904 7 954 8 004 r r 10 90 10 85 10 80 10 75 10 70 10 65 10 60 T T T T T T T 10 55 10 50 10 45 10 40 10 35 10 30 10 25 10 20 10 15 10 10 10 05 ppm Figure 11 6 Comparaison des t che de corr lation correspondant aux atomes d hydrog ne des acides amin s tryptophane du HEWL d termin es lors de deux exp rience NOESY une en absence de complexe de lanthanide en noir l autre en pr sence du complexe Yb DPA 3 en bleu On voit tr s nettement l influence de la fixation du complexe Yb DPA 3 la surface du HEWL sur la position des t ches de corr lation correspondant aux atomes d hydrog ne
92. complexes IRM test s d apr s Stelter 2005 Ce tableau ne r capitule que les modes de fixation ayant t d termin s au cours des travaux de recherche de Meike Stelter ne signifie pas que la prot ine n a pas pu tre r solue l aide du complexe mais indique seulement que le mode de fixation n a pas t d termin 2 1 3 La d tection de la fixation des complexes IRM avant l exp rience de diffrac tion Une des probl matiques laquelle l quipe a toujours voulu r pondre est comment d tecter la fixation des complexes avant l tape de la diffraction L id al serait de pouvoir d tecter la fixation des complexes en solution avant le processus de cristallisation afin de d terminer quel est le meilleur complexe utiliser Dans ce but Meike Stelter a au cours de ces travaux de recherche valu l utilisation de diff rentes m thodes physico chimiques mais aucune n a pu pr tendre au titre de m thode facile 4 mettre en ceuvre pour d tecter la fixation des complexes calorim trie de titrage isotherme r sonance magn tique nucl aire 1 D et 2 D r sonance plasmonique de surface lectrophor se de gels d acrylamide natifs et exp riences de luminescence en solution et dans les cristaux en utilisant le montage exp rimental Cryobench Ursby et al 2002 La plupart des m thodes ont t test es en utilisant le lysozyme de blanc d ceuf de poule comme prot ine mod le et en travaillan
93. conditions tr s similaires celle ci Toutefois travers cette exp rience j ai pu confirmer que tout comme le Ln DPA 3 le com plexe Ln HMTDPA 3l n est pas utilisable en pr sence de fortes concentrations en sel gt 1 M d ions divalents Gar Mg Li ou de MPD gt 25 car il cristallise ou pr cipite dans ces condi tions En outre les cristaux de sel de complexe Ln HMTDPA observ s diff rent de ceux de sel de Ln DPA 3 Le complexe Ln HMTDPA 3 semble former plus facilement un pr cipit cristallin de sel de complexe que de v ritables cristaux 4 2 6 La malate d shydrog nase de Chlorofiezus aurantiacus CaMalDH Pour cette tude cristallographique des complexes Ln TDPA 3 j ai voulu utiliser la malate d shy drog nase de Chloroflerus aurantiacus que nous avons utilis e pour une autre tude d crite dans le se cond chapitre de la seconde partie de ce manuscrit Cette enzyme m a t fournie purifi e et concentr e 20 mg mL par le Dr Dominique Madern membre de notre groupe E L M A 4 2 6 1 Cristallisation de la prot ine native Les conditions de cristallisation utilis es sont inspir es de celles d crites par Dalhus et al 2002 et des observations issues de l exp rience de co cristallisation automatis e d crite dans le pr c dent chapitre Toutes les informations relatives la prot ine et sa cristallisation se trouvent dans le second chapitre de l
94. d autres cristaux d riv s en pr sence de concentrations bien plus le v es de complexe Un tel taux d occupation n a jamais pu tre atteint que ce soit pour le site 1 ou le site 2 Cependant les observations des gouttes de cristallisation issues de ces diff rentes tentatives corr l es avec les diff rentes informations extraites de chacune des tapes menant la construction des mod les affin s nous permettent de proposer un m canisme de fixation pour le complexe Ln HMTDPA 3 2 L ensemble de ces informations sont regroup es dans les tableaux 4 10 et 4 11 suivants 3 me Complexe C 3 3 mM 7 1 mM 10 mM Prot ine P 0 46 mM 0 46 mM 0 70 mM 0 70 mM a7 Tableau 4 10 Faci s cristallins de cristaux d riv s de HEWL par co cristallisation avec diff rentes concentrations de Eu HMTDPA 3 139 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA s3 _ Rapport yg to 7 3 10 8 16 2 10 8 40 M thode d obtention co cristallisation co cristallisation co cristallisation trempage trempage Site loce 70 65 48 0 15 Site 2occ 30 24 47 14 17 Site 1ra pk o 60 85 45 51 30 80 29 08 Site 2ra pk o 23 51 38 13 27 45 27 16 Site 1ra rm o 48 10 73 42 52 64 Site 2ra rm o 16 93 19 72 51 31 Tableau 4 11 M thodes d obtention de cristaux d riv s de HEWL taux d occupation affin s et Fourier an
95. dans les cristaux d riv s par cette m thode Sur l ensemble des jeux de donn es enregistr s partir de cristaux tremp s je n ai vu qu une seule fois un tr s faible pic 11 14 o en Fourier anomale calcul pour un cristal de lysozyme tremp pendant 10 minutes dans une solution contenant 2 7 mM de Eu HECTDPA 3 Seuls des cristaux d riv s de lysozyme de blanc d uf de poule ont pu tre obtenus par co cristallisation Le complexe ne s est jamais fix sur la thaumatine Dans les cristaux d riv s de lysozyme seul le site Trp123 est occup par le complexe 166 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE gt La liaison CH n entre le noyau triazole d un ligand et le tryptophane 123 observ e avec les complexes Ln HMTDPA 3 et Ln HETDPA 3 est syst matiquement remplac e par un empilement rt Compte tenu de nos pr c dentes observations quant l apparition des mauvais cristaux l interaction du complexe Ln HECTDPA 3 avec les acides amin s arginine doit tre beaucoup plus faible qu avec les complexes Ln HMTDPA 3f et Ln HETDPA 3 La charge globale du complexe est neutre Ainsi seules les interactions avec les acides amin s tryptophane sont pr pond rantes Donc m me si ce complexe est ajout plus haute concentration la liaison aux acides amin s arginine n est pas favoris e D une part ceci explique pourquoi je n ai jamais observ de mauva
96. de ce dernier le Ln HMTDPA s ne cristallise pas syst matiquement il pr cipite aussi sous la forme d un pr cipit cristallin opaque et dense Comme le complexe Ln DPA 3 tant charg trois fois n gativement le Ln HMTDPA 3 est toujours accompagn de trois contre ions Ainsi ajout dans la goutte de telles concentrations il fait augmenter tr s fortement la force ionique de la solution ce qui peut expliquer son auto cristallisation dans les milieux fortes concentrations en sels Cependant une des propri t s avantageuses du complexe Ln DPA 3 est conserv e par le Ln HMT DPA 3 et am lior e la possibilit d tre d tect dans les cristaux par luminescence Six sept fois plus luminescent que le Eu Tb DPA s3 en solution et une m me concentration les complexes de Eu Tb HMTDPA 3 sont encore plus facilement d tectables que les Eu Tb DPA 3 En effet la fixation des complexes Eu HMTDPA 3 et Tb HMTDPA 3 dans les cristaux peut tre facilement mise en vidence l aide d une simple lampe ultraviolets de paillasse m me si les complexes ont t 116 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE utilis s une faible concentration initiale Les complexes fluorescent alors respectivement dans le visible du rouge et du vert Notes autant les lamelles en verre silicon es utilis es avec les plaques Hampton laissent passer les UV autant ce n
97. de EGFP Mais ne voyant aucune diff rence sur un gel de polyacrylamide 12 l ensemble des fractions correspondant aux deux pics ont t m lang es Un aliquot de ce m lange syst matiquement t pr lev Cependant afin de mieux s parer ces pics lors de cette tape nous avons essay d tirer le gradient de sel par paliers successifs ou de le modifier mais je n ai jamais r ussi avoir ces deux pics s par s 301 10 2 L ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN DE AEQUOREA VICTORIA AVEGFP Nous avons aussi appliqu le protocole de M Ormo qui pr c de l tape de purification sur colonne Q Sepharose faire passer la solution r sultante du clivage une nouvelle fois sur colonne HisTrap Les tiquettes histidines se retrouvent alors fix es la r sine alors que la prot ine cliv e se retrouve dans le passe tout droit Pour ce faire mon protocole a t le suivant m langer la solution r sultante du clivage avec de la r sine Ni NTA dans un tube Falcon de 15 mL plac sur une roue 4 C Apr s deux heures ce tube a t centrifug 4 C pendant 30 minutes 5000 tpm afin de ne pr lever que le surnageant suppos contenir la prot ine cliv e Malheureusement cette tape suppl mentaire ne m a jamais permis d obtenir de meilleurs r sultats 10 2 2 9 Concentration de la prot ine EGFP purifi e Afin de concentrer la prot ine pour son utilisation dans de futures exp riences de crista
98. de Fourier est d pendant de la r solution des donn es 123 44 D TERMINATION DES PHASES EXP RIMENTALES e b Carte exp rimentale avec mod le affin superpos Figure 4 16 Carte de densit lectronique contour e 1 5 o exp rimentale am lio r e par aplatissement de solvant obtenue partir d un cristal d riv de HEWL avec le Yb HMTDPA 3 R solution 1 35 Phasage SAD hors seuil 0 886 Ces tableaux montrent aussi que le Ln HMTDPA 3 introduit par trempage conduit des phases moins pr cises que lorsqu il est introduit par co cristallisation Tableau 4 6 Comme le montrent les statistiques d int gration les donn es enregistr es partir de ces cristaux d riv s obtenus par trem page sont d excellente qualit Tableau 4 3 page 119 L obtention de cartes de densit lectronique exp rimentales moins interpr tables ne peut donc se justifier par la qualit des donn es enregistr es En trempage les sites des diffuseurs anomaux doivent tre moins peupl s Cette observation coincide 124 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE avec celle issue des cartes de Patterson anomales propos des populations des sites des lanthanides qui semblent varier davantage lorsque les complexes sont introduits par trempage 4 4 2 Evaluation de la qualit des phases d termin es pour la thaumatine de Thau matococcus daniellii Le ta
99. de Picrophilus torridus et la localisation de la boucle catalytique La malate d shydrog nase homot tram rique de Picrophilus torridus est compos e de 1296 acides amin s 4x324 Cette enzyme hyperthermoacidophile a une masse molaire de 140 kDa et l analyse de sa composition donne un point iso lectrique th orique de 5 80 et un coefficient d extinction molaire th orique de 30495 M cm7 M me si ce que je pr sente propos de PtMalDH ne rentre pas tout fait dans le cadre de l tude de l adaptation halophile puisque Picrophilus torridus est un organisme adapt au bas pH cela permet n anmoins de pr senter les nouvelles structures et l information qu elles apportent quant la fonction enzymatique des MalDH A partir des deux conditions de cristallisation possibles obtenues et d crites dans la sous section 7 1 1 page 214 deux types de cristaux de groupe d espace de sym trie quadratique ont pu tre obtenus conduisant l obtention de deux mod les diff rents 7 2 2 1 Int gration des donn es de diffraction Par la m thode SIRAS nous avons r solu la structure du dim re A D de PtMalDH Pour cette m thode nous avons utilis un jeu de donn es anomal enregistr partir d un cristal d riv co cristallis avec le complexe GdHPDO3A et un jeu de donn es enregistr partir d un cristal natif Je pr cise pour la suite que ces cristaux ont t obtenus dans une condition de cristallisation
100. de trempage et de juger un peu mieux de l encombrement st rique des sites de fixation du complexe Compar celui du lysozyme cf chapitre pr c dent l empilement cristallin d un cristal de thaumatine de Thaumatococcus daniellii avec 47 de solvant dans l unit asym trique laisse la place n cessaire la fixation d un complexe de lanthanide plus volumineux tel le TO TNTPA Figures 5 11 a Premi re orientation b Seconde orientation rotation de 90 Figure 5 11 Vue g n rale de empilement cristallin d un cristal d riv de TATHAU avec le complexe TbTNTPA Les mol cules de prot ines sont en vert les complexes occupant les sites 1 sont en orange et les complexes occupant les sites 2 en violet 5 4 R sultats obtenus avec la CaMalDH On obtient des cristaux d riv s de CaMalDH par trempage dans une solution contenant 60 mM de TbTNTPA et en pr sence de 40 mM de chlorure de cadmium sans difficult Aucune fixation du complexe LnTNTPA la surface de CaMalDH n a t d tect e Toutefois cette exp rience a mis en vidence la stabilit du LnTNTPA dans une solution contenant 40 mM d ions divalents Dans ces conditions de cristallisation les autres complexes de la grande famille des picolinates auraient t d stabilis s et nous aurions observ la formation de cristaux de sels de complexe 5 5 Conclusion Le LnTNTPA est un complexe qui peut tre utilis dans n importe quelle condition En ef
101. description ainsi que son protocole de production et de purification seront donn s en annexe 4 2 4 1 Cristallisation de la prot ine native Malgr tout le soin apport aux tentatives de reproduction des exp riences de cristallisation d crites dans la litterature Orm6 et al 1996 Elsliger et al 1999 Rosenow et al 2004 et malgr les v rifications idoines quant l int grit de la prot ine cf annexes aucune d elles n a conduit une cristallisation reproductible de la prot ine C est en menant l exp rience de co cristallisation automatis e l aide du robot de cristallisation nanogoutte de l EMBL d crite dans le chapitre pr c dent que nous avons pu d terminer une nouvelle condition de cristallisation pour l AvEGFP Figure 4 13 70 75 MPD 100 mM HEPES pH 7 9 P 20 mg mL7 Goutte 2 pL P 2 pL R T 293 K 20 C 7 10 jours Cryo protection la liqueur m re est d j cryo protectante a Cristaux natifs b Conditions de cristallisation et de cryo protection d EGFP 575x250 pm Figure 4 13 Cristallisation et cryo protection de l EGFP 4 2 4 2 Obtention de cristaux d riv s Les essais de co cristallisation et de trempage avec le Ln HMTDPA 3 se sont tous r v l s infruc tueux D s l ajout du complexe dans une telle concentration en MPD un pr cipit cristallin se forme Ainsi tout comme le tris dipicolinate de lantha
102. diffraction forme le r seau r ciproque dans l espace r ciproque abstrait et correspond la transform e de Fourier du r seau cristallin qui lui se trouve dans l espace r el On assigne chaque r flexion un point particulier du r seau r ciproque l aide de trois indices h k 1 nomm s indices de Miller La mesure de l intensit Z hkl de chacune de ces r flexions permet de d terminer l amplitude de londe diffract e dans la direction correspondante puisque l intensit est proportionnelle au carr de l amplitude Or pour calculer la densit lectronique partir de ces mesures il faut conna tre non seulement l amplitude de l ensemble des ondes diffract es mais aussi leur d phasage par rapport au rayonnement incident Cela revient conna tre pour la r flexion consid r e l amplitude complexe de chacune des ondes diffract es Cette amplitude complexe transform e de Fourier de la densit lectro nique est appel e facteur de structure F hkl Pour les r flexions hkl h l intensit h est donc proportionnelle au carr du module de facteur de structure F h I h F h F h F h o F h est le complexe conjugu Le facteur de structure F h de l atome j de coordonn es r duites x xj yj Zj l int rieur de la maille se d crit par F h gt fj exp i27h xj j o j varie de mani re d crire l ensemble des atomes de la maille crist
103. directe des ions Binnemans and Gorller Walrand 1995 Pour des ions lanthanide en solution aqueuse le rendement de luminescence est tr s faible Les mol cules d eau de la premi re sph re de coordination donnent lieu la d sexcitation par voie non radiative des tats excit s par couplage vibronique des tats vibrationnels des liaisons O H et N H La liaison des mol cules d eau entra ne galement un fort raccourcissement de la dur e de vie de la luminescence De tous les ions lanthanide seuls les ions Eu Tb Gd Ce3 Dy et Sm sont luminescents de mani re significative en solution aqueuse et temp rature ambiante Horrocks 1993 Seuls l euro pium et le terbium pr sentent respectivement des raies d absorption et d mission dans le domaine de l ultraviolet et du visible La faiblesse des coefficients d absorption des lanthanides est g n ralement contourn e en coordonnant Vion avec un ligand qui contient un chromophore Le chromophore qui sert d antenne absorbe de la lumi re et transf re de l nergie sur l ion qui luminesce Le ligand sert galement exclure des mol cules de solvant de la sph re de coordination de Vion ce qui emp che la d sexcitation non radiative de Vion En augmentant ainsi l absorption de lumi re et le rendement de luminescence on obtient un signal fortement amplifi qui permet de d tecter facilement le complexe lanthanide antenne luminescent 66 C
104. du Eu reste important f de 30 e pour le Eu et 4 e7 pour le Gd On voit ici trois pics intenses en Fourier anomale au seuil du gadolinium prouvant la fixation majoritaire du complexe GGHPDO3A Tableau 4 28 Encore une fois bien que des cristaux de thaumatine co cristallis s avec cette combinatoire aient t obtenus aucun des traitements de donn es r alis s n a permis de d tecter la fixation d un des diffuseurs anomaux 177 4 7 LE LN HMTDPA s UN COMPLEXE MODULABLE LA COMBINATOIRE oe staux obte i a des cristaux de re pee 180 x 180 _ LDC iy Tableau 4 27 R capitulatif des r sultats obten c les combinatoires 6 et 7 178 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Complexe j Se placer au seuil d absorption combin cr 1 Eu HMTDPA Lidu Eu 1 774 teint 1 Eu HMTDPA attendu 16 GGHPDO3A partiellement le signal anomal 16 GGHPDO3A du Gd seuil d absorption Lin C Es But recherch Comp tition de site du Gg 100 Fant x Comp tition de site seuil d absorption Lidu Gd HEWL le signal anomal du Eu et du TATHAI T i 7 Gd est d t ct alors qwau seuil an D pend de la comp tition d absorption Ldu Eu seul le D pend de la comp tition Methode signal anomal du Eu est d t ct A co cristallisation ke Weetf 4e co cristallisation d obtention Eux Gad Gdy Eu Cristaux obtenus au faci s identiq
105. entre la fonction acide des ligands dipicolinates et la fonction amine des acides amin s arginine et lysine par exemple ou liaisons ioniques entre l ion lanthanide et le groupement acide des acides amin s aspartate et glutamate dans le cas du GdDO3A Mais tous ces groupements fonctionnels ionisables ont un pKa en solution de 3 90 pour la fonction acide de la chaine lat rale des aspartates 4 30 pour la fonction acide de la chaine lat rale des glutamates 10 54 pour la fonction amine de la chaine lat rale des lysines et 12 48 pour la fonction amine tertiaire de la chaine lat rale des arginines Bien qu il puisse y avoir une distinction entre le pKa de ces fonctions et le pKa local mesur sur un groupe d acides amin s couvrant une zone donn e la protonation de ces acides amin s est toujours d pendante du pH de la solution tampon utilis e dans les conditions de cristallisation De fait la fixation des complexes doit tre d pendante de cette protonation L influence du pH pourrait par exemple expliquer l absence totale de fixation du complexe GdDO3A sur enzyme PtMalDH Les essais d obtention de cristaux d riv s par co cristallisation ont t r alis s avec une solution tampon d acide citrique pH 3 5 D une part ce pH tous les groupements acides des aspartates et des glutamates sont proton s D autre part le complexe LnDO3A est le seul complexe qui se fixe aux surfaces prot iques non par son ligand mais par
106. est pour cela que nous avons toujours pr t attention a la r solution pour laquelle acen sharp dans les tableaux la valeur du FOM calcul pour les r flexions phase non contrainte FOM tait peu pr s gale 0 5 Cela nous a permis de savoir jusqu quelle r solution il tait possible d obtenir des phases suffisamment pr cises pour anticiper le succ s ou non du phasage Dans le cas d un phasage MAD nous nous sommes aussi r f r s la valeur du Facteur de Qualit cen sharp gt dans les tableaux Sa valeur refl te la calcul e pour les r flexions 4 phase contrainte FOM contribution des atomes lourds vis vis de la quantit totale d atomes qui composent la prot ine Cela 40 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE permet d avoir une id e du taux d occupation du diffuseur anomal dans le cristal d riv donc d avoir une estimation de la quantit d atomes lourds fix s ou d une certaine mani re du taux d occupation de n Ios A e d ces atomes Ici les facteurs f et f n interviennent pas seules sont compar es la quantit d lectrons qui composent la prot ine avec celle des atomes lourds 1 2 4 6 Evaluation de la qualit des phases exp rimentales am lior es par SOLOMON Les programmes d aplatissement de solvant permettent d am liorer les phases pr c demment calcu l es Des indicateurs statistiq
107. est quand lui plac sur l axe de sym trie sa densit lectronique est quasiment invisible contrairement aux deux autres ligands voir Figure 4 30 Au beau milieu de la cavit seule sa fonction hydroxyle semble tablir une liaison hydrog ne avec le O H de Vacide amin Thr150 via une mol cule d eau Figure 4 33 Dans le cas de la thaumatine les fonctions hydroxymethyles des ligands sont toujours orient es vers le solvant au c ur de la poche gt R 150 2 Figure 4 33 Mode de fixation du troisi me ligand du complexe Ln HMTDPA 3 la sur face de TdTHAU Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose saumon 145 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE L interaction du Ln HMTDPA 3 avec la thaumatine se situe dans le m me site que celui observ pour le Ln DPA 3 savoir une cavit form e par l empilement cristallin et charg e positivement du au fait de la pr sence de nombreux acides amin s arginine Il y a donc dans le cas de cette prot ine mod le une interaction de type Ln DPA 3 Ceci est d au fait qu il n y a pas de tryptophane disponible en surface de la prot ine Le complexe Ln HMTDPA se fixe alors via son mode de fixation secondaire les liaisons hydrog nes avec les acides amin s donneurs de protons 4 6 Le Ln HMTDPA un complexe modulable Tout com
108. et la longueur d onde correspondant au seuil Lzzz de l europium ou du gadolinium la r solution impos e n est plus que de dyesg 1 93 gt De plus f ne d croissant que lentement pour lt Aseuil courte longueur d onde le coefficient de diffusion anomale reste une valeur de f 7 permettant de d celer un signal anomal suffisant J ai aussi pu utiliser ce signal anomal plus faible cette longueur d onde pour valuer le pouvoir phasant des diff rents complexes en essayant de phaser par la m thode SAD avec ce seul jeu de donn es Cela me permettait d avoir une id e pr liminaire du taux de fixation des complexes dans les cristaux d riv s gt Enfin il s agit de la longueur d onde pour laquelle la plupart des lignes de bio cristallographie sont optimis es Le faisceau est plus stable et brillant ce qui me permet de diminuer le temps de pose par clich de diffraction et donc de gagner du temps sur l ensemble de l enregistrement Sur BM30A je n ai jamais utilis le positionnement automatique des appareils pour avoir acc s aux seuils d int r t Pour d terminer la longueur d onde exacte du pic d absorption nous avons enregistr un spectre de fluorescence autour du seuil d absorption en pla ant une boucle contenant la solution du complexe sur la t te goniom trique et nous avons utilis le compteur MCA Roentec et le logiciel de contr le la suite XNemo install s sur la li
109. et un maximum d mission la longueur d onde 504 nm qui la rend ais ment identifiabl e avec un spectrophotom tre D crite pour la premi re fois en 1962 elle est actuellement souvent utilis e en tant que prot ine de fusion dans le but de suivre l extraction et la purification d une prot ine cible ou l expression de cette 295 10 2 L ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN DE AEQUOREA VICTORIA AVEGFP derni re dans son environnement naturel la cellule vivante Cette technique n cessite au pr alable Vintroduction du g ne recombinant codant la prot ine tudier joint celui de la GFP On doit la premi re structure de la GFP naturelle M Ormo et S J Remington en 1996 obtenue une r solution de 1 90 par diffraction des rayons X Depuis plusieurs variantes de la GFP ont pu tre obtenue par mutagen se dirig e pour modifier leur propri t s de fluorescence fluorescence dans le cyan le bleu ou le jaune ou leur stabilit en solution Lors de ce travail de th se nous avons utilis une de ces variantes la Enhanced Green Fluorescent Protein ou EGFP Constitu e de 238 acides amin s pour un poids mol culaire de 26 8 kDa et un point iso lectrique th orique de 5 58 cette prot ine modifi e contient les mutations F64L et S65T qui jouxtant le chromophore provoquent le d calage du deuxi me maximum d absorption 488 nm et augmente l mission de fluorescence de la prot ine Un
110. exp rience de dif fraction ren nt DER UN embed AM do tue pee BIS Ate RO UT 74 2 2 3 Etat de nos connaissances sur le mode de fixation du complexe Ln DPA 3 75 Prot ines de structures inconnues d termin es jusqu alors l aide des complexes de lan GHATITAOS LOU TES RAR SR Ne tn ey es ls 1G Moat er telesales fe HU 76 II De nouveaux outils pour la d termination de la structure de macromol cules biologiques la grande famille des complexes picolinates de lanthanide lumines cents 79 3 Le tris dipicolinate de lanthanide agent de nucl ation 83 3 1 Mise en place de l exp rience de co cristallisation automatis e 84 3 1 1 Choix des prot ines mod les 84 3 1 2 Choix des conditions de co cristallisation 84 3 1 3 Mat riel amp m thodes 85 3 1 3 1 Composition des chantillons 85 3 1 3 2 Observations des plaques 86 3 1 3 3 Contr le de la luminescence dans les gouttes 86 3 1 4 La d marche retenue pour l analyse statistique des exp riences de co cristallisation 87 3 2 Les observations issues de l exp rience de co cristallisation automatis e avec le Eu DPA 3 89 3 2 1 Co cristallisation de la prot ine EcAcrB avec le complexe Eu DPA 3 gt 90 3 2 2 Co cristallisation de la prot ine AVEGFP avec le complexe Eu DPA 3
111. faci s cristallin dans la goutte En conclusion seuls les modules prot ine complexe s de composition et de forme qui conviennent pour constituer un empilement cristallin vont tre naturellement s lectionn s dans la goutte pour former un ou plusieurs cristaux d riv s Ainsi seuls seront s lectionn s les modules prot ine complexe s compatible avec l empilement cristallin tenant compte des deux sites de liaison Trp123 Trp62 dans la poche de fixation C est pour cette raison qu on observe une alternance des modules prot ine complexes dans la figure repr sentant l empilement cristallin Figure 4 26 page 137 et que les valeurs des taux d occupation estim es sur l ensemble du cristal se compl tent Cette analyse confirme que dans le cas du HEWL la liaison aux acides amin s arginine et lysine est responsable de l effet supramol culaire des complexes dipicolinates 141 45 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 3 5 A 4T Poche de Figure 4 29 Mod le propos pour expliquer l effet supramol culaire qui conduit aux mauvais cristaux de HEWL avec le complexe Ln HMTDPA 3 compar celui qui conduit aux cristaux monocliniques de HEWL avec le Ln DPA 3 La tr s forte affinit du Ln HMTDPA 3 pour la prot ine HEWL permet de peupler aussi ces deux sites de fixation Trp62 et Trp123 par une exp rience de trempage Mais la compacit de l
112. fait en deux temps entre 13 c a d 33 mM d imidazole et 86 d imidazole Deux pics ont donc toujours t visibles sur les graphiques d lution Comme les fractions m lang es de ces deux pics m ont permis d obtenir des cristaux de EGFP suite la premi re exp rience de purification je n ai jamais pris le soin de s parer les fractions des deux pics Mais il semble donc qu il y ait deux populations diff rentes de EGFP 3200 3000 2800 f A 2600 2200 2000 1800 1600 4 1200 4 1000 AAAA A A A a Ga NAAA tH ma RARE HA Hifi HARMI 56 nan PAi o sb i 100 180 Figure 10 4 Chromatogramme d lution de l EGFP partir de la colonne d affinit au nickel Courbe bleue suivi de la quantit en prot ine Ayy 280 nm Courbe marron mesure de la conductivit Courbe verte gradient d imidazole Lors de la premi re exp rience de purification la quantit de prot ine fut telle que le d tecteur a t satur lors du lavage de la colonne au tampon A HisTrap J ai donc du r p ter toutes les tapes du protocole afin de ne rien gaspiller Il est aussi noter que purifier la prot ine EGFP est simple et ludique En effet d une part le passage de la prot ine est visible lumi re ambiante dans la colonne 300 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES et les tubulures et d autre part si on dispose d un appareil AKTA muni d un
113. fermeture est F PHi FPHi 2 F Hi sin y Si les donn es et ou l isomorphisme ne sont pas parfaits ou encore si la position des atomes lourds n est pas parfaitement d finie les diff rents cercles ne se croisent pas au m me endroit c est l erreur de fermeture La solution n est alors plus une unique valeur de phase mais une distribution de probabilit s de phases P w que l on mod lise soit avec les coefficients d Hendrickson Lattman soit par le Facteur de Qualit FOM FOM Nous valuons la pr cision des phases exp rimentales l aide du Facteur de Qualit FOM Figure Of Merit mesur chaque tape du phasage pour les r flexions phase non contrainte et phase contrainte Pour un module de facteur de structure suppos connu JET P d et ad BOM PF pp o est la phase et P sa distribution de probabilit Ce Facteur de Qualit est le cosinus de l erreur de phase Les valeurs qu il peut prendre sont donc comprises entre 0 et 1 Plus celle ci est lev e plus la distribution de probabilit des phases est r duite et plus cela traduit la garantie du succ s du phasage En effet pour une phase connue et pr cise on peut dire qu une synth se de Fourier ajoute une valeur de 1 pour une position d un atome donn Une valeur de FOM Sharp 0 5 correspond une erreur de phase de 60 erreur de phase que l on consid re comme acceptable C
114. fois les interactions hydrophobes CH r et 2 1 c est le site qui est peupl de fa on pr f rentielle Cette exp rience de co cristallisation men e avec le complexe Ln HETDPA 3 sur le HEWL confirme qu a priori les modes de fixation pr f r s des complexes Ln TDPA 3 sont bien les in teractions hydrophobes CH r et t n entre leur noyau triazole et le noyau indole des acides amin s tryptophane De plus cette exp rience a permis de confirmer le m canisme de cristallisation que nous avons pr c demment propos et a confirm le r alisme de celui ci Affinement des structures et description du mode de fixation du Eu HETDPA sur TdTHAU Nous avons pu obtenir un mod le affin du complexe Eu HETDPA 3 fix la surface de la prot ine TdTHAU Les indicateurs statistiques relatifs l affinement de ce mod le sont indiqu s dans le tableau 4 18 157 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Eu HETDPA s3 TdTHAU co cristallisation Rapport ee OPE a 2 3 Code RCSB PDB 4BAR R solution A 31 50 1 30 Rwork 13 70 R free 15 55 Nbre de r flexions utilis es 78332 Composition nbre d atomes Prot ine 1592 H20 411 Ions 1 Ligands 60 Res hors Ramachandran 0 Ecarts types globaux Liaisonsy ongueurs A 0 013 Liaisons Angles 1 613 Bmoyen prot ine A 11 77 Bmin prot ine A 5 42 Bmax pr
115. hydroxym thyltria zoledipicolinate HMTDPA Chacun des trois ligands tablit une liaison dative avec atome de lanthanide l aide du doublet de l atome d azote de la pyridine et de celui de l oxyg ne n gativement charg du groupement carboxylate La sph re de coordination de l atome de lanthanide est donc com pl te et la charge globale du complexe est triplement n gative figure 4 1b OH NY a A O SN O O SN O Q Q 0 oon oo Tea AN EA TLF x E wel x 0 Z x O O SN SAD ea N An 0 O N N fo 0 HO a Ln DPA 3 b _ En HMTDPA 3 5 Figure 4 1 Formule d velopp e du complexe tris dipicolinate de lanthanide a et du tris hydroxym thyltriazoledipicolinate de lanthanide b 101 4 1 PRESENTATION DU COMPLEXE LUMINESCENT LN HMTDPA 5 Le Ln HMTDPA 3 est une modification du Ln DPA 3 gt dont la synth se par chimie clic Lewis et al 2002 Chamas et al 2010 et les analyses spectroscopiques reviennent Arnaud Goutier et Lionel Nauton collaborateurs du laboratoire SEESIB l Universit Blaise Pascal de Clermont Ferrand Figure 4 2 o O Eto l DNaEOH Na EtOH OEt DH HCI fe HO C COH HO C CO H cl 1 PCl Sy NaN SE Le ooo 2 MeOH ZA MeO C N CO Me MeO TT CO Me NaOH D ed CLICK noi OMe D ed TX VN Biome ih aaa i N or O O Pi Figure 4 2 Synth se modulable d une s rie de ligands de type triazoledipicolinate par chimie
116. id e de la dynamique d une zone pr cise de la mol cule 11 2 2 Br ve description du protocole retenu Nos travaux ont d abord consist reprendre ceux de Gottfried Otting sur l tude de la fixation du complexe Y DPA 3 sur le HEWL Su XC et al 2009 Nous avons pour cela commenc par reproduire le protocole d crit pour nous placer ensuite dans les m mes conditions En effet utiliser le m me tampon et surtout le m me pH que celui qui a permis de d terminer la structure de la prot ine mod le auparavant est fondamental en RMN Un changement de pH sup rieur 4 0 1 unit de pH n cessiterai de r attribuer 315 11 2 DETECTER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE SUR DES MACROMOLECULES BIOLOGIQUES PAR R SONANCE MAGN TIQUE NUCL AIRE tous les acides amin s soit de re d terminer de la prot ine mod le ce qui n tait pas notre but la structure du lysozyme ayant d j t d termin e par RMN Su XC et al 2009 En premier lieu l exp rience NOESY est r alis e sur un m lange de HEWL avec le complexe Y DPA 3 L Yttrium est utilis car en tant qu atome diamagn tique il ne produit pas de d place ment chimique Cela permet donc de mesurer seulement l influence des ligands du complexe d Yttrium sur les d placements chimiques Cela sert de t moin ou de blanc En second lieu on reproduit la m me exp rience mais avec l atome de lanthanide voulu la place de l Yttrium Par
117. ils se sont av r s tre des cristaux de sel de Eu DPA Figure 3 1 86 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION i a Goutte de gauche EcAcrB goutte de droite EcAcrB Eu DPA 3 lumi re visible a g 1g 3 b Goutte de gauche EcAcrB goutte de droite EcAcrB Eu DPA 3 UV proches Figure 3 1 D tection de cristaux de sels de Eu DPA 3 sous UV proches dans le cadre de l exp rience men e avec EcAcrB Avant cela lors de l observation des photos en ligne j ai aussi pu m aider de trois autres crit res pour discriminer les faux n gatifs des vrais positifs Le complexe est tr s sensible l vaporation ce qui provoque sa cristallisation imm diate en bordure de goutte De plus les cristaux de sel de Ln DPA 3 _ apparaissent tr s rapidement en une nuit avant la premi re observation de la plaque par le dispositif de photographies automatis Enfin dans le cas des prot ines AfUox et PhTET2 12s l observation de la troisi me goutte contenant uniquement le complexe s est r v l un excellent contr le Il m a t alors possible de comparer le profil des cristaux dans les trois gouttes pour mieux diff rencier les cristaux de sel de Ln DPA s3 des ventuels cristaux d riv s 3 1 4 La d marche retenue pour l analyse statistique des exp riences de co cristallisation Pour faciliter la compr hension des r sultats qui von
118. interactions entre un complexe de lanthanide et une prot ine que nous avons tent de r v ler par exp riences au Biacore Apr s chaque passage d un complexe de lanthanide et avant le passage d un autre la puce doit tre r g n r e c a d nettoy e de toute mol cule de complexe de lanthanide fix e ou non aux prot ines Je ne d crirai pas ici les nombreux protocoles de r g n ration de puce d essais de diff rents pH et de diff rentes concentrations en complexe car cela allongerait consid rablement cette annexe 312 CHAPITRE 11 EXPLORATION D AUTRES M THODES POUR R V LER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE AVANT L ETAPE DE DIFFRACTION HEWL CaMalDH HvMalDH TdTHAU AfUOx HMTDPA ligand seul X Eu HMTDPA 3 X Eu DPA 3 X X X X X GdDTPA BMA X X X GdDO3A X xX xX GdHPDO3A x X X X X Figure 11 4 R sum des exp riences men es au Biacore En colonne les prot ines mod les greff es sur la puce En ligne les entit s pass es en flux 11 1 4 R sum tr s succinct des r sultats obtenus Nous n avons pu observer d interaction entre le complexe GADTPA BMA et les prot ines HEWL CaMalDH et HvMalDH Hors gr ce aux exp riences de cristallographie men es au cours de cette th se nous savons que ce complexe se lie la prot ine HvMalDH Il est impossible de mesurer un quelconque signal avec le ligand HMTDPA seul m me sur la piste
119. la goutte de cristallisation pouvant introduire du non isomorphisme c est avec le d veloppement des m thodes SAD et MAD que la co cristallisation trouva son essor Cependant l utilisation de ces sels d atomes lourds n est pas toujours ais e Les sels sont g n ra lement faiblement solubles et instables dans des solutions aqueuses incompatibles avec de nombreuses conditions chimiques de cristallisation souvent mal tol r s par les cristaux de prot ine et hautement toxiques Depuis quatorze ann es les diffuseurs anomaux qui font l objet de nos travaux de recherche sont les atomes de lanthanides Mais nous utilisons des complexes chimiques pour introduire facilement ces diffuseurs anomaux dans les cristaux de prot ines par les m thodes de trempage et de co cristallisation Comme nous avons eu en effet recours ces deux m thodes pour nos travaux nous consignons ici le protocole g n ral que nous avons utilis pour obtenir des cristaux d riv s avec les complexes de lanthanide 1 7 5 Protocole d obtention de cristaux d riv s par trempage et par co cristallisation avec les complexes de lanthanide Obtention de cristaux natifs Toutes les prot ines tudi es lors de cette th se sauf l urate oxidase d Aspergillus flavus ont t cristallis es selon la m thode de la goutte suspendue Figure 1 7 Lamelle silicon e Graisse vide joint Goutte solution prot ique puits prot ine concenin e
120. la thaumatine L ajout d une solution de Eu CTDPA concentr e 4 mM n a pas emp ch la croissance de cristaux de lysozyme de thaumatine ou encore de HvMalDH Mais ce complexe n a jamais permis de mener terme un phasage exp rimental avec ces prot ines M me apr s remplacement mol culaire l absence de densit lectronique pour le ligand ne permet pas de d terminer son propre mode de fixation Dans le cas de l enzyme HvMalDH comme avec les autres complexes de la m me famille aucune fixation n a pu tre d cel e En ce qui concerne le lysozyme et la thaumatine le constat est moins tranch le calcul de synth ses de Fourier anomales a permis de r v ler que ce complexe se fixe Dans le cas du lysozyme seul le site 1 Trp123 s av re en partie peupl par le Eu CTDPA 3 Un premier jeu de donn es enregistr au seuil d absorption Lyrr de europium partir d un cristal obtenu par co cristallisation en pr sence de 1 3 mM de complexe a conduit au calcul d un pic 13 0 o par synth se de Fourier anomale Un second jeu de donn es enregistr au seuil d absorption Lyrr de Veuropium mais partir d un cristal d riv obtenu par trempage dans une liqueur contenant 2 7 mM de complexe a conduit la pr sence d un pic de 22 0 o Cependant au cours des essais de co cristallisation du lysozyme le complexe Eu CTDPA 3 a conduit l obtention d un tr s grand nombre de mauvais cristau
121. large gamme de pH de pH 2 0 11 0 Comme le ligand assure l essentiel de la coordination du lanthanide 6 8 coordinations l affinit lev e du ligand pour le lanthanide conduit des complexes extr mement stables dans des solutions fortement concentr es en sels ou en ions divalents Ces complexes sont donc bien adapt s aux conditions physico chimiques que l on rencontre au cours d exp riences de cristallisation de prot ines 68 CHAPITRE 2 UTILISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE EN BIO CRISTALLOGRAPHIE Comme l indique la figure 2 1 certains de ces complexes ont une charge globale nulle lectrique ment neutre d autres sont charg s n gativement Les valeurs de pKa des complexes tant situ es autour de 2 Bianchi et al 2000 aucune protonation notable n a lieu dans les conditions physico chimiques de cristallisation habituelles Ces complexes sont introduits soit par co cristallisation soit par trempage et s utilisent forte concentration 100 mM sans que cela perturbe la cristallisation ou d t riore les cristaux Girard et al 2003b 2 1 2 Etat de nos connaissances sur le mode de fixation des complexes de lanthanide IRM Dans ce paragraphe je ne ferai pas une liste exhaustive des diff rents modes de fixation de l ensemble des complexes IRM en notre possession mais je me focaliserai sur ceux qui ont t le plus couramment utilis s 2 1 2 1 Le complexe LnHPDO3A pour des in
122. m me proportionnelle la quantit de prot ine permet de mesurer la concentration en prot ines en solution Une gamme talon r alis e avec quatre concentrations de S rum Albumine Bovin 0 0 5 1 2 mg mL auxquelles est ajout le m lange BCA CuSO4 permet de calculer la concentration en fractions membranaires finales Figure 10 6 304 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES Dosage BCA AcrB Gamme BSA Abs 562nm 18 c N in AD S Echantillon 0 6 a 2 Soit 0 73 mg mL lt Non dilu 36 48 mg mL J 0 7566x 0 048 0 0 5 1 1 5 2 2 5 x y 0 048 0 7566 BSA mg mL Figure 10 6 Dosage BCA des fractions membranaires de E Coli Les solutions de la gamme talon et notre chantillon sont mis 37 C pendant 30 minutes La mesure de l absorbance de la solution se fait la longueur d onde 562 nm Dans l exemple ci dessus 12 6 grammes de culots bact riens ont permis d extraire 190 mg de fractions membranaires Pour la suite le rendement tant lev il est possible de ne prendre qu un aliquot de 3 mL de fractions membranaires pour avoir un quantit suffisante de prot ine EcAcrB en fin de purification Ainsi nous avons dilu la solution de fractions membranaires afin d obtenir une solution de 6 33 mL 30 mg mL7 Le tampon C a t utilis pour cette dilution La solution peut tre conserv e 80 C 10 4 2 2 Solubilisation des fractions de membranes cytopla
123. m me site de fixation principal sur chaque monom re de la prot ine soit quatre fois le m me site de fixation Or de par l empilement cristallin le complexe ne se fixe en trempage qu trois de ces quatre sites principaux Le quatri me site est masqu car il est pris dans un contact cristallin a Surface lectrostatique du troisi me site de fixation du b Surface lectrostatique de m me r gion dans un cristal GdDO3A sur HvMalDH Echelle de 3 0 kT e charge n ga natif de HvMalDH Echelle de 3 0 kT e charge n gative tive rouge 3 0 kT e charge positive bleu rouge 3 0 kT e charge positive bleu Figure 7 10 R gion du troisi me site de fixation du GdDO3A dans un cristal d riv de HvMalDH a et dans un cristal natif de HvMalDH b Si cette approche devrait nous mener affiner nos connaissances sur les modes de fixation des com plexes IRM elle a d ja permis de confirmer certains modes de fixation d ja d termin s cf introduction Par exemple r soudre la structure de l enzyme HvMalDH avec le GdDO3A une r solution de 1 85 A permet de confirmer que ce complexe se fixe principalement la prot ine via l atome de lanthanide Figure 7 11 et non via le ligand chimique comme c est le cas avec les complexes GdHPDO3A et GdDTPA BMA cf introduction En effet c est bien la fonction acide de la chaine lat rale des acides amin s aspartates ou glutamates de la prot ine qui p
124. malate and L lactate dehydrogenase super family J Mol Evol 54 825 840 Ebel C Costenaro L Pascu M Faou P Kernel B Proust De Martin F amp Zaccai G 2002 Solvent interactions of halophilic malate dehydrogenase Biochemistry 41 13234 13244 Ebel C Faou P Kernel B amp Zaccai G 1999 The relative role of anions and cations in the stabilization of halophilic malate dehydrogenase Biochemistry 38 9039 9047 Costenaro L Zaccai G amp Ebel C 2002 Link between protein solvent and weak protein protein interactions gives insight into halophilic adaptation Biochemistry 41 13245 13252 Bonnet F Ebel C Zaccai G amp Eisenberg H 1993 Biophysical study of halophilic malate dehydrogenase in solution revised subunit structure and solvent interactions of native and recombinant enzyme J Chem Soc Faraday Trans 89 2659 2666 Irimia A Ebel C Madern D Richard S B Cosenza L W Zaccai G amp Vellieux F M 2003 The oligomeric state of Haloarcula marismortui malate dehydrogenase are modulated by solvent compo nents as shown by crystallographic and biochemical studies J Mol Biol 326 859 873 504 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Dalhus B Saarinen M Sauer U H Eklund P Johansson K Karlsson A et al 2002 Structural basis for thermophilic protein stability structures o
125. moiti des plaques j ai pu r duire le nombre de combinaisons pour mieux classer mes observations Premi rement je suis parti du principe que l observation d un pr cipit prot ique en sus de cristaux natifs dans la goutte est tout fait banal La cat gorie pr cipit prot ique n avait donc pas lieu d tre ajout e et mentionn e dans ce cas Deuxi mement je n ai jamais rencontr ni de pr cipit de Eu DPA 3 ni de pr sence conjointe de cristaux natifs et de cristaux d riv s ni de pr sence conjointe de cristaux d riv s et de cristaux de sel de Eu DPA 3 et encore moins de cristaux natifs de cristaux d riv s et de cristaux de sel de Eu DPA 3 dans une m me goutte Le nombre de conditions qui ne purent tre tudi es cause d un d faut dans l laboration de la goutte par le robot a aussi t value ceci permettant de normaliser les proportions de chaque cat gorie vis vis du nombre total de conditions observables J ai donc pu pour classer mes observations r duire le nombre de cat gories sept goutte claire conditions menant l apparition de cristaux d riv s potentiels conditions menant l apparition de cristaux natifs conditions menant l apparition de cristaux de sel de Eu DPA s3 en pr sence de prot ine conditions dans lesquelles la pr sence de complexe provoque la pr cipitation de la prot ine ou la formation de cristaux natifs co
126. occupation et le facteur d agitation thermique isotrope ou anisotrope des diffuseurs anomaux sont affin s ainsi que le facteur d chelle les carts dus un ventuel non isomorphisme et les parties imaginaires et r elles du facteur de diffusion anomale Apr s avoir d termin un premier jeu de phases le programme peut calculer des cartes r siduelles partir desquelles d ventuels sites anomaux suppl mentaires peuvent tre 38 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE d tect s L information de phase est mod lis e sous la forme des coefficients de Hendrickson et Lattman Hendrickson and Lattman 1970 coefficients qui d crivent la distribution de probabilit s de phases Il est ensuite possible d am liorer ces coefficients d Hendrickson et Lattman par modification de den sit via les programmes d aplatissement de solvant SOLOMON Abrahams and Leslie 1996 et ou DM Cowtan and Main 1996 En s appuyant sur le pourcentage de solvant dans la maille cristalline calcul par le programme TRUNCATE de la suite CC P4 le programme SOLOMON d termine l enveloppe de la prot ine limitant la zone de solvant partir des phases basse r solution Le nivellement de solvant consiste fixer une valeur constante positive la densit lectronique correspondant au solvant La correspondance d histogramme consiste ajuster la distribution des valeurs de la densit lectronique o
127. oligom rique seul un monom re est conserv pour le mod le initial b tous les atomes ne faisant pas partie de la prot ine ainsi que ceux qui constituent toutes les chaines lat rales des acides amin s de la prot ine sont effac s Le mod le r side alors en une seule chaine principale poly alanine 2 Obtention d un jeu de phases par remplacement mol culaire l aide du mod le d crit en 1 et du programme Phaser de la suite CCP a Les param tres utilis s ont t le nombre de mol cules pr sentes dans l unit asym trique et la recherche de la solution la plus haute r solution partir des amplitudes mesur es tant dans le groupe d espace indiqu que dans les groupes d espace nantiomorphes si il y en a En effet pour des cristaux de groupes d espace centrosym triques la question de la main ne se pose pas la configuration tridimensionnelle p riodique des atomes et son inverse conduit au m me profil de diffraction Mais dans le cas de groupes d espace non centrosym triques cela conduit une ambiguit de main Blundell and Johnson 1976 3 Calcul d une carte de densit lectronique gr ce aux phases alors obtenues et reconstruction d un mod le a Am lioration des phases calcul es par Phaser l aide du programme DM de la suite CCP4 Cowtan and Main 1996 en absence de tout mod le Par modification de densit le pro gramme DM affine les phases calcul s pr c
128. partie du signal anomal car f ne d croit que lentement pour lt seuit Tableau 1 1 46 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE El ment Eu Gd Tb Yb Z 63 64 65 70 Seuil Lzz A 1 776 1 711 1 649 1 385 Seuil Lzzz keV 6 981 7 246 7 518 8 951 Frias e7 30 fr 16 ee 11 0 12 0 80 5 0 HME 63 67 71 93 Tableau 1 1 Longueur d onde des seuils d absorption Lyrr des lanthanides utilis s lors de ces travaux de recherches et valeur approximative de la partie imaginaire f de leur facteur de diffusion atomique leur seuil d absorption Ly7 respectif au seuil d mission Ka du cuivre A 1 541 A et au seuil d absorption K du s l nium x 0 979 A Est aussi consign e la valeur approximative de la partie r elle f du facteur de diffusion atomique de ces lanthanides leur seuil d absorption Lyrr respectif 1 4 La brisure de la loi de Friedel En l absence de diffusion anomale la loi de Friedel formule que les r flexions d indices de Miller hkl et hkl sont d intensit gale On consid re que cette loi est respect e pour les mol cules ne contenant que des atomes pour lesquels la contribution anomale est faible puisque dans ce cas on peut n gliger la contribution anomale du facteur de diffusion atomique cas d un cristal natif Dans ces conditions le facteur
129. plaques ont t r cup r es et observ es une nouvelle fois mais sous binoculaire Cette derni re tape m a permis de mettre les plaques sous exposition aux UV proches 315 nm l aide d une lampe UV de paillasse afin de v rifier et d valuer approximativement la luminescence des cristaux pr sents dans les gouttes Cette tape m a permis de discriminer les faux positifs des vrais positifs gt un faux positif est un cristal potentiellement d riv c est dire ayant cr en pr sence de Ln DPA 3l et pr sentant un faci s diff rent de celui d un cristal natif mais qui se r v le tre en fait un cristal de sel de Ln DPA 3 est un cristal ayant pouss en pr sence de Ln DPA 3 pr sentant un faci s gt un vrai positi diff rent de celui d un cristal natif et qui se r v le tre un cristal d riv Contr ler la luminescence des cristaux m me tr s approximativement permet en effet de discriminer ces deux types de cristaux car les cristaux de sel de Eu DPA pr sentent une luminescence bien plus forte dans le visible que les cristaux d riv s Figure 3 1 L exemple ci dessous illustre ce contr le et les fausse joies auxquelles nous avons du faire face Dans le cadre de l exp rience men e avec la prot ine EcAcrB la goutte contenant le complexe droite pouvait laisser pr sager de cristaux d riv s Malheureusement aux vues de leur luminescence
130. pour but de d terminer la pr sence sur la s quence de motifs ad quats la fixation des complexes Pour cela sur la base d une s quence prot ique nous pourrons l aide de programmes de d termination de structures secondaires d terminer les secteurs pr sentant le plus de chance d accueillir tel ou tel complexe boucle par exemple Puis au sein de ces secteurs v rifier la pr sence des r sidus propices l interaction et enfin appliquer une p nalit li e aux conditions de cristallisation Comme r sum sur la figure 8 5 nous pourrons ainsi estimer quel est le complexe le plus propice pour d terminer la structure de la prot ine 287 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES MRKKISIIGAGFVGSTTAHWLAAKELGDIVLLDIVEGVPQGKALDLYEASPIEGF MREK 1 S11 GAGFVGSTTAHWLAAKELGD V LDIVEGVPQGKALDLYEASPIEGF Vy MRKK IE 11GAGFVGSTTAHWLAAKELGD DIVEGVPQGKALDLY 45PIEGF SNV LnHPDO3A LnHPDO3A Conditions de cristallisation Figure 8 5 Le but atteindre pouvoir choisir le meilleur complexe en fonction de la prot ine tudier En ce qui concerne la compr hension de l effet supramol culaire observ dans le cas du complexe Ln DPA 3l l tude que nous venons d entreprendre en comparant les structures des prot ines HEWL et TEWL auxquelles le complexe Ln DPA 3 s est fix pourra apporter un nouvel clairage Cette tude pourra tre combin e aux r sultats obtenus sur la combinatoire des ligan
131. pour cette tude Les jeux de donn es anomales relatifs CaMalDH ont t enregistr es au seuil d absorption Ka du cuivre 216 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES 7 1 3 Etude de la fixation du GdHPDO3A sur trois MalDH Pour illustrer la preuve de concept de cette approche je pr sente ici les premiers r sultats obtenus suite une tude cristallographique comparative men e sur les trois MalDH pr cit es CaMalDH PtMalDH et HvMalDH Suite l obtention de cristaux d riv s potentiels nous avons syst matiquement compar les r sultats obtenus avec le complexe GdHPDO3A et les trois MalDH chacune des tapes menant la construction et l affinement du mod le 7 1 3 1 L obtention de cristaux d riv s avec le complexe GdHPDO3A Nous avons d j constat des diff rences au niveau de l obtention de cristaux d riv s en pr sence du complexe GdHPDO3A Introduit en co cristallisation avec les prot ines CaMalDH et HvMalDH le complexe a emp ch toute nucl ation Nous avons pu cependant obtenir des cristaux d riv s de ces prot ines par trempage de 3 secondes avec CaMalDH et 10 minutes avec HvMalDH Seule la prot ine PtMalDH a pu tre co cristallis e avec le complexe 7 1 3 2 Int gration des donn es de diffraction issues des cristaux d riv s de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH Le but de cette tude tant l obtention d informations pr cises sur le mode
132. prot ine EGFP obtenue apr s clivage Une exp rience de biologie mol culaire 4 m me t intent e afin d obtenir une autre construction pour l tiquette histidine en extr mit N terminale de la prot ine Le but tait de cr er un site de cli vage pour une enzyme bien plus sp cifique que a chymotrypsine qui pour rappel coupe une cha ne polypeptidique apr s chaque acides amin s aromatiques accessibles Mais par manque de temps les pre mi res exp riences d amplification d ADN par PCR n ayant pas donn des quantit s d ADN facilement exploitables nous avons choisi de continuer les exp riences avec la construction du Dr Philippe Oger 10 2 2 Production et purification de l AvEGFP Le protocole de production et de purification a t adapt de celui de R M Wachter mais celui de M Orm s est aussi av r parfaitement fonctionnel 297 10 2 L ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN DE AEQUOREA VICTORIA AVEGFP Toutes les valeurs de concentration en prot ine qui vont suivre ont t calcul es avec le coefficient d extinction molaire th orique de l EGFP 488 nm soit e4ggnm 63000 M cm7 Toutes les valeurs de densit optique DO mentionn es ici ont t mesur e 600 nm Obtenir la prot ine purifi e et concentr e par le protocole qui va suivre requiert trois jours pleins au minimum et se fait int gralement 4 C Il faut pr voir de r server un incubateur 37
133. prot ines o aucune fixation n est observ e ce qui indique des modulations dont les causes ne sont pas encore bien comprises Ce constat est encore plus vrai pour les autres complexes IRM test s Bien qu ils aient permis de r soudre un certain nombre de structures leur mode de fixation varie d une prot ine l autre et il a toujours t souvent d licat d expliquer la fixation ou l absence de fixation de ces complexes Au cours de ses travaux de recherche Meike Stelter a r alis une tude syst matique de 7 complexes IRM sur 11 prot ines diff rentes Les structures de ces prot ines ont pu tre r solues par phasage exp rimental avec ces complexes Dans ce paragraphe je dresse le bilan des observations de Meike Stelter Le LnDO3A a permis de phaser 7 structures sur 8 prot ines test es le LnHPDO3A 5 sur 9 test es le LnDTPABMA 4 sur 9 prot ines test es et le LnDOTA BOM 4 sur 5 prot ines test es Le complexe LnDO3A s est donc montr le plus universel L tude du mode de fixation de ces complexes a r v l qu aucune relation directe n apparait entre les conditions physico chimiques pH pr cipitant point iso lectrique de la prot ine et une ventuelle fixation privil gi e d un complexe particulier De mani re g n rale la fixation des complexes engendre peu de changement au niveau de la structure prot ique des param tres de maille et de la forme cristalline Pour certains d riv s la liaison
134. rement stable Dans le cas de nos complexes de lanthanide cette constance dans la g om trie de coordination des lanthanides peut donc expliquer pourquoi les raies blanches observ es aux seuils d absorption Lyrr ne varient que tr s peu selon le complexe tudi ainsi le calcul des valeurs de f et f peut se faire soit partir d une solution contenant l atome consid r soit avec le cristal d riv le contenant La plupart des lignes de lumi re d di es la biocristallographie disposant d un monochromateur accordable propose un acc s des longueurs d onde de rayons X variant entre 0 7 et 2 0 La figure 1 5 montre l volution de la longueur d onde des seuils d absorption K L et M en fonction du num ro atomique Z des l ments du tableau p riodique On voit que les seuils K des l ments l gers situ s entre 45 1 3 LA DIFFUSION ANOMALE le mangan se Mn Z 25 et l yttrium Y Z 39 sont facilement accessibles A 1 89 0 73 Les seuils d absorption L des l ments situ s entre le samarium Sm Z 62 et uranium U Z 92 sont galement facilement accessibles A 1 85 0 72 A EN Longueur d onde 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 l Pre 71 76 81 86 91 Num ro atomique Figure 1 5 Seuils d absorption K L et M pour les l ments stables du tableau p riodique D apr s Chesne 2002 Ces l ments sont donc potentiellement int ressants pour la d termination de
135. s observ es Ces relations mettent en oeuvre les facteurs de structure normalis s E hkl Ce sont des nombres complexes calcul s en divisant les facteurs de structure F hkl par la racine carr e de l intensit moyenne intensit qui serait obtenue une r solution donn e si les atomes taient distribu s au hasard dans la maille Les relations de phases les plus fortes sont obtenues entre les r flexions ayant les valeurs les plus lev es pour le module du facteur de structure normalis E hkl Bricogne 1988 La valeur th orique maximale que peut prendre le module du facteur de structure normalis est proportionnelle la racine carr e du nombre d atomes dans la maille Cette valeur serait obtenue si les contributions au facteur de structure des atomes de la maille taient toutes en phase pour la r flexion hkl consid r e La probabilit d un tel v nement d cro t tr s rapidement avec le nombre d atomes dans la maille Aussi les relations entre phases s amenuisent lorsque le nombre d atomes dans la maille augmente C est pour ces raisons que l utilisation de ces m thodes est limit e la d termination de structures de petites mol cules Ces m thodes directes sont presque toujours utilis es pour r soudre la structure de petites mol cules constitu es de quelques centaines d atomes On peut aussi les exploiter pour d terminer la structure de macromol cules biologiques sans atome lourd mais cela re
136. sodium ait t ajout dans le but de stabiliser la prot ine en solution et pour ventuellement modifier la croissance des futurs cristaux aucun effet particulier n a pu tre constat suite cet ajout 275 8 3 BREF R SUM DES DIVERSES TENTATIVES D AMELIORATION 8 3 2 R sum des tentatives d am lioration des conditions de cristallisation et d lit de faci s cristallin En plus de la condition de cristallisation transmise par le Dr Aur lien Deniaud et C line Julian Binard d crite ci dessus j ai pu disposer de six conditions suppl mentaires publi es partir desquelles de nouvelles conditions ont pu tre labor es Pos and Diederichs 2002 Purdy et al 2002 Yu et al 2003 Pos et al 2004 Seeger et al 2006 Tornroth Horsefield et al 2007 De plus dans son second papier relatif EcAcrB Klaas M Pos pr cise que ce ne sont pas forc ment les cristaux de plus grandes tailles qui pr sentent le meilleur profil de diffraction mais les petits Pos et al 2004 J ai pu obtenir des cristaux natifs d EcAcrB en croisant des conditions de cristallisation pouvant contenir sept gammes de pr cipitant diff rentes PEG 400 PEG 1500 PEG 2000 PEG 2000 MME PEG 3350 PEG 4000 PEG 6000 et glyc rol quatre tampons diff rents citrate de sodium pH 5 6 phospate de sodium pH 6 2 HEPES pH 7 0 et Tris HCl pH 8 0 trois gammes de sel diff rentes chlorure de sodium sulfate d ammonium et sulfate de
137. sous stoechiom trie par rapport la prot ine dans le cristal Cette m thode de calcul n cessite donc de pr ter attention d une part aux dimensions des cristaux utilis s pour le trempage et d autre part au volume de la goutte de trempage Cryoprotection des cristaux Lors de leur exposition aux rayons X durs les cristaux subissent des d g ts d irradiation qui les d gradent au cours du temps A l origine les d g ts d irradiation sont dus Vabsorption des rayons X par la mati re arrachant des lectrons aux atomes c est l ionisation primaire Certaines liaisons chimiques comme les ponts disulfure se retrouvent bris es Aussi des radicaux libres peuvent se former et diffuser dans le cristal temp rature ambiante les radicaux ainsi form s sont l origine de r actions radicalaires en cha ne qui d gradent certains acides amin s Garman 2010 Le fait de travailler temp rature cryog nique r duit la diffusion des radicaux et limite ainsi les d g ts associ s Pour congeler les cristaux il convient de choisir un cryoprotectant qui ne d grade pas les cristaux et qui assure une vitrification suffisante On choisi le cryoprotectant en fonction de la liqueur m re dans laquelle sont apparus les cristaux Par exemple pour des cristaux apparus dans une liqueur m re contenant du PEG le PEG 400 l thyl ne glycol ou le glyc rol sont des cryoprotectants de choix Dans le cas de cristaux obtenus en pr senc
138. suffisante du complexe sont variables car elles d pendent de la solubilit du complexe et des ventuelles d gradations constat es sur les cristaux natifs Tous nos trempages dans la liqueur contenant les com plexes de lanthanide ont t suivis d un second trempage dans une m me solution mais sans complexe c est le back soak Garman and Murray 2003 avant l tape de cryo protection La co cristallisation consiste faire cro tre un cristal de prot ine en pr sence du complexe Nous avons essay d introduire les complexes diff rentes concentrations par co cristallisation avec toutes les prot ines mod les disponibles et selon deux m thodes distinctes 1 en ajoutant un volume de solution concentr e en complexe sur la goutte de cristallisation d j constitu e d un volume de solution de prot ine et d un volume de solution de cristallisation D s l ajout de ce volume to la prot ine ainsi que les agents pr cipitants subissent le m me facteur J q P P 62 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE de dilution Leur concentration to est donc calculable contrairement celle atteinte une fois la goutte l quilibre bien plus difficile valuer 2 en dissolvant au pr alable la prot ine avec la solution de complexe dans le cas des prot ines lyophi lis es lysozyme et thaumatine ou des prot ines stables haute concentration eGFP MalDH
139. the salt concentration dependent stability of the Hm enzyme compare positions equivalent to those of Hm chloride binding site no 1 four sites per tetramer top row Hm chloride binding site no 2 four sites per tetramer middle row and Hm cation binding site two sites per tetramer bottom row The monomers are colored according to Fig 1 At the positions equivalent to two different inter subunit chloride binding sites CB1 and CB2 of Hm MalDH between monomers A and D Sr MalDH does not contain ions and is more similar to its non halophilic orthologs from Tt and Ca which also lack bound ions Fig 2 According to structural criteria ion ligand distances and opposing negative charges a sodium ion was identified in Hm MalDH between monomers A and B The same location in Sr MalDH is occupied by hydrophobic amino acids suggesting that the cation binding site is absent Fig 2 As lithium chloride a non physiological salt was a constituent of the crystal lization solutions used with Sr MalDH a careful inspection of the solvent structure was conducted to detect these ions Non protein positive peaks larger than 3 in difference Fourier maps were modeled as water molecules Due to the larger number of electrons for Cl 17 versus water 10 large positive peaks would be expected in the difference Fourier maps if chloride ions were bound to the protein Moreover a water molecule modeled in place of a chlorid
140. une ventuelle incorporation dans les cris taux avait d j merg e lors des travaux de recherche de Marie Laure Chesne La premi re approche qu elle avait entreprise s appuyait alors sur des colorants utilis s dans l industrie textile Ces mol cules color es sont capables de fixer un ion uranyle propri t int ressante puisque l uranium pr sente une diffusion anomale encore plus importante que les lanthanides Malheureusement l introdution de telles mol cules dans les cristaux s est av r e assez difficile m me si l une d entre elles a permis la d termi nation de la paroxonase humaine Contreras Martel et al 2006 Morales et al 2006 Toutefois cette approche a ouvert la voie la recherche de nouvelles mol cules facilement d tectables voie qui a conduit la synth se du complexe tris dipicolinate de lanthanide ou Ln DPA 3 qui fit l objet des travaux de recherche de Guillaume Pompidor 2 2 1 Pr sentation Le complexe tris dipicolinate de lanthanide est form de trois ligands dissoci s qui compl tent la premi re sph re de coordination du lanthanide ch lat Ces trois ligands sont des acides dipicoliniques ou dipicolinate pyridine 2 6 dicarboxylate DPA De par les deux fonctions acides que porte chaque ligand dipicolinate ce complexe non cag est trois fois n gativement charg Figure 2 4 Son poids mol culaire th orique sans atome de lanthanide est de 636 34 g mo
141. une premi re fois dans une solution identique celle du puits avec 5 de glyc rol Ce m me cristal est ensuite tremp dans la solution cryo protectrice finale de m me composition que la pr c dente mais avec 30 de glyc rol Dans le cas o les cristaux ne supportaient pas cet cart de concentration en glyc rol j ai proc d de la m me fa on mais en multipliant les trempages interm diaires par pas de 5 de glyc rol Les temps de trempage varient de 2 5 minutes Observ s sous binoculaire les cristaux d EcAcrB semblent bien supporter l une ou l autre m thode 8 3 Bref r sum des diverses tentatives d am lioration Malheureusement aucun de ces cristaux au faci s engageant n a jamais diffract une r solution sup rieure 6 5 Apr s un certain nombre d essais je me suis d abord tourn vers la modification de l tape de cryo prot ction tape la plus d licate pouvant engendrer ces profils de diffraction inutiles notre tude Nous disposions l poque du g n rateur de rayons X de laboratoire pour tester rapidement l effet des diff rentes modifications apport es au protocole de cryo protection Devant l absence d am lioration je me suis alors concentr sur la cristallisation de la prot ine pour remonter ensuite l tape de purification Sans apporter de modification au protocole de production de la prot ine EcAcrB L issue de cette tude n ayant pas t un succ
142. was only partial as the sequence and three dimensional structure remained unknown at that time In the present study we report the crystal structure of the enzyme at a resolution of 1 55 A and analyze the solution behavior in different salt conditions In addition we extend and enhance this characteriza tion by including two other non halophilic counter parts Our comparative work indicates that the Sr MalDH corresponds to a newly described acclima tion state of an enzyme adapting to high salt conditions Results Comparison strategy We explored the effects of KCl on i the conformational stability ii weak protein protein interactions that control solubility and iii enzy matic activities of the various halophilic and non halophilic homologs from the LDH and LDH MalDH superfamily We analyzed the data with respect to the available structural information including consideration of the structural features previously described as important for halophilic adaptation Fig 1 The halophilic LDH like MalDHs were from the bacterium Sr and the archaeon Hm while the non halophilic enzymes were the bacteria Chloroflexus aurantiacus Ca LDH like MalDH and Thermus thermophilus Tt LDH Crystal structure of Sr MalDH The structure of Sr MalDH enzyme was deter mined at 1 55 A resolution using molecular replace ment Table 1 The asymmetric unit contains a 314 residue monomer with the physiological tetramer obeying the c
143. water binding capacity is comparable to that of a non halophilic protein 7 With a solvation shell similar to bulk solvent the protein can remain soluble in high salt concentrations At low salt concentrations below 2 M KCl the Hm MalDH enzyme dissociates and unfolds The stability of Hm MalDH depends on the types and concentrations of cations and anions present in the buffer Anions appear to control stability via a few strong binding sites whereas cations play a dual role through both weak binding sites and hydration effects The crystal structure of Hm MalDH shows the surface of the tetramer to be enriched in acidic residues Complex salt bridges occur across the monomeric interfaces that form the tetramer and each tetramer contains two sodium binding sites and eight chloride binding sites Non halophilic orthologs of LDH like MalDH from several eubac teria have also been studied but to date there is little information to provide a link between these enzymes and the halophilic Hm MalDH To assess if an identical evolutionary constraint high cytoplas mic KCl concentration induced an adaptive re sponse similar to that observed in Hm MalDH we Structural Analysis of MalDH from S ruber analyzed the molecular properties of LDH like MalDH from the halophilic bacterium Sr Purification of this enzyme was described previ ously and some of its biochemical properties were investigated However this characterization
144. 0 65 24 48 47 Tableau 4 8 R sum des statistiques d affinement pour les structures de lysozyme de blanc d uf de poule avec le Ln HMTDPA 3 Cristaux d riv s obtenus par co cristallisation 127 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 3 _ Ln HMTDPA 3 HEWLiremp 4 HEWLtremp 5 Rapport Qe AE COMP IEE a 10 8 40 R solution A 39 13 1 93 39 23 1 93 Rwork 18 62 18 76 Rfree 22 85 24 09 Nbre de r flexions utilis es 8903 9070 Composition nbre d atomes Prot ine 1009 1001 H20 160 154 Ions 12 12 Ligands 51 23 Res hors Ramachandran 0 0 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs 0 011 0 016 Liaisons Angles 0 984 1 530 Bmoyen prot ine A 17 59 19 18 Bmin prot ine 7 37 8 51 Bmax prot ine A 54 46 63 92 Bmoyen eau A 27 42 28 84 Bmoyen ions lanthanide A 14 52 19 21 Bmoyen ligands A 14 70 20 56 Sitesocc 0 14 15 17 Figure 4 18 R sum des statistiques d affinement pour les structures de lysozyme de blanc d uf de poule avec le Ln HMTDPA Cristaux d riv s par trempage Pour l affinement des jeux de donn es 1 35 j ai proc d un affinement avec correction de l anisotropie sur l ensemble des atomes Il en a r sult une chute remarquable du Rx et du R free Ceci explique l cart entr
145. 1 6 L aminopeptidase TET2 12s de l archaea Pyrococcus horikoshii PhTET2 12s prot ine homodo d cam rique t tra drique de 450 kDa produite et purifi e par la Dr Eva Rosenbaum et Myl ne Ferruit membre de notre groupe E L M A Notre choix fut orient par plusieurs crit res Nous avons choisi un ventail de prot ines pr sentant dif f rentes tailles diff rentes propri t s de surface charges cavit s et diff rentes propri t s cristallines proportion de solvant empilement Nous avons travaill avec des prot ines pour lesquelles des don n es cristallographiques sont disponibles AVEGFP EcAcrB CmCH34CnrXs En effet pour ce type d exp rience o l examen minutieux de chaque faci s cristallin pour chaque condition de cristallisation est n cessaire il est judicieux de travailler avec des prot ines dont les conditions de cristallisation et les formes cristallines associ es sont connues Cela permet ainsi de d pister les nouveaux faci s cristallin dus la pr sence du Ln DPA 3 dans la goutte Nous avons utilis les prot ines produites et purifi es au laboratoire en quantit suffisante pour une telle exp rience AVEGFP EcAcrB Nous avons aussi profit de celles fournies par nos collaborateurs pour lesquelles nous recherchions de nouvelles conditions de cristallisation AfUox CaMalDH PhTET2 12s et CmCH34CnrXs 3 1 2 Choix des conditions de co cristallisation Les robots de cristallisatio
146. 10 Fa 2 Khz site it w bie A Tr s Bo mique n cessite l utilisation d une lumi re dont la longueur d onde doit tre A r quences ea m z 5 Du du m me ordre de grandeur c est dire de l ngstr m gamme de longueurs ae ee S ondes courtes laquelle appartiennent les rayons X Figure 2 Ces rayons X peuvent Ar e tre produits par des g n rateurs d di s mais ils font surtout partie de la Aes 6 10 icro ondes S large gamme des longueurs d onde couvertes par le rayonnement synchro g tron dont le spectre va de l infrarouge aux rayons X durs Particuli rement stable et brillant car intense et focalis le faisceau synchrotron coh rent pr sente une faible divergence dans la gamme des rayons X durs Cela per met entre autres la mise en uvre d exp riences de diffraction des rayons i X par un cristal de macromol cules biologiques Pourquoi la n cessit d un tel cristal D autant plus qu apr s les tapes biochimiques de production ou 3 ga C d extraction de purification et de concentration de la mol cule souhait e 10 fon Comma la cristallisation de celle ci constitue une tape probl matique Car c est le 10 motif cristallin soit la r p tition p riodique d une maille l mentaire dans Figure 2 Spectres d ondes lectromagn tiques Feter dire la diffusion lastique des rayons X dans des directions sp cifiques man 2010 les trois direc
147. 2006 J Biol Chem 281 36327 36337 Sheldrick G M 2008 Acta Cryst A64 112 122 Silvaggi N R Martin L J Schwalbe H Imperiali B amp Allen K N 2007 J Am Chem Soc 129 7114 7120 Tancrez N Feuvrie C Ledoux I Zyss J Toupet L Le Bozec H amp Maury O 2005 J Am Chem Soc 127 13474 13475 Weis W I Kahn R Fourme R Drickamer K amp Hendrickson W A 1991 Science 254 1608 1615 Weiss M S 2001 J Appl Cryst 34 130 135 78 Romain Talon etal Lanthanoid complexes J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 Chapitre 7 Les malate d shydrog nases issues d organismes extr mophiles Le mot collaboration sous entend change de bons proc d s C est dans cette optique que fut tablie celle avec le Dr Dominique Madern biochimiste sp cialiste des enzymes appartenant aux super familles des lactate d shydrog nases LacDH et des malate d shydrog nases MalDH collaboration qui devint assez vite un travail d quipe tant donn la fusion de nos deux quipes pour former le groupe E L M A Au sein du groupe E L M A l tude de adaptation des macromol cules aux environnements ex tr mes hautes pressions hautes et basses temp ratures hautes concentrations en sels hauts ou bas pH hautes concentrations en m taux hautes doses de rayonnement est une des th matiques dont l ana lyse des enzymes lactate d shydrog
148. 23 mais une liaison n n comme le second ligand le fait avec le Trp62 La liaison hydrog ne entre l un de ses groupements carboxylates et le groupement NgHo de la Lys33 est toujours pr sente cette lysine 33 adoptant une seconde conformation Une autre diff rence plus l g re r side dans une interaction polaire entre sa fonction hydroxyethyle et la fonction carboxyle de la Thr118 d une mol cule sym trique en rose via un pont impliquant une mol cule d eau interaction permise gr ce la longueur de la fonction hydroxyethylcholine Figure 4 45 164 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE vx TRP 123 THR 118 Figure 4 45 Mode de fixation du complexe Ln HECTDPA 3 la surface du HEWL Cristal d riv par co cristallisation 1 ligand Description des interactions impliqu es par le 21 ligand Le second ligand tablit toujours l empilement r entre son cycle triazole et le cycle benz nique du noyau indole du Trp62 d une mol cule sym trique en bleu Figure 4 46 En outre la longueur de sa queue choline lui permet d tablir encore une fois une liaison polaire impliquant une mol cule d eau avec la fonction carboxyle de l Ala107 de cette m me mol cule sym trique u7 jJ HOH 2 8 o 1 ca Figure 4 46 Mode de fixation du complexe Ln HECTDPA 3 la surface du HEWL Cristal d riv par co cristallisation 24 ligand 165 4 6 LE
149. 3A a permis de r soudre deux nouvelles structures celle de la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus et celle de la malate d shydrog nase de Picrophilus torridus en permettant alors le phasage des 620 acides amin s qui composent leur dim re A D Le complexe G4DO3A a lui permis de r soudre aussi la structure de la malate d shydrog nase de Chloroflerus aurantiacus mais aussi celle de la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii en permettant le phasage cette fois ci des 1216 acides amin s qui composent cette enzyme Quant au complexe GdDTPA BMA il a lui aussi permit la d termination de la structure de la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii Enfin travers ce chapitre nous avons aussi illustr ce que la d termination de ces trois structures a apport pour la compr hension de l adaptation halophile l identification et le positionnement d ions dans la structure de HvMalDH les conformations de la boucle catalytique du site actif de HvMalDH en lien avec l activit enzymatique et l organisation singuli re de l eau la surface d une malate d shy drog nase non halophile et d une autre halophile Comparer plus finement les structures actuellement disponibles et celles venir apportera davantage d informations sur l adaptation halophile En ce qui concerne l tude de la structure des mol cules d eau la surface de CaMalDH comme la taille des cristaux de CaMalDH le permet je pense
150. 4 0 11 0 49 0 33 Nombre de sites 1 2 R solution FOM 07 0 5 A 2 06 2 27 Pope Po e 6 54 0 80 2 51 0 00 SIGMAA solomon 0 58 0 55 Arp Warp construit total 127 129 50 129 a Statistiques de phasage exp rimental Eu HETDPA 3 HEWL LLG 1259 RFZ 19 3 TFZ 34 8 b Statistiques de phasage par remplacement mol culaire pour le jeu de donn es SAD Tableau 4 15 Statistiques de phasage issues de donn es de diffraction de cristaux de HEWL d riv s avec le Eu HETDPA s Figure 4 35 Carte de densit lectronique exp rimentale contour e 1 5 o am lior e par aplatissement de solvant obtenue partir d un cristal d riv de HEWL Eu HETDPA 3 phasage MAD r solution 1 20 A 151 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Phasage exp rimental de TdTHAU avec le Eu HETDPA 3 Avec la thaumatine de Thaumatococcus daniellii le phasage est effectu partir du m me site de fixation que celui du Eu HMTDPA 3 En effet bien que tr s peu loign es les coordonn es du lanthanide du complexe Eu HETDPA 3 diff rent tr s l g rement de celles qui avaient t d termin es avec le complexe Eu HMTDPA 3 C est d ailleurs ce l ger d calage qui a permis la r ussite imm diate du phasage exp rimental En effet le diffuseur anomal ne se trouvant plus strictement sur l axe de sym trie d ordre 2 son origine n tai
151. 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Eu HECTDPA 3 HEWL Complexe mM 12 Prot ine mM 0 67 Rapport Sie Com PERE y 17 91 M thode co cristallisation Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD oui 1 776 Eur 75 0 979 Groupe d espace P43212 Param tres de maille A a 77 240 c 38 362 Contenu unit asym trique 1 mol cule R solution A 38 62 1 93 2 03 1 93 38 75 1 21 1 27 1 21 Nombre de r flexions uniques 9212 1291 36469 5190 Rmerge 5 3 20 8 5 1 59 8 Ryim 3 3 13 4 6 5 34 4 Sigano XDS 3 09 1 32 1 19 0 80 Rano 9 5 15 9 3 5 27 3 a 10 7 3 7 10 8 1 3 Compl tude 99 7 98 2 99 7 98 8 Redondance 6 5 6 3 7 6 7 2 Tableau 4 20 Statistiques d int gration des jeux de donn es de diffraction de cristaux d riv s de HEWL Eu HECTDPA s suite Phasage exp rimental avec le Eu HECTDPA Les jeux de donn es de diffraction dont les statistiques sont d crites ci dessus ont tous conduit a un phasage d excellente qualit Figure 4 21 De plus la recherche de pics apr s calcul de la Fourier anomale montre que deux autres jeux de donn es SAD enregistr s hors seuil de l europium ont aussi conduit la mesure de fortes diff rences anomales Ces deux jeux de donn es sont issus de l exp rience de diffraction de crist
152. 7 5 mg mL de AfUox 0 18 mg mL7 de 8 azaxanthine 2 90 pL de solution comprenant 7 5 mg mL de AfUox 0 18 mg mL de 8 azaxanthine 10 mM Eu HMTDPA 3l 3 90 pl de solution comprenant 20 mM Eu HMTDPA 3 Comme je l ai mentionn dans le premier chapitre de cette premi re partie le robot utilise les plaques de cristallisation Greiner de 96 puits avec 3 emplacements pour gouttes assises par puits J ai donc pu en une seule exp rience gt rechercher des conditions de co cristallisation pour la prot ine avec le Eu HMTDPA 3l rechercher de nouvelles conditions de cristallisation pour la solution de AfUox utilis e gt tudier comme cela avait t fait pour le Ln DPA 3 l influence des 576 conditions de cristal lisation des kits commerciaux sur le complexe en pr sence ou non de prot ine Les kits commerciaux qui ont t utilis s pour cette exp rience sont The Classics Qiagen Nextal pour la plaque 1 Crystal Screen light Hampton pour la plaque 2 MemFac Hampton pour la plaque 3 Crystal Ammonium Sulfate Hampton pour la plaque 4 PEG 6K Hampton pour la plaque 5 et Screen Index Hampton pour la plaque 6 Mener cette exp rience ne m a pas permis de mettre en vidence des conditions de cristallisation ou de co cristallisation r ellement diff rentes de celle mentionn e ci dessus les cristaux les plus prometteurs apparaissant dans des
153. 8 M bis Figure 3 17 Formes cristallines caract ristiques de cristaux de sel de Eu DPA 3 99 3 3 SYNTH SE DES OBSERVATIONS ET CONCLUSION Pour conclure quant l utilisation de ce complexe pour obtenir des cristaux d riv s je pr coniserai la d marche suivante Il faut en premier lieu v rifier si les conditions de cristallisation de la prot ine native sont compatibles avec l utilisation du complexe Ln DPA 3 Si c est le cas commencer alors par utiliser ce complexe Et si les conditions sont incompatibles avec son utilisation lui pr f rer alors les complexes IRM Ces exp riences de co cristallisation automatis e ont donc montr qu avec les six prot ines diff rentes test es nous n avons jamais constat l effet supramol culaire du complexe Ln DPA 3 Pour essayer de d terminer quels sont les crit res physico chimiques et structuraux qui sont susceptibles de conduire cet effet supramol culaire nous avons entrepris une nouvelle tude comparative sur deux structures r solues l aide du Ln DPA 3 par Guillaume Pompidor au cours de ses travaux de recherche le lysozyme de blanc d uf de poule HEWL et le lysozyme de blanc d uf de dinde TEWL Dans le cas du HEWL la fixation du complexe a entrain le changement du groupe d espace des cristaux d riv s apparus dans les conditions de cristallisation conduisant habituellement a la croissance de cristaux natifs Ce ph n
154. 83 060 c 111 940 amp 101 720 102 020 Contenu unit asym trique t tram re R solution A 41 58 1 95 2 05 1 95 48 34 1 50 1 58 1 50 Nombre de r flexions uniques 92636 13029 205562 29939 Rimerge 11 1 42 4 5 8 40 4 Ryim 7 2 24 1 2 3 16 0 Sigano XDS 1 29 0 85 Rano 9 7 23 8 ay 8 9 3 5 21 6 4 9 Compl tude 98 6 95 4 100 0 99 9 Redondance 5 0 4 9 7 4 7 3 Tableau 7 11 Statistiques d int gration des jeux de donn es utilis s pour le phasage de HvMalDH par la m thode SIRAS colonne de gauche cristal d riv de HvMalDH avec le complexe G4ADTPA BMA colonne de droite cristal natif de HvMalDH 232 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES 7 2 1 2 Phasage par la m thode SIRAS Le phasage s appuyant d une part sur le signal anomal apport par le jeu issu du cristal d riv avec le complexe GGDTPA BMA et d autre part sur les diff rences isomorphes a conduit la construc tion automatique de plus de 98 des acides amin s qui composent le t tram re contenu dans l unit asym trique HvMalDH SIRAS R solution A 50 90 1 50 FOM harp FOM arp 0 15 0 06 Nombre de sites 11 R solution FOM e 0 5 A 4 8 sharp Fi h x 1 Pont Poeme oat 145 Solvant 40 SIGMAA golomon 0 69 B
155. 91 3 2 3 Co cristallisation de la prot ine CmCH34CnrXs avec le complexe Eu DPA 3 93 3 24 Co cristallisation de la prot ine CaMalDH avec le complexe Eu DPA 3 94 3 2 5 Co cristallisation de la prot ine AfUox avec le complexe Eu DPA 3 gt 95 3 2 6 Co cristallisation de la prot ine PhTET2 12s avec le complexe Eu DPA 3 96 3 3 Synth se des observations et conclusion 96 4 La famille des tris triazoledipicolinates de lanthanide 101 4 1 Pr sentation du complexe luminescent Ln HMTDPA 3 101 4 1 1 Caract ristiques chimiques du complexe 102 4 1 2 Caract ristique spectroscopique la luminescence dans le visible par effet d an OHNE te MM oe teh M A MR ad Ae es AN NE ool em A A 104 42 Pr paration de cristaux d riv s avec le complexe Ln HMTDPA 3 en vue d une exp rience de diffraction des rayons X 107 4 2 1 Choix des prot ines mod les et m thodes syst matiquement utilis es 107 4 2 2 Le lysozyme de blanc d uf de poule HEWL pour Hen Egg White Lysozyme 107 4 2 2 1 Cristallisation de la prot ine native 108 4 2 2 2 Obtention des cristaux d riv s 108 4 2 3 La thaumatine de Thaumatococcus daniellii TdTHAU 110 4 2 3 1 Cristallisation de la prot ine native 110 4 2 3 2 Obtention des cristaux d riv s
156. AD Oui 1 385 Yb 0 886 Groupe d espace P 43212 P 43212 Param tres de maille A a 77 274 c 38 305 a 77 357 c 38 220 Contenu unit asym trique 1 mol cule R solution A 18 74 1 98 2 09 1 98 19 11 1 35 1 42 1 35 Nombre de r flexions uniques 8121 964 25738 3600 Rmerge 4 8 10 6 5 0 20 7 Rpim 1 9 5 7 2 9 12 0 Sigano XDS 5 68 2 66 1 53 0 87 Rano 9 4 12 6 4 2 12 0 a0 11 3 6 4 8 4 3 7 Compl tude 95 8 82 1 99 0 96 9 Redondance 12 7 7 3 6 9 6 7 Tableau 4 2 Statistiques d int gration de donn es issues de cristaux d riv s HEWL Ln HMTDPA 3 2 partie 118 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE HEWL 4 Eu HEWL 5 Eu Complexe mole 5 4 10 9 2 1078 Prot ines mole 5 10710 5 10710 Rapport RE to 10 8 x 40 M thode d obtention trempage trempage Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD Non Non a 1 776 Eur 1 776 Eur Groupe d espace P 43212 P 43212 Param tres de maille A a 78 254 c 37 906 a 78 405 c 37 702 Contenu unit asym trique 1 mol cule 1 mol cule R solution A 39 13 1 93 2 04 1 93 39 23 1 93 2 04 1 93 Nombre de r flexions uniques 9024 1250 9238 1280
157. ATE Pra tiquement l intensit de chaque pixel impliqu s dans une t che de diffraction sont somm es Apr s une analyse de la forme des t ches l intensit est int gr e sur l ensemble des pixels de la t che La troisi me et derni re tape est la mise l chelle par la routine CORRECT Tout d abord les r flexions quivalentes i e celles mesur es plusieurs fois ou reli es par les op rations de sym trie sont moyenn es Dans la th orie cristal parfait l intensit est identique pour chacune de ces r flexions En pratique l intensit de toutes ces r flexions quivalentes est moyenn e et l cart type sur cette moyenne est not Rmerge Cet cart type est un des indicateurs de la qualit du jeu de donn es voir ci dessus Enfin la totalit des intensit s est mise l chelle d une part en liminant les signaux parasites et d autre part en prenant en compte les fluctuations de l intensit du faisceau incident de rayons X Cette mise l chelle est r alis e par la routine XSCALE A cette tape on obtient une liste de r flexions uniques avec pour chacune d elles la valeur moyenne de l intensit I et sa d viation standard o I Autre indicateur statistique calcul par XDS que nous avons utilis SigAno Evaluation des diff rences anomales estim es partir des intensit s d une paire de Friedel J et I lorsque la loi de Friedel est bris e Une valeur totale sup rieur
158. Blot Christophe Moreau Bernhard Brutscher Adrien Favier Izabel B rard Nicole Thielens J r me Dupuis Viviana Job Pierre Legrand Bill Shepard et Roger Fourme Je remercie Blandine Cadiou Chantal Robesson et Dominique Ribeiro pour leur accueil mais surtout pour avoir eu l infinie d licatesse de corriger voire d anticiper mes b vues administratives tout au long de cette th se Je remercie aussi mes geeks pour les divers d pannages informatiques inopin s et les moments de craquage d lirants Didier Depoisier Jean luc Parouty et surtout Fabrice Leger une pinte nous attend toujours mon Fab Il m est impossible de ne pas remercier Felix Romain mon encadrant de stage de seconde ann e de Master l Institut Pasteur qui m a mis le pied l trier de la Recherche Je sais pertinemment que remercier un pr sident d Universit peut paraitre louche ou gentiment obs quieux dans un contexte de sinc res remerciements Mais si le Professeur Farid Ouabdesselam pr sident de l Universit Joseph Fourier de Grenoble ne m avait pas accord cette bourse pr sident vous ne seriez pas en train de lire tout ceci Pour fermer la marche je souhaite remercier et le terme est trop faible ma compagne ma belle et douce Marine D un infaillible soutien tu m as support contre vents et marr es tout du long que ce soit de pr s heureux Grenoble ou de loin depuis Dijon Ta pr sence rassurante et apaisante a eu plus d
159. Cammon J A 2001 Electrostatics of na nosystems application to microtubules and the ribosome Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 10037 10041 Barthelmes K Reynolds A M Peisach E Jonker H R A Denunzio N J Allen K N Imperiali B and Schwalbe H 2010 Engineering encodable lanthanide binding tags into loop regions of proteins Journal of the American Chemical Society 133 808 819 Bianchi A Calabi L Corana F Fontana S Losi P Maiocchi A Paleari L and Valtan coli B 2000 Thermodynamic and structural properties of Gd III complexes with polyamino polycarboxylic ligands basic compounds for the development of MRI contrast agents Coordination Chemistry Reviews 204 309 393 Bijvoet J M Peerdeman A F and van Bommel A J 1951 Determination of the absolute confi guration of optically active compounds by means of X rays Nature 168 271 272 Binnemans K and G rller Walrand C 1995 On the color of the trivalent lanthanide ions Chemical physics letters 235 163 174 Blundell T L and Johnson L N 1976 Protein Crystallography Academic Press Bonnete F Vivares D Robert C and Colloc h N 2001 Interactions in solution and crystallization of Aspergillus flavus urate oxidase Journal Of Crystal Growth 232 330 339 Borissenko L and Groll M 2005 Crystal structure of TET protease reveals complementary
160. Chartreuse visible du pont du tramway de l avenue Foch la place de Gordes et sa cr perie m diocre les joggings la Bastille pour faire le plein en gaz carbonique ceux le long du Drac couleur d meraude le march de l Estacade la cascade de l Oursi re la place Saint Andr que le soleil ne quitte qu en dernier lieu les matchs de rugby La Nat les trop rares fa ades color es de la place Grenette contrast es par le bleut du mont Saint Eynard le Cours Beriat et son tramway le beau parc de la Villeneuve et son tumulte sordide le Subway les concerts gratuits au printemps les toutes petites terrasses plus ou moins italiennes du quai Saint Laurent l aviron sur le gris bleu de l Is re les reflets du Tri ves dans le lac du Monteynard Je me suis laiss happ par le Y grenoblois qu il s agisse de l appellation g ographique ou de la principale caract ristique du micro accent local Mais lorsqu on s attache autant un endroit ce n est pas uniquement en fonction du paysage ou de son travail mais surtout cause de toutes les personnes qui le peuplent 329 REMERCIEMENTS Alors avant que vous entriez en sc ne sachez que si l envie de partir ne m est pas encore venue Vheure o j cris ces lignes c est en grande partie de votre faute Si pour des raisons sentimentales et professionnelles je ne m en tiendrai pas ce constat il est bien r el et voil il sera maintenant crit
161. D r solution 1 30 A 5 3 4 Affinement du mod le et description du mode de fixation du TbTNTPA la surface de la Td THAU Deux sites de fixation se trouvent a la surface de la prot ine Mais h las 4 part celle de l atome de lanthanide aucune densit lectronique correspondant au ligand cage n est visible que ce soit dans l un ou l autre des sites Ainsi seuls les atomes de lanthanide ont t plac s Nous ne pourrons donc qu intuiter un mode de fixation pour ce nouveau complexe Fid le la lign e des dipicolinates les deux sites se trouvent dans une zone charg e positivement charge notamment due la pr sence de deux acides amin s arginine par site 187 5 3 CO CRISTALLISATION DE LA TDTHAU AVEC LE TBTNTPA FIXATION DU TBTNTPA TbTNTPA TATHAU_ cristallisation Complexe mM 31 R solution A 40 83 1 30 Rwork 13 81 R free 15 99 Nbre de r flexions utilis es 63889 Composition nbre d atomes Prot ine 1588 H20 396 Ions 2 Ligands 20 Res hors Ramachandran 0 Ecarts types globaux Liaisonsy ongueurs 0 019 Liaisons Angles 0 250 Bmoyen prot ine A 12 55 Bmin prot ine A 5 49 Bmax prot ine A 47 26 Bmoyen eau A 29 23 Bmoyen ions lanthanide A 18 38 Bmoyen ligands A Site 1 occ 20 Site 2 occ 15 Tableau 5 3 R sum des statistiques d affinement p
162. D tecter la fixation des complexes de lanthanide sur des macromol cules biologiques par R sonnance Plasmonique de Surface Biacore 11 1 1 Principe th orique de la SPR et fonctionnement du Biacore 111 2 Protocole g n ral saisir ast Pope ae ed amas Dire nas GROW Pa ae oo Au a ete 11 1 3 R sum tr s succinct des exp riences men es 11 1 4 R sum tr s succinct des r sultats obtenus IERS Conclusion 2 EL LR EE NME AT LR pA ea Manor bw amine a aA 11 2 D tecter la fixation des complexes de lanthanide sur des macromol cules biologiques par R sonance Magn tique Nucl aire 11 2 1 Br ve description du principe th orique 11 2 2 Br ve description du protocole retenu 11 2 3 Type de r sultat observable par RMN 11 24 Conclusion yo es hs mes Ne ne A ae a ie eB ee a a tes Remerciements 309 329 20 INTRODUCTION GENERALE Ce E MEA AG A gt KS AE gt Baies Ko 4 QE kf if at a LR CEN Re At ee A My g 4 san AT Eu A Ware a de thaumatine avec le complexe d europium Eu HETDPA 3 Phasage MAD 1 20 A de r solution Carte am lior e par aplatissement de solvant Contours 1 5 o 2 riv tale d un cristal d 2 rimen
163. DE DIFFRACTION European Synchrotron Radiation Facility Grenoble et PROXIMAL ligne de lumi re du centre de rayonnement synchrotron SOLEIL Source Optimis e de Lumi re d Energie Interm diaire du LURE Saint Aubin Nous avons enregistr des donn es MAD deux longueurs d onde pour la majorit des cristaux d riv s Nous avons toujours cherch obtenir des donn es haute r solution car la mod lisation et l affinement subs quent des complexes de lanthanide en d pend Les donn es MAD deux longueurs d onde ont donc t enregistr es de la mani re suivante enregis trement d un jeu de donn es au seuil d absorption Lyrr du lanthanide pr sent dans le cristal d riv en l occurrence l europium le terbium l ytterbium ou le gadolinium afin d avoir un coefficient de diffusion anomale maximal f amp 30 Puis un second jeu de donn es est enregistr la longueur d onde correspondant au seuil K du s l nium A 0 978 Le choix d enregistrer les donn es au seuil du s l nium peut s expliquer par trois raisons La premi re vient du fait qu cette longueur d onde nous avons acc s la haute r solution n cessaire pour l affinement subs quent du complexe Sur la ligne BM30A par exemple le d tecteur ADSC Quantum 315r avanc jusqu la but e 110 mm du cristal permet d atteindre une r solution de dreso 0 98 A cette distance minimale
164. DH MalDH superfamily solving the activity problem at high salt concentrations is consistent with the notion of stability activity trade offs a phenomenon previously observed in the case of thermal adaptation Numerous studies suggest that enzymes adapted to high temperatures have reduced activity at lower temperatures because of reduced flexibility In terms of the stability activity landscape increasing the salt concentration for halo adaptation corresponds to decreasing the tempera ture for cold adaptation High salt concentrations as well as low temperatures decrease the rate at which the enzyme reaches the conformational subset favor able to sustain activity In both cases the effects of adaptive substitutions involve increase flexibility restoring activity to the hyperstabilized enzyme In the case of LDH like MalDH previous studies have shown that the minimal unit that sustains enzymatic activity corresponds to the dimer A B or D C1 Here our results suggest that the decrease of buried hydrophobic surface between monomers may favor a higher flexibility of the active dimeric unit for the halo adapted enzymes We point out however that because the native state of oligomeric proteins corresponds to the final step of a complex assembly process requiring the proper folding of intermediates and their association into oligomers we cannot exclude the effect of the substitutions on this pathway In particular substitutions re
165. EDEL 299 HvMalDH AHMVEAVLHDTGEVLPGSL JEDTAFGVPVKLGSNGIEEVVEWDLDDYAD 286 wk kKkKke ee ek Fan ee s okes sees oe CaMalDH ALLNASAKAVR ATLDTLKSL 309 PtMalDH EAWKKSVESVKKNSAIADDYFAKNO 324 HvMalDH EMNBAAEKLLDOYDEIA Site de fixation du complexe GdHPDO3A Site de fixation du complexe GdDO3A Site de fixation du complexe GdDTPABMA Acide amin conserv Substitution au sein du m me groupe d acides amin s polaires ou apolaires mais conservation des propri t s physico chimiques Substitution au sein du m me groupe d acides amin s sans conservation des propri t s physico chimiques Figure 7 9 Position des sites de fixation des complexes IRM occup s plus de 40 ramen s aux s quences primaires d un monom re de MalDH align es avec le programme Clustal W Comme le repr sente la Figure 7 9 en s int ressant tout d abord aux sites de fixation les plus fortement occup s on constate que des complexes partagent des sites communs de fixation la surface d une m me MalDH cas du GdDO3A et du GdDTPA BMA la surface de HvMalDH Aligner les s quences primaires permet de mettre aussi en vidence les diff rences au niveau de la composition en acides amin s des r gions impliqu es dans la fixation des complexes Prenons une fois de plus exemple du GdHPDO3A On remarque que le GGHPDOSA se fixe sur PtMalDH dans une r gion quivalente celle o se fixent sur HvMalDH les comp
166. Eu DPA Figure 3 14 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA s en co cristallisation avec PhTET2 12s Cette exp rience conduit aux m me conclusions la formation de cristaux de sel de complexe Eu DPA 3 se produit dans 18 des conditions test es Figure 3 13 ce qui correspond toujours la part la plus importante 58 des manifestations possibles du Eu DPA 3 en co cristallisation Et concentr 25 mM seul dans la goutte le complexe auto cristallise beaucoup moins facilement qu 100 mM Figure 3 14 3 3 Synth se des observations et conclusion En voulant v rifier de fa on statistique d une part l hypoth se de l utilisation du tris dipicolinate de lanthanide en tant qu agent facilitant la nucl ation et d autre part sa facilit d emploi pour une exp rience ordinaire de cristallisation automatis e compte tenu de sa propension auto cristalliser j ai test le complexe en co cristallisation avec six prot ines dans 576 conditions de cristallisation en goutte assise 20 C l aide du robot nanogouttes HTX de EMBL Aucun cristal d riv n a pu tre observ Ceci signifie que lors de cette exp rience nous n avons pas constat d action supra mol culaire de la part 96 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION du tris dipicolinate de lanthanide ou la manifestation caract ristique d un agent capabl
167. Eu DPA s ont t mis en pr sence de 0 46 mM de HEWL Des cristaux quatratiques aux faci s tortur s sont apparus 176 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE semblables ceux que l on obtient lorsqu on co cristallise la prot ine avec une concentration en complexe Eu DPA 3 inf rieure 50 mM Tableau 4 27 Aucune donn e de diffraction interpr table n a pu tre enregistr e On devine bien ici l influence du complexe Eu DPA 3 qui ne peut que provoquer un effet supramol culaire partiel conduisant aux mauvais cristaux Combinatoire 7 M lange d une solution de complexe Eu HMTDPA 3f 15 mM avec une solution de Eu DPA 3f 150 mM Tentative pour cr er un complexe hybride ayant un ou plusieurs ligands dipicolinates avec un ou plusieurs ligands HMTDPA Car c est partir de 50 mM que le complexe Eu DPA 3l conduit usuellement la forme monoclinique des cristaux d riv s de HEWL la stoechiom trie est ici en faveur du complexe Eu DPA 3 ceci afin de d terminer quel complexe a le plus d affinit pour cette prot ine Par rapport la sixi me combinatoire le complexe Eu DPA 3 a t ajout dans le m lange une concentration suffisante pour conduire la forme monoclinique des cristaux de lysozyme Dans le cadre de cette exp rience le complexe Eu HMTDPA 3 est donc largement minoritaire Ainsi bien que les cristaux d riv s obtenus aient des faces plu
168. FIXATION DU LN HMTDPA 3 5 Figure 4 27 Vue du site de fixation 1 du Ln HMTDPA s3 sur la prot ine HEWL Super position de 5 structures 3 issues de la co cristallisation dominantes bleues 2 du trempage dominantes vertes On voit ainsi que quelle que soit la m thode employ e au niveau du site 1 le complexe se fixe toujours de la m me fa on Les liaisons hydrophobes CH r et m n sont maintenues quoi qu il advienne seule la fonction hydroxyle adopte diff rentes conformations ce qui prouve qu elle n intervient pas de fa on indispensable dans la fixation du complexe la prot ine Figure 4 27 Figure 4 28 Vue du site de fixation 2 du Ln HMTDPA 3 sur la prot ine HEWL Super position de 5 structures 3 issues de la co cristallisation dominantes bleues 2 du trempage dominantes vertes 138 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Par contre on voit que la population du second site est un peu moins assuj tie une r gle syst ma tique La position du centre du complexe l ion lanthanide est toujours respect e mais la position et la conformation des ligands qui l entourent peuvent diff rer 4 5 2 2 La corr lation entre la m thode d obtention de cristaux d riv s le faci s cristallin et le mode de fixation Afin de chercher atteindre un taux d occupation des complexes de 100 dans l un des sites d crits ci dessus nous avons essay obtenir
169. G J et al 2010 MolProbity all atom structure validation for macro molecular crystallography Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 66 12 21 Eventoff W Rossmann M G Taylor S S Torff H J Meyer H Keil W amp Kiltz H H 1977 Structural Chapitre 8 AcrB la prot ine mod le membranaire putative Dans le cadre du d veloppement de nouveaux outils pour le phasage de macromol cules biologiques la recherche de prot ines clectiques en guise de mod le d tude nous a conduit vers l Acriflavine resistance protein B ou AcrB et ce pour deux raisons La premi re est que cette prot ine a toutes les caract ristiques d un mod le pouvant d montrer le pouvoir phasant des complexes de lanthanide sur les grands assemblages prot iques Il s agit d une prot ine non seulement homotrim rique de 341 kDa mais aussi membranaire elle apporte ainsi de nouvelles propri t s de surface pour l tude du mode de fixation des complexes Elle est facile produire purifier cristalliser et sa structure est connue La seconde raison est qu appartenant la classe des prot ines membranaires elle constitue un mod le pour l tude d un nouveau complexe de lanthanide synth tis dans le but de cibler ce type de prot ine l acide 1 3 bis phytanylamide thyl ne tri amine triac tique ou DTTA BPA Nous verrons dans ce court chapitre pourquoi AcrB s est av r un mauv
170. G a2G 499 Sr MalDH Hm MalDH 2 3 KCI M Fig 4 Graphs The effect of KCI concentration on the enzymatic activity of Tt LDH Ca MalDH Sr MalDH and Hm MalDH Pictures Illustrations of structural differences related to activity Top Surface contact of monomer A at the monomer monomer interface that build up the dimer A B or D C see also Fig 1 The hydrophobic buried surface area is colored black The percentage of the hydrophobic surface that contributes to the total buried surface is 60 56 47 and 38 for Tt LDH Ca MalDH Sr MalDH and Hm MalDH respectively Second row Central cavity in black of the enzymes Calculated volume is 1775 1602 2156 and 3516 for Tt LDH Ca MalDH Sr MalDH and Hm MalDH respectively Third row Close up view of the catalytic pocket with residues His195 Arg171 red sticks involved in catalysis the backbone is colored green high salt concentrations According to the folding and association pathway of LDH and LDH like MalDH the minimal folded unit that sustains activity assembles via the association of monomer A or D with monomer B or C to build the dimer A B or D C 7 The total surface area of each dimer as well as the area buried at the dimer interface is about the same 5 not shown However the composition of the monomer monomer interface changes with the enzyme Specifically the hydrophobic buried surface repre sents 60 and 56 of the total buried sur
171. HMTDPA 3 plus on augmente sa concentration plus les cristaux d riv s sont tortur s et plus la qualit de leur profil de diffraction baisse Mais l instar du Eu HMTDPA 3 d s 2 7 mM de Eu HETDPA 3 il n est d j plus possible d obtenir des cristaux permettant d enregistrer des donn es interpr tables Tableau 4 12 Eu HETDPA gt Prot ine mod le HEWL M thode d obtention co cristallisation co cristallisation Prot ine P mM 0 Tableau 4 12 Faci s cristallin de cristaux d riv s avec le Eu HETDPA 3 148 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE On s attend donc d j ce que le mode de fixation du Eu HETDPA 3 soit le m me que celui du Eu HMTDPA 3 avec les sites tryptophane qui une fois satur s plus hautes concentrations orientent le complexe vers l utilisation des sites arginine ce qui conduit aux mauvais cristaux Quand aux cristaux d riv de thaumatine avec le Eu HETDPA 3 ceux ci conservent un faci s identique aux cristaux natifs L encore le Eu HETDPA 3 se comporte comme le Eu HMTDPA 3 Tableau 4 12 Il a t aussi possible d obtenir un cristal d riv de HEWL avec le complexe Eu HETDPA 3 par la m thode de trempage J ai aussi essay d obtenir des cristaux d riv s de HvMalDH et de PhTET1 avec ce complexe mais je n ai pas constat de fixation Int gration des donn es de diffraction issues de
172. HMTDPA 3l et surface lectrostatique autour du site de fixation principal de la pro t ine HEWL La surface a t calcul e l aide du programme APBS sur une chelle allant de 3 0 kT e charge n gative rouge 3 0 kT e charge positive bleu Concernant ce premier site dans le cas des cristaux d riv s obtenus par trempage que le cristal d riv ait t pr par en pr sence de 2 7 mM ou 10 mM de complexe le trop faible taux d occupation de ce site n a pas permis d observer la densit lectronique pr cise des trois ligands Seul le ligand 1 responsable de l interaction CH xr a pu tre plac mais sa densit lectronique n a pas permis de conclure quand la pr sence de l interaction CH r Site 2 taux d occupation maximum constat 47 Quelle que soit la m thode d obtention des cristaux d riv s de HEWL avec le complexe co cristallisation trempage concentrations en complexe ce deuxi me site est toujours moins occup que le premier Dans ce site le complexe est aussi fix deux mol cules de lysozyme pi g dans l empilement cristallin Figure 4 25 La plupart du temps les taux d occupation pour ce site m ont seulement conduit la mod lisation d un seul ligand voire de l ion lanthanide seul Un seul jeu de donn es celui avec le Yb HMTDPA 3 m a permis d aboutir la mod lisation de deux des trois ligands pour ce second complexe J ai pu mod liser deux ligands car les c
173. HvMalDH Cristaux en MgBr2 Cristaux en MgCli x A 0 921 Brg 1 711 Gdz Groupe d espace C2 Param tres de maille a 144 886 b 83 475 c 112 377 amp 101 535 a 144 610 b 83 418 c 112 311 amp 101 505 Contenu unit asym trique t tram re R solution A 48 45 1 60 1 69 1 60 46 00 1 88 1 98 1 88 Nombre de r flexions uniques 170600 24312 99062 13575 Rmerge 5 4 41 5 5 0 10 2 Rpim 4 4 34 4 4 3 8 2 Rano 3 4 25 5 3 9 6 5 aD 10 3 1 9 8 9 6 6 Compl tude 98 8 96 7 93 0 87 5 Redondance 4 6 4 6 4 0 3 9 Tableau 7 15 Statistiques d int gration du jeu de donn es HvMalDH enregistr au seuil absorption K du brome sur un cristal en pr sence de MgBr2 colonne de gauche et du jeu de donn es enregistr au seuil d absorption Lyry du gadolinium sur un cristal natif obtenu en pr sence de MgCly colonne de droite La diffusion anomale des atomes de brome nous permet donc de confirmer la position des atomes de chlore De plus un jeu enregistr au seuil d absorption Ly du gadolinium enregistr sur un cristal natif obtenu en pr sence de MgCl nous renseigne sur la diffusion anomale de ces atomes de chlore m me si celle ci est faible Enfin en ce qui concerne les ions Mg t les deux enregistrements effectu s au seuil d absorption K du brome et a
174. I pH 8 0 100 mM MgCl2 P 10 mg mL Goutte 1 5 pL P 1 5 yL R T 293 K 20 C 2 4 jours Cryo protection la liqueur m re est d j cryo protectante a Cristaux natifs de Hv b Conditions de cristallisation et de cryo protection MalDH 240x150 pm Figure 7 5 Cristallisation et cryo protection de la HvMalDH Conditions pour obtenir les cristaux d riv s de HvMalDH Les cristaux d riv s de HvMalDH ont t uniquement obtenus par trempage de 3 secondes 10 minutes dans une solution contenant 100 mM de chacun des trois complexes GdHPDO3A GdDO3A et GdDTPA BMA en plus des consti tuants cit s dans la figure 7 5 L obtention de cristaux d riv s par co cristallisation s est r v l e im possible avec la condition de cristallisation utilis e La cryo protection des cristaux d riv s est identique celle des cristaux natifs Je rappelle ici qu apr s chaque trempage j ai syst matiquement effectu un back soak cf introduction 7 1 1 3 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus Conditions pour obtenir les cristaux natifs de CaMalDH La condition de cristallisation prin cipalement utilis e est inspir e de celle d crite par B Dalhus et al 2002 Dalhus et al 2002 et des observations issues de l exp rience de co cristallisation automatis e avec le complexe Eu DPA 3l d crite dans le premier chapitre de la premi re p
175. M HEPES pH 7 0 0 02 amp DDM 2 4 mg mL EcAcrB 73 mM Eu DPA 3 1 15 mg mL AvEGFP AvEGFP 20 mM HEPES pH 7 5 2 15 mg mL AVEGFP 73 mM Eu DPA s 1 10 mg mL CmCH34CnrXs CmCH34CnrXs 20 mM HEPES pH 7 5 120 mM NaCl 2 10 mg mL CmCH34CnrXs 73 mM Eu DPA 3 1 10 mg mL CaMalDH CaMalDH 50 mM TRIS HCl pH 8 0 2 10 mg mL CaMalDH 73 mM Eu DPA s3 1 10 mg mL AfUox AfUox 2 10 mg mL AfUox 73 mM Eu DPA 3 100 mM TRIS HCl pH 8 0 50 mM NaCl 3 25 mM Eu DPA 3 1 8 mg mL PhTET2 12s PhTET2 12s 2 8 mg mL PhTET2 12s 73 mM Eu DPA 3 _ 50 mM TRIS HCl pH 7 5 150 mM NaCl 3 100 mM Eu DPA 3 Tableau 3 2 Concentrations en prot ine et en complexe dans chaque goutte de cristallisation form e par le robot HTX Le tampon de stockage initial dans lequel la prot ine tait conserv e est galement indiqu 3 1 3 2 Observations des plaques Les plaques de cristallisation r alis es ont t plac es dans le dispositif de photographies automa tis RoboDesign Minstrel III Rigaku 20 C Apr s d p t chaque goutte a t successivement photographi e six fois selon les intervalles suivants 1 jour 3 jours 7 jours 16 jours 5 semaines et 10 semaines Ces photos sont consultables en ligne et m ont permis de suivre l volution de chacune des gouttes de cristallisation 3 1 3 3 Contr le de la luminescence dans les gouttes Une fois les 10 semaines coul es les 36
176. MalDH diff rentes indiquent des fixations de trois complexes IRM qui diff rent selon la composition des surfaces Disposer d un ensemble grandissant de conditions physico chimiques devrait permettre d affiner la compr hension des interactions entre la prot ine et les complexes IRM En tenant syst matiquement compte de la composition des diff rentes surfaces des prot ines mod les MalDH de la 256 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES r partition des charges leurs surfaces de l influence des conditions de cristallisation et de empilement cristallin pour les cristaux d riv s par trempage pour chacune des structures r solues multipli par le nombre de sites de fixation par structure augure une tude o l ennui n aura pas sa place Cela est d autant plus vrai que l quipe a d j en main la production et la purification d autre MalDH aux propri t s de surface encore diff rentes comme la MalDH de l arch e alkalophile pH basique halophile Natrialba magadii ou celle de la bact rie pi zothermophile Thermoanaerobacter marianensis A l issue de ce travail nous pouvons esp rer d terminer quel sera le meilleur complexe en fonction de la s quence en acide amin de la prot ine cible En outre ce chapitre a de nouveau montr la force des complexes de lanthanide pour la d termination des structures par les m thodes de phasage exp rimental Ainsi le complexe GdHPDO
177. McCoy A J McKee E Moriarty N W Read R J Sacchettini J C Sauter N K Storoni L C Terwilliger T C and Adams P D 2008 Automated structure solution with the PHENIX suite Methods in molecular biology 426 419 435 328 Partie de la th se d pourvue de science longs mais sinc res remerciements Ces quatre ann es grenobloise ont t riches en motions et en d cou vertes scientifiques certes mais aussi humaines sportives ou encore pro pos de soi m me Ma premi re d claration d imp t mon premier loyer et ma premi re publication scienti fique auront t grenobloise Com mencer dans la Recherche par autant de D couvertes n est pas rien Le pe tit bourgeois parisien prot g s est re trouv propuls dans la vie active tel un lectron dans un synchrotron et ce pour son plus grand bonheur Comme c est all vite Si vite Grenoble La Chamechaude en point de fuite de la rue Thiers l Archange les hivers aux Sept Laux les serveuses de La Bobine la Dent de Crolles le Hasard le Moucherotte et ses Trois Pucelles le Basse Terre le magistral Taillefer ternellement enneig qui domine la rue des Martyrs le parc Paul Mistral et sa tour Perret Chamrousse qui porte si bien son nom les soirs cl ments de printemps le Family s la terrasse universitaire EVE les pelouses du campus Stendhal et ses d collet s estivaux l Ardoise l aiguill te de Quaix en
178. NH4 2SO data cannot be Structural Analysis of MalDH from S ruber recorded due to the strong precipitation of the protein In a given solvent differences in protein protein and protein solvent interactions between homolo gous enzymes are mainly due to the nature of the protein surfaces We therefore analyzed the surfaces of Tt LDH and Ca Sr and Hm MalDH to determine the structural consequences of the acidic amino acid substitutions in halophilic enzymes The Sr enzyme has about the same number of acidic amino acids oriented toward the solvent 27 as Hm 25 and has 14 and 18 more than the Ca and Tt enzyme respectively Of the exposed acidic residues in Sr and Hm MalDH 12 are located in identical positions The qualitative difference between non halophilic and halophilic enzymes is reflected in the surface electrostatic potential which is more nega tive for the halophilic enzymes Fig 3 middle row For the non halophilic enzymes the calculated charge density is 0 004 e A for Tt MalDH and 0 006 e A for Ca MalDH while it is 0 023 and 0 038 e for halophilic Sr and Hm MalDH respectively The solubility should also be impacted by the hydrophobic surface since the hydrophobic effect is enhanced by high concentrations of neutral salts or by salting out salts The total surface area of the tetramer is about the same within 2 of 41 000 for each enzyme but the exposed hydrophobic surface decreases from 38 of
179. PARATION DE CRISTAUX DERIVES AVEC LE COMPLEXE LN HMTDPA EN VUE D UNE EXP RIENCE DE DIFFRACTION DES RAYONS X En co cristallisation on constate la pr sence de deux formes cristallines dans la goutte Figure 4 8 qui luminescent sous exposition aux UV La premi re forme ressemble des cristaux natifs mais tortur s et aux faces stri es Elle apparait la premi re et la taille des cristaux est g n ralement assez importante La deuxi me forme ressemble en tout point aux cristaux natifs de HEWL Ils apparaissent quelques jours apr s les pr c dents et sont de taille r duite Que ce soit en trempage ou en co cristallisaton il m a t possible d obtenir des cristaux d riv s de lysozyme de blanc d ceuf de poule avec diff rentes concentrations de complexe Bien que le complexe Ln HMTDPA 3 ait t utilis de faibles concentrations sa luminescence intrins que dans le visible tant sup rieure celle du Ln DPA s3 il a t relativement facile de d tecter sa fixation dans les cristaux en les exposant aux UV proches Lorsqu aucun signal anomal n a pu tre d tect suite l enregistrement de donn es cristallographiques sur l un de ces cristaux la luminescence des autres cristaux du m me type et de la m me goutte que celui utilis pour l exp rience de diffraction fut v rifi e En outre bien que deux faci s cristallins soient observables dans le cas de cristaux d riv s obtenus en co crista
180. PLEXES DE LANTHANIDE AVANT L ETAPE DE DIFFRACTION Intensit de l onde r fl chie R variation d intensit en fonction de l angle de r sonnance pour un tat normal R variation d intensit en fonction de l angle de r sonnance apr s fixation de l entit 1 ce qui est greff sur la puce R variation d intensit en fonction de l angle de r sonnance apr s fixation de l entit 2 ce qui est greff sur la puce 6 ka cin tique d association kd cin tique de dissociation Temps min ou ul inject s Figure 11 2 Donn es mesur es pou pouvant tre calcul es par une exp rience Biacore Aussi la mesure du niveau d interaction entre les deux entit s en fonction du temps permet d valuer un taux d association Pour cela tracer les valeurs que prend l unit de r sonance RU en fonction du temps permet de calculer une cin tique d association ka et une cin tique de dissociation kg figure 11 2 Une unit de r sonance correspond une variation de 0 0001 de la valeur de l angle de r fraction Connaissant la valeur de kg et celle de kg on pourra alors calculer la valeur de la constante d affinit ou constante de dissociation Kg car ka Ka d ka Une entit qui se fixe rapidement et qui se dissocie tout aussi vite aura donc la m me valeur de Kg qu une entit qui s associe lentement et se dissocie aussi lentement Le calcul d un
181. Probity server Table 1 The numbering of Sr MalDH model is based on that of Hm MalDH and the Eventoff nomenclature Model analysis The model of Sr MalDH was compared to the structures of the halophilic Hm MalDH PDB code 1GT2 and of the non halophilic Ca MalDH PDB code 1GUY and Tt LDH PDB code 2V6M Residue numbering of Ca MalDH in this article is based on Sr MalDH numbering and differs from that of the initial PDB The solvent accessible surface area of all tetrameric MalDHs was calculated using the program AREAIMOL For each tetramer interfaces between monomers were examined with the program PISA The probe accessible volume of the central cavities was calculated using the program VOIDOO The probe radius was set to 1 4 i e water radius and the central cavity was specifically selected with coordinates of a cavity point The electrostatic potential was generated with the program APBS and rendered with PyMOL PyMOL Molecular Graphics System Version 1 2r3pre Schr dinger LLC which was also used to prepare all the figures The relative crystallographic B factor difference for each residue was calculated for the backbone atoms using the formula Ba ee ia Bs where Bc and Bs refer to B factor values extracted from Ca and Sr MalDH models respectively and where B refers to the mean value for the whole structure This calculation leads to a distribution with a zero mean value and limits bias from refinements
182. R solution A 49 43 2 10 FOMS er FOM _ 0 14 0 09 Nombre de sites 3 R solution FOM5karp 0 5 A 6 13 a Es 0 40 0 95 Solvant 52 SIGMAA oiomon 0 64 Buccaneer construit total 508 648 Tableau 7 18 Statistiques du phasage exp rimental SIRAS de PtMalDH avec le complexe GdHPDO3A Cristaux obtenus en pr sence de sulfate d ammonium NH 4 2SO4 PtMalDH Sans NH4 2SO4 LLG 6236 RFZ 42 6 TFZ 106 8 Tableau 7 19 Statistiques du phasage par remplacement mol culaire Cristaux obtenus sans sulfate d ammonium 7 2 2 3 Affinement des structures de PtMalDH L affinement a t effectu avec le programme Phenix selon le protocole indiqu dans l introduction de ce manuscrit Les statistiques d affinement sont consign es dans les tableaux suivants 238 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES PtMalDH Avec NH4 2SO4 R solution A 49 43 2 10 Rwork 18 52 R free 20 90 Nbre de r flexion utilis es 53717 Composition nbre d atomes Prot ine 4992 H20 329 Ligands 265 Res hors Ramachandran 0 60 Ecarts types globaux LiaisonsLongueurs 0 003 Liaisons Angles 0 713 Bmoyen prot ine A 41 15 Bmin prot ine A 17 64 Bmax prot ine A 148 01 Bmoyen eau A 46 79 Bmoyen ligands divers A 53 81 Tableau 7 20 R sum
183. RDDLLLKN GIMKSVG CaMalDH 1 309 a SrMalDH 1 324 EA 150 180 190 200 210 1 NAV T E A T S A E x A K N N R K PtMalDH 1 324 a A K N N K F HvMalDH 1 303 S S AE ND EN NR E ORDAN R RED KN SKVRWD i LRESA 6675379675559679 7 79763767685454699 187 9 77 88865 7778 7 6994 1 75666797 6 65686397648 9376848 Consensus AI KYSPES 1 VVTNPADIMAYAIY ASGISPER IGLGGSLDS RFRTFLAOELNVS EDVNAFV1GGHGDDMVPFIRYSNVSGIPIEDLLPR KIDEIVKRTRFGG 320 dl CaMalDH 1 309 KSL SrMalDH 1 324 FAKNQ 300 A T gt K KNS D PtMalDH 1 324 K KNS HvMalDH 1 303 M DLD Th FF YDEMM 89997 965877 586 3 8995 658 9 8876 8 878 678668 99 96 47 59 79697388954437555837596 467 auf De on LU ieee oe et Consensus GEIVNLYKTGSAFYAP 1ISIAVMVE NDRKRVIPCAAY TGEH KTYLVN LF GVP K GKNGVEKIY LK NEDELEAWK SV SVKKNSAIADDYFAKNO Figure 7 2 Alignement des s quences primaires des malate d shydrog nases issues des or ganismes Chloroflecus aurantiacus CaMalDH Salinibacter ruber SrMalDH Haloferax volcanit HvMalDH et Picrophilus torridus PtMalDH Alignement r alis l aide du programme Clustal W2 dans sa version 2 1 en utilisant la matrice Gonnet Programme dis ponible en ligne partir du site internet NCBI Le rendu provient de l diteur d alignement Jalview version 2 6 1 Waterhouse et al 2009 212 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES
184. TDPA 3 Combinatoire 1 M lange d une solution de complexe Eu HMTDPA 3P 4 mM avec une solution de Eu HETDPA 3f 4 mM et d une solution de Eu HECTDPA 3 4 mM La solution r sultante de ce m lange contient donc au minimum 4 mM d une des combinatoires les moins probables parmi les 10 possibles Tableau 4 23 La solution r alis e a t introduite dans la goutte de cristallisation comme s il s agissait d une solution de complexe unique Appellation Combinaisons Probabilit s des diff rentes combinaisons Ligand HMTDPA M MMM EEE CCC pour un m lange quimolaire de 3 complexes Ligand HETDPA E MME EEM CCE MMM EEE CCC iz Ligand HECTDPA O MMC EEC CCM MME MMC MEE MCC EEC ECC MEE EMM CEE MEC 3 MCC ECC CMM MEC EMC CME Tableau 4 23 Probabilit de chacune des diff rentes combinaisons de ligands rendues pos sibles par la pr paration de la combinatoire 01 Des cristaux d riv s aux faces stri es sont apparus dans la goutte de cristallisation compos e de 1 33 mM de combinatoire et de 0 46 mM de HEWL Cassant au niveau des stries nous avons pu isoler des fragments cristallins qui ont conduit l enregistrement de donn es de diffraction SAD se L Une r solution de 1 40 Alors que la solution de combinatoire contenait les ligands HMTDPA HETDPA et HECTDPA apr s un phasage exp rimental ais la carte de densit l
185. TG Une fois la temp rature du milieu descendue 30 C la culture est mise nouveau en incubateur 30 C pendant 3h30 et 180 t p m temps n cessaire l induction Tout le volume de culture est ensuite centrifug 6000 t p m 4 C pendant 20 minutes Les culots bact riens sont resuspendus dans un tampon A qui contient 20 mM Tris HCl pH 8 0 et 0 5 M NaCl Le choc osmotique alors produit permet de commencer la lyse cellulaire Cette suspension est enfin centrifug e 4000 t p m 4 C pendant 30 40 minutes Pour 3 L de culture on obtient 12 16 g de culots bact riens 10 4 2 Purification d EcAcrB La purification de la prot ine membranaire EcAcrB est ais e en quatre tapes sans recours a des syst mes automatis s de type HPLC ou FPLC Les quatre tapes sont La pr paration et le dosage des fractions membranaires La solubilisation de ces derni res La purification de la prot ine sur colonne d affinit en r sine de nickel HisTrap La concentration de la solution de prot ine sur membrane tangentielle 10 4 2 1 Pr paration et dosage des fractions membranaires de E coli Les culots bact riens sont mis en suspension dans un tampon B 20 mM Tris HCl pH 8 0 0 5 M NaCl 2 mM MgCl 3 comprim s de cocktail de prot ases Complete sans EDTA des laboratoires Roche traces de DNasel La lyse des bact ries s effectue en passant la solution en presse de French 11000 Psi jus
186. TREMOPHILES Abr viations utilis es dans les tableaux 7 25 et 7 26 R seau Num ro d un r seau de mol cules d eau constitu d au moins deux polygones Plg Num ro du polygone Mer Monom re de la prot ine correspondant Res Couvert Acide amin couvert par le polygone Ic correspond chaine lat rale c a d chaine aliphatique d un grand acide amin ch3 signifie que seule cette fonction chimique hydrophobe est recouverte par le polygone Coord par C O des res Ici sont num r s les acides amin s dont l oxyg ne de la fonction peptidique coordonne le polygone OH est l pour pr ciser qu exceptionnellement c est la fonction hydroxyle de la tyrosine qui coordonne le polygone Distances Du res Couv Distance la plus courte mesur e entre l atome le plus haut de la chaine lat rale de l acide amin couvert et le plan form par le polygone D min Distance la plus courte mesur e entre deux mol cules d eau qui constituent le p rim tre du polygone D max Distance la plus longue mesur e entre deux mol cules d eau qui constituent le p rim tre du polygone Av D Moyenne des distances mesur es entre deux mol cules d eau du p rim tre du polygone A min Angle le plus petit mesur entre trois mol cules d eau qui constituent le p rim tre du polygone A max Angle le plus grand mesur entre trois mol cules d eau qui constituent le p rim tre du polygone Av Moyenne des angle
187. UNIVERSIT DE GRENOBLE TH SE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITE DE GRENOBLE Sp cialit Physique pour les Sciences du Vivant Arr t minist riel 7 ao t 2006 Pr sent e par Romain TALON Th se dirig e par Richard KAHN et codirig e par Eric GIRARD pr par e au sein de l Institut de Biologie Structurale Groupe Extremophiles and Large Macromolecular Assemblies dans l cole Doctorale de Physique DEVELOPPEMENT DE NOUVEAUX OUTILS POUR LA DETERMINATION DE LA STRUCTURE DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES PAR DIFFRACTION APPLICATION AUX PROTEINES MEMBRANAIRES ET AUX GRANDS COMPLEXES PROTEIQUES Th se soutenue le 6 juin 2012 devant le jury compos de M Vincent VILLERET Directeur de Recherche CNRS de Villeneuve d Ascq Rapporteur M Daniel PICOT Directeur de Recherche Universit Paris Diderot de Paris Rapporteur M Giuseppe ZACCAI Directeur de Recherche Institut Laue Langevin de Grenoble Membre M Andrew THOMPSON Responsable de ligne de lumi re Synchrotron SOLEIL de Gif sur Yvette Membre M Olivier MAURY Directeur de Recherche de l ENS de Lyon Membre A Richard Kahn feu mon directeur de th se Ont t imprim s 24 exemplaires de cette th se 10 au format A4 dont 3 uniques 14 au format A5 dont 12 uniques Achev d imprimer en juin 2013 Notes Le terme complexe d signe l ensemble que constitue l ion lanthanide Gd Eu avec le ligand Le
188. a Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 358 365 Kabsch W 1993 Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants Journal Of Applied Crystallography 26 795 800 Kahn R Fourme R Bosshard R Chiadmi M Risler J L Dideberg O and Wery J P 1985 Crystal structure study of Opsanus tau parvalbumin by multiwavelength anomalous diffraction FEBS letters 179 133 137 Karle J 1980 Some developments in anomalous dispersion for the structural investigation of macro molecular systems in biology International Journal of Quantum Chemistry 18 357 367 Ko T P Day J Greenwood A and McPherson A 1994 Structures of three crystal forms of the sweet protein thaumatin Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 50 813 825 Koch M Diez J Wagner A and Fritz G 2010 Crystallization and calcium sulfur SAD pha sing of the human EF hand protein S100A2 Acta crystallographica Section F Structural biology and crystallization communications 66 1032 1036 Kramers H 1927 La diffusion de la lumiere par les atomes Atti Cong Intern Fisica 2 545 557 Kronig R d L 1926 On the Theory of Dispersion of X Rays Journal of the Optical Society of America 12 547 556 Lakomek K Dickmanns A Mueller U Kollmann K Deuschl F Berndt A L bke T and Ficner R 2009 De novo sulfur SAD phas
189. a reesei les cristaux d riv s obtenus sont de sym trie cristalline C2 au lieu de P2 2121 3 ubiquitine de c ur de b uf les cristaux d riv s obtenus sont de sym trie cristalline C222 au lieu de P4332 Dans le cas du HEWL les cristaux de forme monoclinique ont pr sent une diffraction tr s haute r solution 0 8 A au lieu de 1 4 pour les cristaux de sym trie cristalline quadratique L analyse de l empilement cristallin montre que le complexe Ln DPA ponte plusieurs mol cules de prot ine ce qui induit le changement de groupe d espace Figure 2 7 75 2 3 PROT INES DE STRUCTURES INCONNUES DETERMINEES JUSQU ALORS L AIDE DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Figure 2 7 Repr sentation de l empilement cristallin observ dans les cristaux de HEWL de forme monoclinique obtenu en pr sence de Ln DPA 3 Les mol cules de complexe en rouge cr ent une interaction supramol culaire avec les acides amin s arginine et lysine en jaune de la prot ine en vert De ces observations nous avons envisag l utilisation du complexe Ln DPA 3 en tant que com plexe au fort pouvoir phasant capable de promouvoir la nucl ation lorsqu il est introduit dans la goutte en co cristallisation Cette hypoth se a t tudi e au travers d une exp rience de co cristallisation automatis e d crite dans le premier chapitre de la premi re partie 2 3 Prot ines de structures inconnues d termin es jus
190. a seconde partie de ce manuscrit 114 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 4 2 6 2 Obtention des cristaux d riv s Les essais de co cristallisation ou de trempage avec le complexe se sont tous r v l s infructueux La pr sence de 40 mM d ac tate de cadmium dans les conditions de cristallisation de la prot ine provoque l apparition imm diate d un pr cipit cristallin opaque de sel de complexe Dans un premier temps j ai voulu essayer d obtenir des cristaux d riv s dans d autres conditions de cristallisation Mais rares sont celles o la prot ine semble cristalliser sans qu il n y ait de sel d ions divalents Dans ces rares conditions les profils de diffraction des cristaux obtenus n ont pas permis d enregistrer des donn es Nous avons aussi essay de co cristalliser la prot ine avec une concentration suffisamment faible de complexe dans l espoir que la totalit des mol cules de complexe se fixe aux mol cules de pro t ine avant l tape de nucl ation emp chant ainsi le complexe de pr cipiter J ai donc r alis des es sais de co cristallisation avec les deux rapports suivants 1 mol cule de CaMalDH 1 5 mol cules de Ln HMTDPA 3 et 1 mol cule de CaMalDH 10 mol cules de Ln HMTDPA 3 Ceci m a permis d obtenir des cristaux semblables aux cristaux natifs Mais en observant les m mes gouttes plusieurs semaines apr s j ai constat l apparition d
191. a step 0 6 signe v g 7 Pp Q U lt Seale 2 0000 ma A Section 16 0 25 HEWL_EuDPApCho_Sec_Bu Anomalous Patterson map Seale 2 0000 ma A Section 32 0 50 HEVL_EuDPApCho_3ec_Eu Anomalous Patterson map a Carte de Patterson anomale section de Harker b Carte de Patterson anomale section de Harker Figure 4 43 Deux sections de Harker de la carte de Patterson anomale du cristal d riv de HEWL par co cristallisation avec 2 7 mM du Eu HECTDPA 3 jeu de donn e MAD 162 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 44 Carte de densit lectronique exp rimentale am lior e par aplatissement de solvant d un cristal d riv de HEWL Eu HECTDPA s contour e 1 0 o phasage MAD 1 21 de r solution Affinement des structures et description du mode de fixation du Eu HECTDPA Trois structures provenant de cristaux d riv s avec trois concentrations diff rentes de complexe ont pu tre r solues haute r solution Cela nous a permis encore une fois de regarder l influence de la concentration en complexe sur les taux d occupation des sites de fixation Que le complexe Eu HECTDPA 3 soit ajout 2 7 ou 12 mM4 la fixation la prot ine se fait majoritairement dans le site 1 Trp123 Les taux d occupation affin s pour ce site plafonnent 62 dans les structures issues d un c
192. agents pr cpitant tarnpon ads R servoir Solution de cristallisation du puits a Sch ma de la m thode de la goutte suspendue et de la goutte assise Lamelle silicon e Graisse a vide joint R servoir Huile de paraffine eli Solution de prot ine Solution de cristallisation b Sch ma de la m thode batch Figure 1 7 Illustration des m thodes de la goutte assise de la goutte suspendue et de la m thode dite batch Le principe de la m thode est de mettre l quilibre dans une enceinte herm tique une goutte de quelques microlitres contenant la solution de cristallisation et la prot ine face un volume bien plus important 500 pL 1 mL de cette m me solution mais sans la prot ine Figure 1 7 La goutte est donc le m lange d une solution concentr e en prot ine et de la solution de cristallisation contenue dans le puits elle m me tant un m lange d agent s pr cipitant s de tampon et d additifs ventuels L agent le plus volatil l eau diffuse alors de la goutte vers le puits jusqu ce que leurs pressions partielles respectives 61 1 7 DES CRISTAUX D RIV S PR SENTANT UN SIGNAL ANOMAL POUR UN PHASAGE DE NOVO s quilibrent provoquant ainsi une diminution du volume de la goutte et donc une augmentation de la concentration de la prot ine et des agents pr cipitants dans la goutte Le diagramme de solubilit d crit l volution dans la goutte d
193. aires se trouvant en surface glycine alanine valine leucine isoleucine proline ph nylalanine et tryptophane Il est noter que certains polygones forment des superstructures Figure 7 15 248 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES gt soqoydorpAy sguiure soploe s p f yepoooyo u saptydorpAy suture soploe sap AT OUUOD ap 998JINS eJ SLI8 N9 q UT HC eINeO op 998JINS EI g nea p souosAjod op neosey GT SANS on 249 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO D s qu un acide amin polaire est pr sent la surface le r seau s interrompt pour laisser la place la chaine lat rale hydrophile qui coordonne alors les mol cules d eau non impliqu es dans un polygone Figure 7 16 LYS 221 Figure 7 16 R seau de pentagones d eau recouvrant une leucine de la surface de CaMalDH expos e au solvant Couleur chocolat les acides amin s hydrophobes en bleu gris les acides amin s hydrophiles dont les chaines lat rales emp chent le r seau de polygones de s tendre Plus pr cis ment les polygones recouvrent les chaines lat rales hydrophobes des acides amin s qui constituent la surface prot ique Cela signifie que si la forme de la zone le permet il est possible de trouver non seulement des pentagones dont le plan se situe pr cis ment la perpendiculaire de la fonction m thyle de la chaine lat
194. ais mod le d tude en ne d passant pas la premi re tape requise pour l tude du mode de fixation des complexes de lanthanide qu est une diffraction une r solution raisonnable 8 1 Les deux protagonistes de la courte histoire membranaire 8 1 1 La prot ine membranaire EcAcrB L Acriflavine resistance protein B est une prot ine homotrim rique ancr e dans la membrane interne cytoplasmique de la bact rie Gram n gatif Escherichia Coli Okusu and Ma 1996 Associ e aux prot ines AcrA et TolC l assemblage AcrAB TolC constitue une pompe efflux dont le r le est le trans fert direct en vitant le p riplasme et la membrane externe de mol cules hydrophobes hydrophiles ou amphiphiles entre le cytoplasme et l ext rieur de la cellule Fralick 1996 et dont la force motrice est proton d pendante Zgurskaya and Nikaido 2000 Ainsi en tant m me de rejeter ce type de mol cules EcAcrB conf re la bact rie une r sistance accrue un grand nombre d antibiotiques d o son nom Nikaido and Zgurskaya 2001 Mais cette prot ine membranaire est aussi un contaminant bien connu des biochimistes des prot ines membranaire recombinantes D une part elle est exprim e par E coli bact rie tr s largement utilis e comme support d expression pour prot ines recombinantes membranaires ou non Et d autre part la prot ine naturelle poss de deux histidines tr s accessibles en 271 8 1 LES DEUX
195. aisons 4ngies 1 292 Bmoyen prot ine A 21 50 Bmin prot ine A 9 17 Bmax prot ine A 109 92 Bmoyen eau 36 04 Bmoyen ions divers A 34 55 Bmoyen ligands divers A 32 47 Tableau 7 24 R sum des statistiques d affinement de la structure native de CaMalDH Je pr cise ici que le mod le de CaMalDH r pondant au code PDB 1GUY contient une erreur en position 34 toutes les s quences primaires disponibles dans les banques de donn es indiquent une ph nylalanine et non pas une isoleucine 7 2 3 4 Structuration de l eau la surface de CaMalDH et adaptation halophile S il m est permis de raconter encore une courte histoire je compterai comment l tude de la structure des mol cules d eau la surface de CaMalDH a merg au sein de l quipe Alors que Richard Kahn et moi m me tions en train de parcourir la carte de densit lectronique am lior e par aplatissement de solvant nous esclaffant devant un phasage SIRAS d une telle pr cision je tombais sur une densit un peu particuli re qui nous laissa pantois A l cran nous observions cinq densit s lectroniques de forme parfaitement sph rique bien distinctes de celle correspondant celles de la prot ine respectant scrupuleusement la g om trie pentagonale A ma question Mais l qu est ce que je mod lise l dedans mon directeur de th se resta comme moi un peu perplexe La r ponse vint rapidement au d
196. alline Et avec fi facteur de diffusion atomique de l atome j transform e de Fourier de la densit lectronique de l atome j Les facteurs de structure sont des nombres complexes avec une amplitude F h et une phase h que Von peut donc crire F h F h exp io h La densit lectronique p r se calcule par la transform e de Fourier inverse des facteurs de structure de chaque atome plr TF 1 F h gt F h exp i2rh x gt 5 F h exp i h exp i2rh x 1 a h o V est le volume de la maille cristalline La mesure de l intensit Z h ne peut fournir que le module du facteur de structure des atomes F h Or la phase h est indispensable pour le calcul de la synth se de Fourier qui conduit la densit 28 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE lectronique p r c est ce que l on nomme le probl me des phases Une exp rience de diffraction sur un cristal natif ne permet donc pas elle seule la r solution de la structure 1 2 Les diff rentes m thodes de phasage Parmi les m thodes permettant de calculer ces phases nous nous int resserons plus particuli rement aux m thodes de phasage de novo 1 2 1 Le remplacement mol culaire Avant d exposer les m thode de phasage de novo il convient de pr senter la m thode du remplace ment mol culaire m thode la plus couramment utilis e pour la r solution d
197. alo adapted enzymes from other eubacterial species The S ruber enzyme is active at the high physiological concentrations of KCl but unlike typical halo adapted enzymes remains folded and active at low salt concentrations Structural aspects of the protein including acidic residues at the surface solvent exposed hydrophobic surface and buried hydrophobic surface place it between the typical halo adapted and non halo adapted proteins Edited by G Schulz Keywords halophilic malate dehydrogenase protein adaptation stability The enzyme lacks inter subunit ion binding sites often seen in halo adapted solubility enzymes These observations permit us to suggest an evolutionary pathway that is highlighted by subtle trade offs to achieve an optimal compromise among solubility stability and catalytic activity 2010 Elsevier Ltd All rights reserved Introduction accumulation of compatible solutes osmolytes Halophilic organisms that use this strategy typically eubacteria and higher organisms have efficient Halophilic microorganisms inhabit extremely sa transmembrane ion selective pumps as well as line environments up to NaCl saturation These microbes have selected various strategies of adapta tion in order to cope with the resulting strong osmotic pressure One strategy is to maintain a low cytoplasmic salt concentration using salt exclusion mechanisms together with the synthesis and or Corresponding auth
198. alview Version 2 a multiple sequence alignment editor and analysis workbench Bioinformatics 25 1189 1191 Weik M and Colletier J P 2010 Temperature dependent macromolecular X ray crystallography Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 437 446 Weiss M S 2001 Global indicators of X ray data quality Journal Of Applied Crystallography 34 130 135 Wells A F 1984 Structural Inorganic Chemistry Acta Cryst Wood K Fr lich A Paciaroni A Moulin M Hartlein M Zaccai G Tobias D J and Weik M 2008 Coincidence of Dynamical Transitions in a Soluble Protein and Its Hydration Water Direct Measurements by Neutron Scattering and MD Simulations Journal of the American Chemical Society 130 4586 4587 Ying W 2008 NAD NADH and NADP NADPH in cellular functions and cell death regulation and biological consequences Antioridants amp Redox Signaling 10 179 206 Vu E W McDermott G Zgurskaya H I Nikaido H and Koshland D E 2003 Structural basis of multiple drug binding capacity of the AcrB multidrug efflux pump Science 300 976 980 Zgurskaya H I and Nikaido H 2000 Multidrug resistance mechanisms drug efflux across two membranes Molecular Microbiology 37 219 225 Zulauf H 1991 Detergent phenomena in membrane protein crystallization 53 72 CRC Press Zwart P H Afonine P V Grosse Kunstleve R W Hung L W Ioerger T R
199. am rique halophile de Haloferax volcanii est compos e de 1216 acides amin s 4x304 Sa masse molaire est de 130 kDa et l analyse de sa composition permet de calculer un point iso lectrique th orique de 4 20 et un coefficient d extinction molaire th orique de 24410 M lem La HvMalDH est purifi e et cristallis e en pr sence d ions diff rents en pr sence d ions potassium tr s forte concentration lors de la purification et en pr sence d ions magn sium lors de la cristallisation Dans le cadre de l tude de l adaptation halophile sa structure constitue un bon mod le pour tudier la conservation phylostructurale des potentiels sites ioniques et analyser l influence de ces ions sur la structure de l enzyme 7 2 1 1 Int gration des donn es en vue d un phasage par la m thode SIRAS Un jeu de donn es de diffraction a t enregistr au seuil d absorption Ly du gadolinium partir d un cristal d riv de HvMalDH obtenu par trempage dans une solution de complexe GdDTPA BMA L autre jeu de donn es est issu d un cristal natif et a t enregistr au seuil d absorption K du s l nium une r solution de 1 5 HvMalDH Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re 1D23 1 FIP BM30A M thode SIRAS Donn es Jeu anomal jeu natif a 1 711 Gdr 0 979 Ser Groupe d espace C2 Param tres de maille A a 143 750 b 82 320 c 112 750 a 143 680 b
200. and arginine Angewandte Chemie International ed in English 47 3388 3391 325 BIBLIOGRAPHIE Pompidor G Girard E Maillard A Ramella Pairin S Bersch B Kahn R and Cov s J 2009 Biostructural analysis of the metal sensor domain of CnrX from Cupriavidus metallidurans CH34 Antonie van Leeuwenhoek 96 141 148 Pompidor G Maury O Vicat J and Kahn R 2010 A dipicolinate lanthanide complex for solving protein structures using anomalous diffraction Acta Crystallographica Section D Biological Crystal lography 66 762 769 Pos K M and Diederichs K 2002 Purification crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB an inner membrane multi drug efflux protein Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 58 1865 1867 Pos K M Schiefner A Seeger M A and Diederichs K 2004 Crystallographic analysis of AcrB FEBS letters 564 333 339 Purdy M D Ge P Chen J Selvin P R and Wiener M C 2002 Thiol reactive lanthanide chelates for phasing protein X ray diffraction data Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 58 1111 1117 Ramachandran G N and Sasisekharan V 1968 Conformation of polypeptides and proteins Ad vances in protein chemistry 23 283 438 Ramagopal U A Dauter M and Dauter Z 2003 Phasing on anomalous signal of sulfurs what is the limit Acta Crystallographica Section D Biological Crys
201. ans la m me r gion Dans le cas des combinatoires 5 6 7 et 8 l absence de fixation dans les cristaux de TdTHAU peut s expliquer par le fait que nous avons utilis des solutions de combinatoires des concentrations trop faibles pour obtenir des cristaux d riv s de cette prot ine 179 4 8 CONCLUSIONS QUANT L UTILISATION DES COMPLEXES DE LA FAMILLE DES LN TDPA 3 Figure 4 50 Synth ses de Fourier anomale calcul es avec le jeu de donn es SAD enregistr au seuil d absorption L du gadolinium en bleu gris et avec le jeu de donn es SAD enregistr au seuil d absorption L de l europium en rouge Les mod les de HEWL avec le complexe Eu HMTDPA 3 en orang et de HEWL avec le GGHPDO3A en vert sont align s et superpos s 4 8 Conclusions quant a l utilisation des complexes de la famille des Ln TDPA L utilisation du complexe Ln HMTDPA s d riv chimique du Ln DPA 3 a conduit l ob tention de phases tr s pr cises qui ont permis la r solution de la structure du lysozyme de blanc d ceuf de poule et de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii deux prot ines mod les Son affinit pour la surface de ces prot ines est telle qu elle permet de les utiliser 4 une concentration de quelques millimolaires seulement La forte affinit de ce complexe et des autres membres de la famille des Ln TDPA 3 est li e la pr sence du noyau triazole qui cr e des interactio
202. ant changer ce groupement carboxyle en ester en utilisant un agent de liaison crosslinker le m lange EDC NHS ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide N Hydroxysuccinimide Cet ester constitue un parfait groupe partant pour la cr ation d une liaison amide avec un groupement amine proton disponible la surface de la prot ine La greffe d une prot ine sur une puce Biacore peut donc se sch matis ainsi Puce Dextran EDC NHS amine de la prot ine figure 11 1 Afin que les groupements de la prot ine soient proton s nous avons toujours utilis lors de cette tape un tampon pour la prot ine dont le pH soit si possible 4 deux unit s en dessous du point iso lectrique de la prot ine De plus un surfactant P20 a toujours t ajout dans le tampon de greffe au dernier moment Les surfactant permettent d viter toutes les interactions non specifiques hydrophobes entre deux entit s Ainsi en fixant au pr alable ce surfactant P20 la prot ine on s assure qu elle ne pourra pas se lier une autre entit que la puce via ses groupements amine En dernier lieu une fois la prot ine greff e nous avons inject de l ethanolamine afin de saturer toutes les mol cules de dextran esterifi es n ayant pas fix une mol cule de prot ine Ainsi sur la piste t moin piste 1 seul l ethanolamine est greff e la puce 11 1 3 R sum tr s succinct des exp riences men es Le tableau 11 4 r sume toutes les
203. ant seulement deux complexes diff rents dans des proportions equimolaires alors que ceux ci sont form s de trois ligands notre id e tait de d terminer quelle est la forme combin e la plus favorable pour une interaction avec la prot ine Bien que seuls les complexes Eu HMTDPA 3 et Eu HETDPA 3 qui normalement conduisent la r solution de la structure des deux prot ines mod les aucun cristal au profil de diffraction enregis trable n a peu tre obtenu Tableau 4 26 Combinatoire 4 Solution d un complexe d europium pr par au laboratoire SEESIB avec un rapport de 1 ligand HMTDPA pour 2 ligands HECTDPA concentr e 9 mM Ayant toujours effectu la complexation du lanthanide avec les ligands et r alis les diff rents m langes avec mes propres protocoles j ai voulu comparer les r sultats obtenus avec lesdits protocoles avec ceux obtenus partir d une pr paration d un complexe hybride issue du laboratoire de chimie SEESIB 3 mM4 de combinatoire ont t ajout s au 0 46 mM de HEWL dans la goutte de co cristallisation Je n ai jamais observ de mauvais cristaux avec cette combinatoire seulement des cristaux volumineux aux faces r guli res L enregistrement de donn es de diffraction sur ces cristaux a permis d aboutir 172 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Z 99 I SOIIOJEUIQUIOS S 2948 SNUd qO SJEJINS9I sop JIyeNyIdessy psp Nes qey O
204. anthanide et la fonction acide de ces acides amin s En outre dans le cadre de cette approche nous avons aussi compar une r gion de la structure de HvMalDH o vient se fixer un complexe GdDO3A avec la r gion qui valente sur la structure de HvMalDH issue d un cristal natif Cette comparaison a r v l une probable comp tition entre une mol cule de PEG et le complexe qui peut se produire lors d une exp rience de trempage Au regard des r sultats pr liminaires obtenus nous pouvons esp rer qu l issue de ce travail nous pourrons d terminer quel sera le meilleur complexe en fonction de la s quence en acides amin s de la prot ine cible et des conditions de cristallisation 281 Discussion et perspectives DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES Tout d abord au cours de cette discussion je ne reviendrai ni sur la d termination des structures de malate d shydrog nases ni sur les hypoth ses qu elles ont permis d mettre quant l adaptation halophile importance des sites ioniques et de l organisation du solvant Je vais donc me focaliser sur les complexes de lanthanide et leur utilisation Au cours de ce travail de recherche nous avons men une tude sur un nouveau complexe lumines cent le triazonanetripicolinate de lanthanide et nous avons poursuivi celles entreprises pr c demment au sein de l quipe Le d veloppement de ce nouveau complexe a permis d enrichir la collaboration avec le D
205. aphica Section A 35 245 247 322 BIBLIOGRAPHIE Hendrickson W A 1981 Structure of the hydrophobic protein crambin determined directly from the anomalous scattering of sulphur Nature 290 107 113 Hendrickson W A Horton J R and LeMaster D M 1990 Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction MAD a vehicle for direct determination of three dimensional structure The EMBO journal 9 1665 1672 Hendrickson W A and Lattman E E 1970 Representation of phase probability distributions for simplified combination of independent phase information Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry 26 136 148 Hoppe W 1975 Anomalous Scattering Ramaseshan S amp Abrahams S C Horrocks W D 1993 Luminescence spectroscopy Methods in enzymology 226 495 538 Horrocks W D and Sudnick D R 1981 Lanthanide ion luminescence probes of the structure of biological macromolecules Accounts of Chemical Research 14 384 392 Jeudy S Stelter M Coutard B Kahn R and Abergel C 2005 Preliminary crystallographic analysis of the Escherichia coli YeaZ protein using the anomalous signal of a gadolinium derivative Acta crystallographica Section F Structural biology and crystallization communications 61 848 851 Joyce M G Radaev S and Sun P D 2010 A rational approach to heavy atom derivative screening Act
206. apo Il convient de noter que c est la premi re fois qu il est possible d observer par cristallographie les changements conformationnels associ s 4 la catalyse d une MalDH t tram rique En effet comme il n existe pas d inhibiteur comp titif de l oxaloac tate les r organisations conformationnelles n avaient t d crites jusqu alors que pour les LacDH Bien que ce ne soit pas illustr de mani re d taill e dans ce manuscrit la comparaison des formes ouvertes et ferm es entre MalDh et LacDH montre des diff rences notables qui seront exploit es ult rieurement dans le cadre d analyses phylostructurales 7 2 3 CaMalDH la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus et la struc ture de l eau dans son enveloppe de solvatation La malate d shydrog nase homot tram rique de Chloroflerus aurantiacus est compos e de 1236 acides amin s 4x309 Cela lui conf re une masse molaire de 131 kDa un point iso lectrique th o rique de 5 16 et un coefficient d extinction molaire th orique e de 18910 M cm7 Les conditions de cristallisation ayant permis d obtenir des cristaux diffractant haute r solution sont d crites dans la sous section 7 1 1 page 214 7 2 3 1 Int gration des donn es utilis es pour le phasage par la m thode SIRAS La structure de la prot ine naturelle a t r solue par la m thode SIRAS une r solution de 1 70 Deux jeux de donn es ont t utilis s un jeu de do
207. ar aplatissement de solvant et contour e 2 0 o obtenue partir d un cristal d riv de CaMalDH avec le GdHPDO3A Phasage SAD au seuil d absorption CuKo 1 7 de r solution Mod le ruban de la CaMalDH superpos Contrairement aux donn es de diffraction des cristaux de PtMalDH et HvMalDH qui ont t en registr es avec le rayonnement synchrotron celles relatives aux cristaux d riv s de CaMalDH obtenus par trempage avec les complexes GdHPDO3A et GdDO3A ont t enregistr es avec le g n rateur de 221 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE rayons X du laboratoire Ces donn es enregistr es au seuil d absorption Ka du cuivre ont conduit un phasage exp rimental permettant la construction automatique de plus de 85 du mod le avec le complexe GdDO3A et de plus de 95 avec le complexe GGHPDO3A Tableau 7 4 et Figure 7 7 Seulement les cristaux de CaMalDH croissent en pr sence de 40 mM de chlorure de cadmium En re gardant les cartes de Patterson anomale et consid rant le peu de sites Gd construits sur les mod les affin s ainsi que leur taux d occupation nous nous sommes demand si les deux phasages exp rimentaux n avaient pas pu tre r alis s du fait de la contribution anomale des ions Cd En effet la longueur d onde correspondant au seuil d absorption Ka du cuivre 1 541 la valeur de la partie imaginaire f du fact
208. ar le Dr Nathalie Colloc h de l quipe CERVOxy du Laboratoire ISTCT de Caen et par le Pr Thierry Prange de Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques de l Universit Paris V Ren Descartes de Paris Ils sont galement auteurs des deux premi res structures de AfUox en pr sence ou en absence de l inhibiteur 8 azaxanthin obtenues en 2004 par diffraction des rayons X aux r solutions respectives de 1 75 A et 2 30 C est initialement dans le but de trouver d autres conditions de cristallisation pour la prot ine mais cette fois sans son inhibiteur 8 azaxanthine qu elle nous a t confi e En effet comme le but intrins que tait d obtenir des cristaux sans inhibiteur diffractant une meilleure r solution et connaissant les propri t s supramol culaire du Eu DPA 3 gt pouvant conduire de tels cristaux nous nous sommes propos de co cristalliser l AfUox avec ce complexe 10 2 L enhanced Green Fluorescent Protein de Aequorea victoria AVEGFP 10 2 1 Pr sentation de la prot ine et donn es de biologie mol culaire La Green Florescent Protein est une prot ine monomerique soluble du cytoplasme de cellules de la m duse Aequorea victoria La prot ine se caract rise par sa structure en tonneau 6 qui abrite un chromophore qui la rend intrins quement fluorescente et photo excitable La prot ine naturelle pr sente deux maxima d excitation aux longueurs d ondes 395 nm et A 475 nm
209. artes de Patterson anomales La fixation du complexe se manifeste par la pr sence de pics intenses dans les sections de Harker ici la section w Pour ces trois cartes le plus bas niveau est de 1 5 o et chaque pas correspond 0 5 o Au regard de l intensit de ces pics il est d j possible d avoir une id e du nombre de complexes li s la prot ine Il est alors possible d anticiper le succ s du phasage subs quent On remarque que dans la carte de Patterson anomale correspondant au jeu de donn es de diffraction issu d un des cristaux d riv s obtenus par trempage jeu de donn es n 5 l intensit des pics est moindre par rapport aux autres cartes calcul es partir de jeux de donn es issus de cristaux d riv s obtenus par co cristallisation partir de 121 44 D TERMINATION DES PHASES EXP RIMENTALES cette observation on peut d j supposer que la la m thode de trempage utilis e ici et la concentration de Eu HMTDPA 3 qu elle impose ne permet pas d atteindre un taux d occupation similaire celui constat en co cristallisation pour ce m me site Les cartes de Patterson anomales calcul es ont toujours mis en vidence la pr sence syst matique de deux sites de fixation mais dont la population semblait varier notamment pour l un des deux sites Nous expliquons ces diff rences de taux d occupation un peu plus loin dans le chapitre cf 4 5 2 2 page 139 Compte tenu de la positio
210. artie 215 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE 4 14 PEG 400 100 mM ac tate de sodium pH 4 6 40 mM ac tate de de cadmium P 20 mg mL 1 Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R T 293 K 20 C 1 3 jours Cryo protection 25 PEG 400 a Cristal natif de Ca b Conditions de cristallisation et MalDH 800x750 pm de cryo protection Figure 7 6 Cristallisation et cryo protection de la CaMalDH Conditions pour obtenir les cristaux d riv s de CaMalDH Les cristaux d riv s de CaMalDH ont t obtenus avec les complexes G4HPDO3A GdDO3A et GADTPA BMA uniquement par trempage L obtention de cristaux d riv s par co cristallisation s est r v l e impossible Les trempages ont t r alis s dans une solution contenant 100 mM de complexes de lanthanide en plus des constituants cit s dans la figure 7 6 et d une dur e allant de 3 secondes 10 minutes La cryo protection des cristaux d riv s est identique celle des cristaux natifs 7 1 2 L tude de l interaction des trois complexes IRM sur les trois MalDH La comparaison des structures issues du phasage de novo complexe par complexe et site de fixation par site de fixation permettra de d terminer les caract ristiques des sites prot iques pr f rentiels pour la fixation de chacun des compos s et celles r dhibitoires pour leur fixa
211. atissement de solvant d F ivi solution un cris 20 3 1 r Eu HETDPA sur le ion du du mode de fixat lon Affinement des structures et descript HEWL i permettent de juger la iques qu teurs statist ica ind 18 suivant donne les valeurs des Le tableau 4 affin al le HEWL Eu HETDPA qualit du mod 153 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Eu HETDPA 3 HEWL o cristallisation HEWLtrempage Rapport SG oC 3 0 z 10 8 Code RCSB PDB 4BAF R solution A 34 78 1 51 39 10 1 93 Rwork 15 64 18 98 Rfree 17 87 23 19 Nbre de r flexions utilis es 18847 9233 Composition nbre d atomes Prot ine 1048 1048 H20 148 152 Ions 12 13 Ligands 62 12 Res hors Ramachandran 0 0 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 011 0 003 Liaisons Angles 1 384 0 718 Bmoyen prot ine A 15 87 16 90 Bmin prot ine A 7 97 8 25 Bmax prot ine A 47 11 38 02 Bmoyen eau A 30 00 29 27 Bmoyen ions lanthanide A 10 72 19 57 Bmoyen ligands A 14 10 21 42 Site loc 45 19 Site 20cc 7 Tableau 4 17 R sum des statistiques d affinement pour la structure du HEWL avec le Ln HETDPA 3 Au regard de la structure du HEWL mod lis e avec le complexe Eu HETDPA 3 on constate que son mode de fixation n e
212. ative sont d crites dans le second chapitre de la deuxi me partie de ce manuscrit 4 2 7 2 Obtention des cristaux d riv s Ne disposant que d une petite quantit de prot ine seules des exp riences de trempage ont pu tre r alis es avec la HvMalDH et le complexe Ln HMTDPA 3 D une dur e inf rieure ou gale 5 min avec une solution contenant 20 mM Ln HMTDPA 3 d pourvue de MgCl pr sent dans les conditions de cristallisation de la prot ine native ces trempages ont pu tre men s bien 115 4 2 PREPARATION DE CRISTAUX DERIVES AVEC LE COMPLEXE LN HMTDPA 3 EN VUE D UNE EXPERIENCE DE DIFFRACTION DES RAYONS X 4 2 8 L aminopeptidase TET1 12s de Pyrococcus horikoshii PhTET1 12s L aminopeptidase TET1 12s de Pyrococcus horikoshii a aussi t choisie comme prot ine mod le pour cette tude Une fois de plus nous disposions d ja de la prot ine pour la co cristalliser en pr sence du complexe Eu DPA 3 en vue de l exp rience de diffraction de rayons X d crite dans le premier chapitre de la seconde partie La prot ine m a t fournie purifi e et concentr e 6 2 mg mL par la Dr Asunci n Dura membre de l quipe Dura et al 2005 4 2 8 1 Cristallisation de la prot ine native Les conditions de cristallisation sont celles d crites dans le premier chapitre de la seconde partie de ce manuscrit Elles m ont t transmises par la Dr Asunci n Dura 4 2 8 2 Obtentio
213. au m me constat le complexe Eu DPA 3 a auto cristallis dans 24 des conditions utilis es ce qui correspond nouveau la part la plus importante des observations et correspond 46 de l ensemble des profils retenus pour d crire l influence du complexe en co cristallisation Figure 3 7 et 3 8 93 3 2 LES OBSERVATIONS ISSUES DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATISEE AVEC LE EU DPA 5 3 2 4 Co cristallisation de la prot ine CaMalDH avec le complexe Eu DPA Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs B Cristaux de sel de Eu DPA Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu oPa E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA O Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 9 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de CaMalDH avec le complexe Eu DPA Cristaux d riv s E Cristaux de sel de Eu DPA M Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA Figure 3 10 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA s en co cristallisation avec CaMalDH Encore une fois la figure 3 9 indique que l apparition de cristaux de sel de Eu DPA 3 survient dans 23 des conditions de cristallisation Si on s en tient uniquement aux observations des gouttes
214. au repliement et ou diff re significativement des mod les existants le recours aux m thodes de phasage exp rimental est n cessaire D autre part la solution obtenue peut tre biais e par les informations apport es par le mod le choisi et dans ce cas l information introduite peut tre difficile supprimer ou modifier au cours du processus d affinement Protocole que nous avons utilis en cas d chec du phasage de novo Au cours de ce travail de th se comme d crit par la suite nous nous sommes parfois heurt s des situations o la contribution anomale des atomes n a pas toujours permis d aboutir la construction d un mod le suite un phasage exp rimental De plus si la synth se de Fourier anomale cf ci apr s pr sentait toutefois des pics dont la hauteur pr figurait un taux d occupation suffisant pour mod liser une partie du complexe nous avons eu alors recours au remplacement mol culaire En guise de mod le nous avons toujours choisi une structure de la m me prot ine d j r solue par nos soins Nous avons mis au point un protocole de phasage dont le but est de permettre de s affranchir au maximum du biais que pourrait introduire le mod le choisi Voici la description de ce protocole 1 Construction d un mod le prot ique de d part pur pour s affranchir au maximum du biais mod le 29 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE a Si la prot ine tudier est
215. aux apparus suite la co cristallisation de la prot ine HEWL concentr e 0 46 MMi avec respectivement 2 7 mM4 et 12 mM de Eu HECTDPA 3 161 4 6 LE LN HMTDPA UN COMPLEXE MODULABLE Eu HECTDPA HEWLco_ cristallisation Rapport Qtde compress s 5 87 14 92 17 91 Type de donn es MAD SADEur MAD R solution A 38 15 1 36 38 69 1 94 38 75 1 21 Picspa Picsoufre Pk 3 59 24 6 20 42 77 6 45 60 30 5 50 Picsra Picsoufre rm o 56 56 8 04 72 22 7 86 FOM lt FOMM 0 47 0 43 0 52 0 12 0 38 0 14 Nombre de sites 1 1 1 R solution FOM 0 5 A 1 88 2 10 1 68 OO isp acer nn 1 33 0 00 5 28 0 00 1 32 0 00 SIGMAA olomon 0 55 0 50 0 56 Arp Warp construit total 50 129 82 129 104 129 Tableau 4 21 Statistiques de phasage exp rimental pour des cristaux d riv s de HEWL avec le complexe Eu HECTDPA s Le pouvoir phasant du complexe Eu HECTDPA 3 a aussi clairement t observable lors de lexa men de carte de Patterson anomale Figure 4 43 et de la carte de densit lectronique exp rimentale am lior e par modification de densit La figure 4 44 montre que l empilement x entre un des ligands du complexe et le tryptophane du lysozyme est d ja visible dans la carte de densit lectronique exp rimentale Anomalous Patterson Level 1 6 signa step 0 5 signa Anomalows Patterson Level 1 5 sign
216. avec celui du complexe Eu HMTDPA 3 Figure 4 31 Mode de fixation du premier ligand du complexe Ln HMTDPA 3 la surface de TdTHAU Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose saumon De par l axe de sym trie d ordre 2 ce qui est observ pour le premier ligand l est aussi pour le second Ces liaisons engendrent la fermeture de la poche qui se referme alors sur le complexe en le pi geant En outre contrairement au lysozyme je ne vois pas d interaction hydrophobe de type CH r ou T T avec des acides amin s aromatiques Seul l acide amin Phe80 orient vers l int rieur de la poche pourrait faire office de cible mais il est 4 5 du noyau triazole du ligand Enfin bien que la cavit soit riche en mol cules d eau elles ne semblent pas jouer un r le fondamental dans la fixation des ligands Cependant une liaison hydrog ne s tablit entre l oxyg ne du ligand 1 et la fonction carboxyle de la Gly20 via une mol cule d eau de part la sym trie m me observation pour le ligand 2 y 144 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 32 Mode de fixation du second ligand du complexe Ln HMTDPA la surface de TdTHAU Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose saumon Le troisi me ligand
217. avons envisag de poursuivre l avenir cette tude avec la prot ine membranaire EcFhua dont les protocoles de production purification et de cristallisation nous ont t g n reusement transmis par le Dr C cile Breyton de l quipe SSIMPA du groupe Membrane et pathog ne de l institut A Vinverse l tude sur l utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de grands assem blages prot iques s est av r e plus riche en r sultats Nous avons montr que le complexe tris dipicolinate d europium Eu DPA 3 a permis de d terminer la structure de l amino peptidase homodod cam rique t tra drique PhTET1 12s malgr une r solution minimale des donn es de 4 0 A Le phasage par la m thode SAD a t r alis avec le jeu de donn es anomales issu du cristal d riv Eu DPA 3 4 0 de r solution La carte de densit lectronique exp rimentale obtenue s est av r e parfaitement interpr table pour cette tranche de r so lution prouvant que les complexes de lanthanide peuvent conduire un phasage pr cis m me basse r solution Les complexes de lanthanides issus de l imagerie m dicale ont aussi permis d terminer la structure de trois nouvelles enzymes homot tram riques la malate d shydrog nase de la bact rie thermophile 279 8 4 CONCLUSIONS QUANT L UTILISATION DE LA PROTEINE MOD LE ECACRB Chloroflerus aurantiacus CaMalDH la malate d shydrog nase de l arc
218. b and c respectively the two data sets were scaled and merged using the program XSCALE in space group 1222 with cell dimensions of 76 11 87 72 and 100 45 A Structure factor amplitudes were derived using the program XDSCONV Table 1 The asymmetric unit content was estimated as a single subunit via the calculation of the Matthews coefficient The three dimensional structure was determined using the molecular replacement method with the program PHASER v 1 3 3 and diffraction data in the resolution range 40 3 A The search model was a monomer of Chlorobium tepidum MalDH Protein Data Bank PDB code 1GUZ and a unique solution was found with a Z factor of 26 3 LL gain of 613 After a rigid body refinement using data in the resolution 40 3 A an initial R factor of 42 was obtained Subsequent refinement process consisted of energy minimization and individual anisotropic B factor refinement for protein atoms and isotropic B factor refinement for solvent atoms using the complete set of recorded reflections using the program PHENIX v 1 6_288 The model was built with Coot between refinement cycles The current refined atomic model comprises 306 residues and 340 water molecules The homotetrameric molecule that corresponds to the biological assembly can be generated by the crystal symmetry operators of the 222 space group The quality 503 Structural Analysis of MalDH from S ruber of the model was checked using the Mol
219. bleau 4 7 montre que malgr l enregistrement d un jeu de donn es de diffraction d excellente qualit Tableau 4 4 page 120 et le calcul d un pic de 93 o par synth se de Fourier anomale il n a pas t possible de calculer des phases exp rimentales permettant de construire un mod le avec le complexe Eu HMTDPA 3 En outre on constate qu il n y a qu un seul site de fixation pour le complexe la surface de la prot ine TdTHAU Ln HMTDPA 3 TdTHAU Rapport Dm 16 67 M thode d obtention co cristallisation Type de donn es MAD Ln HMTDPA 3 R solution maximum A 1 30 Pi Pi pk o 93 37 7 87 res ics ic pk co gt Pi Pi a o 38 27 6 99 BHG Ie ics ic rm o Fa Soufre RFZ 24 4 FOM re FOME 0 29 0 21 S arp s arp TFZ 54 8 R solution FOM sharp x 0 5 A 2 00 Zanomales 7 Lisonorphes 2 20 6 65 b Statistiques de phasage PP harp acen Psharpacen par remplacement mol culaire SIGMAA olomon 0 40 pour le jeu de donn es de dif 7 fraction issu du cristal d riv de Arp Warp construit total 0 207 TATHAU Buccaneer construit total 0 207 a Statistiques de phasage exp rimental pour le jeu de don n es de diffraction issu du cristal d riv de TATHAU par co cristallisation Tableau 4 7 Statistiques de phasage exp rimental pour le jeu de donn es de diffraction issu du cristal d
220. bserv e la distribution des valeurs qui est attendue pour la densit lectronique une r solution donn e Pour un phasage par la m thode SAD je dirais que c est cette tape que r side le phasage exp ri mental Comme nous l avons vu dans le cadre de la d termination des phases par la m thode SAD la distribution de probabilit s de phases est bimodale et apporte moins d information qu avec la m thode MAD qui m ne a une distribution de probabilit s de phases sans ambiguit Ainsi non seulement les modifications de densit permettent de lever l ambigu t en faisant ressortir la phase correspondant la densit modifi e mais c est aussi et seulement l issue de cette tape que l exp rimentateur peut savoir si la carte de densit lectronique est interpr table ou non Enfin via l utilisation du programme de construction automatique Arp Warp Perrakis et al 2001 j ai pu non seulement juger la qualit de la carte de densit lectronique exp rimentale calcul e partir de ces phases gr ce au crit re nombre d acides amin s construits sur le nombre d acides amin s total mais aussi obtenir un mod le mol culaire de d part Le programme a t utilis avec ses param tres par d faut c est dire 10 cycles de construction automatique avec 10 cycles d affinement pour cycles de construction Le programme d affinement alors appel est celui de la suite CC P4 Refmac Seule la s
221. btenir en quelques minutes 39 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE 1 2 4 5 Evaluation de la qualit des phases exp rimentales dans SHARP Plusieurs indicateurs statistiques permettant d valuer la qualit des phases exp rimentales sont calcul s durant tout le processus de d termination et d am lioration de phases Dans cette partie je donne la description de ceux que nous avons retenus pour illustrer la qualit des phases obtenues l aide des complexes de lanthanide Phasing power Le phasing power Ppower ou p permet d estimer l efficacit du phasage en cours et permet d anticiper l issue de ce phasage Il est mesur pour les r flexions phase non contrainte u isomorphess 4 anomales R OP harpacen 3 PPsharpdcen dans les tableaux et phase contrainte Avec le diagramme de Harker en m moire isomorphes FH p JFPHi FP FH atomes lourds FH calcul s de la phase FHIH et des amplitudes moyennes FP de la prot ine avec FP FH vecteur somme des facteurs de structure des avec la phase FPHi FP FH est l erreur de fermeture calcul e pour les diff rences isomorphes FH re ppranomales EPP EE PTE avec F PHi FPHi la diff rence anomale observ e et 2 F Hi sin s la diff rence anomale calcul e o 4 est la phase de la prot ine Calcul e partir des diff rences anomales l erreur de
222. ccupent exclusivement ce site de fixation le complexe LnTNTPA se fixe dans un deuxi me site la surface de la prot ine TATHAU en dehors de cette cavit 189 5 3 CO CRISTALLISATION DE LA TDTHAU AVEC LE TBTNTPA FIXATION DU TBTNTPA 5 3 4 2 Description du site de fixation 2 taux d occupation 15 Le second site de fixation est lui aussi l interface de deux mol cules dans le cristal figure 5 9 Il montre que les deux chaines lat rales des acides amin s Ag119 et Arg122 de la mol cule de r f rence s cartent comme pour laisser la place quelque chose d imposant La figure 5 10 montre que la charge globale de ce site de fixation est bien plus neutre que celle du site majoritairement peupl Figure 5 9 Second site de fixation du TbTNTPA une interface entre deux mol cules de TdTHAU Cristal d riv obtenu par co cristallisation La mol cule de r f rence est en vert la mol cule sym trique en bleu Figure 5 10 Surface lectrostatique du second site de fixation du TP TNTPA Echelle allant de 4 0 kT e charge n gative rouge 4 0 kT e charge positive bleu 190 CHAPITRE 5 UN TRIS DIPICOLINATE CAG LE LNTNTPA 5 3 4 3 Le complexe TbTNTPA dans l empilement cristallin d un cristal d riv de Td THAU Avoir une vue g n rale de l empilement cristallin peut donner une id e de la taille des canaux de solvant de l accessibilit aux sites de fixation en cas
223. clic Zan La figure 4 2 montre les trois premiers ligands ayant t obtenus au laboratoire SEESIB par chimie click PhOMe acide 4 4 4 methoxyphenyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique Ph acide 4 4 phenyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique et PhNO2 acide 4 4 4 nitrophen yl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique Les complexes de terbium et d europium form s l aide de ces ligands ont fait l objet d analyses spectroscopiques qui seront d crites dans le prochain paragraphe 4 1 1 Caract ristiques chimiques du complexe Tout comme le complexe Ln DPA 3 le Ln HMTDPA 3 est une mol cule non cag e et chirale on la retrouve donc sous forme d un m lange rac mique de deux formes nantiom res La taille du complexe est quivalente une sph re d environ 22 de diam tre Figure 4 3 Sa solubilit dans l eau MilliQ est inf rieure celle du tris dipicolinate de lanthanide 220 mM 298 K elle est de l ordre de 75 mM 298 K temp rature ambiante et 110 mM 315 K Les complexes luminescents Eu HMTDPA 3 et Tb HMTDPA s3 nous ont t fournis sous forme de poudre avec trois ions sodium en guise de contre cation La solubilisation des poudres conduit une solution transparente de couleur jaune Plusieurs mol cules d eau dont le nombre d pend du lanthanide ch lat leur sont d j associ es Le poids mol culaire d un l
224. cm optical path length For each sample 200 absorbance profiles were recorded at 280 nm Tt LDH Sr MalDH and Hm MalDH or 275 nm Ca MalDH at 42 000 RPM at 20 C after a temperature equilibration of 2 h At a protein concentration close to 3 mg ml data were also recorded at 250 nm to avoid optical saturation artifacts The experi mental sedimentation coefficients were determined using the continuous size distributions c s option in the SEDFIT software The data were fitted over the range of 0 1 to 15 s with a resolution grid of 200 points and systematic noise subtraction The sedimentation profiles were well fit with a single component 95 of the signal and some discrete non interacting species which are considered to be contaminants The experimental S value was obtained by the weight average S value of the main sharp distribution peak Because the analyzed enzymes are homologous and display a globular shape we assume that http www expasy ch tools protparam html Structural Analysis of MalDH from S ruber they have a same partial specific volume of 0 74 and friction coefficient f f of 1 20 In the case of Hm MalDH this last assumption is only valid at high salt concentra tions in which the enzyme is stable According to SEDFIT specifications under optimal conditions the S values are given with errors of 0 4 We assume that in most of our experiments the small RMSD and low residual variation of 0 015 optical
225. contenant du sulfate d ammonium Tableau 7 16 236 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES PtMalDH Cristaux obtenus avec sulfate d ammonium Source synchrotron SOLEIL Ligne de lumi re PROXIMA1 M thode SIRAS Donn es Jeu anomal jeu natif a 1 711 Gdz 0 979 Ser Groupe d espace 14 22 Param tres de maille A a 112 402 c 286 400 a 112 211 c 287 261 Contenu unit asym trique dim re A D R solution A 47 73 2 54 2 68 2 54 49 43 2 10 2 21 2 10 Nombre de r flexions uniques 29874 3601 53817 7581 Rmerge 5 8 29 7 8 2 55 3 Rpim 3 5 19 5 3 1 20 8 Sigano XDS 1 43 0 75 Rano 4 9 19 7 OI 11 4 2 6 7 6 1 4 Compl tude 97 3 81 1 99 6 97 6 Redondance 6 7 4 8 8 0 8 0 Tableau 7 16 Statistiques d int gration des jeux de donn es utilis s pour le phasage de PtMalDH par la m thode SIRAS colonne de gauche d un cristal d riv de PtMalDH avec le complexe GGHPDO3A colonne de droite d un cristal natif de PtMalDH cristaux obtenus dans les conditions avec sulfate d ammonium Comme nous allons le voir suite une demande du Dr Madern un autre jeu de donn es a t enregistr sur un cristal natif ayant t obtenu partir des conditions de cristallisation sans sulfate d ammonium en pr sence de PEG Tableau 7 17
226. crB pis se fait avec les 200 mM d imidazole contenus dans le tampon G Comme le montre la photo du gel d naturant de polyacrylamide 8 figure 10 7 ce protocole de purification suffit amplement pour obtenir la prot ine EcAcrB pis pure la composition du gel ainsi que celle du colorant au bleu de Coomassie utilis es sont donn es en annexe Aucun protocole de purification ne pr voit ce jour le clivage de l tiquette histidine car il n entrave en rien la cristallisation de la prot ine Figure 10 7 Suivi de la purification de la prot ine membranaire EcAcrB sur gel d naturant de polyacrylamide 8 La derni re tape est la concentration de prot ine EcAcrB His sur membrane tangentielle tape qui permet aussi le changement de tampon afin de mettre la prot ine dans son tampon de stockage Dans un tube centricon de seuil de coupure 50 kDa la solution finale est concentr e 10 mg mL dans 306 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES un tampon de stockage H contenant 10 mM HEPES pH 7 0 et 0 02 p DDM Ainsi pour 90 mg de fractions membranaires solubilis es on obtient 2 05 mg de prot ine membranaire EcAcrB His purifi e En terme de volume cela revient obtenir 205 pL de solution de prot ine EcAcrBy 10 mg mL pour 3 mL de prot ines membranaires solubilis es 30 mg mL ce qui quivaut environ 1 5 L de culture bact rienne initiale 10 5 Le lysozyme de blanc d uf de poule HEWL
227. cristaux d riv s de HEWL avec le Eu HETDPA 3 Des donn es MAD et SAD ont t enregistr es au seuil d absorption Ly de l europium sur des cristaux d riv s de HEWL Les statistiques d int gration de ces donn es sont r pertori es dans le tableau suivant Eu HETDPA 3 HEWL Rapport et 3 0 10 8 M thode co cristallisation trempage Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD oui non x 1 776 Eur 0 979 1 776 Eur Groupe d espace P43212 P43212 Param tres de maille a 77 107 c 37 828 a 77 763 c 37 896 a 78 209 c 38 012 Contenu unit asym trique 1 mol cule 1 mol cule R solution A 38 55 2 00 2 11 2 00 38 88 1 51 1 59 1 51 39 10 1 93 2 04 1 93 Nombre de r flexions uniques 8077 1118 18899 2644 9278 1304 Rmerge 3 8 7 1 5 0 32 3 4 5 10 6 Rpim 2 4 4 7 2 0 13 3 1 8 4 5 Sigano XDS 5 47 3 59 1 28 0 81 2 15 1 06 Rano 11 0 15 0 2 0 11 0 4 0 5 0 aw 13 9 9 2 10 3 2 4 11 3 6 8 Compl tude 99 4 97 1 99 7 98 0 99 6 98 4 Redondance 6 4 6 0 13 6 12 7 12 5 11 9 Tableau 4 13 Statistiques d int gration des donn es de diffraction de cristaux d riv s de HEWL Eu HETDPA 3 Int gration des donn es de diffraction issues de cristaux d riv s de TdTHAU avec le Eu HETDPA 3 gt Des donn es MAD ont t
228. cturaux observ s entre ces MalDH pour expliquer quels sont ceux qui ont permis telle ou telle adaptation extr mophile au cours du temps 7 1 Les malate d shydrog nases pour une tude rationalis e du mode de fixation des complexes de lanthanide Aupr s du Dr Madern nous disposons donc d une banque de prot ines dont les tudes d j men es montrent qu elles poss dent la m me structure quaternaire homot tram re 300 330 acides amin s par monom re RMSD gt 0 95 entre les structures align es et une similarit de s quence primaire de 72 Figures 7 1 et 7 2 Toutefois malgr ces similitudes ces prot ines ont des propri t s de surface diff rentes en lien avec les conditions physico chimiques auxquelles le cytoplasme de l organisme dont elles sont issues doit faire face Figure 7 3 Ainsi l id e a germ d utiliser ces enzymes homotetram riques comme une banque de fonctions chimiques pour comprendre les modes de fixation des complexes de lanthanide En effet selon les mutations d acides amin s li es l adaptation extr mophiles et les positions conserv es on dispose d un ensemble de conditions physico chimiques qui nous permettent d tudier finement les interactions requises pour que les complexes se lient la prot ine En outre le fait que les MalDH cristallisent dans au moins deux conditions diff rentes engendre des variations suppl mentaires au niveau de la surface prot iq
229. cune fixation du complexe n a pu tre d tect e sur la prot ine AfUox prot ine dont la structure avait pu tre pourtant r solue avec le tris dipicolinate d europium utilis en trempage par Guillaume Pompidor au cours de ses travaux de recherche Lorsque nous affirmons ne pas avoir constat de fixation c est au regard de ces trois crit res gt l absence de signal anomal valu l tape CORRECT du programme XDS gt l absence de pic dans la carte de Patterson anomale l absence de pic suite au calcul d une synth se de Fourier anomale avec les phases calcul es partir du mod le correspondant Dans les tableaux de donn es qui suivent les valeurs entre parenth ses correspondent la tranche de plus haute r solution 4 3 1 1 Int gration des donn es enregistr es sur des cristaux d riv s de lysozyme de blanc d uf de poule Plusieurs jeux de donn es de diffraction ont peu tre enregistr s partir de cristaux d riv s de HEWL avec les complexes tris hydroxymethyltriazoledipicolinates d europium de terbium et d ytterbium Ceux ayant abouti la construction d un mod le sont ceux dont les statistiques sont donn es dans les tableaux 4 1 4 2 et 4 3 suivants Les d finitions de l ensemble des indicateurs statistiques utilis s sont donn es dans l introduction du manuscrit 117 4 3 ACQUISITION ET TRAITEMENT DES DONN ES DE DIFFRACTION HEWL 1 Tb HEWL 2 Eu
230. cycle de construction conduit une carte de densit aplatie aussi bien interpr table l il que par les programmes de construction automatique de mod le M me si la valeur que prend cet indicateur l avant dernier cycle est importante l volution entre celle au premier cycle et celle l avant dernier est aussi prendre en consid ration Une valeur inf rieure 0 1 au premier cycle est synonyme d une mauvaise carte de d part et donc de phases de d part impr cises De plus dans le cas de la m thode SAD cette premi re valeur que peut prendre le I 4 permet de discriminer la bonne main de la mauvaise valeur bien plus lev e au premier cycle d aplatissement s il s agit de la bonne main 1 3 La diffusion anomale Afin de r soudre ce probl me des phases nous utilisons des m thodes de calcul de phases qui exploitent le fait que le facteur de diffusion atomique d un atome donn varie fortement en module et en phase dans la r gion d un seuil d absorption de cet atome C est ce ph nom ne qu on appelle la diffusion anomale 1 3 1 Pr sentation du ph nom ne La th orie classique de la diffusion d un rayonnement lectromagn tique par un lectron appel e diffusion Thomson repose sur le mod le de l lectron libre Sous l action du rayonnement incident les 41 1 3 LA DIFFUSION ANOMALE lectrons des atomes mettent un rayonnement de m me fr quence mais
231. d tecteur plusieurs longueurs d onde on peut en plus suivre sp cifiquement la concentration en EGFP en utilisant aussi la d tection 488 nm Des aliquots du passe tout droit du lavage au tampon A HisTrap et du m lange final des fractions ont toujours t pr lev s pour analyse sur gel de polyacrylamide 12 Pour 4 L de culture et 8 g de culots bact riens entre 70 et 90 mL de EGFP tiquet e peuvent tre r cup r s par ce protocole 10 2 2 6 Colonne de d salinisation Afin de retirer un maximum d imidazole de la solution riche en EGFP tiquet e nocif pour la prot ine moyen terme et afin de changer de tampon ladite solution j ai utilis pour cette tape transitoire une colonne de d salinisation PD 10 Amersham Biosciences 4 C Le protocole fourni avec la colonne PD 10 a t scrupuleusement suivi afin d changer le tampon J ai cependant du concentrer la solution de EGFP tiquet e au pr alable afin d obtenir l chantillon de 2 5 mL requis Pour cela la prot ine a t concentr e sur membrane tangentielle tube centricon Millipore Amicon Ultra de seuil de coupure de 10000 Da et de 15 mL 4 C et 5000 tpm La colonne a t quilibr e avec 25 mL du tampon de d salinisation puis l chantillon de 2 5 mL contenant la prot ine tiquet e a t pass Un aliquot de la solution r sultante a t pr lev e pour analyse sur un futur gel de polyacrylamide 12
232. de cristaux d riv s avec le CEE AR PE SR ce has da dee iis ae em dak NA Re ee 116 43 Acquisition et traitement des donn es de diffraction 117 4 3 1 Statistiques d int gration des donn es pour les prot ines pr sentant une fixation du Complexes 4 ri ak gate RE ER Se ns ete Das us Aie 117 4 3 1 1 Int gration des donn es enregistr es sur des cristaux d riv s de lysozyme de blanc d uf de poule 117 4 3 1 2 Int gration des donn es enregistr es sur des cristaux d riv s de thauma tine de Thaumatococcus daniellii 119 4 4 D termination des phases exp rimentales 120 44 1 Evaluation de la qualit des phases d termin es pour le lysozyme de blanc d uf depoul ses ns ENS to tas bet he BNR TES PT nr ee ae ne 120 4 4 2 Evaluation de la qualit des phases d termin es pour la thaumatine de Thauma tococcus daniel sx neg se einer ER ann pales ee Re r 125 4 5 Affinement des structures et description du mode de fixation du Ln HMTDPA 3 126 4 5 1 Statistiques des affinements des structures issues de cristaux d riv s 126 4 5 1 1 Statistiques des affinements des structures du HEWL avec le Ln HMTDPA 3 126 4 5 1 2 Statistiques des affinements des structures de la TATHAU avec le Ln HMTDPA 3 128 4 5 2 Description des modes de fixation du Ln HMTDPA s gt 129 4 5 2 1 Le Ln HMTDPA 3 la surface du
233. de diffusion fj de l atome j et son complexe conjugu fi sont gaux Pour une paire de Friedel compos e des r flexions hkl h et hkl h ona F F b J fyexp i2mh x J F F h gt f exp i27h x J Si pour tous ces atomes fj fj on voit que F F Les deux intensit s I et I d une paire de Friedel sont en effet gales 1 F F F F I Dans le cas d un cristal natif ne contenant pas de diffuseurs anomaux remarquables la loi de Friedel est donc respect e les amplitudes d une paire de Friedel Fp et Fp sont identiques Dans le cas d un diffuseur anomal j le facteur de de diffusion atomique fj devient complexe f AOS Consid rons ce diffuseur anomal introduit dans un cristal de prot ine pour obtenir un cristal d riv Soit Fy et Fh respectivement les contributions des parties r elles et imaginaires du facteur de diffusion atomique au facteur de structure du diffuseur anomal On a donc Fy S Cf f exp i2th xj et Fy f exp i2rh xj j j 47 1 4 LA BRISURE DE LA LOI DE FRIEDEL Consid rons les facteurs de structure du cristal d riv du cristal natif et des diffuseurs anomaux Fpy Fp et Fa Fy F respectivement Fpy Fp Fa Fp Fy Fh De part la contribution Fy et F des diffuseurs anomaux les amplitudes d une paire de Friedel diffract es par le cristal d riv deviennent diff rentes F
234. de fixation des complexes il est essentiel que les donn es enregistr es soient de qualit lev e Les valeurs statistiques consign es dans les tableaux 7 1 7 2 et 7 3 permettent de juger la qualit des donn es enregistr es sur les cristaux d riv s obtenus en pr sence de GdHPDO3A 217 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Int gration des donn es de diffraction issues d un cristal de CaMalDH d riv avec le com plexe GdHPDO3A GdHPDO3A CaMalDH M thode trempage 100 mM de complexe 3 secondes Situation Institut de Biologie Structurale Source de rayons X G n rateur de laboratoire MAD non x 1 541 Cuga Groupe d espace P3121 Param tres de maille a 106 775 c 103 526 Contenu unit asym trique dim re A D R solution 19 63 1 67 1 76 1 67 Nombre de r flexions uniques 78541 10741 Rmerge 7 1 75 5 Rpim 3 4 40 2 Sigano XDS 1 29 0 85 Rano 4 3 28 9 ott 9 6 1 0 Compl tude 99 1 94 0 Redondance 10 3 8 2 Tableau 7 1 Statistiques d int gration du jeu de donn es de diffraction d un cristal d riv de CaMalDH avec le complexe G4HPDO3A J ai conserv une haute r solution de 1 67 A malgr une valeur de Rmerge de 75 posteriori car j ai constat que la haute r solution tait essentielle pour entrevo
235. de tris dipicolinate can be used and we examined its possible ability to promote protein crystallization supramolecular effect Secondly a newly developed lanthanide tris hydroxymethyltriazoledipicolinate complex Ln ITDPA 3 derived from this previous complex allowed us to obtain a very precise de novo phasing for solving the high resolution structure of the hen egg white lysozyme and the thaumatin from Thaumatococcus daniellii Besides various ligands for these new complexes were synthetized by click chemistry enabling us to create both unique complexes outfit and hybrid complexes We have shown that this new complexes family presents a better affinity for proteins allowing their use at very low concentrations Tests conducted with those LnaTDPA have also evidenced the importance of complex global charge to explain the supramolecular effect Third a caged tripicolinate the Lon TNTPA was evaluated Characterized by a neutrally charged chemical cage we have shown that this new luminescent complex is the only one of the picolinate complexes family that can be used in the presence of divalent ions In the second part of this thesis we describe the use of lanthanide complexes for phasing large multimeric proteins by de novo phasing methods First the structure of the 480 kDa dodecameric aminopeptidase PRTET1 12s was solved at 4 A resolution by using the europium tris dipicolinate which demonstrates that the lanthanide complexes can be used to obtain
236. demment par le programme Phaser cf protocole utilis pour les exp riences SAD et MAD Lors de cette tape la combinaison de phases a toujours t d sactiv e afin que le calcul de la carte aplatie s affranchisse un peu plus du biais qu a pu introduire le mod le dans le calcul des phases initiales Dans ce cas la combinaison de ces phases initiales avec les nouvelles phases am lior es n est plus utilis e et seules ces derni res sont utilis es b Construction automatique de mod le par le programme Buccaneer Cowtan 2006 l aide des amplitudes exp rimentales des phases am lior es et de la s quence primaire de la prot ine sans cycle d affinement entre les cycles de construction A l issue de ce remplacement mol culaire trois indicateurs statistiques sont calcul s permettant de juger la qualit des solutions propos es le gain du logarithme de maximum de vraisemblance global LLG et les Z scores des fonctions de rotation RFZ et de translation TF7 du mod le orient La valeur du LLG indique quel point les donn es calcul es partir du mod le orient sont meilleures que celles qui auraient t pr dites partir d un mod le atomique al atoire autrement dit qu un maximum de vraisemblance calcul partir d une distribution de Wilson Si cette valeur est n gative cela signifie que notre mod le orient est moins bien choisi qu un mod le atomiq
237. dence par exp rience de Biacore Le GdDO3 lt A se fixe sur CaMalDH m me tr s faible concentration Par contre il y a un effet seuil avec le lysozyme il faut charger injection avec au minimum 100 mM de complexe pour qu il se fixe la prot ine L interaction entre le complexe GdHPDO3A et les prot ines HEWL et CaMalDH a aussi pu tre mise en vidence par exp rience de Biacore M me observation qu avec le complexe G4DO3A il y a un effet seuil avec le lysozyme Il faut ajouter le complexe plus de 100 mM pour d tecter une interaction Cependant aucune interaction entre le G4HPDO3A et la prot ine TdTHAU n a pu tre d tect e 313 11 1 D TECTER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE SUR DES MACROMOL CULES BIOLOGIQUES PAR R SONNANCE PLASMONIQUE DE SURFACE BIACORE test_compos Fc 4 3 1_Y test_compos Fc 4 3 1_Y test_composE Fc 4 3 2_Y test_composE Fc 4 3 2_Y EuHMTDPA3_Lyso_ph7_repro EuHMTDPA3_Lyso_ph7_repro 500 300 400 200 S 300 S 100 2 2 e e amp B 200 x 0 100 100 200 0 200 400 600 800 1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Temps s Temps s a Interaction mesur e par Biacore entre le complexe b R g n ration de la puce Biacore o l interaction entre le Eu HMTDPA 3 inject deux concentrations diff rente complexe Eu HMTDPA 3 et la prot ine HEWL a t observ e et la prot ine HEWL Figure 11 5 Observation reproductible de
238. density permitted us to determine S values with an uncertainty of 1 The c s analysis within such confident limits was shown to be very satisfactory to characterize halophilic Hm MalDH in complex solvents and to probe the behavior of an elongated protein in concentrated salt solution Crystallization and structure determination of Sr MalDH Crystals were grown at room temperature using the hanging drop vapor diffusion method Sr MalDH pro tein 11 mg ml in 50 mM Tris HCl pH 8 was mixed with an equal volume 2 ul of mother liquor of 1 M LiCl pH 4 0 0 1 M citric acid and 10 polyethylene glycol 6000 The crystal was soaked into a cryo protective buffer mother liquor containing 20 v v added glycerol before being flash cooled in a nitrogen vapor stream at 100 K Diffraction data were collected to a resolution of 1 55 A at beam line BM30 of the European Synchrotron Radiation Facility ESRF Ice rings at resolutions of 2 2 and 1 9 A were visible in diffraction frames and reflections in these resolution ranges were excluded A second crystal was soaked in a slightly different cryo protectant buffer mother liquor containing 25 v v added glycerol and diffraction data were recorded to a resolution of 1 8 A at ESRF beam line ID29 Diffraction data frames from each data set were indexed and integrated with the program XDS As the crystals were isomorphous a difference of 0 1 0 4 and 0 3 in cell parameters was observed for a
239. des acides amin s tryptophane du site de fixation 316 CHAPITRE 11 EXPLORATION D AUTRES M THODES POUR REVELER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE AVANT L ETAPE DE DIFFRACTION 11 2 4 Conclusion Par une exp rience de r sonance magn tique nucl aire bidimensionnelle de type NOESY il semble donc tout fait possible de r v ler la fixation d un complexe de lanthanide sur une prot ine en solution Cependant il faut aussi garder l esprit qu une exp rience de RMN requiert une tr s grande quantit de prot ine quantit qu il est rarement ais d obtenir 317 Bibliographie Abrahams J P and Leslie A 1996 Methods used in the structure determination of bovine mito chondrial F1 ATPase Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 52 30 42 Adams P D Afonine P V Bunkoczi G Chen V B Davis I W Echols N Headd J J Hung L W Kapral G J Grosse Kunstleve R W McCoy A J Moriarty N W Oeffner R Read R J Richardson D C Richardson J S Terwilliger T C and Zwart P H 2010 PHENIX a comprehensive Python based system for macromolecular structure solution Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 213 221 Allen K N and Imperiali B 2010 Lanthanide tagged proteins an illuminating partnership Current Opinion in Chemical Biology 14 247 254 Baker N A Sept D Joseph S Holst M J and Mc
240. des amin s aspartate et glutamate Mais tous ces groupements prot iques ionisables ont un pKa en solution La protonation de ces acides amin s est toujours d pendante du pH de la solution tampon utilis e dans les conditions de cristallisation De fait la fixation des complexes doit tre d pendante de cette protonation Que se passe t il si tr s bas pH les acides amin s aspartate et glutamate sont proton s Pourront t il toujours fixer l ion lanthanide du complexe Si les acides amin s arginine et lysine sont d proton s pH tr s basique pourront t ils tablir des liaisons hydrog nes avec les ligands des complexes L influence du pH pourrait par exemple expliquer l absence totale de fixation du complexe GdDO3A sur l enzyme PtMalDH En effet les cristaux sont obtenus pH 3 5 A ce pH tous les groupements acides des acides amin s aspartate et des glutamate doivent tre proton s Ainsi de part leur tat carboxylique et non plus carboxylate il est possible que ces fonctions ne puissent plus s impliquer dans une liaison ionique avec l ion lanthanide du complexe LnDO3A En fonction des r sultats qui seront obtenus sur une s rie large de MalDHs nous pourrons proposer une m thode d analyse de la s quence d une prot ine de structure inconnue et ainsi r pondre la question Quel complexe dois je utiliser pour r soudre la structure de ma prot ine D ores et d j je peux anticiper que cette m thode aura
241. des formes ouvertes et ferm es entre malate et lactate d shydrog nases montrent des diff rences notables qui seront exploit es ult rieurement dans le cadre d analyses phylostructurales Troisi mement nous avons pu mettre en vidence une organisation singuli re des mol cules d eau la surface de CaMalDH Les prot ines halophiles ont principalement volu en modifiant leurs surfaces d interaction avec le solvant ce qui engendre une modification de leur enveloppe de solvatation en solution par rapport leurs homologues non halophiles Gr ce la d termination de la structure de Venzyme CaMalDH haute r solution il a t possible de d montrer pour la premi re fois que la minimisation de l exposition au solvant de groupements hydrophobes haut sel pourtant d favorable d un point de vue nerg tique est la principale force volutive qui dicte l adaptation des prot ines halophiles Ces enzymes MalDH partagent plus de 72 de similarit de s quence et pr sentent pourtant des propri t s de surface tr s diff rentes en fonction de leur caract re adaptatif Ainsi en utilisant ces enzymes comme biblioth que de fonctions chimiques nous avons pu mettre en place une nouvelle ap proche m thodologique pour comprendre finement les modes d interaction des complexes de lanthanides Cette approche a t mise l preuve avec les trois malate d shydrog nases diff rentes pr cit es et trois complexes IRM GdHPDO3A
242. des statistiques d affinement de la structure native de PtMalDH avec construction d ions sulfates SO et NAD A Vissue de l affinement de la premi re structure nous avons t m me de construire un mod le de enzyme dans son int gralit Nous avons aussi pu construire un certain nombre de mol cules de sulfate ainsi qu une mol cule de cofacteur NAD Le NADF n ayant pas t ajout ni au cours de la purification ni au cours de la cristallisation les deux mol cules de NAD pi g es dans chaque monom re doivent provenir du cytoplasme de la bacterie E coli utilis e pour la production des MalDH recombinantes A la demande du Dr Madern qui souhait aussi avoir une version d pourvue de tout ligand forme apo nous avons donc r solu la structure de l enzyme enti re issue du cristal obtenu dans les conditions sans sulfate d ammonium En effet cette fois aucun groupement sulfate n a pu tre mod lis ni aucune mol cule de NAD 239 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO PtMalDH Sans NH4 2SO4 Code RCSB PDB 4BGV R solution A 46 47 1 81 Rwork 14 65 R free 18 47 Nbre de r flexion utilis es 121529 Composition nbre d atomes Prot ine 10046 H20 1219 Ligands 100 Res hors Ramachandran 0 60 Ecarts types globaux LiaisonSLongueurs A 0 008 Liaisons 4ngies
243. diff rents compos s ont t r alis es l aide du logiciel Chemdraw Ultra de la soci t CambridgeSoft dans sa version 11 0 Cousins 2011 Les surfaces lectrostatiques pr sent es dans ce manuscrit ont t calcul es partir du mod le avec le module APBS Tools2 pour Pymol dans sa version 2 1 Baker et al 2001 Pour les calculs de Poisson Boltzmann des surfaces lectrostatiques le module fait appel au programme PDB2PQR Dolinsky et al 2004 Glossaire P Concentration en prot ine P Volume de solution concentr e en prot ine pr lev C Concentration en complexe C Volume de solution concentr e en complexe pr lev R Volume de solution pr lev dans un r servoir de plaque de cristallisation APS Persulfate d ammonium DDM n dod cyl beta D maltoside CHM 6 Cyclohexyl beta D maltoside DMSO Dim thylsulfoxyde DO Densit optique EDTA Acide thyl ne diamine t trac tique FPLC Chromatographie rapide des prot ines en phase liquide HCI Acide chloridrique HEPES Acide 4 2 hydroxy thyl 1 pip razine thane sulfonique HPLC Chromatographie en phase liquide 4 haute performance IPTG Isopropyl D thiogalactopyranoside IRM Imagerie par r sonance magn tique MAD Multiple wavelength anomalous diffraction MgCl Chlorure de magn sium MPD 2 Methyl 2 4 pentanediol NaCl Chlorure de sodium NAD Nicotinamide adenine dinucleotide PCR R action en chaine par polym rase PEG MME Polyethy
244. ds dans le cas des com plexes Ln TDPA 3 La qu te du complexe parfait Disposer d un complexe de lanthanide unique tr s soluble capable de se fixer au plus grand nombre de prot ines utilisable dans n importe quelle condition de cristallisation et dont la fixation dans les cristaux peut tre d tect e par une m thode simple est notre but ultime A issue de ce travail de th se je souhaite toutefois formuler une sorte de mise en garde D une part nous avons pu constater qu chaque nouveau complexe synth tis pour un certain nombre de nouvelles propri t s gagn es on perd une ou plusieurs propri t s d sirables ou on gagne des ind sirables D autre part nous avons encore en notre possession un certain nombre de complexes de lanthanide lyophilis s produits par la soci t Bracco Imaging que nous n avons pas encore pu tudier Je pense donc qu il ne faut pas se fourvoyer en s aventurant trop t t dans la synth se et l analyse d un tout nouveau complexe de lanthanide Il faut en premier lieu parfaire notre connaissance des modes de fixation des complexes utilis s jusqu pr sent ce que les tudes MalDH et HEWL TEWL devraient permettre En l tat actuel de nos connaissances le complexe quasi id al est certainement le LnDO3A En effet il pr sente un mode de fixation privil giant les tr s ubiquistes acides amin s aspartate et glutamate et une souplesse d utilisation en co cristallisation ou en
245. du complexe engendre des mouvements de cha ne lat rale de r sidus en interaction directe avec le complexe Elle r sulte g n ralement de multiples interactions faibles impliquant le plus souvent un r seau de mol cules d eau coordonn es entre le complexe et la surface prot ique et elle semble d pendre de la forme de la surface prot ique Les complexes se lient souvent dans des cavit s plus ou moins prononc es form es par la surface de la prot ine thaumatine ou par l empilement cristallin lysozyme ce qui indique l importance de facteurs st riques pour la fixation Les complexes charg s n gativement ont plus tendance se lier sur des parties de surface charg es positivement que les complexes neutres Aussi les complexes semblent se lier de pr f rence selon une orientation qui accorde leur forme la forme de la surface La fixation des 7 complexes test s peut combiner diff rents types d interaction 1 L interaction directe entre l ion Ln et des atomes charg s n gativement des r sidus de la surface prot ique atome d oxyg ne de la cha ne lat rale des r sidus Asn Gln Asp ou Glu 2 Des ponts salins ou des liaisons hydrog nes directes entre les atomes d oxyg ne des bras des ligands avec des acides amin s donneurs ou accepteurs d hydrog ne de la surface prot ique 3 L interaction hydrophobe entre le macrocycle et des r sidus aromatiques de la surface prot ique 4 L tablissement d un
246. dual amino acids 3 4 Experimental 3 09 A SIRAS phasing We performed SIRAS single isomorphous replacement with anomalous scattering phasing using the 3 09 A resolu tion native data set from which the structure of PhTET1 12s PDB code 2cf4 was solved by molecular replacement Rossmann 1990 As for the SAD phasing the SIRAS experimental phases were accurate since the figure of merit b e a Experimental 4 0 A SAD electron density map contoured at 1 50 showing b one of the large pores situated in each facet of the PhTET1 12s particle that gives access to the interior of the system and c one of the small orifices situated on each of the four apices Figs 1 and 2 were prepared using COOT Emsley et al 2010 and PyMOL http www pymoLorg 76 Romain Talon et al Lanthanoid complexes J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 diffraction structural biology Figure 2 a Experimental 4 0 SAD electron density map b Experimental 3 09 SIRAS electron density map Both maps are contoured at 1 50 The model shown corresponds to PDB code 2cf4 Schoehn et al 2006 c Anomalous Fourier map contoured at 100 showing that the Eu ion of the Eu DPA complex is located between two monomers on the large channel side of the particle This dimer is considered as the minimal building block to form the whole TET1 particle after SHARP and DM were 0 211 and 0 785 respectively Despite the introduction of the
247. e 1 0 calcul e sur l ensemble du jeu de donn es pour toute la gamme de r solutions indique une fixation du diffuseur anomal mais cela n implique pas pour autant la r ussite du phasage ult rieur 54 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE 1 5 8 2 Calcul des amplitudes des facteurs de structure partir des intensit s A la fin de l tape d int gration r alis e avec le programme XDS le fichier ASCII contenant les intensit s de chaque r flexion n est pas enregistr dans un format autorisant les diverses manipulations n cessaires pour la suite des v nements Nous avons pour habitude d utiliser les programmes COMBAT et SORTMTZ pour le convertir en un tel format Les diff rentes observations de chacune des r flexions sont mises l chelle avec le programme SCALA qui les convertit alors en intensit s moyennes Evans 2005 Enfin nous utilisons le programme TRUNCATE pour obtenir les amplitudes des facteurs de structure partir de ces intensit s mises l chelle Ces quatre programmes font partie de la suite CCP4 Collaborative Computational Project Number 4 1994 De plus les programmes SCALA et TRUNCATE calculent des indicateurs statistiques tels que les facteurs Rmerge Rano Rpim le rapport signal sur bruit la compl tude la redondance ou multiplicit ainsi que la proportion th orique de solvant dans l unit asym trique Indicateurs que j utilise tout
248. e il faut trouver un compromis entre une valeur lev e de f et les probl mes li s l utilisation de rayons X mous Une longueur d onde optimale avec une ligne de lumi re non optimis e pour les grandes longueurs d onde conduit des rapports de Bijvoet tr s faibles Utiliser ce faible signal anomal n cessite des donn es d une tr s grande pr cision les donn es doivent donc tre enregistr es avec une redondance tr s lev e Cette m thode ne s applique donc pour le moment qu des cristaux qui diffractent tr s bien et qui r sistent aux d g ts d irradiation 1 7 3 Utilisation de gaz nobles Il est aussi possible d obtenir des cristaux d riv s en introduisant des gaz nobles x non ou krypton dans des cristaux natifs Schiltz et al 2003 Ces cristaux sont d di s aux m thodes de phasage SIRAS ou MIRAS Pour cela on soumet les cristaux une atmosph re du gaz sous pression dans une cellule d di e Ces gaz tant relativement bien solubles dans l eau ils diffusent rapidement dans les canaux de solvant du cristal Cette m thode permet ainsi d obtenir des cristaux d riv s qui sont isomorphes aux cristaux natifs et qui peuvent pr senter un nombre lev de sites de fixation 1 7 4 Introduction d atomes lourds par trempage et co cristallisation Des cristaux d riv s de macromol cules biologiques peuvent tre aussi obtenus en trempant un cristal natif dans une solution concentr e en diff
249. e ce type d ions Le complexe tant de surcroit de taille plus importante notre choix s est port sur la malate d shydrog nase de Chloroflerus aurantiacus dont les cristaux apparaissent en pr sence de 40 mM d ac tate de cadmium et dont les diam tres des canaux de solvant sont importants cf chapitre 2 de la seconde partie 5 2 Co cristallisation du HEWL avec le complexe TbTNTPA pas de fixation du TbTNTPA Bien que des cristaux de lysozyme de blanc d ceuf de poule soient apparus en co cristallisation avec 24 mM4 30 MMe et 60 mM et malgr l enregistrement de donn es MAD trois longueurs d onde je n ai pas pu constat de fixation du complexe THTNTPA Aucun signal anomal n est pr sent dans les donn es de diffraction La synth se de Fourier anomale ne permet pas non plus de d tecter des sites de fixation L absence de luminescence des cristaux de formes identiques celles des cristaux natifs par rapport au reste de la goutte corrobore cela Figure 5 4 183 5 3 CO CRISTALLISATION DE LA TDTHAU AVEC LE TBTNTPA FIXATION DU TBTNTPA a HEWL 24 mM b HEWL 24 mM TbTNTPA lumi re visible TbTINTPA lumi re visible c HEWL 24 mM d HEWL 24 mM TbTNTPA UV proches TbTNTPA UV proches Figure 5 4 Cristaux non luminescents de HEWL obtenus en pr sence de 24 mM de TbINTPA Le complexe LnTNTPA ne semble donc pas capable d effet supramol culaire La compacit de l em pilem
250. e complexe tant luminescent dans le visible une lampe UV de paillasse pourra facilement r v ler sa fixation dans les cristaux 285 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES C est le complexe qui pr sente la plus forte affinit pour les macromol cules biologiques il pourra donc tre utilis faible concentration de 3 10 mM Par contre il vaut mieux utiliser le Ln HMTDPA 3 en co cristallisation car sa fixation semble moins vidente par trempage gt recommander le LnHPDO3A si les conditions de cristallisation ne permettent pas l utilisation du Ln HMTDPA s3 Le LAHPDO3A est aussi connu pour tablir des interactions hydrophobes avec les acides amin s tryptophane Il n est pas luminescent mais il est tout fait utilisable en trempage Il est stable quelle que soit la condition de cristallisation et comme le LnDO3A il vaut mieux l utiliser en concentration saturante plus de 80 mM gt pr coniser le complexe Ln DPA 3 si la solubilisation de la prot ine d int r t semble sous entendre une surface prot ique tr s basique ou si la s quence primaire pr sente une importante quantit d acides amin s arginine ou lysine Tout comme le Ln HMTDPA 3 il a l avantage d tre luminescent on peut donc d tecter sa fixation dans les cristaux Mais il reste inutilisable si les conditions de cristallisation de la prot ine exigent l utilisation de sels d ions divalents et ou de fortes concentrations e
251. e de Patterson anomale Param tres du programme HySS de la suite Phenix et du programme ShelxD de la suite CCP4 Que ce soit avec l un ou l autre des programmes la recherche de de la position des lanthanides a toujours t r alis e en utilisant les intensit s mises l chelle et leur sigma associ I SIGI I SIGI En ce qui concerne le programme ShelxD la recherche d un nombre de sites a t r alis e sur plus de 500 it rations Bien qu il ait la m me utilit que le programme ShelxD j ai davantage utilis le programme HySS avec comme indication un nombre de sites attendus gal au nombre de sites identifi s et confirm s sur la carte de Patterson anomale pour la cr ation des fichiers d entr e n cessaires au programme ShelxD 1 2 3 5 La synth se de Fourier anomale Comme nous l avons vu la synth se de Fourier permet de passer de l espace r ciproque vers l espace r el et vice versa Contrairement la carte de Patterson elle contient donc une information de phase Nous avons utilis le calcul d une synth se de Fourier pour faire appara tre l ensemble des sites de fixations des lanthanides autour d un mod le donn Le coefficient utilis pour le calcul de la synth se est la diff rence de Bijvoet Dano F F La phase utilis e pour calculer la carte est en retard de 3 La carte obtenue par synth se de Fourier anomale peut galement servir d termine
252. e de contr le suppl mentaire et ne contenant que le Ln DPA 3 a t analys au robot Ce troisi me chantillon m a permis d une part d affiner mes observations quant au comportement du complexe en pr sence et en absence de prot ine et d autre part de me servir de contr le visuel pour la comparaison des faci s cristallin Le robot de cristallisation nanogoutte du laboratoire HTX l EMBL Grenoble utilise des plaques de cristallisation 96 puits Greiner avec 3 emplacements de gouttes assises par puits Hormis AcrB qui a t cristallis e en goutte suspendue sur le film plastique qui recouvre herm tiquement la plaque la pr sence de d tergent provoquant sinon l talement de la goutte dans les emplacements pour goutte assise toutes les autres prot ines ont t cristallis es selon la m thode de la goutte assise Le robot d pose 100 uL de solutions de cristallisation qui diff rent dans chacun des 96 puits Puis pour former la goutte il pr l ve et d pose 100 nL d un chantillon avant d y ajouter 100 nL de puits La pr sence de trois emplacements par puits m a permis pour chaque prot ine de synchroniser la cristallisation de la prot ine seule et la co cristallisation de la prot ine avec le complexe Le volume d un chantillon requis pour une exp rience de cristallisation avec ces six kits est de 90 yL Le tableau 3 2 r capitule les concentrations en prot ine en en complexe dans la goutte de cri
253. e de fixation du 1 ligand du complexe Ln HMTDPA 3 la surface du HEWL dans le premier site Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose Site 1 description de l interaction du second ligand avec la prot ine Le deuxi me ligand ligand 2 est li par une interaction hydrophobe de type empilement x entre son cycle triazole et le cycle benz nique du noyau indole du Trp62 de la mol cule sym trique Figure 4 20 La distance mesur e entre les deux cycles est de 3 4 A Bien que la chaine lat rale de l Arg73 de la mol cule 130 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE sym trique soit orient e vers le centre du complexe sa distance de 3 9 vis a vis d un des groupements carboxylates de ce ligand est trop grande pour permettre une liaison hydrog ne L Arg73 interagit avec le troisi me ligand Pour la suite du manuscrit nous nommons ligand 2 ce ligand qui tablit la liaison mr avec la prot ine Figure 4 20 Mode de fixation du 2 ligand du complexe Ln HMTDPA 3 la surface du HEWL dans le premier site Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose Site 1 description de l interaction du troisi me ligand avec la prot ine Le troisi me ligand ligand 3 est fix la mol cule de r f renc
254. e de novo Dans les sections suivantes je vais bri vement pr senter ce que les trois nouvelles structures r solues par la m thode de phasage SIRAS ont apport la compr hension de l adaptation halophile Comme cela a t expliqu dans l introduction de ce chapitre les enzymes MalDH doivent faire face des conditions de stress dans le cytoplasme de l organisme Conditions qui d pendent du caract re extr mophile de l organisme En ce qui concerne les MalDH des cytoplasmes d organismes halophiles ces enzymes doivent rester actives des concentrations en sel sup rieures au molaire Ginzburg and Sachs 1970 L tude de la composition et de la structure du solvant la surface des MalDH halophiles devrait apporter de pr cieuses informations sur l adaptation des prot ines aux hautes concentrations en sel En effet l hypoth se de base toute cette tude structurale est que les substitutions adaptatives de 231 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO surface chez les prot ines halophiles induisent une organisation du solvant leur surface diff rente de celles non halophiles Ceci leur conf re des propri t s de solubilit tr s diff rentes ce postulat mane d une tude dont la description d taill e se trouve dans notre article ajout la fin du ce chapitre 7 2 1 HvMalDH la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii La malate d shydrog nase homot tr
255. e de promouvoir la nucl ation En regroupant toutes les observations faites sur les gouttes contenant du tris dipicolinate d europium avec les six prot ines utilis es on peut dresser un bilan statistique sur l auto cristallisation du complexe Eu DPA 3 Ce bilan est illustr dans les figure 3 15 et 3 16 Conditions o des cristaux de complexe Conditions o le complexe cristallise quelle Conditions o le complexe n a cristallis qu en O n ont t observ s que dans un seul cas O que soit la prot ine 71 mM et seul 25 mM pr sence de prot ine Conditions o des cristaux de complexe Conditions o aucun cristal n est apparu Conditions o des cristaux de complexe ne ont t observ s dans au moins deux cas O sont apparus qu en absence de prot ine et 100 mM Conditions o le complexe cristallise quelle que soit la prot ine 71 mM et individuellement 100 mM o 11 12 QQQQQQQ O00000O O ow IOT O a O Q O e Plaque 5 Plaque 6 Figure 3 15 Observations concernant lauto cristallisation du complexe Eu DPA s toutes prot ines confondues 97 3 3 SYNTH SE DES OBSERVATIONS ET CONCLUSION Test en co cristallisation avec 6 prot ines tr s diff rentes et 20 C le tris dipicolinate d europium a cristallis au moins une fois dans 39 des 576 conditions de cristallisation que composent les 6 kits de cristallisation commerciaux usuels Il a cristallis de fa o
256. e de sulfate d ammonium on peut aussi choisir comme cryoprotectant le sucrose ou le saccharose Si le cryoprotectant n est pas adapt il y a formation de glace cristalline lors de la cong lation Celle ci cr e non seulement des contraintes m caniques qui abiment le cristal mais elle alt re aussi les clich s de diffraction y apparaissant sous forme de diagramme de poudre Le cryoprotectant entraine lui la formation de glace vitreuse amorphe qui diffuse les rayons X sans conduire 4 un diagramme de diffraction de poudre Tous les cristaux tudi s au cours de nos travaux ont t transf r s dans leur solution cryoprotectrice respective dont la composition correspond sauf mention contraire celle de la liqueur m re laquelle a t ajout un cryoprotectant la concentration requise Les transferts sont r alis s l aide d une boucle 64 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE et les temps de trempage sont de l ordre de la seconde Le cristal est ensuite congel dans l azote liquide 100 K 1 8 Utilisation des lanthanides en tant que diffuseurs anomaux 1 8 1 Les lanthanides des diffuseurs anomaux sous utilis s lorsqu il s agit de la pr paration de cristaux d riv s Comme nous l avons pr c demment indiqu le s l nium est le diffuseur anomal le plus utilis Com parons le pouvoir de phasage des atomes de lanthanide celui des atomes de s l nium a
257. e est nulle 147 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Je pr sente dans cette section les essais r alis s avec les complexes Eu HETDPA 3 Eu CTDPA 3 et Eu HECTDPA 3 ainsi que les observations associ es Nous confronterons alors les r sultats obtenus avec ceux du complexe Eu HMTDPA 3 4 6 1 1 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu HETDPA 3 Obtention de cristaux d riv s de HEWL et de TATHAU avec le Eu HETDPA 3 Que ce soit au cours des diff rents essais de cristallisation et du phasage en lui m me le com plexe Eu HETDPA 3 se comporte comme le Eu HMTDPA 3 L analyse de son mode de fixa tion ne montre d ailleurs que tr s peu de changements par rapport celui du Eu HMTDPA 3 La taille du complexe Eu HETDPA 3 correspond une sph re de 24 A environ contre 22 A pour le Eu HMTDPA 3 Comme le Eu HMTDPA l introduction du complexe Eu HETDPA 3 par co cristallisation avec le lysozyme a une influence sur le faci s des cristaux d riv s obtenus En co cristallisation ces cristaux d riv s sont plus petits et leurs faces sont plus tortur es que celles de cristaux natifs de lysozyme Pour les essais de co cristallisation j ai pu augmenter la concentration de ce complexe dans la goutte par suspension de la prot ine lyophilis e dans des solutions de complexe concentr es 4 2 7 mM et 4 0 mM Mais le complexe Eu HETDPA 3 gt se comporte comme le Eu
258. e et Bruno Franzetti notre m lancolique et grand chef tous L encore nous avons fait ensemble de la belle Science M me si nous n tions pas dans la m me quipe je remercie amicalement et au m me titre Jacques Coves et Antoine Maillard pour leur aide et leur soutien Je remercie les membres de mon jury de th se pour avoir pris la peine de juger mon travail de recherche le Dr Daniel Picot et le Dr Vincent Villeret en tant que rapporteurs le Dr Giuseppe Zaccai Andrew Thompson et le Dr Olivier Maury en tant que membres du jury Je tiens aussi remercier toutes celles et ceux qui lors de conversations de couloir ou de r unions machine caf improvis es m ont transmis entre deux l g ret s leur Science ou leur soutien Gr ce vous et nos conversation vous m avez parfois donn un grand nombre d informations scientifiques et m me sans le savoir de bons coups de pouce J enfonce une porte ouverte mais vous tes la preuve m me que n gliger ces conversations qui peuvent paraitre futiles de prime abord serait une grave h r sie Bien des id es si petites soient elles peuvent merger de ce type de conversations J ai d ailleurs appris bien apr s ma th se que le monde de l entreprise un terme pour cela le r seau parall le consid r comme bien plus efficace que l officiel En racontant cela je pense a Jean Michel Jault Guy Schoehn Philippe Carpentier Eric Forest Delphine
259. e ion should have a very low B factor compared to those of neighboring residues No Structural Analysis of MalDH from S ruber chloride ions were identified in our model by using these criteria Lithium ion protein interactions can be characterized by interatomic distances and coordination geometries Based on high resolution protein structures lt 1 5 resolution the distances between a bound lithium ion and its oxygen or nitrogen atom ligands are generally in the 1 8 to 2 0 A range None of the water molecules bound to Sr MalDH showed such interaction distances suggesting the absence of bound lithium ions To distinguish water molecules from sodium ions which differ by only a single electron we considered the coordination geometry of solvent molecules with coordination number greater than 4 as well as structural similarities or differences between Sr and Ca MalDHs No water molecule fulfilled the criteria to be assigned as a sodium ion 0 5 M NH SO it E a 3 8M KCI Sedimentation coefficient S Charged surface Hydrophobic surface 497 Finally we tried to look for sites with unfavorable interactions such as negatively charged residues facing each other as was used to identify a potential cation binding site in Hm MalDH However no such structural motif was observed in Sr MalDH The other interactions at the various monomeric interfaces that build up the tetramer are very similar between Sr and Ca MalDH
260. e la puce Biacore suite au passage des complexes de lanthanide De 314 CHAPITRE 11 EXPLORATION D AUTRES M THODES POUR R V LER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE AVANT L ETAPE DE DIFFRACTION mani re g n rale l interaction entre les complexes et les prot ines lorsqu elle a lieu est telle qu il devient difficile voir quasi impossible de r g n rer la puce Cela signifie qu il faudrait compter une puce CM4 pour d celer la fixation d un seul complexe avant l tape de diffraction Hors si la m thode Biacore n est pas si complexe 4 mettre en ceuvre elle devient d s lors extr mement cofiteuse 11 2 D tecter la fixation des complexes de lanthanide sur des macro mol cules biologiques par R sonance Magn tique Nucl aire Nous avons men des exp riences de R sonance Magn tique Nucl aire RMN pr liminaires avec les complexes Eu HMTDPA 3 Eu DPA 3 et le HEWL Le but principal de ces exp riences tait de mettre en vidence qu en solution on constate aussi la diff rence que nous avons r v l par cristallographie entre l interaction du complexe Eu DPA 3 avec le HEWL et celle du complexe Eu HMTDPA s avec le HEWL Pour rappel nous avons montr au cours de cette th se qu au niveau des m me acides amin s tryptophane de la prot ine HEWL le complexe Eu DPA 3 se lie principa lement par des interactions hydrog nes avec les acides amin s arginine et lysine voisin
261. e les valeurs de leurs facteurs R et ceux des autres jeux de donn es 4 5 1 2 Statistiques des affinements des structures de la TATHAU avec le Ln HMTDPA 3 Le tableau 4 9 suivant permet de juger la qualit du mod le qui comprend la prot ine thaumatine et le complexe Eu HMTDPA 3 complet Cet affinement fait suite au phasage par la m thode du remplacement mol culaire 128 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Ln HMTDPA 3 TdTHAU cristallisation Rapport me to 16 67 Code RCSB PDB 4BAL R solution A 28 99 1 30 Rwork 13 56 Rfree 15 78 Nbre de r flexions utilis es 64138 Composition nbre d atomes Prot ine 1592 H20 376 Ions 1 Ligands 57 Res hors Ramachandran 0 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 009 Liaisons Angles 1 269 Bmoyen prot ine A 11 90 Bmin prot ine A 5 27 Bmax prot ine A 38 27 Bmoyen eau A 28 40 Bmoyen ions lanthanide A 15 77 Bmoyen ligands A 21 17 Siteoce 48 Tableau 4 9 R sum des statistiques d affinement pour la structure de la TATHAU avec le Ln HMTDPA 3 4 5 2 Description des modes de fixation du Ln HMTDPA 3 4 5 2 1 Le Ln HMTDPA 3 la surface du lysozyme de blanc d uf de poule Deux sites de fixation du complexe la surface du lysozyme ont pu tre d termin s Les deux sites se situe
262. e par une liaison hydrog ne entre un de ses groupements carboxylates et le groupement N H de l Arg5 Figure 4 21 Enfin la distance de 3 1 entre une des fonctions carboxylates de ce ligand et le groupement NH1 de l Arg73 de la mol cule sym trique montre une liaison hydrog ne suppl mentaire entre ces deux entit s 131 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 5 b a Figure 4 21 Mode de fixation du 3 ligand du complexe Ln HMTDPA la surface du HEWL dans le premier site Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en rose La comparaison de cette structure celle de HEWL r solue avec le complexe Ln DPA 3 r v le que ce site de fixation principal du Ln HMTDPA 3 se situe 9 7 A du site de fixation principal du Ln DPA 3 le plus proche occup 88 Aussi tout comme le complexe Ln DPA s fix la m me prot ine le Ln HMTDPA 3 vient se fixer dans une zone charg e positivement Les acides ami n s donneurs de protons arginine et lysine en l occurrence tant impliqu s dans des liaisons hydrog nes avec les fonctions carboxylates de la partie dipicolinique des ligands Figure 4 22 132 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 22 Carte de densit lectronique 2F F contour e 1 0 o du complexe Ln
263. e structures de macromo l cules biologiques Rossmann 1972 Taylor 2010 Cette m thode ne fait pas partie des m thodes de phasage de novo car l information de phase recherch e provient d un mod le d j existant et que l on suppose proche de la structure d terminer Le choix du mod le est orient par le postulat qui stipule que l homologie de s quences entre deux prot ines implique tr s fr quemment une similarit structurale Le mod le doit pr senter une forte identit de s quences au moins 30 avec celle de la prot ine dont la structure est d terminer En outre le mod le choisi peut correspondre l ensemble ou une partie de la structure d int r t Une fois le mod le choisi il faut alors rechercher la position et l orientation de ce mod le dans la maille qui conduit au calcul des intensit s qui correspondent aux intensit s observ es tout en vitant le chevauchement de mol cules sym triques Les phases obtenues pour les mod les positionn s et orient s qui donnent les meilleurs accords sont appliqu es aux donn es exp rimentales L avantage de cette m thode est qu elle ne n cessite que des donn es de diffraction d un cristal natif De plus le nombre croissant de structures r solues enrichit le catalogue de mod les disponibles Cependant cette m thode peut tre mise en d faut dans deux occasions D un part si la structure de la prot ine d terminer pr sente un nouve
264. e troisi me mutation H231L permet d am lio rer sa stabilit en solution tamponn e Ses coefficients d extinction molaire se retrouvent quelque peu modifi s par rapport la prot ine naturelle et prennent pour valeur 2g0nm 22015 M 507 et 488 nm 63000 M cm7 Un clone de la bact rie Escherichia coli souche BL21 DE3 contenant un plasmide pRSET B avec le g ne recombinant codant la EGFP une tiquette histidine et un site de clivage l a chymotrypsine en N terminal m a t confi par notre collaborateur le Dr Philippe Oger du Laboratoire de Sciences de la Terre l Ecole Normale Sup rieure de Lyon A partir de ce clone j ai pu produire purifier et cristalliser la prot ine au laboratoire La figure 10 1 montre la s quence d ADN ins r e dans le plasmide pRSET B Aussi ce plasmide conf re la bact rie Escherichia coli la r sistance l antibiotique ampicilline Des stocks en glycerol de EGFP ont t r alis s partir d aliquots d une culture juste avant induction DO x 0 65 avec 50 v v de culture et 50 v v de glycerol Ces stocks on t conserv s 80 C dans des tubes bouchon vissable d di s 100 1 130 11 160 21 190 31 ATG AGC AAG M S K 220 41 250 51 280 61 310 71 GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC G E E L F z G x P I L v E L D G D Y N G H K E
265. ectif est de d velopper l utilisation de compos s permettant de d terminer ces phases afin de r soudre exp rimentalement la structure de prot ines par diffraction des rayons X Notre approche s appuie sur l introduction de m taux lourds dans les cristaux par le truchement des ligands chimiques ch latant l atome lourd en l occurrence un lanthanide Des m thodes de phasage seront alors mises en uvre en particulier celles exploitant la diffusion anomale de ces atomes lourds La diffusion anomale est un ph nom ne caract ristique et mesurable qui apparait lorsque l nergie des rayons X incidents est proche d un des seuils d absorption de l atome en question Ici r side le c ur de mon travail de recherche dont le but est double D une part il est de parfaire notre compr hension des modes de fixation des complexes de lanthanide existants dans le but d am liorer ces complexes ou d en d velopper de nouveaux D autre part il consiste prouver qu un tr s grand nombre d acides amin s ne constituent pas un obstacle l utilisation de ces complexes de lanthanide pour l obtention de phases pr cises bien au contraire Ce travail fait valoir ces outils comme alternatives d autres m thodes de phasage bien tablies comme l incorporation de s l nom thionine ou de s l nocyst ine dans les prot ines Ce travail de recherche m thodologique fait suite trois th ses au sein de l quipe initi es
266. ectronique affin e m a conduit mod liser un complexe form de trois ligands HMTDPA Tableau 4 24 Un seul des deux sites de fixation du HEWL est occup 87 par le complexe A l issue de cette exp rience nous avons pu formuler deux hypoth ses gt si il n y a pas change de ligands le complexe mod lis est le complexe qui a la plus forte affinit pour la prot ine gt si il y a change de ligands soit il y a s lection des complexes hybrides ayant la plus forte affinit soit il y a change de ligands la surface de la prot ine 171 AT LE LN HMTDPA UN COMPLEXE MODULABLE LA COMBINATOIRE Combinatoire 2 M lange d une solution de complexe Eu HMTDPA 3f 4 mM avec une solution de Eu HECTDPA 3 8 mM Suite ce qui a t observ avec la premi re combinatoire celle ci a t r alis e afin de forcer l change de ligands autour de l ion lanthanide pour favoriser le complexe Eu HECTDPA 3 1 33 mMM de combinatoire o la stoechiom trie favorise la formation de complexe avec des ligands HECTDPA ont t m lang s 0 46 mM de HEWL Des cristaux semblables au cristaux de lysozyme natifs sont apparus dans la goutte Compte tenu de ce que nous avions observ propos des cristaux ind pendamment d riv s avec les complexes Eu HMTDPA 3 et Eu HECTDPA 3 nous nous atten dions ce que ces cristaux contiennent des complexes form s de ligands HECTDPA moins invasifs que ceu
267. ectrons si leur taux d occupation n est pas tr s lev 7 2 1 4 Une mod lisation fiable des ions dans la structure de HvMalDH gr ce la diffusion anomale Si la densit lectronique seule ne peut parfois pas suffire distinguer des ions d une mol cule d eau leur contribution anomale peut permettre de les discriminer Tableau 7 14 Brseuil K A 0 921 Gdseuil Lyr A 1 711 f pr e7 6 7 fo e7 0 9 fug e7 0 1 0 2 fx e7 0 4 1 3 fs e7 0 2 0 7 fun e7 1 2 3 3 fre e7 1 3 3 8 fz e7 2 0 0 8 f Ca e7 0 5 1 5 Tableau 7 14 Valeur de la partie imaginaire du facteur de diffusion atomique des atomes pouvant se trouver dans un cristal de HvMalDH en fonction de la longueur d onde utilis e C est dans cette optique que nous avons men une nouvelle exp rience de diffraction avec un cristal de HvMalDH ayant t obtenu non plus en pr sence de MgCl mais en pr sence de MgBrg Alors qu il n est pas possible d atteindre le seuil d absorption K du chlore sur une ligne de lumi re synchrotron il est possible de travailler une longueur d onde qui correspond au seuil d absorption K du brome Nous avons suppos que les ions Br se comportent comme les ions C17 la surface de la prot ine aux vues de leur propri t s Wells 1984 Tableau 7 15 234 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES
268. edipicolinate person nalis et b tir ainsi toute une famille de complexes Mais comme rien n est parfait dans le meilleur des mondes cette famille de complexes conserve le d faut d utilisation du tris dipicolinate de lanthanide d origine l auto cristallisation dans certaines conditions de cristallisation C est pourquoi nous nous sommes int ress s un nouveau complexe le triazonanetripicolinate de lanthanide ou LnTNTPA A la diff rence du complexe Ln DPA 3 et de ceux de la famille des lLn TDPA 3 ce complexe est cag et sa charge globale est nulle Un macrocycle triazacylononane relie les trois acides picoliniques et le tout forme une cage qui ch late l ion lanthanide D une part cette structure vite au complexe d tre d stabilis par la pr sence d ions divalents une des conditions 81 qui engendre l auto cristallisation des autres complexes pr cit s D autre part elle pr vient l ventuelle substitution de l ion lanthanide par un ion divalent au sein du complexe Ce ph nom ne avait t observ avec le complexe Ln DPA s3 et un ion Zn dans la structure de l ubiquitine de c ur de b uf En outre le complexe conserve toutes les propri t s de luminescence Les premi res observations et les premiers r sultats obtenus avec le complexe TbTNTPA sont consign s dans le troisi me chapitre 82 Chapitre 3 Le tris dipicolinate de lanthanide agent de nucl
269. eill es Avoir la plus belle femme de l IBS dans sa g ographie amicale est une chance dont je me flatte chaque jour ah mais si Une avalanche de mercis pour Aur lien Deniaud qui m a chaperonn mon arriv e au laboratoire et pour l ensemble de son recueil de blagues dont lui seul a le secret Pour leurs messages leurs coups de fil pour tre venu Grenoble que ce soit en vacances ou pour ma soutenance parce qu ils se sont toujours rendus disponibles lors de ma pr sence la capitale et surtout pour leur patience vis a vis de l ours taciturne que j ai souvent t lors de cette th se je remercie avec une infinie affection mes bons vieux potes de Paris Pilou Brandon Fannynou Jaulmes Lolo Mendy Kiki 331 REMERCIEMENTS Bertuletti Laurence Feraud Matt Dartois Fran ois Laur Didou Weisenburger Gaelle Schmidt Laura et Alfredo Raimundo Lapin Alloin Martial Sankar Fabio Valente Fran ois et Linda Montenvert FX Da Cunha Gladys Potirath Vass Kalokyris S bastien Pontio J r me Glay TomTom Brunel Tristan Wagner Vincent Tanguy et Claire Colin Guillemant Antoine Movschin Par votre ind fectible amiti vous avez toujours su m apporter et parfois malgr vous moult bouff es d air frais r confort et soutien Il y a des amiti s qui sont faites pour durer Gratitude et insondable reconnaissances aux potes is rois tr s rarement d origine qui ont contribu rendre ma vie grenobloi
270. elles a t amen au robot de cristallisation nanogouttes HTX de EMBL Pour la recherche des conditions de cristallisation natives 576 conditions de cristallisation fournies par les six kits de cris tallisation commerciaux les m mes que ceux nonc s dans le premier chapitre de la premi re partie ont t test es Plusieurs conditions de cristallisation ont pu tre d termin es pour chaque MalDH Si nous avons isol plusieurs de ces conditions pour obtenir des cristaux natifs de MalDH nous n en avons pour l instant utilis qu une seule par MalDH pour obtenir les cristaux d riv s avec les complexes IRM Tous les cristaux ont t vitrifi s 100 K dans l azote liquide apr s avoir t tremp s dans une solution cryo prot ctante en accord avec leurs conditions de cristallisation 7 1 1 1 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Picrophilus torridus Conditions pour obtenir les cristaux natifs de PtMalDH Deux conditions de cristallisation diff rentes conduisent l apparition de cristaux de PtMalDH de groupe d espace quadratique Figure 7 4 La condition avec de hautes concentrations en sulfate d ammonium permet d avoir des cristaux de groupe d espace 14122 avec un dim re dans l unit asym trique La condition en PEG permet d obtenir des cristaux de groupe d espace P41212 avec un t tram re dans l unit asym trique 1 2 1 8 M Sulfate d ammonium 9 14 PEG 4000 100 mM acide citrique
271. empilement cristallin dans les cristaux natifs de lysozyme ne permet pas d atteindre les taux d occupation observ s lorsque les complexes ont t introduis par co cristallisation avec ce complexe Figure 4 26 page 137 En trempage le second site de fixation Trp62 a tendance davantage se peupler que le premier site Cela peut s expliquer par le fait que d une part les canaux de solvant des cristaux natifs de HEWL doivent proposer un acc s privil gi au site Trp62 et d autre part en trempage lorsqu un premier complexe occupe d j la poche de fixation il est impossible d en fixer un deuxi me En trempage la fixation privil gi e au site Trp62 peut donc emp cher la fixation au site Trp123 ce qui explique l cart entre les valeurs des taux d occupation respectifs de ces sites 4 5 2 3 Une fixation nantiosp cifique du Ln HMTDPA 3 Tout comme le tris dipicolinate de lanthanide le tris hydroxym thyltriazoledipicolinate de lantha nide est un m lange rac mique de deux formes nantiom res cf 4 1 1 page 102 L nergie requise our passer d une forme l autre est suffisamment faible pour qu il y ait toujours la m me proportion P 142 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE des deux formes en solution temp rature ambiante Le ph nom ne d interconversion d une forme l autre est tr s rapide dans l eau de l ordre de 10 100 ms De mani re g n
272. emps D autre part si la r solution maximale impos e par les bords du d tecteur la longueur d onde utilis e pour enregistrer les donn es de diffraction du cristal d riv n est pas assez lev e l enregistrement des donn es sur le cristal natif peut permettre d atteindre la haute r solution Le processus de phasage r ussi on utilise g n ralement ces m thodes pour obtenir uniquement la structure de la prot ine native le jeu de don n es anomal ne servant qu au processus de phasage proprement dit Toutefois ces m thodes souffrent potentiellement du probl me d isomorphisme Pour ces m thodes les atomes de lanthanide choisis initialement en tant que diffuseurs anomaux sont aussi int ressants ls fournissent en effet un fort signal isomorphe puisqu ils poss dent entre 57 lectrons lanthane et 70 lectrons lut tium 1 2 4 4 Protocole retenu pour la d termination des phases par les m thodes SAD et MAD Je d cris ici le protocole et les programmes que j ai utilis s pour la d termination des phases par les m thodes SAD et MAD Une fois les coordonn es des sites de diffuseurs anomaux d termin es nous avons introduit cette information dans le programme SHARP de La Fortelle 1997 pour le calcul des phases exp rimen tales Selon la m thode du maximum de vraisemblance ce programme calcule la sous structure que composent les atomes lourds dans la maille Les coordonn es tridimensionnelles le taux d
273. en anglais Un bien affectueux remerciement mon autre invincible contrefort ma famille pour leur soutien qu il soit moral culinaire et parfois bien que j ai tout fait pour que non financier mes parents Isabelle et Philippe Talon ma s ur Kikou mon beau fr re Raynald Bachelet et ma grand m re Mauricette Talon Je profite de ce paragraphe qui fait r f rence la famille et au soutien moral ou culinaire pour remercier aussi ma marraine Elizabeth Strich ainsi que ma belle famille Michel Peyret Joelle Guzzon et Monique Dugas Je remercie aussi tout particuli rement les laragnais Guy et Ren e Queyrel ainsi que les Chastel pour leurs accueils dans le paysage proven al toujours agr ables et le d licieux miel carburant indispensable un ours pour faire une bonne th se Je remercie aussi mes pr cieux collaborateurs avec qui j ai appris faire de la bonne science le Dr Olivier Maury du Laboratoire de Chimie de l Ecole Normale Sup rieure de Lyon Arnaud Gautier et Lionel Nauton de l quipe SEESIB de l Institut de Chimie de Clermont Ferrand le Dr Eric Condamine de la plateforme RMN 1D de l Institut de Biologie Structurale Jean Pierre Ebel de Grenoble le Pr Thierry Prange de Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques de l Universit Paris V Ren Descartes de Paris le Dr Nathalie Colloc h de l quipe CERVOxy du Laboratoire ISTCT de Caen le Dr C cile Breyton de l quipe SSIMPA du gro
274. en opposition de phase d phas de 180 par rapport au rayonnement incident Cependant dans un atome les lectrons des couches internes K et L sont fortement li s au noyau et ces lectrons ne peuvent plus tre consid r s comme libres Leur comportement sous rayonnement peut tre d crit avec le mod le de l oscillateur harmonique amorti de fr quence de r sonance wo correspondant la fr quence d absorption de l atome Le facteur de diffusion atomique f pour un lectron li peut alors s exprimer de la sorte w2 Pere w iawow wg avec w la pulsation du rayonnement incident a le facteur d att nuation Pour un rayonnement incident d une longueur d onde voisine du seuil d absorption consid r la r so nance implique une modification de la diffusion c est le ph nom ne de diffusion anomale Alors que dans le mod le de l lectron libre le facteur de diffusion atomique f est r el dans le cas de la diffusion anomale il devient un nombre complexe et s exprime de la mani re suivante fa fer A ou 0f est la partie du facteur de diffusion atomique ind pendante de la longueur d onde f est la partie r elle de la contribution anomale au facteur de diffusion Af est la partie imaginaire de la contribution anomale au facteur de diffusion Lorsqu il y a absorption le rayonnement incident est absorb par les lectrons des couches inf rieures qui sont excit
275. ent cristallin dans les cristaux de lysozyme de groupe d espace P432 2 27 de solvant nous montre peut tre ici que nous avons atteint une taille de complexe qui dans ce cas ne permet pas sa fixation 5 3 Co cristallisation de la Td THAU avec le TbTNTPA fixation du TbINTPA Contrairement au lysozyme les cristaux de TdTHAU d riv s par co cristallisation avec le TDTNTPA ce dernier ajout une concentration de 31 mM ont conduit la r solution de la structure de la prot ine par phasage exp rimental Mais malgr la haute r solution le ligand n a pu tre mod lis car le taux d occupation du complexe est mod r ment lev 5 3 1 Obtention de cristaux d riv s de TdTHAU avec le TbTNTPA Les cristaux de thaumatine co cristallis s en pr sence de plus de 30 mM de complexe TbTNTPA ont conduit la r solution de la structure de la prot ine Les cristaux d riv s sont semblables aux cristaux natifs de thaumatine A l inverse aucune fixation du complexe dans les cristaux issus de trempages dans des solutions concentr es 31 40 ou 70 mM en TbTNTPA n a t constat e 184 CHAPITRE 5 UN TRIS DIPICOLINATE CAG LE LNTNTPA 5 3 2 par co cristallisation avec le TbTNTPA Int gration des donn es de diffraction issues d un cristal de TdTHAU obtenu Suite au traitement des donn es MAD on d tecte un signal anomal un peu moins lev que ce que nous avions pu constater avec les membres de la famil
276. ent trois mol cules d eau si les contraintes de distance et de coordination sont respect es Nakasako 2004 Matsuoka and Nakasako 2009 Apr s avoir tabli la cartographie compl te des mo l cules d eau la surface de l enzyme CaMalDH ainsi que leurs caract ristiques structurales je pense que nous ne pouvons nous appuyer sur la m me hypoth se dans le cadre de notre tude En effet si je m en suis tenu la d tection de pentagones et d hexagones de mol cules d eau d s le d but de cette tude c est parce qu il s agit des deux structures g om triques qui se manifestent de fa on vidente lorsqu on regarde simplement la structure de CaMalDH structures qui sont tr s favorables d un point de vue nerg tique Par ailleurs si trois mol cules d eau peuvent suffire pour constituer un polygone il devient possible de cr er des r seaux de polygones extr mement tendus Matsuoka and Nakasako 2009 Dans le cadre de notre tude du r le des mol cules d eau dans l adaptation halophile amoindrir les contraintes afin de pouvoir tendre davantage des r seaux de polygones pourrait entrainer la perte d informations et aboutir des conclusions moins contrast es 7 3 Conclusions et perspectives Les premiers r sultats obtenus par la nouvelle approche m thodologique pour la compr hension fine des modes de fixation des complexes de lanthanide sont tr s prometteurs L tude d ores et d j men e sur trois
277. ermet la fixation du complexe entier en venant compl ter la sph re de coordination du lanthanide 230 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Figure 7 11 Mode de fixation du complexe GdDO3A la surface de HvMalDH site occup 72 De m me r soudre la structure de CaMalDH avec le GdHPDO3A la r solution de 1 67 nous confirme que ce complexe se fixe toujours par paire Figure 7 8 comme c tait d j le cas sur le lysozyme de blanc d uf de poule cf introduction Utilis s en co cristallisation avec les enzymes CaMalDH et HvMalDH les complexes GdHPDO3A GDDO3A et GdDTPA BMA ont emp ch la cristallisation Pourquoi dans certains cas la pr sence des complexes de lanthanide dans la goutte emp che t elle la cristallisation Les complexes de lanthanide utilis s en co cristallisation peuvent ils aussi avoir un effet solubilisant Se fixent ils pr cis ment dans les zones de la surface prot ique normalement impliqu es dans les contacts cristallins emp chant ainsi la formation de cristaux d riv s et natifs Nous n avons pas encore r pondu ces questions Fort heureusement les cas o les complexes de lanthanide ont un effet solubilisant sont rares Et comme nous avons pu le v rifier lorsque cela se produit il est toujours possible d avoir recours au trempage pour obtenir des cristaux d riv s 7 2 Les nouvelles structures de MalDH r solues par phasag
278. ermis de cr er cette fois ci un complexe r ellement hy bride HMTDPA HECTDPA 2 dont la mod lisation contre toute attente prouve qu il n y a pas change de ligands dipicolinates en solution autour de l ion lanthanide Comme nous l avons explicit auparavant la prot ine TATHAU ne permet qu un mode de fixation impliquant des liaisons hydrog nes avec les acides amin s arginine pour les complexes de la famille des TDPA 3 Mode de fixation que nous avons d montr comme d pendant de la charge globale du com plexe picolinate utilis Dans le cas de cette quatri me combinatoire et bien que le complexe hybride ait permis le phasage son taux d occupation n a pas t assez lev pour mod liser les ligands Cela rappelle l absence de fixation du complexe Ln HECTDPA s sur la thaumatine Avec deux ligands HECTDPA pour un ligand HMTDPA la charge globale du complexe n est plus 37 mais 17 De par son unique charge n gative le complexe hybride HMTDPA HECTDPA 2 se rapproche du Ln HECTDPA 3 neutre et ne se fixe que tr s peu la TATHAU 4 7 2 2 La combinatoire 5 avec complexation de l ion lanthanide avec deux ligands de la famille Ln TDPA M lange d une solution contenant 3 mM de ligand HMTDPA d une solution contenant 3 mM de ligand HETDPA d une solution contenant 3 mM de ligand CTDPA avec une solution de EuCl 3 mM Cette fois ce sont les ligands et non plus les complexes complets qui ont
279. es aucun cristal m me de petite taille n aura diffract a une r solution plus lev e que 6 5 A De plus la solution de stockage en d tergent CHM semblait mal vieillir 4 C La figure 8 4 et l information quant la possibilit d obtenir de meilleurs profils de diffraction avec les petits cristaux illustrent bien le dilemme auquel je me suis confront ou le pi ge dans lequel je suis tomb lors de cette tude Si am liorer des conditions de cristallisation revient rechercher les conditions de cristallisation conduisant aux plus beaux cristaux alors il faut dans le cas 276 CHAPITRE 8 ACRB LA PROT INE MOD LE MEMBRANAIRE PUTATIVE d EcAcrB red finir la notion de beau cristal Est alors un beau cristal celui qui diffracte haute r solution et non pas celui qui pr sente le plus joli faci s cristallin Dans cette mesure m me avec un acc s privil gi un g n rateur de rayons X de laboratoire il devient difficile d am liorer de visu des conditions de cristallisation Fus je coupable de d lit de faci s cristallin Une fois seulement un cristal natif d EcAcrB a diffract 3 6 A de r solution Il s agit du cristal pr sent dans la figure 8 4b Mais son profil de diffraction ne permit pas d enregistrer la moindre donn e tant le cristal avait souffert lors de l tape de cryo protection 8 3 3 R sum des tentatives d am lioration du protocole de cryo
280. es concentrations de la prot ine en solution et en agent pr cipitant Figure 1 8 On y distingue la zone de solubilisation sous la courbe de solubilit et la zone de sursaturation Cette derni re qui se subdivise en trois parties la zone m tastable la zone de nucl ation et le zone de pr cipitation La goutte dans son tat initial se trouve en un point sous la courbe de solubilit Lorsque la diffusion commence la concentration de prot ine en solution P et en agent pr cipitant AP augmente dans la goutte pour atteindre la zone de nucl ation D s lors les cristaux se forment Plus ils continuent de grossir plus P diminue et la croissance s arr te lorsque celle ci est de nouveau au niveau de la courbe de solubilit Etat m tastable AP 2 AP Agent Pr ciphant CESR SURSATURATION J SOLUBILISATION Figure 1 8 Diagramme de phase Les cristaux d Urate oxidase d Aspergillus flavus ont t cristallis s selon la m thode batch Figure 1 7 Obtention des cristaux d riv s Il est possible de pr parer des cristaux dits d riv s selon deux m thodes le trempage et la co cristallisation Le trempage comme son nom l indique consiste tremper un cristal natif dans une solution de composition identique celle de la liqueur m re mais contenant aussi le complexe que l on souhaite introduire dans le cristal Les concentrations requises pour obtenir des cristaux d riv s avec une fixation
281. es d int gration des donn es de diffraction d un cristal d riv Td THAU Eu HMTDPA 3 Les statistiques d int gration de donn es de diffraction d un cristal d riv de TdTHAU montrent encore une fois une valeur assez forte du signal anomal indiquant une fixation du complexe sur la prot ine Contrairement au HEWL la fixation du complexe a t mise en vidence seulement dans des cristaux d riv s par co cristallisation Une exp rience de trempage a t men e avec une solution contenant 30 mM de complexe Je n ai pas d tect la fixation du complexe suite analyse de l int gration de donn es enregistr es au seuil d absorption AK du s l nium sur un cristal d riv obtenu par cette m thode Le fait de ne pas enregistrer les donn es au seuil Lyr du lanthanide n a pas permis d avoir une valeur de f maximale mais dans le cas du lysozyme cela n avait pas emp ch de mettre en vidence le signal anomal et de d terminer les phases Le taux d occupation du complexe introduit dans ce cristal de TATHAU ne devait pas tre lev 4 4 D termination des phases exp rimentales 4 4 1 Evaluation de la qualit des phases d termin es pour le lysozyme de blanc d ceuf de poule Selon le protocole d crit dans l introduction nous avons d termin des jeux de phases exp rimentales pour les cristaux de HEWL d riv s avec le complexe Eu HMTDPA 3 La position des atomes de lanthanide a t d te
282. es de fixation tant identiques pour les deux prot ines mod les nous voulions tudier le r sultat de la comp tition entre les deux complexes pour ces sites l affinit du complexe Eu HMTDPA 3 pour ces prot ines est elle en effet si lev e que ce complexe peut s imposer au GGHPDO3A Ou observe t on davantage une r partition des occupations de sites dans le cristal Nous avons r alis une s rie de huit exp riences cristallographiques pr liminaires avec nos prot ines mod les habituelles pour cible le lysozyme de blanc d ceuf de poule et la thaumatine de Thaumatococcus daniellii 4 7 1 Pr parations des diff rentes combinatoires en fonction du but recherch Les huit exp riences r alis es ont consist obtenir des cristaux d riv s de HEWL et TdTHAU avec les huit solutions diff rentes de complexes de lanthanide hybrides et ce uniquement par co cristallisation Le HEWL a t co cristallis avec les huit combinatoires alors que la TATHAU seulement avec les combinatoires 5 6 7 8 La pr paration des diff rentes solutions de combinatoires conduit un m lange qui contient une distribution de probabilit s des diff rentes combinaisons de ligands qui d pend de ce qui est introduit dans le m lange Si la constante de dissociation d un ligand pour l ion lanthanide est la m me pour tous les ligands et si l change de ligand a en effet bien lieu en solution il est alors possible de d placer cette dis
283. est pas le cas des bouchons des plaques Nextal de la marque Qiagen Il faut donc les d visser et les retourner avant d exposer la goutte aux UV Muni d un simple appareil photo et d une binoculaire dans le noir il est aussi difficile de rendre compte travers une photo pour un manuscrit de th se du contraste entre la faible luminescence mise par la solution et celle des cristaux pourtant plus intense dans le visible 4 3 Acquisition et traitement des donn es de diffraction Comme cela a t stipul dans l introduction l ensemble des donn es de diffraction a t enregistr avec le rayonnement synchrotron sur les lignes de lumi re MAD BM30A ID23 2 et ID29 de ESRF Grenoble et PROXIMA ligne de lumi re du centre de rayonnement synchrotron SOLEIL Le protocole utilis et les crit res retenus pour enregistrer des donn es de diffraction en vue d un phasage par les m thode SAD et MAD sont d crits dans l introduction de ce manuscrit 4 3 1 Statistiques d int gration des donn es pour les prot ines pr sentant une fixa tion du complexe Seuls seront pr sent s les r sultats obtenus avec les prot ines pour lesquelles j ai constat in fine une fixation du complexe Ln HMTDPA s soit gt le lysozyme de blanc d ceuf de poule gt la thaumatine de Thaumatococcus daniellii Nous n avons jamais constat de fixation du complexe sur les prot ines AVEGFP CaMalDH HvMalDH et PhTET1 12s Au
284. et le Rwork tendance s accro tre vers une valeur sup rieure 5 j ai pu avoir recours deux options suppl mentaires i A cette tape les facteurs d agitation thermique tant d j bien affin s il est possible de faire une analyse TLS Translation Libration Screw dont la description permettra de restreindre avec logique l affinement ult rieur de ces facteurs L analyse TLS repose sur 57 1 6 AFFINEMENT DE LA STRUCTURE ET INTERPR TATIONS la valeur du facteur d agitation thermique des atomes qui composent la prot ine c est pour cela qu il est n cessaire qu elle soit d j affin e Par la normalisation et la diff ren ciation de la totalit des facteurs d agitation thermique d crits l analyse TLS propose de partitionner une chaine principale en un certain nombre de segments qui sont alors consi d r s individuellement comme des corps rigides soumis aux mouvements vibrationnels suivants la translation la libration et l h lico dalisation Les atomes appartenant un groupe TLS subissent la m me variation Selon la v racit avec laquelle ils expliquent le facteur d agitation thermique observ issue de l affinement une note est alors attribu chacun de ces segments Cette analyse met en vidence les mouvements locaux ou les mouvements des domaines prot iques qui peuvent expliquer la flexibilit des macromo l cules biologiques Les analyses TLS ont t r al
285. eur de diffusion atomique de l atome de Cd est de 4 71 e De plus 3 des 10 atomes de Cd construits ont un taux d occupation sup rieur 60 dont un 100 Nous avons donc r alis une exp rience contr le en enregistrant des donn es de diffraction au seuil d absorption Ly du gadoli nium le g n rateur de rayon X du laboratoire ayant rendu l me sur un cristal natif de CaMalDH sans complexe de gadolinium A cette longueur d onde 1 711 A la partie imaginaire f du facteur de diffusion atomique de l atome de Cd est de 5 76 e7 on le favorise donc Le r sultat de cette exp rience fut non quivoque aucun phasage de novo n a pu aboutir alors que les statistiques d int gration des donn es non pr sent es ici montraient aussi que le cristal avait parfaitement support l exposition la lumi re synchrotron Le phasage exp rimental de la CaMalDH est donc bien du la diffusion anomale des atomes de gadolinium Phasage exp rimental des donn es PtMalDH avec le complexe GGHPDO3A GdHPDO3A PtMalDH Type de donn es SADG r R solution A 46 70 2 54 2 68 2 54 Picsra Picsoufre Pk 0o 54 88 14 05 12 26 9 69 FOM sharp FOM arp 0 30 0 03 Nombre de sites 3 R solution FOM lt 0 5 A 4 29 F l Zi h Pes ee 1 24 0 00 SIGMAA golomon 0 76 Buccaneer construit total 634 648 Tableau 7 5 Statistiques de phasage exp rimen
286. eurs des angles et 4 favorable autoris e g n reusement autoris e et interdite Ces zones ont t tablies en tenant compte des param tres st r ochimiques d crits par Morris et al 1992 et partir des param tres propres aux structures connues ces zones sont donc r guli rement mises jour Pour des structures autour de 2 de r solution la g om trie g n rale du mod le est consid r e satisfaisante lorsque 90 des acides amin s se trouvent dans la zone autoris e Ce diagramme peut tre calcul par le programme Procheck Laskowski et al 1993 ou pheniz validate de la suite Phenix Les d viations standards Certains param tres physico chimiques ont des valeurs dites id ales longueur de liaisons angles planarit et le calcul de leurs d viations standards au sein du mo d le est autant de crit re de validit de la structure Encore une fois le programme phenix validate de la suite Phenix permet une analyse d taill e du mod le pour tous ces param tres 58 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Il convient aussi de pr ter attention aux facteurs d agitation thermique de l ensemble des mol cules affin es afin de juger l homog n it du mod le complet Les atomes de lanthanide ont t plac s l aide de la carte de densit calcul e partir de la synth se de Fourier anomale La population des diff rents sites a t ajust e pa
287. f thermophilic and mesophilic malate dehydrogenases J Mol Biol 318 707 721 Madern D amp Zaccai G 2004 Molecular adaptation the malate dehydrogenase from the extreme halophil ic bacterium Salinibacter ruber behaves like a non halophilic protein Biochimie 86 295 303 Coquelle N Fioravanti E Weik M Vellieux F amp Madern D 2007 Activity stability and structural studies of lactate dehydrogenases adapted to extreme thermal environments J Mol Biol 374 547 562 Madern D amp Ebel C 2007 Influence of an anion binding site in the stabilization of halophilic malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui Biochimie 89 981 987 Olsher U Izatt R M Bradshaw J S amp Dalley N K 1991 Coordination chemistry of lithium ion a crystal and molecular structure review Chem Rev 91 137 164 Tardieu A Bonnet F Finet S amp Vivar s D 2002 Understanding salt or PEG induced attractive inter actions to crystallize biological macromolecules Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 58 1549 1553 Behlke J amp Ristau O 1999 Analysis of the thermodynamic non ideality of proteins by sedimenta tion equilibrium experiments Biophys Chem 76 13 23 Solovyova A Schuck P Costenaro L amp Ebel C 2001 Non ideality by sedimentation velocity of halophilic malate dehydrogenase in complex solvents Biophys J 81 1868 1880 Schuck P 2000 Size distribut
288. f Sr Ca and Hm MalDH and Tt LDH enzymes were carried out as previously reported 1 1 Protein concentrations were determined from the absor bance at 280 nm using extinction coefficients calculated from the sequence of each proteint Conformational stability Residual circular dichroism CD and residual activity were used to determine conformational stability The proteins of interest were incubated for 24 h at 0 1 mg ml in various KCI concentrations prior to performing CD and activity assays Standard enzymatic assay The activity was determined by following the oxidation of NADH over 30 s by measuring the decrease in absorbance at 340 nm Beckman DU 7500 Spectropho tometer For MalDH the measurements were performed at 60 C near the optimal temperature for each enzyme using saturating concentrations of the substrate oxaloac etate OAA to avoid artifacts from Km variation due to high salt concentrations For the measurements on Tt LDH the temperature was set to 75 C and the substrate was pyruvate instead of OAA Enzyme aliquots were mixed with 1 ml of 50 mM Tris HCl pH 8 0 supplemen ted with OAA 0 3 mM or pyruvate 0 3 mM and NADH 0 2 mM at various salt concentrations Sedimentation velocity measurement Sedimentation velocity experiments were performed with a Beckman XLI analytical ultracentrifuge equipped with a UV scanning system using an eight hole AN 60 Ti rotor with a double channel centerpiece of 1 2
289. f exp i2rh x Fp exp iap j o ap est la phase Etant donn la somme des contributions conduisant aux facteurs de structure F Fp Fy Fret F Fp Fy Fh 36 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE o F est le complexe conjugu de F On en d duit Fp F Fa Fy F Fy FH Le diagramme de Harker permet d illustrer la d termination de la phase de Fp Figure 1 2 Axe imaginaire Figure 1 2 Diagramme de Harker illustrant la d termination de la phase par la m thode SAD Pour la m thode SAD dans le plan complexe les cercles de rayons F et F et d origines respectives C extr mit du vecteur Fy F7 et D extr mit du vecteur F y FH se croisent en deux points d intersection H et M Les deux vecteurs r sultants JH et JM correspondent aux deux solutions possible de la phase ap de Fp Dans le cas de la m thode MAD l ambigu t de phase est lev e par une mesure r alis e une autre longueur d onde donnant d autres valeurs de F et F conduisant au trac de deux autres cercles se coupant l un des deux points H ou M De plus avec la m thode MAD une information suppl mentaire peut tre utilis e la variation de la partie r elle du facteur de diffusion atomique f avec la longueur d onde De la m me mani re que la diff rence anomale est d finie une lon
290. face of this interface in the non halophilic Tt LDH and Ca MalDH enzymes and decreases to 47 and 38 for Sr and Hm MalDH respectively Fig 4 second row from top Assembly of the active dimers that build up the tetramer creates a solvent accessible cavity Fig 4 third row from top The volume of this cavity increases from an average of 1688 for the non halophilic enzymes to 2156 and 3513 for Sr and Hm MalDH respectively Inside the catalytic vacuole there are only a few relatively conservative substitutions that are not involved in substrate binding and reactivity and 500 are therefore probably not responsible for the changes in catalytic efficiency The catalytic mech anism of LDH and MalDH is well understood following an ordered mechanism in which NADH binds first inside the catalytic vacuole followed by the substrate 2 In LDH substrate binding and release induce structural reorganizations of differ ent amplitudes between the apo state and the ternary complex When switching from the apo state to the ternary complex there is a large movement of the catalytic loop and helix aD E associated with other reorganizations of less impor tance involving i the connecting region between strand BJ and helix 1G and ii helix a1G a2G In the non halophilic Tt LDH the connecting region corresponds to a small helix aT which is shortened in the non halophilic Ca MalDH In the halophilic Sr MalDH this very small
291. faci s tortur apparaissent au d triment des beaux cristaux De plus qu elle que soit la concentration en NaCl de la condition de cristallisation test e d s que la concentration en complexe est sup rieure 10 mMM nous avons test des ajouts de complexe jusqu plus de 30 mM le pr cipit qui se forme habituellement se densifie et ne conduit plus l apparition de cristaux d riv s Comme nous l avons vu pr c demment de par l empilement cristallin les sites de fixation Trp123 et Trp62 sont spatialement proches dans le cristal et forment donc une poche de fixation Ainsi l addition des valeurs des taux d occupation des deux sites par cristal est peu pr s gale 100 Au sein de cette poche de fixation le complexe Ln HMTDPA se lie donc au Trp123 de la mol cule de r f rence et ou Trp62 de la mol cule sym trique conduisant 4 un encombrement st rique Le taux d occupation de l un est d pendant de l autre On peut alors corr ler nos observations de la mani re suivante En supposant que le complexe se lie d abord la prot ine en solution cela conduit des modules prot ine complexe s qui vont constituer les briques de base pour la croissance du cristal Compte tenu des observations et des explications pr c dentes on peut proposer un m canisme qui permet d expliquer l apparition des mauvais cristaux Figure 4 29 bien plus concentr que la prot ine HEWL dans la goutte de cristallisa
292. fet gr ce sa cage c est le seul complexe de la grande famille des complexes picolinates qui s affranchit du probl me 191 5 5 CONCLUSION de l influence des ions divalents Plus luminescent dans le visible que le tris dipicolinate ou que les tris triazoledipicolinates de lanthanide neutre et tr s soluble il se manipule aussi bien en trempage qu en co cristallisation Cependant le complexe LnTNTPA ne s est pas fix sur le lysozyme de blanc d uf de poule prot ine mod le sur laquelle se sont fix s les autres membres de la grande famille des complexes picolinates Cela montre que nous avons peut tre atteint la taille limite de complexes utilisables dans des cristaux o le pourcentage de solvant dans l unit asym trique est inf rieur 45 D autre part l tude men e sur les complexes de la famille des Ln TDPA 3 avait mis en vidence que c est la charge globale des complexes qui induit l effet supramol culaire qui conduit alors aux mauvais cristaux Nous avions aussi observ que les complexes neutres de cette famille ne se fixent pas la TATHAU car cette prot ine ne propose que des interactions de type liaison hydrog ne Le fait que le complexe Ln TNTPA neutre ait trouv un autre site de fixation sur la prot ine TATHAU et aucun sur le lysozyme tend prouver que ce complexe ne peut induire d effet supramol culaire 192 Conclusions l issue de cette tude sur les
293. ffert Devant cette maigre preuve du possible nous nous sommes alors demand s si la solution n tait pas finalement d amener une centaine de cristaux d EcAcrB sur une ligne de lumi re puis de tester leur diffraction l aide du chargeur automatique d chantillons jusqu d couvrir le cristal lu le cristal d EcAcrB diffractant haute r solution Alors que d autres projets pr sentaient d j des r sultats prometteurs les projets MalDH di picolinate ou encore le projet PhTET1 les difficult s rencontr es pour solubiliser le complexe de lanthanide DTTA BPA et pour obtenir des cristaux de prot ine mod le diffractant haute r solution ont fait que cette tude a t mise en suspend Cependant il n est pas exclu de trouver une autre prot ine membranaire mod le pour l tude du pouvoir phasant et du mode de fixation des complexes de lanthanide en notre possession Mais celle ci devra regrouper les caract ristiques habituelles des pro t ines mod les facile produire facile purifier d une cristallisation rapide conduisant des cristaux diffractant haute r solution Pour une prot ine soluble le choix est vaste mais il se rr duit pour les prot ines membranaires Apr s quelques recherches au sein de l institut et apr s avoir men une seule fois sa production et sa purification il est possible que la prot ine membranaire FhuA de E coli constitue une bonne candidate Fergus
294. ficient d extinction molaire mesur est de 93000 M cm7 8 1 2 Le complexe de lanthanide DTTA BPA C est dans le but de cr er un complexe de lanthanide dont la structure cible sp cifiquement les prot ines membranaires que le complexe LnDTTPA BPA a t synth tis Cette synth se revient au Dr Olivier Maury du laboratoire de Chimie de l Ecole Normale Sup rieure de Lyon Le complexe est d riv du 1 3 bis phytanylamide thyl ne tri amine triac tate de lanthanide ou LnDTTA BP complexe LnDTPA BMA Deux chaines seize carbones ramifi s 2 6 10 14 tetram thylhexad cane ou phytane ont t greff es aux deux fonctions amides du ligand DTPA BMA via leur groupement m thyle Figure 8 2 La structure finale du complexe pr sente ainsi une t te hydrophile quasi identique au ligand DTPA BMA qui lie l atome de lanthanide et une queue tr s hydrophobe cens e se lier la partie 272 CHAPITRE 8 ACRB LA PROT INE MOD LE MEMBRANAIRE PUTATIVE trans membranaire des prot ines membranaires La ressemblance du complexe avec un phospholipide n est pas un hasard il a t synth tis pour ressembler au phytanyl phospholipide qui compose la membrane des arch es Cavicchioli 2007 D riv du complexe LnDTPA BMA le complexe LnDTTA BPA ne peut mettre de fluorescence dans les longueurs d onde du visible la pr sence d une mol cule d eau dans la sph re de coordination de l atome de la
295. fraction des rayons X Une fois sa stabilit en solution v rifi e sur la dur e j ai utilis le Ln HMTDPA 3 en co cristallisation ou en trempage pour tenter d obtenir des cristaux d riv s de six prot ines diff rentes Dans le cas de la co cristallisation et dans le but d exp rimenter diff rents rapports de concentration un volume de solution de complexe a t ajout des solutions concentr s de prot ine ou directement sur des prot ines lyophilis es pour les solubiliser Les concentrations de complexe Ln HMTDPA 3 utilis es pour les trempages ont t de 2 mM 27 mM La dur e de trempage a vari entre 2 minutes plus d 1 heure temps pendant lequel le cristal est observ sous binoculaire afin de retirer le cristal de la solution en cas de d t rioration visible Toutes ces manipulations se font avec des boucles de taille ad quate 4 2 1 Choix des prot ines mod les et m thodes syst matiquement utilis es Cette tude syst matique a t men e avec sept prot ines diff rentes dont les conditions de cristalli sation et la structure ont t respectivement d termin es Les prot ines choisies ont t pour la plupart les m mes que celles que nous avons utilis es pour l tude des propri t s de nucl ation du Ln DPA 3 pr sent e dans le chapitre pr c dent Outre celles d j fournies par nos collaborateurs je rappelle ici les crit res de choix d une prot ine mod le pour tester l
296. g NaCl 5 mM mercaptoethanol Eau MilliQ q s p 0 1 mM PMSF Cocktail d anti prot ases Eau MilliQ q s p Tableau 10 1 Composition du milieu de culture et du tampon de lyse Tampon A HisTrap Tampon B HisTrap Tampon de d salinisation 50 mM HEPES pH 7 9 50 mM HEPES pH 7 9 50 mM HEPES pH 7 9 300 mM NaCl 300 mM NaCl 25 mM NaCl 5 mM mercaptoethanol 5 mM mercaptoethanol Eau MilliQ q s p Eau MilliQ q s p 250 mM Imidazole Eau MilliQ q s p sation Tableau 10 2 Composition des tampons pour la colonne HisTrap et la colonne de d salini 298 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES Tampon A Q Sepharose Tampon B Q Sepharose Tampon de stockage 50 mM HEPES pH 7 9 50 mM HEPES pH 7 9 20 mM HEPES pH 7 5 25 mM NaCl 500 mM NaCl Eau MilliQ q s p Eau MilliQ q s p Eau MilliQ q s p Tableau 10 3 Composition des tampons pour la colonne Q Sepharose et du tampon de stockage de la prot ine 10 2 2 2 Pr culture sur la nuit Pr voir un volume de sup rieur 120 mL de pr culture pour une culture de 4 L venir Dans un erlenmeyer plus de 120 mL de milieur de culture YT gt 100 pg mL d ampicilline clone de EGFP ou aliquot de stock en glycerol incubation sur la nuit 37 C 200 tpm 10 2 2 3 Culture bact rienne et production de la prot ine Afin que l oxyg nation de la culture bact rienne
297. gne Les variations des facteurs f et f ont t d duites du spectre de fluorescence l aide du programme CHOOCH Cependant lors des runs sur les lignes de lumi re ID29 et ID23 2 de l ESRF qui me sont moins famili res bien que s appuyant sur le m me principe que celui de la ligne BM30A j ai utilis le processus automatique de d placement la longueur d onde du pic d absorption choisi Mais le processus acc s aux seuils tr s opaque via cette automatisation a t source de pannes et d incertitudes quant au positionnement exact au pic d absorption Utilisation du robot de montage automatique de cristaux A l heure o j cris ces lignes la plupart des lignes de lumi re d di es a la bio cristallographie des seize synchrotrons mondiaux sont munies de chargeurs automatiques d chantillons Que ce soit le bo tier chargeur d chantillons MK collaboration entre l EMBL PESRF et la ligne BM14 ou le robot de montage automatique de cristaux 52 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE congel s et de plaque de cristallisation 96 puits CATS Cryogenetic Automated Transfer System de la soci t fran aise IRELEC install s sur la plupart des lignes de bio cristallographie ils facilitent et assurent le montage des chantillons ainsi que leur r cup ration Je prends nouveau l exemple de la ligne de lumi re o j ai pass le plus de temps BM30A
298. groupe d espace P1 et ce sans recours la sym trie non cristallographique Delfosse et al 2009 Dans le cas de la prot ine Pab87 17 atomes de lut tium ont t mod lis s la surface de la pro t ine Ceci prouve que le pouvoir phasant des lanthanides est suffisant pour le phasage d un grand nombre d acides amin s De plus le nombre de sites d termin s sur ces grands assemblages permet aussi d mettre cette simple hypoth se si les complexes de lanthanide ont trouv des sites de fixation sur de petites prot ines la surface de prot ines de bien plus grande taille devrait proposer davantage de sites de fixation adequat C est cette hypoth se qui a fait l objet de l tude d crite dans la seconde partie de ce manuscrit 77 Deuxi me partie De nouveaux outils pour la d termination de la structure de macromol cules biologiques la grande famille des complexes picolinates de lanthanide luminescents 79 Dans cette premi re partie m thodologique je pr sente les diff rents d veloppements entrepris autour du complexe tris dipicolinate de lanthanide Ln DPA 3 Ce complexe dont l tude a fait l objet de la th se de Guillaume Pompidor 2004 2007 arbore des propri t s physico chimiques qui le distingue des complexes issus de l imagerie m dicale En effet au cours de sa th se Guillaume Pompidor a montr que ce complexe a l avantage de pr senter une fluorescence dans le v
299. gueur d onde on d finit la diff rence dispersive entre deux E 2 o ri F la longueur d onde Les contributions au phasage des deux longueurs d onde seront d autant longueurs d ondes A et Dpis FX est le module moyen des r flexions F et plus grandes que les diff rences dispersives seront lev es Ce qui est le cas si les deux longueurs d onde choisies conduisent des valeurs tr s diff rentes de f Historiquement c est en 1951 que Bijvoet et al 1951 ont propos que les variations de f et f en fonction de la longueur d onde pouvaient permettre de mimer un remplacement isomorphe Ils ont ainsi ouvert la voie l utilisation de la diffusion anomale pour r soudre le probl me des phases en cristallographie Apr s qu un formalisme pour la d termination des phases pour les cristaux d riv s non centrosym triques ait t d velopp Okaya and Pepinsky 1956 et que le signal anomal du fer aux 37 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE longueur d ondes d mission Coke et Nika fut utilis pour d terminer les phases de plusieurs centaines de r flexions d un cristal d h moglobine Hoppe 1975 c est en 1981 que le pouvoir de phasage de ces m thodes fut d montr la structure de la prot ine crambine pu tre r solue avec le faible signal anomal du soufre la longueur d onde d mission CuKa Hendrickson 1981 Avec l av ne
300. h e hyperthermoacidophile Pi crophilus torridus PtMalDH et la malate d shydrog nase de l arch e halophile Haloferax volcanii Hv MalDH respectivement 1 7 A 2 0 et 1 5 de r solution La d termination de ces structures haute r solution par les m thodes de phasage de novo a permis la mod lisation de trois l ments structuraux particuliers qui apportent de nouveaux clairages sur l adaptation halophile En premier lieu nous avons pu identifier et positionner les ions Cl et K au sein de la structure de HvMalDH Le positionnement pr cis de ces ions permet d tudier les caract ristiques structurales de ces sites ioniques potentiels et de regarder leur conservation phylostructurale par tudes comparatives avec d autres structures de MalDH et LacDH halophiles Ce qui permettra d analyser l influence des sites ioniques cl s sur la structure de ces enzymes halophiles Deuxi mement en lien avec l activit enzymatique plusieurs conformations de la boucle catalytique du site actif de PtMalDH ont pu tre mod lis es Il convient de noter que c est la premi re fois qu il est possible d observer par cristallographie les changements conformationnels associ s la catalyse d une malate d shydrog nase t tram rique Les r organisations conformationnelles n avaient t d crites jusqu alors que pour les LacDH Bien que ce ne soit pas illustr de mani re d taill e dans ce manuscrit la comparaison
301. hapitre 2 Utilisation des complexes de lanthanide en bio cristallographie Afin d introduire les lanthanides dans les cristaux de prot ine l approche de l quipe est depuis quatorze ann es d utiliser des complexes de lanthanide Ces complexes sont tous constitu s d un ligand qui ch late un ion lanthanide Tr s solubles ils peuvent tre introduits dans les cristaux par trempage ou par co cristallisation L ion lanthanide n tant pas libre les complexes de lanthanide ne sont pas nocifs et peuvent tre utilis s sans pr caution particuli re Dans la majorit des cas c est le ligand qui assure la fixation du complexe la prot ine Nous r capitulerons dans ce chapitre l ensemble de nos observations sur la fixation de ces complexes de lanthanide Puis je rappellerai que certains complexes permettent d exploiter les propri t s de luminescence des lanthanides en jouant le r le d antenne propri t que nous utilisons pour d tecter la fixation de ces complexes dans les cristaux avant l tape de diffraction 2 1 Les complexes de lanthanide issus de l imagerie m dicale Historiquement les complexes d velopp s pour l imagerie par r sonance magn tique que nous sur nommerons complexes IRM ont t les premiers tre utilis s par l quipe 2 1 1 Pr sentation des complexes IRM Les quatre complexes commerciaux GdHPDO3A GdDOTA GdDTPA et GADTPABMA ainsi que des complexes d riv
302. he catalytic pocket that undergo large conformational changes associated with catalysis Fig 5a The conformational entropy is further increased in the Sr enzyme relative to the Ca one via the removal of Pro at positions 107 and 196 Fig 5a We also performed a comparison of the refined crystallographic B factors between Sr and Ca MalDH using the relative B factor difference at equivalent positions which limits bias coming from data collection data integration and refinement processes This approach was successful in high lighting the role of three loops in the catalytic process of urate oxidase Changes in B factors at equivalent Fig 5 a Ribbon diagram superimposition of Sr gray and Ca MalDH pale gray In the Ca MalDH structure the NADH is colored yellow and the catalytic residue H195 is in blue The blue arrows indicate the main structural differences between the apo state and the ternary complex of LDH The locations of additional glycine residues red balls in Sr MalDH compared to Ca MalDH and locations of proline residue green in Ca MalDH compared to Sr MalDH are indicated PDB numbering b View of the Ca MalDH backbone showing in color those residues whose relative crystallographic B factor difference between the Ca MalDH and Sr MalDH structures is greater than 1 standard deviation with respect to the average value Red indicates that the Sr structure has the higher relative B factor while blue indicates that the Ca
303. helix superimposes very well with the one observed in Ca MalDH not shown In Hm MalDH the connecting region BJ a1G does not contain any secondary elements due to the deletion of few residues This has a consequence on the location and shape of the a1G a2G helix which is in a straight position allowing the catalytic site to be in a wider open state a situation that favors substrate trafficking This phenomenon is not observed in the halophilic Sr MalDH enzyme As observed with its non halophilic counterparts the alG a2G helix of Sr MalDH is kinked Fig 4 bottom row Our data suggest that gradual structural rearrangements Structural Analysis of MalDH from S ruber promote favorable change of enzymatic activity at high salt concentrations Flexibility of the Sr MalDH catalytic pocket One way that the Sr enzyme could acquire increased activity at high salt concentrations relative to the Ca enzyme would be to increase overall flexibility in the active site region Because of their effects on local conformational entropy specific glycine and proline substitutions have been empha sized in adaptive mechanisms within the malate LDH superfamily In cold adapted LDHs glycine residues have been selected for mostly in hinge regions that control enzyme conformational flexibility We found substitutions of non glycine residue from Ca MalDH into glycine residues in Sr MalDH These changes occur mainly in regions surrounding t
304. hiles en solution par rapport leurs homologues non halophiles Mes observations d montrent que la s lection position quivalente d un acide amin acide perturbe la structure de l eau dans l enveloppe de solvatation d une enzyme halophile par rapport son homologue non halophile Pour la premi re fois et par une exp rience de cristallographie il aura donc t possible de d montrer que la minimisation de l exposition au solvant de groupements hydrophobes d favorable d un point de vue nerg tique haut sel Thomas and Elcock 2006 est la principale force volutive qui dicte l adaptation des prot ines halophiles Les polygones d eau dans la litt rature L association des mol cules d eau en r seaux de polygones la surface des prot ines a d j t ob serv e et l tude g n rale de la structure des mol cules d eau la surface des prot ines est d actualit Sterpone et al 2010 Le professeur Masayoshi Nakasako de l Universit Kei Japon est en parti culier le le seul avoir mis en lumi re cette caract ristique structurale travers une tude statistique pouss e s appuyant sur l ensemble des structures de la Protein Data Bank Matsuoka and Nakasako 2009 profitant d un programme de d tection de polygones de son cru Toutefois pour ses travaux l hy poth se de base que le Pr Nakasako utilise est qu un polygone de mol cule d eau peut tre constitu par seulem
305. hoice for solving de novo protein structures Consequently the preparation of effective heavy atom derivatives displaying anomalous scattering has become a key point for de novo crystal structure determination With the incorporation of selenium through the substitution of methionine residues by seleno methionine Hendrickson et al 1990 Doublie 1997 and with the developments at third generation synchrotron radiation sources which allow weak anomalous signals from intrinsic scatterers to be used the time consuming preparation of heavy atom derivatives has been facilitated However the use of such procedures is not always possible which revives the problem of incorporating effective anom alous scatterers into protein crystals Therefore we proposed to use lanthanoid complexes for preparing lanthanoid deri vative crystals Girard et al 2002 Lanthanoid ions Ln are well suited to anomalous diffraction experiments since they all exhibit a strong white line in their Ly absorption edge leading to extremely large anomalous contributions of almost 30 e for both f and f A way to assess the phasing power of lanthanides is to compare them with the most frequently used anomalous scatterer ie selenium from seleno methionine For this purpose the Bijvoet ratio can be considered We have shown Girard Stelter et al 2003 that the Bijvoet ratio can be expressed as 1 2 AF 1 2a F F Lett Np where N
306. holine Figure 4 34 page 147 De plus sa taille correspond une sph re de 28 environ alors que celle des com plexes Eu HMTDPA 3 et Eu HETDPA 3 est de 22 et 24 respectivement Nos observations ont r v l que tant pour l obtention de cristaux d riv s que pour son mode de fixation le complexe Eu HECTDPA 3 diff re des deux autres complexes Eu HMTDPA 3 et Eu HETDPA 3 Obtention de cristaux d riv s de HEWL avec le Eu HECTDPA 3 Contrairement aux complexes Eu HMTDPA 3 et le Eu HETDPA 3 je wai jamais constat de double faci s cristallin dans les gouttes de co cristallisation Qu elle que soit la concentration en complexe utilis e les cristaux d riv s obtenus pr sentent des faces unies et ressemblent aux cristaux natifs de lysozyme mais aplatis dans une direction Figure 4 42 Pour du lysozyme et du complexe m lang s dans les m mes rapports de concentration que pour les Eu HMTDPA 3 et le Eu HETDPA 3 j ai toujours observ avec le Eu HECTDPA 3 des cristaux d riv s bien plus gros et moins nombreux dans la goutte de cristallisation 159 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE HEWL mM 10 d riv s de HEWL mg mL 149 avec 10 MMi Eu HMTDPA 3 UV proches d riv s de avec 10 a Cristaux 10 mgmL Eu HMTDPA s3 lumi re visible b Cristaux Figure 4 42 Cristaux d riv s de HEWL par co cristallisation avec le complexe Eu HECTDPA s Int g
307. i USA 95 11476 11481 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Structural Analysis of MalDH from S ruber Johns G C amp Somero G N 2004 Evolutionary convergence in adaptation of proteins to temperature A4 lactate dehydrogenases of Pacific damselfishes Mol Biol Evol 2 314 320 Girard E Marchal S Perez J Finet S Kahn R Fourme R et al 2010 Structure function perturbation and dissociation of tetrameric urate oxidase by high hydrostatic pressure Biophys J 98 2365 2373 Thomas A S amp Elcock A H 2006 Direct observation of salt effects on molecular interactions through explicit solvent molecular dynamics simu lations differential effects on electrostatic and hydrophobic interactions and comparisons to Pois son Boltzmann theory J Am Chem Soc 128 7796 7806 Collins T Meuwis M A Gerday C amp Feller G 2003 Activity stability and flexibility in glycosi dases adapted to extreme thermal environments J Mol Biol 328 419 428 Georlette D Damien B Blaise V Depiereux E Uversky V N Gerday C amp Feller G 2003 Structural and functional adaptations to extreme temperatures in psychrophilic mesophilic and ther mophilic DNA ligases J Biol Chem 278 37015 37023 Bae E amp Phillips G N Jr 2004 Structures and analysis of highly homologous psychrophilic meso philic and the
308. icipent au r seau de liaisons hydrog nes Figure 2 2 Dans ce cas la distance entre les les deux atomes de lanthanide est d environ 6 En couvrant les zones hydrophobes le complexe LnHPDO3A forme un cran au solvant L nergie totale du syst me physico chimique prot ine LnHPDO3A est donc plus faible Le caract re nergi quement d favorable de pr senter des zones hydrophobes la surface de la prot ine est d autant plus important que la force ionique du solvant est importante Ceci est en accord avec la forte fixation du LnHPDO3A lorsque les conditions de cristallisation contiennent des fortes concentrations en sels 2 1 2 2 Le complexe LnDO3A pour les interactions ioniques Le complexe LnDO3A est aussi une mol cule dont la charge globale est nulle Sa structure est similaire au LnHPDO3A ce complexe poss de le m me macrocycle donc la m me face hydrophobe et une face hydrophile La diff rence avec le LnHPDO3A r side dans le groupement hydroxy propyl qui est absent chez le complexe LnDO3A Cette absence conduit la pr sence de deux mol cules d eau dans la premi re sph re de coordination Bien que la structure entre les deux complexes soit tr s similaire le complexe LnDO3A pr sente un tout autre mode de fixation Le LnDO3A se fixe sur les acides amin s aspartate et glutamate par une liaison ionique entre la fonction acide de ces acides amin s et l ion lanthanide Figure 2 3 En chassant une des deux mol
309. ies reservoir solution PhTET1 12s derivative crystals 150 um x 150 um x 30 um were obtained within three weeks by cocrystallization with Eu DPA 3 by mixing 1 5 ul of 6 2 mg ml protein solution 1 5 ul of 220 mM Na3 Eu DPA 6H O solution and 1 5 ul of reservoir solution containing 23 24 PEG 3350 or 23 26 PEG 2000 MME Prior to data collection derivative crystals were cryo cooled in liquid nitrogen using mother liquor containing 20 ethyl ene glycol as cryo protectant 2 3 Data collection and data processing SAD data were collected on the FIP BM30A beamline at the ESRF Based on a fluorescence scan the wavelength was chosen at the Ly europium absorption edge and was set to 1 766 A which corresponds to the maximum value of f 28 e Diffraction data were integrated using the program XDS Kabsch 2010a b and the integrated intensities were scaled and merged using the CCP4 programs SCALA and TRUNCATE Collaborative Computa tional Project Number 4 1994 A a summary of the processing statistics is given in Table 1 3 Results 3 1 Derivative crystal form As described in 2 we used crystal lization conditions that led to a new high resolution form of PhTET1 12s in space group P2 with an entire dode camer in the asymmetric unit Dura et al 2010 Surprisingly the addition of the tris dipicolinate complex led to the initial F4 32 crystal form diffracting at low resolution that was used for the in
310. igand HMTDPA est de 308 16 g mol 102 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 3 Les deux formes nantiom res du Ln HMTDPA 3 Avant de disposer des complexes entiers nous ne poss dions que du ligand sous forme de poudre J ai pu alors pr parer le complexe entier en suivant ce protocole Pr paration du complexe Tb HMTDPA 3 partir du ligand seul La masse molaire du ligand HMTDPA est gale Mig 308 16 g mol Apr s avoir pes une masse Mig 4 5 mg de poudre je l ai dissoute enti rement dans un volume Vjjg 95 pL ce qui conduit une solution de concentration Cyg 153 7 mM Etant donn que le complexe est form de trois ligands pour un ion lanthanide il faudra une concentration finale de sel de lanthanide de Cry 50 mM un l ger exc s de ligand tant indispensable pour ne pas laisser d ions lanthanides libres en solution Ainsi pour une masse my 1 4 mg de chlorure de terbium pes e et pour Mr 373 38 g mol t j ai ajout un volume Vy one 75 pL de solution de ligand pour pr parer une solution contenant 50 mM de complexe Tb HMTDPA 3 D s lors il est possible de v rifier la formation du complexe en solution qui fluoresce fortement dans le vert lorsqu on l expose aux proches UV A 315 nm l aide d une lampe de paillasse mod le qu on utilise par exemple pour mettre en vidence l ADN marqu au BET sur gel d
311. igh throughput phasing Current opinion in structural biology 12 674 678 320 BIBLIOGRAPHIE Dauter Z Dauter M and Dodson E 2002 Jolly SAD Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 58 494 506 Dauter Z Dauter M and Rajashankar K R 2000 Novel approach to phasing proteins derivatiza tion by short cryo soaking with halides Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 56 232 237 de La Fortelle E 1997 SHARP A maximum likelihood heavy atom parameter refinement program for the MIR and MAD methods Methods in Enzymology 276 472 494 Delfosse V Girard E Birck C Delmarcelle M Delarue M Poch O Schultz P and Mayer C 2009 Structure of the archaeal pab87 peptidase reveals a novel self compartmentalizing protease family PloS one 4 e4712 Dolinsky T J Nielsen J E McCammon J A and Baker N A 2004 PDB2PQR an automated pipeline for the setup of Poisson Boltzmann electrostatics calculations Nucleic Acids Research 32 665 667 Doubli S 1997 Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination Methods in enzy mology 276 523 530 Doutch J Hough M A Hasnain S S and Strange R W 2012 Challenges of sulfur SAD phasing as a routine method in macromolecular crystallography Journal of synchrotron radiation 19 19 29 Dura M A Receveur Br chot V Andrieu J P Ebel C Schoehn G Rousse
312. igure 3 6 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA 3 en co cristallisation avec AVEGFP En examinant les gouttes de la m me mani re que pour la prot ine EcAcrB et en conservant le m me code couleur nous voyons sur les figures 3 5 et 3 6 qu il n a pas t possible d obtenir des cristaux d riv s de AVEGFP et que de toutes les observations l auto cristallisation du complexe Eu DPA 3 est la plus courante 92 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION 3 2 3 Co cristallisation de la prot ine CmCH34CnrXs avec le complexe Eu DPA Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs E Cristaux de sel de Eu DPA E Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA J O Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 7 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de CmCH34CnrXs avec le complexe Eu DPA 3 Cristaux d riv s E Cristaux de sel de Eu DPA Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA Figure 3 8 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA 3 en co cristallisation avec CmCH34CnrXs L examen des deux gouttes dans les 576 conditions de cristallisation a conduit
313. ilis es 55806 Composition nbre d atomes Prot ine 4959 H20 101 Tons 0 Ligands 102 Res hors Ramachandran 0 93 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 004 Liaisons 4ngies 0 726 Bmoyen prot ine A 45 64 Bmin prot ine A 22 62 Bmax prot ine A 144 56 Bmoyen ligands divers A 55 50 Bmoyen eau A 43 51 Bmoyen ions lanthanide A 49 33 Bmoyen ligands A 49 20 Site Loce 53 Site 20cc 24 Site 30c 23 Tableau 7 8 R sum des statistiques d affinement pour la structure de PtMalDH avec le complexe GGHPDO3A 224 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Affinement de la structure de HvMalDH avec mod lisation du GGHPDO3A GdHPDO3A HvMalDH R solution A 48 40 1 95 Rwork 18 14 Rfree 21 57 Nbre de r flexions utilis es 179201 Composition nbre d atomes Prot ine 9160 H20 787 Ions 28 Ligands 0 Res hors Ramachandran 1 49 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 007 Liaisons 4ngles 0 973 Bmoyen prot ine A 37 67 Bmin prot ine A 14 24 Bmax prot ine A 133 19 Bmoyen ions divers A 56 44 Bmoyen eau A 42 94 Tableau 7 9 R sum des statistiques d affinement pour la structure de HvMalDH avec le complexe GGHPDO3A 7 1 3 5 Comparaison des surfaces lectrostatiques 4 r gion quivalente des trois MalDH Dans les tra
314. ille sup rieure L analyse de la s quence primaire de la prot ine PhTET1 12s conduit un point iso lectrique th o rique de 5 27 et un coefficient d extinction molaire de c289nm 26025 M cm7 La prot ine m a t fournie purifi e et concentr e 6 2 mg mL par la Dr Asunci n Dura membre de l quipe Dura et al 2005 6 2 Obtentions de cristaux natifs et d riv s La prot ine PhTET1 12s peut cristalliser sous deux formes La premi re forme de groupe d espace F4132 a permis la r solution initiale de la structure 3 1 A de r solution Schoehn et al 2006 Plus r cemment une nouvelle forme cristalline de sym trie monoclinique groupe d espace P21 a t obtenue 199 6 3 L EFFET SUPRAMOLECULAIRE ET LE POUVOIR PHASANT DU COMPLEXE EU DPA 3 Ces cristaux difficilement reproductibles diffractent 2 1 de r solution Sur la base des conditions de cristallisation conduisant cette forme monoclinique nous avons introduit le complexe tris dipicolinate d europium par co cristallisation Comme le montre la figure 6 1 les cristaux obtenus ne ressemblaient plus aux cristaux natifs 20 22 PEG 3350 20 PEG 2000 MME 100 mM Tris HCl pH 7 5 200 mM TMAO P 6 2 mg mL Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R T 293 K 20 C 20 25 jours Cryo protection 20 ethylene glycol a Cristaux natifs de b Cristaux d riv s de c Condition
315. in Vives pour l acc s la plateforme Biacore de l IBS et pour leur pr cieux conseils Enfin je remercie de Dr leva Sutkeviciute pour m avoir donn la composition de son m lange personnel pour r g n rer les puces Biacore 309 11 1 D TECTER LA FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE SUR DES MACROMOL CULES BIOLOGIQUES PAR R SONNANCE PLASMONIQUE DE SURFACE BIACORE 11 1 1 Principe th orique de la SPR et fonctionnement du Biacore Afin d tudier l interaction de deux entit s dans un flux et de calculer une constante d affinit Ka pour ladite interaction on greffe une des deux entit sur une puce Biacore une prot ine par exemple et on fait passer dans un flux au dessus de cette puce une autre entit figure 11 1 Il n y a donc pratiquement pas de flux au niveau de ce qui est greff sur la puce Toutes les entit s qui peuvent interagir avec ce qui est greff se retrouvent li es via le ph nom ne de s dimentation Le flux n intervient donc pas dans la modification de ce qu on mesure l angle de r fraction En fonction de ce qui interagit l angle de r fraction 0 entre l onde r fl chie et la puce va changer et c est cette variation de 0 que l on mesure D un point de vue plus physique une liaison entre l entit greff e et celle qui s dimente va modifier la propagation de l onde vanescente dans le nuage d lectron que constitue une fine couche de m tal de lor dans le cas d
316. ine et permet de pr sumer un phasage exp rimental ult rieur conduisant la structure de celle ci Mais seule cette famille de complexe pr sente actuellement cette tr s int ressante propri t Pour les autres complexes issus de l imagerie m dicale il est n cessaire d arriver jusqu la lourde tape de la diffraction pour savoir si le complexe se fixe la prot ine Ainsi la recherche de m thodes simples et peu co teuses permettant de savoir au pr alable si un complexe de lanthanide peut se fixer la prot ine d int r t a toujours t au centre de nos pr occupation et d j fait l objet de la th se de Meike Stelter C est donc en partie dans ce but qu au cours de mon travail de recherche nous avons aussi r alis s des exp riences de R sonnance Magn tique Nucl aire et de R sonnance Plasmonique de Surface avec les complexes de lanthanide Cette annexe contient donc une description tr s succincte de ces exp riences et de l ensemble des observations qui en d coulent 11 1 D tecter la fixation des complexes de lanthanide sur des macro mol cules biologiques par R sonnance Plasmonique de Surface Biacore Je tiens remercier ici le Dr Eric Chabrol pour m avoir non seulement chaperonn tout au long de ces exp riences de R sonnance Plasmonique de Surface SPR Biacore mais aussi pour m avoir transmis une bonne partie de son savoir Je remercie aussi le Dr Nicole Thielens et le Dr Roma
317. ing of the lysosomal 66 3 kDa protein from mouse Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 65 220 228 323 BIBLIOGRAPHIE Larson S B Day J S Cudney R and McPherson A 2007 A novel strategy for the crystallization of proteins X ray diffraction validation Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 63 310 318 Laskowski R A MacArthur M W Moss D S and Thornton J M 1993 PROCHECK a program to check the stereochemical quality of protein structures Journal Of Applied Crystallography 26 283 291 Lewis W G Green L G Grynszpan F Radi Z Carlier P R Taylor P Finn M G and Sharpless K B 2002 Click chemistry in situ acetylcholinesterase as a reaction vessel for the selective assembly of a femtomolar inhibitor from an array of building blocks Angewandte Chemie International ed in English 41 1053 1057 Lye R C Phillips J C Kaplan D Doniach S and Hodgson K O 1980 White lines in L edge x ray absorption spectra and their implications for anomalous diffraction studies of biological materials Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77 5884 5888 Madern D 2002 Molecular evolution within the L malate and L lactate dehydrogenase super family Journal of molecular evolution 54 825 840 Matsuoka D and Nakasako M 2009 Probability distributions of hydration water molecules
318. ion 25 thyl ne glycol ou paratone a Cristal natif de b Conditions de cristallisation et de cryo protection TdTHAU 1100x520 pm Figure 4 10 Cristallisation et cryo protection de la thaumatine 110 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 4 2 3 2 Obtention des cristaux d riv s Des cristaux d riv s de TUTHAU ont pu tre obtenus par co cristallisation avec le Ln HMTDPA s et ce dans les m mes conditions de cristallisation que la prot ine native Les cristaux semblent identiques en tout point aux cristaux natifs Figure 4 11 0 3 0 9 M tartrate double de potassium et de sodium 100 mM bis tris propane pH 6 5 Plstock 40 mg mL C stock 30 75 mM Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R 1 5 pL C T 293 K 20 C 5 jours 0 9 M tartrate K Na 10 jours 0 3 M Cryo protection 25 thyl ne glycol ou paratone a Cristaux d riv s de b Conditions de cristallisation et de cryo protection TdTHAU 700x190 pm Figure 4 11 Cristaux d riv s de TATHAU Ln HMTDPA 3 par co cristallisation En comparasaison une goutte de cristallisation sans complexe et quelle que soit la concentration de pr cipitant j ai syst matiquement d nombr davantage de cristaux de taille plus r duite dans une goutte de cristallisation avec complexe La pr sence de ce dernier semble augmenter le nombre de points de nucl ation La fi
319. ion analysis of macro molecules by sedimentation velocity ultracentrifuga tion and Lamm equation modeling Biophys J 78 1606 1619 Madern D Ebel C Mevarech M Richard S B Pfister C amp Zaccai G 2000 Insights into the molecular relationships between malate and lactate dehydrogenases Structural and biochemical proper ties of monomeric and dimeric intermediates of a mutant of tetrameric LDH like malate dehydrogenase from the halophilic archaeon Haloarcula marismortui Biochemistry 39 1001 1010 Holbrook J J Lilias A Steindel S J amp Rossmann M G 1975 Lactate dehydrogenase In The Enzymes Boyer P D ed pp 191 292 Academic Press New York NY Gerstein M amp Chothia C 1991 Analysis of protein loop closure Two types of hinges produce one motion in lactate dehydrogenase J Mol Biol 220 133 149 Iwata S Kamata K Yoshida S Minowa T amp Ohta T 1994 T and R states in the crystals of bacterial L lactate dehydrogenase reveal the mechanism for allosteric control Nat Struct Biol 1 176 185 Dym O Mevarech M amp Sussman J L 1995 Structural features that stabilize halophilic malate dehydrogenase from an archaebacterium Science 267 1344 1346 Fields P A amp Somero G N 1999 Hot spots in cold adaptation localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes Proc Natl Acad Sc
320. ir et ou mod liser le ligand des complexes J aurais donc pu couper en r solution afin d obtenir de meilleures statistiques Toutefois compte tenu de la forte redondance la valeur de l indicateur Rpim est de 40 peut aussi justifier notre choix de conserver une r solution de 1 67 A 218 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Int gration des donn es de diffraction issues d un cristal de PtMalDH d riv avec le com plexe GdHPDO3A GdHPDO3A PtMalDH M thode co cristallisation 100 mM de complexe Source synchrotron SOLEIL Ligne de lumi re PROXIMA1 MAD non x 1 711 Gdz Groupe d espace 14 22 Param tres de maille A a 112 402 c 286 400 Contenu unit asym trique dim re A D R solution A 47 73 2 54 2 68 2 54 Nombre de r flexions uniques 29874 3601 Rmerge 5 8 29 7 Rpim 3 5 19 5 Sigano XDS 1 43 0 75 Rano 4 9 19 7 sty 11 4 2 6 Compl tude 97 3 81 1 Redondance 6 7 4 8 Tableau 7 2 Statistiques d int gration du jeu de donn es de diffraction d un cristal d riv de PtMalDH avec le complexe GdHPDO3A 219 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Int gration des donn es de diffraction issues d un cristal de HvMalDH d riv avec le complexe GdHPDO3A
321. is es avec le serveur TLSMD Painter and Merritt 2006b a ii Lorsque la r solution tait suffisamment haute lt 1 30 A j ai pris le parti d affiner les facteurs d agitation thermique de tous les atomes avec correction d anisotropie la place du TLS iii En dernier lieu et toujours dans le but de maintenir un cart raisonnable entre le R free et le Rwork il peut tre judicieux de laisser le programme d terminer le meilleur poids accorder entre l affinement des coordonn es atomiques et l affinement des facteurs d agi tation thermique le calcul de ces poids requiert un temps de calcul plus long 1 6 3 Les cartes de densit lectronique La carte 2F Fe g n re une densit lectronique autour de l ensemble du mod le prot ine ions ligands mol cules d eau En compl ment on utilise une carte Fo Fe nomm e carte diff rence qui rend directement compte des d saccords entre le mod le et les donn es exp rimentales 1 6 4 Les facteurs de qualit d affinement de structure gt Le diagramme de Ramachandran Ramachandran and Sasisekharan 1968 Ce diagramme per met d valuer la qualit de la g om trie de la chaine principale Pour la majorit des acides amin s seules les conformations nergiquement favorables sont permises pour les angles di dres axe N C et p axe C C des liaisons peptidiques Quatre zones distinctes sont d finies en fonction des val
322. is s Certains jeux de donn es trait s avec la version de d cembre 2009 ou avec des versions ult rieures qui n avaient pu conduire l obtention de phases exp rimentales ou qui avaient du tre coup s en r solution afin d obtenir des statistiques plus favorables ont finalement t exempts de tout d faut lors d un nouveau traitement avec la version de d cembre 2010 sans que cela soit li une augmentation du nombre de r flexions rejet es Ceci peut s expliquer par le soin apport d une part l analyse du bruit d aux anneaux de glace et d autre part la r alisation de la table de bruit de fond Dans la version de d cembre 2010 ces deux routines donnent de bien meilleurs r sultats lorsqu on fait en sorte qu elles soient r alis es sur l ensemble des clich s de diffraction et pas seulement sur les premiers clich s La premi re tape du traitement des donn es cristallographiques est l indexation de l ensemble des t ches de diffraction pour d terminer les param tres de maille et assigner chaque r flexion un point du r seau r ciproque Ceci est effectu avec la routine IDXREF du programme XDS Elle produit une liste de r seaux de Bravais possibles avec leur param tres de maille associ s Le r seau de Bravais choisi pour l tape suivante poss dera la plus haute sym trie et le meilleur accord de qualit La seconde tape consiste d terminer l intensit de chaque r flexion routine INTEGR
323. is cristaux contrairement aux complexes Ln HMTDPA 3 et Ln HETDPA s3 et d autre part cela explique aussi pourquoi ce complexe ne se lie pas la thaumatine Cette prot ine ne propose en effet que des acides amin s arginine pour tablir des liaisons hydrog nes et les interactions hydrophobes tant le mode de fixation exclusif du complexe Ln HECTDPA s il ne se fixe pas sa surface Tout comme nous l avions mentionn pour le complexe Ln HMTDPA 3 le fait d avoir plusieurs structures r solues avec le m me complexe permet d avoir une id e du positionnement statistique des ligands du complexe La figure 4 48 montre que comme le laissait pr supposer les facteurs d agitation thermique et la double conformation mod lis e dans la structure la queue hydroxyethylcholine est assuj tie un mouvement rotationnel autour de l axe que forme la liaison entre le Nt et le carbone qui suit le noyau triazole Ceci est valable pour les trois ligands qui composent le complexe Cette observation confirme que la queue choline ne joue pas un r le direct dans la fixation du complexe elle n est pas impliqu e dans des liaisons fortes avec la prot ine Mais elle joue un r le indirect porteuse de la charge qui rend le complexe neutre elle a conf r l ensemble du complexe de nouvelles propri t s de fixation D Figure 4 48 Vue du site de fixation 1 du Eu HECTDPA apr s superposition de 3 struc tures
324. is the number of atoms of the protein of mean scattering factor Zer q and f are the site occupancy and the 74 doi 10 1107 0909049510036824 J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 diffraction structural biology imaginary part of the atomic scattering factor of the anom alous scatterer j respectively This formula clearly shows that assuming fixed site occupancies identical Bijvoet ratios are obtained for a protein that is four times larger when f is doubled for each anomalous scatterer Assuming that the diffraction data are collected at the respective absorption edge f values are about 10 and 30e for selenium and lanthanoid respectively This means that one fully occupied lanthanoid atom will allow a protein that is nine times larger compared with a fully occupied Se atom to be phased Hence lanthanoids are good candidates for macro molecular structure determination based on the use of the anomalous signal Lanthanoid ions were used in early MAD studies on calcium binding proteins Kahn et al 1985 Weis et al 1991 as they can substitute for Ca Nagem et al 2001 proposed to incorporate lanthanoid salts through the quick cryo soak method but soaking crystals in solutions containing lanthanoid salts often damages the crystals owing to the preferred nine based coordination of lanthanoid ions To overcome this problem Purdy et al 2002 proposed to use a covalent linkage between a lanthanoid complex featu
325. isible lorsqu il est expos au UV proches Cette propri t permet de r v ler la fixation du complexe dans les cristaux d riv s de prot ine avant l tape de diffraction De plus l obtention de cristaux d riv s par co cristallisation et l tude du mode de fixation du complexe Ln DPA 3 ont r v l une autre propri t qui lui est propre Dans les conditions de cristallisation natives de deux prot ines de petite taille introduction de ce complexe a conduit des cristaux d un groupe d espace diff rent de celui des cristaux natifs En tablissant des liaisons hydrog nes et hydrophobes de type empilement x simultan ment avec plusieurs mol cules ce complexe peut conduire un empilement cristallin diff rent ce que nous avons qualifi d effet supramol culaire du tris dipicolinate de lanthanide cf introduction Ainsi ces deux propri t s font du complexe Ln DPA 3 un complexe tr s prometteur un complexe dont la fixation peut tre facilement r v l e et qui peut jouer le r le d agent de nucl ation pour promouvoir l apparition de cristaux d riv s en co cristallisation C est ce que nous avons voulu v rifi en premier lieu Nous avons men une exp rience de co cristallisation automatis e l aide du robot de cristallisation nanogoutte de l EMBL avec six prot ines clectiques Cette exp rience nous a en outre permis de mettre en vidence et de fa on statistique un d faut inh rent
326. isme MalDH 4 14 PEG 400 100 mM ac tate de Chloroflexus Bact rie f sodium pH 4 6 aurantiacus thermophile 53 51 40 mM ac tate de cadmium 1 2 1 8 M sulfate Picrophilus arch e hyperther d ammonium j torridus moacidophile 100 mM acide citrique 53 PH 3 5 4 0 34 36 PEG 400 a 100 mM 65 83 59 Haloferax volcanii arch e halophile Tris HCl pH 8 0 s es 59 50 100 mM chlorure de 48 46 S 44 magn sium 41 Tableau 7 10 R sum des r sultats de l tude de l interaction de trois complexes IRM sur les MalDH Aucune fixation fixation faible site d tect par synth se de Fourier anomale fixation forte phasage de novo par m thode SAD possible Seuls les taux d occupation affin s des sites occup s plus de 40 sont indiqu s 7 1 LES MALATE DESHYDROGENASES POUR UNE ETUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Le tableaux 7 10 montre que la fixation des complexes GGHPDO3A GdDO3A et GdDTPA BMA diff re selon le complexe et la MalDH utilis s Le mode de fixation des complexes de lanthanide utilis s jusqu alors a r v l l importance des liaisons hydrog nes et des liaisons ioniques qui se cr ent entre les acides amin s de la surface prot ique et les complexes Les complexes utilisent les groupements fonctionnels ionisables de ces acides amin s pour cr er ce type de liaison liaisons hydrog nes
327. issues des cristaux d riv s de Ca MalDH PtMalDH et HvMalDH 217 7 1 3 3 Phasage des donn es de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH avec le GGHPDO3A 220 7 1 3 4 Affinement des structures de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH 223 7 1 3 5 Comparaison des surfaces lectrostatiques 4 r gion quivalente des trois MalD EE 3 63 6 kG es Gh Pe gh Ae teak wet ARE elo Me 225 7 1 4 R sum des premi res observations issues de l tude de l interaction des trois com plexes IRM sur les trois MalDH 227 7 2 Les nouvelles structures de MalDH r solues par phasage de novo 231 7 2 1 HvMalDH la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii 232 7 2 1 1 Int gration des donn es en vue d un phasage par la m thode SIRAS 232 7 2 1 2 Phasage par la m thode SIRAS 233 7 2 1 3 Affinement de la structure de HvMalDH 233 7 2 1 4 Une mod lisation fiable des ions dans la structure de HvMalDH gr ce la diffusion anomale 234 7 2 2 PtMalDH la malate d shydrog nase de Picrophilus torridus et la localisation de la boucle catalytique sie 4 4 48e En oh fee ig ele ee Be Marge 4e 236 7 2 2 1 Int gration des donn es de diffraction 236 7 2 2 2 Calcul des phases pour les deux types de donn es enregistr es 238 7 2 2 3 Affinement des structures de PtMalDH
328. istal d riv par trempage Tableau 4 13 Phasage exp rimental de HEWL avec le Eu HETDPA 3 Avec le lysozyme de blanc d ceuf de poule on constate que le complexe s est suffisamment fix dans le cristal pour permettre le phasage exp rimental Comme c tait le cas pour le complexe Eu HMTDPA 3 _ le phasage r alis 4 partir de donn es de diffraction issues d un cristal d riv par co cristallisation est plus pr cis que celui r alis partir d un cristal d riv par trempage Il permet la construction auto matique de plus de 98 des r sidus qui composent la prot ine Tableau 4 15 et Figure 4 35 Suite la co cristallisation un seul site de fixation sert au calcul des phases alors que suite un trempage ces phases se calculent 4 partir de deux sites de fixation En trempage le second site de fixation se peuple davantage au d triment du premier D apr s les coordonn es des sites de fixation des diffuseurs anomaux on peut en d duire un comportement quivalent au Eu HMTDPA 3 150 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Eu HETDPA 3 HEWL Rapport DRE to 3 0 10 8 M thode d obtention co cristallisation trempage Type de donn es MAD SADzEuz R solution A 40 83 1 51 41 06 1 93 Picsra Picgoufre pk 5 58 75 4 38 38 38 22 64 7 05 Picsra Picgoufre rm oc 60 05 5 74 FOM harp FOM Sharp 0 4
329. it es ci dessous qui permettent de faire la preuve de concept de cette nouvelle approche Dans les sections suivantes je pr senterai trois nouvelles structures de malate d shydrog nases r solues par phasage exp rimental avec les complexes de lanthanide 1 la structure de la malate d shydrog nase issue de l arch e hyperthermoacidophile Picrophilus tor ridus PtMalDH r solue gr ce au complexe GGHPDO3A 2 la structure de la malate d shydrog nase issue de l arch e halophile Haloferax volcanii Hv MalDH r solue gr ce aux complexes G4DO3A et GdDTPA BMA 3 la structure de la malate d shydrog nase issue de la bact rie thermophile Chloroflexus aurantiacus CaMalDH r solue gr ce aux complexes GdHPDO3A et GdDO3A Nous verrons aussi en quoi la construction de ces mod les haute r solution permet de fournir des informations cl s pour mieux comprendre l adaptation de ces enzymes au stress auquel elles doivent faire face dans le cytoplasme de la cellule 213 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE 7 1 1 Cristallisation des diff rentes malate d shydrog nases et obtention de cris taux d riv s Les PtMalDH HvMalDH et CaMalDH purifi es et respectivement concentr es 10 mg mL 10 mg mL et 20 mg mL m ont t fournies par le Dr Madern Un chantillon concentr 10 mg mL7 de chacune d
330. it du complexe qui une fois introduit dans la goutte conduit syst matiquement au plus grand nombre de cristaux au faci s tortur Cette forte charge fait basculer son mode de fixation qui s oriente alors non plus vers les interactions hydrophobes mais uniquement vers les liaisons hydrog nes avec les acides amin s arginine et lysine En ce sens le complexe Ln CTDPA 3 est l oppos du complexe Ln HECTDPA 3 alors que ce dernier de charge globale neutre privil gie le mode de fixation impliquant les interactions hydrophobes avec les acides amin s tryptophane le Ln CTDPA 3 six fois charg n gativement privil gie le mode de fixation impliquant les acides amin s arginine et lysine Son mode de fixation ressemble alors celui du tris dipicolinate de lanthanide induisant des liaisons supramol culaires pour cr er un nouvel empilement cristallin Mais la pr sence d un petit nombre de complexes fix s aux acides amin s tryptophane et ou l encombrement qu induit le noyau triazole conduit un empilement mal organis et donc aux cristaux pr sentant un faci s tortur 4 7 Le Ln HMTDPA un complexe modulable la combinatoire Le fait d avoir d une part un complexe compos de trois ligands non li s covalament entre eux et d autre part plusieurs ligands diff rents rapidement modifiables par chimie click a ouvert une autre piste celle de la combinatoire J entends par ce terme le fait de cr
331. itial structure determination of PhTET1 12s at 3 09 resolution Porciero et al 2005 Schoehn et al 2006 Figure 1 3 2 De novo structure determination As shown in Table 1 the high value of Rano clearly indicated the presence of tris dipicolinate europium complex binding sites which was then confirmed by the anomalous Patterson map Despite the low resolution of the data we attempted de novo phasing of the structure of PhTET1 12s Using the program SHELXD Sheldrick 2008 we were able to locate one Eu site per TET monomer Heavy atom refinement and initial phasing were performed using the program SHARP La Fortelle amp Bricogne 1997 Phases from SHARP were improved by density modification using the CCP4 program DM Cowtan amp Main 1996 assuming a solvent content of 50 3 3 Experimental 4 0 A SAD phasing Despite the low resolution the experimental phases were accurate since the figure of merit after SHARP and DM are 0 369 and 0 731 respectively The resulting experimental electron density map was of good quality Fig 1a since it allowed the polypeptide chain to be traced as shown in Fig 2 a The overall shape of the PhTET1 12 subunit particle could be easily recognized with on one side of the particle the large channel Fig 1b assumed to be the entrance for the peptide substrate and on the other side the small channel Fig 1c assumed to be the exit pathway for the reaction products which are indivi
332. l ion lanthanide Ainsi de part leur tat carboxylique et non plus carboxylate il est possible que ces fonctions ne puissent plus tre impliqu es dans une liaison ionique avec l ion lanthanide du complexe LnDO3A 228 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES CaMalDH MRKKISIIGAG FVGSTTAHWLAAKELGDIVLLDEMEEVPOGKALDLYEASPIEGFDVR PtMalDH MARSKISVIGAG AVGATVAOTLAIROTGDIYIFDIVDGLAEGKALDILEGAPHWGYDLD HvMalDH MTKVSVIGAAGTVGAAGGYNLALRDVCDELVFVDIPKMEDKTVGQAADTNHGIAYDSN AFETERETE BESS MH sie in eS Ue EO ore CaMalDH TNNYADTANSDVIVVTSGAPRKPGMSREDLIKVNADITRACISQAAPLSPNA PtMalDH IKGFCTADESKYAEMKGSDVIVVTAGLARKPGMSRDDLLLKNIGIMKSVGEAIKKYSPES HvMalDH TVVT QGGYEDTAGSDVVVITAGIPROPCOTR NAP IMDDIGSSLAEYNDDF a ok K SK SK EK o Sk KK CaMalDH VIIMVNNPLDAMTYLAAEVSGFPKERVIGQAGVLDAARYRTF IAMEAGVSVEDVQAMLMG PtMalDH KIVVVTNPADIMAYAIYKASGISPERIIGLGGSLDSTRFRTFLAQELNVSFEDVNAFVIG HvMalDH VS CON RARE ET ZEEL DEN PRIMA AIOE EE VENT ILG one 8g SKK wk FF ogg ks ses r2 2 eok CaMalDH GHGDEMVPLPRFSTISGIPVSEFIAPDRLAQIVERTRKGGGEIVNLLKTGSAYYAPAAAT PtMalDH GHGDDMVPFIRYSNVSGIPIEDLLPREKIDEIVKRTRFGGGEIVNLYKTGSAFYAPGISI HvMalDH EHGDAQVPVFSKVRVDGN DPAFSADERE I LGDLQESAMDVIE RKGATQOWGPATGV xx el ke sees eo kee ary se fe 7 e888 ss se e CaMalDH AOMVEAVLKDKKRVMPVAAYLTGOYG LNDIYFGVPVILGAGGVEKILELPLNEEEM 289 PtMalDH AVMVESIVNDRKRVIPCAAYIT LVNNLFIGVPIKIGKNGVEKIYISIN
333. l A and Franzetti B 2005 Characterization of a TET like aminopeptidase complex from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii Biochemistry 44 3477 3486 Dura M A Rosenbaum E Larabi A Gabel F Vellieux F M D and Franzetti B 2009 The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea Molecular Microbiology 72 26 40 Elsliger M A Wachter R M Hanson G T Kallio K and Remington S J 1999 Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH Biochemistry 38 5296 5301 Emsley P Lohkamp B Scott W G and Cowtan K 2010 Features and development of Coot Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 486 501 Evans G and Pettifer R F 2001 CHOOCH a program for deriving anomalous scattering factors from X ray fluorescence spectra Journal Of Applied Crystallography 34 82 86 Evans P 2005 Scaling and assessment of data quality Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 62 72 82 Eventoff W Rossmann M G Taylor S S Torff H J Meyer H Keil W and Kiltz H H 1977 Structural adaptations of lactate dehydrogenase isozymes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 2677 2681 321 BIBLIOGRAPHIE
334. l car en solution trois contre ions sodium viennent se fixer aux trois oxyg nes de la fonction carboxylate de chaque ligand Figure 2 4 Le tris dipicolinate de lanthanide 73 2 2 UN COMPLEXE DE LANTHANIDE LUMINESCENT LE TRIS DIPICOLINATE D EUROPIUM Lorsque les ligands dipicolinate ch latent un ion lanthanide dont le spectre d absorption est dans le domaine des proches ultra violets et dont le spectre d mission de fluorescence est dans le domaine du visible le complexe excit sous UV proches luminesce alors dans le visible Comme nous l avons indiqu dans le chapitre pr c dent seuls deux lanthanides ont leur spectre d mission de fluorescence dans le visible le terbium et l europium Les complexes Tb DPA 3 et Eu DPA 3 luminescent respectivement dans le vert et le rouge Le complexe Ln DPA 3 pr sente une bonne solubilit dans l eau 220 mM 25 C Comme Va indiqu Guillaume Pompidor la pr sence de sels fortes concentrations ou la pr sence de cations divalents conduisent la dissociation du complexe Un complexe tris dipicolinate de zinc par exemple a t mis en vidence dans la structure de la thaumatine r solue par phasage exp rimental l aide du complexe Ce complexe ne peut donc tre utilis dans n importe quelle condition de cristallisation mais de par sa luminescence dans le visible il est possible de d tecter sa fixation dans les cristaux cf premier
335. l ne glycol monom thyl ether PMSF Phenylmethanesulfonylfluoride RMSD Ecart quadratique moyen SAD Single wavelength anomalous diffraction SDS Dod cylsulfate de sodium SIRAS Single isomorphous replacement with anomalous scattering TMAO Trimethylamine N oxide Tris 2 amino 2 hydroxym thyl 1 3 propanediol UV Ultraviolet Index AfUox 83 85 94 294 AfUox cristallisation 112 AvEGFP 83 85 90 AvEGFP biologie mol culaire 294 AvEGFP cristallisation 111 AvEGFP production 296 AvEGFP purification 299 Biacore 309 CaMalDH 83 85 93 113 224 240 243 CaMalDH cristallisation 114 214 CmCH34CnrXs 83 85 92 302 Combinatoire 168 EcAcrB 83 85 89 270 273 EcAcrB production 302 EcAcrB purification 303 HEWL 99 116 119 125 128 148 149 152 182 192 287 306 HEWL cristallisation 107 HvMalDH 114 231 HvMalDH cristallisation 214 LnCTDPA 146 167 LnDO3A 67 69 227 229 284 LnDPA 72 80 192 198 285 LnDTPA BMA 67 227 285 LnDTTA BPA 271 LnEATDPA 146 LnHECTDPA 146 158 LnHETDPA 146 147 LnHMTDPA 80 100 192 284 LnHPDO3A 67 68 216 226 285 LnTNTPA 80 180 192 Luminescence 65 73 103 108 110 MAD 36 11 PhTET1 12s 115 198 PhTET1 12s cristallisation 198 PhTET2 12s 83 85 95 Protocole d affinement 55 Protocole d int gration des donn es 53 Protocole MR 29 Protocole phasage 38 Protocole ShelxD 33 PtMalDH 235 286 PtMalDH crista
336. l EN DE LA N o o oO A NS o ZA o oO L xN O SS NN A NZ KOH Sol aq 1 M SS PNG LnCl 6H 0 _MeOH reflux 18h reflux 18h KC o Rendement 100 A es o o ES o A A a L LnL Figure 5 2 Synth se chimique du TNTPA par alkylation et complexation du lanthanide A l issue de cette synth se chimique les r sultats spectroscopiques confirment la complexation du lanthanide et permettent de mesurer la luminescence dans le visible La luminescence du LnTNTPA mesur e avec l europium est sup rieure celles des complexes tris dipicolinates d europium et tris hydroxymethyltriazoledipicolinate d europium t 0 83 ms le temps de demi vie mesur t tant de 1 09 ms avec un ion Eu Figure 5 3 page suivante 182 CHAPITRE 5 UN TRIS DIPICOLINATE CAG LE LNTNTPA Temps de vie P tat excit Eu 1 09 ms Tb 2 09 ms Intensit s normalis es a u 450 500 550 600 650 700 Temps ms Figure 5 3 R sultats spectroscopiques l issue de la synth se du TbTNTPA et du EuTNTPA J ai test ce nouveau complexe en co cristallisation et en trempage avec nos deux prot ines mod les habituelles le lysozyme de blanc d ceuf de poule et la Thaumatine de Taumatococcus daniellii Mais comme la cage qui forme le complexe a pour but d emp cher tout ion divalent de d stabiliser le complexe nous nous devions de trouver une prot ine mod le cristallisant en pr sence d
337. la surface de la prot ine puisque sa s quence d ADN est introduite dans le g ne qui code la prot ine par les techniques de biologie mol culaire classique Allen and Imperiali 2010 Barthelmes et al 2010 Mais cette m thode est assez lourde mettre en uvre et l encombrement st rique et la flexibilit qu introduit l imposante tiquette peuvent rendre difficile la croissance cristalline 65 1 8 UTILISATION DES LANTHANIDES EN TANT QUE DIFFUSEURS ANOMAUX Afin d introduire des lanthanides dans les cristaux de prot ines l approche de l quipe est d utiliser des complexes de lanthanide tr s solubles qui se fixent aux prot ines via des liaisons non covalentes cf chapitre suivant 1 8 2 La luminescence des lanthanides Comme nous allons voquer de nombreuses reprises la luminescence de certains complexes de lanthanide j introduis ici bri vement la luminescence intrins que des atomes de lanthanides Les cations trivalents des lanthanides ont la configuration lectronique Xe 4fn avec n variant de 1 pour le Cet 14 Lu Les transitions des lectrons f sont responsables des propri t s optiques des ions de lanthanides La luminescence des lanthanides est caract ris e par une longue dur e de vie des tats excit s de l ordre de la milliseconde C est l interdiction des transitions f f qui est responsable de la longue dur e de vie des tats excit s mais aussi de la faible photoexcitation
338. lding block of the whole particle Since the Eu DPA complex is bound within this building block it did not directly influence the molecular packing as would be the case if bridging two building blocks A possible explanation for the space group change is that binding of the tris dipicolinate europium complex induces a small conformational change in the PhTET1 12s protomer leading to the growth of the low resolution crystal form The tris dipicolinate europium complex binding site is located in the vicinity of a loop which is assumed to be a key player in the addressing of the substrate toward the catalytic chambers of the TET particle Dura et al 2009 To obtain new insights into this important functional zone we therefore plan to attempt to increase the resolution of the experimental data either by soaking PhTET1 crystals in solutions containing Eu DPA 3 or by preparing Eu DPA 3 derivative crystals of PhTET2 or PhTET3 in order to obtain more precise experimental i e model bias free information As mentioned the binding of the lanthanoid complexes to the protein depends on their ligand the non covalent inter action being for example hydrophobic for the complex Gd HPDO3A Girard Stelter et al 2003 or through hydrogen bonding between arginine lysine residues and the dipicolinate complex Pompidor et al 2010 Thus the probability of occurrence of the appropriate binding sites in the protein increases with the pr
339. le Ln TDPA 3 TbINTPA TdTHAU Complexe mM 31 Prot ine mM 0 6 Rapport 51 6 M thode co cristallisation Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD oui 1 648 Tbz 0 979 Groupe d espace P4 212 Param tres de maille A a 57 880 c 150 123 Contenu unit asym trique 1 mol cule R solution A 45 84 1 79 1 89 1 79 45 89 1 30 1 37 1 30 Nombre de r flexions uniques 24832 3508 64086 9183 Rmerge 4 3 8 2 5 4 42 7 Rpim 1 7 3 5 2 1 17 0 Sigano XDS 1 55 1 04 0 86 0 80 Rano 2 3 3 7 1 7 11 8 a 11 7 8 9 9 5 1 8 Compl tude 99 9 99 5 100 0 99 9 Redondance 13 1 12 4 13 9 13 8 Tableau 5 1 Statistiques d int gration du jeu de donn e de diffraction d un cristal d riv s TdTHAU TbTNTPA 5 3 3 Phasage exp rimental de la T ATHAU avec le TbTNTPA Les donn es MAD enregistr es au seuil Lzzz du terbium et hors seuil ont permis de mettre en vidence la pr sence de deux diffuseurs anomaux dans l unit asym trique Figure 5 5 Le jeu de phases exp rimentales obtenu permit au programme ArpWARP de construire automatiquement un mod le 171 acides amin s sur 207 ont pu tre automatiquement construits partir de la carte exp rimentale am lior e par aplatissement de solvant Figure 5 6 185 5 3 CO CRISTALLISATION DE LA TDTHAU
340. lexes GdDO3A et GdDTPA BMA mais il ne se fixe pas pour autant dans cette r gion sur HvMalDH L inverse est aussi observable il y a une r gion de la s quence primaire qui correspond un site de fixation du GdHPDO3A sur CaMalDH mais qui montre que sur PtMalDH et HvMalDH il ne s est pas fix Figure 7 9 Ainsi comparer les compositions en acides amin s respectives des r gions dans lesquelles un complexe s est fix pourra apporter de nombreuses informations quant au mode de fixation de ces complexes En comparant la structure de la prot ine HvMalDH native avec celle issue d un cristal d riv avec le GdDO3A on met en vidence que dans un cristal natif une mol cule de PEG occupe 100 le m me site qu un complexe GdDO3A dans un cristal d riv Or les cristaux d riv s de HvMalDH avec 229 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE le GdDO3A ayant t obtenus par trempage il n est pas exclu que ce complexe entre en comp tition avec la mol cule de PEG pour se fixer ce site Ceci pourrait d ailleurs expliquer le taux d occupation plus faible du complexe ce site 32 Figure 7 10 Aussi nous avons constat que l accessibilit de certains sites de fixation pouvait tre modifi e par l empilement cristallin dans le cadre d une exp rience de trempage HvMalDH tant homot tram rique le complexe GdDO3A devrait trouver le
341. lithium et avec ou sans 0 02 de d tergent J ai aussi fait varier le volume du puits 250 500 et 1000 uL le volume de la goutte 2 3 ou 4 5 pl avec adjonction ou non d un volume d eau et la solution stock concentr e en prot ine en pr sence de d tergent DDM ou CHM avec ou sans NaCl En diminuant le nombre de points de nucl ation dans des conditions ot la diffusion de vapeur fut ralentie des cristaux aux faces r guli res dont les ar tes avoisinaient 400 pm de longueur ont pu tre obtenus Pour cela la solution tait concentr e en EcAcrB 10 mg mL purifi e avec le d tergent CHM dans des gouttes o 1 pL d eau MilliQ a t ajout face un volume de puits de 500 pL et dans les condition d crites dans la figure 8 4 La pr sence de glyc rol permet au cristal de mieux r sister au protocole de cryo protection retenu 4 10 PEG 4000 5 glyc rol 100 mM HEPES pH 7 0 100 mM NaCl P 10 mg mL Goutte 1 0 pL P 1 0 pL R 1 pL eau T 293 K 20 C 3 5 jours a Cristaux natifs de b Cristal natif d EcAcrB c Conditions de cristallisation d EcAcrB 230 x 300 pm 410 x 380 pm Figure 8 4 Conditions de cristallisation conduisant aux cristaux d EcAcrB offrant la plus grande taille et la plus grande r gularit Puits de 500 pL Condition de purification et de stockage avec d tergent CHM A nouveau et malgr les diff rentes tentativ
342. llisation V luat de la chromatographie sur colonne Q Sepharose a t plac dans un tube centricon Millipore Amicon Ultra de seuil de coupure de 10000 Da et centrifug 4 C et 5000 tpm Cette tape permet aussi d changer le tampon pour le tampon de stockage final de la prot ine Un aliquot de cette solution a toujours t pr lev pour analyse sur gel de polyacrylamide 12 En fin de purification il m a t possible d obtenir 30 40 mg de EGFP purifi e pour 4 L de culture initiaux La figure 10 5 rend compte de la qualit de la puret de la prot ine Figure 10 5 Analyse de la puret de la solution finale concentr e en EGFP sur gel de polyacrylamide 12 302 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES 10 3 Forme soluble de la m talloprot ine membranaire CnrX du cp riplasme de la bact rie Cupriavidus metallidurans souche CH34 CmCH34Cnr Xs La prot ine CnrXs correspond 4 la partie cytoplasmique soluble de la m talloprot ine membranaire CnrX du p riplasme de la bact rie Cupriavidus metallidurans Elle est impliqu e dans la r gulation de l expression de l op ron cnrCBA qui code une pompe efflux de cations qui participe la r sistance de la bact rie au cobalt et au nickel La prot ine ancr e dans le p riplasme sous forme homodim rique agit en tant que capteur d ions m talliques dans le complexe qui initie la transduction du signal Pompidor 2008 Il s agit d u
343. llisation 213 RMN 314 SAD 36 Seuils d absorbtion 46 SIRAS 38 Supramol culaire 7 75 82 97 99 192 199 201 TdTHAU 118 124 127 142 148 151 183 192 306 TATHAU cristallisation 109 Table des mati res Introduction g n rale 20 I Du cristal biologique la structure de la macromol cule l int r t des com plexes de lanthanide en biocristallographie 25 1 Du cristal la structure de la macromol cule biologique 27 1 1 La diffraction par un cristal et le probl me des phases 27 1 2 Les diff rentes m thodes de phasage 29 1 2 1 Le remplacement mol culaire 29 1 2 2 Les m thodes directes m thodes de phasages ab initio 31 1 2 3 D termination de la sous structure par les m thodes de Patterson 31 1 2 3 1 La fonction de Patterson 32 1 2 3 2 La fonction de Patterson anomale 32 1 2 3 3 La fonction de Patterson isomorphe 33 1 2 3 4 Choix du protocole de d termination des positions des diffuseurs anomaux 33 1 2 3 5 La synth se de Fourier anomale 34 1 2 4 Un triste sire en ligne de mire son seuil franchi la triste H l ne de Troie devint folle description des m thodes de phasage de novo 34 1 2 4 1 Les m thodes de remplacement isomorphe SIR et MIR 34 1 2 4 2 Les m th
344. llisation celui tortur semble conserver la forme g n rale d un cristal natif je n ai jamais observ avec le Ln HMTDPA 3 de changement radical de forme cristalline comme cela a pu tre observ avec le Ln DPA 3 cf introduction 4 2 3 La thaumatine de Thaumatococcus daniellii TdTHAU La thaumatine est une prot ine globulaire soluble eucaryote qui est extraite du cytoplasme des cellules qui constituent les graines du fruit de l arbre Thaumatococcus daniellit Compos e de 207 acides amin s son poids mol culaire est de 22 2 kDa pour un point iso lectrique th orique de 8 5 et un coefficient d extinction molaire 280 nm 280nm 29420 M l cm J ai utilis la prot ine commercialis e par la soci t Sigma Aldrich r f rence T7638 sans puri fication ni dialyse suppl mentaires 4 2 3 1 Cristallisation de la prot ine native Tout comme le lysozyme il est possible d obtenir des cristaux de diff rents groupes d espace dans diff rentes conditions Charron et al 2004 Je n ai r ussi obtenir des cristaux que dans des conditions inspir es de celles d crites par Ko et al 1994 La nucl ation se produit toujours 4 partir d un l ger pr cipit Figure 4 10 0 3 0 9 M tartrate double de potassium et de sodium 100 mM bis tris propane pH 6 5 P 40 mg mL Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R T 293 K 20 C 2 7 jours Cryo protect
345. lucon og n se mais aussi au renouvellement du stock de protons disponibles pour la cellule sous forme de NADH agent r ducteur essentiel de nombreuses r actions enzymatiques Ying 2008 La s quence primaire des enzymes de cette famille poss de normalement une num rotation qui lui est propre Eventoff et al 1977 Je pr cise ici que dans ce chapitre je n utiliserai pas cette num rotation mais une num rotation lin aire 209 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE Au sein du groupe E L M A adaptation mol culaire des malate d shydrog nases est tudi e selon trois approches une approche biochimique qui permet d tudier en solution la stabilit et l activit des MalDH purifi es une approche phylog n tique rigoureuse qui conduit d terminer les distances g n tiques qui s parent les diff rentes MalDH de diff rents taxons au sein d arbres phylog n tiques Le calcul de ces arbres s appuie sur des m thodes heuristiques qui utilisent l information phylog nomique concat nation de g nes ARN ribosomiques et celle contenues dans les s quences codantes des MalDH une approche phylostructurale qui permet de replacer l tude des relations structure fonction de ces enzymes dans un contexte volutif En tenant compte des liens phylog n tiques qui lient les MalDH compar es on met en lumi re les changements stru
346. lysozyme de blanc d uf de poule 129 4 5 2 2 La corr lation entre la m thode d obtention de cristaux d riv s le faci s cristallin et le mode de fixation 139 4 5 2 3 Une fixation nantiosp cifique du Ln HMTDPA 3 gt 142 16 TABLE DES MATI RES 4 5 2 4 Le Ln HMTDPA la surface de la thaumatine de Thaumatococcus DONIC sos the tex BASS SR AR Basch ab Sas R Bohs BIS Ee Ra 143 46 Le Ln HMTDPA s un complexe modulable 2 2 6 6 0 eee ee 146 4 6 1 Cinq ligands dipicoliniques diff rents pour quatre complexes diff rents 146 4 6 1 1 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu HETDPA 3 148 4 6 1 2 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu HECTDPA 3 159 4 6 1 3 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu CTDPA 3 168 4 7 Le Ln HMTDPA s3 un complexe modulable la combinatoire 169 4 7 1 Pr parations des diff rentes combinatoires en fonction du but recherch 170 4 7 2 Pr sentation des diff rentes combinatoires et r sultats obtenus 171 4 7 2 1 Les combinatoires avec m lange de complexes Ln TDPA 3 entiers 171 4 7 2 2 La combinatoire 5 avec complexation de lion lanthanide avec deux li gands de la famille Ln TDPA 3 174 4 7 2 3 Les combinatoires avec m lange de complexes entiers appartenant la grande famille des complexes picoli
347. m thode consiste exprimer la prot ine d int r t en incorporant de la s l nom thionine ou plus r cemment de la selenocyst ine Sanchez et al 2002 Strub et al 2003 Walden 2010 au lieu des m thionines Doubli 1997 L atome de soufre de cet acide amin est donc remplac par un atome de s l nium qui pr sente un contribution anomale f de 6 10 e dans son seuil d absorption K selon d oxydation du s l nium Les avantages de cette m thode sont l occupation compl te des sites de s l nium et l acc s au seuil facilit sur les lignes de lumi re habituelles L inconv nient majeur de cette m thode est la mise en ceuvre relativement laborieuse Il faut exprimer la prot ine en milieu s l ni ce qui conduit souvent de faibles taux d expression La prot ine recombinante s l ni e cristallise souvent dans des conditions modifi es par rapport la prot ine native De plus certaines prot ines eucaryotes ne peuvent pas tre exprim es dans des syst mes bact riens et certaines prot ines ne contiennent pas d acide amin m thionine 1 7 2 Utilisation de la diffusion anomale des atomes intrins ques Il est possible d utiliser comme diffuseurs anomaux certains atomes naturellement pr sents dans les prot ines Les m thodes de phasage profitent alors de sites de fixation de diffuseurs anomaux fortement sinon totalement occup s et ne n cessitent pas de pr paration de d riv Plus de 20 de
348. matine de Thaumatococcus daniellii TdTHAU La thaumatine est une prot ine globulaire soluble eucaryote qui est extraite du cytoplasme des cellules qui constituent les graines du fruit de l arbre Thaumatococcus daniellii autrement appel Ka temfe Compos e de 207 acides amin s son poids mol culaire est de 22 2 kDa pour un point iso lectrique th orique de 8 5 et un coefficient d extinction molaire 280 nm 280 nm 29420 M cm Elle est uti lis e dans l alimentation et la pharmacologie en tant qu dulcorant exhausteur de go t ou att nuateur d amertume car il s agit d un dulcorant naturel ayant un pouvoir sucrant des plus lev s entre deux mille et trois mille fois plus sucr que le saccharose poids gal Il s agit en outre d une prot ine mod le pour la biocristallographie car les cristaux obtenus sont robustes et pr sentent un tr s beau profil de diffraction La premi re structure publi e sur la Protein Data Bank a t r solue par diffraction des rayons X en 1989 et 3 2 de r solution 307 Chapitre 11 Exploration d autres m thodes pour r v ler la fixation des complexes de lanthanide avant l tape de diffraction Nous avons vu que la luminescence des complexes de la famille des picolinates d europium ou de terbium permet de d tecter leur fixation dans les cristaux d riv s de prot ine Cette propri t permet de savoir si le complexe a une affinit pour la prot
349. mbranaire la pompe a efflux membranaire Acriflavine resistance protein B de Escherichia coli Cette tude s est malheureusement r v l e infructueuse Je profite de cette fin d introduction pour raconter une anecdote relative aux travaux pr sent s dans ces chapitres Au cours de ma premi re ann e de th se j ai parcouru les diff rents laboratoires de l institut la recherche de prot ines de type membranaire ou grand complexe multim rique afin de disposer de mod les potentiels pour l tude du mode de fixation de nos complexes de lanthanide Cela m a conduit a tablir diverses collaborations notamment celles avec le Dr Dominique Madern et le Dr Bruno Franzetti tous deux membres du Laboratoire de Biophysique Mol culaire l poque Les premiers r sultats obtenus avec la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus confi e par le Dr Madern et ceux obtenus avec la prot ase TET1 du Dr Franzetti s av r rent extr mement concluants Les change de bons proc d s continuant d aller bon train ils furent entre autre 4 Vorigine de la 197 fusion de nos deux quipes en 2010 La nouvelle quipe ainsi cr e se nomme Extremophiles and Large Molecular Assemblies group ou E L M A 198 Chapitre 6 L amino peptidase dod cam rique TET1 12s de Pyrococcus horikoshii La prot ine TET1 est une prot ase g ante auto compartiment e De part sa taille cette amino peptidase isol e sou
350. me le tris dipicolinate de lanthanide le complexe tris hydroxym thyltriazoledipicolinate de lanthanide est form de trois ligands identiques mais ind pendants La greffe possible par chimie clic d une fonction hydroxym thyltriazole a donn naissance l id e de greffer d autres fonctions chimiques pouvant am liorer et ou rendre sp cifique la fixation du complexe entier sur les prot ines sans pour au tant d t riorer sa luminescence Ainsi quatre groupements chimiques connus pour tre impliqu s dans les interactions de type liaison hydrog ne du monde biologique ont t ajout s ind pendamment au noyau triazole une fonction amine une fonction carboxylate une fonction hydroxy thyle et une fonc tion de type choline 2 hydroxyethyl trim thylammonium ici 2 hydroxyethyl dim thylammonium la liaison un groupement m thyle tant maintenant impliqu e dans la liaison au cycle triazole Le motif choline omnipr sent des cycles m taboliques est en effet bien connu pour tablir des liaisons fortes avec les prot ines Molina et al 2009 Nous avons ainsi dispos de cinq ligands diff rents Figure 4 34 La synth se de ces ligands revient toujours Arnaud Gautier et Lionel Nauton collaborateurs de l Universit Blaise Pascal de Clermont Ferrand au laboratoire SEESIB 4 6 1 Cinq ligands dipicoliniques diff rents pour quatre complexes diff rents Les ligands HETDPA CTDPA et EATDPA nous on
351. ment du rayonnement synchrotron il est devenu possible de mesurer la r sonance des raies blanches aux seuils d absorption L des m taux de transition et des lanthanides Lye et al 1980 et de travailler la longueur d onde correspondant au maximum du facteur f La m thode MAD est alors apparue comme une m thode de choix pour la d termination des phases Phillips and Hodgson 1980 Les bases alg briques de la d termination d une solution unique par la m thode MAD furent pos es ind pendamment par Hendrickson Hendrickson 1979 et Karle Karle 1980 Ces bases alg briques ont ensuite t utilis es pour la r solution des premi res structures par la m thode MAD Kahn et al 1985 1 2 4 3 Les m thodes combin es SIRAS et MIRAS Les m thodes SIRAS Single Isomorphous Replacement with Anomalous Scattering et MIRAS Multiple Isomorphous Replacement with Anomalous Scattering tiennent compte en plus des diff rences d intensit des pics de diffractions observ es entre un cristal d riv et le cristal natif utilis des diff rences anomales des donn es de diffraction du cristal d riv comme sources d information de phase suppl mentaire Ces m thodes n cessitent donc l enregistrement de donn es de diffraction issues d un cristal natif et celles issues d au moins un cristal d riv contenant un atome lourd pr sentant une contri bution anomale D une part ces m thodes permettent donc de travailler en deux t
352. mesur es ont t int gr es avec le programme XDS Kabsch 1993 Une fois tous les param tres initiaux impl ment s le profil des taches de diffraction est d duit des donn es exp rimen tales et ce avec d autant plus de pr cision que le d coupage angulaire de la rotation du cristal est fin C est pourquoi nous avons toujours travaill avec un pas angulaire de 0 5 Afin d obtenir une int gra tion optimale des donn es j ai syst matiquement appliqu cette m thode affinement des param tres cristallins et exp rimentaux puis d termination du profil des taches de diffraction 4 partir du jeu de 53 1 5 EVALUATION DU SIGNAL ANOMAL ET DE LA QUALIT DES DONN ES DE DIFFRACTION donn es entier avant d int grer nouveau les intensit s avec pour param tres de d part ceux affin s au tour pr c dent La table de bruit de fond est r alis e sur l ensemble du jeu de donn es lors de la premi re it ration En conservant les r sultats de chacune des it rations il est ais de suivre l volution du processus d int gration notamment via l interface graphique xds_ viewer de la suite logicielle ou l aide d un script ad quat Nous pr cisons ici que nous avons constat une am lioration consid rable des r sultats d int gration entre l utilisation de la version de d cembre 2009 du logiciel et celle de d cembre 2010 et ce pour un m me jeu de donn es et les m mes param tres initiaux util
353. minutes quelques heures et ils pr sentent une luminescence tr s intense une fois expos s aux UV proches Les formes cristallines de sel de tris dipicolinate de lanthanide diff rent selon la prot ine le type de sel ou l ion divalent pr sent dans la solution Seul les cristaux en pr sence de calcium et en hautes concentrations en NaCl sont toujours reproductibles La figure 3 17 montre quelques exemples de cristaux de sel de Eu DPA 3 caract ristiques observ s dans une goutte contenant de la prot ine Les cristaux de sel de Eu DPA 3 en pr sence de prot ine sont d ailleurs toujours diff rents de ceux qui apparaissent dans la m me condition mais d pourvue de prot ine ils apparaissent toujours sous une forme plus tortur e aux faces imparfaites qui laisse moins bien passer la lumi re Ceci prouve qu il y a une interaction en solution entre le complexe et les prot ines a Cristaux de sel de b Cristaux de sel de Eu DPA 3 en pr sence Eu DPA 3 en pr sence de prot ine et de Ca2 de prot ine et de gt NaCl 0 8 M c Cristaux de sel de d Cristaux de sel de Eu DPA 3 en pr sence Eu DPA 3 en pr sence de prot ine et de Mg2 de prot ine et de gt citrate de sodium 0 8 M e Cristaux de sel de Cristaux de sel de Eu DPA 3m en pr sence Eu DPA 3 en pr sence de prot ine et de gt 0 8 M de prot ine et de gt 0 8 M malonate de sodium 0 8 M malonate de sodium 0
354. mol culaires utilis s Deux types de marqueurs de poids mol culaires ont t utilis s raison d un d pot de 5 pL par gel Ils proviennent tous deux des laboratoires Fermentas et r pondent aux noms de PageRuler Prestained Protein Ladder r f rence SM0671 et PageRuler Unstained Protein Ladder r f rence SM0661 Le premier n a t utilis que lors de la purification de la prot ine membranaire AcrB le second pour tous les autres gels notamment ceux qui permirent de suivre la purification de la prot ine AvEGFP 294 Chapitre 10 Les prot ines mod les 10 1 L urate oxidase de Aspergillus flavus AfUOx L urate oxydase ou encore uricase issue du champignon Aspergillus flavus est une enzyme ap partenant la famille des oxydor ductases E C 1 7 3 3 qui catalyse l oxydation de l acide urique en 5 Hydroxyisourate Chez l homme ce produit peut alors tre son tour oxyd en allanto ne compos chimique utilis aussi bien en m decine qu en cosm tique notamment en tant que produit cicatri sant et r g n rant cellulaire Cette enzyme est active sous la forme d un homot tram re de 137 kDa 4x34 24 kDa compos de 1204 acides amin s 4x301 Son point iso lectrique th orique est de 7 18 et son coefficient d extinction molaire est de e28onm 53525 M cm7 Un aliquot de 200 pL de solution comprenant la prot ine concentr e 16 mg mL m a t confi p
355. n des cristaux d riv s Ne disposant que d une petite quantit de solution concentr e en prot ines seuls des essais par trempage ont pu tre r alis s avec la Ph TET1 12s J ai r alis des trempages de 2 5 minutes avec une solution comprenant 10 mM Ln HMTDPA 3 Les cristaux de PhTET112s n ont pas t d t rior s par cette m thode 4 2 9 Constats exp rimentaux concernant la pr paration de cristaux d riv s avec le Ln HMTDPA f Bien qu il fut toujours possible d obtenir des cristaux natifs de prot ine les essais de cristallisation n ont pas tous permis d obtenir des cristaux d riv s exploitables Les tentatives d obtention de cristaux d riv s avec les prot ines CaMalDH et AVEGFP ont montr que comme le tris dipicolinate de lantha nide dont il est issu le tris hydroxym thyltriazole dipicolinate de lanthanide est inutilisable en pr sence de Cd ou en pr sence de 2 methyl 2 4 pentanediol Utiliser le Ln HMTDPA 3 dans ces conditions provoque l apparition d un pr cipit cristallin opaque et fortement luminescent Suite l exp rience de co cristallisation automatis e r alis e avec l urate oxidase de Aspergillus flavus nous avons pu confir mer cette observation et l tendre aux conditions de cristallisation compos es de hautes concentrations salines d ions Meg ou d ions Ca D riv chimique du Ln DPA 3 on pouvait s attendre un tel r sultat mais la diff rence
356. n des lanthanides dans la maille le phasage proprement dit a alors t entrepris Les statistiques de phasage sont consign es dans les tableaux suivants Comme pour celles relatives l int gration des donn es de diffraction les d finitions des indicateurs statistiques utilis s pour juger la qualit du phasage sont donn es dans le second chapitre de la premi re partie du manuscrit Qt de prot ine to Ln HMTDPA 3 HEWL 1 HEWL 2 HEWL 3 Rapport t de complexe 7 3 10 8 16 2 M thode d obtention co cristallisation co cristallisation co cristallisation Type de donn es MAD SADrm MAD Plus haute r solution A 1 57 1 35 1 35 Picsra Picgoufre Pk 0o 60 85 23 51 6 50 45 51 38 13 4 93 Picsra Picsoufre rm o 48 10 16 93 4 76 73 42 19 72 4 32 52 64 51 31 4 74 FOMEEEN FOMCER 0 57 0 46 0 40 0 13 0 32 0 16 R solution FOM een 0 5 A 1 90 2 10 2 07 sharp T i h Meee S 531 380 THE 511 135 SIGMAA solomon 0 63 0 60 0 61 Arp Warp construit total 120 129 109 129 119 129 Tableau 4 5 Statistiques de phasage exp rimental pour trois jeux de donn es de diffraction issues de cristaux d riv s de HEWL par co cristallisation Ln HMTDPA 3 HEWL 4 HEWL 5 Rapport QE COMPARE a 10 8 40 M thode d obtention trempage trempage Type de donn es SAD E
357. n du Ln HMDPA s correspond au troisi me site de fixation du Ln DPA 3 o un des ligands du complexe Ln DPA s3 tablit aussi une liaison n z entre le cycle de l acide dipicolinique et le cycle benz nique du r sidu Trp62 Dans le cas du Ln DPA 3 le taux d occupation maximal constat pour ce site est de 62 Mais l interaction hydrophobe n se faisant cette fois avec le cycle triazole du complexe Ln HMTDPA 3 le centre du complexe Ln HMTDPA 3 est d cal de 5 0 par rapport celui du Ln DPA 3 135 45 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 3 5 Figure 4 25 Carte de densit lectronique 2F4 F contour e 1 0 o du complexe Ln HMTDPA 3l et surface lectrostatique autour du second site de fixation sur la pro t ine HEWL La surface a t calcul e l aide du programme APBS sur une chelle allant de 3 0 kT e charge n gative rouge 3 0 kT e charge positive bleu En trempage la population du site 2 est privil gi e J ai ainsi pu mod liser les deux ligands d crits ci dessus dans un cristal d riv pr par en pr sence de 2 7 MM ou 10 mM de complexe Aucune variation dans ses liaisons la prot ine n a t constat e Dans le cas du lysozyme on constate qu aucun des deux sites de fixation du complexe Ln HMTDPA 3 ne peut tre peupl 100 tant donn qu ils se partagent l interaction avec l acide amin Tr
358. n nanogoutte sont de plus en plus utilis s pour d terminer rapidement d ventuelles conditions de cristallisation Pour cette exp rience afin qu elle soit le reflet d une exp rience ordinaire de cristallisation nous avons choisi les six kits de cristallisation commerciaux Tableau 3 1 et le stockage des plaques de cristallisation temp rature ambiante 576 conditions de cristallisation par prot ine ont ainsi pu tre analys es 84 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION Plaque Nom des kits Hampton Noms des kits quivalent Qiagen 1 Crystal screen I amp II The Classics 2 Crystal screen lite amp PEG Ion M lange HTX pour plaque n 2 3 MembFac amp Natrix M lange HTX pour plaque n 3 4 Quick screen amp Grid screens sulfate formate malonate M lange HTX pour plaque n 4 5 Grid screens PEG 6K PEG LiCl MPD Screen Mme M lange HTX pour plaque n 5 6 Index screen The Classics IT Tableau 3 1 Kits commerciaux de cristallisation utilis s au robot HTX 3 1 3 Mat riel amp m thodes 3 1 3 1 Composition des chantillons Pour les prot ines EcAcrB AVEGFP CmCH34CnrXs et CaMalDH deux chantillons ont t ap port s au robot HTX l un ne contenant que la prot ine concentr e et l autre contenant la prot ine et le complexe Ln DPA 3 Dans le cas des prot ines AfUox et PhTET2 12s un troisi me chantillon faisant offic
359. n ne devrait donc quasiment plus retrouver de r seau de polygones de mol cules d eau sa surface Les premi res observations issues de la comparaison de ces deux structures montrent que seuls trois r seaux de polygones d eau se retrouvent la surface de SrMalDH Ces r seaux se retrouvent chez les deux enzymes dans des r gions tr s conserv es dans les deux sites catalytiques hydrophobes Figure 7 20 et 7 21 et dans la r gion de la leucine 241 l interface du monom re D et C Figure 7 22 Nous avons pris le parti de mentionner ce dernier exemple malgr le fait que certaines mol cules d eau constituant le r seau de pentagone n aient pas t construites dans le mod le SrMalDH Lorsqu on superpose les deux structures la forme g n rale du r seau apparait de fa on vidente Nous pensons que l absence de mol cule d eau est ici du un protocole d affinement utilis qui diff re du notre Dans la figure 7 21 ce sont les diff rentes conformations des boucles autour de la poche catalytique qui r duisent la taille de celle du monom re D chez SrMalDH chain aX HIS 175 chain A HIS 175 a R seau de polygones dans la poche du site actif surface b R seau de polygones dans la poche du site actif surface de Connolly beige de la chaine A de CaMalDH bordeau de Connolly beige de la chaine A de SrMalDH bleu Figure 7 20 R seau de polygones conserv dans le site actif de la chaine A de CaMalDH
360. n reproductible quelle que soit la prot ine dans 28 de ces m mes conditions Figure 3 16 E Conditions o le complexe cristallise quelle que soit la prot ine 71 mM et individuellement 25 mM Conditions o le complexe cristallise quelle que soit la prot ine 71 mM et individuellement 100 mM Conditions o le complexe cristallis avec au moins deux prot ines diff rentes 61 Conditions o le complexe n a cristallis qu une seule fois en pr sence de prot ine Absence de cristaux de sel de complexe Figure 3 16 Bilan statistique sur l auto cristallisation du complexe Eu DPA 3 suite des exp riences de co cristallisation men es avec 6 prot ines diff rentes La pr sence de prot ine dans la goutte semble favoriser la formation de cristaux de sel de Eu DPA 3 comme le montrent les exp riences contr les avec les prot ines AfUox et PhTET2 12s Figure 3 16 Alors que nous recherchions l effet supramol culaire du Eu DPA 3 nous avons parfois observ que sa pr sence dans la goutte provoquait l effet inverse un effet solubilisant En effet alors que des cristaux de prot ine apparaissaient dans la goutte de cristallisation sans complexe ils n apparaissaient pas dans la goutte quivalente avec le complexe Le complexe tant charg trois fois n gativement il est possible qu il puisse aussi provoquer le contraire de l effet escompt augmenter la solubilit de la pr
361. n sels Il faudra l introduire par co cristallisation en l utilisant plus de 50 mM car sa fixation ne semble pas suffisante si on lutilise une concentration plus basse gt recommander le complexe LaDTPA BMA en guise d alternative au Ln DPA s3 Son mode de fixation semble privil gier les liaisons hydrog nes avec les acides amin s lysine arginine glutamine et thr onine et contrairement au Ln DPA s3 reste stable en pr sence de sels d ions divalents ou de fortes concentrations en sels Le LnDTPA BMA pr sente aussi l avantage d tre utilisable en trempage Mais quelle que soit la m thode d obtention de cristaux d riv s il faut l utiliser une concentration d au moins 80 mM Enfin si aucun choix pr alable ne peut tre fait il est toujours possible de les utiliser conjointe ment Au cours de mon travail de th se je n ai pas constat quoi que ce soit qui puisse contre indiquer une telle m thode Les complexes ne semblent pas interagir entre eux et le seul risque auquel on s expose est d avoir une comp tition entre deux complexes si ceux ci partagent le m me site de fixation Mais cela n emp chera pas le phasage ult rieur si les complexes se fixent Les diff rentes tudes men es permettent de d finir les axes d analyse n cessaires la compr hension fine des modes d interaction Ainsi la fixation des complexes de lanthanide d pendra de La s quence en acides amin s de la prot ine en
362. nases et leur paralogues malate d shydrog nases extr mophiles fait partie int grante Ces enzymes sont ubiquitaires et sont donc pr sentes dans le cytoplasme d organismes cellulaires dont certains ont la capacit de se d velopper dans ces environnements dits extr mes d o le terme extr mophile donn ces organismes Pour s adapter de telles conditions la composition du cytoplasme des cellules de tels organismes doit s hom ostaser avec le milieu ext rieur Ainsi dans le cas d organismes vivants dans des milieux hautes concentrations en sels par exemple adaptation halophile le cytoplasme cellulaire contient lui aussi une concentration en un sel g n ralement du KCl sup rieure au molaire Ginzburg and Sachs 1970 Ainsi c est en voulant comprendre comment des partenaires prot iques impliqu s dans des m canismes cellulaires ubiquitaires essentiels restent actifs dans de telles conditions de stress que l quipe s est int ress e la famille des enzymes malate d shydrog nases En effet dans le cas des organismes eucaryotes cette famille d oxidoreductases classification enzy matique E C 1 1 1 37 est impliqu e dans la derni re tape du cycle de Krebs o ces enzymes catalysent l oxydation r versible du L Malate en oxaloac tate via l utilisation du co facteur NAD Ying 2008 En oxydant le L Malate issu de la mitochondrie ces enzymes participent non seulement l indispensable g
363. nates 176 4 7 2 4 La combinatoire 8 avec m lange de deux complexes dissemblables le Eu HMTDPA et le GdHPDOBA ua oe A er 177 4 8 Conclusions quant l utilisation des complexes de la famille des Ln TDPA 3 180 5 Un tris dipicolinate cag le LnTNTPA 181 5 1 Description du complexe de lanthanide LnTNTPA 181 5 2 Co cristallisation du HEWL avec le complexe TbTNTPA pas de fixation du TobTNTPA 183 5 3 Co cristallisation de la TATHAU avec le TbTNTPA fixation du TbTNTPA 184 5 3 1 Obtention de cristaux d riv s de TATHAU avec le TETNTPA 184 5 3 2 Int gration des donn es de diffraction issues d un cristal de TdTHAU obtenu par co cristallisation avec le TETNTPA 185 5 3 3 Phasage exp rimental de la TATHAU avec le TRTNTPA 185 5 3 4 Affinement du mod le et description du mode de fixation du TbTNTPA la surface de la TATHAU 2 187 5 3 4 1 Description du site de fixation 1 taux d occupation 20 188 5 3 4 2 Description du site de fixation 2 taux d occupation 15 190 5 3 4 3 Le complexe TbTNTPA dans l empilement cristallin d un cristal d riv Ge TAPANT Se SE A Get ee SAR ES AR sean er 191 5 4 R sultats obtenus avec la CaMalDH 191 Bp CONCIUSION LS LAS be ees amp ip A LT Baa Re nd oh MP ne ot CE Se MORT 191 III Les complexe
364. nditions dans lesquelles la pr sence de complexe provoque la solubilisation de la prot ine disparition du pr cipit prot ique ou dissolution des cristaux natifs d faut du robot Dans le cas des prot ines AfUox et PhTET2 12s la troisi me goutte contenant uniquement le complexe a permis d ajouter des pr cisions concernant la quatri me cat gorie pr cit e l apparition de cristaux de sel de Eu DPA 3 gt conditions dans lesquelles le complexe ne cristallise qu en pr sence de prot ine gt conditions dans lesquelles le complexe ne cristallise qu en absence de prot ine gt conditions dans lesquelles le complexe cristallise qu il soit en pr sence de prot ine ou non 88 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION Enfin le fait de d poser une troisi me goutte contenant uniquement le complexe et ce deux concen trations diff rentes 25 mM et 100 mM nous a permis de mesurer l influence de sa concentration sur sa cristallisation en absence de prot ine 3 2 Les observations issues de l exp rience de co cristallisation auto matis e avec le Eu DPA Nous rapportons dans cette partie l ensemble des observations recueillies lors des l exp riences de co cristallisation automatis e men es avec chacune des prot ines Afin de ne pas alourdir le manuscrit je ne donne qu un exemple illustrant la fa on dont j ai proc d pour noter l ensemble des
365. ne 2 6 dicarboxylate Celle du tris hydroxym thyltriazole dipicolinate est non seulement due cette m me fonction mais le noyau triazole participe aussi la d localisation des lectrons La fluorescence dans le visible des complexes Ln HMTDPA 3 est alors bien plus importante que celle du Ln DPA 3 nous l estimons six sept fois sup rieure au regard de la fluorescence mise par des solutions de Tb HMTDPA s et Tb DPA 3f pr par es concentrations quivalentes 104 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Intensit ua Energie cm a Diagramme d nergie des tats des lec trons 4f des complexes Eu HMTDPA 3 et TH HMTDPA 3 0 025 0 020 PhOMe Eu Qars exc 399 8 nm Aem 616 5 nm 0 010 T 0 83 ms T 300K 0 005 Temps ms Aexe 399 8 nm T 300K I u a SD gt F 580 620 660 700 nm I u a 500 55 00 650 0 6 nm b Profil de fluorescence dans le visible des com plexes Eu HMTDPA 3 et Tb HMTDPA 3 PhNO 0 85 ms Ph 0 87 ms N3 azide 1 11 ms c Profil des d clins de fluorescence Figure 4 5 Mesure de l mission dans le visible des complexes de terbium et d europium Avec exe la longueur d onde excitatrice Aem la longueur d onde d mission 7 le temps de demi vie et T la temp rature d absorption vers le domaine du visible La figure 4 6 montre qu
366. ne prot ine de 33 2 kDa 2x16 6 kDa dont le point iso lectrique th orique est de 7 04 et le coefficient d extinction molaire 280 nm E2g0nm est de 15470 M em 10 4 L Acriflavine resistance protein B EcAcrB EcAcrB est une prot ine homotrim rique ancr e dans la membrane interne cytoplasmique de la bact rie 4 Gram n gatif Escherichia Coli L analyse de sa s quence primaire r v le un poids mol culaire de 341 kDa 3147 acides amin s 1049 par monom re un point iso lectrique th orique de 5 39 et un coefficient d extinction molaire mesur est de 93000 M cm Dans cette annexe sont consign s les protocoles mis au point pour obtenir de multiples cristaux de prot ine EcAcrB parfaitement r guliers pouvant avoisiner les 500 ym de longueur d ar te Toutes les tapes qui vont suivre sont initialement inspir es du protocole de purification tabli par Klaas M Pos Pos and Diederichs 2002 Le protocole a t am lior par C line Julian Binard et le Dr Deniaud puis ensuite par moi m me 10 4 1 Production d EcAcrB dans E coli J ai utilis la bact rie E coli souche CD43 pr lev e partir de solution stock glyc rol 50 et transform e avec le vecteur d expression modifi de Klaas M Pos le plasmide pET24 Ce plasmide porte trois cassettes une cassette qui code la prot ine EcAcrB avec 4 histidines en plus a l extremit C terminale une cassette conf rant la r sistance l a
367. nfin une liaison hydrog ne s tablit entre l autre groupement carboxylate et la fonction C5H2 de l acide amin Asn103 de la mol cule de r f rence Figure 4 23 Mode de fixation du 1 ligand du complexe Ln HMTDPA la surface du HEWL dans le second site Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en orange Site 2 description de l interaction du second ligand avec la prot ine Le second ligand se lie la prot ine en cr ant un empilement r entre son noyau triazole et le cycle benz nique du noyau indole du Trp62 distance de 3 4 Figure 4 24 Deux liaisons hydrog nes suppl mentaires viennent le stabiliser La premi re se cr e entre un groupement carboxylate du ligand et le groupement NH du r sidu Trp63 de la mol cule de r f rence L autre liaison hydrog ne s tablit entre l autre groupement carboxylate du ligand et l azote N H de l Arg125 de la mol cule sym trique 134 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE ARG 125 Figure 4 24 Mode de fixation du 2 ligand du complexe Ln HMTDPA 3 la surface du HEWL dans le second site Cristal d riv par co cristallisation La mol cule de r f rence est repr sent e en vert la mol cule sym trique en orange Comparer notre structure celle de HEWL r solue avec le Ln DPA indique que ce second site de fixatio
368. ngueur d onde soit choisie de mani re obtenir la valeur de f la plus lev e possible si on veut d terminer les phases d un grand nombre d acides amin s prot ine de grande taille 1 5 2 L importance de la r solution des donn es D apr s la loi de Bragg la r solution se d finit en fonction de l angle maximal de diffraction dr so ra 281NO max En pratique la r solution correspond la plus petite distance entre les plans r ticulaires du cristal pour laquelle des taches de diffraction peuvent tre enregistr es Cependant la formule d crite ci dessus correspond une d finition dans l espace r ciproque et non dans l espace direct La r solution r qui valente dr so dans l espace direct qui correspond au plus petit d tail visible dans la carte de densit lectronique vaut r 0 715d 650 Blundell and Johnson 1976 Etant donn es les diff rentes contributions au facteur de diffusion atomique f f f f seule le facteur de diffusion atomique de la prot ine native f d cro t fortement avec l angle de diffraction Selon le rapport de Bijvoet que nous avons d j d fini le signal anomal devrait alors tre relativement plus lev plus haute r solution Cet effet est cependant limit par l agitation thermique de l ensemble 49 1 5 EVALUATION DU SIGNAL ANOMAL ET DE LA QUALIT DES DONN ES DE DIFFRACTION des atomes et en particulier des diffu
369. nide le Ln HMTDPA 3 est inutilisable en pr sence de MPD 112 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 4 2 5 L urate oxydase de Aspergillus flavus AfUox Tout comme le fut la prot ine AVEGFP nous r utilisons la prot ine AfUox pour cette tude L urate oxydase est une enzyme homot tram rique de 137 kDa 4x34 24 kDa compos e de 1204 acides amin s 4x301 Son point iso lectrique th orique est de 7 18 et son coefficient d extinction molaire est de 280nm 53525 M l cm f Un aliquot de 400 uL de solution comprenant la prot ine concentr e 11 3 mg mL un inhibiteur 8 azaxanthine 0 28 mg mL ainsi qu une plaque contenant d j des cristaux obtenus en pr sence de l inhibiteur et selon la m thode batch cf introduction m ont t tr s g n reusement confi s par le Dr Nathalie Colloc h de l quipe CERVOxy du laboratoire Imagerie et Strat gie Th rapeutiques des pathologies C r brales et Tumorales Caen et par le Pr Thierry Prang du Laboratoire de Cristallo graphie et RMN Biologiques de l Universit Paris V Ren Descartes Paris 4 2 5 1 Cristallisation de la prot ine native Les conditions de cristallisation utilis es sont inspir es de celles d crites par Vivar s et Bonnet Bonnete et al 2001 Figure 4 14 5 15 PEG 8000 100 mM Tris HCl pH 8 5 P 11 3 mgmL Goutte 5 pL P 5 uL R T 293 K 20 C
370. nn es de diffraction issu du cristal d riv avec le complexe GdHPDO3A d crit en 7 1 3 2 page 217 et celui issu d un cristal natif enregistr au seuil d absorption K du s l nium Il existe d j dans la Protein Data Bank une structure de CaMalDH 241 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO 2 20 de r solution code PDB 1GUY mais le mod le ne comprend ni la boucle catalytique ni les parties N terminales et C terminales Dalhus et al 2002 CaMalDH Situation Institut de Biologie Structurale ESRF Source de rayons X G n rateur de laboratoire FIP BM30A M thode SIRAS Donn es Jeu anomal jeu natif x 1 541 Cure 0 979 Sex Groupe d espace P3121 Param tres de maille a 106 775 c 103 526 a 106 230 c 102 570 Contenu unit asym trique dim re A D R solution 19 63 1 90 2 00 1 90 19 70 1 70 1 79 1 70 Nombre de r flexions uniques 54120 7772 68673 10178 Rmerge 5 0 23 7 8 4 35 6 Rpim 1 9 8 5 4 4 20 3 Sigano XDS 1 29 0 85 Rano 3 6 9 6 zT 12 4 3 3 6 3 2 2 Compl tude 98 8 99 1 93 7 95 8 Redondance 10 6 9 8 4 2 3 9 Tableau 7 22 Statistiques d int gration des jeux de donn es utilis s pour le phasage de CaMalDH par la m thode SIRAS colonne de gauche un cristal d riv de CaMalDH avec le complexe GAHPDO3A colonne de droite
371. ns de type CH r et empliement r avec le noyau indole des acides amin s tryptophane de la surface prot ique Ce groupement qui rend donc les complexes Ln TDPA 3 plus affins que le complexe Ln DPA 3 ne les emp che pas d tablir aussi des liaisons hydrog nes avec les acides amin s arginine et lysine mode de fixation pr f r du complexe Ln DPA 3 Leur luminescence dans le visible lorsqu excit sous UV proches permet de le d tecter ais ment dans les cristaux d riv s de prot ines et ce m me si le complexe est utilis 4 basse concentration Chacun des complexes qui compose la famille des Ln TDPA s est un d riv du Ln HMTDPA s et ne diff re que par le groupement chimique ajout au noyau triazole La possibilit de greffer par chimie clic un noyau triazole portant une fonction particuli re a permis de cr er diff rents ligands picolinates Cette panoplie de ligands permet son tour de composer diff rents complexes de lanthanide form s soit de trois ligands identiques soit de ligands diff rents Cela conf re 4 chacun de ces complexes uniques des propri t s cristallographiques diff rentes qui offrent donc la possibilit de choisir le complexe selon la composition en acides amin s de la prot ine cibl e L tude des complexes uniques et des complexes hybrides de la famille des Ln TDPA 3 a aussi r v l contre toute attente qu il n y a pas change de ligands dipicolinates en solution autou
372. nt l interface entre deux mol cules de prot ine dans le cristal Le nouveau complexe Ln HMTDPA 3 conserve donc l aspect supramol culaire du Ln DPA 3 mais sans engendrer un empilement cristallin diff rent de celui d un cristal natif Le complexe Ln HMTDPA 3 diff re du complexe Ln DPA 3 non seulement par le nombre de site de fixation la surface du HEWL le Ln DPA 3 se fixe au lysozyme dans quatre sites distincts mais aussi par son mode de fixation prin cipal En effet la fixation du Ln HMTDPA 3 la prot ine se fait essentiellement par des liaisons hydrophobes entre les cycles triazoles des ligands hydroxymethyltriazoledipicolinates et les cycles ben z niques des noyaux indoles des acides amin s tryptophane Il s agit de liaisons dites empilement r ou r r et CH x Pour renforcer les interactions hydrophobes on retrouve les liaisons hydrog nes entre les groupements carboxylates des ligands et des donneurs de protons de la prot ine en particulier les groupements amines liaisons qui constituent le mode de fixation principal du Ln DPA 3 Pompidor et al 2008 Le mode de fixation du Ln HMTDPA diff re donc de celui du complexe Ln DPA 3 129 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 5 Site 1 taux d occupation maximum constat 70 Le premier site de fixation se situe l interface entre deux mol cules de lysozyme dans l empilement c
373. nt de celui des cristaux natifs Pompidor et al 2008 ceux d riv s avec le tris hydroxymethyltriazoledipicolinate de lanthanide ont le m me groupe d espace que les cristaux natifs P 432 2 4 3 1 2 Int gration des donn es enregistr es sur des cristaux d riv s de thaumatine de Thaumatococcus daniellii Deux jeux de donn es de diffraction ont pu tre enregistr s partir de cristaux d riv s de TdTHAU avec le complexe tris hydroxymethyltriazoledipicolinates d europium qui a permis le calcul de phases par la m thode de phasage MAD 119 44 D TERMINATION DES PHASES EXP RIMENTALES TdTHAU Eu Complexe mM 10 Prot ine mM 0 6 Rapport SE to 16 67 M thode d obtention co cristallisation Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD Oui 1 776 Eur 0 979 Sex Groupe d espace P 4121 2 P 41212 Param tres de maille A a 57 914 c 149 972 a 57 988 c 150 184 1 mol cule 45 84 1 93 2 04 1 93 45 90 1 30 1 37 1 30 Contenu unit asym trique R solution A Nombre de r flexions uniques 9024 1250 64239 9169 Rmerge 3 3 5 2 4 9 45 4 Rpim 1 4 2 3 3 1 29 2 Sigano XDS 3 0 1 95 0 90 0 79 Rano 3 6 4 6 2 6 21 2 am 16 6 13 2 12 5 1 7 Compl tude 99 9 99 7 99 9 99 4 Redondance 11 5 11 0 6 6 6 5 Tableau 4 4 Statistiqu
374. nt sur le signal anomal du lanthanide intro duit dans les cristaux d riv s gr ce au complexe L DPA 3 le lysozyme de blanc d ceuf de poule HEWL le lysozyme de blanc d ceuf de dinde la thaumatine de Thaumatococcus daniellii l urate oxidase d Aspergillus flavus la xylanase de Trichoderma reesei et l ubiquitine de coeur de b uf Le mode de fixation du complexe Ln DPA s3 a pu tre d termin de fa on pr cise Il se fixe aux arginines et aux lysines pr sentes dans la prot ine via des liaisons hydrog nes entre les groupements carboxylate des ligands dipicolinate et les groupements amine des acides amin s pr cit s Figure 2 6 A la surface du HEWL le complexe se fixe aussi en tablissant une interaction hydrophobe de type empilement r avec un acide amin tryptophane En co cristallisation les cristaux d riv s apparaissent g n ralement dans un pr cipit assez dense Figure 2 6 Mode de fixation principal du complexe Ln DPA s3 observ la surface du HEWL Dans trois cas le complexe Ln DPA 3 a induit un effet supramol culaire qui conduit un empi lement cristallin diff rent de celui observ pour la prot ine native Dans les conditions de cristallisation conduisant habituellement aux cristaux natifs et dans le cas des prot ines 1 lysozyme de blanc d ceuf de poule les cristaux d riv s obtenus sont de sym trie cristalline C2 au lieu de P432 2 2 xylanase de Trichoderm
375. ntales Nous avons ensuite compl t et affin ce mod le afin d tudier le mode de fixation du complexe Ln HMTDPA 3 sur la prot ine Contrairement aux complexes de gadolinium avec les malate d shydrog nases je n ai jamais t confront des difficult s concernant la mod lisation et l affinement du tris hydroxymethyltriazole dipicolinate de lanthanide lorsqu il a permis le phasage ex p rimental auparavant En effet lorsqu il y a eu r ussite du phasage les taux d occupation des sites de complexe ont toujours permis d obtenir une carte de densit lectronique d finie pour que je puisse mo d liser les ligands des complexes En outre la qualit des cartes de densit lectronique et les valeurs de taux d occupation du complexe obtenues lors des premiers affinements m ont incit pr parer des d ri v s avec diff rentes concentrations de complexe selon les deux m thodes d insertion la co cristallisation ou le trempage Cela m a permis d estimer l influence de ces diff rents param tres sur l ensemble du processus de determination de structure Dans cette partie sont d crits les sites de fixation du complexe Ln HMTDPA 3 4 5 1 Statistiques des affinements des structures issues de cristaux d riv s Les valeurs des diff rents indicateurs statistiques indiqu es dans cette partie sont relatives aux af finements r alis s avec le programme Phenix et proviennent des analyses men es par le prog
376. nthanide venant la masquer La charge globale du complexe de lanthanide est neutre De formule chimique C54H102N508 le ligand DTTA BPA a une masse mol culaire de 948 42 g mol7 yeh Pa as a Le complexe de lanthanide b Le complexe de lanthanide LnDTTA BPA Figure 8 2 Le complexe de lanthanide LnDTTA BPA pour le phasage des prot ines mem branaires Malheureusement c est tout ce que je puis dire propos de ce complexe Mes toutes premi res tentatives pour solubiliser le complexe se sont r v l es infructueuses et les premiers clich s de diffraction issus des cristaux natifs d EcAcrB enregistr s au m me moments n ont gu re t encourageants Lors de premiers essais de solubilisation dans l eau MilliQ je n ai pu valuer qu une concentration de seulement 3 pM environ avec le complexe EuDTTA BPA 100 pg de complexe dans 30 mL d eau MilliQ et n ai pas pu mesurer de concentration suite une tentative de dilution dans une solution de d tergent DDM tant la solution tait trouble Je n ai cependant pas essay de diluer le complexe dans le DMSO par exemple solvant organique polaire couramment utilis en biochimie des prot ines 273 8 2 PRODUCTION PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE ECACRB 8 2 Production purification et cristallisation de EcAcrB 8 2 1 Production amp purification de EcAcrB En annexe sont consign s les protocoles de production et de purification permettant d ob
377. ntibiotique kanamycine et un op ron en 5 des deux autres qui le rend fortement inductible l IPTG Cette construction plasmidique permet donc de produire abondamment une prot ine EcAcrBy avec une tiquette d histidines qui permettra de la retenir par chromatographie d affinit au nickel et de restreindre les cultures de bact ries celles qui n expriment que cette construction celles pouvant se multiplier en pr sence de kanamycine La production de culots de bact ries exprimant la prot ine EcAcrBy commence par une pr culture de 100 mL en milieu TB Terrific Broth pour 1 L de milieu 47 6 g de TB en poudre 8 mL de glyc rol 100 eau MilliQ q s p et autoclavage avec 50 pg mL de kanamycine La pr culture est mise en incubateur sur la nuit 37 C 200 t p m On mesure la densit optique DO de la pr culture la longueur d onde 600 nm l aide d un spectrophotom tre et 3 L de cultures sont pr par s avec 50 pg mL7 de kanamycine Un volume de pr culture est ajout dans chaque erlen de culture volume calcul pour avoir une DO 0 1 au d part de la culture L ensemble est mis en incubation 37 C 200 t p m Apr s 3h15 d incubation environ la mesure de la DO indique une valeur d environ 0 78 Les 3 L de culture sont alors plac s en chambre 303 10 4 L ACRIFLAVINE RESISTANCE PROTEIN B ECACRB froide 4 C et l induction est r alis e avec 0 5 M d IP
378. o Fluidizer Dans le cas o un sonicateur a t utilis l chantillon toujours la glace j ai toujours utilis le programme suivant deux fois une session de pulses de 2 min 60 W pour 10 min de repos 299 10 2 L ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN DE AEQUOREA VICTORIA AVEGFP L chantillon a ensuite t centrifug a 4 C 48400 tpm pendant 45 minutes et le surnageant r sultant r cup r sans filtration le culot ne se d collant pas du tube Aussi un aliquot de ce surnageant a t pr lev pour un futur d p t sur gel de polyacrylamide 12 10 2 2 5 Chromatographie sur colonne d affinit au nickel Afin de d isoler la prot ine EGFP gr ce son tiquette histidine une colonne avec 10 mL de r sine au nickel Ni NTA Superflow de marque Qiagen t utilis e Toute les tapes se font en chambre froide 4 C sur un appareil KTA d livrant un flux de 2 mL min La colonne est d abord quilibr e avec 50 mL cinq fois le volume de la colonne de tampon A HisTrap Le surnageant est alors pass sur la r sine et le passe tout droit repass encore une fois En second lieu la colonne est lav e avec cette fois 100 mL de tampon A HisTrap Le gradient d imidazole de 0 4 250 mM tampon B HisTrap est ensuite pass sur la colonne selon un flux de 2 mL min tout en luant la prot ine dans des fractions de 2 mL Comme le montre la figure 10 4 l lution de la prot ine se
379. observations figure 3 2 89 3 2 LES OBSERVATIONS ISSUES DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATIS E AVEC LE EU DPA 3l stallisation de la prot ine EcAcrB avec le complexe Eu DPA 3 2 1 Co cri CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION Les premi res observations issues de l exp rience de co cristallisation men e avec la prot ine AcrB confirment celles de Guillaume Pompidor quel que soit le type de sel d s que sa concentration d passe 0 8 M on observe une auto cristallisation du tris dipicolinate d europium dans la goutte La plaque de cristallisation 4 qui contient les liqueurs m res 4 base de hautes concentrations en sels provoque l apparition de cristaux de sel de Eu DPA 3 dans plus de 38 des gouttes Figure 3 3 Sur ensemble des plaques de cristallisation le complexe cristallise dans 19 des conditions de cristallisation Nous n avons pas constat de goutte o des cristaux d riv s taient apparus En outre si on ne se concentre que sur les observations relatives l influence du tris dipicolinate d eu ropium sur la cristallisation en goutte suspendue on met en vidence le fait que son auto cristallisation est sa manifestation la plus fr quente Figure 3 4 Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs 62 Cristaux de sel de Eu DPA E Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr
380. odes exploitant la diffusion anomale SAD et MAD 36 1 2 4 3 Les m thodes combin es SIRAS et MIRAS 38 1 2 4 4 Protocole retenu pour la d termination des phases par les m thodes SAD et MAD 6 Se te Mas Prat nf ne Ps mt RARES 2 a e eek es 38 1 2 4 5 Evaluation de la qualit des phases exp rimentales dans SHARP 40 1 2 4 6 Evaluation de la qualit des phases exp rimentales am lior es par SO LOMON Vans anne pa ee ghee han oe ah gap 2e mit note 41 1 3 La diffusion anomale es 3 34 lid RL opie niet 96 Ee me gl a ete eae EN 41 1 3 1 Pr sentation du ph nom ne 41 1 3 2 Tes raies blanches nso hh 4454 ch ots ee EUR ARE Ed ec EM Lena DO Ee 45 1 4 La brisure de la loi de Friedel 47 1 5 Evaluation du signal anomal et de la qualit des donn es de diffraction 49 1 5 1 L importance du taux d occupation du diffuseur anomal choisi 49 1 5 2 L importance de la r solution des donn es 49 1 5 3 L importance du rapport signal sur bruit 50 13 TABLE DES MATI RES 1 6 1 7 1 5 4 L importance de la redondance des donn es 50 1 55 La compl tude enric en sen manger ge a an gl de dde ni nt es 50 1 5 6 Les facteurs r siduels 50 TOO IN ABS facteur Rmergen A depts Lise RG edd oO ek gt Msn 51 1 5 6 2 Le fac
381. oduction d atomes lourds par trempage et co cristallisation 60 1 7 5 Protocole d obtention de cristaux d riv s par trempage et par co cristallisation avec les complexes de lanthanide 61 1 8 Utilisation des lanthanides en tant que diffuseurs anomaux 65 1 8 1 Les lanthanides des diffuseurs anomaux sous utilis s lorsqu il s agit de la pr pa ration de cristaux d riv s 65 1 8 2 La luminescence des lanthanides 66 2 Utilisation des complexes de lanthanide en bio cristallographie 67 2 1 Les complexes de lanthanide issus de l imagerie m dicale 67 2 1 1 Pr sentation des complexes IRM 67 2 1 2 Etat de nos connaissances sur le mode de fixation des complexes de lanthanide IRM 69 2 1 2 1 Le complexe LnHPDO3A pour des interactions hydrophobes 69 2 1 2 2 Le complexe LnDO3A pour les interactions ioniques 70 2 1 2 3 Les autres complexes IRM 71 2 1 3 La d tection de la fixation des complexes IRM avant l exp rience de diffraction 72 2 2 Un complexe de lanthanide luminescent le tris dipicolinate d europium 73 2 2 1 Pr sentation goyo dAn Iaa pee dre 2 REO tu Roe ee ew dla MAD 73 14 TABLE DES MATI RES 2 3 2 2 2 La d tection de la fixation du complexe Eu DPA 3 avant l
382. oduction de la prot ine 299 10 22 24 Lysescellulaire sicir an a eds a a tes BE e E LE de HUE Re 299 10 2 2 5 Chromatographie sur colonne d affinit au nickel 300 10 2 2 6 Colonne de d salinisation 301 10 2 2 7 Clivage de l tiquette histidine 301 10 2 2 8 Chromatographie sur colonne changeuse de cations 301 10 2 2 9 Concentration de la prot ine EGFP purifi e 302 19 INTRODUCTION GENERALE 10 3 Forme soluble de la m talloprot ine membranaire CnrX du cp riplasme de la bact rie Cupriavidus metallidurans souche CH34 CmCH34CnrXs 10 4 L Acriflavine resistance protein B EcAcrB 10 4 1 Production d EcAcrB dans E coli 10 4 2 Purification d EcAcrB secedere Bee a sua Mia die A Re NU nt a 10 4 2 1 Pr paration et dosage des fractions membranaires de E coli 10 4 2 2 Solubilisation des fractions de membranes cytoplasmiques 10 4 2 3 Purification de la prot ine sur colonne d affinit en r sine de nickel 10 5 Le lysozyme de blanc d uf de poule HEWL 10 6 La thaumatine de Thaumatococcus daniellii TATHAU 11 Exploration d autres m thodes pour r v ler la fixation des complexes de lanthanide avant l tape de diffraction 11 1
383. om ne ne s est pas produit avec le TEWL qui pourtant cristallise dans les m mes conditions que le HEWL et ne diff re de ce dernier que par la pr sence de sept substitutions Afin de comprendre pourquoi dans le premier cas il y a eu effet supramol culaire et pas dans l autre nous avons entrepris cette nouvelle tude comparative Les premi res observations montrent que ce n est pas l acide amin impliqu dans la liaison avec le Ln DPA 3 qui est substitu mais celui avoisinant Mener terme cette tude comparative pourra peut tre apporter des claircissements quant l effet supramol culaire du tris dipicolinate de lanthanide 100 Chapitre 4 La famille des tris triazoledipicolinates de lanthanide Dans ce chapitre sont pr sent s le d veloppement et l tude de nouveaux complexes d riv s du com plexe luminescent tris dipicolinate de lanthanide qui a fait l objet du chapitre pr c dent Ces nouveaux complexes constituent la nouvelle famille des tris triazoledipicolinates qui appartient donc la grande famille des complexes picolinates de lanthanide 4 1 Pr sentation du complexe luminescent Ln HMTDPA Le tris hydroxym thyltriazoledipicolinate de lanthanide est un complexe form d un cation lan thanide ch lat par trois anions 4 4 hydroxymethyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylate aussi nomm 4 4 hydroxymethyl 1H V triazole dipicolinate ou plus simplement
384. om ne se produit lorsque l nergie du rayonnement incident correspond l nergie de transition de V lectron vers un tat li du continuum La pr sence de raies blanches pour des transitions depuis les couches K L et M est attribu e l existence d un grand nombre d tats accessibles dans le continuum Brown et al 1977 Comme le ph nom ne de raie blanche fait intervenir les orbitales mol culaires Vallure des spectres d absorption est fortement influenc e par l environnement mol culaire de l atome consid r Dans le cas du seuil d absorption Lyrr des atomes de lanthanide ce sont les lectrons de la couche L qui sont excit s Leur raie blanche est particuli rement marqu e comme le montre le pic que pr sente leur spectre d absorption tel que celui de la figure 1 4 L apparition des raies blanches aux seuils L semble li e la pr sence d tats inoccup s dans la bande de valence d Pour les atomes de lanthanide la bande de valence 5d tant totalement inoccup e l amplitude de la raie blanche aux seuils d absorption L est identique pour tous ces atomes L amplitude et la position de la raie blanche peuvent tre influenc es par le degr d oxydation de l l ment consid r D une mani re g n rale les ions lanthanides poss dent 9 atomes dans leur premi re sph re de coordination L nergie des orbitales mol culaires form es entre les lanthanides et les atomes coordonn s est donc particuli
385. omales des sites de fixation du Ln HMTDPA On constate que selon les m thodes de pr paration de cristaux d riv s utilis es co cristallisation trempage diff rentes concentrations les taux d occupation observ s varient Ces variations s observent d j lors du calcul des cartes de Patterson anomales et lors du phasage au regard de l intensit du signal anomal mesur pour chacun des sites de fixation Le tableau 4 11 montre que la fixation du complexe est favoris e par la pr paration de cristaux d riv s de HEWL par co cristallisation plut t que par la m thode de trempage Toujours dans le cas de cristaux d riv s obtenus par co cristallisation on voit aussi que plus on augmente la quantit de complexe introduit dans la goutte plus le faci s des cristaux se d grade Le profil de diffraction de ces cristaux au faci s tortur est de pi tre qualit par commodit nous les avons donc qualifi s de mauvais cristaux En de de 2 0 mM de complexe la proportion de cristaux pr sentant un faci s propre est majoritaire Ils ressemblent aux cristaux natifs de lysozyme Figure 4 7 Entre 2 0 mMM et 3 3 mM4 de complexe des cristaux aux faci s tortur s apparaissent en m me temps que les pr c dents double faci s cristallin voir figure 4 8 c est partir de ce type de goutte que provient la majorit de mes jeux de donn es Entre 3 3 mM et 10 mM de complexe de plus en plus de cristaux d riv s au
386. ompl ter la sph re de coordination du lanthanide Aussi l utilisation de sels de lanthanide endommage g n ralement les cristaux de prot ines Il existe diverses solutions pour introduire des lanthanides dans les cristaux de prot ines afin de limiter leur d t rioration Il a t propos d utiliser des sels de lanthanides via la m thode de trempage rapide short cryo soak Dauter et al 2000 Nagem et al 2001 Cette m thode consiste tremper pendant un temps tr s court inf rieur 4 la minute des cristaux dans une solution tr s concentr e en sel de lanthanide au del du molaire Mais cette m thode provoque aussi une d gradation des cristaux Suite la publication initiale sur l utilisation des complexes de lanthanide IRM Girard et al 2003b complexes qui seront d crits dans le chapitre suivant la cr ation d une liaison covalente entre des complexes de lanthanide d riv s de pr c dents et la prot ine par l interm diaire d une fonction r active thiol a t propos e Purdy et al 2002 La fonction thiol permet la cr ation de ponts disulfure avec les cyst ines libres de la prot ine Plus r cemment la structure de l ubiquitine a t r solue par phasage exp rimental gr ce la greffe d une tiquette lanthanides sur la prot ine Silvaggi et al 2007 Cette tiquette lanthanoid binding tag peut fixer un ou deux atomes de lanthanide Elle est directement exprim e
387. on et al 1998 277 Conclusion quant l utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de macromol cules biologiques de grande taille Les tudes pr liminaires sur le complexe DTTA BPA nouveau complexe dont le mode de fixation putatif est de cibler les parties transmembranaires des prot ines membranaires se sont av r es plus difficiles qu escompt es D une part les essais de solubilisation du complexe n ont pas abouti une solution suffisamment concentr e en complexe et d autre part la prot ine choisie EcAcrB ne s est pas pas r v l e un bon mod le En effet bien que facile produire purifier et cristalliser aucun cristal natif d EcAcrB n a diffract une r solution sup rieure 6 5 A Or la haute r solution nous est indispensable pour d terminer le mode de fixation subs quent des complexes Cela est d autant plus dommageable que la prot ine entrait aussi dans la cat gorie des grandes prot ines multim riques homotrim re de 341 kDa Elle aurait ainsi pu constituer un bon repr sentant pour illustrer le pouvoir phasant des complexes de lanthanide Si dans le cas d EcAcrB la solution tait d amener une centaine de cristaux sur une ligne de lumi re afin d isoler celui qui diffracte haute r solution approche incompatible avec une tude syst matique des complexes de lanthanides nous avons pr f r nous tourner vers une autre prot ine mod le C est pourquoi nous
388. onditions de pr paration des cristaux d riv s m ont permis d aboutir des taux d occupation quilibr s entre les deux sites 48 pour le premier site et 47 pour le second dans les figures utilis es ici En fin d affinement pour les autres mod les les taux d occupation des sites ont plut t t en moyenne de 65 pour le premier et 25 pour le second Dans la suite du manuscrit nous utiliserons les termes Site 2 ou Site Trp62 pour qualifier ce site de fixation L unit de l ensemble des distances indiqu s dans les figures est l angstr m Site 2 description de l interaction du premier ligand avec la prot ine Le premier ligand que je nomme ainsi car il s agit de celui que j ai pu mod liser le plus souvent fixe un second complexe la prot ine l aide de deux interactions La premi re est une interaction t n entre les atomes du noyau 133 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 5 triazole du ligand et les atomes Nz Cz N1 et N2 de l Arg112 de la mol cule de r f rence Figure 4 23 En effet l extr mit de la chaine lat rale de l Arg112 se plie pour pouser la forme plane impos e par les cycles qui composent le ligand distance de 3 5 On observe le m me type d interactions entre les atomes de la fonction carboxylate de ce ligand et les atomes Ns Cz N1 et N2 de l Arg125 de la mol cule sym trique distance de 3 4 E
389. ons apport es au protocole de purification d EcAcrB 275 8 3 2 R sum des tentatives d am lioration des conditions de cristallisation et d lit de faci s cristalline as eE tt peje ARO TADS et hte sde Se Et go s 276 8 3 3 R sum des tentatives d am lioration du protocole de cryo protection des cristaux H CAGER RL Re a Mas a ds Re de Bh De ie Be th Cee Gand ee dt ge 277 8 4 Conclusions quant l utilisation de la prot ine mod le EcAcrB 277 Discussion g n rale et perspectives 285 IV Annexes 291 9 S paration des prot ines par lectrophor se sur gel de polyacrylamide en pr sence de dod cylsulfate de sodium 293 9 1 Pr paration des gels d naturants de polyacrylamide 293 9 2 Pr paration du colorant au bleu de Coomassie 294 9 3 Marqueurs de poids mol culaires utilis s 294 10 Les prot ines mod les 295 10 1 L urate oxidase de Aspergillus flavus Af UOx 295 10 2 L enhanced Green Fluorescent Protein de Aequorea victoria AVEGFP 295 10 2 1 Pr sentation de la prot ine et donn es de biologie mol culaire 295 10 2 2 Production et purification de AVEGFP 297 10 2 2 1 Description du milieu de culture et de l ensemble des tampons utilis s 298 10 2 2 2 Pr culture sur la nuit 299 10 2 2 3 Culture bact rienne et pr
390. ont des caract ristiques qui rappellent les complexes destin s l imagerie m dicale LnHPDO3A etc Cependant gr ce aux trois acides pico liniques qui viennent compl ter la sph re de coordination de l atome de lanthanide ce nouveau complexe conserve toutes les propri t s de luminescence Aucune mol cule d eau ne vient alors masquer l mission de fluorescence Figure 5 1 Formule d velopp e du 6 6 6 1 4 7 triazonane 1 4 7 triyl tris methyl ne tripicolinate de lanthanide LnTNTPA 181 5 1 DESCRIPTION DU COMPLEXE DE LANTHANIDE LNTNTPA Le complexe m a t fourni sous la forme de poudre complex avec le terbium La masse molaire de la cage seule est de 666 46 g mol Celle du complexe de terbium est de 825 38 g mol Le complexe est tr s soluble dans l eau 74 mM 25 C Tout comme les complexes pr c dents le m me protocole de pr paration est applicable et on peut v rifier la solubilisation du complexe en exposant la solution aux UV proches 315 nm La synth se du ligand TNTPA revient greffer les trois acides dipicoliniques sur un cycle triazacy clononane par alkylation et via l utilisation d une de leur fonction acide L adjonction du lanthanide se fait ensuite par adjonction du chlorure correspondant et en pr sence de carbonate de potassium Figure 5 2 o Ss N ZA a SS NN VE K CO 3 CH3CN reflux 3 jours 3 1 7 o N e Rendement 66 N 3 HC
391. ope Fig 3 The non halophilic and halophilic enzymes showed opposite behavior Fig 3 The non halophilic enzyme from Tt is controlled by a strongly attractive regime at both low and high KCl concentrations Fig 3a and at 3 8 M KCI the enzyme starts to precipitate at 6 8 mg ml The Ca MalDH exhibits a more neutral behavior with small or slightly negative slopes Fig 3b At low salt concentrations we were able to concentrate Ca MalDH to 20 30 mg ml In contrast Sr MalDH exhibits a repulsive behavior Fig 3c and at 3 8 M KCI the protein remains soluble at 35 mg ml Due to the limited amount of protein available we were not able to determine the solubility limit of this enzyme Hm MalDH also exhibits repulsive behav ior at high KCI concentrations and at 4 M NaCl this enzyme can be concentrated to 200 mg ml For probing the relationship between various enzyme surface properties and solubility in more drastic salt conditions we also measured the AUC profiles in NH4 2SO 0 5 and 2 0 M which typically strongly favors protein precipitation Halophilic Sr MalDH and Hm MalDH are still under a repulsive regime and stay soluble Fig 3c and d With Tt MalDH data are very difficult to record at 0 5 and 2 0 M NH 4 25O4 because the Tt enzyme precipitates slowly at 0 5 M and immediately at 2 M In the case of Ca MalDH the slope indicates a slightly attractive or neutral behavior at low salt concentra tions Fig 3b At 2 0 M
392. opeptidase a chymotrypsine Figure 10 1 S quence d ADN ins r e dans le plasmide pRSET B qui code la prot ine EGFP l tiquette histidine et le site de clivage l a chymotrypsine en N terminal Les figures 10 2 et 10 3 repr sentent la s quence d acide amin s qui r sultent de la s quence d ADN pr sent e pr c demment avant et apr s clivage 296 CHAPITRE 10 LES PROT INES MOD LES 10 20 30 40 50 60 ViRGSHHHHHH GHASMTGGOG NGRDLYDDDD KDEPAEJMSK GEELFTGWVP ILVELDGDVN 70 80 90 100 110 120 GHKLTVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT LTYGVQCFSR YPDHMKQHDF 130 140 190 160 170 180 FKSAMPEGYV QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI ELKGIDFKED GNILGHKLEY 190 200 210 220 230 240 NYNSHNVYIM ADKOKNGIKV NFKIRHNIED GSVQLADHYQ QNTPIGDGPV LLPDNHYLST 250 260 270 QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTAAGITLGM DELYK Mutations F64L S65T et H231 Figure 10 2 S quence d acide amin s qui constitue la prot ine EGFP avec son tiquette histidine et le site de clivage l o chymotrypsine en N terminal 10 20 30 40 50 60 MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT GKLPVPWPTL 70 80 90 100 110 120 VTTLTYGVQOC FSRYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV 130 140 150 160 170 180 NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKOKNG IKVNFKIRHN IEDGSVQLAD 190 200 210 220 230 HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT LGMDELYK Figure 10 3 S quence d acide amin s qui constitue la
393. or E mail address Dominique Madern ibs fr Abbreviations used OAA oxaloacetate MalDH malate dehydrogenase LDH lactate dehydrogenase Ca Chloroflexus aurantiacus Sr halophilic bacterium Salinibacter ruber halophilic bacterium Hm Haloarcula marismortui halophilic archaea Tt Thermus thermophilus AUC analytical ultracentrifugation PDB Protein Data Bank specific pathways for osmolyte synthesis A second strategy involves KCl accumulation at molar con centrations in the cytoplasm to counterbalance the external osmotic pressure This strategy is typical of extreme halophilic archaea but was also recently discovered for the first time in a eubacterial species Salinibacter ruber Sr which inhabits the same natural environment as halophilic archaea Where as osmolytes typically have only small effects on enzyme stability and catalysis high salt concentra tions are generally deleterious to enzyme function Nevertheless enzymes from halophilic cells have evolved to maintain solubility catalytic efficiency and structural stability in high concentrations of KCI all necessary for proper function 0022 2836 see front matter 2010 Elsevier Ltd All rights reserved 494 Work on several protein systems over the last 15 years has uncovered three general features of molecular adaptation via the KCI accumulation strategy First halophilic proteins from ex treme archaea are very acidic with a mean calc
394. orable Tableau 7 27 De plus bien que les polygones soient plans dans 64 5 des cas on constate qu ils peuvent se tordre pour s adapter des contraintes structurales de surface C est par exemple le cas lorsque un pentagone recouvre partiellement une proline Par rapport au plan form par les quatre autres mol cules d eau la pointe du pentagone la plus proche de la proline se rel ve permettant de maintenir une distance d environ 3 20 0 8 entre le pentagone et la surface de la prot ine Tableau 7 27 247 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO CaMalDH Dim re A D Nombre de mol cules d eau total 972 x2 pour le tetram re complet Nombre de mol cules d eau par r sidus 1 57 Chaine B A et chaine C D Mol cules d eau constituant des polygones 28 09 273 932 Nombre de polygones trouv s 76 Nombre de pentagones trouv s 66 Nombre d hexagones trouv s 10 Nombre de r seaux de polygones diff rents 15 Plus grand r seau de polygones trouv 15 polygones associ s Pourcentage de polygones tout fait plans 64 47 49 76 Distance minimale observ e entre le r sidu couvert et le plan form par un polygone 2 58 A Distance maximale observ e entre le r sidu couvert et le plan form par un polygone 4 02 Distance moyenne entre les r sidus couverts et les plans form s par les polygones 3 23 istance minimale observ e entre deux mol
395. ors du processus d affinement 1 6 1 1 Le facteur R 4 5 Fovs hkt a Featc hkl hkl y Fos hkt hkl Rwork 59 1 6 AFFINEMENT DE LA STRUCTURE ET INTERPR TATIONS Ce facteur r siduel permet de suivre l volution de l affinement en calculant l ad quation entre le module des facteurs de structure observ s Fobs hkl avec le module des facteurs de structure calcul partir du mod le construit Feaic hkl et pour toutes les r flexions 1 6 1 2 Le facteur R free Il s exprime de la m me fa on que le Rwork En revanche il est calcul en utilisant une proportion de r flexions choisies al atoirement qui ne sont pas incluses dans le processus d affinement typiquement 5 des r flexions totales Il constitue un indicateur non biais de l avancement de l affinement 1 6 2 Protocole d affinement retenu pour nos travaux Tous les affinements de structure ont t r alis s l aide du programme Phenix refine de la suite Phenix Adams et al 2010 dans ses versions v1 4 v1 7 1 en suivant le protocole d crit ci apr s Toutes les valeurs statistiques et les cartes de densit lectronique qui seront pr sent es dans ce manuscrit sont issues d un affinement en mode ml simple Partant d un jeu anomal nous avons cepen dant essay de comparer ce type d affinement ce que pourrait apporter un affinement mlh qui tient compte de l information de phase expe
396. ot ine A 32 02 Bmoyen eau A 28 29 Bmoyen ions lanthanide A 17 77 Bmoyen ligands A 20 51 Siteo 49 Tableau 4 18 R sum des statistiques d affinement de la structure du TATHAU avec le Ln HETDPA 3 A la surface de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii le Eu HETDPA se place dans la m me poche que le Ln HMTDPA 3 les ligands dans la m me orientation Bien que le centre du complexe soit l g rement d cal par rapport celui du complexe Ln HMTDPA 3l leurs modes de fixation se sont av r s identiques R soudre cette structure a donc permis de confirmer la pr sence de la liaison hydrog ne entre le groupement NH2 d une des deux conformations de l Arg79 et le groupement carboxylate du premier et du second ligand Les fonctions hydroxyethyles des ligands ne permettent pas ce complexe d tablir de nouvelles liaisons avec la surface de la prot ine ces groupements sont toujours orient s vers le solvant au c ur de la poche Figure 4 41 158 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 41 Carte de densit lectronique du Eu HETDPA apr s affinement la surface de la TdTHAU 4 6 1 2 R capitulatif des essais r alis s avec le complexe Eu HECTDPA 3 Le complexe Eu HECTDPA s se distingue des autres complexes de la famille des triazoledipicolinates par sa charge globale nulle et son encombrement Ceci est du la fonction thylc
397. ot ine s il s y fixe Une observation concernant non plus les cristaux mais les pr cipit s corrobore cela Les pr ci pit s de prot ine en pr sence de Eu DPA 3 sont syst matiquement plus homog nes moins diffus et presque d pourvus de volutes opaques par rapport aux pr cipit s observables dans les gouttes avec la prot ine seule Le nombre de conditions de cristallisation o apparaissent les cristaux de sel de complexe Eu DPA 3 _ semble d pendant de la prot ine test e Bien que nous ayons explor la piste du point iso lectrique de la prot ine en solution nous n avons pas r ussi trouver de corr lation entre le taux d auto cristallisation du complexe et la prot ine tudi e Nos observations confirment que le Eu DPA 3 auto cristallise syst matiquement dans quatre situations r s 2 2 2 2 en pr sence d ions divalents Ca Mg Cd Ni etc dans des conditions o les concentrations en sels chlorure malonate et formate de sodium sulfate ou ac tate d ammonium chlorure de lithium etc sont sup rieures ou gales 0 8 M en pr sence du pr cipitant 2 Methyl 2 4 pentanediol isopropanol d s que la diffusion de vapeur est accentu e en bordure de goutte ou dans une goutte qui s ass che 98 CHAPITRE 3 LE TRIS DIPICOLINATE DE LANTHANIDE AGENT DE NUCL ATION Les cristaux de sel de complexe sont reconnaissables car ils apparaissent rapidement en quelques
398. otein size Combined with the strong anomalous signal of the lanthanoid ions these complexes are thus efficient tools for solving the structure of large macro molecular assemblies irrespective of their size This work was supported by the French National Research Agency ANR Project MacroTET BLAN07 3_204002 J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 Romain Talon et al Lanthanoid complexes 77 diffraction structural biology References Arnoux P Morosinotto T Saga G Bassi R amp Pignol D 2009 Plant Cell 21 2036 2044 Bono S de Riechmann L Girard E Williams R L amp Winter G 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102 1396 1401 Borissenko L amp Groll M 2005 J Mol Biol 346 1207 1219 Chaudhuri B N Sawaya M R Kim C Y Waldo G S Park M S Terwilliger T C amp Yeates T O 2003 Structure 11 753 764 Collaborative Computational Project Number 4 1994 Acta Cryst D50 760 763 Cowtan K D amp Main P 1996 Acta Cryst D52 43 48 D Al o A Pompidor G Elena B Vicat J Baldeck P L Toupet L Kahn R Andraud C amp Maury O 2007 ChemPhysChem 8 2125 2132 Delfosse V Girard E Birck C Delmarcelle M Delarue M Poch O Schultz P amp Mayer C 2009 PLoS ONE 4 e4712 Doublie S 1997 Methods Enzymol 276 523 Dur M A et al 2010 In preparation Dur M A Rosenbaum E Larabi A Gabel F
399. oteins Two structures of large multimeric proteins have already been determined by using such complexes Here the use of the luminescent europium tris dipicolinate complex Eu DPA to solve the low resolution structure of a 444kDa homo dodecameric aminopeptidase called PhTET1 12s from the archaea Pyrococcus horikoshii is reported Surprisingly considering the low resolution of the data the experimental electron density map is very well defined Experimental phases obtained by using the lanthanoid complex lead to maps displaying particular structural features usually observed in higher resolution maps Such complexes open a new way for solving the structure of large molecular assemblies even with low resolution data Keywords lanthanoid complexes experimental phasing large macromolecular assemblies TET aminopeptidase 1 Introduction Even though most of the newly deposited structures in the Protein Data Bank PDB were solved by molecular repla cement experimental phasing remains essential for deter mining three dimensional protein structures if only for solving structures with new folds or which significantly differ from any known model structure Over the last ten years methods based on anomalous scattering namely the single wavelength anomalous diffraction SAD and multiple wavelength anomalous diffraction MAD methods have replaced the traditional methods based on isomorphous replacement thus becoming the methods of c
400. our la structure de la TATHAU avec le TbTNTPA 5 3 4 1 Description du site de fixation 1 taux d occupation 20 Le premier site se situe dans la m me cavit que celle d crite dans le chapitre relatif la fixation des complexes Ln TDPA 3 chapitre pr c dent Il s agit de la m me cavit charg e positivement et form e par l empilement cristallin dans laquelle vient se fixer la plupart des complexes de lanthanide charg s Figure 5 8 Ici aussi encore une fois la chaine lat rale de l Arg79 vient refermer cette cavit y pi geant le complexe Cette fois l atome de lanthanide ne se situe pas tout fait sur l axe de sym trie d ordre 2 comme cela avait t le cas avec le complexe Ln HETDPA 3l ce d calage a d ailleurs permis le phasage exp rimental direct Figure 5 7 Les taux d occupation du site de r f rence et de son sym trique sont donc de 20 188 CHAPITRE 5 UN TRIS DIPICOLINATE CAG LE LNTNTPA Figure 5 7 Premier site de fixation du THTNTPA une interface entre deux mol cules de TdTHAU Cristal d riv obtenu par co cristallisation La mol cule de r f rence est en vert la mol cule sym trique en rose Figure 5 8 Surface lectrostatique du premier site de fixation du TH TNTPA Echelle allant de 3 0 kT e charge n gative rouge 3 0 KT e_ charge positive bleu Alors que tous les complexes de la grande famille des complexes picolinates o
401. ours pu les cristalliser que dans une seule de leurs conditions d crites 4 2 2 Le lysozyme de blanc d uf de poule HEWL pour Hen Egg White Lyso zyme Le lysozyme Murramidase ou encore N acetylmuramide glycanhydrolase est une enzyme globu laire soluble eucaryote qui appartient la famille des O glycosyl hydrolases classification enzymatique E C 3 2 1 17 Son poids mol culaire est de 14 3 kDa pour 129 acides amin s avec un point iso lectrique 107 4 2 PREPARATION DE CRISTAUX D RIV S AVEC LE COMPLEXE LN HMTDPA 3 gt EN VUE D UNE EXP RIENCE DE DIFFRACTION DES RAYONS X th orique de 9 32 et un coefficient d extinction molaire th orique 280 nm e289 nm 37970 M cm Grunclova et al 2003 Nous utilisons la prot ine commercialis e par la soci t Roche sans purification ni dialyse suppl mentaire 4 2 2 1 Cristallisation de la prot ine native Le lysozyme de blanc d ceuf de poule cristallise dans un certain nombre de conditions physico chimiques qui conduisent des formes cristallines diff rentes Je me suis inspir des conditions habituel lement utilis es pour obtenir des cristaux de forme quadratique le plus rapidement possible Ducruix amp Gieg 1992 Figure 4 7 0 4 1 5 M NaCl 100 mM ac tate de sodium pH 4 6 P 20 mg mL Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R T 293 K 20 C 3 7 jours 12h si P 100 mg mL Cryo p
402. p Fpy et Fy sont respectivement les facteurs de structure du cristal natif du cristal d riv et de la sous structure des atomes lourds dans le cristal d riv Dans le cas de la m thode MIR avec deux cristaux d riv s isomorphes les mesures des intensit s diffract es par le cristal natif et les deux cristaux d riv s conduisent respectivement aux modules des facteurs de structure Fp Fpxil et Fpy2 Apr s avoir d termin les coordonn es des atomes lourds partir des cartes de diff rences de Patterson des deux cristaux d riv s il est possible de calculer Fy1 et Fy2 en amplitude et en phase Dans le plan complexe Fp se trouve sur un cercle de rayon Fp centr l origine alors que Fpy1 et Fpy2 se trouvent respectivement sur un cercle de rayon Fpy1l et d origine Fr et sur un cercle de rayon Fpx2 et d origine Fy2 L intersection de ces trois cercles permet de d terminer la phase de Fp Figure 1 1 La m thode SIR qui utilise un cristal natif et un seul cristal d riv m ne deux solutions pour chaque phase r sultante Comme on a pu le voir pour d terminer la phase des facteurs de structure sans ambiguit il faut au moins deux cristaux d riv s isomorphes diff rents Dans ce cas avec plus d un cristal d riv on parle alors de m thode MIR C est la m thode de phasage qui t utilis e en 1954 pour r soudre la premi re structure de l h moglobine Green et al 1954 39
403. p residues 101 108 for Sr MalDH The final Sr MalDH model also includes 340 water molecules per monomer with no ions Sr MalDH shows the conformational stability of a non halophilic protein The conformational stabilities of the four enzymes after a 24 h incubation at 25 C in various KCl concentrations were compared Data for Tt LDH and Ca MalDH were measured here whereas data from Sr MalDH and Hm MalDH were taken from previous studies Both Tt LDH and Ca MalDH show a salt independent stability as expected for non halophilic proteins Fig 2a and b As was shown previously Sr MalDH is also stable over the whole KCl range Fig 2c whereas the halophilic Hm MalDH unfolds below 2 M KCl Fig 2d Previous measurements of the Sr MalDH quaternary assembly using analytical ultracentrifu gation AUC showed that the enzyme is still tetrameric after 24 h of incubation at low salt which was repeated here After the first AUC data acquisition on Tt LDH Ca MalDH and Sr MalDH at low KCI 0 05 M the cell contents were homoge nized and a second measurement was performed The AUC results were identical before and after incubation showing again that these enzymes are stable data not shown The low salt unfolding for Hm MalDH which is well documented is due to the presence of ion binding sites at the tetramer interfaces A putative sodium binding site at a dimer interface two sites per tetramer and two different chloride
404. p62 Le complexe Ln HMTDPA dans l empilement cristallin du HEWL Je pr sente ici deux vues de l empilement cristallin dans un cristal de lysozyme de groupe d espace P432 2 136 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 26 Vue g n rale de l empilement cristallin d un cristal d riv de lysozyme avec le complexe Ln HMTDPA dans une premi re orientation Les mol cules de prot ines sont en vert les complexes occupant les sites 1 en bleu et les complexes occupant les sites 2 sont en rouge Cette vue de l empilement cristallin d un cristal d riv de HEWL montre la forte compacit de cet empilement 27 de solvant La figure met aussi en vidence que les positions des sites de fixation 1 et 2 sont altern es dans le cristal le long d un m me axe Figure 4 26 Superposition des cinq structures de lysozyme obtenues l aide du Ln HMTDPA A l aide de la superposition des cinq structures de lysozyme ayant pu tre r solues gr ce au com plexe Ln HMTDPA s il est possible d avoir acc s une information suppl mentaire relativement statistique concernant la position pr f r e de chaque ligand du complexe au sein d un site de fixation Aussi cette m thode de repr sentation permet de comparer rapidement ce qui est observ suite un trempage ou une co cristallisation 137 45 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE
405. pH 3 5 4 0 100 mM acide citrique pH 3 0 3 5 P 10 mg mL Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R T 293 K 20 C 8 a 10 jours 12 15 jours Cryo protection 30 glyc rol Cryo protection 30 glyc rol a ristaux natifs de Pt onditions de cristallisation et de cryo protection Cri ifs de P b Conditi d istallisati de cry i MalDH obtenus en pr sence de sulfate d ammo nium 360x290 pm Figure 7 4 Cristallisation et cryo protection de la PtMalDH Conditions pour obtenir les cristaux d riv s de PtMalDH Les cristaux d riv s de PtMalDH ont t obtenus par co cristallisation avec 100 mM des complexes GdHPDO3A GdDO3A et GdDTPA BMA dans la condition contenant du sulfate d ammonium figure 7 4 La cryo protection des cristaux d riv s a aussi t effectu e avec ajout de 30 de glyc rol aux conditions de la goutte De l huile de paraffine a t ajout e pour le cristal d riv avec le GdHPDO3A 214 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES 7 1 1 2 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii Conditions pour obtenir les cristaux natifs de HvMalDH_ La meilleure condition de cristalli sation pour obtenir rapidement des cristaux de HvMalDH diffractant 1 5 de r solution est d crite dans la figure 7 5 Nous n avons utilis que cette condition de cristallisation 31 36 PEG 400 100 mM Tris HC
406. par celle de mon co directeur de th se Eric Girard 1998 2001 et suivies de celles de Meike Stelter 2002 2005 et Guillaume Pompidor 2004 2007 Elles ont toutes d montr l efficacit des complexes de lanthanide pour la r solution de structures de prot ines Il convient ici d ajouter la th se de Marie Laure Chesne 1999 2002 qui mit profit la diffusion anomale de l uranium fix aux prot ines via un ligand chimique color Cette th se a ouvert la voie au d veloppement de complexes dont les propri t s physico chimiques les rendent d tectables dans un cristal pr alablement l exp rience de diffraction approche qui fut pleinement exploit e dans la th se de Guillaume Pompidor Trois tudes constituent la premi re partie du travail pr sent ici elles s articulent autour du complexe tris dipicolinate de lanthanide complexe dont le d veloppement et l tude ont fait l objet de la th se de Guillaume Pompidor et qui s est r v l tr s prometteur D une part sa fixation peut tre ais ment r v l e par luminescence dans le visible et d autre part il est susceptible de jouer le r le d agent de nucl ation pour promouvoir l apparition de cristaux d riv s en co cristallisation Ainsi par une premi re tude statistique s appuyant sur un large spectre de prot ines nous v rifierons si ses propri t s avantageuses font de lui un complexe si id al Nous pr senterons donc les avantages et le
407. parce que je ne tenais plus debout pour tes pr cieux conseils pour la soutenance ou pour m avoir apport un dimanche de r daction au labo en compagnie de ta si belle Marl ne que je remercie aussi une norme boite de bonbon d encouragement merci pour tout a Et pour tout le reste Une seule ombre au tableau cependant quel dommage que tu sois avec Marl ne Meow Laissez moi vous pr senter maintenant ma Sarah Ancelet un bijou romantique petit format brun et au teint clair qui a tant d nergie revendre et transmettre Alors que tu tais dans les parages depuis le d but ce n est qu en fin de th se que nous avons d cid de rattraper le retard Et l je te remercie pour beaucoup de choses pour ton dynamisme contagieux pour ne pas m avoir facilement laiss tomber sur cette ligne qui s estompe pour m avoir pr sent la Bastille sous un autre jour et surtout pour ton soutien Un grand merci mon ami Gu nol Mainsant qui a eu la bonne id e de rejoindre aussi Grenoble pour une th se Si on m avait dit On peut continuer comme a longtemps si tu veux a me va tr s bien tant donn qu on sera encore potes je te dis dans 50 ans Vancouver pour un petit caf sur mon balcon Guillaume Monin pourquoi m a tu l chement abandonn Ces conversations de m nag res autour d un bon th nos s quences cin ma en amoureux et tes recettes de cr pes et galettes bretonnes me manquen
408. particulier la proportion de certains types de r sidus La r partition des charges lectrostatiques la surface de la prot ine La topologie de la surface de la prot ine La composition chimique et du pH de la solution de cristallisation qui moduleront la fixation des complexes L approche bas e sur la famille des malate d shydrog nases devrait permettre de comprendre le poids et l influence de chacun des points pr sent s ci dessus En effet si le premier et le dernier points sont connus pour une prot ine en cours d tude structurale il n en est pas de m me pour la r partition de la charge ou pour la topologie qui suppose que la structure est connue Ainsi pour chaque structure d termin e y compris les structures natives il faudra regarder la topologie des surfaces en particulier si la zone d interaction fait partie d une h lice d un brin b ta ou simplement d une boucle analyse qui finalement n a jamais t entreprise jusqu pr sent et cartographier la r partition des charges et ainsi d terminer l importance pour l interaction d un certain type de r sidus L tude fine du mode de fixation 286 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES des complexes dans leur site le plus peupl pourra alors commencer afin de d terminer les r sidus parti cipant l interaction Cela impliquera pour chaque complexe la comparaison site site avec les r gions quivalentes de toutes les MalDHs dont les st
409. picolinate pour acide 4 4 hydroxymethyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique 308 16 g mol HETDPA HydroxyEthylTriazoleDipicolinate pour acide 4 4 2 hydroxyethyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique 322 18 g mol CTDPA CarboxylateTriazoleDipicolinate pour acide 4 4 carboxy 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyridine 2 6 dicarboxylique 322 14 g mol7 EATDPA EthylAmineTriazoleDipicolinate pour acide 4 4 aminomethyl 1H 1 2 3 triazol 1 yl pyri dine 2 6 dicarboxylique 307 17 g mol HECTDPA HydroxyEthylCholineTriazoleDipicolinate pour N 1 2 6 dicarboxypyridin 4 yl 1H 1 2 3 triazol 4 yl methyl 2 hydroxy N N dimethylethanammonium 380 29 g mol Dans un premier temps j ai utilis des solutions de complexe Eu HETDPA 3 Eu CTDPA 3 et Eu HECTDPA s respectivement concentr es 4 mM 4 mM et 35 mM pour essayer d obtenir des cristaux d riv s avec trois prot ines Les deux prot ines mod les usuelles le lysozyme de blanc d ceuf de poule et la thaumatine de Thaumatococcus daniellii mais j ai aussi test ces complexes sur la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii Il est noter que tout comme le complexe Eu HMTDPA 3f le complexe Eu HETDPA 3 est charg trois fois n gativement ce qui n est plus le cas ni du complexe Eu CTDPA 3 charg six fois n gativement ni du complexe choline Eu HECTDPA s dont la charge global
410. polygones d eau la surface de CaMalDH ont de commun avec les chanterelles Trompette des morts Craterellus cornucopioides Pearson 1825 la m thode par laquelle on les trouve il est bien plus probable d en trouver dans une zone moins hydrat e et lorsqu on en trouve un en soulevant un peu l humus de proche en proche on en trouve mille En effet la surface de CaMalDH plus de 28 des mol cules d eau mod lis es sont impliqu es dans des polygones 76 polygones dont 66 pentagones et 10 hexagones ont t observ s 15 r seaux de polygones distincts ont pu tre construits et le plus tendu de ces r seaux associe 15 polygones Enfin je n ai jamais constat la pr sence de polygones de mol cules d eau ni dans la cavit centrale de CaMalDH ni aux interfaces monom re monom re tous les polygones recens s se situent la surface de la prot ine Ceci peut s expliquer par le fait que d une part la surface de la cavit centrale est riche en acides amin s polaires et que d autre part il y a un encombrement st rique important aux interfaces monom re monom re qui ne laisse pas la place la formation de polygones de mol cules d eau Pour l instant suite ces premi res observations la structuration de l eau en polygone ne semble donc pas intervenir dans la structure quaternaire de la prot ine Ce qui m am ne discuter du r le de la structuration de l eau dans l adaptation halophile
411. protection des cristaux d EcAcrB Toujours en s appuyant sur la litt rature mentionn e pr c demment et sur les cryo protectants utili s s au laboratoire diff rents tests de diffraction ont t men s avec douze conditions de cryo protection diff rentes Les cryo protectants candidats ont t le PEG 400 le PEG 2000 l thyl ne glycol le glyc rol la paraffine et la paratone Ce qui semblait la meilleure combinaison obtenue tait la cryo protection des cristaux obtenus en pr sence de 5 de glyc rol voir les conditions ci dessus r alis e par trempage dans des solutions formant une gamme de 5 30 de glyc rol par pas de 5 Mais encore et toujours bien que les cristaux semblaient parfaitement r sister aucun profil de diffraction obtenu ne fut digne d enregistrement 8 4 Conclusions quant l utilisation de la prot ine mod le EcAcrB Sur une quarantaine de cristaux test s sur la ligne de lumi re Proximal du centre de rayonnement synchrotron SOLEIL et une quarantaine sur la ligne de lumi re BM30A de VE S R F une seule et unique fois un cristal natif de prot ine EcAcrB a diffract 3 6 de r solution R solution qui aurait pu tre suffisante pour tester le pouvoir phasant des complexes sur un grand assemblage membranaire mais insuffisante pour tudier le mode de fixation de ces complexes sur une telle prot ine Le profil de diffraction fut de toute fa on non enregistrable tant ce cristal avait sou
412. protein degradation pathways in prokaryotes Journal of Molecular Biology 346 1207 1219 319 BIBLIOGRAPHIE Bricogne G 1988 A Bayesian statistical theory of the phase problem I A multichannel maximum entropy formalism for constructing generalized joint probability distributions of structure factors Acta crystallographica Section Foundations of crystallography 44 517 545 Brown M Peierls R and Stern E 1977 White lines in x ray absorption Physical Review B 15 738 744 Cavicchioli R 2007 Archaea molecular and cellular biology Amer Society for Microbiology Chamas Z E A Guo X Canet J L Gautier A Boyer D and Mahiou R 2010 Clicked dipicolinic antennae for lanthanide luminescent probes Dalton Transactions 39 7091 7097 Charron C Gieg R and Lorber B 2004 Structure of thaumatin in a hexagonal space group comparison of packing contacts in four crystal lattices Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 60 83 89 Collaborative Computational Project Number 4 1994 The CCP4 suite programs for protein crys tallography Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 50 760 763 Contreras Martel C Job V Di Guilmi A Vernet T Dideberg O and Dessen A 2006 Crystal structure of penicillin binding protein la PBPla reveals a mutational hotspot implicated in beta lactam resistance in Streptococcus pneumoniae Journal of
413. py Fpx La loi de Friedel est rompue Figure 1 6 Axe imaginaire Axe r el Figure 1 6 Diagramme d Argand illustrant la brisure de la loi de Friedel Fpy Fp Fy et Fy d signent respectivement les facteurs de structure du cristal d riv du cristal natif de la contribution r elle et de la contribution imaginaire des diffuseurs anomaux On d finit alors la diff rence anomale ou diff rence de Bijvoet par la diff rence des amplitudes d une paire de Friedel Dano F F L intensit des effets anomaux une longueur d onde donn e peut tre estim e l aide du rapport de Bijvoet Dauter 2002 Girard et al 2003b Dano _ f2Naf 1 JEY IF Np fp fp Np x Vz repr sente la racine carr e de la valeur quadratique moyenne de la grandeur x O F F F 4 F hkl F hkI est la valeur moyenne des amplitudes d une paire de Friedel Np est le nombre d atomes de la prot ine dans la maille poss dant un facteur de diffusion moyen fp Na est le nombre de diffuseurs anomaux dans la maille dont la contribution imaginaire du facteur de diffusion atomique est f ou f pour un diffuseur anomal j ayant un taux d occupation q 48 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Lorsque l effet anomal est essentiellement d un seul type de diffuseur anomal le rapport de Bijvoet est donc proportionnel
414. pyridine 2 6 dicarboxylate e g dipicolinate was prepared using the procedure described by Tancrez et al 2005 2 2 Crystallization Crystallization was performed by vapour diffusion using the hanging drop method at 293 K Native PhTET1 12s crystals 200 um x 140 um x 20 um were grown within three weeks by mixing 1 5 ul of 6 2 mg ml protein solution and 1 5 ul of 20 22 PEG 3350 or 20 PEG 2000 MMB 100 mM Tris HCI buffer at pH 7 5 and 200 mM trimethylamine N oxide J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 Romain Talon et al Lanthanoid complexes 75 diffraction structural biology Table 1 Data collection and processing statistics of the Eu DPA 3 derivative of TET1 12s Space group F432 Unit cell parameter a 219 83 A Resolution range high resolution shell 49 16 4 00 A 4 22 4 00 A No of unique reflections 4207 591 Riegel 8 6 22 3 Rpim 3 0 8 7 Rano 6 8 7 8 Lo D 7 5 3 5 Completeness 99 9 97 9 Multiplicity 13 7 13 7 t Rieg Don Di IX 1 h ba par 1 h where J h is the ith measurement of reflection h and J h is the mean measurement of reflection h Rim nD N DE X L 1 a Xi Lh This indicator which describes the precision of the averaged measurement is most relevant Weiss 2001 Rang Xa HO 1 h 3 where I h and I h are the mean intensities of a Friedel mate I o J is the signal to noise ratio for merged intensit
415. qu l obtention d une solution relativement limpide deux passages sont g n ralement requis Une premi re centrifugation 10 minutes 9000 t p m 4 C permet de s parer les bact ries non lys es et les gros d bris membranaires des fractions membranaires d int r t Le surnageant est alors soumis une ultracentrifugation 1 heure 29300 t p m 4 C dans le but de faire s dimenter les fractions membranaires Les culots sont de couleur noir orang e l intensit de la couleur orange peut servir pour juger de la quantit de prot ines membranaires Le surnageant est jet Les culots de fractions membranaires sont resuspendus 4 leur tour dans 2 mL d un tampon C 20 mM Tris HCl pH 8 0 et 0 5 M NaCl La solution r sultante est homog n is e lentement au Dounce Cela permet de broyer de fa on pr cise un maximum de fractions membranaires Enfin le dosage des prot ines dans les fractions membranaires se fait 4 l aide du kit BCA Sigma Aldrich Cette m thode d analyse spectroscopique s appuie sur l utilisation conjointe de l acide bi cinchoninique acide 2 2 biquinoline 4 4 dicarboxylique ou BCA et du sulfate de cuivre pour suivre la r duction des ions Cu en Cult complex s aux prot ines pH basique L acide bicinchoninique forme un complexe bleu violet dans le visible avec le Cul et pH basique La mesure de l intensit de la couleur relative la quantit d ions Cu r duits elle
416. qu alors l aide des complexes de lanthanide Lors de nos tests nous valuons le pouvoir phasant des complexes en d terminant la structure des prot ines mod les comme s il s agissait de structures inconnues D s lors dans la liste des structures inconnues d termin es l aide des complexes on peut aussi inclure les prot ines utilis es comme mod les d tude Ainsi plus d une quinzaine de structures de macromol cules biologiques ont t d termin es l aide des complexes de lanthanide Parmi ces structures r solues je m attarde un peu plus sur la prot ine dod cam rique chim rique Ornythile Transcarbamoyl 3630 Girard et al 2003b et la prot ase octam rique Pab87 de Pyrococcus horikoshii Delfosse et al 2009 Ces deux assemblages prot iques de par leur poids mol culaire sup rieur 4 400 kDa illustrent le fort pouvoir phasant des complexes de lanthanide Dans le cas de la prot ine auto compartiment e Pab87 de nombreux d riv s lourds ont d abord t test s sans succ s sel de platine d iridium d osmium et d holmium prot ine s l ni e avec treize m thionines par monom re C est finalement des cristaux d riv s obtenus par co cristallisation avec 200 mM de complexe LuHPDO3A qui ont permis le phasage 76 CHAPITRE 2 UTILISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE EN BIO CRISTALLOGRAPHIE SAD 2 0 de r solution des 3500 acides amin s compris dans l unit asym trique
417. que mener une exp rience de diffraction neutronique pourrait permettre une compr hension plus fine de la structuration de l eau en r seau de polygones 257 doi 10 1016 j jmb 2010 09 055 J Mol Biol 2010 404 493 505 Contents lists available at www sciencedirect com Journal of Molecular Biology ELSEVIER journal homepage http ees elsevier com jmb Gradual Adaptive Changes of a Protein Facing High Salt Concentrations Nicolas Coquelle Romain Talon Douglas H Juers Eric Girard Richard Kahn and Dominique Madern TBS Institut de Biologie Structurale Jean Pierre Ebel Extremophilic and Large Molecular Assemblies Team UMR 5075 CEA CNRS Universit Joseph Fourier 41 rue Jules Horowitz F 38027 Grenoble France Department of Physics Whitman College Walla Walla WA 99362 USA Received 9 July 2010 received in revised form 22 September 2010 accepted 24 September 2010 Available online 1 October 2010 Several experimental techniques were applied to unravel fine molecular details of protein adaptation to high salinity We compared four homologous enzymes which suggested a new halo adaptive state in the process of molecular adaptation to high salt conditions Together with comparative functional studies the structure of malate dehydrogenase from the eubacterium Salinibacter ruber shows that the enzyme shares characteristics of a halo adapted archaea bacterial enzyme and of non h
418. r Olivier Maury du Laboratoire de Chimie de l Ecole Normale Sup rieure de Lyon collaboration d j tablie avant mon arriv e Nous avons aussi particip au d veloppement et l tude d une nouvelle famille de complexes luminescents les tris triazoledipicolinates de lanthanide Ce d veloppement m a conduit tablir une nouvelle collaboration avec Lionel Nauton et Arnaud Gautier du laboratoire SEE SIB de l Universit Blaise Pascal de Clermont Ferrand Ces nouveaux complexes ont permis le phasage de novo des deux prot ines couramment utilis es comme mod les dans le domaine de la cristallographie le lysozyme de blanc d ceuf de poule et la thaumatine de Thaumatococcus daniellii Depuis quatorze ann es un nombre important de structures de prot ines de tailles et de propri t s de surface vari es a t r solu par phasage exp rimental grace aux complexes de lanthanide Rien qu au cours des travaux r alis s pour cette th se ont ainsi t r solues par phasage de novo la structure du lysozyme de blanc d ceuf de poule 17 mod les la structure de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii 4 mod les la structure de CaMalDH 3 mod les la structure de PtMalDH 2 mod les la structure de HvMalDH 3 mod les et la structure de PhTET1 12s 1 mod le En r solvant les structures de grandes prot ines multim riques par les m thodes de phasage exploi tant le signal anomal des lanthanides nous avons confirm
419. r seau de liaisons hydrog nes travers la coordination de mol cules d eau par les atomes d oxyg ne et d azote des bras des ligands Ces mol cules d eau pouvant aussi tablir des ponts vers la surface prot ique 5 L interaction entre deux complexes menant la fixation coop rative de deux mol cules de complexe voisines 71 2 1 LES COMPLEXES DE LANTHANIDE ISSUS DE L IMAGERIE MEDICALE Le tableau r sume quelle sorte d interaction d crite ci dessus intervient lors de la fixation des complexes pour les diff rents d riv s Avec pour abr viations AfUOx urate oxydase d Aspergillus flavus Bon nete et al 2001 GT glucose isom rase de Streptomyces rubiginosus Ramagopal et al 2003 Td THAU thaumatine de Thaumatococcus daniellii Ko et al 1994 HEWHL lysozyme de blanc d oeuf de poule Girard et al 2003a X prot ine X YGGV prot ine hypoth tique Yggv d Escherichia coli collaboration avec Chantal Abergel IGS Marseille YEAZ yeaZ d Escherichia coli Jeudy et al 2005 AfUOx GI TdTHAU HEWL X YGGV YEAZ LnHPDO3A 345 234 LnDO3A 1345 13 1 12 LnDOTMA 234 4 24 14 LnDTPABMA 24 3 7 LnDTPA 124 234 124 LnDOTA 23 3 9 LnDOTA BOM 234 234 7 Tableau 2 1 Bilan des types de liaisons principales impliqu es dans la fixation des
420. r de Vion lanthanide 180 Chapitre 5 Un tris dipicolinate cag le LnTNTPA Les membres de la famille des complexes tris triazoledipicolinates de lanthanide ont permis d obte nir des phases tr s pr cises pour r soudre la structure haute r solution de deux prot ines mod les et ce m me tr s basse concentration le lysozyme de blanc d uf de poule et la thaumatine de Thau matococcus daniellii Ils ont en outre ouvert la voie des complexes modulables Mais bien que plus luminescents encore que le tris dipicolinate de lanthanide dont ils sont issus ils conservent cependant son d faut ils ne peuvent tre utilis s en pr sence d ions divalents C est dans ce contexte qu a t synth tis un nouveau complexe toujours d riv du tris dipicolinate de lanthanide le Ln TNTPA 5 1 Description du complexe de lanthanide LnTNTPA Dans ce complexe les trois ligands dipicolinates sont reli s par un cycle trois azotes et six car bones tri azacyclononane formant ainsi une cage chimique qui permet d avoir les neuf coordinations n cessaires a la liaison d un atome de lanthanide Figure 5 1 Sa synth se revient 4 Olivier Maury collaborateur du Laboratoire de Chimie de l Ecole Normale Sup rieure de Lyon Contrairement au tris dipicolinate de lanthanide ou au tris hydroxym thyltriazoledipicolinate la charge globale de ce complexe est nulle Le cycle tri azacyclononane et cette charge globale nulle s
421. r it rations successives en analysant chaque tape la carte diff rence Fo Fe Le taux de fixation du lanthanide et celui des ligands ont toujours t maintenus identiques et leurs facteurs d agitation thermique ajust s par rapport ceux des atomes voisins constituant la prot ine Le taux d occupation des ligands du complexe est ajust par rapport celui du lanthanide qui sert de r f rence Aussi l orientation des chaines lat rales des acides amin s ont t v rifi es tout comme les angles et des liaisons peptidiques de ces derniers afin qu ils puissent se trouver dans les r gions favorables ou autoris es du diagramme de Ramachandran Enfin ayant dispos de donn es de diffraction haute r solution quelle que soit la structure affin e j ai toujours fais en sorte que l cart entre le R free et le Rwork ne soit pas sup rieur 5 1 7 Des cristaux d riv s pr sentant un signal anomal pour un phasage de novo Diff rentes m thodes existent pour introduire des diffuseurs anomaux dans des cristaux destin s un enregistrement de jeux de donn es de diffraction anomale Il est aussi possible de se servir des diffuseurs anomaux naturellement pr sents dans les prot ines 1 7 1 Utilisation de prot ines s l ni es La m thode de phasage de novo la plus utilis e avec le rayonnement synchrotron est la m thode MAD appliqu e des cristaux de prot ines s l ni es Hendrickson et al 1990 La
422. r une origine commune entre plusieurs jeux d riv s 1 2 4 Un triste sire en ligne de mire son seuil franchi la triste H l ne de Troie devint folle description des m thodes de phasage de novo Au cours de ces quinze derni res ann es les m thodes utilisant la diffusion anomale c est dire la m thode SAD Single wavelength Anomalous Diffraction et la m thode MAD Multiple wavelength Anomalous Diffraction ont quasiment remplac les m thodes qui utilisent exclusivement le remplace ment isomorphe les m thodes SIR Single Isomorphous Replacement et MIR Multiple Isomorphous Replacement Elles sont devenues les m thodes de choix pour la d termination de novo de la structure des macromol cules biologiques 11530 structures sur les 64784 structures obtenues par cristallographie des rayons X recens e sur la Protein Data Bank r pondent aux mots cl s anomalous SAD MA D SIRAS ou MIRAS les m thodes SIRAS et MIRAS combinent l utilisation de la diffusion anomale et le remplacement isomorphe L utilisation de la diffusion anomale a t port e par deux v nements majeurs le d veloppement des sources synchrotron de seconde puis de troisi me g n ration capable d mettre un rayonnement X intense et de longueur d onde ajustable d une part et l utilisation de prot ines recombinantes s l ni es comme m thode d incorporation de diffuseurs anomaux d autre part Hend
423. rale d une thr onine mais aussi des pentagones dont le plan est parall le a la chaine aliphatique qui constitue la chaine lat rale d une lysine ou d une arginine Or ces trois acides amin s sont pourtant polaires Dans ces trois cas le p rim tre du pentagone ne surplombe jamais le groupement polaire respectivement hydroxyle guanidinium et amine de ces acides amin s Figure 7 17 250 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Figure 7 17 Polygone d eau la surface de CaMalDH parall le la chaine aliphatique d une lysine L oxyg ne de la liaison petptidique d un acide en amont fait partie int grante du pentagone Les polygones sont exclusivement coordonn s avec la surface prot ique par l atome d oxyg ne des liaisons peptidiques Dans un petit nombre de cas cet atome d oxyg ne fait partie int grante des penta gones Figure 7 17 Je n ai constat qu une seule fois la coordination d un pentagone par l atome d oxyg ne du groupement hydroxyle d une tyrosine Les Figures 7 18 et 7 19 sont deux exemples de ce que j ai pu observer et que je consid re comme des polygones d eau structurants Le premier exemple Figures 7 18 montre la participation de certains pentagones dans la structure tertiaire de la prot ine Le second exemple 7 19 concerne les r seaux de pentagones pr sents autour et dans la poche des sites catalytiques de CaMalDH Les
424. ramme de pr validation de structure pheniz validate de la suite Phenix cf introduction 4 5 1 1 Statistiques des affinements des structures du HEWL avec le Ln HMTDPA 3 Les indicateurs statistiques permettant de juger de la qualit des mod les de HEWL affin s avec les complexes Ln HMTDPA s3 mod lis s sont donn s dans les tableaux 4 5 et 4 6 suivants Comme 126 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE toujours les d finitions de l ensemble des indicateurs statistiques utilis s ici sont consign es dans l in troduction de ce manuscrit Ln HMTDPA 3 HEWL o crist 1 HEWLco crist 2 HEWLco crist 3 Rapport Sede compress 7 3 10 8 16 2 Code RCSB PDB 4BAD R solution 38 46 1 57 19 74 1 35 19 77 1 35 Rwork 17 99 15 27 12 40 Rfree 19 86 17 19 16 32 Nbre de r flexions utilis es 30113 26140 47398 Composition nbre d atomes Prot ine 1001 1091 1165 H20 142 159 217 Ions 12 11 5 Ligands 80 80 99 Res hors Ramachandran 0 0 0 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 006 0 019 0 018 Liaisons 4ngies 1 055 1 861 1 751 Bmoyen prot ine A 13 22 13 17 13 49 Bmin prot ine A 4 81 6 04 6 51 Bmax prot ine A 41 76 39 32 35 44 Bmoyen eau A 26 08 26 50 30 40 Bmoyen ions lanthanide A 16 42 17 80 11 21 Bmoyen ligands A 16 02 18 10 11 40 Sitesoce 70 3
425. ration des donn es de diffraction issues de cristaux d riv s de HEWL avec le Eu HECTDPA 3 Plusieurs jeux de donn es haute r solution ont pu tre enregistr s partir des cristaux d riv s obtenus par co cristallisation donn es de qualit qui ont conduit la r solution de la structure du complexe et de la prot ine Tableaux 4 19 et 4 20 Eu HECTDPA 3 HEWL Complexe mM 2 7 10 Prot ine mM 0 46 0 67 Rapport mere 0 5 87 14 92 M thode co cristallisation Source synchrotron ESRF Ligne de lumi re FIP BM30A MAD oui non a A 1 776 Buzzer 0 979 1 776 Eur Groupe d espace P43212 P43212 Param tres de maille a 77 027 c 38 110 a 77 340 c 38 080 Contenu unit asym trique 1 mol cule R solution A 38 51 1 93 2 04 1 93 38 15 1 36 1 43 1 36 38 69 1 94 2 04 1 94 Nombre de r flexions uniques 9018 1251 25390 3604 9105 1263 Rmerge 4 9 20 9 5 6 48 9 6 7 28 5 Rpim 2 0 8 9 2 9 26 0 3 4 15 1 Sigano XDS 4 84 1 75 1 17 0 76 2 91 1 11 Rano 9 2 13 3 3 3 16 0 9 4 15 8 am 12 2 3 6 8 3 1 5 8 7 2 6 Compl tude 99 7 97 7 99 8 99 0 99 6 97 6 Redondance 12 8 11 8 8 5 8 4 8 5 7 9 Tableau 4 19 Statistiques d int gration des jeux de donn es de diffraction de cristaux d riv s de HEWL Eu HECTDPA 160 CHAPITRE
426. rential effects on electrostatic and hy drophobic interactions and comparisons to Poisson Boltzmann theory Journal of the American Che mical Society 128 7796 7806 Thorn A and Sheldrick G M 2011 ANODE anomalous and heavy atom density calculation Journal Of Applied Crystallography 44 1285 1287 T rnroth Horsefield S Gourdon P Horsefield R Brive L Yamamoto N Mori H Snijder A and Neutze R 2007 Crystal structure of AcrB in complex with a single transmembrane subunit reveals another twist Structure 15 1663 1673 Ursby T Weik M Fioravanti E Delarue M Goeldner M and Bourgeois D 2002 Cryopho tolysis of caged compounds a technique for trapping intermediate states in protein crystals Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 58 607 614 Us n I and Sheldrick G M 1999 Advances in direct methods for protein crystallography Current opinion in structural biology 9 643 648 Veesler D Blangy S Cambillau C and Sciara G 2008 There is a baby in the bath water AcrB contamination is a major problem in membrane protein crystallization Acta crystallographica Section F 64 880 885 327 BIBLIOGRAPHIE Walden H 2010 Selenium incorporation using recombinant techniques Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66 352 357 Waterhouse A M Procter J B Martin D M A Clamp M and Barton G J 2009 J
427. rickson et al 1990 Doubli 1997 1 2 4 1 Les m thodes de remplacement isomorphe SIR et MIR Les m thodes de phasage par remplacement isomorphe consistent comparer les intensit s des pics de diffraction d un cristal natif et d un cristal d riv contenant des atomes lourds fix s dans le cristal 34 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Les atomes lourds ins r s doivent avoir un num ro atomique nettement sup rieur ceux des atomes constitutifs de la prot ine S N C O H afin que les intensit s diffract es par le cristal d riv diff rent significativement de celles diffract es par le cristal natif Une condition essentielle pour la r ussite de ces m thodes est l isomorphisme des structures cristal lines de la prot ine native et de la prot ine d riv e L insertion des atomes lourds sur la mol cule ne doit ni modifier l orientation des mol cules de prot ines dans le cristal ni modifier de mani re importante les param tres la maille cristalline La densit lectronique ppy du cristal d riv peut alors tre consid r e comme la somme de la densit lectronique pP de la macromol cule seule identique celle du cristal natif et de la densit lectronique pp de la sous structure des atomes lourds Cette propri t se traduit sur les facteurs de structure par la transform e de Fourier et l isomorphisme conduit l galit Fey Fp Fg o F
428. rimentale sous forme de coefficients d Hendrickson Lattmann Mais aucune diff rence n a t constat e cf Partie I chapitre 2 Je consigne ici le protocole d affinement qui a toujours t appliqu sauf mention contraire Le mod le de d part compl t au maximum dans le programme Coot Emsley et al 2010 l aide de la carte de densit lectronique exp rimentale am lior e par aplatissement de solvant par Solomon et ou DM Ce programme permet de visualiser les cartes de densit lectronique et de reconstruire le mod le dans l espace r el 1 Avant de commencer l affinement trois possibilit s s offrent nous a Si le mod le initial provient du programme Arp Warp son utilisation par d faut conduit a p prog p Warp p la cr ation d un indicateur R free Ce dernier doit donc tre transf r pour l affinement avec Pheniz refine afin de s assurer que les r flexions qui sont utilis es pour valuer le R free soient conserv es b Toujours dans le cas o le mod le initial provient du programme Arp Warp une fois compl t il est aussi possible d effacer toute trace d affinement de ce dernier avant de faire g n rer un nouveau R free par Pheniz refine qui sera celui utilis ensuite Pour cela il est n cessaire de retirer du mod le initial les mol cules d eau les double conformations et de remettre tous les facteurs d agitation thermique aux valeurs de Wilson 30 00 2
429. ring a saturated coordination sphere and the protein of interest through a thio reactive functionality and Silvaggi et al 2007 proposed to use a double lanthanoid binding tag Girard et al 2002 proposed to use gadolinium complexes initially used as contrast agents for magnetic resonant imaging to incorporate lanthanoid ions into protein crystals Seven different gadolinium complexes were studied Girard Stelter et al 2003 These complexes are made of a ligand that surrounds the lanthanoid ions as a cage thus providing the majority of the coordination sphere of the ion More recently we have proposed to use complexes based on dipicolinate DPA pyridine 2 6 dicarboxylate ligands namely the lanthanoid tris dipicolinate complex ions Ln DPA the Eu and Tb complexes being luminescent D Al o et al 2007 Pompidor et al 2008 As previously mentioned lanthanoid salts often damage protein crystals even at low concentration The great advantage of using lanthanoid complexes comes from the fact that the interaction of the lanthanoid ions with the protein occurs through the ligand forming the complexes rather than direct interaction The binding mode of the various used complexes to the protein turned out to depend on the nature of the ligand Girard Anelli et al 2003 These complexes can be introduced in protein crystals either by co crystallization or soaking and can be used at rather high concentration 50 to 100 mM The
430. ristal d riv avec 2 7 mM de complexe Tableau 4 22 163 4 6 LE LN HMTDPA 3 UN COMPLEXE MODULABLE Eu HECTDPA 3 HEWLcc_ cristallisation HEWlheo cristallisation HEWlLeo cristallisation Rapport Qt de compress 5 87 14 92 17 91 Code RCSB PDB 4BAP R solution A 34 47 1 36 38 69 1 94 38 75 1 21 Rwork 13 86 17 75 15 81 Rfree 17 29 20 22 17 83 Nbre de r flexions utilis es 25342 16468 68533 Composition nbre d atomes Prot ine 1113 1105 1100 H20 171 111 146 Ions 11 12 11 Ligands 100 76 4 Res hors Ramachandran 0 0 0 Ecarts types globaux Liaisons 7 on gueurs A 0 018 0 005 0 008 Liaisons Angles 0 278 0 900 1 253 Bmoyen prot ine A 14 70 15 54 13 35 Brin prot ine A 5 9 4 9 6 50 Bmax prot ine 37 35 54 06 42 98 Bmoyen eau A 28 80 27 26 27 40 Bmoyen ions lanthanide A 15 62 19 89 11 63 Bmoyen ligands A 23 04 15 30 17 00 Site Locc 62 48 62 Site 2 occ 4 Tableau 4 22 R sum des statistiques d affinement de la structure du HEWL avec le Ln HECTDPA 3 Description du mode de fixation du Eu HECTDPA la surface de HEWL Description des interactions impliqu es par le 1 ligand Avec la mol cule de r f rence en vert le premier ligand ne cr e plus la liaison hydrophobe CH x entre son cycle triazole et le cycle benz nique du noyau indole du Trp1
431. ristallin Le premier complexe y tablit donc des liaisons supramol culaires avec deux mol cules de lysozyme dans le cristal Je d cris ici le site de fixation du complexe dans un cristal de lysozyme obtenu par co cristallisation Dans la suite du manuscrit il est probable que nous utilisions les termes Site 1 ou Site Trp123 pour qualifier ce site de fixation L unit de l ensemble des distances indiqu es dans les figures est l angstr m Site 1 description de l interaction du premier ligand avec la prot ine Un groupement hy droxymethyltriazole est reli la prot ine de r f rence par une interaction hydrophobe CH r entre son cycle triazole et le cycle benz nique du noyau indole du r sidu Trp123 Figure 4 19 La distance me sur e entre les deux cycles est de 3 3 De plus un de ses groupements carboxylates tabli une liaison hydrog ne avec le groupement NH de la Lys33 de la mol cule de r f rence Une double conformation a pu tre mod lis e pour cette lysine qui d crit la position de sa chaine lat rale en pr sence et en absence du complexe leur taux d occupation respectif tant en accord avec celui du complexe Enfin ce m me ligand est li la mol cule de r f rence par sa fonction hydroxyle et la fonction carboxyle de l Asp119 via une mol cule d eau Pour la suite du manuscrit nous nommons ligand 1 ce ligand qui tablit la liaison CH r avec la prot ine Figure 4 19 Mod
432. rmin l aide des cartes de Patterson anomales 120 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Anomalous Patterson Level 1 5 signe step 0 5 signa al A Scale Section 161 0 26 2 0000 asy HEWL_TeDPAp_ce_pk Anomalous Patterson sap a Carte de Patterson anomale section de Harker w b du cristal d riv de HEWL avec le Tb HMTDPA 3 jeu de donn e n 1 MAD co cristallisation Anomalous Patlerson Level 1 6 sigas step 0 5 signe Anomalous Patterson Laval 1 4 sigma stop 05 signa L A vane re Seale 20000 ey Section za 0 26 Lysa Yo MelcPl Ball Anonaloss Patterson aap b Carte de Patterson anomale section de Harker w i du cristal d riv de HEWL avec le Yb HMTDPA 3 jeu de donn e n 3 MAD co cristallisation van Seale 2 0000 maya HEVL_BeOPAp_trp_10aM_Bu Anomalous Patterson sap Section 16 0 26 c Carte de Patterson anomale section de Harker w i 4 du cristal d riv de HEWL avec le Eu HMTDPA 3 jeu de donn e n 5 SADEuz trempage Figure 4 15 Cartes de Patterson anomales calcul es partir des jeux de donn es de diffraction n 1 n 3 et n 5 enregistr s sur des cristaux d riv s de HEWL avec le complexe Ln HMTDPA 3 gt La figure 4 15 montre que le diffuseur anomal est tr s facilement d tectable dans les c
433. rmophilic adenylate kinases J Biol Chem 279 28202 28208 Madern D Ebel C Dale H A Lien T Steen I H Birkeland N K amp Zaccai G 2001 Differences in the oligomeric states of the LDH like L MalDH from the hyperthermophilic archaea Methanococcus jannaschii and Archaeoglobus fulgidus Biochemistry 40 10310 10316 Okemefuna A I Nan R Gor J amp Perkins S J 2009 Electrostatic interactions contribute to the folded back conformation of wild type human factor H J Mol Biol 391 98 118 Kabsch W 1993 Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants J Appl Crystallogr 26 795 800 Matthews B W 1968 Solvent content of protein crystals J Mol Biol 33 491 497 McCoy A J Grosse Kunstleve R W Storoni L C amp Read R J 2005 Likelihood enhanced fast translation functions Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 61 458 464 Adams P D Afonine P V Bunk6czi G Chen V B Davis I W Echoo N et al 2010 PHENIX a comprehensive Python based system for macromo lecular structure solution Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 66 213 221 Emsley P Lohkamp B Scott W G amp Cowtan W 2010 Features and development of Coot Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 66 486 501 Chen V B W Arendall B Headd J J Keedy D A Immormino R M Kapral
434. rococcus horikoshii three different open reading frames coding for TET homologous proteins were identified These were named PhTET1 2 and 3 Their three dimensional structures were determined Franzetti et al 2002 Russo amp Baumann 2004 Borissenko amp Groll 2005 Schoehn et al 2006 Dura et al 2009 It has been shown Schoehn et al 2006 that PhTET1 assembles as a tetrahedral dodecameric particle called PhTET1 12s for the 444 kDa assembly made up of 12 sub units or as an octahedral tetracosameric edifice called PhTET1 24s for the 888 kDa assembly made up of 24 sub units Since the TET particles are highly symmetrical molecular edifices formed by a single type of subunit they provide an excellent model for probing the phasing capacity of different lanthanoid complexes Moreover the currently available TET crystallographic structures do not permit detailed analyses of the particles interior The polypeptide trafficking and the processing mechanisms by the TET particles remain therefore unclear In this paper we show that low resolution experi mental phase obtained with tris dipicolinate complex can provide novel structural information on the PhTET1 12s complex 2 Materials and methods 2 1 Materials The expression of TET1 12s from P horikoshii in Escher ichia coli its purification and initial crystallization assays will be described elsewhere Dura et al 2010 Na3 Eu DPA s3 6H O complex where DPA stands for
435. rotection R 25 glyc rol parafine k a Cristaux natifs de HEWL b Conditions de cristallisation et de cryo protection amp 1330x200 pm 380x240 pm Figure 4 7 Cristallisation et cryo protection du lysozyme de blanc d ceuf de poule 4 2 2 2 Obtention des cristaux d riv s Des cristaux d riv s de HEWL ont pu tre obtenus par trempage et par co cristallisation avec le Ln HMTDPA 3 dans les m mes conditions de cristallisation que la prot ine native mais dans la partie haute de la gamme de concentration en NaCl Figure 4 8 En co cristallisation comme observ pour les cristaux d riv s de HEWL avec le complexe Ln DPA 3 Pompidor et al 2010 la nucl a tion se produit partir d un pr cipit blanch tre et dense qui se forme d s l ajout du complexe dans la goutte Ce dernier disparait progressivement au fur et mesure que les cristaux croissent 108 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 0 9 1 5 M NaCl 100 mM ac tate de sodium pH 4 6 Plstock 20 mg mL C stock 30 75 mM Goutte 1 5 pL P 1 5 pL R 1 5 pL C ou 2 uL P 2 pL R 1 pL C ou 2 pL P 5 pl R 2 pL eau MQ 1 pL C T 293 K 20 C 5 1 3 1 5 M NaCl 15 jours 0 9 M NaCl Cryo protection R 25 glyc rol parafine a Cristaux d riv s de HEWL z b Conditions de cristallisa
436. rticule TET Dura et al 2009 Ainsi dans le but d obtenir de nouvelles information structurales quant cette zone d importance il est pr vu d essayer d obtenir des donn es de diffraction une r solution sup rieure Pour cela on peut tenter d obtenir des cristaux d riv s par trempage dans une solution concentr e en complexe Eu DPA 3 ou obtenir des cristaux d riv s de PhTET2 ou PhTET3 qui pourraient conduire de nouvelles informations exp rimentales 202 electronic reprint Journal of Synchrotron Radiation ISSN 0909 0495 Editors G Ice Kvick and T Ohta Using lanthanoid complexes to phase large macromolecular assemblies Romain Talon Richard Kahn M Asuncion Dura Olivier Maury Fr d ric M D Vellieux Bruno Franzetti and Eric Girard J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 This open access article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Licence http creativecommons org licenses by 2 0 uk legalcode which permits unrestricted use distribution and reproduction in any medium provided the original authors and source are cited Synchrotron Radiation Synchrotron radiation research is rapidly expanding with many new sources of radiation being created globally Synchrotron radiation plays a leading role in pure science and in emerging technologies The Journal of Synchrotron Radiation provides comprehensive coverage of the entire field of synchro
437. ructures seront disponibles Il est noter que l quipe d j en main la production et la purification d autres MalDHs aux propri t s de surface probablement diff rentes comme la MalDH de l arch e alkalophile halophile Natrialba magadii celle de la bacterie pi zothermophile Thermoaerobacter marianensis ou encore celle de la bact rie hyperacidophile Methy lacidiphilum infernorum Cette analyse et celle des sites secondaires permettront ensuite de d terminer si les r sidus en amont et en aval de l acide amin impliqu principalement dans l interaction module la fixation et de quelle mani re Enfin l influence de la composition de la solution de cristallisation pourra tre corr l e au site de fixation Par exemple la pr sence de forte concentration en sels renforcera les interactions de type hydrophobe alors que ces m mes interactions seront att nu es en pr sence de PEG La possibilit de disposer de plusieurs conditions de cristallisation diff rentes comme c est souvent le cas pour les MalDHs permettra de d terminer finement l influence de la composition de la solution de cristallisation A titre d exemple nous avons vu l importance des liaisons hydrog nes et des liaisons ioniques pour la fixation des complexes liaisons hydrog nes entre la fonction acide des ligands dipicolinates et la fonction amine des acides amin s arginine et lysine liaisons ioniques entre l ion lanthanide et le groupement acide des aci
438. ruits Tableau 7 4 M me constat pour PtMalDH ou le phasage de novo a conduit la construction automatique de 634 acides amin s sur 648 Tableau 7 5 Comme nous l avons pr c demment indiqu le programme ANODE a t utilis pour confirmer le nombre de sites Dans le cas de HvMalDH le calcul des phases n a pu se faire par les m thodes de phasage exp rimental nous avons eu donc recours au remplacement mol culaire selon le protocole indiqu dans l introduction Tableau 7 6 220 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Phasage exp rimental des donn es CaMalDH avec le complexe GGHPDO3A GdHPDO3A CaMalDH Type de donn es SADGura R solution 20 61 1 67 1 76 1 67 37 62 31 17 30 31 22 19 Pics Pic k o Fa Pi soufre pk 9 22 16 20 69 19 85 15 41 12 24 FOM harp f FOM harp 0 338 0 028 Nombre de sites 8 R solution FOM c 0 5 A 3 30 De eee LIT 0 00 SIGMAA solomon 0 73 Arp Warp construit total 592 618 Tableau 7 4 Statistiques de phasage exp rimental de CaMalDH avec le complexe GdHPDO3A La figure 7 7 met en vidence la pr cision de la carte exp rimentale am lior e par aplatissement de solvant qui a permis la construction automatique de 95 8 du dim re A D contenu dans l unit asym trique Figure 7 7 Carte de densit lectronique exp rimentale am lior e p
439. rystal 222 symmetry Fig 1 The final Sr MalDH model shows a fold previously observed for enzymes of the LDH MalDH family composed of two topological domains a dinucleotide binding domain and a catalytic domain Sequence identities between Sr MalDH and Tt LDH between Sr MalDH and Ca MalDH and between Sr MalDH and Hm MalDH are 35 53 and 34 respective ly while structural similarities as measured by RMSD are 1 21 0 60 and 1 07 A respectively for 210 258 and 216 superimposed C atoms Weak electron density occurs in two short regions of the Sr enzyme Consequently the model does not include the two carboxy terminal residues or as frequently observed in crystal structures of LDHs and MalDHs Structural Analysis of MalDH from S ruber Interface A B or D C Central cavity Catalytic pocket Interface Protein surface solvent 495 Fig 1 Left panel Schematic drawing of the tetrameric state of LDH and LDH like MalDH Each monomer is labeled A B C or D In the present study several biochemical properties of the halophilic Sr LDH like MalDH are analyzed with respect to several structural features the nature of the various interfaces A B or B C that play a role in the quaternary structure the protein surface and the catalytic pocket Right panel C ribbon drawing of the tetrameric Sr enzyme The tetramer has three dyads named P Q and R following the convention of Rossmann a flexible loo
440. s base de PEG S appuyant sur la litt rature nous avons retenu et am lior les conditions d crites par Satoshi Murakami Murakami et al 2002 qui conduisent de tr s beaux cristaux d EcAcrB Figure 8 3 5 20 PEG 2000 40 mM Citrate de sodium pH 5 6 10 mM Phosphate de sodium pH 6 2 P 12 mgmL Goutte 1 0 pL P 1 0 pL R T 293 K 20 C 48 heures a Cristaux natifs de b Cristaux natifs de c Conditions de cristallisation 6 mg mL to EcAcrB 120 6 mg mL EcAcrB 130 x 100 pm pour le plus gros x 110 pm Figure 8 3 Premi res conditions de cristallisation d EcAcrB utilis es Le volume de solution dans les puits est ici de 500 pL 8 2 2 2 Cryo protection des cristaux avant l tape de diffraction des rayons X Dans le processus qui conduit de la production de la prot ine la diffraction la cryo protection des cristaux natifs d EcAcrB est l tape la plus d licate Bien que de tailles cons quentes les cristaux sont tr s sensibles aux variations de concentrations lors des trempages et ils sont souvent pi g s dans 274 CHAPITRE 8 ACRB LA PROT INE MOD LE MEMBRANAIRE PUTATIVE un filet lastique tr s r sistant constitu de d tergent et de prot ine non cristallis e rendant ainsi la p che difficile Figure 8 3b La m thode de Klaas M Pos s est av r e la meilleure Avant la vitrification en azote liquide un cristal est tremp
441. s tallisation form e par le robot Toutes les valeurs des concentrations indiqu es correspondent celles calcul es to c est dire au moment o la goutte de cristallisation est form e Pour retrouver la valeur des concentrations respectives des chantillons apport s au laboratoire HTX il faut donc multiplier les valeurs indiqu es par le facteur de dilution de 2 Pour les gouttes contenant la fois la prot ine et le com plexe Ln DPA s3 nous avons fait en sorte que la concentration en complexe to soit la m me que celle lors d une exp rience de co cristallisation en laboratoire La solubilit du complexe Ln DPA 3 temp rature ambiante tant de 220 mM lorsque nous ajoutons un volume de solution de complexe sur une goutte form e par un m me volume de liqueur m re et un m me volume de solution de prot ine le facteur de dilution est to de 3 Dans la goutte la concentration est donc d environ 73 mM Ce tableau 3 2 indique aussi la composition du tampon dans lequel chaque prot ine tait stock e avant l experience ceci pour eventuellement correler les r sultats de cristallisation avec cette compostion si cela s averera necessaire 85 3 1 MISE EN PLACE DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATIS E Experience Goutte Concentrations dans la goutte to Tampon de stockage de la prot ine 1 4 mg mL EcAcrB EcAcrB 10 m
442. s Ceci cr e des lacunes dans les couches internes qui sont alors de nouveau combl es par des lectrons de couches de plus haute nergie En venant combler ces lacunes ces lectrons mettent un rayonnement caract ristique de l l ment la fluorescence Tout en faisant varier la longueur d onde autour du seuil d absorption de l l ment c est cette fluorescence qui est enregistr e pour r aliser les spectres d absorption La fluo rescence est proportionnelle l absorption Les facteurs de diffusion anomaux f et f sont calcul s partir de ces spectres d absorption l aide du programme CHOOCH Evans and Pettifer 2001 44 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE 0 10 20 0 08 0 06 L l u Anomalous scattering factors 0 02 000 0 7220 0 7240 0 7260 0 7280 0 7300 0 7320 0 7220 7240 7260 7280 7300 Energy eV X ray Energy eV Figure 1 4 Spectre d absorption enregistr en mode fluorescence sur la ligne BM30A de VESRF sur une solution de 100 mM de complexe de gadolinium au seuil d absorption Ly7 du Gd gauche Facteurs de diffusion anomaux f et f du gadolinium en fonction de l nergie du rayonnement incident calcul s par le programme CHOOCH a partir du spectre d absorption a droite 1 3 2 Les raies blanches Le spectre d absorption d un atome pr sente parfois un pic marqu appel raie blanche Ce ph n
443. s cristaux de sym trie monoclinique l introduction du complexe Eu DPA 3 a conduit l apparition de cristaux de sym trie cubique En tablissant des interactions hydrog nes et hydrophobes de type empilement z avec plusieurs mol cules dans le cristal interactions supramol culaires le complexe Eu DPA 3 peut provoquer un changement de groupe d espace tel que d crit dans la premi re partie de ce manuscrit Toutefois dans le cas des cristaux d riv s de PhTET1 12s il semble que l origine du changement de groupe d espace ne soit pas due de telles interactions En effet bien que la r solution ne permette pas la mod lisation compl te du complexe on peut voir que lion Eu est situ entre deux monom res proximit du pore large de la particule Or ces deux monom res forment le dim re suppos tre l unit de base de la particule enti re Ainsi le complexe tant li l int rieur de ce bloc de base ne peut pas influencer directement l empilement cristallin Une explication possible du changement de groupe d espace est que la fixation du complexe Eu DPA 3 induit un l ger changement dans la conformation globale du protom re de PhTET1 12s qui conduit la croissance des cristaux cubiques De plus la qualit de la carte de densit lectronique obtenue permet de situer le complexe non loin d une boucle que l on suppose indispensable pour l adressage du substrat vers la chambre catalytique de la pa
444. s il est inutile de d tailler les diff rentes modifications apport es chacune de ces tapes 8 3 1 R sum des modifications apport es au protocole de purification d EcAcrB Dans l optique d obtenir des cristaux d EcAcrB diffractants une r solution suffisante je me suis permis de modifier le protocole de purification selon deux grands axes le changement de d tergent utilis et l adjonction de sel lors de la purification dans la solution de stockage de la prot ine L autre d tergent choisi est celui pr conis dans la litt rature le 6 Cyclohexyl beta D maltoside ou CHM aussi connu sous le nom commercial de Cymal 6 Ainsi quatre protocoles de purification s appuyant sur le protocole initial ont t men s de conserves Solubilisation et purification en pr sence de d tergent DDM sans NaCl identiques celles d crites pr c demment Solubilisation et purification en d tergent DDM avec 200 mM NaCl Solubilisation et purification en d tergent CHM sans NaCl Solubilisation et purification en d tergent CHM avec 200 mM NaCl Comme nous le verrons dans la sous section suivante la prot ine purifi e et stock e en pr sence de CHM a conduit de plus beaux cristaux mais la solution de prot ine pure semble moins stable 4 C qu avec le detergent DDM En effet apr s trois semaines de conservation un pr cipit blanch tre s dimente au fond du tube de stockage Bien que le chlorure de
445. s inconv nients inh rents aux conditions d utilisation de ce complexe Au cours de ma recherche cette tude s est retrouv e toff e par le d veloppement de deux nouveaux complexes luminescents d riv s de ce tris dipicolinate de lanthanide Aussi je pr senterai donc une seconde tude men e sur ces nouveaux complexes nomm s tris triazoledipicolinate de lanthanide Enfin je pr senterai les travaux pr liminaires r alis s sur un complexe cag le triazonanetripicolinate de lanthanide Cette premi re partie est donc consacr e aux d veloppements entrepris au sein de la famille des complexes luminescents bas s sur le ligand picolinate Le second aspect de ce travail est la fois m thodologique et appliqu L objectif est ici de d montrer que l utilisation des complexes de lanthanide peut s tendre aux prot ines multim riques de grande taille tant le signal anomal mis par les lanthanides est important et tant la fixation permise par les ligands est forte Ceci sera mis en vidence dans le cas de prot ines issues d organismes extr mophiles telles que 23 INTRODUCTION GENERALE les malate d shydrog nases homot tram riques et l aminopeptidase homodod cam rique t tra drique PhTET1 12s de Pyroccocus horikoshii Enfin dans cette seconde partie nous poserons les bases d une nouvelle approche pour approfondir notre connaissance des modes de fixation des complexes issus de l imagerie m dicale
446. s alors que le complexe Eu HMTDPA 3 se lie non seulement par ce type d interaction mais aussi par des interac tions de type m n et CH n Je tiens 4 remercie ici le Dr Eric Condamine pour avoir si bien accueilli avec dynamisme et bonne humeur ce projet et pour avoir r alis les exp riences de RMN proprement dites Toujours par soucis de ne pas alourdir davantage ce manuscrit je ne d crirais cependant pas l in t gralit des exp riences r alis es et seul un r sultat pr liminaire sera pr sent a titre de preuve de concept 11 2 1 Br ve description du principe th orique Nous avons utilis ici une exp rience de RMN bidimensionnelle la s quence NOESY Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY Elle permet de d terminer les corr lations par couplage spatial entre deux noyau lectroniques espac s de moins de 5 Cette m thode permet par exemple de distinguer deux hydrog nes proches dans l espace NHget NH de deux hydrog nes pouvant tre s par s par de nombreuses liaisons mais proche dans l espace par repliement de la mol cule Dans le cadre de notre exp rience nous mesurons l influence de la distance moyenne entre l atome paramagn tique l atome de lanthanide et son voisinage au cours du temps Cette influence est visible sur un spectre RMN 2D sous forme de t che de corr lation ou raie Comme les mesures se font au cours du temps par RMN il est donc aussi possible d avoir une
447. s coordonn es x y z des diffuseurs anomaux peuvent tre d duites des coordonn es u v w des pics des sections de Harker La coh rence du r sultat est v rifi e par inspection des pics crois s Alors que pour un faible nombre de sites anomaux on peut interpr ter soi m me une carte de Patterson on utilise g n ralement des programmes de d tection des sites des atomes lourds 1 2 3 4 Choix du protocole de d termination des positions des diffuseurs anomaux Diff rents programmes permettent de rechercher les positions des diffuseurs anomaux dans un cristal partir de donn es SIR MIR SAD SIRAS ou MAD Le programme ShelrD Sheldrick 2008 qui s appuie entre autre sur les m thodes de d convolution de Patterson est le programme le plus connu pour le phasage de novo Il existe aussi le programme Shake n Bake Miller et al 2007 qui s appuie sur des m thodes similaires Au cours de cette th se nous avons utilis le programme ShelrD en compl ment du programme HySS Hybrid Substructure Search de la suite Phenix Grosse Kunstleve and Adams 2003 pour la d termination des atomes lourds Le programme ShelxD regroupe les deux m thodes interpr tation de la carte de Patterson dans l espace r ciproque puis utilisation des m thodes directes Apr s identification 33 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE des sites nous avons v rifi la correspondance entre les pics calcul s et ceux observ s dans la cart
448. s de ces derniers ont t test s pour obtenir des cristaux d riv s Figure 2 1 67 2 1 LES COMPLEXES DE LANTHANIDE ISSUS DE L IMAGERIE M DICALE ue 3 Le N HN N N N N Le iw WS Sy o o o HO CH o CH3 fe a LnDO3A neutre b LnHPDO3A neutre c LnDOTMA e Q oO n HC o ui P La N N 2 b oS l E O Ba RU Le d LnDOTA e LnDOTA BOM Er TG Yet LnDTPA2 g LnDTPABMA en Figure 2 1 Complexes issus de l imagerie par r sonance magn tique D finition des ligands DO3A acide 1 4 7 10 tetraazacyclododecane 1 4 7 triac tique masse mol culaire th orique de 343 36 g mol 1 DOTA acide 1 4 7 10 tetraazacyclododecane 1 4 7 10 tetraac tique 400 39 g mol HPDO3A acide 10 2 hydroxypropyl 1 4 7 10 tetraazacyclododecane 1 4 7 triac tique 401 44 g mol DOTMA acide 1 4 7 10 tetramethyl 1 4 7 10 tetraazacyclododecane 1 4 7 10 tetraac tique 456 49 g mol DOTA BOM acide phenylmethoxy methyl 1 4 7 10 tetraazacyclododecane 1 4 7 10 tetraac tique 562 61 g mol DTPA acide ethylene tri amine pentaac tique 388 31 g mol DTPABMA acide 1 3 bis methylamide ethylene tri amine pentaac tique 416 41 g mol Les ligands sont tous des cages qui peuvent ch later un ion Lo A part le ligand lin aire DTPA et ses d riv s tous sont d riv s du macrocycle t tra azacyclodod cane cyclen Ces complexes sont tr s solubles dans l eau gt 500 mM et stables sur une tr s
449. s de cristallisation et de cryo PhTET1 12s 560x180x15 pm PhTET1 12s 120x90x60 pm protection Figure 6 1 Cristallisation et cryo protection de PhTET1 12s 6 3 L effet supramol culaire et le pouvoir phasant du complexe Eu DPA Des donn es de diffraction ont t enregistr es partir des cristaux obtenus en pr sence de Eu DPA s3 VE S R F et sur la ligne de lumi re FIP BM30A La longueur d onde a t choisie au seuil d absorption Lyrrr de l europium pour que la valeur de la partie imaginaire de son facteur de diffusion atomique soit maximale De mani re inattendue l int gration des donn es indiqua le groupe d espace F4132 Ainsi malgr l utilisation des conditions de cristallisation conduisant normalement aux cristaux de sym trie monocli niques la pr sence du complexe Eu DPA 3 a provoqu l apparition des cristaux de sym trie cubique Malheureusement les cristaux ne diffractaient qu 4 A de r solution Toutefois les indicateurs anomaux confirmant la fixation du complexe nous avons d cid de tenter de d terminer la structure sur la base des donn es SAD disponibles Un site de fixation par monom re a t d termin et malgr la r solution de 4 A le phasage a conduit une carte de densit lectronique exp rimentale tout fait interpr table Comme le montre la figure 6 2 la forme g n rale de la particule est facilement reconnaissable et ce sous deux orientations caract ristiq
450. s de lanthanide pour le phasage de prot ines multim riques de grande taille 195 6 L amino peptidase dod cam rique TET1 12s de Pyrococcus horikoshii 199 6 1 L amino peptidase t tra drique dod cam rique PhTET1 12s 199 6 2 Obtentions de cristaux natifs et d riv s 199 17 TABLE DES MATI RES 6 3 L effet supramol culaire et le pouvoir phasant du complexe Eu DPA 3 200 GA Conclusion sas 28 ob eee ty PR RY ch EN Ras ER de pan chide Boa a Bons Be es 202 7 Les malate d shydrog nases issues d organismes extr mophiles 209 7 1 Les malate d shydrog nases pour une tude rationalis e du mode de fixation des com plexes de lanthanide sesti marasi eee ge ee ED a ee ue we ee 210 7 1 1 Cristallisation des diff rentes malate d shydrog nases et obtention de cristaux A TIV S EE qe ns en EL ate h ne dB ye al ee a ee eee 214 7 1 1 1 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Picrophilus torridus 214 7 1 1 2 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Haloferax volcanii 215 7 1 1 3 Cristallisation de la malate d shydrog nase de Chloroflexus aurantiacus 215 7 1 2 L tude de l interaction des trois complexes IRM sur les trois MalIDH 216 7 1 3 Etude de la fixation du GdHPDO3A sur trois MalDH 217 7 1 3 1 L obtention de cristaux d riv s avec le complexe GdHPDO3A 217 7 1 3 2 Int gration des donn es de diffraction
451. s mesur s entre trois mol cules d eau du p rim tre du polygone S gt e7 3 Valeur de sigma n cessaire pour faire dispara tre la densit lectronique d au moins trois mol cules d eau du polygone Valeur qui peut tre interpr t e comme la probabilit d existence du polygone Plus cette valeur est lev e plus l existence de ce polygone la surface de la prot ine est probable Tordu Le polygone s est tordu pour s adapter la surface de la prot ine ou non Qu elle que soit l organisation les distances moyennes permettant une coordination par liaison hydrog ne entre les mol cules d eau ou avec les acides amin s de la surface prot ique sont toujours respect es environ 2 80 0 06 Il en est de m me pour les angles entre trois mol cules d eau L angle est form par l axe d une liaison hydrog ne entre l atome d hydrog ne d une premi re mol cule d eau avec le doublet non liant de l atome d oxyg ne d une deuxi me et l axe de la liaison hydrog ne entre l atome d hydrog ne de la deuxi me et le doublet non liant de l atome d oxyg ne d une troisi me mol cule d eau La valeur moyenne de ces angles est de 107 Weik and Colletier 2010 Tableau 7 27 Dans le cas de r seaux de pentagones ces valeurs peuvent fluctuer l g rement autour de la valeur moyenne mais l ensemble du r seau en s tirant ou en se comprimant maintient un ensemble nergi quement fav
452. s prot ines d pos es dans la Prot in Data Bank appartiennent la classe des m talloprot ines et contiennent naturellement des m taux comme le Cu le Fe le Mn le Ni et le Zn Les seuils d absorption K d un grand nombre de ces m taux sont accessibles avec le rayonnement synchrotron 59 1 7 DES CRISTAUX D RIV S PR SENTANT UN SIGNAL ANOMAL POUR UN PHASAGE DE NOVO et conduisent des valeurs de f pour l atome concern de l ordre de 4 e Ces prot ines se pr tent donc des exp riences MAD ou SAD il est aussi possible d exploiter le signal anomal du soufre contenu dans les acides amin s m thionine et cyst ine Ainsi la premi re structure de prot ine a t r solue en 1981 avec le signal anomal du soufre Hendrickson 1981 Depuis 1999 un certain nombre de structures ont t r solues par la m thode SAD en se servant uniquement du signal anomal du soufre Ramagopal et al 2003 Lakomek et al 2009 Koch et al 2010 Doutch et al 2012 Toutes les prot ines contenant des acides amin s cyst ine ou m thionine contiennent du soufre Ces deux acides amin s repr sentent en moyenne 4 des acides amin s Il est possible utiliser la diffusion anomale du soufre une longueur d onde hors de son seuil d absorption le seuil K du soufre tant 5 02 A Toutefois la diffusion anomale du soufre des longueurs d onde habituelles est tr s faible Comme f augmente avec la longueur d onde utilis
453. s r guli res que ceux obtenus avec la combinatoire 6 aucun jeu de donn es de diffraction interpr table n a pu tre enregistr Tableau 4 27 Ceci prouve que m me en faible quantit le complexe Eu HMTDPA 3 a une telle affinit pour la prot ine qu il peut entrer en comp tition avec le Eu DPA 3 au point d emp cher l effet supramol culaire Eu DPA 3 ce dernier tant pourtant introduit en large exc s 4 7 2 4 La combinatoire 8 avec m lange de deux complexes dissemblables le Eu HMTDPA et le GdHPDO3A M lange d une solution de complere Eu HMTDPA 3f 15 mM avec une solution de complexe GdHPDO3A 240 mM Combinatoire qui met en comp tition les deux complexes ayant une forte affinit pour le HEWL et la TdTHAU En utilisant conjointement les complexes Eu HMTDPA 3 et GdHPDO3A des concentrations suffisantes pour qu il se fixent la prot ine respectivement 5 mM et 80 mM nous provoquons donc une comp tition de site entre ces deux complexes radicalement diff rents Lors de l enregistrement de donn es de diffraction des cristaux d riv s de HEWL avec ce m lange se placer au seuil d absorption Lyrr de l europium 1 774 teint partiellement le signal anomal du gadolinium car son seuil d absorption Lyrr est lui de 1 709 Ainsi au seuil Lyrr du Gd le signal anomal du Eu et du Gd sont d tect f de 10 e et 30 e7 respectivement alors qu au seuil L777 du Eu seul le signal anomal
454. s sa forme homodod cam rique de 444 kDa au sein du groupe E L M A s est av r une candidate de choix pour illustrer le pouvoir phasant des complexes de lanthanide Nous verrons dans ce chapitre que cette amino peptidase illustre d une part le pouvoir phasant des lanthanides partir de donn es basse r solution et d autre part les capacit s supramol culaire du complexe tris dipicolinate d europium M appuyant sur la publication ajout e la fin de ce chapitre je ne ferai ici qu un r sum de cette tude 6 1 L amino peptidase t tra drique dod cam rique PhTET1 12s L amino peptidase TET a initialement t isol e chez l arch e Haloarcula marismortui Franzetti et al 2002 Dans le g nome de l arch e Pyrococcus horikoshii trois g nes distincts codant des prot ines homologues de HmTET ont t identifi s Elles ont t nomm es PhTET1 2 et 3 Leurs structures tridimentionnelles respectives ont t d termin es Russo and Baumann 2004 Borissenko and Groll 2005 Schoehn et al 2006 Auto compartiment es ces prot ines forme des assemblages douze sous unit s ou 24 sous unit s nomm s TET 12s et TET 24s respectivement Schoehn et al 2006 Au sein de la cellule elles participent la d gradation de polypeptides qui sont dans le cas de PhTET1 12s hydrophiles et de petite taille La forme octa drique icositetraedrique PhTET 24s permettrait de d grader des polypeptides de ta
455. s vers des tats d nergie plus lev e I en r sulte un changement de phase entre le rayonnement incident et le rayonnement diffract La composante imaginaire du facteur de diffusion f est reli e au coefficient lin aire d absorption f A par le th or me optique Mie 1908 qui peut s crire Mpl r 2AroNap avec K le coefficient de proportionnalit K NS le rayon classique de l lectron ou longueur de diffusion Thompson 2 m 4negmoc la longueur d onde du rayonnement incident M la masse molaire de l l ment Na le nombre d Avogadro p la masse volumique de l l ment 42 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Cette relation permet d obtenir les variations de f selon l nergie du rayonnement partir des variations du coefficient d absorption Les variations de f avec l nergie tant connues on obtient f partir de l quation de dispersion de Kramers Kronig Kronig 1926 Kramers 1927 ae E E 2p O avec P valeur principale de Cauchy Nous rappelons ici que si nous utilisons maintenant le terme nergie pour qualifier le rayonnement incident plut t que d utiliser sa longueur d onde c est que ces deux composantes sont facilement calculables car li es par la relation du spectre lectromagn tique E avec E V nergie du rayonnement lectromagn tique h
456. se si d sopilante Gaby Hellio aux grands yeux bleus Zouki Lebrouc et So Foret Alex Appolaire biochimiste culinaire ou tout court et photographe de talent Les Perrault Mat thieu du m me nom et Aurore Laurendeau Alex Regnault Anne Obermann et La planous Thomas Planes mon d pressif pr f r Guigui Bacques Antonin Kermen Blandine Boue Mimi Lafabrie Pinou Daphna Fenel Francesca Mastropietro Gildas Mainsant les bonnes id es c est de famille merci d tre aussi venu faire une th se Grenoble mon ami allemand Holger Euchner Stephane Chavand Isabelle Gauvin Clotilde Effantin Jeannot Letort Julien Trepcu Lauris Chaumond Marcio Lolotte et Warody Lombardi les bonnes id es c est finalement breton merci d tre aussi venu s installer Grenoble Antoine Licinio Woltech Thomas Cutuil mon biophysicien militant Les Rupin Matthieu et Sandy Myriam de l Ardoise Nicolas Rihet et Laurene Huck Pierre Bottelin Pierre Bou Romain Jolivet Sivan Yann Huon de Kermadec Thierry Max Ahmad Sultan Anne So Couvent Arnaud et Laureen mes premiers voisins de palier qui sont partis en nous donnant leurs snowboards Je remercie tout particuli rement Marie Charlotte qui s est d brouill e pour me concocter un si d licieux et si savoureux pot de th se Un autre remerciement tout particulier adress ma voisine de palier Sylvette Maniguet qui s est donn la peine de corriger mon r sum de th se
457. sence de Eu DPA Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA J O Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 3 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de EcAcrB avec le complexe Eu DPA 3 E Cristaux d riv s E Cristaux de sel de Eu DPA Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA M Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA Figure 3 4 Bilan statistique des observations suite l ajout du complexe Eu DPA s3 en co cristallisation avec EcAcrB 3 2 2 Co cristallisation de la prot ine AVEGFP avec le complexe Eu DPA Les m me essais de co cristallisation ont t men s avec la prot ine AVEGFP 91 3 2 LES OBSERVATIONS ISSUES DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATISEE AVEC LE EU DPA 3 gt Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs Cristaux de sel de Eu DPA J E Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA O Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 5 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de AvEGFP avec le complexe Eu DPA 3 E Cristaux d riv s M Cristaux de sel de Eu DPA E Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA F
458. seurs anomaux qui fait qu haute r solution les r flexions sont beaucoup moins intenses et que leur intensit est mesur e avec une pr cision moindre que celle des r flexions basse r solution On peut ainsi choisir de limiter la r solution d un jeu de donn es de diffraction pour conserver un bon rapport signal anomal sur bruit 1 5 3 L importance du rapport signal sur bruit Pour que le signal anomal soit significativement sup rieur l impr cision des mesures il faut am liorer l exactitude des mesures exactitude qui peut se mesurer par le rapport signal sur bruit I o 1 Le rapport signal sur bruit d pend de la qualit du cristal mais il d pend aussi des conditions d enregistrement un temps de pose lev et donc un nombre lev de coups Ne par r flexion am liore la pr cision statistique des donn es le rapport signal sur bruit est approximativement proportionnel VN Id alement le rapport signal sur bruit doit rester sup rieur 2 jusque dans la derni re tranche de r solution 1 5 4 L importance de la redondance des donn es Elle correspond au nombre de fois qu une r flexion unique a t enregistr e Augmenter la redon dance des donn es permet d am liorer non seulement la pr cision statistique des mesures mais aussi et surtout le rapport signal anomal sur bruit en liminant les erreurs syst matiques dues aux artefacts de l exp rience Dauter et al 2002 C
459. smiques Pour solubiliser les prot ines membranaires contenues dans les fractions de membrane interne nous utilisons le d tergent amp DDM Le d tergent n Dod cyl maltoside a un poids mol culaire de 510 g mol et une Concentration Micellaire Critique CMC concentration partir de laquelle apparaissent les micelles de d tergent de 0 17 mM 0 0087 dans l eau et de 0 12 mM 0 0062 dans une solution de 0 1 M NaCl Zulauf 1991 Ce d tergent est particuli rement utilis pour la solubilisation des prot ines membranaires de la membrane interne des bact ries Gram n gatif En formant des micelles dans lesquelles les parties transmembranaires des prot ines viennent se loger les d tergents cr ent une bou e qui vitent l agr gation du fait de ces parties hydrophobes Pebay Peyroula et al 1995 Penel et al 1998 3 mL de la solution de fractions membranaires 30 mg mL sont dilu s dans 10 mL d un tampon D 50 mM Tris HCl pH 7 0 10 mM imidazole pH 7 0 10 glyc rol 2 DDM et un demi comprim de cocktail de prot ases cOmplete sans EDTA des laboratoires Roche La solution r sultante est mise 4 C sur tourniquet pendant 1 heure Elle est ensuite soumise une ultracentrifugation 1 heure 29000 t p m 4 C qui permet de culoter les bouts de membranes et les prot ines non solubilis es On r cup re donc le surnageant contenant les prot ines membranaires en micelles de d tergent
460. soit optimale des erlenmeyer de 5 L pour contenir 1 L de culture ont t syst matiquement utilis s Voici le protocole pour 1 L de culture 1 L de milieu YT 100 pg mL d ampicilline volume de pr culture ajouter pour que la densit optique th orique de d part pour chaque erlenmeyer soit de 0 1 incubation 25 C 200 tpm jusqu ce que DO amp 0 7 3h40 4h induction avec 1 mM IPTG incubation 4 25 C 200 tpm pendant au moins 5 h centrifugation 4 4 C 5000 tpm pendant 30 min L induction de 4 L de culture au moment ot la DO atteint une valeur de 0 65 permet d obtenir environ 8 g de culots bact riens vert fluo Ces culots peuvent tre conserv s 20 C dans des tubes Falcon de 50 mL 10 2 2 4 Lyse cellulaire Les culots bact riens ont t resuspendus dans 50 mL du tampon de lyse Durant tout le processus de lyse j ai toujours essay de maintenir la suspension basse temp rature en utilisant de la glace Pour lyser les bacteries un Micro Fluidizer a t principalement utilis mais bien que moins efficace la sonication conduit aussi 4 de bons r sultats Au Micro Fluidizer le m me chantillon a subi deux passages sous une pression de 12000 psi A la fin l chantillon doit tre tr s liquide Et afin de maintenir ce dernier le plus froid possible j ai toujours couvert le serpentin du Mirco Fluidizer avec de la glace Faire attention cependant la dilution due au volume mort du Micr
461. sponsible for decreasing the hydrophobic surface between monomers that compose active LDH like MalDH dimers could have been also selected to prevent improper association due to the high salt concentration Another potential solution to the activity problem via increased flexibility is with glycine substitutions and decrease of proline content which has been observed in cold adapted LDH Although similar changes have occurred in Sr MalDH the sum of these various effects change of surface composition decrease of buried hydrophobic interface and increase of local entropy is not enough to have fully optimized the enzymatic efficiency of Sr MalDH at high salt concentrations since the activity is still inhibited by 50 compared to its maximal activity achieved at low salt concentration Our work suggests that the evolutionary process of proteins adapting to high salt concentrations is an ordered sequential trade off between activity solubility and stability to counterbalance the unfa vorable effect of high salt concentrations on enzyme conformational landscape fluctuations In the first step of halo adaptation sequence changes are selected to favor solubility and partially prevent salt inhibition The activity at high salt concentra tions can then be improved further reducing stability and correspondingly increasing the flexi bility required for catalysis 502 Materials and Methods Sample preparation Purifications o
462. st pas diff rent de celui du complexe Eu HMTDPA 3 pr c demment tudi En ce sens la fonction hydroxyethyle seul changement au niveau de la structure n apporte quasiment rien par rapport la fonction hydroxymethyl Dans les cristaux d riv s de lysozyme le Eu HETDPA 3 occupe donc les m mes sites de fixation que le Eu HMTDPA 3 En co cristallisation le premier site est peupl 45 alors qu l emplace ment du second site l absence de densit ne permet pas de placer le diffuseur anomal En trempage le premier site n est plus occup qu 19 alors que le second l est 7 Toutes les observations concernant le mode du fixation du complexe Ln HETDPA 3 la sur face du lysozyme de blanc d uf de poule ont t r alis es partir du cristal d riv obtenu par co cristallisation Site 1 description de l interaction du premier ligand avec la prot ine De la m me fa on que pour le Ln HMTDPA s3 le premier ligand du complexe Ln HETDPA 3 tablit une liaison hydrophobe CH xr entre son cycle triazole et le cycle benz nique du noyau indole du Trp123 La liaison hydrog ne entre l un de ses groupements carboxylates et le groupement NH de la Lys33 est toujours pr sente Ces deux interactions se font avec la mol cule de r f rence en vert La seule diff rence avec 154 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE le ligand HMTDPA r side au nivea
463. ste limit des structures constitu es d environ un millier atomes et pour lesquelles les donn es de diffraction enregistr es sont tr s haute r solution dr so lt 1 2 A Us n and Sheldrick 1999 Utilisant les m thodes de phasage exp rimental nous utilisons les m thodes directes pour rechercher la position d atomes lourds dans un cristal d riv Elles permettent ainsi de d terminer la sous structure qui sert de r f rence pour r soudre la structure de la macromol cule d int r t par phasage exp rimental 1 2 3 D termination de la sous structure par les m thodes de Patterson La d termination de la position des diffuseurs anomaux peut se faire soit par m thode directe soit par m thode de Patterson Patterson 1934 Celle que nous avons utilis e est la m thode de Patterson d crite ici 31 1 2 LES DIFF RENTES M THODES DE PHASAGE 1 2 3 1 La fonction de Patterson La fonction de Patterson est d finie comme le d veloppement en s rie de Fourier des intensit s mesur es exp rimentalement I F h P u F h exp i27h u h avec V le volume de la maille cristalline u ua vb wc vecteur unitaire dans l espace r ciproque En l absence de diffusion anomale par cons quent la loi de Friedel est respect e la fonction de Pat terson devient la fonction d autocorr lation de la densit lectronique p r Pw pr pot mdr Pour des densit s
464. structure has the higher relative B factor Structural Analysis of MalDH from S ruber positions between the two enzymes convey the effects of amino acid substitutions on protein flexibility including glycine and proline substitu tions as was discussed previously According to our calculations there is a net increase of flexibility in Sr MalDH compared to Ca MalDH Fig 5 bottom panel It should be pointed out that flexibilities of various regions surrounding the catalytic vacuole of Sr MalDH are increased in particular the connecting region BJ al1G In the case of LDH it has been demonstrated that increasing the glycine content in this region permits the enzyme to be more efficient Discussion The intermediate nature of the structure and function of Sr MalDH offers new insight into molecular halophilic adaptation The comparison helps to elucidate the specific roles of different types of amino acid substitutions between halophilic and non halophilic enzymes The high KCI concentration induces two types of nonspecific effects on enzyme structure and function that are relevant here First weak protein protein interactions tend to become more attractive due to preferential hydration de creasing protein solubility Second protein stability is increased not only because of preferential hydration but also because the hydrophobic effect is enhanced in high salt The increase in stability is thought to freeze ou
465. structures par uti lisation de la diffusion anomale Cependant tous ne pr sentent pas de raies blanches dans leur seuil d absorption K ou Lyyr Pour les l ments ne pr sentant pas de raie blanche la valeur de la partie imaginaire f du facteur de diffusion atomique est de l ordre de 4 e pour la plupart des seuils d absorption K et de 10 e pour les seuils d absorption L Joyce et al 2010 Ainsi leur d absorption K le s lenium Se et le mangan se Mn ont une contribution anomale f de l ordre de 8 e et 10 e7 respectivement A leur seuil d absorption Lyrr la contribution anomale f des atomes de lanthanide est d environ 30 e7 Tableau 1 1 Pour plusieurs raisons on peut avoir recours des exp riences hors seuil notamment si la longueur d onde du seuil d absorption de l l ment n est pas accessible On peut aussi vouloir enregistrer des donn es hors seuil si dans le cadre d une exp rience MAD on veut atteindre une r solution maximale En effet r solution gale les grandes longueurs d onde imposent des angles de Bragg plus grands la r solution maximale que l on peut obtenir aux bords du d tecteur pour une distance cristal d tecteur donn e est alors souvent inf rieure la limite de diffraction du cristal Pour une position du d tecteur identique travailler une longueur d onde plus courte permet aussi de gagner en r solution Cela est possible car m me hors seuil on conserve une
466. t mis en pr sence de l ion lanthanide Nous avons eu cette d marche afin d augmenter la probabilit d change de ligand autour du lanthanide mais aussi afin de tenter de mod liser le ligand CTDPA En complexant moi m me trois ligands diff rents avec les ions europium en proportion equimolaire je m attendais pouvoir mod liser un complexe totalement hybride Mais le m lange de 1 mM de cette combinatoire avec 0 46 mM de HEWL n a permis d obtenir que des cristaux au faci s tortur La pr sence du ligand CTDPA semble tre r dhibitoire l apparition de cristaux d riv s au profil de diffraction enregistrable Tableau 4 26 174 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Y 9110FBUIQUIOD VI 2948 SNUOJQO syeq Nser sop JeTNyIdeoey QZP Nee qey O 060 Peot NVH LP L ET EU UUMESINS S JoxT as sud m d au Jp amneu as apriqdy x jdwo2 sane BJU C a O 287 onbrun uos red aq D es SPUEST SJ Jospopour Imod 2499 zosse sed 3so u apriqdy sxaduwos tu np uonednss0 p XN 2 adesvyd 2 surad ye pnb uag mee gsn ayvuroord x jdwo np aeqoys asreyp eT ap uepuadap autos amuOUTap suoav snou onb uonexy ap IPO OUTUTSIe souTUTY SIPI So 2948 aUaSOIpAY suOsTET sep SRE AVALE ap XNUISH sap mao g onbauopr SAIDEJ NE snusa qo XNEISIIT quenbydun uonexy ep spour mab vac sep arwez e ap s x jdwo say Inod jourrod au AVHILPL euejord vy UONESMUISH9 09
467. t t fournis s par ment en poudre Nous avons donc pr par le complexe de lanthanide selon la m thode d crite en 4 1 1 Avec ladite m thode j ai pu pr parer en solution les complexes Eu HETDPA 3 et Eu CTDPA s3 une concentration de 4 mM que ce soit dans l eau MilliQ ou dans une solution tampon correspondant aux conditions de cristallisation des prot ines tests Je n ai jamais pu pr parer de complexe de lanthanide avec le ligand EATDPA un pr cipit blanc opaque insoluble apparaissant d s l ajout de la solution de sel de lanthanide sur celle de ligand Il m a t impossible de solubiliser ce pr cipit et ce m me apr s avoir soumis l chantillon de plus hautes temp ratures bain marie 42 C et 60 C et aux ultra sons Quant au ligand avec le motif choline le HECTDPA il m a t fourni en poudre d j complex avec l europium J ai ainsi pu pr parer une solution de Eu HECTDPA 3 une concentration maximale de 35 mM 146 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE OH 9 OH OH N IN I IN Nv Nn D A A A HO C N COH HO C N COH HO C N COH a HMTDPA b HETDPA c CTDPA A NH3 N N N i Z D Za Po HO C N COH HO C N COH d EATDPA e HECTDPAL Figure 4 34 Les diff rents ligands du complexe de lanthanide Ln HMTDPA 3 Voici la nomenclature exacte pour chacun des ligands pr cit s HMTDPA HydroxyMethylTriazoleDi
468. t tre pr sent s nous d crivons ici la d marche qui a t retenue pour ne retenir que les observations pertinentes pour cette tude Cette tude n cessitant l observation et l analyse comparative de 2 x 576 x 4 gouttes pour les quatre premi res prot ines pr cit es et de 3 x 576 x 2 gouttes pour les prot ines AfUox et PhTET1 12s nous avons cibl des profils de goutte afin de ne pas se fourvoyer dans une tude comparative fastidieuse Avec deux gouttes d pos es par puits la premi re ne contenant que la prot ine la seconde contenant la prot ine avec le complexe voici la liste exhaustive des profils de goutte observables 87 3 1 MISE EN PLACE DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATIS E Goutte n 1 prot ine seule Goutte n 2 prot ine et Eu DPA 3 _ gt goutte claire goutte claire gt pr cipit prot ique pr cipit prot ique is eristaix natiis pr cipit prot ique cristaux de Eu DPA s cristaux natifs cristaux d riv s cristaux de Eu DPA 3l cristaux natifs cristaux de Eu DPA s cristaux natifs cristaux d riv s cristaux de Eu DPA s3 cristaux d riv s cristaux natifs cristaux d riv s cristaux de Eu DPA L observation des gouttes deux deux conduisait un trop grand nombre de combinaisons possibles et toutes n taient pas utiles pour cette tude C est ainsi que apr s avoir examin un peu moins de la
469. t J suis mu Mon local pr f r et alter ego Nicolas Martin ainsi qu Agn s Thevenot je vous remercie ici pour tout ce qui ce qui serait ind cent de d crire ici Vous serez toujours les bienvenus c est acquis comme vous le savez d j m me si il n y aura pas toujours du chou Je vous souhaite le meilleur pour la suite Je voudrai remercier mon mentor montagnard celui qui connait mieux la distance entre le sommet de l Obiou et celui du Bonnet de Calvin que le nom de la rue de son bar pr f r Julien Marcoux Merci toi et Mam pour m avoir vad du labo certaines fins d apr s midi caniculaires d aout pour aller plonger dans le lac du Monteynard Merci pour les nombreuses soir es dans la colloc du bonheur Je remercie sp cialement Juliette Trepcu pour tous les bons moments partag que ce soit en tant que compatriote de r daction ou le reste du temps Tu vois l heure o j cris ces lignes je t aime On verra demain si a continue Je tiens aussi remercier Chabrule Eric Chabrol Lydia Caro David amp Maisa Neves pour tous les bons d lires laborantins et les bonnes journ es ensoleill es en Haute Savoie Remerciement particulier Gallou Goret pour ses raisonnements singuliers et pour toutes nos conversations plus qu instructives Un orage bleu lectrique de mercis la divine Corinne Vives pour avoir illumin de sa l gendaire beaut nos journ es laborantines devenant de fait ensol
470. t dans la mesure du possible avec des conditions physico chimiques proches des conditions de cristallisation La difficult laquelle elle a t confront e pour tablir une corr lation entre les observations en solution et celles dans le cristal peut s expliquer par le fait que les complexes n tablissent que des liaisons non covalentes avec des affinit s faibles pour les prot ines Jusqu pr sent nous n avons pas trouv de m thode physico chimique fiable ais e et peu coti teuse permettant de d tecter la fixation des complexes IRM Mais un nouveau complexe exploitant les propri t s de luminescence des lanthanides a pu tre synth tis le tris dipicolinate de lanthanide Sa luminescence dans le visible permet de d tecter sa pr sence dans les cristaux 72 CHAPITRE 2 UTILISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE EN BIO CRISTALLOGRAPHIE 2 2 Un complexe de lanthanide luminescent le tris dipicolinate d eu ropium Dans le cas des complexes issus de l imagerie m dicale au moins une mol cule d eau vient compl ter la sph re de coordination du lanthanide d pla ant la longueur d onde de la fluorescence mise par le lanthanide hors du domaine du visible Contrairement ces complexes dans le cas du complexe tris dipicolinate de terbium ou d europium la luminescence intrins que de ces atomes de lanthanide est mesurable dans le visible L id e de complexes luminescents permettant de d tecter
471. t compar au gain que l on peut escompter En revanche l investissement dans le d veloppement d une tiquette riche en arginine ou en lysine serait acceptable dans le cadre de l utilisation du Ln DPA 3 en tant qu agent de cristallisation en mettant a profit ses propri t s supramol culaires 289 Quatri me partie Annexes 291 Chapitre 9 S paration des prot ines par lectrophor se sur gel de polyacrylamide en pr sence de dod cylsulfate de sodium Je transcris ici le protocole que j ai utilis pour r aliser l ensemble des colorations de prot ines sur gel de polyacrylamide durant ce travail de th se Je n ai utilis que des gels dits d naturant en pr sence du d tergent Dod cylSulfate de Sodium SDS 9 1 Pr paration des gels d naturants de polyacrylamide Dans le tableau 9 1 qui suit je donne la composition des gels d naturants r alis s au cours de ces travaux de th se Le pourcentage d acrylamide requis est donn en fonction de la r solution du gel requise indiqu e en gamme de poids mol culaires pouvant tre s par s Au laboratoire nous utilisons le m lange Laemmli pr par pour la communaut qui contient d ja le tampon Tris HCl et le SDS n cessaire la pr paration des gels de polyacrylamide Le m lange Laemmli est pr par avec 25 mM de Tris Base 192 mM de Glycine et 0 1 SDS p 6 8 10 12 15 20
472. t conformational fluctuations required for catalytic activity Thus the function of a protein placed in a halophilic environment can be improved by a increasing solubility and b increasing flexibility via decreasing stability which restores catalytic activity With Sr and Hm MalDH the solubility problem for the native tetrameric state is solved in two ways First the surface is enriched in acidic amino acids which is well described About half of the acidic residues occur at the same surface positions sug gesting that either both enzymes had a common halophilic protein ancestor with an intermediate acidic surface divergent evolution or there are some specific key surface positions for the location of charge to enhance solubility convergent evolution Our comparison and previous studies show that the acidic enrichment in halophilic proteins enhances both weak repulsive interparticle inter actions and protein solvent interactions Selection of an acidic surface is therefore needed to maintain protein solubility in high salt Second by reducing the external hydrophobic surface of the folded protein hydrophobic protein protein attraction is also diminished The reduction in positively charged residues mainly lysine sometimes observed in halophilic proteins thus improves solubility by both increasing the net negative surface charge and 501 decreasing the hydrophobic surface area of the folded protein In the L
473. t plus glissante Eu HETDPA TdTHAU Rapport Cre to 2 3 Type de donn es MAD R solution A 48 124 1 20 Picsra Picsoufre pk co 99 05 6 68 Picsra Picgoufre rm o 67 73 7 87 FOM enor FOMSkarp 0 29 0 17 Nombre de sites 1 R solution FOM 0 5 A 2 00 POLETE POENE 5 02 1 87 SIGMA A solomon 0 78 Arp Warp construit total 197 207 Tableau 4 16 Statistiques de phasage exp rimental partir des donn es de diffraction de cristaux de TATHAU d riv s avec le Eu HETDPA Le processus de phasage conduit la construction automatique de plus de 95 des acides amin s Tableau 4 16 Ce qui n est gu re tonnant au vu de la pr cision de la carte de densit lectronique obtenue apr s nivelation de solvant Figures 4 36 et 4 37 152 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE CHAPITRE 4 ior e l 5 6 am 3 phasage 1 e HETDPA ale contour t imen r de TdTHAU Eu lectronique exp 36 Carte de densit issement de solvant d 4 igure F iv tal d ri solut MAD un cris par aplat 20 7 1 10n r 7 A7 gt ve ior e l 5 6 am 3 phasage contour e 1 de TATHAU Eu HETDPA tale ique exp rimen tal d r MAD A lectron it igure 4 37 Carte de dens par apl
474. tal de PtMalDH avec le complexe GdHPDO3A Phasage par remplacement mol culaire des donn es HvMalDH avec le complexe GGHPDO3A HvMalDH LLG 5577 4 RFZ 21 2 TFZ 64 8 Tableau 7 6 Statistiques de phasage par remplacement mol culaire de HvMalDH avec le complexe GGHPDO3A 222 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES 7 1 3 4 Affinement des structures de CaMalDH PtMalDH et HvMalDH Les trois structures obtenues ont t affin es Elles comportent la mod lisation des atomes de lan thanide et dans la mesure du possible celle des ligands Affinement de la structure de CaMalDH avec mod lisation du GGHPDO3A Huit atomes de lanthanide ont pu tre mod lis s Comme nous l avons indiqu dans l introduction il est fr quent que deux mol cules de complexe GdHPDO3A s associent la surface de la prot ine C est effectivement ce que la structure r v le il y a deux sites de fixation par monom re et dans chacun des sites le complexe GdHPDO3A se lie par deux GdHPDO3A CaMalDH R solution A 19 63 1 67 Rwork 15 60 Rfree 2 19 36 Nbre de r flexions utilis es 151239 Composition nbre d atomes Prot ine 4609 H20 909 Ions 9 Ligands 12 Res hors Ramachandran 0 33 Ecarts types globaux Liaisonszongueurs A 0 021 Liaisons 4ngles
475. tallography 59 1020 1027 Rosenow M A Huffman H A Phail M E and Wachter R M 2004 The crystal structure of the Y66L variant of green fluorescent protein supports a cyclization oxidation dehydration mechanism for chromophore maturation Biochemistry 43 4464 4472 Rossmann M 1972 The molecular replacement method a collection of papers on the use of non crystallographic symmetry Gordon and Breach Russo S and Baumann U 2004 Crystal structure of a dodecameric tetrahedral shaped aminopepti dase The Journal of biological chemistry 279 51275 51281 Sanchez J Hoh F Strub M and Aumelas A 2002 Structure of the cathelicidin motif of protegrin 3 precursor structural insights into the activation mechanism of an antimicrobial protein Structure 10 1363 1370 Schiltz M Fourme R and Prang T 2003 Use of noble gases xenon and krypton as heavy atoms in protein structure determination Methods in enzymology 374 83 119 Schoehn G Vellieux F M D Asuncion Dur M Receveur Br chot V Fabry C M S Ruigrok R W H Ebel C Roussel A and Franzetti B 2006 An archaeal peptidase assembles into two different quaternary structures a tetrahedron and a giant octahedron The Journal of biological chemistry 281 36327 36337 Schrodinger L 2010 The PyMOL molecular graphics system Schr dinger LLC 326 BIBLIOGRAPHIE Sch ttelkopf A W and van Aalten
476. technique of introducing lanthanoid ions into protein crystals by using lanthanoid complexes was successfully used to solve the structure of several proteins Chaudhuri et al 2003 de Bono et al 2005 Hermoso et al 2005 Jeudy et al 2005 Marquez et al 2006 Gras et al 2007 Delfosse et al 2009 Molina et al 2009 Arnoux et al 2009 P rez Dorado Gonzalez et al 2010 P rez Dorado Sanles et al 2010 1 The different lanthanoid complexes can be purchased from NatX ray http www natx ray com home html The lanthanoid complexes have also been used to solve structures of large macromolecular assemblies The structure of a chimeric ornithine carbamoyl transferase OTCase3630 a dodecamer of 450 kDa was solved by using the SAD method Girard Stelter et al 2003 More recently the structure of the Pyrococcus abyssi Pab87 protein an archaeal member of a new self compartmentalizing protease family forming a cubic shaped octamer of 400 kDa was determined at 2 2 A resolu tion by the SAD method Delfosse et al 2009 Here we report the use of the tris dipicolinate complex to obtain experimental phases at low resolution on a large homo dodecameric enzyme PhTET1 12s which is a tetrahedral aminopeptidase belonging to a new family of self compart mentalized large protease complexes Franzetti et al 2002 The TET peptidase was initially isolated from Haloarcula marismortui Franzetti et al 2002 In the archae Py
477. tein Science 273 1392 1395 Painter J and Merritt E 2006a TLSMD web server for the generation of multi group TLS models Journal Of Applied Crystallography 39 109 111 Painter J and Merritt E A 2006b Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 62 439 450 Patterson A 1934 A fourier series method for the determination of the components of interatomic distances in crystals Physical Review 46 372 376 Pebay Peyroula E Garavito R M Rosenbusch J P Zulauf M and Timmins P A 1995 Deter gent structure in tetragonal crystals of OmpF porin Structure 3 1051 1059 Penel S Pebay Peyroula E Rosenbusch J Rummel G Schirmer T and Timmins P A 1998 Detergent binding in trigonal crystals of OmpF porin from Escherichia coli Biochimie 80 543 551 Perrakis A Harkiolaki M Wilson K S and Lamzin V S 2001 ARP wARP and molecular replacement Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 57 1445 1450 Phillips J C and Hodgson K O 1980 The use of anomalous scattering effects to phase diffraction patterns from macromolecules Acta Crystallographica Section A 36 856 864 Pompidor G D Al o A Vicat J Toupet L Giraud N Kahn R and Maury O 2008 Pro tein crystallography through supramolecular interactions between a lanthanide complex
478. tendre comme le fait qu il ait disparu trois jours apr s la fin de mon contrat de th se ou qu Eric fut son premier th sard sur le projet lanthanide et moi le dernier je crois que j aurai jamais le regret de ne pas avoir pu f ter dignement avec lui notre r ussite tant professionnelle qu humaine On aurait eu tellement de temps apr s la th se pour faire encore les bons vivants Je le remercie ici pour sa bienveillance sa patience sa Science qu il prenait le temps de transmettre son peut tre trop grand sens de la pond ration son intelligibilit son sens de l humour bien que moins polyvalent que le mien concernant certains sujets ses casse t tes g om triques ou math matiques espi gle il n aurait sans doute pas r sist vous faire remarquer que le num ro de cette page est divisible par onze ses pizzas chez Pierre et pour m avoir pr sent sa famille dont il aimait tant parler Juliette Myrtil Damien et Nicolas que je salue affectueusement ici Alors Un grand merci ce petit moustachu d une telle grandeur d Ame Qui vient ensuite J entrevois encore du monde Car je ne compte oublier personne 330 REMERCIEMENTS Mon ami Michel Thepaut dit Michou Ma canne mon appui mon tan on mais aussi le MacGyver du laboratoire Soutenir quelqu un de bout en bout et ce point devrait m riter un financement en soi Que ce soit pour m avoir imprim et reli tous mes exemplaires de th se
479. tenir de multiples cristaux de prot ine EcAcrB parfaitement r guliers pouvant avoisiner les 500 pm de longueur d ar te Ils n ont malheureusement jamais diffract une r solution sup rieure 6 5 Mettre cependant par crit les r sultats obtenus de ces exp riences de biochimie me permet de rendre compte de la qualit respective des contr les de production de cristallisation et de cryo protection Car cette qualit g n rale ne nous jamais permis d expliquer pourquoi les cristaux obtenus n ont jamais diffract plus haute r solution d nouement rendant le mod le EcAcrB inexploitable pour l tude du pouvoir phasant des complexes de lanthanide Je tiens a remercier ici chaleureusement le Dr Aur lien Deniaud ami et actuellement post doctorant dans la team Schaffitzel E M B L de Grenoble En me formant la production la purification et la cristallisation de la prot ine EcAcrB avec didactisme patience et exhaustivit il m a permis non seulement d utiliser la construction plasmidique de Klaas M Pos mais aussi de m introduire et de me former aux us et coutumes du laboratoire 8 2 2 Cristallisation de la prot ine EcAcrB et cryo protection des cristaux 8 2 2 1 Cristallisation de la prot ine EcAcrB Tout comme la purification la cristallisation de la prot ine EcAcrB est ais e car elle cristallise dans de nombreuses conditions de cristallisation en goutte suspendue conditions la plupart du temp
480. teractions hydrophobes Le LnHPDOSA est une mol cule lectriquement neutre qui laisse entrer une mol cule d eau dans la premi re sph re de coordination du lanthanide Le ligand HPDO3A pr sente une face hydrophobe et une face hydrophile Elles constituent respectivement le macrocycle et les fonctions carboxyles avec la mol cule d eau Ce complexe fait partie de ceux pour lesquels le mode de fixation est le mieux compris car lorsqu il se fixe avec un taux d occupation sup rieur 50 le m me mode de fixation a toujours t observ Ce mode de fixation implique un contact hydrophobe entre le macrocycle du ligand et des acides amin s hydrophobes de la prot ine Figure 2 2 Cette interaction de van der Waals est renforc e par un r seau de liaisons hydrog nes impliquant les fonctions carboxyles des mol cules d eau et des acides amin s au voisinage du site de fixation HPDO3A D S pe a Mode de fixation du HPDO3A observ dans les cristaux b Mode fixation du HPDO3A observ dans les cristaux de de prot ine CbpF lysozyme de blanc d uf de poule d apr s Stelter 2005 Figure 2 2 Mode de fixation du complexe LnHPDO3A A la surface des prot ines nous avons toujours observ que lorsque la fixation est forte deux mol cules de complexe s associent les deux mol cules tant en contact par leur face hydrophile qui 69 2 1 LES COMPLEXES DE LANTHANIDE ISSUS DE L IMAGERIE MEDICALE part
481. teut Rpm Se ce fal he Fe a apd Hie AS Gok Wh ss RENTE 51 Lano L efacteur Rare o a ren eue ann en Aa Oe bre nr R s A 51 1 5 7 Strat gie d enregistrement des donn es de diffraction choisie au cours de ces tra VAUX de these ae ie dun NA monies Boy ae eis A eS ee aaa oe et ANA 51 1 5 8 Protocole d int gration des donn es de diffraction retenu 53 1 5 8 1 Obtention des intensit s 53 1 5 8 2 Calcul des amplitudes des facteurs de structure partir des intensit s 55 1 5 8 3 Estimation de la proportion de solvant dans l unit asym trique 55 Affinement de la structure et interpr tations 55 1 6 1 Les facteurs r siduels utilis s lors du processus d affinement 55 KEL shettacteur Rope ses LME A Bas Ae Se i ee SA RER 55 LGA e facteut ne tony ep Ready ble din a hie Gale bee Su Et 56 1 6 2 Protocole d affinement retenu pour nos travaux 56 1 6 3 Les cartes de densit lectronique 58 1 6 4 Les facteurs de qualit d affinement de structure 58 Des cristaux d riv s pr sentant un signal anomal pour un phasage de novo 59 1 7 1 Utilisation de prot ines s l ni es 59 1 7 2 Utilisation de la diffusion anomale des atomes intrins ques 59 1 7 3 Utilisation de gaz nobles 60 1 7 4 Intr
482. the total area in the case of the Tt LDH to 33 23 and 18 for the Ca Sr and Hm enzymes respectively Fig 3 bottom panels Our data thus show a strong correlation between the nature of intermolecular interactions attractive versus repulsive and surface physical properties electrostatic charge and hydrophobicity This suggests that the main adaptive consequence of acidic amino acid substitutions in a halophilic protein favors a change in its intrinsic solubility due to the modification of its surface properties The favorable change in enzymatic activity at high salt concentration correlates with subtle structural changes We measured the effect of KCI on the activity of each enzyme As expected for non halophilic enzymes the activities of Tt LDH and Ca MalDH were drastically inhibited at KCl concentrations higher than 2 M Fig 4a and b For Hm MalDH Fig 4d the activity was maximal over the salt concentration range in which the enzyme is stable 2 4 M At lower KCI activity cannot be recorded because the enzyme deactivates The Sr MalDH activity shows an intermediate behavior as it drops with increasing KCl but still remains at 60 of maximum at high KCI Fig 4c Structural analysis showed that some structural changes correlate with the increase of activity at Structural Analysis of MalDH from S ruber Tt LDH Ca MalDH 2 3 KCI M Buried hydrophobic Surface of mono A Cavity size Shape of Helice 01
483. tion Les structures r solues par remplacement mol culaire dues 4 une trop faible fixation des complexes permettront de moduler et d affiner les observations pr c dentes Dans un premier temps le calcul de phases a syst matiquement t r alis par les m thodes de phasage exp rimental SAD et MAD Lorsque le phasage exp rimental n a pu tre men terme nous n avons pas utilis ici le script utilis dans la premi re partie mais le programme de Andrea Thorn et George M Sheldrick ANODE Thorn and Sheldrick 2011 pour d tecter la fixation des complexes par synth se de Fourier anomale Si des pics lev s dans la synth se de Fourier anomale ont t d tect s un remplacement mol culaire est effectu selon la m thode d crite dans l introduction pour construire un mod le dans lequel les diffuseurs anomaux sont alors plac s Ceci permet d avoir une id e des caract ristiques des sites qui ne permettent qu une faible fixation des complexes IRM Ensuite un affinement de ses mod les est r alis dans le but de d terminer un taux d occupation pour chacun des sites y com pris pour ceux faiblement occup s Afin de ne pas alourdir le manuscrit seuls les tableaux de donn es relatifs l exemple donn en guise de preuve de concept seront report s dans cette section Les jeux de donn es anomales relatifs PtMalDH et HvMalDH ont t enregistr s au seuil d absorption Lyy du gadolinium lanthanide utilis
484. tion au d part to et de par sa plus forte affinit pour les acides amin s tryptophane le complexe Ln HMTDPA s va se fixer et saturer tous les sites tryptophane 140 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE la surface de la prot ine en solution Toujours en sur stoechiometrie par rapport la prot ine et ayant satur tous les sites tryptophane pr f rentiels les mol cules de complexe libres vont chercher se fixer d autres sites la surface de HEWL Elles vont alors utiliser les interactions de type dipicolinate pour se fixer aux arginine et lysine comme le Ln DPA 3 D s lors le complexe Ln HMTDPA 3 induit des liaisons supramol culaires de type Ln DPA 3 pour cr er un nouvel empilement cristallin Toutefois contrairement ce qui a t observ pour le Ln DPA 3 la pr sence des autres complexes fix s aux acides amin s tryptophane conduit un empilement mal organis et donc aux cristaux pr sentant un faci s tortur Ainsi plus on augmente la concentration en complexe Ln HMTDPA 3 plus on obtient de mauvais cristaux Au fur et mesure de l apparition de ces mauvais cristaux la concentration en Ln HMTDPA 3 dans la goutte diminue pour tre finalement en sous stoechiometrie ce qui conduit une fixation uniquement sur les sites tryptophane pr f rentiels et ce qui produit les cristaux tudi s Ceci explique ainsi pourquoi j ai toujours observ deux
485. tion et de cryo protection 240x200 pm c 100x90 pm Figure 4 8 Les deux formes cristallines des cristaux d riv s HEWL Ln HMTDPA s3 en co cristallisation La fixation du complexe dans les cristaux est ais ment v rifiable sous binoculaire l aide d une lampe UV de paillasse en exposant la goutte aux UV proches 315 nm Le complexe tant plus fortement concentr dans les cristaux que dans la solution de la goutte proprement dite le contraste entre la faible luminescence mise par la solution et celle des cristaux bien plus intense dans le visible permet de d terminer si le complexe s est fix ou non Figure 4 9 a 3 mg mL HEWL 2 7 mM b 3 mg mL t HEWL 2 7 mM TH HMTDPA 3 lumi re visible Tb HMTDPA 3 proches UV Figure 4 9 d tection du Tb HMTDPA dans des cristaux d riv s de HEWL Pour diminuer la densit du pr cipit dans la goutte qui se forme d s l ajout du complexe j ai parfois eu recours une modification des proportions de prot ine de complexe et de r servoir dans la goutte de cristallisation J ai ajout pour cela diff rents volumes de solution de prot ine de complexe et de r servoir dans la goutte modifiant ainsi leur dilution respective figure 4 8 Afin d viter toute confusion le rapport quantit de complexe sur quantit de prot ine to dans la goutte sera indiqu pour chaque tableau de donn es de ce chapitre 109 4 2 PRE
486. tions de l espace qui permet le ph nom ne de diffraction c est par les lectrons des atomes qui composent le cristal Les rayons X ainsi diffus s interf rent de fagon constructive ou destruc tive Ce que nous mesurons sont les intensit s des taches de diffraction r sultantes des rayons X lorsque ceux ci diffus s par le cristal chantillon ont travers le d tecteur De la mesure de ces intensit s le cristallographe d termine l information structurale partir de laquelle un mod le mol culaire pourra tre construit la densit lectronique du cristal Figure 1 Travailler avec la diffraction des rayons X issus du rayonnement synchrotron suppose de travailler sans un couple de lentilles proprement dit qui comme cela est le cas avec un microscope lectronique permettrait de recr er directement une image de l chantillon Pour un peu plus imager mon propos je dirais qu la place de la premi re lentille d un microscope nous avons un d tecteur enregistrant des ondes diffract es la seconde lentille celle qui permet de reconstruire l image r duite ou agrandie est en fait recr e par calcul math matique la transform e de Fourier mais elle ne permet pas de faire le 22 INTRODUCTION GENERALE plan focal Ainsi une information cruciale pour obtenir la densit lectronique n est pas mesur e le d phasage des ondes diffract es Mon travail de recherche se situe ce niveau l Notre obj
487. tions fines entre les ligands du complexe et la prot ine sont ici plus d licates d terminer Le complexe se situe dans une cavit form e par l empilement cristallin Figure 4 30 Figure 4 30 Carte de densit lectronique 2F F contour e 1 0 o du complexe Ln HMTDPA l et surface lectrostatique autour du site de fixation du complexe sur la pro t ine TdTHAU Echelle allant de 3 0 kT e charge n gative rouge 3 0 kT e charge positive bleu 143 4 5 AFFINEMENT DES STRUCTURES ET DESCRIPTION DU MODE DE FIXATION DU LN HMTDPA 5 Cette cavit est charg e tr s positivement car on y trouve quatre acides amin s arginine Arg79 Arg82 et leurs sym triques respectifs et deux acides amin s lysine la Lys78 et sa sym trique La pr sence de double conformation pour la Lys78 et l Arg79 prouve la dynamique de cette poche Nous avons d termin deux types d interactions entre le complexe et la prot ine Figure 4 31 La premi re est une liaison hydrog ne entre le groupement NH2 d un conform re de l Arg79 de la mol cule sym trique et le groupement carboxylate du premier ligand La seconde liaison est une interaction t n entre les atomes du noyau triazole du ligand et les atomes N Cz N1 et N2 de l autre conform re de l Arg79 mais cette fois de la mol cule de r f rence distance de 3 5 Il est noter que les taux d occupation affin s de chacune des conformations concordent
488. tour du second tour d affinement lorsque la construction automatique des mol cules d eau fut termin e 243 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO Un grand nombre de mol cules d eau dans l enveloppe de solvatation de CaMalDH La premi re information qui saute au yeux lorsqu on regarde la structure de la CaMalDH native est la forte hydratation de cette derni re En fin d affinement le mod le contient 1 56 mol cules d eau par r sidu En 2004 Clemens Vonrhein a pr sent les statistiques bas es sur tous les fichiers de la Protein Data Bank concernant le nombre de mol cules d eau par acide amin Cette tude a montr que pour l ensemble des structures 1 7 de r solution il y avait 0 13 mol cules d eau par atome ce qui fait donc environ 1 3 mol cules d eau par acide amin Wood et al 2008 Avec 1 56 mol cules d eau par acide amin nous avons donc r solu la structure d une macromol cule biologique particuli rement hydrat e Figures 7 14 Cette m me figure montre aussi la taille des canaux de solvant dans les cristaux obtenus caract ristique que nous avions exploit e dans l tude du complexe LnTNTPA pr sent e dans le dernier chapitre de la premi re partie de ce manuscrit Figure 7 14 Vue de la maille cristalline d un cristal natif de CaMalDH Seules les mol cules d eau sont repr sent es en bleu gris Un r seau de polygones d ea
489. travers le rapport de Bijvoet d crit en 1 4 Si l on suppose des taux d occupation identiques pour les diffuseurs anomaux et si l on consid re que les donn es de diffraction sont enregistr es au seuil d absorption correspondant la contribution imaginaire f vaut environ 10 e pour le s l nium et 30 e pour les lanthanides le rapport de Bijvoet montre qu un site lanthanide totalement occup permettra de d terminer la structure d une prot ine de masse mol culaire neuf fois plus importante compar un site s l nium totalement occup L utilisation des ions lanthanides en tant que diffuseurs anomaux a t propos e depuis que leur fixation dans le site de fixation calcium de certaines prot ines a t d montr e Dans ce cas pr cis l atome de lanthanide se substitue l atome de calcium Horrocks and Sudnick 1981 Cette particularit a t exploit e lors des premi res exp riences MAD Kahn et al 1985 Comme nous l avons indiqu les ions lanthanide poss dent une coordination particuli re pouvant accueillir de 3 11 atomes dans leur premi re sph re de coordination avec une coordination privil gi e de 9 Ainsi hormis dans le cas des prot ines calcium la coordination compl te est difficile satisfaire la surface d une prot ine seuls les acides amin s aspartate et glutamate sont favorables ce type de coordination avec leur fonction acide mais un acide amin ne peut lui seul c
490. trempage quelles que soient les conditions de cristallisation Toutefois il lui manque la propri t d tre facilement d tectable dans les cristaux d riv s Sur la base des diff rentes th ses effectu es sur cette th matique au sein de l quipe le LnDO3A est le complexe qui pr sente le taux de succ s en phasage le plus lev M me si les taux d occupation ne sont pas toujours les plus lev s il conduit un nombre important de sites de fixation en ad quation avec son mode d interaction qui assurent la r ussite du phasage Il est noter que c est le seul complexe 288 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES qui pr sente une coordination incompl te de l ion lanthanide avec la pr sence de deux mol cules d eau dans la premi re sph re ce qui explique son mode d interaction Si on utilise ce complexe comme point de d part pour une am lioration future il faudra que la modification laisse la coordination incompl te point qui risque d tre difficile si l on souhaite par exemple obtenir une luminescence dans le visible Une autre voie pourrait tre le d veloppement d une tiquette prot ique pouvant tre ajout e la prot ine et ciblant tel ou tel complexe de lanthanide Biochimiste de formation je sais que cette m thode peut tre longue mettre en oeuvre et pr sente un caract re al atoire En effet il pourrait tre difficile de pr parer une telle tiquette par les m thodes de biologie mol
491. tribution de probabilit s afin de favoriser une des combinaisons Ceci en modifiant deux param tres le nombre de type de ligands introduits dans le m lange et leurs concentrations respectives En outre que les changes de ligands pour un ion lanthanide soient quiprobables ou non ces exp riences permettent d mettre des hypoth ses propos de l affinit des complexes de la combinatoire test e pour la prot ine compte tenu de la comp tition pour les sites de fixation la prot ine a t elle une affinit particuli re pour un complexe ou une combinaison de ligands donn e 170 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE 4 7 2 Pr sentation des diff rentes combinatoires et r sultats obtenus Qu elle que soit la combinatoire si un doute subsistait quant la mod lisation des ligands dans les cartes de densit lectronique plusieurs affinements ont t men s de conserve avec des mod les contenant les diff rentes combinaisons de complexes possibles Dans les tableaux qui vont suivre les cellules stri es de noir signifient que les donn es de diffraction correspondantes n ont pas t enregistr es ou se sont r v l es non interpr tables 4 7 2 1 Les combinatoires avec m lange de complexes Ln TDPA 3 entiers Il s agit de quatre combinatoires r alis es par m lange de solutions contenant chacune un complexe entier lanthanide ligands appartenant la famille des Ln
492. tris dipicolinate europium complex the isomorphism between the native and derivative crystals was preserved The resulting SIRAS electron density map was of high quality as shown in Fig 2 b 4 Conclusion We have shown that using Eu DPA the high phasing power heavy atom derivative of PhTET1 12s may be obtained by co crystallization Highly accurate experimental phases were obtained even at the low resolution of this work 4 0 A The presence of the Eu DPA 3 complex modified the crystal space group from crystallization conditions that led to the monoclinic crystal form diffracting at high reso lution the introduction of Eu DPA 3 induced the formation of cubic crystals Pompidor et al 2010 showed that the interaction between the protein and the Ln DPA complex occurs through hydrogen bonds between the O atom of the carboxylate groups of the DPA ligands and hydrogen bond donor residues and through hydrophobic z stacking interaction between DPA rings and aromatic residues In some cases this specific binding mode improves the protein protein interaction involved in crystal packing leading to supramolecular interactions In the present structure it seems that it is not the case Even if the low resolution of the data limits the modelling of the DPA ligand the Eu ion is located between two monomers on the large channel side of the particle as shown in Fig 2 c These two monomers are supposed to be the minimal bui
493. tron radiation research including instrumentation theory computing and scientific applications in areas such as biology nanoscience and materials science Rapid publication ensures an up to date information resource for sci entists and engineers in the field Crystallography Journals Online is available from journals iucr org J Synchrotron Rad 2011 18 74 78 Romain Talon et al Lanthanoid complexes diffraction structural biology ae Using lanthanoid complexes to phase large ynchrotron f Radiation macromolecular assemblies ISSN 0909 0495 Romain Talon Richard Kahn M Asunci n Dur Olivier Maury Received 26 May 2010 Accepted 14 September 2010 Fr d ric M D Vellieux Bruno Franzetti and Eric Girard CEA IBS F 38054 Grenoble France CNRS UMR5075 F 38027 Grenoble France Universit Joseph Fourier F 38000 Grenoble France and dUniversit de Lyon Ecole Normale Sup rieure de Lyon Laboratoire de Chimie UMR CNRS 5182 46 All e d Italie 69364 Lyon Cedex 07 France E mail bruno franzetti ibs fr eric girard ibs fr Lanthanoid ions exhibit extremely large anomalous X ray scattering at their Lim absorption edge They are thus well suited for anomalous diffraction experiments A novel class of lanthanoid complexes has been developed that combines the physical properties of lanthanoid atoms with functional chemical groups that allow non covalent binding to pr
494. tructure du lysozyme de blanc d uf de poule et de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii Leur affinit pour la surface de ces prot ines est bien plus lev e que celle du complexe Ln DPA 3 et ces complexes conservent la propri t d tre ais ment d tectables dans les cristaux de par la luminescence qu ils mettent dans le visible lorsqu ils sont excit s sous UV proches Les exp riences men es avec ces complexes ont aussi ouvert la voie des complexes dipicolinates hybrides dont l tude a permis d entrevoir l importance de la charge globale pour l effet supramol culaire Cependant tout comme le complexe Ln DPA s3 les complexes de la famille des Ln TDPA 3 ne sont pas utilisables dans des conditions de cristallisation contenant des ions divalents ou de fortes concentration en sels C est en tenant compte de cette derni re propri t que le nouveau complexe LnTNTPA d riv lui aussi du Ln DPA 3 a t synth tis Ce complexe cag s affranchit de l influence des ions divalents et conserve la propri t d tre luminescent dans le visible L utilisation de ce complexe a permis de r soudre la structure de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii suite un phasage de novo 193 5 5 CONCLUSION 194 Troisi me partie Les complexes de lanthanide pour le phasage de prot ines multim riques de grande taille 195 La seconde partie de cette th se contient l ensemble des r s
495. ttement de celle de HvMalDH Bien plus contrast e et charg e n gativement chez HvMalDH la surface de CaMalDH est dans cette r gion plus hydrophobe Cela co ncide avec le mode de fixation du complexe GdHPDO3A qui implique des interactions hydrophobes avec les surfaces des prot ines cf introduction Le complexe ne s est pas fix dans cette r gion la surface de PtMalDH Pourtant la r partition des charges semble quivalente entre les deux surfaces Toutefois on peut mettre l hypoth se de l influence de la topologie de la surface qui est tr s diff rente entre les deux MalDH En effet dans cette r gion la surface accessible au solvant de PtMalDH pr sente une pro minence absente chez CaMalDH 226 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES Au regard des structures secondaires qui composent cette r gion de la surface de CaMalDH nous avons constat que le complexe GdHPDO32 se fixe sur une boucle hydrophobe Cette boucle existe aussi chez PtMalDH mais dans le cas pr sent sa conformation est diff rente L analyse plus approfondie de ce site de fixation du GdHPDO3A sur CaMalDH r v le la pr sence d un ion cadmium qui pourrait expliquer le changement de conformation de la boucle et la fixation du complexe En effet la surface de CaMalDH cet ion Cd cr e un pont salin entre la fonction carboxylate d une des deux conformations de l acide amin Glu36 mod lis es et l
496. u DPA 3 est pr sent il forme des cristaux de sel qu il soit en pr sence de prot ine ou non Dans 12 des conditions de cristallisation il ne cristallise que dans les gouttes qui contiennent la prot ine pas dans les gouttes quivalentes o il est seul et ce malgr le fait qu il soit concentr 100 mM A l inverse dans 3 des conditions de cristallisation le complexe auto cristallise dans les gouttes o il est seul mais pas dans les gouttes quivalentes avec la prot ine Figure 3 12 95 3 3 SYNTH SE DES OBSERVATIONS ET CONCLUSION 3 2 6 Co cristallisation de la prot ine Ph TET2 12s avec le complexe Eu DPA 3 E Mauvais fonctionnement du robot Cristaux d riv s Cristaux natifs de CnrXs Cristaux de sel de Eu DPA m Pr cipitation ou cristallisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA E Solubilisation de CnrXs en pr sence de Eu DPA O Goutte claire ou pr cipit de prot ine Figure 3 13 Bilan statistique des observations des essais de co cristallisation de PhTET2 12s avec le complexe Eu DPA s3 Cristaux d riv s le complexe cristallise dans la goutte m contenant la prot ine ET dans la goutte ne contenant que le complexe le complexe ne cristallise qu en pr sence de prot ine le complexe ne cristallise qu en absence de prot ine E Pr cipitation ou cristallisation de PhTET2 12s en pr sence de Eu DPA M Solubilisation de PhTET2 12s en pr sence de
497. u dans la premi re couche de solvatation Une observation rapide des mol cules d eau mod lis es permet de constater une structuration par ticuli re de ces derni res et ce uniquement dans la premi re couche de solvatation autour de la surface de la prot ine Les mol cules d eau coordonn es entre elles s arrangent la surface de la prot ine CaMalDH selon trois structurations possibles une g om trie pentagonale une g om trie hexagonale ou en vrac Nous avons cartographi les mol cules d eau dont la coordination adopte une g om trie pentagonale ou hexa gonale La liste exhaustive de ces mol cules d eau et leur caract ristiques structurales se trouvent dans les tableaux 7 25 et 7 26 244 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES LL 901 C LOI L TO1 Ih 19 901 T 801 96 S01 T6 COL 9L COL FL LOI TO LOT Lt SOI G OF IZL 6 OIT TOZI TEIL OY LIT CL STI OS LCL LO LTT 9601 TS ICI LOTT FOOT 89 FEL III IO IZI S9 CCl CI GIE cOGLI Sc zH OO FIT xew y jun y fg Ay xew q um q aed aT HCTPIN O 9P A Y WIP Np sovzns EI Y N9 P SMJ sep o1yde1807I8 GZ Z Nee qey 7 LTT r 08 76 88 CL 66 9C YG OT 98 GC L8 866 00201 80 6L cocs L8 C6 C816 6t 101 0c 06 CCS 10 6 0982 06001 af ef ei 89T SLT 99T SCT 99T TIT y souesiq re of isa t MH ANOS
498. u de la troisi me interaction une liaison polaire s tablit entre la fonction hydroxyethyl du ligand HETDPA et la fonction carboxyle de l acide amin histidie 117 d une mol cule sym trique en orange Figure 4 38 amp 3 1 GLY 117 Figure 4 38 Mode de fixation du complexe Ln HETDPA s la surface du HEWL Cristal d riv obtenu par co cristallisation 1 ligand Site 1 description de l interaction du second ligand avec la prot ine On retrouve l empilement rentre le cycle triazole du second ligand et le cycle benz nique du noyau indole du Trp62 de la mol cule sym trique en rose Je nai pas trouv d interaction mettant en cause la queue hydroxyethyle pour ce ligand Figure 4 39 155 4 6 LE LN HMTDPA UN COMPLEXE MODULABLE 4 Figure 4 39 Mode de fixation du complexe Ln HETDPA 3 la surface du HEWL Cristal d riv obtenu par co cristallisation 24 ligand Site 1 description de l interaction du troisi me ligand avec la prot ine La fixation du troi si me ligand HETDPA est la m me que pour le ligand HMTDPA On mod lise clairement une liaison hydrog ne entre un de ses groupements carboxylates et le groupement NH de l Arg5 Malgr la distance mesur e de 3 7 on peut signaler une liaison hydrog ne suppl mentaire entre une des fonctions car boxylates du complexe et le groupement NH1 de l Arg73 de la mol cule sym trique en rose Figure 4 40
499. u seuil d absorption L777 du gadolinium conduisent une valeur quivalente faible de la contribution imaginaire f pour les atomes de magn sium Figure 7 12 Figure 7 12 Cartes de densit anomales calcul es avec le jeu de donn es enregistr au seuil absorption K du Brome en bleu et avec le jeu de donn es enregistr au seuil d absorption Lyrr du gadolinium en rouge dans la structure de HvMalDH 235 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO Des synth ses de Fourier anomale utilisant le mod le affin ont t calcul es avec le programme ANODE Thorn and Sheldrick 2011 et ont permis de mod liser avec assurance 71 ions Cl et 23 ions K position taux d occupation et facteur d agitation thermiques affin s dans la structure de HvMalDH En effet nous nous sommes aper u aposteriori que la diff rence des hauteurs des pics calcul es pour chacune des deux longueur d ondes correspondait finalement non pas celle d atomes de magn sium mais celle d atomes de potassium Nous nous attendions pourtant a mod liser des ions magn sium car ils sont pr sents dans les conditions de cristallisation de la prot ine Mais compte tenu du fait du protocole de purification qui requiert l utilisation de tampons tr s concentr s en chlorure de potassium il tait tout aussi logique de trouver des ions K dans la prot ine HvMalDH 7 2 2 PtMalDH la malate d shydrog nase
500. ualiser et am liorer la position et la brillance du faisceau en sortie de ligne apr s chaque changement de longueur d onde Le risque li cette approche est une ventuelle d gradation accrue des cristaux induite par le rayonnement Param tres des enregistrements de donn es Pour les cristaux pr alablement test s dont la dif fraction n tait pas au del de 1 90 A sur la ligne BM30A et pour les donn es enregistr es sur les lignes de lumi re ID29 ID23 1 ID23 2 de l ESRF et Proximal du synchrotron SOLEIL seules des donn es SAD au maximum de f ont t enregistr es En outre pour les quatre derni res lignes de lumi re pr cit es qui utilisent un l ment d insertion ou onduleur le faisceau a du tre att nu afin d viter au maximum les d g ts d irradiation et la saturation de la basse r solution Sur la ligne de lumi re BM30A de l ESRF le temps d enregistrement par image requis me permet de commencer int grer les intensit s en cours d enregistrement Ceci m a permis de changer d chantillon lorsque le signal anomal alors valu se r v la trop faible ou nul Tous les jeux de donn es de diffraction ont t enregistr s avec un pas angulaire Ad de 0 5 un temps de pose par image limitant toute saturation basse r solution et avec une redondance lev e 1 5 8 Protocole d int gration des donn es de diffraction retenu 1 5 8 1 Obtention des intensit s Les intensit s
501. uccaneer construit total 1193 1216 Tableau 7 12 Statistiques du phasage SIRAS de HvMalDH avec le complexe GADTPA BMA 7 2 1 3 Affinement de la structure de HvMalDH L affinement a t effectu avec le programme Phenix selon le protocole indiqu dans l introduction de ce manuscrit Les statistiques d affinement sont consign es dans le tableau suivant HvMalDH Code RCSB PDB 4BGU R solution A 48 48 1 49 Rwork 15 58 Ryree 17 88 Nbre de r flexion utilis es 205541 Composition nbre d atomes Prot ine 9360 H20 1814 Ions 94 Ligands 167 Res hors Ramachandran 0 50 Ecarts types globaux Liaisons ongueurs A 0 010 Liaisons 4ngies 1 300 Bmoyen prot ine A 14 24 Bmin prot ine A 4 81 Bmax prot ine A 63 52 Bmoyen eau A 29 60 Bmoyen ions divers A 22 32 Bmoyen ligands divers A 30 34 Tableau 7 13 R sum des statistiques d affinement de la structure native de HvMalDH 233 7 2 LES NOUVELLES STRUCTURES DE MALDH R SOLUES PAR PHASAGE DE NOVO A la fin de l affinement du mod le un certain nombre d ions Mg et C17 ont pu tre mod lis s Mais m me si on se fie la forme anisotrope de la densit lectronique et l environnement prot ique il est parfois difficile de distinguer un ion Mg 14 lectrons ou un ion CIT 16 lectrons d une mol cule d eau 10 l
502. ue augmentant ainsi la chimioth que 210 CHAPITRE 7 LES MALATE DESHYDROGENASES ISSUES D ORGANISMES EXTREMOPHILES A pernix E maquilingensis 100 T neutrophilus eg pcalidi ontis Parsenaticum 2 LONCUS Pmarina e 98 Tacidophilum sibiricum B subtili is B is S ST modenirifeans kaustophilus B coahuilensi ag p askensis R denitrificans Ox pn intarcticus M era ftp mefacie otdtrop ica B LA si ponicum _ C atlanticus B thetaiotaomicron Sop F psychrophilum F frigimaris 95 C Gi R mad M marina C th C parvum C tepidum Paestuarii E spasohacteroides 92 C ferrooxidans Emarianensi S castenholzii 97 Died H modesticaldum Pthermopropionicum 96 96 CELCEEEEEEEEEEECEEED D re a D F a aseu2301 LELLEEELEEEECEEEEEEE Lactate d shydrog nase Archaea Bacteria Figure 7 1 Section d arbre phylog n tique montrant les distances g n tiques entre les diff rentes MalDH 211 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE CaMalDH 1 309 MEK EISI CAC FVGRRTAHWLAARELGDIVLLDOFVEGVPQGGRALDLVEASPIEGFDVRVTG TNN SrMalDH 1 324 M frerao SK PtMalDH 1 324 M FCTADIESK HvMalDH 1 303 bi gas E FA Conservation Quality Consensus MARSKISVIGAG AVGATVAOTLAIROTGDIYIFDVIDGLAEGKALDILEGAPHWGYDLDIKGFCTADESKYA GSDVIVVTAGL RKPGMS
503. ue a celui des cristaux de TdTHAU natifs Synth ses de Fourier anomale au Eu et au A Gd cartes contour es 5 0 Mod les Picspa PiCsoutre 27 97 23 70 6 20 superpos s de HEWL Eu HMTDPA F et Eu pk a de HEWL GdHPDO3A icSpa Picot 44 50 35 67 16 15 4 01 Gd pk 0 5 4 0 Re B BOL GGG PR Aucune fixation de complexe Complexe GdH combin Danoise A n DCE observ Tableau 4 28 R capitulatif des r sultats obtenus avec la combinatoire 8 Cette fois ci l affinit du complexe Eu HMTDPA 3 pour le lysozyme n a pu rivaliser avec celle du GdHPDO3A ajout en large exc s C est ce que montrent les synth ses de Fourier anomale avec les deux mod les HEWL Eu HMTDPA s et HEWL GdHPDO3A Girard et al 2003b align s et superpos s du tableau 4 28 et de la figure 4 50 On voit les deux pics relatifs au gadolinium l empla cement exact du mod le superpos qui prouve que le complexe GdHPDO3A est bien le complexe fix Les pics sym triques visibles au niveau du mod le du complexe Eu HMTDPA montrent bien que ce dernier ne s est que peu ou pas fix La tr s faible fixation du Eu HMTDPA 3 pourrait cependant expliquer le troisi me pic observable par la synth se de Fourier anomale calcul e avec le jeu gadolinium Il pourrait s agir de la diffusion anomale des atomes de gadolinium de complexes GdHPDO3A qui se sont d cal s a cause de la pr sence du Eu HMTDPA 3 pr sents d
504. ue al atoire Pour la solution choisie la valeur du LLG doit donc tre positive Aussi permet elle d estimer la pr cision de la solution plus elle est lev e plus la solution est correcte Note d apr s le manuel d utilisation une valeur de LLG globale sup rieure 400 caract rise une solution non quivoque Les Z scores r sultant des fonctions de rotation RFZ et de translation TF7 sont calcul s ainsi 30 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE LLG LLG d un chantillon al atoire d orientations LLG RMSD iG al atoire Z score ot RMS bee iy atoire St P cart type calcul entre une distribution de valeurs de LLG al atoires et la valeur moyenne mesur e du LLG En d autres termes la valeur de RFZ et de TFZ indique respectivement le nombre d carts type sup rieurs la moyenne pour une valeur de LLG r sultant de la rotation et le nombre d carts type sup rieurs la moyenne pour une valeur de LLG r sultant de la translation du mod le Note d apr s le manuel d utilisation un Z score sup rieur 5 prouve une orientation correcte du mod le 1 2 2 Les m thodes directes m thodes de phasages ab initio Sous le terme de m thodes directes on regroupe un ensemble de m thodes qui s attachent r soudre le probl me des phases en utilisant des relations entre phases qui d coulent uniquement des intensit
505. ues 200 CHAPITRE 6 L AMINO PEPTIDASE DODECAMERIQUE TET1 128 DE PYROCOCCUS HORIKOSHII Figure 6 2 a Carte de densit lectronique exp rimentale SAD contour e 1 5 o 4 de r solution b Un des pores larges responsables de l acc s des polypetides l int rieur de la particule c Un des petits orifices situ s sur chacun des quatre sommets La carte exp rimentale 4 de r solution calcul e partir des donn es SAD a permis de deviner ais ment la chaine polypeptidique figure 6 3 Nous avons aussi utilis les donn es 3 1 A de r solution enregistr es partir d un cristal natif pour r aliser un phasage par la m thode SIRAS celles qui avaient aussi permis de d terminer la structure initiale par remplacement mol culaire Schoehn et al 2006 Ce phasage a conduit une carte exp rimentale d excellente qualit qui indique que l introduction du complexe Eu DPA s3 n introduit pas un d faut d isomorphisme Figure 6 3 Figure 6 3 Cartes de densit lectronique exp rimentales coutour es 1 5 o obtenues a par phasage SAD 4 A de r solution et b par phasage SIRAS 3 1 A Un mod le de PhTET1 12s est superpos 201 6 4 CONCLUSION 6 4 Conclusion Le complexe tris dipicolinate d europium a permis de r soudre la structure de l amino peptidase g ante TET1 12s En partant des conditions de cristallisation qui habituellement conduisent de
506. ues permettent de suivre cette am lioration toujours dans le but de fournir une estimation quant l issue du phasage la construction du mod le I 4 Tout au long du calcul des poids attribu s aux facteurs de structure modifi s l indicateur I 4 calcul par le programme SIGMAA traduit la comparaison des phases des facteurs de structure des donn es exp rimentales avec les phases des facteurs de structure de la carte aplatie De mani re g n rale le programme SIGMAA est utilis pour combiner un jeu de phases calcu l es avec un jeu de phases d j d termin es auparavant phases traduites sous la forme de coefficients d Hendrickson Lattman ref Read 1986 The program SIGMAA Read 1986 can be used to combine a set of calculated phases with a set of previously determined phases for which the phase probability profiles are held in the form of Hendrickson Lattman coefficients It calculates weighted Fourier coefficients either from the calculated phase from a partial model structure or by combining phase probabilities from isomorphous phases with those from one or more partial structures Comprise entre 0 et 1 plus la valeur de l indicateur I 4 est lev e l avant dernier cycle d aplatissement plus cela signifie que la carte de densit lectronique et le phasage ont pu tre am lior s De part l exp rience je suis en mesure d indiquer qu une valeur de I 4 sup rieure 0 60 l avant dernier
507. ulated pl value of 5 for proteomes of various halophilic species Crystal structures of several proteins from halophilic archaeal cells with KCI rich cytoplasms have shown their surfaces to be rich in acidic residues Second many halophilic proteins have specific ion binding sites often at subunit interfaces Third there is often a reduction of hydrophobic content of the protein on the folded surface as well as buried in the core This occurs in some cases via the substitution of large hydropho bic residues for small ones and in other cases concomitantly with the reduction of the number of lysine residues A recent site directed mutagenesis study underscored the decrease of a protein s solvent accessible area as an important mechanism for halo adaptation One of the most extensively studied groups of proteins with respect to halo adaptation is the family of lactate dehydrogenase LDH like malate dehy drogenases MalDHs A halophilic version of MalDH from the archaeon Haloarcula marismortui Hm is a 130 kDa homotetramer bearing each of the three adaptive signatures described above The solvent interactions stability and weak protein protein interactions of Hm MalDH in the presence of various salts have been studied in detail pre viously At high physiological salt concentrations the solvation shell of this very acidic enzyme has a slightly higher concentration of salt than that of a non halophilic protein whereas its
508. ultats obtenus suite l utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de macromol cules multim riques de grande taille Cette voie fut ouverte par la r solution de deux structures celle de l enzyme dod cam rique chim rique OTCase 3630 de 450 kDa l aide du complexe GdHPDO3A Girard et al 2003 et celle de Pab87 hydrolase octam rique de 400 kDa Delfosse et al 2009 Dans ce dernier cas le complexe LuHPDO3A permit le phasage de l octam re entier groupe d espace P1 cf introduction Il n est donc pas question dans cette partie de grands complexes prot iques au sens large mais bel et bien de grandes prot ines mul tim riques L appellation grands complexes prot iques pouvant tout aussi bien inclure par exemple les complexes h t roprot iques d initiation de transcription ou de traduction Prouver que l utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de grands assemblages pro t iques est r alisable mane de deux postulats simples Le premier postulat est que si les complexes de lanthanide ont trouv des sites de fixation sur de petites prot ines telles que le lysozyme de blanc d uf de poule ou la Thaumatine de Thaumatococcus daniellii la surface des prot ines de bien plus grande taille devrait proposer davantage de sites de fixation Le second postulat est li l expression du rapport de Bijvoet telle que d crite dans l introduction Il prouve en effet que pour des tau
509. un pr cipit cristallin opaque isol identique celui observ dans les gouttes de trempage Expos s aux UV proches ces cristaux ne se sont pas r v l s luminescents confirmant davantage encore que le complexe ne s tait pas fix la prot ine D apr s le calcul permet tant de d terminer la quantit de complexe introduit par rapport la quantit de prot ine utilis e cf introduction calcul r alis apr s coup nous tions peut tre toujours en exc s de complexe alors que nous pensions tre en proportions stoechiom triques 1 1 4 2 7 La malate d shydrog nase de Haloferax volcanii HvMalDH Comme pour l enzyme CaMalDH nous avons voulu profiter du fait que dans le cadre de l tude sur les malate d shydrog nases nous disposions de la malate d shydrog nase de Haloferax volcanit Cette enzyme a donc t naturellement choisie comme prot ine mod le pour l tude de la famille des Ln TDPA s3 Comme CaMalDH la prot ine m a t fournie purifi e et concentr e 10 mg mL par le Dr Dominique Madern 4 2 7 1 Cristallisation de la prot ine native Les conditions de cristallisation de la prot ine HvMalDH tant inconnues nous avons eu recours une fois de plus une exp rience de co cristallisation automatis e men e l aide du robot de cristal lisation nanogoutte de l EMBL Tout comme la description biochimique de la prot ine les conditions de cristallisation de la prot ine n
510. une des trois fonctions carboxylates du ligand HPDO3A Les taux d occupation affin s respectifs la conformation de Glu36 impliqu e 45 de Pion Cd 45 et du complexe GAHPDO3A 51 sont en accord avec cette observation La pr sence de lion Cd et du complexe a modifi la conformation g n rale de cette boucle hydrophobe de CaMalDH permettant la fixation du complexe Le fait qu aucune fixation du complexe GdHPDO3A n ait pu tre constat e chez PtMalDH dans cette r gion qui pr sente les m mes caract ristiques structurales illustre bien l influence des conditions de cristallisation sur la fixation des complexes 7 1 4 R sum des premi res observations issues de l tude de l interaction des trois complexes IRM sur les trois MalDH Bien qu ayant seulement choisi l exemple de l tude du mode de fixation du GdHPDO3A sur trois MalDH pour illustrer l approche MalDH je consigne ici l ensemble des premi res observations concer nant les fixations de trois complexes IRM sur les trois MalDH pr cit es De mani re g n rale il ne m a t possible de mod liser avec fiabilit le ligand de ces complexes que pour un taux d occupation sup rieur ou gal 54 et pour un facteur d agitation thermique maximum de 45 00 5 00 A Nom de Caract re l organisme j Conditions de Gd Gd Gd extr mophile dont est issu la i cristallisation HPDO3A DO3A DTPABMA de l organ
511. upe Membrane amp Pathog ne de l Institut de Biologie Structurale Jean Pierre Ebel de Grenoble le Dr Fabio Sterpone et Maria Kalimeri du Laboratoire de Biochimie Th orique de l Institut de Biologie Physico Chimique de Paris le Dr Philippe Oger du Laboratoire de G ologie de l Ecole Normale Sup rieure de Lyon ainsi que toute l quipe de la ligne de lumi re FIP BM30A de ESRF le Dr Jean Luc Ferrer Michel Pirocchi et Jacques Joly 332 REMERCIEMENTS Pour leur accueil pour la bonne ambiance qu ils savent mettre dans un labo et pour toute l aide pr cieuse qu ils m ont quotidiennement apport e que ce soit lors de discussions parfois assez anim es ou de fa on plus pratico pratique je remercie tr s chaleureusement et en premier lieu les membres de mon ancienne quipe LPM C line Julian Binard le labo s croulerait sans toi Antoine Picciocchi Gavin Fox merci pour m avoir transmis des techniques ancestrales de cristallo et pour avoir partag tes d couvertes musicales avec l amateur de cheesy pop que je suis En second lieu et pour les m mes raisons je remercie les membres de mon groupe E L M A Dominique Madern on n est pas toujours sur la m me longueur d onde mais tes malate d shydrog nases sont tout de m me de formidables bestioles Myl ne Ferruit Frank Gabel Frederic Vellieux merci pour ton aide pr cieuse en cristallo Pierre Vauclare Eva Rosenbaum Asun Dura Louise Lassal
512. upements diamines Pour certaines prot ines l ajout de ce type de mol cules dans les gouttes de cristallisation conduit l apparition de diff rentes formes cris tallines Dans certains cas des effets notables sur la qualit de diffraction des cristaux augmentation de la r solution baisse de la mosa cit ont t observ s Larson et al 2007 Par ailleurs comme l avait d j indiqu Guillaume Pompidor la pr sence de fortes concentrations en sels ou la pr sence de cations divalents dans les conditions de cristallisation semble conduire la dissociation du complexe Je me suis moi m me confront la formation de cristaux de sel de complexe lors de la pr paration de cristaux d riv s En effet d s que la solution de cristallisation contenait des ions divalents Mg Ca Cd ou une concentration trop importante de sel le complexe cristallisait dans la goutte C est donc avec un double objectif que j ai men une exp rience de co cristallisation automatis e l aide du robot de cristallisation nanogoutte du laboratoire HTX de PEMBL v rifier d une part l utilisation de ce complexe en tant qu agent facilitant la nucl ation et d autre part essayer de mieux comprendre ce probl me d auto cristallisation 83 3 1 MISE EN PLACE DE L EXP RIENCE DE CO CRISTALLISATION AUTOMATIS E 3 1 Mise en place de l exp rience de co cristallisation automatis e 3 1 1 Choix des prot ines mod les
513. useur anomal ou en faisant cro tre les cristaux dans des gouttes de cristallisation contenant la prot ine et le diffuseur anomal Pour obtenir des cristaux d riv s par trempage ou co cristallisation on utilise g n ralement les sels de platine d or de mercure d uranium ou de plomb K2PtCly KAu CN 2 KoHgl4 UO2 C2H302 2 HgCle K2UO2F5 etc Le seuil d absorption Lyrr de chacun de ces l ments est accessible et permet d avoir une valeur de f d environ 10 e sauf pour le platine et l uranium qui pr sentent une raie blanche dans ce seuil avec une valeur de f sup rieure 20 e7 Les temps de trempages peuvent tre relativement longs quelques heures ou plusieurs jours et les concentrations en sels d atomes lourds varient g n ralement entre 0 1 et 10 mM Mais des trempages bien plus courts short cryo soak semblent donner des d riv s de meilleure qualit cristalline avec un meilleur isomorphisme qu avec des trempage longs Nagem et al 2001 Dauter 2002 En outre la connaissance de la s quence de la prot ine peut aider orienter le choix des sels d atomes lourds tester Ainsi les sels de mercure se lient de pr f rence des cyst ines libres ou l azote des histidines et les sels de platine aux cyst ines aux histidines ou aux m thionines Garman and 60 CHAPITRE 1 DU CRISTAL LA STRUCTURE DE LA MACROMOL CULE BIOLOGIQUE Murray 2003 L incorporation du diffuseur anomal dans
514. utilisation des complexes La prot ine ayant un r le de mod le sur lequel on applique plusieurs m thodes tudier il est n cessaire de disposer d une quantit suffisante de prot ine pure et de connaitre les conditions de cristallisation qui permettent d obtenir des cristaux le plus rapidement possible qui diffractent relativement haute r solution En effet la haute r solution est indispensable pour une description pr cise des interactions entre les complexes et les prot ines Un autre crit re est de choisir un ensemble de prot ines repr sentant un ventail clectique de tailles de propri t s de sur face charges cavit s et de propri t s cristallines proportion de solvant empilement Il convient d ajouter ces crit res la possibilit de disposer de prot ines capable de cristalliser dans diff rentes conditions ce qui doit permettre de d terminer l influence des conditions physico chimiques de cristal lisation temp rature pH agent pr cipitant sur la fixation des complexes Enfin un autre crit re peut tre de pr f rer des prot ines cristallisant dans un groupe d espace de haute sym trie afin de b n ficier d une redondance lev e et ainsi am liorer le rapport signal sur bruit conduisant une estimation des diff rences anomales encore plus pr cise Dans notre cas bien que plusieurs conditions de cristallisation aient t d crites pour chacune des prot ines choisies nous n avons touj
515. uz y SAD Euz zz Plus haute r solution 1 90 1 90 Picspa Picsoufre pk o 30 80 27 45 6 46 29 08 27 16 6 78 Picsra Picsoufre rm o FOME FOMS 0 42 0 02 0 43 0 03 R solution FOM e 0 5 A 3 27 2 80 sharp t i h me ne 136 7 1 63 SIGMAA olomon 0 58 0 56 Arp Warp construit total 108 129 58 129 Tableau 4 6 Statistiques de phasage exp rimental pour deux jeux de donn es de diffraction issus de cristaux d riv s de HEWL par trempage 122 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Les tableaux 4 5 et 4 6 montrent le fort pouvoir phasant du complexe Ln HMTDPA 3 et ce m me lorsqu il est utilis basse concentration Qu il s agisse d un phasage MAD ou m me d un phasage SAD pour des donn es enregistr es hors des seuils d absorbtion L777 des lanthanides les cartes de densit lectronique obtenues ont conduit la construction et l affinement automatique de plus de 83 des acides amin s qui composent la prot ine Figure 4 16 Cependant ces tableaux mettent aussi en vidence l importance de l information MAD sur l effica cit du phasage Tableau 4 5 Le fait que l cart entre la valeur de l intensit des pics calcul s par synth se de Fourier anomale et la valeur des taux d occupation ne varie pas de fa on proportionnelle peut s expliquer par le fait que le calcul de la synth se
516. vaux d crits dans la premi re partie nous avons vu que la composition en acides amin s du site de fixation et la r partition des charges sont des param tres essentiels pour expliquer le mode de fixation des complexes de lanthanide Pour illustrer la nouvelle approche apport e par les MalDH j ai choisi les premi res observations issues de l tude comparative des surfaces lectrostatiques de la r gion de fixation du complexe GdHPDO3A des trois MalDH En comparant les surface lectrostatiques de la m me r gion sur les trois MalDH diff rentes r gion occup e 53 par le complexe GGHPDOSA sur la CaMalDH on peut d j observer des diff rences qui pourraient expliquer la fixation ou l absence de fixation du complexe Figure 7 8 225 7 1 LES MALATE D SHYDROG NASES POUR UNE TUDE RATIONALIS E DU MODE DE FIXATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDE a Surface lectrostatique de la r gion du 1 site de fixation b Surface lectrostatique de la r gion correspondante chez du GdHPDO3A sur CaMalDH PtMalDH c Surface lectrostatique de la r gion correspondante chez HvMalDH Figure 7 8 Surfaces lectrostatiques de la r gion du premier site de fixation du complexe GdHPDO3A sur CaMalDH et de la r gion correspondante chez PtMalDH et HvMalDH Echelle de 3 0 kT e charge n gative rouge 3 0 kT e charge positive bleu On voit que dans cette r gion la charge de la surface de CaMalDH diff re ne
517. x Seuls quelques cristaux co cristallis s avec 1 3 mM de complexe ont conduit des profils de diffraction enregistrables D s que la concentration en complexe est sup rieure 3 mM la co cristallisation conduit des cristaux au faci s tortur pr sentant un mauvais profil de diffraction Figure 4 49 168 CHAPITRE 4 LA FAMILLE DES TRIS TRIAZOLEDIPICOLINATES DE LANTHANIDE Figure 4 49 Cristal de HEWL co cristallis en pr sence de 2 7 mM de Eu CTDPA 3 En ce qui concerne les essais avec la thaumatine un jeu de donn es SAD enregistr au seuil d ab sorption Lyrr de l europium partir d un cristal co cristallis avec 1 3 mM de complexe conduit la pr sence d un pic de 38 5 o par synth se de Fourier anomale L intensit de ce pic est cependant relativiser car comme pour le complexe Ln HMTDPA 3 le lanthanide se situe sur l axe de sym trie d ordre 2 Le Ln CTDPA 3 comme illustration du mod le propos pour expliquer l effet supra mol culaire Comme nous l avons pr c demment mentionn les interactions hydrophobes avec la prot ine entre les noyaux triazoles des ligands et les acides amin s tryptophane de la prot ine sont le mode de fixation privil gi par les membres de la famille des Ln TDPA 3 De par le groupement carboxylate suppl mentaire sur chacun de ses ligands le complexe Ln CTDPA 3 f pr sente une charge globale six fois n gative Or il s ag
518. x d occupation de diffuseurs anomaux identiques et pour des donn es de diffraction enregistr es leur seuil d absorption un site totalement occup par un atome de lanthanide permettra de d terminer la structure d une pro t ine de masse mol culaire neuf fois plus importante qu un site totalement occup par un atome de s l nium cf introduction Cette seconde partie est ainsi constitu e de trois chapitres Le premier chapitre concerne le phasage de l amino peptidase dod cam rique TET1 12s de 480 kDa grand assemblage prot ique issu de l arch e Pyrococcus Horikoshii La r ussite de ce phasage illustre le pouvoir phasant des lanthanides et ce m me sur les donn es basse r solution Le second chapitre est davantage m thodologique En premier lieu je pr senterai la nouvelle approche mise en place pour approfondir notre connaissance des modes de fixation des diff rents complexes tudi s Cette approche s appuie sur la grande famille des malate d shydrog nases MalDH En second lieu je d crirai les trois nouvelles structures de malate d shydrog nases d termin es haute r solution gr ce aux complexes de lanthanide issus de l imagerie m dicale Je pr senterai ainsi les nouveaux clairages sur adaptation halophile que nous avons pu d gager de ces structures Enfin le troisi me chapitre est relatif l tude de la fixation des complexes de lanthanide men e sur un grand assemblage prot ique me
519. x form s de ligands HMTDPA Le jeu de donn es de diffraction MAD 1 40 de r solution m a cette fois conduit construire un complexe form de deux ligands HECTPA et d un ligand HMTDPA Cependant c est en diminuant le niveau de contour de la carte de densit lectronique une valeur de 0 70 6 que la queue choline des ligands 1 et 2 apparait de fa on distincte Si les contours sont de 1 0 o il m a t difficile de distinguer la fonction hydroxyethylcholine de la fonction hydroxymethyl des ligands Mod liser le premier ligand en tant que HECTDPA fut aussi confort par le fait que la carte de densit lectronique affin e ne montre qu un seul site de fixation occup 64 et une liaison hydrophobe avec le Trp123 de type n m caract ristiques du ligand HECTDPA et non pas deux sites de fixation et une interaction CH x caract ristiques du ligand HMTDPA Tableau 4 24 Dans les structures avec un complexe unique les ligands avaient pu tre ais ment mod lis s M me observation dans le cas de la combinatoire 4 o le complexe hybride issu d une synth se en laboratoire de chimie est bien compos de diff rents ligands que nous avons pu facilement mod liser Dans cette mesure nous pensons qu il n y a pas change de ligands lorsque l on m lange des solutions de complexes Combinatoire 3 M lange d une solution de complexe Eu HMTDPA 3f 4 mM avec une solution de Eu HETDPA 3P 4 mM En m lange
520. xation du complexe dans les cristaux est moins facilement v rifiable lors d une exposition aux UV car non seulement les cristaux luminescent mais le pr cipit qui les entoure aussi De fait le contraste entre la luminescence mise par le pr cipit et celle des cristaux est un peu moins discernable sous binoculaire Figure 4 12 a 20 mgmL TdTHAU b 20 mgmL t TdTHAU 4 5 mM Eu HMTDPA s3 _ 4 5 mM Eu HMTDPA 3 lumi re visible proches UV Figure 4 12 D tection du EUHMTDPA 3 dans des cristaux d riv s de TATHAU 111 4 2 PREPARATION DE CRISTAUX DERIVES AVEC LE COMPLEXE LN HMTDPA EN VUE D UNE EXP RIENCE DE DIFFRACTION DES RAYONS X Il m a t possible d obtenir des cristaux d riv s de thaumatine en co cristallisation ou en trempage avec diff rentes concentrations de complexe Seuls les cristaux d riv s obtenus par co cristallisation ont permis un phasage exp rimental 4 2 4 La Prot ine Fluorescente Verte de Aequorea victoria AvEGFP pour Ae quorea victoria Enhanced Green Fluorescent Protein Nous avons une nouvelle fois choisi la AvEGFP prot ine qui a d j t utilis e lors de l tude consign e dans le chapitre pr c dent La prot ine a t produite et purifi e au laboratoire partir du clone bact rien transform que notre collaborateur M Philippe Oger du Laboratoire de Sciences de la Terre l Ecole Normale Sup rieure de Lyon nous avait confi Sa

Romain TALON

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