Home

liste des tableaux

1. TR H8 730G 2000 1000 1 Lau 13C 730T 531 C 134T o N Figure 18 Sch ma des constructions utilis es lors des exp riences de mutagen se dirig e pour le g ne YWHAB H8 141T 2000 1000 47 L activit promotrice des contructions mut es a t test e par des essais de g ne rapporteur pour v rifier l impact des mutations sur l activit promotrice d YWHAB Le r sultat de la transfection cellulaire dans la lign e JEG3 est montr a la Figure 19 On constate que le promoteur mut est toujours fonctionnel avec des valeurs de lucif rases sont de 33 330 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Une activit diff rentielle est observ e p lt 0 001 dans les trois lign es o l haplotype H8 montre une activit promotrice plus faible que les deux autres haplotypes mut s le H8 730G montre une activit de 1 1 2 0 fois sup rieure l haplotype H8 original et le H8 141T montre aussi une activit de 1 2 2 0 fois sup rieure l haplotype H8 Le m me profil d expression a t observ dans toutes les lign es cellulaires test es 48 E H8 600 DH8 730G 500 BH8 141T 400 4 OpGL2BASIC i a ja msv40 300 v T 200 100 0 Figure 19 Impact fonctionnel de la mutagen se dirig e partir de l haplotype H8 du promoteur d YWHAB La transfection cellulaire illustr e est faite dans la lig
2. 285 T gt C chr10 49 609 402 49 609 402 rs28395807 109 C gt A chr10 49 609 578 49 609 578 rs3730154 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 Tableau XXI SNPs du promoteur de NOD1 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1684 C gt A chr7 30 520 076 30 520 076 rs5 743322 972 C gt T chr7 30 519 364 30 519 364 638 C gt T chr7 30 519 030 30 519 030 210 G gt A chr7 30 518 602 30 518 602 rs2075816 174 A gt G chr7 30 518 566 30 518 566 rs2066973 146 G gt C chr7 30 518 538 30 518 538 rs7790806 86 A gt C chr7 30 518 478 30 518 478 rs2108356 85 A gt T chr7 30 518 477 30 518 477 rs2108355 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 XXvi Tableau XXII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne BAG1 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1725 1710 1023 685 453 Fr quence A gt G A gt G C gt A C gt G C gt G Cohorte Contr les Patients LLA 1 A C 23 75 27 5 20 0 3 A A C 6 25 5 0 7 5 4 G C 68 75 67 5 70 0 Tableau XXIII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne BAG3 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1724 856 788 787 7
3. 80 Coleman S L Hoogendoorn B Guy C Smith S K O Donovan M C Buckland P R 2002 Streamlined approach to functional analysis of promoter region polymorphisms Biotechniques 2002 Vol 33 pp 412 418 Conde L Vaquerizas J M Santoyo J Al Shahrour F Ruiz Llorente S Robledo M Dopazo J 2004 PupaSNP Finder a web tool for finding SNPs with putative effect at transcriptional level Nucleic Acid Research 2004 Vol 32 pp W242 W248 Conklin DS Galaktionov K Beach D 1995 14 3 3 proteins associate with CDC25 phosphatases Proc Natl Acad Sci USA 1995 Vol 92 pp 7892 7896 Cory S Adams J M 2002 The Bcl 2 family regulators of the cellular life or death switch Nat Rev Cancer 2002 Vol 2 pp 647 656 Cryns V Yuan J 1998 Proteases to die for Genes Dev 1998 Vol 12 11 pp 1551 1570 Dai D L Martinka M Bush J A Li G 2004 Reduced Apaf 1 expression in human cutaneous melanomas British Journal of Cancer 2004 Vol 91 pp 1089 1095 Dalby B Cates S Harris A Ohki EC Tilkins ML Price PJ Ciccarone VC 2004 Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent primary neurons siRNA and high troughput applications Methods 2004 Vol 33 pp 95 103 Datta S R Katsov A Hu L Petros A Fesik S W Greenberg M B Yaffe M E 2000 14 3 3 proteins and survival kinases cooperate to inactivate BAD by BH3 domain phosphorylation Molecular Cell 2000 Vol 6 pp 41 51 Degterev A Boyce M Yuan J 2003 A decade
4. Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 515T gt C sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules JEG3 Les puits 1 5 repr sentent la sonde marqu 515T alors que les puits 6 a 9 repr sentent la sonde 515C Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines a l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue 56 Sonde non marqu e 95C 95G AP2 Extrait prot ique lt Complexe 1 lt lt Complexe 2 LE Complexe 3 pe lt Complexe 4 4 4 bha 4 Complexe 5 t4 i F 123 45 6 7 8 9 Figure 25 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison non diff rentielle au niveau du rSNP 95 C gt G d YWHAQ Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 95C gt G sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules HeLa Les puits 1 4 repr sentent la sonde marqu
5. Tableau XI S quence des oligonucl otides utilis s pour les essais de retardement sur gel G ne SNP S quence 913 C CAACTACCTTCAGAGGAGTAG 913 G CAACTACCTTGAGAGGAGTAG 730T CAGGTTGGAGTGCAGTGGCATGACCATAGCTCACTGCAGCCT 730 G CAGGTTGGAGTGCAGGGGCATGACCATAGCTCACTGCAGCCT oe 531C AAAGAAGGAAAAGGTAAGTACCCTGAAGGATTGAAAGGATTAAATGAA 531T AAAGAAGGAAAAGGTAAGTATCCTGAAGGATTGAAAGGATTAAATGAA 141C CGCCCTGCCCCGGCCCCTGCAACCCTGCCTTTCGCTCT 141T CGCCCTGCCCCGGCCCCTGCAATCCTGCCTTTCGCTCT 134 T CCTGCCCCGGCCCCTGCAACCCTGCCTTTCGCTCTTCTTCCTCC 134 C CCTGCCCCGGCCCCTGCAACCCTGCCCTTCGCTCTTCTTCCTCC 7G GCCAGGACCGGAGCGGAAGTGGCGATCGGAGCGGAAGTGGAGCTAC 7T GCCAGGACCGGAGCGGAAGTGGCTATCGGAGCGGAAGTGGAGCTAC 515T TTCTTTCCTCCACCTTTCTATCCGTGACAAAGGTTTGGATCC 515C TTCTTTCCTCCACCTTTCCATCCGTGACAAAGGTTTGGATCC YWHAQ 95C CCGCCCAATGATGCGCCGAGCTTCTCCCGAGAGTCCCGCCCCCAG 95G CCGCCCAATGATGCGCCGAGCTTGTCCCGAGAGTCCCGCCCCCAG Contr le de AP2 GATCGAACTGACCGCTTGAGGCCCGT sp cificit Les positions des SNPs sont calcul es en prenant le d but de l exon 1 comme tant la position 1 Seule la s quence en brin sens est donn e Xxi Tableau XII S quence des oligonucl otides utilis s pour les essais de mutagen se dirig e G ne SNP S quence 730 5 CAGGTTGGAGTGCAGGGGCARGACCARAGCT 3 YWHAB T gt G 141 5 CCCGGCCCCTGCAATCCTGCCTTTC 3 C T 95 5 ACTCTCGGGAGAAGCTCGGCGCATCATTGG
6. 45 0 45 0 45 0 Tableau XXVII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne MAP4K3 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1370 440 C gt T 316 Fr quence T gt C C gt T Cohorte Contr les Patients LLA 1 T C C 59 3 50 0 67 4 2 T T C 384 50 0 28 3 xxviii Tableau XXVIII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne MAPK1 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1334 1040 351 134 Fr quence A gt T DELT T gt G A gt T Cohorte Contr les Patients LLA 1 A G T 46 0 46 9 44 4 4 A T T A 44 0 43 8 44 4 Tableau XXIX Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne MAPKS8 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1937 1695 1049 897 674 509 285 109 Fr quence G gt A C gt T G gt A C gt T C A G T gt C C gt A Cohorte Contr les Patients LLA 1 G C G C C A T A 57 50 65 0 50 0 4 G C A C S A T A 20 00 15 0 25 0 5 G T G C A T A 6 25 5 0 7 5 6 A C A C A T A 10 00 7 5 12 5 Tableau XXX Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne NOD1 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1684 972 638 210 174 146 86 85 Fr quence C gt A C gt T C gt T G
7. CO une lyse passive des cellules est effectu e et la mesure de l activit du g ne rapporteur la lucif rase est r alis e avec la trousse DLR assay Promega avec un luminom tre Spectra Max 190 Molecular Devices selon le protocole du manufacturier L activit Firefly des constructions haplotypiques est normalis e par l activit du contr le interne de la Renilla puisqu on exprime les r sultats en ratio de la Firefly Renilla Les r sultats pr sent s pour chaque haplotype correspondent la moyenne de quatre r plicas de diff rents clones Pour qu une r gion promotrice tudi e soit 32 d clar e active son activit doit tre d environ 10 fois supp rieure l activit du promoteur pGL3basic Coleman 2002 Des analyses statistiques sont effectu es l aide du test param trique Student s t test non pair pour d terminer le seuil de signification valeur p des r sultats observ s Exp riences de Retard sur gel L impact de certains SNPs sur la liaison entre l ADN et les prot ines nucl aires activateurs ou r presseurs de la transcription t d termin par essais de retard sur gel pour les g nes YWHAB et YWHAQ Les oligonucl otides double brins marqu s au P correspondent la r gion entourant le site polymorphique d int r t la liste des s quences des oligonucl otides test s est en annexe Tableau XI La s quence de ces sondes est d termin e en utilisant le logiciel MatInspector
8. Caspase 8 in apoptosis the begining of the end IUBMB Life 2000 Vol 50 2 pp 85 90 Kurosaka K Takahashi M Watanabe N Kobayashi Y 2003 Silent cleanup of very early apoptotic cells by macrophages Journal of Immunology 2003 Vol 171 pp 4672 4679 Kuwana T Newmeyer D D 2003 Bcl 2 family proteins and the role of mitochondria in apoptosis Curr Opin Cell Biol 2003 Vol 15 pp 691 699 Kuzelova K Grebenova D Pluskalova M Kavan D Halada P Hrkal Z 2009 Isoform Specific cleavage of 14 3 3 proteins in apoptotic JURK MK1 cells Journal of Cellular Biochemistry 2009 Vol 106 pp 673 681 Labuda D Labbe C Langlois S Lefebvre J F Freytag V Moreau C Sawwicki J Beaulieu P Pastien T Hudson T J 2007 Patterns of variation in DNA segments upstream of transcription start sites Human Mutations 2007 Vol 28 pp 441 450 Laitinen T Polvi A Rydman P Vendelin J Pulkkinen V Salmikangas P Makela S Rehn M Pirskanen A Rautanen A Zucchelli M Gullst n H Leino M Alenius H Pet ys T Haahtela T Laitinen A Laprise C Hudson TJ Laitinen L A Kere J 2004 Characterization of a common susceptibility locus for asthma related traits Science 2004 Vol 304 pp 300 304 Lane DP 1993 A death in the life of p53 Nature 1993 Vol 362 pp 786 787 Lavrik I N Krammer P H Life and Death decisions in the CD95 system Main pro and anti apoptotic modulators ActaNaturae pp ISSN 2075 8251 Levine AJ 1997 P53 the
9. Kostakis A Anagnou N P Nikiteas N 2009 Survivin 31G G promoter polymorphism and sporadic colorectal cancer Int J Colorectal Dis 2009 Vol 24 pp 145 150 Genome wide association study of CNVs in 16 000 cases of eight common diseases and 3 000 shared controls Consortium The Welcome Trust Case Control 2010 2010 Vol 464 pp 713 720 Graeber T G Osmanian C Jacks T Housman D E Koch C J Lowe S W Giaccia A J 1996 Hypoxia mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours Nature 1996 Vol 379 6560 pp 88 91 Graf M Brobeil A Sturm K Steger K Wimmer M 2010 14 3 3 beta in the healthy and diseased male reproductive system Human Reproduction November 26 2010 Vol 0 0 pp 1 8 82 Gragan Y P Bidlack W R Cohen S M Gldsworthly T L Hard G C Howard P C Riley RT Voss K A 2001 Implications of apoptosis for toxicity carcinogenicity and risk accessment fumonisin B 1 as an example Toxicology Science 2001 Vol 61 pp 6 17 Gross A McDonnell J M Korsmeyer S J 1999 BCL 2 family members and the mitochondria in apoptosis Genes amp developpement 1999 Vol 13 pp 189 1911 Hajn czky G Davies E Madesh M 2003 Calcium signaling and apoptosis Biochem Biophys Res Commun 2003 Vol 304 3 pp 445 454 Harris N Brill E Shohat O and al 1986 Molecular basis for heterogeneity of human p53 protein Mol Cell Biology 1986 Vol 6 pp 4650 4656 Healy J B langer H Beauli
10. L int grit de l ADN plasmidique des clones obtenus est v rifi e par s quencage afin de confirmer l identit des l haplotypes d sir s avant d effectuer les exp riences de transfections transitoire 31 Pour faire l essai de g ne rapporteur avec la lucif rase on a utilis le protocole de Promega fournit dans la trousse Dual Luciferase Reporter Assay System Les constructions des clones ont t transfect dans trois diff rentes lign es cellulaires JURKAT JEG3 et HeLa en utilisant la Lipofectamine 2000 qui est un agent transfectant qui forme des gouttelettes lipidiques autour de l ADN facilitant ainsi la p n tration a travers la membrane phospholipidique des cellules eucaryotes Dalby 2004 L utilisation de lign es cellulaires diff rentes permet de v rifier la pr sence d une sp cificit cellulaire tissu sp cifique Les constructions sont cotransfect es avec le vecteur pRL CMV Promega contenant la lucif rase Renilla sous le contr le d un promoteur SV40 ratio 200 1 pour les JEG3 et HeLa et 20 1 pour les JURKAT Cette cotransfection d un contr le interne permet de normaliser les exp riences en fonction de l efficacit de la transfection d un chantillon a l autre Le vecteur pGL3basic Invitrogene est utilis comme t moin n gatif alors que le vecteur pGL3SV40 Invitrogene est utilis comme t moin positif Apr s 24 heures d incubation 37 C dans un incubateur contentant 5 de
11. ases vont a leur tour activer les caspases effectrices en aval de la cascade telles que la caspase 3 la caspase 6 et la caspase 7 Li 1998 eeeeTTTTT TTT rr rrr TE ett TTT reer A Vie lt lt O Pr oo ETS Mitochondria EP Cytochrome c lt gt Apat 1 es t Apoptosome Caspase 9 Caspases 3647 Go o o C Figure 4 Sch ma des diff rentes composantes menant l activation de la voie intrins que de l apoptose Ashkenazi 2002 Malgr leurs diff rences les voies extrins que et intrins que de l apoptose ont des points communs tel que l importance de la caspase 8 dans leur m canisme d activation Kruidering 2000 Cette cyst ine prot ase est un exemple de cross talk entre les deux voies puisqu elle peut cliver et activer BID une des prot ines de la famille des BCL 2 Igney 2002 Sous sa forme active nomm e tBID truncated BID elle peut migrer vers la surface de la mitochondrie et remplacer les prot ines BAX et BAK dans le d clenchement de l apoptose via la lib ration du cytochrome c Li 1998 Esposti 2002 Autres voies de l apoptose L apoptose peut aussi tre d clench par d autres voies secondaires Il existe une voie qui implique les cellules lymphocytes T cytotoxiques CTL et la lib ration les enzymes nomm es perforines et granzymes Lors de la d granulation des cellules CTL des perforines permettent la perm abilisation de la membrane de la cellule
12. nes De plus il est possible qu un seul polymorphisme n ait pas ou peu d impact mais que ce soit la combinaison de plusieurs polymorphismes i e haplotype qui modifie l expression du g ne Nous proposons que ces rSNPs g n rent une variabilit interindividuelle dans les m canismes contr lant l apoptose d o un risque variable de d velopper certaines maladies complexes tel que le cancer AAAA Exons _ a rSNP Expression Voie 1 Risque de g nique m tabolique d velopper une maladie Figure 10 Variation des taux de transcrits et des prot ines correspondantes caus e par un rSNP 26 Objectifs du projet L objectif g n ral est d identifier des rSNPs et haplotypes fonctionnels qui seraient responsables de la variation des niveaux d expression des g nes impliqu s dans la voie intrins que d apoptose Plus particuli rement j ai tudi la voie intrins que puisque celle ci est initi e suite des stress intracellulaires qui semblent favoriser le d r glement de voies biologiques impliqu es dans le d veloppement d un cancer tel que la leuc mie lymphoblastique aigue Les objectifs sp cifiques du projet de recherche sont 1 Identifier les polymorphismes pr sents dans la r gion promotrice proximale des 11 g nes d apoptose suivants BAG1 BAG3 CARD9 CD47 CYCS MAP4K3 MAPK1 MAPK8 NOD1 YWHAB et YWHAQ 2 D terminer les haplotypes les plus fr quents dans la population po
13. promotrice de ces trois haplotypes a t test e par des essais de g ne rapporteur pour v rifier leur impact sur l activit promotrice Figure 15 On constate que le promoteur sous clon est actif puisque ses valeurs de lucif rase sont de 15 1000 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Une activit diff rentielle est observ e p lt 0 005 et ou p lt 0 0005 dans les trois lign es cellulaires o l haplotype H8 montre une activit promotrice plus forte que les deux autres l haplotype H1 a l activit promotrice la plus faible de 1 6 a 2 3 fois plus faible que l haplotype H8 et l haplotype H11 a l activit promotrice interm diaire de 1 5 a 1 7 fois seulement plus faible que l haplotype H8 Un profil d expression similaire a t observ dans toutes les lign es cellulaires a l exception de l haplotype H11 qui a eu une activit plus faible que l haplotype H1 dans la lign e JURKAT Ces r sultats indiquent la pr sence d une activit promotrice diff rentielle in vitro selon l haplotype du promoteur d YWHAB pr sent 41 14 BH1 m H8 12 GH11 10 A pGL3basic 2 e 4 2 0 a JEG3 x 1 HELA x 100 Jurkat x 100 Figure 15 Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur d YWHAB La transfection cellulaire est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes JEG 3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences
14. s reconnaissante Xvi INTRODUCTION Apoptose Chaque jour un corps adulte produit environ 50 70 billions de cellules grace au cycle cellulaire Kitada 2002 Afin de rester quilibr il limine autant de cellules afin de garder son corps en hom ostasie Il existe deux diff rents types de mort cellulaire l apoptose et la n crose Ces deux m canismes cellulaires ont des caract risques qui les distringuent et ils peuvent se produire ind pendament s quentillement et m me silmultan ment Zeiss 1997 Hirsch 1997 D une part la n crose survient suite a des traumatismes extr mes hypothermie hypoxie isch mie ou suite une exposition divers agents toxiques Kanduc 2002 Clavien 2000 Les organelles intracellulaires tels que la mitochondrie sont alors d truits ce qui causera une lyse cellulaire compl te La destruction de la membrane plasmique cause ultimement la lib ration d enzymes lysomales Trump 1997 La n crose est souvent associ e avec des dommages tissulaires et une r action inflammatoire intense Opie 1962 D autres part l apoptose ou la mort cellulaire programm e est un processu biologique hautement r gul qui limine de fa on contr l e les cellules en exc s endommag es infect es potentiellement dangereuses pour le corps Elmore 2007 Denecker 2001 Lors de l activation de l apoptose les cellules activ es forment des corps apoptotiques et leur ADN se fragmente Les co
15. 26 Epub 2010 Dec 1 2010 Vol 33 4 Opie Eugene L 1962 On the relation of necrosis and inflammation to denaturation of proteins J Exp Med 1962 Vol 115 3 pp 597 608 Park J Y Park J M Jang JS Choi J E Kim K M Cha S I Kim C H Kang Y M Lee W K Kam S Park R W Kim LS Lee J T Jung T H 2006 Caspase 9 promoter polymorphisms and risk of primary lung cancer Human Molecular Genetics 2006 Vol 15 12 pp 1963 1971 Pastinen T Hudson T J 2004 Cis acting regulatory variation in the human genome Science 2004 Vol 206 pp 647 650 Pastinen T Sladek R Gurd S Sammak A Ge B Lepage P Lavergne K Villeneuve T Gaudin A Brandstorm H 2004 A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression Physiological Genomics 2004 Vol 16 pp 184 193 Pepper C Hoy T Bentley P 1998b Elevated Bcl 2 bax are a consistent feature of apoptosis resistance in B cell chronic lymphocytic leukaemia and are correlated with in vico chemoresistance Leuk Lymphoma 1998b Vol 28 3 4 pp 355 361 Pereira Faca Kuick Puravs Zhang Krasnoselsky Phanstiel Qiu Misek Hinderer Tammemagi Landi Caporaso Pfeiffer Edelstein Goodman Barnett Thornquist Brenner Hanash 2007 Identification of 14 3 3 theta as an antigen that induces a humoral response in lung cancer Cancer Research 2007 Vol 67 24 pp 12000 12006 Piedrafita F J Molander R B Vansant G Orlova E A Pfahl M Reynolds W F 1996 An Alu elem
16. 3 YWHAQ C gt G 95 5 ACTCTCGGGACAAGCTCGGCGCATCATTGG 3 G C Les positions des SNPs sont calcul es en prenant le d but de l exon 1 comme tant la position 1 xxii Tableau XIII SNPs du promoteur de BAG1 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1725 A gt G chr9 33 266 445 33 266 445 rs706123 1710 A gt G chr9 33 266 430 33 266 430 rs706122 1023 C gt A chr9 33 265 743 33 265 743 rs11791605 685 C gt G chr9 33 265 405 33 265 405 rs16919130 453 C gt G chr9 33 265 215 33 265 215 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 Tableau XIV SNPs du promoteur de BAG3 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1724 AT chr10 121 409 158 121 409158 rs61869035 856 G gt A chr10 121 410 026 121410 026 rs2420641 788 T gt DEL T C chr10 121 410 094 121410 094 rs35117013 787 DELA chr10 121 410 095 121410 095 rs34330597 786 DEL A chr10 121 410 096 121410 096 rs35097693 212 C gt T chr10 121 410 670 121410 670 rs11199059 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 Tableau XV SNPs du promoteur de CARD9 avec leur position g nomique xxiii SNP Position chromosomique Num ro rs 2016 A gt G chr9 139270149 139270149 rs3088081 1772 T gt C chr9 13926990
17. 95C alors que les puits 5 a 8 repr sentent la sonde 95G Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue 57 Puisqu il semble que le SNP 95C gt G soit responsable de l activit promotrice diff rentielle observ e entre les trois haplotypes d YWHAQ des essais de mutagen se dirig e ont t r alis s pour valider cet effet Pour ce faire les constructions plasmidiques des haplotypes H1 et H2 ont t utilis es comme gabarits pour les diff rentes r actions ind pendantes de mutagen se Figure 26 Une r action a permis de muter l haplotype H1 en haplotype H2 en changement le nucl otide C en G a la position 95 Le r sultat attendu tait une diminution de l activit promotrice de l haplotype H1 95G Une seconde r action inverse a permis de muter l haplotype H2 en haplotype H1 en changement le nucl otide G en C la position 95 Le r sultat attendu tait une aug
18. C G semble affecter l activit diff rentielle puisque l all le C est seulement observ avec l haplotype H1 tandis que l all le G est observ dans les deux autres haplotypes avec l activit promotrice plus faible Les exp riences de mutagen se dirig e sur le SNP 95C G n ont pas permis de valider l impact directe de ce SNP sur l activit promotrice diff rentielle observ e pour YWHAQ Les essais de transfections cellulaires des contructions raccourcis 600 bp du g ne YWHAQ H1 95G et H2 95C ont montr une activit promotrice semblable pour les haplotypes H1 et H2 Figure 29 i e une perte de l activit promotrice diff rentielle Il est connu que la liaison d un complexe prot ique tel que les facteurs de transcription peut n cessiter la liaison plusieurs points d ancrage l ADN Ainsi la perte d une r gion enti re d ADN peut emp cher la liaison du complexe prot ique de ce SNP ainsi causer la perte l activit 72 promotrice diff rentielle d YWHAQ Ceci sugg re que la r gion tronqu e en amont influence ses SNPs afin de cr er l activit promotrice diff rentielle ant rieurement avec les constructions de 2kb Les essais de retard sur gel n ont pas montr de liaison diff rentielle au niveau des deux rSNPs et ce dans les trois lign es cellulaires test es Figure 24 et Figure 25 avec les conditions exp rimentales utilis es Une tude pr c dente a tudi l expression de l isofor
19. En effet ce rSNP repr sente la seule diff rence g notypique partag e entre les haplotypes H2 et H4 mais divergeant de haplotype H1 53 350 mH2 H1 300 mH4 SV40 250 pGL3 basic s200 oi oO Firefly Reni 100 50 JEG3 x 100 HELA x 100 Jurkat x 10 000 Figure 23 Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur d YWHAQ La transfection cellulaire est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes JEG 3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 10 000 selon indication Les valeurs p sont calcul s a partir de 4 r plicas avec le test Student non paire p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 54 Des essais de retard sur gel ont t effectu s pour v rifier la pr sence de liaisons diff rentielles au niveau des SNPs de cette r gion promotrice Les gels des SNPs 515T gt C et 95C gt G avec l extrait nucl aire JEG3 et HeLa respectivement sont montr s a titre d exemple Figure 24 et Figure 25 Tout d abord avec le SNP 515T gt C Figure 24 on observe la pr sence de sept diff rents complexes prot iques complexe 1 7 qui lient de fa on non diff rentielle autant 515T que 515C puits 2 vs puits 6 La comp tition dans les puits 3 et 4 ou dans les puits 7 et 8 confirme que les complex
20. Num ro rs R gion r gulatrice R f rences MDM2 Rs227944 Promotrice Bond and al MDM2 Rs937283 Promotrice Ohsaka and al Rs2870820 P16 Position 191 Promotrice Ohsaka and al CASP3 Rs4647603 5 UTR Jang and al CASP8 Rs3834129 Promotrice Mei Sheng Xiao and al Rs3769821 CASP8 Position 652 Promotrice Kesarwani and al CASP9 Position 1263 Promotrice Kesarwani and al CASP9 Rs4645978 Promotrice Park and al Rs4645981 BIRC5 Rs9904341 Promotrice Ma andal Gazouli and al Jang and al BAX Rs4645878 5 UTR Saxena and al BCL 2 Rs2279115 Promotrice Nuckel and al BCL 2 Rs4987853 3 UTR Enjuanes and al APAF1 Rs17028658 3 UTR Enjuanes and al Voir texte ci haut pour r f rences d taill es ou autres r f rences 23 Haplotypes et d s quilibre de liaison Puisque le nombre de SNPs dans le g nome est tr s lev il est inconcevable de vouloir tester l impact fonctionnel de chacun de ceux ci sur l expression g nique On se sert alors de la notion de d s quilibre de liaison qui mesure la coexistence non al atoire des all les de deux loci Deux all les en d s quilibre de liaison sont trouv s ensemble sur le m me haplotype plus souvent que ce qui peut tre pr vu par le hasard Beckmann 2007 Un d s quilibre de liaison total survient lorsque deux all les de deux loci cos gr gent toujours n ayant jamais subi de recombinaison entre ces deux loci Puisque le taux de recombinaison dans le g nome est assez faible environ 1 par 100 Mb pa
21. Rs11101312 Rs17697972 Rs10857561 Rs17697978 Rs11332662 Rs17698002 Rs28395807 Rs3730154 Non Non YWHAB Rs3092669 Rs3091409 Rs3092248 Rs6031847 Rs6031848 Rs6031849 Rs35664412 Oui Oui YWHAQ 2 Rs10203320 Rs2091210 3 Oui Oui plusieurs g nes n ont pas d essais de retardement sur gel cause de l absence d activit promotrice diff rentielle Les g nes en gris sont ceux ayant un impact fonctionnel 38 YWHAB 14 3 3 B YWHAB l isoforme b ta B de la famille 14 3 3 est un g ne anti apoptotique qui code pour une prot ine qui lie diff rentes prot ines incluant des phosphatases des kinases et des r cepteurs membranaire YWHAB est impliqu e dans la r gulation de la progression du cycle cellulaire et dans la tumorigen se Ce g ne est connu pour favoriser l activation de la voie MAPK mitogene activated protein kinase mais son m canisme menant la carcinogen se n est pas clairement compris Graf 2010 Le res quen age de la r gion promotrice d YWHAB chez 40 individus a permis d identifier sept rSNPs 913C gt G 730T gt G 531C gt T 141C gt T 134T gt C 7G gt T 70in CGC Tableau III Le sch ma du promoteur d YWHAB est illustr a la Figure 14 Tous les SNPs trouv s dans ce promoteur taient r pertori s dans dbSNP Tableau III SNPs du promoteur d YWHAB avec leur position g nomique
22. d YWHAB Figure 21 On constate que les promoteurs raccourcis sous clon sont actif puisque ses valeurs de lucif rase sont de 50 a 1000 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Aucune activit diff rentielle n est observ e entre les deux haplotypes H1 900bp et H8 900bp dans les lign es cellulaires test es Le m me profil d expression a t observ dans les deux lign es cellulaires 50 Cette perte d activit diff rentielle entre ses deux haplotypes permet de confirmer l importance d un ou des SNPs 913C gt G et 730T gt G dans l activit promotrice diff rentielle observ e auparavant avec les haplotypes H1 et H8 de 2kb 1000 4 H1 900pb i m H8 900pb 800 pGL3 basic SV40 N So Oo 1 Ratio Firefly Renilla Ww gt vi fo Oo Oo O Oo Oo N Oo oO 100 Jurkat x 1000 JEG 3 x 100 Figure 21 Impact fonctionnel des promoteurs raccourcis d YWHAB La transfection cellulaire illustr e est faite dans 2 lign es cellulaires diff rentes JURKAT et JEG 3 Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Les valeurs p sont calcul s partir de 4 r plicas avec le test Student non pair p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 51 YWHAQ 14 3 3 T 0 YWHAQ l
23. de l apoptose et des suppresseurs de tumeurs Cette liaison prot ique est phosphos rine d pendante ou phosphos rine ind pendante selon le partenaire de liaison Muslin 1996 La fonction des prot ines 14 3 3 varie selon le mode d action sur leurs cibles Obsilova 2008 1 la prot ine14 3 3 peut changer la conformation de son partenaire de liaison 2 la prot ine 14 3 3 peut obstruer physiquement les s quences sp cifiques ou les caract ristiques structurelles de son partenaire de liaison 3 la prot ine 14 3 3 peut agir comme une mol cule adaptatrice et ancrer des prot ines proximit les unes des autres 65 Un des m canismes d action des prot ines 14 3 3 est leurs capacit a modifier l activit des sites de liaison a l ADN Un exemple connu est la liaison avec la prot ine suppresseur de tumeur p53 Apr s un dommage l ADN la d phosphorylation de la Ser376 g n re un motif de liaison des 14 3 3 l extr mit carboxyle de la prot ine p53 Waterman 1998 Figure 30 Cette association conduit une augmentation de son activit de liaison l ADN Par contre la perte de cette capacit lier les prot ines 14 3 3 conduit une forte r duction de la capacit de la prot ine p53 induire la transcription des g nes qui interviennent normalement dans un arr t du cycle cellulaire apr s un dommage l ADN Stavridi 2001 A aE Beal Figure 30 Les dommages l ADN indu
24. eee eae tre 29 Experiences de Retard Sur pelle nn eee ee 32 Mutagen se ditig Re A en nn Nr vere ry ed 33 vii R SULTATS on a SR D cn 35 D ANA S PAU EEE ne 0 DE dE a a a 38 YWHAOQ LAB a TO ee nn 51 DISCUSSIONS nat dec 62 Rappel du projet SSSR en at cee hea ve 62 Sommaire des r sultats ODLENUS 28m en tn 63 La famille prot ique 143 352 eae haters ne NS ne ea teenies 64 YWHAB TEA SES seein cea renee ee en ee 68 YWHAQ 14 3 3 T nina 71 EiMitations Gel CU cesta eee ened sn ne ns 74 CONCESSIONS nd E N tea 76 BIBLIOGRAPHIE ice taen neue do 77 ANNEXES arianami nnana A O NA AN xvii viii LISTE DES TABLEAUX Tableau I Polymorphismes des r gions r gulatrices des g nes de l apoptose associ s a diverses maladies Tableau II R sum des r sultats obtenus pour les promoteurs des 11 g nes tudi s de la voie intrins que de l apoptose Tableau III SNPs du promoteur d YWHAB avec leur position g nomique Tableau IV Haplotypes fr quents de la r gion promotrice d YWHAB et leur fr quence observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Tableau V Liste des facteurs de transcription pr dits lors des analyses in silico pour le SNP 730 T G du g ne YWHAB par le logiciel MatInspector Tableau VI Liste des facteurs de transcription pr dits lors des analyses in silico pour le SNP 141 C T du g ne YWHAB par le logiciel MatInspector Tableau VII SNPs du promoteur d YWHAQ avec le
25. effet sur la prot ine Finalement les rSNPs localis s dans la partie promotrice du g ne r gion r gulatrice peuvent avoir un impact fonctionnel sur le niveau d expression du g ne donc le niveau de transcrit de la prot ine en affectant les sites de liaisons des facteurs de transcription 18 SNPs r gulateurs rSNPs Au cours des derni res ann es la plupart des tudes r alis es ont port sur les SNPs localis s dans dans la partie codante de la prot ine cSNP coding SNP qui pourraient alt rer la fonction de la prot ine Mitchison 2001 On croyait alors que seuls les cSNPs qui modifiaient la s quence d une prot ine avaient de l importance l oppos les SNPs non codants en particulier des r gions r gulatrices ont t moins tudi e malgr l estimation qu au moins 25 de la variabilit expliquant les maladies r siderait dans les r gions r gulatrices des g nes Knight 2005 Au cours de me mon stage mon attention port plus particuli rement sur les rSNPs Les SNPs positionn s dans la r gion r gulatrice d un g ne peuvent influencer la liaison de facteurs de transcription gain ou perte et ainsi affecter le niveau de transcrits de la prot ine Pastinen 2004 Cette modification d un site de liaison expliquerait la diff rence du niveau de transcrits de la prot ine Les rSNPs pourraient expliquer jusqu 25 35 de la variabilit interindividuelle Pastinen 2004 Comme le taux de pro
26. humans Mol Biol Evol 2002 Vol 19 pp 1991 2004 Salvesen G S Dixit V M 1997 Caspases intracellular signaling by proteolysis Cell 1997 Vol 91 4 pp 443 446 Samuel T Weber H O Rauch P Verdoodt B Eppel J T McShea A Hermeking H Funk J 0 2001 The G2 M regulator 14 3 3sigma prevents apoptosis through sequestration of Bax Journal Biology Chemistry 276 2001 Vol 48 pp 45201 45206 Sanak M Pierzchalska M Bazan Socha S Szczeklik A 2000 Enhanced Expression of the Leukotriene C4 Synthase Due to Overactive Transcription of an Allelic Variant Associated with Aspirin Intolerant Asthma American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2000 Vol 23 pp 290 296 Saxena A Moshynska O Sankaran K Viswanathan S Sheridan DP 2002 Association of a novel single nucleotide polymorphism G 248 A in the 5 UTR of BAX gene in chronix lymphocytic leukemia with disease progression and treatment resistance Cancer letters 2002 Vol 187 pp 199 205 Schulte Hermann R Bursh W Low Baselli A Wagner A Grasl Kraupp B 1997 Apoptosis in the liver and its role in hepatocarcinogenesis Cell Biol Toxiocology 1997 Vol 13 pp 339 348 Schulte Hermann R Hufnagl K Low Baselli A Rossmanith W Wagner A Ruttkay Neky B Bursh W Mullauer L Parzefall W Grasl Kraupp B 1998 Apoptosis and hepatocarcinogenesis Digestion 1998 Vol 59 pp 64 65 Shi L Chen G He D Bosc D G Litchfield D W Greenberg A H 1996 Granzyme B
27. ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli par 1 ou 100 selon indication Les valeurs p sont calcul s a partir de 4 r plicas avec le test Student non pair p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 Des essais de retard sur gel ont t effectu s pour v rifier la pr sence de liaisons diff rentielles au niveau des SNPs de cette r gion promotrice Les gels des SNPs 730T gt G et 141C gt T avec l extrait nucl aire JURKAT et HeLa respectivement sont montr s dans les Figure 16 et Figure 17 42 Tout d abord avec le SNP 730T gt G Figure 16 on peut observer la pr sence d une liaison diff rentielle au niveau des complexes 1 et 2 chaque complexe lie uniquement 730G puits 2 vs puits 6 La comp tition dans les puits 7 et 8 confirme que le complexe se lie davantage a la sonde G car la bande ne dispara t qu en pr sence du comp titeur 730G non marqu La liaison est sp cifique puisque la comp tition avec la sonde AP2 ne fait pas dispara tre les bandes puits 9 Le SNP 141C gt T Figure 17 montre la pr sence de plusieurs liaisons diff rentielles au niveau des complexe 3 7 chaque complexe tant form uniquement en pr sence de l all le 141T puits 2 vs puits 6 Les exp riences de comp tition puits 7 et 8 confirme que le complexe se lie davantage la sonde T car le profil de bandes est modifi seulement en pr sence du comp t
28. induces apoptosis and cyclin A associated cyclin dependant kinase 92 activity in all stage of cell cycle The Journal of Immunology 1996 Vol 157 6 pp 2381 2385 Sinnett D Beaulieu P B langer H Lefebvre JF Langlois S Theberge M C Drouin S 2006 Detection and characterization of DNA variants in the promoter regions of hundreds of human disease candidate genes Genomics 2006 Vol 87 pp 704 710 Soung Y H Lee J W Kim S Y Sung Y J Park W S Nam S W Kim S H Lee J Y Yoo N J Lee S H 2005 Caspase 8 gene is frequently invactivated by frameshift somatic mutation 1225 1226 delTG in hepatocellular carcinomas Oncogene 2005 Vol 24 1 pp 141 147 Stavridi E S Chehab N H Malikzay A Halazonetis T D 2001 Substitutions that compromise the ionizing radiation induced association of p53 with 14 3 3 proteins also compromise the ability of p53 to induce cell cycle arrest Cancer Research 2001 61 pp 7030 7033 Stephens M Smith N J Donnelly P 2001 A New Statistical Method for Haplotype Reconstruction Am J Hum Genet 2001 Vol 68 pp 978 989 Strasser A Harris A W Bath M L Corry S 1990 Novel primitive lymphoid tumours induced in transgenic mice by cooperation between myc and bcl 2 Nature 348 1990 pp 331 333 Subramanian R R Masters S C Zhang H Fu H 2001 Functional conservation of 14 3 3 isoforms in inhibiting BAD induced apoptosis Experimental Cell Research 2001 Vol 271 pp 142 151 Sugiyama A Miy
29. isoforme th ta 6 aussi nomm tau O de la famille 14 3 3 est un g ne codant pour une prot ine adaptatrice impliqu e dans la r gulation de plusieurs voies de signalisation autant g n rales que sp cialis es Aitken 2006 Cette liaison se traduit g n ralement par la modulation de l activit du partenaire de liaison Wang 2004 Sous sa forme d homodim re YWHAQ peut interagir avec plusieurs prot ines et ainsi moduler leur activit Le res quen age de la r gion promotrice d YWHAQ chez 40 individus a permis d identifier deux rSNPs 515T gt C et 95C gt G Tableau VII Le sch ma du promoteur d YWHAQ est illustr a la Figure 22 Tous les SNPs trouv s dans ce promoteur taient r pertori s dans dbSNP Tableau VII SNPs du promoteur d YWHAQ avec leur position g nomique et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte SNP Position chromosomique Num ro RS 515 T gt C chr2 9689071 9689071 rs10203320 95 C gt G chr2 9688651 9688651 rs2091210 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 130 1 5 C gt G 515 T gt C 1000 2000 Figure 22 Sch ma du promoteur d YWHAQ avec ses SNPs 52 Les deux SNPs du promoteur d YWHAQ se retrouvent sous la forme de trois haplotypes fr quents Tableau VIII Ces trois haplotypes forment 95 de la totalit des haplotypes observ s On observe une fr quence similaire entre les
30. la technologie Gateway Figure 13 Vue d ensemble de la m thode utilis e pour la mutagen se dirig e r f rence manuel d utilisation fournit par Agilent Technologies Figure 14 Sch ma du promoteur proximal d YWHAB avec ses rSNPs Figure 15 Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur d YWHAB Figure 16 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 730 T gt G d YWHAB Figure 17 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 141 C gt T d YWHAB Figure 18 Sch ma des constructions utilis es lors des exp riences de mutagen se dirig e pour le gene YWHAB Figure 19 Impact fonctionnel de la mutagen se dirig e partir de haplotype H8 du promoteur d YWHAB Figure 20 Sch ma des haplotypes du promoteur raccourci d YWHAB Figure 21 Impact fonctionnel des promoteurs raccourcis d YWHAB Figure 22 Sch ma du promoteur d YWHAQ avec ses SNPs Figure 23 Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur d YWHAQ xi Figure 24 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison non diff rentielle au niveau du rSNP 515 T gt C d YWHAQ Figure 25 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison non diff rentielle au niveau du rSNP 95 C gt G d YWHAQ Figure 26 Sch ma des constructions utilis es lors des exp riences de mutagen se dirig e pour le gene YWHAQ Figure 27 Impact f
31. la voie intrins que de l apoptose Tableau II Le but de cet tude tait de d couvrir s il y avait un impact fonctionnel entre les diff rents haplotypes pour un promoteur donn Sur les 11 genes tudi s les promoteurs des g nes d YWHAB et YWHAQ ont montr une activit promotrice diff rentielle Ces r sultats supportent l hypoth se initiale qui proposait que la variabilit g n tique au niveau des promoteurs pouvait mener a une activit promotrice diff rentielle Plusieurs SNPs haplotypes taient pr sents dans les neuf autres promoteurs tudi s mais aucun d entre eux ne semble tre fonctionnel du moins dans le contexte des lign es cellulaires utilis es 64 La famille prot ique 14 3 3 La famille 14 3 3 est un groupe de prot ines tr s conserv es entre esp ces et qui sont impliqu es dans de nombreux processus cellulaires vitaux tels que le m tabolisme la circulation des prot ines la signalisation cellulaire l apoptose et la r gulation du cycle cellulaire Mackinstosh 2004 La famille 14 3 3 est compos e de sept isoformes nomm s b ta epsilon z ta ta th ta gamma et sigma Jones 1995 Ces prot ines sont exprim es ubiquitairement et elles ont la capacit de s auto assembler en homo et h t rodim res afin de lier un large spectre de partenaires les facteurs de transcriptions des enzymes de biosynth se des prot ines du cytosquelette des mol cules de signalisation des facteurs
32. leur part pr senter des centaines de r p tition tal es sur de grandes r gions 20 kb Beckmann 2007 Ceux ci sont g n ralement riches en GC et surtout localis s dans les r gions sub t lom riques chez l humain Jarman 1989 Bois 2003 Pour ces polymorphismes c est le nombre de r p titions qui varie entre les individus et qui est transmis de fa on mend lienne 15 Les SNPs Single Nucleotide Polymorphism sont des polymorphismes simples car un seul nucl otide est diff rent Ce sont des mutations d un seul nucl otide qui sont tr s fr quentes dans le g nome Ce nucl otide peut tre soit supprim ins r ou chang pour n importe lequel des trois autres nucl otides Leur nombre est estim a au moins 4 millions et leur fr quence est d environ 1 a tous les 500 pb le long du g nome Walter 2008 Un autre type de variabilit g n tique retrouv est de type structural La variabilit du nombre de copies d un g ne ou CNV pour copy number variation d signe une forme de polymorphisme ot le nombre de copies d un g ne ou d un segment chromosomique dans le g nome est variable entre les individus Les CNVs sont des polymorphismes de r p titions de plus de 1kb et allant jusqu a quelques m gabases Cette d finition pourrait tre prochainement r vis e afin de comprendre des r p titions plus petites Beckmann 2007 La variabilit du nombre de copies d un g ne ou d une r gion serait due a de
33. mpcir O O O O O Figure 13 Vue d ensemble de la m thode utilis e pour la mutagen se dirig e r f rence manuel d utilisation fournit par Agilent Technologies Pour le g ne YWHAQ des mutants ont t cr s en utilisant comme gabarit les haplotypes H1 et H2 alors que pour YWHAB les mutants ont t con us a partir des haplotypes H1 et H8 r f rence Tableau VIII et Tableau IV La s quence des amorces utilis es voir la liste des s quences des oligonucl otides en annexe Tableau IV a t d termin e l aide du programme QuikChange Primer Design Agilent Technologies La confection des mutants est r alis e selon le protocole du manufacturier et la purification de ADN plasmidique des mutants est accomplie avec le QIAGEN mini kit L efficacit de la mutagen se dirig e est v rifi e par s quen age directe pour chacun des mutants Ces derniers sont ensuite transfect s dans les trois m mes lign es cellulaires HeLa JEG3 et JURKAT avec le m me protocole et les m mes conditions d crites auparavant 35 RESULTATS Dans mon projet de maitrise j ai caract ris la diversit g n tique de la r gion promotrice de 11 g nes de la voie intrins que de l apoptose L tude d une cohorte de 40 individus non reli s d origine europ enne a permis d identifier 63 SNPs dans les promoteurs proximaux que nous avons d finit comme tant une r gion de 2kb en amont du premier exon Tous les promoteurs taient
34. of caspases Oncogene 2003 Vol 22 53 pp 8543 8567 Denecker G Vercammen D Declercq W Vandenabeele P 2001 Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors Cell Mol Life Science 2001 Vol 58 pp 356 370 Dougherty M K Morrison D K 2004 Unlocking the code of 14 3 3 Journal of Cell Science 2004 Vol 117 10 pp 1875 1884 81 Du C Fang M Li Y Li L Wang X 2000 Smac a mitochondrial protein that promotes cytochrome c dependant caspase activation bt elimination IAP inhibition Cell 2000 Vol 102 pp 33 42 Elmore Susan 2007 Apoptosis A review of programmed cell death Toxicol Pathol 2007 Vol 35 4 pp 495 516 Esposti MD 2002 The roles of BID Apoptosis 2002 Vol 7 pp 433 440 Eujuanes S Benavente Y Bosch F Martin Guerrero I Colomer D Perez Alvarez S Reina O Ardanaz M T Jares P Garcia Orad A and al 2008 Genetic variants in apoptosis and immunoregulation related genes are associated with risk of chronic lymphocytic leukemia Cancer research 2008 Vol 68 pp 10178 10186 Evan G Littlewood T 1998 A matter of life and cell death Science 1998 Vol 281 5381 pp 1317 1322 Evan G I Vousden K H 2001 Proliferation cell cycle and apoptosis in cancer Nature 2001 Vol 411 pp 342 348 Ferl R J Manak M S Reyes M F 2002 The 14 3 3sigma reviews Genome Biology 2002 Vol 3 pp 3010 1 3010 7 Gazouli M Tzanakis K Rallis G Theodoropoulos G Papaconstantinou I
35. 1 g nes cibles BAG1 BAG3 CARD9 CD47 CYCS MAP4K3 MAPK1 MAPK8 NOD1 YWHAB et YWHAQ ont t amplifi s par PCR Les diff rentes conditions de PCRs sont d crites en annexe aux tableaux I et II Afin d identifier des rSNPs nous avons proc d au s quen age directe des produits de PCR g n r s partir d une cohorte de 40 individus d origines europ ennes 20 patients atteints de la leuc mie lymphoblastique aigu LLA et 20 individus sains contr le Les patients atteints de la LLA ont t ajout s la cohorte de cette tude en raison des int r ts de notre laboratoire pour l tude des d terminants g n tiques de la leuc mie de l enfant Les fragments de PCR ont t s quenc au centre d innovation g nome Qu bec Mc Gill l aide de s quenceurs automatiques mod le 3730 Les s quences d ADN ainsi obtenues furent compar es avec la s quence humaine homo sapiens de r f rence de NCBI afin de d terminer les polymorphismes pr sents et les SNPs obtenus sont compar s ceux d j r pertori s dans dbSNPs build 130 La comparaison des s quences est effectu e l aide du logiciel Sequencer 4 8 D termination des haplotypes fr quents Une fois les polymorphismes identifi s dans une r gion promotrice il est possible de d terminer la structure des haplotypes correspondant c est dire les combinaisons de rSNPs Pour faire cette analyse on utilise le logiciel PHASE version 2 1 1 Univer
36. 1573 1581 Ho S Y Wang Y J Chen H L Chen C H Chang C J Wang P J Chen H H Guo H R 2004 Increased risk of developing hepatocellular carcinoma associated with carriage of the TNF2 allele of the 308 tumor necrosis factor alpha promoter gene Cancer Causes Control 2004 Vol 15 pp 657 663 Hogarth L A Hall A G 1999 Increased BAX expression is associated with an increased risk of relapse in childhood acrute lymphocytic leukemia Blood 1999 Vol 93 pp 2671 2678 Hsu H Xiong J Goeddel D V 1995 The TNF repcetor 1 associated protein TRADD signals cell death and NF kappa B activation Cell 1995 Vol 81 pp 495 504 Hsu S Y Kaipia A Zhu L Hsueh A J 1997 Interference of BAD Bcl xL Bcl 2 associated death promoter induced apoptosis in mammalian cells by 14 3 3 isoforms and P11 Molecular Endocrinology 11 1997 pp 1858 1867 Igney F H Krammer P H 2002 Death and anti death tumor resistance to apoptosis Nat Rev Vancer 2002 Vol 2 pp 277 288 Invitrogen 2004 Gateway Technology with Clonase II 2004 Irby R B Mao W Coppola D Kang J Loubeau JM Trudeau W Karl R Fujita DI Jove R Yeatman TJ 1999 Activting SRC mutation in a subset of advanced human colon cancers Nature Genetics 1999 Vol 21 pp 187 190 Jang JS Kim K M Choi J E Cha S I Kim C H Lee W K Kam S Jung T H Park J Y 2008 Identification of polymorphisms in the Caspase 3 gene and their association with lung cancer risk Molecular carcinogen
37. 5 139269905 rs3812560 1411 T gt C chr9 139 269 544 139 269 544 1350 G gt A chr9 139269483 139269483 rs3829111 1205 C gt T chr9 139269338 139269338 rs10781500 1159 C gt T chr9 139 269 292 139 269 292 1065 A gt G chr9 139269198 139269198 rs3829110 1002 A gt G chr9 139269135 139269135 rs3812558 362 A gt G chr9 139 268 495 139 268 495 320 C gt T chr9 139 268 453 139 268 453 134 C gt G chr9 139 268 267 139 268 267 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 Tableau XVI SNPs du promoteur de CD47 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1750 C gt G chr3 107 811 685 107 811 685 1281 G gt A chr3 107 811 142 107 811 142 rs326341 1176 C gt G chr3 107 811 037 107 811 037 rs7612356 343 C gt T chr3 107 810 278 107 810 278 308 C gt T chr3 107 810 243 107 810 243 rs62264065 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 XXiv Tableau XVII SNPs du promoteur de CYCS avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1432 A gt G chr7 25 166 387 25 166 387 rs2107123 882 A gt G chr7 25 165 837 25 165 837 847 C gt T chr7 25 165 802 25 165 802 769 A gt G chr7 25 165 724 25 165 724 rs3846998 719 DEL AT chr7 25 165 674 25 165 675 rs5
38. 70 C 2 72 C 10 95 C 10 MAPK1 B 8 cycles 95 C 45 60 56 C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45 70 C 2 72 C 10 xix 95 C 10 MAPK8 A 40 cycles 95 C 45 58 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 8 cycles 95 C 45 60 56 NOD1 B C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 6 cycles 95 C 45 55 52 YWHAB C C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 53 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 14 cycles 95 C 45 62 55 YWHAQ C C 45 70 C 2 20 cycles 95 C 45 55 C 45 70 C 2 72 C 10 A 0 3 uM des amorces F et R 0 2 mM dNTPs 1X de tampon Fast Start Taq contenant MgCl a 25mM Roche 1X de tampon GC rich Roche 2 unit s d ADN polym rase Fast Start Taq Roche et 20 ng d ADN g nomique dans un volume total de 50 uL B 0 4 uM des amorces F et R 0 2 mM dNTPs 1X de tampon Fast Start Taq contenant MgClz a 25mM Roche 1X de tampon GC rich Roche 2 unit s d ADN polym rase Fast Start Taq Roche et 50 ng d ADN g nomique dans un volume total de 50 uL C 0 5 uM des amorces F et R 0 2 mM dNTPs 1X de tampon Fast Start Taq contenant MgClz a 25mM Roche 1X de tampon GC rich Roche 2 unit s d ADN polym rase Fast Start Taq Roche et 50 ng d ADN g nomique dans un volume total de 50 uL XX
39. 86 212 A gt T G gt A DELT DELA DEL C gt T Fr quence ou C A Cohorte Contr les Patients LLA 1 A G T A A C 55 0 60 5 45 5 A T 33 3 31 6 36 4 4 T G T A A C 10 0 7 9 13 6 Tableau XXIV Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne CARD9 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Hap 2016 1772 1411 1350 1205 1159 1065 1002 Fr quence A gt G T gt C T gt C G gt A C gt T C gt T A G A G 362 320 134 0 A G C T C T Cohorte Contr les Patient LLA 1 A T T G C C A A A C C 56 6 55 0 58 3 6 G C T A T C G G A C C 27 6 27 5 27 8 8 G C T A T C G G A T C 5 3 5 0 5 6 xxvii Tableau XXV Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne CD47 et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1750 1281 1176 343 308 Fr quence C gt G G gt A C gt G C gt T C gt T Cohorte Contr les Patients LLA 1 C G C C C 48 75 52 5 45 0 2 C A C C C 22 50 20 0 25 0 4 C A G C C 25 00 25 0 25 0 Tableau XXVI Haplotypes fr quents de la r gion promotrice du g ne CYCS et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte de contr les et de patients Haplotype 1432 882 847 769 719 Fr quence A gt G A gt G C gt T A gt G AT Cohorte Contr les Patients LLA 1 A A C A 2 22 5 25 0 20 0 A C A 27 5 25 0 30 0 4 G A C G
40. 882962 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 Tableau XVIII SNPs du promoteur de MAP4K3 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1370 T gt C chr2 39 665 589 39 665 589 440 C gt T chr2 39 664 659 39 664 659 rs56128332 316 C gt T chr2 39 664 535 39 664 535 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 Tableau XIX SNPs du promoteur de MAPK1 avec leur position g nomique SNP Position chromosomique Num ro rs 1334 A gt T chr22 22 223 303 22 223 303 rs9607343 1040 del T chr22 22 223 009 22 223 009 351 T gt G chr22 22 222 320 22 222 320 rs9607340 134 A gt T chr22 22 222 103 22 222 103 rs9610505 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 131 SNP non r pertori dans dbSNP 131 Tableau XX SNPs du promoteur de MAPK8 avec leur position g nomique XXV SNP Position chromosomique Num ro rs 1937 G gt A chr10 49 607 750 49 607 750 rs11101312 1695 C gt T chr10 49 607 992 49 607 992 rs17697972 1049 G gt A chr10 49 608 638 49 608 638 rs10857561 897 C gt T chr10 49 608 790 49 608 790 rs17697978 674 DEL C chr10 49 609 013 49 609 013 rs11332662 509 A gt G chr10 49 609 178 49 609 178 rs17698002
41. A K Hussain A Bu R Guti rrez M I 2003 The tumor suppressor gene 14 3 3 sigma is commonly methylated in normal and malignant lymphoid cells Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Febuary 2003 Vol 12 2 pp 165 169 Boccia L M Lillicrap D Newcombe K Mueller C R 1996 Binding of the Ets factor GA binding protein to an upstream site in the factor IX promoter is a critical event in transactivation Molecular Cell Biology 1996 Vol 16 pp 1929 1935 Bois P R 2003 Hypermutable minisatellites a human affair Genomics 2003 Vol 60 pp 349 355 Bond G L Hu W Bond E E and al 2004 A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor supressor pathway and accelerates tumor formation in humans Cell 2004 Vol 119 pp 591 602 Breckenridge D G Germain M Mathai J P Nguyen M Shore G C 2003 Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways Oncogene 2003 Vol 22 pp 8608 8618 Brimmell M Mendiola R Mangion J Packham G 1998 BAX frameshift mutations in cell lines derived from human haemopoietic malignancies are 79 associated with resitance to apoptosis and microsatellite instability Oncogene 1998 Vol 16 14 pp 1803 1812 Burlacu A 2003 Regulation of apoptosis by Bcl 2 family proteins J Cell Mol Med 2003 Vol 7 pp 249 257 Cartharius K Frech K Grote K Klocke B Haltmeier M Klingenhoff A Frisch M Bayerlein M Werner T 2005 MatInspector and beyond promoter analysis
42. GTACAAAAAAGCAGGCTCTCCAGGATTCAAATCCAATG F GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGGGAACAAAGACCCTTCC R YWHAB GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACTGCAGCCTACAACTCC F 900pb GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGGGAACAAAGACCCTTCC R YWHAQ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCACCACTTTGATCTGCTT F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAACTTGCCCAAGGTCACTG R YWHAQ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCACCACTTTGATCTGCTT F 600pb GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCTTAATTCGGAGCCCTA R 1 Les nucl otides en gras sont des queues attb1 et attb2 servant au syst me de recombinaison Gateway Invitrogen xviii Tableau X Conditions et programmes de PCR pour l amplification des r gions promotrices G ne Conditions de PCR Programme de PCR 95 C 10 BAG1 A 40 cycles 95 C 45 58 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 BAG3 A 40 cycles 95 C 45 56 C 45 72 C 2 72 C 10 95 C 10 8 cycles 95 C 45 60 56 CARD9 A C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 CD47 A 8 cycles 95 C 45 60 56 C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 CYCS 8 cycles 95 C 45 60 56 A oC 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45 70 C 2 72 C 10 95 C 10 8 cycles 95 C 45 60 56 MAP4K3 A C 45 70 C 2 30 cycles 95 C 45 56 C 45
43. Genomatix Software GmbH afin de pr dire les diff rents sites de liaison de facteurs de transcription entourant chacun des SNPs test s Un match parfait la matrice obtient un score de 1 00 chaque position s quence correspond au plus haut nucl otide conserv cette position dans la matrice Un bon match la matrice a g n ralement une similitude de gt 0 80 Cartharius 2005 Les sondes marqu es sont incub es avec des extraits nucl aires des lign es HeLa JEG3 et JURKAT en utilisant la trousse de Gel Shift Assay System Promega Le dosage des prot ines dans les extraits nucl aires est effectu par essai Bradford BioRad selon les indications du fabriquant Une r action pour chaque SNP est fait comme suit 5 ug d extrait nucl aire sont incub s s par ment avec 35 nmol de sonde marqu e dans un tampon 5X contenant 50mM Tris HCL pH 7 5 5 mM 33 MgCl2 2 5mM EDTA 2 5mM DTT 250mM NaCl 0 25ug uL polydeoxyinosinate deoxycytidylate et 20 glyc rol dans un volume final de 10 uL Ces incubations ont t effectu es a temp rature ambiante pendant 20 minutes Les complexes prot iques form s sont s par s par lectrophor se sur un gel de polyacrylamide non d naturant 6 acrylamide bisacrylamide 60 1 avec un tampon 1X de Tris Glycine EDTA a 4 C pendant 2h30 a 190V L utilisation du tampon TGE par rapport au tampon TBE Tris Borate EDTA plus couramment utilis permet d obtenir des bandes plus fortes et m
44. HAQ est illustr la Figure 28 1 v P 600 1 a 600 Figure 28 Sch ma des haplotypes du promoteur raccourci d YWHAQ L activit promotrice des haplotypes raccourcis H1 600bp et H2 600bp a t test e par des essais de g ne rapporteur pour voir leur impact sur l activit promotrice d YWHAQ Figure 29 On constate que le promoteur raccourci sous clon est actif puisque ses valeurs de lucif rase sont de 10 350 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Aucune activit diff rentielle n est observ e entre les deux haplotypes raccourcis dans les lign es cellulaires test es Le m me profil a t observ dans les trois lign es cellulaires 61 250 H1 600pb E H2 600pb 200 pGL3 basic SV40 s 150 E 4 z E 100 LL 2 t 50 0 Jurkat x 1000 HELA x 100 JEG 3 x 100 Figure 29 Impact fonctionnel des promoteurs raccourcis d YWHAQ La transfection cellulaire illustr e est faite dans les 3 lign es cellulaires JURKAT HeLa et JEG 3 Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli soit par 100 ou par 1000 selon indications Les valeurs p sont calcul s a partir de 4 r plicats avec le test Student non pair p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 62 DISCUSSION Rappel du projet L existance de va
45. MAP4K3 La transfection est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes HeLa JEG3 et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXXV 1 34 A gt T 351 T gt G 1040 DELT 1334 A gt T i 1000 2000 25 20 15 10 Ratio Firefly Renilla x 100 JEG3 HeLa Figure 7 A Sch ma du promoteur du g ne MAPK1 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de MAPK1 La transfection est faite dans 2 lign es cellulaires diff rentes JEG3 et HeLa Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXXVI A lt K lt es 3 amp amp ag FA lt un a a S S 5 lt 2 a g 9 pap 2000 1000 B E H1 Em H4 E H5 m HG pGL3BASIC oO 1 x 2 Vv o g xz JEG3 HELA Jurkat Figure 8 A Sch ma du promoteur du g ne MAPK8 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de MAPKS8 La transfection est
46. P 913 C gt G d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 913 C gt G sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules JURKAT Les puits 1 5 repr sentent la sonde marqu 913 C alors que les puits 6 9 repr sentent la sonde 913G Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue XXX X 531 C 531 T Sonde non marqu e o ee o o 531C 531T ee AP2 Extrait prot ique Complexe 1 gt Complexe 2 eat Complexe 3 123456789 Figure 11 Retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 531 C gt T d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 531 C gt T sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules JEG3 Les pui
47. P SV40 Taq TBE TE xiii recombinaison homologue SNP intronique kilobase Luria broth leuc mie lymphoblastique aigu molaire mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 3 mitogen activated protein kinase 1 mitogen activated protein kinase 8 milligramme chlorure de magn sium microARN millilitre millimolaire Hydroxide de sodium nanogramme nucleotide binding oligomerization domain containing 1 OptimalModification Minimum essential Medium SNP dans le promoteur phosphate buffer solution Polymerase Chain Reaction picomoles quantitative Real Time PCR SNP r gulateur sodium dodecyl sulfate Single Nucleotide Polymorphism virus simien 40 Thermus aquaticus Tris Borate EDTA Tris EDTA TF TFBS TNF Tris UTR VNTR YWHAB YWHAQ H8 uL xiv Facteur de transcription Transcription factor binding site Tumor Necrosis Factor tris hydroxym thyl aminom thane Untranslated Region volt Variable Number of Tamdem Repeats tyrosine 3 monoxygenase tryptophan 5 monoxygenase protein beta polypeptide tyrosine 3 monoxygenase tryptophan 5 monoxygenase protein theta polypeptide microgramme microlitre XV REMERCIEMENTS Je tiens a remercier le Dr Daniel Sinnett ainsi que tous les membres de son laboratoire Un merci particulier Manon Ouimet Mathieu Larivi re et Pauline Cassart pour votre aide vos id es et nos discussions que j ai beaucoup appr ci es je vous en suis tr
48. Regulatory polymorphisms underlying complex disease traits Journal of Molecular Medecin 2005 Vol 83 pp 97 109 Kn gel L F Werle Schneiger G Dally H M ller P J Edler L Bartsch H Heussel C P Thomas M Risch A 2008 Six single nucleotide polymophisms in apoptotic genes and chemotherapy outcome in lung cancer patients J Clin Oncol 2008 Komiya Y Kurabe N Katagiri K Ogawa M Sugiyama A Kawasaki Y Tashiro F 2008 A Novel Binding Factor of 14 3 38 Functions as a Transcriptional Repressor and Promotes Anchorage independent Growth Tumorigenicity and Metastasis The Journal of Biological Chemistry 4 July 2008 Vol 283 27 pp 18753 18764 Kong A N Yu R Hebbar V Chen C Owuor E Hu R Ee R Madlekar S 2001 Signal transduction events elicited by cancer prevention compounds Mutation Research 2001 Vol 481 pp 231 241 Konopleva M Tari A M Estrov S Harris D Xie Z Zhao S Lopez Berestein G Andreeff M 2000 Liposomal Bcl 2 antisense oligonucleotides enhance proliferation sensitive acute myeloid leukemia to cytosine arabinoside and induce apoptosis independent of other antiapoptotic proteins Blood 2000 Vol 95 12 pp 3929 3938 Kornblau S M Vu H T Ruvolo P Extrov Z O Brien S Cortes J Kantarjian H Andreeff M May W S 2000 BAX and PKC alpha modulate the pronostic impact 86 of BCL 2 expression in acrute myelogenous leukemia Clin Cancer Res 2000 Vol 6 4 pp 1401 1409 Kruidering M Evan G I 2000
49. SNP Position chromosomique Num ro RS 913 C gt G chr20 42946845 42946845 rs3092669 730 T gt G chr20 42947028 42947028 rs3091409 531 C gt T chr20 42947227 42947227 rs3092248 141 C gt T chr20 42947617 42947617 rs6031847 134 T gt C chr20 42947624 42947624 rs6031848 7 GT chr20 42947751 42947751 rs6031849 70 ins CGC chr20 42947828 42947827 rs35664412 Position calcul e en consid rant le d but de la transcription comme tant 1 USCS dbSNP build 130 39 H Exon 1 913 G 730 T gt G 531 CT 141 T 134 T gt C 7 G gt T 2000 1000 70 INS CGC Figure 14 Sch ma du promoteur proximal d YWHAB avec ses rSNPs Les sept SNPs du promoteur d YWHAB se retrouvent sous la forme de trois haplotypes fr quents Tableau IV Ces trois haplotypes forment 85 de la totalit des haplotypes observ s On remarque que l haplotype H11 est plus fr quent dans le groupe LLA que dans le groupe contr le alors que pour les deux autres haplotypes ont une fr quence similaire dans les deux groupes Tableau IV Haplotypes fr quents de la r gion promotrice d YWHAB et leur fr quence observ e dans notre cohorte de contr les et de patients H 913 730 531 141 134 7 70 Fr quence C gt G T gt G C gt T C gt T T gt C G gt T ins CGC Cohorte Contr l Patients e LLA 1 G G C C T G 22 5 22 5 22 5 8 C T C C T G 41 0 45 0 37 5 11 C T C T C T CGC 21 3 125 30 0 40 L activit
50. Universit de Montr al Impacts fonctionnels des variants g n tiques dans les promoteurs des g nes associ s a la survie et a la mort cellulaire Par Janick St Cyr Programme de biologie mol culaire Facult de m decine M moire pr sent la Facult des tudes sup rieures en vue de obtention du grade de maitrise en biologie mol culaire Aott 2011 Copyright Janick St Cyr 2011 Universit de Montr al Facult de m decine Ce m moire intitul Impacts fonctionnels de variants g n tiques dans les promoteurs des g nes associ s a la survie et a la mort cellulaire Pr sent par Janick St Cyr A t valu par un jury compos des personnes suivantes Richard Bertrand Pr sident rapporteur Daniel Sinnett Directeur de recherche Andrea Richter Membre du jury ili RESUME La r gulation de l apoptose est importante dans le maintient de l hom ostasie cellulaire et l int grit du mat riel g n tique L apoptose est un m canisme cellulaire qui limine les cellules endommag es Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies g n tiques La d r gulation des g nes codants pour des composantes de la voie intrins que de l apoptose est fr quemment observ e chez divers types de cancers incluant la leuc mie Nous proposons que des polymorphismes fonctionnels localis s dans la r gion r gulatrice rSNP d
51. YWHAE et YWHAZ a t d montr dans le cancer du poumon Qi 2003 Les isoformes 14 3 3 f y o et t sont fortement exprim s dans des biopsies de cancer du poumons comparativement au tissu seins Qi 2005 De plus un SNPc d YWHAQ rs6734469 a montr une corr lation dans la r sistance au traitement des patients atteints de sarcomes des tissus mous Vazquez 2009 Donc les prot ines 14 3 3 ont un r le central dans la survie cellulaire leur d pl tion peut mener l activation de facteurs pro apototiques Lors de stress cellulaire un m canisme d inhibition peut tre exerc sur les prot ines 14 3 3 pour contre carrer leur effet pro apoptotique 68 YWHAB 14 3 3 B YWHAB est l isoforme b ta de la famille 14 3 3 qui est impliqu dans plusieurs m canismes cellulaires essentiels La prot ine encod e par ce g ne est connue pour lier RAF1 et la phosphatase CDC25 sugg rant son implication dans la signalisation mitog nique et dans la machinerie du cycle cellulaire Conklin 1995 Takihara 2000 Le promoteur de ce g ne contient 7 rSNPs qui forment 3 haplotypes communs plus de 5 dans notre cohorte Tableau IV Nous avons montr qu il existe une activit promotrice diff rentielle entre les haplotypes du promoteur d YWHAB Figure 15 L haplotype H8 poss de une activit promotrice plus forte que les deux autres haplotypes H1 et H11 En comparant les s quences des diff rents haplotypes il est diffici
52. aacson P G Dyer M J 1999 Bcl10 is involved in t 1 14 p22 q32 of MALT B 95 cell lymphoma and mutated in multiple tumor types Cell 1999 Vol 96 1 pp 35 45 Wu X Deng Y 2002 Bax and BH3 domain only proteins in p53 mediated apoptosis Front Biosci 2002 Vol 7 pp d151 156 Wuill me Toumi S Robillard N Gomez P Moreau P Le Gouill S Avet Loiseau H Harousseau J L Amiot M Bataille R 2005 Mcl 1 is overexpressed in multiple myeloma and associated with relapse and shoter survival Leukemia 2005 Vol 19 pp 1248 1252 Xiao M Zhang D F Zeng Y Cheng Y F Yao Y G 2011 Polymorphisms in the promoter region of the CASP9 gene are not associated with the non Hodgkin s lymphoma in Chinese patients Ann Hematol 2011 pp 1265 1273 Xu K Tavernarakis N Driscol M 2001 Necrotic cell death in C elegans requires the function of calreticulin and regulators of CA 2 release from the endoplasmic reticulum Neuron 2001 Vol 31 pp 957 971 Yaffe Michael B 2002 How do 14 3 3 proteins work Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis FEBS Letters 2002 Vol 513 pp 53 57 Yan H Yuan W Velculescu V E Vogelstein B Kinzler K W 2002 Allelic variation in human gene expression Science 297 2002 p 1143 Yan H Zhou W 2004 Allelic variations in gene expression Curr Opin Oncol 2004 Vol 16 pp 39 43 Yang H Masters S C Wang H Fu H 2001 The proapoptotic protein BAD binds the amphipathic groov
53. actifs dans au moins une des lign es cellulaires tudi es Hela JEG 3 et Jurkat Parmi les g nes tudi s les promoteurs des g nes YWHAB et YWHAQ ont montr une activit promotrice diff rentielle entre les diff rents haplotypes communs Nous avons observ des liaisons ADN prot ines diff rentielles pour 2 SNPs l int rieur du promoteur du g ne YWHAB Le Tableau II r sume l tude de l ensemble des promoteurs Les g nes YWHAB et YWHAQ seront par la suite d crits en d tails On retrouve en annexe toutes informations relatives sur les SNPs les haplotypes et les essais lucif rases des autres 9 g nes n ayant pas montr d activit promotrice diff rentielle au cours de notre tude La densit des polymorphismes correspondante est de 2 9 SNPs kb en moyenne ce qui est un peu faible si l on compare avec la litt rature environ 4 5 SNPs kb Labuda 2007 Il est possible que la r gion promotrice des g nes tudi s soient davantage conserv es dans l volution tant donn leur r le essentiel dans une voie biologie hautement r gul e Par exemple deux g nes MAPK1 et YWHAQ n ont que 3 et 2 SNPs respectivement au total dans leur promoteur de 2 kb 36 Parmi les 63 SNPs identifi s il y a 38 transitions 18 transversions et 7 insertion d l tions Les transitions sont les changements entre le m me groupe soit entre les purines A lt gt G ou entre les pyrimidines T lt C D autre part les transversion so
54. agi Y Komiya Y Kurabe N Kitanaka C Kato N Nagashima Y Kuchino Y Tashiro F 2003 Forced expression of antisense 14 3 3beta RNA suppresses tumor cell growth in vitro and in vivo Carcinogenesis 2003 Vol 24 9 Susin SA Lorenzo H K Zamzami N Marzo I Brenner C Larochette N Prevost M C Alzari P M Kroemer G 1999 Mitochondrial release of caspase 2 and 9 during the apoptotic process Exp Med 1999 Vol 189 pp 381 394 Sutton V R Davis J E Cancilla M Johnstone R W Ruefli A A Sedelies K Browne K A Trapani J A 2000 Initiation of Apoptosis by Granzyme B 93 Requires Direct Cleavage of Bid but Not Direct Granzyme B Mediated Caspase Activation JEM 2000 Vol 192 10 pp 1403 1414 Takihara Y Matsuda Y Hara J 2000 Role of the B isoform of 14 3 3 proteins in cellular proliferation and oncogenic transformation Carcinogenesis 2000 Vol 21 pp 2073 2077 Talpaz M Shah N P Kantarjian H and al 2006 Dasatinib in imatinib resistant Philadelphia chromosome positive leukemias The New England Journal of Medecine 2006 Vol 345 24 pp 2531 2541 Timmer J C Salvesen G S 2007 Caspase substrates Cell death and differenciation 2007 Vol 14 1 pp 66 72 Trump B F Berezesky I K Chang S H Phelps P C 1997 The pathways of cell death oncosis apoptosis and necrosis Toxicol Pathol 1997 Vol 25 pp 82 88 Tsujimoto Y Croce C 1986 Analysis of the structure transcripts and protein products of bcl 2 the gene
55. apoptotiques sont regroup es en deux groupes selon leur structure et leur fonctions les caspases 2 8 9 et 10 ont un pro domaine plus long et elles font partie des prot ines initiatrices de l apoptose et elles activent les prot ines effectrices soit les caspases 3 6 et 7 Cette cascade prot olytique o une caspase active d autres caspases cr e une amplification du signal apoptotique ce qui m ne a une mort cellulaire rapide Chowdhury 2008 Il existe deux voies majeurs d activation de l apoptose menant l activation des caspases la voie extrins que et la voie intrins que Figure 2 Figure 2 Sch ma repr sentant la voie intrins que gauche et la voie extrins que droite de l apoptose La voie extrins que La voie extrins que death receptor pathway est d clench e via l activation des r cepteurs transmembranaires de la superfamille des r cepteurs TNF tumor necrosis factor receptor Aggarwal 1997 Les r cepteurs de mort cellulaire les mieux connus sont FAS et TNF R1 qui sont activ s lors de la liaison avec leurs ligands Fas Fas L et le TNF a respectivement Ashkenazi 1998 Chicheportiche 1997 L activation de ceux ci a la surface cellulaire d clenchent leur tridim risation ainsi que le recrutement de prot ines adaptatrices tel que FADD MORT1 et ou RIP Hsu 1995 Kelliher 1998 FADD peut alors s associer et activer les pro caspases 8 ou 2 via la dim risation des domaines
56. avant d atteindre leurs conformations finales L accumulation de prot ines contenant des erreurs dans le repliement ou glycosyl es incompl tement dans le r ticulum endoplasmique RE r sulte en un stress qui m ne au d clenchement de l apoptose par la voie de signalisation menant au r tablisssement du repliement UPR unfold protein response Par ailleurs les membres des trois classes des prot ines de la famille BCL 2 sont retrouv s a la surface de la membrane du RE et elles y influencent sa perm abilit et sa lib ration du calcium stock dans sa lumi re La lib ration du Ca active la caspase 12 qui est localis e dans la r gion cytosolique du ER Yoneda 2001 Hajn czky 2003 La caspase 12 est sp cifiquement stimul e lors de l activation de l apoptose par un stress du r ticulum endoplasmique Breckenridge 2003 Plusieurs tudes sugg rent aussi que des changements de la membrane plasmique li s l afflux de Ca figurent parmi les changements critiques pouvant compromettre l int grit des cellules ainsi que son destin cellulaire McConkey 1989 Xu 2001 10 D r gulation de l apoptose et cancer La d r gulation de l apoptose est un facteur impliqu dans plusieurs maladies humaines tels que les maladies neurod g n ratives les dommages l isch miques les maladies autoimmunes le SIDA ainsi que certains types de cancers Elmore 2007 Le cancer est un exemple o les m canismes norma
57. based on transcription factor binding sites Bioinformatics 2005 Vol 21 pp 2933 2942 Chaudhary J Skinner M K 2000 Characterization of a Novel Transcript of 14 3 3 Theta in Sertoli Cells Journal of Andrology 2000 Vol 21 5 pp 730 738 Chen K Zhao H Hu Z Wang L Zhang W Sturgis E M Wei Q 2008 CASP3 polymorphisms and risk of squamous cell carcinoma of head and neck Clin Cancer Res 2008 Vol 14 pp 6343 6349 Chicheportiche Y Bourdon P R Xu H Hsu Y M Scott H Hession C Garcia I Browing J L 1997 TWEAK a new secreted ligand in the tumor necrosis factor family that wealy induces apoptosis J Biol Chem 1997 Vol 272 51 pp 32401 32410 Chowdhury I Tharakan B Bhat G K 2008 Caspases An update Comparative Biochemistry and Physiology B 2008 Vol 151 1 pp 10 27 Chrisanthar R Knappskog S Lokkevik E Anker G Ostenstad B Lundgren S Risberg T Mjaaland I Skj nsberg G T Schlichting E Fj sne H E Nysted A Lillehaug J R PE L nning P E 2011 Predictive and Prognostic Impact of TP53 Mutations and MDM2 Promoter Genotype in Primary Breast Cancer Patients Treated with Epirubicin or Paclitaxel PLoS One 2011 Vol 6 4 p e19249 Clavien P A Rudiger H A Selzner M 2000 Mechanism of hepatocyte death after ischemia apoptosis versus necrosis International Journal of Oncology 17 2000 pp 869 879 Cohen G M 1997 Caspases the executioners of apoptosis Bochem Journal 1997 Vol 326 Pt1 pp 1 16
58. cellular gatekeeper for growth and division Cell 1997 Vol 88 pp 323 331 Li H Zhu H Xu C J Yuan J 1998 Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis Cell 1998 Vol 94 pp 491 501 Li L C Chui R M Sasaki M Nakajima K Perinchery G Au H C Nojima D Carroll P Dahiya R 2006 A single nucleotide polymorphism in the E cadherin 87 gene promoter alters transcriptional activities Cancer Research 2006 Vol 60 pp 873 876 Li P Nijhawan D Budihardjo I Srinivasula S M Ahmad M Alnemri ES Wang X 1998 Cytochrome c and dATP dependent formation of Apaf 1 caspase9 compex initiates an apoptotic protease cascade Cell 1998 Vol 91 pp 479 489 Lodygin D Hermeking H 2006 Epigenetic silencing of 14 3 3sigma in cancer Seminars in Cancer Biology 2006 Vol 16 pp 214 224 2005 The role of epigenetic inactivation of 14 3 3sigma in human cancer Molecular Oncology 2005 Vol 15 4 pp 237 246 Lu Y Chen G Q 2011 Effector Caspases and Leukemia International Journal of Cell Biology 2011 pp 1 8 Ma F Zhang H Zhai Y Huang W Zhao C Ou S Zhou H Yuan W Wang Z Wang H Yue W Yu L Li P Xia X Cai M Zhang Y Cui Y He F Ma Y Zhou G 2011 Functional Polymorphism 31C G in the Promoter of BIRC5 Gene and Risk of Nasopharyngeal Carcinoma among Chinese PloS One 2011 Vol 6 2 Mackinstosh Carol 2004 Dynamic interactions between 14 3 3 proteins and phospho
59. cible afin de faire p n trer des granules Pinkoski 2001 Les granules sont compos es de prot ases s rines granzyme B ou granzyme A qui ont la capacit d induire la mort cellulaire Figure 5 La prot ase granzyme B peut agir par deux m canismes distincts soit par une voie cytosolique ou par une voie nucl aire La voie cytosolique active la cascade des caspases pro apoptotiques tandis que la voie nucl aire implique des prot ines du cycle cellulaire tel que la kinase Cdc2 Shi 1996 Le granzyme B induit l apoptose intrins que en clivant directment la prot ine BID sans requerir la lib ration du cytochrome c Sutton 2000 Parall lement le granzyme A peut induire l apoptose via un m canisme caspase ind pendant qui cause un dommage simple brin l ADN et qui n implique pas la prot ine BAX Zhu 2006 Cytolytic Effector Cell Degranulation Ca Granzyme B 42 Ca Perforin Granzyme B gt 7 Apoptosis T Apoptosis Figure 5 Voie de l apoptose induite par la lib ration des perforines et granzyme B d une cellule lymphocyte T cytotoxique SIGMA ALDRICH D autre part l apoptose peut tre d clench e lorsqu une erreur dans la agencement des compartiments cellulaires survient Par exemple la synth se des prot ines dans le r ticulum endoplasmique implique certains changement post traductionnels et un repliement structurel des prot ines
60. comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue xli 7 G 7 T Sonde non marqu e 7G 7T AP2 Extrait prot ique _ Complexe La Complexe 2 a gt b t 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figure 13 Retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 7 G gt T d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 7 G gt T sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules JEG3 Les puits 1 a 5 repr sentent la sonde marqu 7 G alors que les puits 6 a 9 repr sentent la sonde 7 T Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents al
61. diff rents haplotypes pour les deux groupes Contr les vs Patients LLA Tableau VIII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice d YWHAQ et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte Haplotype 515T gt C 95 C gt G Fr quence Cohorte Contr les Patients LLA 1 T C 62 0 58 8 65 4 2 T G 10 0 11 8 7 7 4 C G 23 0 20 6 26 9 L activit promotrice de ces trois haplotypes a t test e par des essais de g ne rapporteur pour voir leur impact sur l activit promotrice d YWHAQ Figure 23 On constate que le promoteur sous clon est actif puisque ses valeurs de lucif rase sont de 3 a 150 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Une activit promotrice diff rentielle est observ e p lt 0 005 et ou p lt 0 0005 dans les trois lign es cellulaires o l haplotype H1 montre une activit promotrice plus forte que les deux autres qui ont sensiblement la m me activit promotrice haplotype H2 a une activit promotrice de 1 4 1 5 fois plus faible que l haplotype H1 et l haplotype 4 a l activit promotrice de 1 3 1 4 fois plus faible que l haplotype H1 Le m me profil a t observ dans toutes les lign es cellulaires Ces r sultats indiquent la pr sence d une activit promotrice diff rentielle in vitro selon l haplotype du promoteur d YWHAQ pr sent Il semble que le SNP 95C gt G soit responsable de cette activit promotrice diff rentielle observ e
62. e tude sur les polymorphismes dans la r gion promotrice des g nes CASP 8 et CASP 9 a d montr que ces variants influencent la susceptibilit et le d veloppement du cancer de la prostate Kesarwani 2011 Le SNP 31C G localis dans la r gion promotrice du g ne BIRC5 est associ au cancer du poumon au cancer colorectale sporadique ainsi qu au carcinome du nasopharynx Jang 2008 Gazouli 2009 Ma 2011 Le g ne BAX de la famille des BCL 2 contient un rSNP rs4645857 qui est associ au risque d velopper la leuc mie lymphoblastique chronique LLC Saxena 2002 Une tude sugg re que ce SNP influence la r ponse du patient a son traitement chimioth rapeutique contre le cancer du poumon Kn gel 2008 Le g ne BCL 2 poss de deux SNPs dont un dans sa r gion promotrice et un dans sa r gion 3 UTR qui sont reli s a la LLC Nuckel 2007 L augmentation du risque de d velopper cette maladie est aussi associ e a un SNP dans la r gion 3 UTR du g ne APAF1 Eujuanes 2008 Malgr la pr sence de plusieurs tudes r alis es sur la variabilit g n tique des promoteurs des g nes de la voie intrins que de l apoptose les connaissances sur l impact fonctionnel de ces rSNPs sur l activit de leur promoteur demeurent limit es Tableau I Polymorphismes des diverses maladies 22 r gions r gulatrices des g nes de l apoptose associ s G nes
63. e diff rentielle in vitro entre haplotype H1 et H2 originaux du promoteur d YWHAQ 59 200 180 160 Ratio Firefly Renilla e e gt ex N D N Sv40 OH1 OH1 95G H2 H2 95C pGL3BASIC JURKAT X 1000 JEG 3 X 100 HELA X 100 Figure 27 Impact fonctionnel de la mutagen se dirig e partir des haplotypes H1 et H2 du promoteur d YWHAQ La transfection cellulaire illustr e est faite dans les trois lign es cellulaires JURKAT JEG 3 et HeLa Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indications Les valeurs p sont calcul s a partir de 4 r plicas avec le test Student non pair p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 60 Puisque ni les essais de mutagen se dirig e et ni les essais de retardement sur gel n ont pas permis valider l impact fonctionnel des deux SNPs 515T gt G et 95C gt G du promoteur d YWHAQ de nouvelles constructions raccourcis du promoteur ont t confectionn es Ces constructions contenaient seulement 600 paires de bases et excluant ainsi la r gion en amont des deux SNPs du promoteur d YWHAQ r gion qui pourrait potentiellement affecter l activit promotrice en liant ses deux SNPs Le sch ma du promoteur raccourci d YW
64. e of 14 3 3 zeta Biochim Biophys Acta 2001 Vol 1547 pp 313 319 Yoneda T Imaizumi K Oono L Yui D Gomi F Katayama T Tohyama M 2001 Activation of caspase 12 an endoplasmic reticulum ER resident caspase through tumor necrosis factor receptor associated factor 2 dependent mechanism in response to the ER stress J Biol Chem 2001 Vol 276 17 pp 13935 13940 Youle R J Strasser A 2008 The BCL 2 protein family opposing activities that mediate cell death Nature Reviews January 2008 Vol 9 pp 47 59 96 Zannis Hadjopoulos M Yahyaoui W Callejo M 2008 14 3 3 Cruciform binding proteins as regulators of eukaryotic DNA replication Trends in biochemical sciences 2008 Vol 33 pp 44 50 Zeiss CJ 1997 The apoptosis necroisis continuum insights from genetically altered mice Vet Pathol 1997 Vol 40 pp 481 495 Zerban H Radig S Kopp Schneider A Bannasch P 1994 Cell proloferation and cell death apoptosis in hepatic preneoplasia and neoplasia are closely related to phenotypic cellular diversity and instability Carcinogenesis 1994 Vol 15 pp 2467 2473 Zha J Harada H Yang E Jockel J Korsmeyer SJ 1996 Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14 3 3 not BCL X L Cell 87 1996 Vol 4 pp 619 628 Zhu P Zhang D Chowdhury D Martinvalet D Keefe D Shi L Lieberman J 2006 Granzyme A which causes single stranded DNA damage targets the doubl
65. e strand break repair protein KU70 EMBO reports 2006 Vol 7 pp 431 437 Zornig M Hueber A Baum W Evan G 2001 Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis Biochimia Biophysica Acta 2001 Vol 1551 pp F1 F37 xvii ANNEXES Tableau IX Amorces pour l amplification PCR des promoteurs des diff rents g nes de l apoptose G nes Amorces Sens F et anti sens R BAG1 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGCCCGCACTTGTTGAC F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCAGCAGGCCACTCCTTA R BAG3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGAAAGCCTTGCCAATAACA F GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGAGTCATCGGCTATAA R CARD9 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCCTCTGGGAGATGCTG F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAGAGGCCAGGTATCTGCTG R CD47 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCACAGGCAGGACCCACTG F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGCCTCTCATTCCATTTTC R CYCS GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACCGGTGTAAGTGCAACCA F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGAAGACACCCCAAAACATT R MAP4K3 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAAACTCCAACATGGCTTCC F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCACTCAAGCCTGGACAACT R MAPK1 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATGCGGATTGGTTCCTC F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTCCCCAGTTTCTGAGCTTG R MAPK8 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAGGAGCTTTTCCTTGCTG F GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTGTTGTCACGCTTGCTTCT R NOD1 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGAACTGGCTGCGACTACAG F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGAGGGGAGAGGTTAGATGG R YWHAB GGGGACAAGTTT
66. effecteurs death effector domain Wajant 2002 La voie extrins que est emprunt e entre autre par le syst me immunitaire pour reconna tre et liminer les cellules infect es par un virus ou les cellules tumorales Le d clenchement de l apoptose est possible lorsque la cellule T cytotoxique va lier la cellule cible par ses ligands FAS Pro apoptotic ligand Cell extrinsic pathway Caspase 8 o0 t Caspases 3 6 847 sy NN G Figure 3 Sch ma des diff rentes composantes menant l activation de la voie extrins que de l apoptose Ashkenazi 2002 La voie intrins que La voie intrins que voie mitochondriale survient lors d une r ponse a un stimulus intracellulaire tel qu un dommage l ADN ou un stress oxydatif Figure 4 Le contr le et la r gulation de ces v vements apoptotiques au niveau de la mitochondrie sont effectu es par les prot ines de la famille Bcl 2 Cory 2002 Les membres de la famille des Bcl 2 comportent autant des prot ines pro apoptotiques qu anti apoptotiques ce jour un total de 25 g nes ont t identifi s dans la famille Bcl 2 Les prot ines anti apoptotiques Bcl 2 comprennent Bcl X Bcl XL Bcl W et BAG et les prot ines pro apoptotiques comprennent Bax Bak Bid Bad Bim Bik Bcl XS et Blk Adams 1999 Gross 1999 C est l quilibre dynamique entre la quantiti de prot ines pro et anti apoptose qui d termine le devenir d une ce
67. emia Polymorphisms promoters apoptosis functional impact cancer vi TABLES DES MATIERES RESUME tee den dr iii ABSTRACT sn natures a E v TABLES DES MATI RES irinenn tian panan aa an vi LISTE DESTABLEA UX Send manne aea A RRR viii LISTE DES FIGURES sie anne a A A E ANAN ix LISTE DES SIGLES ET ABR VIATIONS nm xii REMERCIEMENT Sinaine anneau endettement XV TIN PROD GTO Nias nes hante nie than cmann nant ce 1 ADOPTOS Eiry ie aa E N A uen 1 Caspase Siira rect eee a a a a a AN 2 Lavoie extrins gu Ciminna AN a Te ia ec enact eas 4 ba voie Ntrins gU Cisia a ai 5 Autres voies de apoptose SR ce Sd NN ess 7 D r gulation de lapoptose et Cancer sas rnb 10 Variabilit g n tique zisrann r a i i 14 Les SNPs la mutation des nucl otides et l impact de leur localisation 16 SNPs r gulateurs rSNPs cccccc etree ed ee ale 18 SNPs r gulateurs dans les g nes de l apoptose eesesseesseesseesteeseeeteeeteeeteenteeneentenseenteeaees 20 Haplotypes et d s quilibre de liaison 23 OO RES ESS ST en 25 O jectifs AU DrOJe LA ae An At eee 26 MAT RIELS ET M THODES 2 en cau tase cate 27 Lign s CARS a Me 27 Identification de polymorphismes r gulateurs rSNPs seesseesseessessseeseeeseeseesstesteesteeseens 28 D termination des haplotypes fr quents 0 esssesseesseesseseeseeeseeeseeeteeatesneeseeeatentesseesteeateeseens 28 Etude de l impact fonctionnel des rSNPs rHaplotyPe mme 29 Essai de g ne rapporteur ease ee eee eee
68. enant la portion du g ne tudier born e de s quences attL Apr s une incubation de 16 heures temp rature ambiante l ajout de l enzyme LR Clonase IT et d un vecteur de destination permet de r aliser une r action LR entre les s quences attL du vecteur pENTR et les s quences attR du vecteur de destination pGL3basic qui ne contient pas de promoteur interne Le r sultat final est un vecteur 30 contenant les diff rents haplotypes d int r t promoteur de 2kb en amont du g ne de la lucif rase Firefly Puisque le vecteur pGL3basic contient initialement seulement le g ne de la lucif rase d pourvu de son promoteur son expression sera r gul e par le promoteur ins r LR Clonase fl Figure 12 R actions de recombinaison BP et LR effectu e par la technologie Gateway Le fragment gene dans cette illustration correspond un fragment de 2kb x utilis dans le cadre cette tude r f rence modifi a partir du protocole d Invitrog ne 2004 Gateway Technology with Clonase II Une r action individuelle doit tre r alis e pour chacun des haplotypes tudi s Les diff rentes r actions sont ensuite utilis es pour la transformation de bact ries E Coli comp tentes DH5a ou One Shot Mach Une purification avec l ensemble QIAGEN Plasmid Mini Kit est effectu e afin d obtenir de l ADN plasmidique ultra pure qui est n cessaire pour faire des essais in vitro de transfections QIAGEN 2005
69. ent in the myeloperoxidase promoter contains a composite SP1 thyroid hormone retinoic acid response element Journal of Biology Chemistry 1996 Vol 271 pp 14412 14420 Pihlajam ki J Karjalainen L Karhapaa P Vauhkonen I Taskinen M R Deeb S S Laakso M 2000 G 250A Substitution in Promoter of Hepatic Lipase Gene Is Associated With Dyslipidemia and Insulin Resistance in Healthy Control Subjects 90 and in Members of Families With Familial Combined Hyperlipidemia Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2000 Vol 20 pp 1789 1795 Pinkoski M J Waterhouse N J Heibein J A Wolf B B Kuwana T Goldstein J C Newmeyer D D Bleackley R C Green D R 2001 Granzyme B mediated apoptosis proceeds predominantly through a Bcl 2 inhibitable mitochond J Biol Chem 2001 Vol 276 pp 12060 12067 Pola R Flex A Gaetani E Dal Lago A Gerardino L Pola P Bernabei R 2002 The 74 G C polymorphism of the interleukin 6 gene promoter is associated with Alzheimer s disease in an Italian population Neuroreport 2002 Vol 3 pp 1645 1647 Porter G W Khuri F R Fu H 2006 Dynamic 14 3 3 client protein interactions integrate survival and apoptotic pathways Semin Cancer Biology 2006 16 pp 193 202 Qi W Liu X Qiai D D Martinez J D 2005 Isoform specific expression of 14 3 3 proteins in human lung cancer tissues International Journal Cancer 2005 Vol 113 pp 359 363 Qi W Martinez J D 2003 Reduction of 14 3 3 proteins co
70. ent la sonde marqu 730T alors que les puits 6 9 repr sentent la sonde 730G Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue 45 Sonde non marqu e 141C 141T AP2 Extrait prot ique Complexe 1 Complexe 2 Complexe 3 Complexe Complexe 5 TITI Complexe 6 Complexe 7 123 45 67 8 9 Figure 17 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 141 C gt T d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 141 C gt T sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules HeLa Les puits 1 5 repr sentent la sonde marqu 141C alors que les puits 6 9 repr sentent la sonde 141T Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc
71. ertaines leuc mies et my lomes humains dont Mcl 1 Bcl XL Wuill me Toumi 2005 Allen 2010 Amarante Mendes 1998 Des mutations somatiques qui cause un changement du cadre de lecture frameshift dans le g ne codant pour la caspase 8 ont t d tect s dans des carcinomes h patocellulaires Soung 2005 Une tude a d montr que le g ne Apaf 1 une cible en aval de la voie p53 est inactiv dans le m lanome m tastasique De plus une perte d h t rozygotie LOH du g ne Apaf 1 a t retrouv dans 40 des m lanomes test s Dai 2004 La prot ine p53 joue un r le central dans le d clenchement des r ponses cellulaires une vari t de signaux de stress Levine 1997 Elle est cruciale dans la capacit d un individu contrer la transformation cellulaire et r pondre aux dommages l ADN induits par des th rapies contre le cancer Riley 2008 Dans la voie p53 les variations g n tiques h r ditaires commun ment tudi s sont les SNPs retrouv s dans les g nes p53 Harris 1986 Matlashewski 1987 et MDM2 Bond 2004 13 p53 2 Se pr Q f Abnormal N geme DNA damage Abnormal Telomere Hypoxia i proliferation NT RER nes f o Var B j Loss of suppor Chemoresistance angiogenesis survival factors rosi erosion j Increased sensitivity Reduced apoptosis Decreased death Decreased death to mutagens followin
72. es cellulaires diff rentes JEG3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif xxxiii 19 DEL AT 769 A G 7 847 C gt T 1 882 A gt G 1432 A gt G 1000 2000 B 700 AHI m H3 600 m H4 pGL3BASIC 500 sv40 400 300 200 100 0 JEG3 x 100 HELA x 100 Jurkat x 1000 Figure 5 A Sch ma du promoteur du g ne CYCS B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de CYCS La transfection est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes JEG3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXXIV A QU ROR oO UO 1 R o S Exon 1 1000 2000 450 400 350 300 250 200 150 Ratio Firefly Renilla 100 50 JEG 3 X 100 HELA X100 Jurkat x 1000 Figure 6 A Sch ma du promoteur du g ne MAP4K3 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de
73. es g nes impliqu s dans la voie d apoptose intrins que auraient un impact significatif dans l oncogen se en modifiant le taux d expression de ces g nes Dans cette tude nous avons valid l aide d une combinaison d approches in silico et in vitro l impact fonctionnel de la variabilit g n tique sous la forme d haplotypes rHAPs au niveau du promoteur proximal de 11 g nes codant pour des composantes de la voie intrins que de l apoptose Pour ce faire nous avons sous clon les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le g ne rapporteur lucif rase pGL3b Ces constructions furent utilis es dans des essais de transfections transitoires dans 3 lign es cellulaires Hela Jeg3 et Jurkat Nous avons observ qu au moins 2 rHAPs influencent significativement l activit transcriptionelle de fa on all le sp cifique Ces rHAPs sont associ s aux genes YWHAB et YWHAQ Les analyses de retard sur gel d lectrophor se EMSA ont permis d identifier 2 sites de liaison ADN prot ine diff rentielles dans les rHAPs du g ne YWHAB La iv variabilit du niveau d expression des g nes tudi s pourrait contribuer a la susceptibilit interindividuelle de d velopper un cancer tel que la leuc mie de l enfant Polymorphismes promoteurs apoptose impact fonctionel cancer ABSTRACT The regulation of apoptosis is important in maintaining cellular homeostasis and the integrity of the genetic material Apopto
74. es se lie autant a la sonde T qu a la sonde C car la bande ne disparait pas en pr sence des comp titeurs 515T ou 515C non marqu s La liaison est sp cifique puisque la comp tition avec la sonde AP2 ne fait pas dispara tre les bandes puits 9 Ensuite avec le SNP 95C gt G Figure 25 on peut y voir la pr sence de cinq diff rents complexes prot iques complexe 1 5 qui lient de fa on non diff rentielle autant 95C que 95G puits 2 vs puits 6 La comp tition dans les puits 3 et 4 ou dans les puits 7 et 8 confirme que les complexes se lie autant la sonde C qu la sonde G car la bande ne dispara t pas indiff remment du comp titeur 95C ou 95G non marqu La liaison semble sp cifique puisque la comp tition avec la sonde AP2 ne fait pas dispara tre les bandes puits 9 Toutes les trois lign es cellulaires pour les polymorphismes 515T gt C et 95C gt G ont montr aucune liaison diff rentielle Il semble les conditions utilis es pour ces essais de retard sur gel ne puissent pas d montrer quels SNPs qui seraient responsable de l activit promotrice diff rentielle observ e 55 Sonde non marqu e 515T 515C AP2 Extrait prot ique Complexe 1 Complexe 2 ow Complexe ff Complexe n Complexe Complexe 6 I lt 4 Complexe 7 1 23 4 5 6 7 8 9 Figure 24 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison non diff rentielle au niveau du rSNP 515 T gt C d YWHAQ
75. esis 2008 Vol 47 pp 383 390 Jang JS Kim K M Kang K H Choi JE Lee W K Kim C H Kang Y M Kam S Kim LS Jun J E 2008 Polymorphisms in the survivin gene and risk of lung cancer Lung cancer Amsterdam Netherlands 2008 Vol 60 pp 31 39 Jarman A P Wells R A 1989 Hypervariable minisatellites recombinators or innocent bystanders Trends Genetic 1989 Vol 5 pp 367 371 84 Jin J Smith F D Stark C Wells C D Fawcett J P Kulkarni S Metalnikov P O Donnell P Taylor P Taylor L Zougman A Woodgett J R Langeberg L K Scott J D Pawson T 2004 Proteomic Functional and Domain Based Analysis of In Vivo 14 3 3 Binding Proteins Involved in Cytoskeletal Regulation and Cellular Organization Current Biology 24 August 2004 Vol 14 16 pp 1436 1450 Jobling M A Hurles M E Tyler Smith C 2004 Human evolutionary genetics origins peoples and disease s l Garland Science 2004 Jones D Ley S Aitken A 1995 Isoforms of 14 3 3 protein can form Homo and Heterodimers in vivo and in vitro Implications for function as adapter proteins FEBS Letters 1995 Vol 368 1 pp 55 58 Kacinski B M Flick M 2001 Apoptosis and cutaneous T cell lymphoma Annals of the NY Academy of Sciences 2001 Vol 941 pp 194 199 Kanduc D Mittelman A Serpico R Sinigaglia E Sinha AA Natale C Santacroce R Di Corcia MG Lucchese A Dini L Pani P Santacroce S Simone S Bucci R Farber E 2002 Cell death Apoptosis versus necro
76. eu P Larivi re M Labuda D Sinnett D 2007 Promoter SNPs in G1 S checkpoint regulators and their impact on the susceptibility to childhood leukemia Blood 2007 Vol 109 2 pp 683 692 Healy J Dionne J B langer H Larivi re M Beaulieu P Labuda D Sinnett D 2009 Functional impact of sequence variation in the promoter region of TGFB1 International Journal of Cancer 2009 Vol 125 pp 1483 1489 Helms C Cao L Krueger J G Wijsman E M Chamian F Gordon D Heffernan M Daw JA Robarge J Ott J Kwok PY Menter A Bowcock A M 2003 A putative RUNX1 binding site variant between SLC9A3R1 and NAT9 is associated with susceptibility to psoriasis Nature Genetics 2003 Vol 35 pp 349 356 Hermeking H Lengauer C Polyak K He T C Zhang L Thiagalingam S Kinzler K W Vogelstein B 1997 14 3 3 sigma is a p53 regulated inhibitor of G2 M progression Mol Cell 1997 Vol 1 1 pp 3 11 Hermeking H 2003 THE 14 3 3 CANCER CONNECTION Nature Reviews 2003 Vol 3 pp 931 943 Hill M M Adrain C Duriez P J Creagh E M Martin S J 2004 Analysis of the composition asse bly kinetics and activity of native Apaf 1 apoptosomes Embo J 2004 Vol 23 pp 2134 2145 Hirsch T Marchetti P Susin S A Dallaporta B Zamzamis N Marzo I Geuskens M Kroemer G 1997 The apoptosis necrosis paradox Apoptogenic 83 proteases activated after mitochondrial permeability transition determine the mode of cell death Oncogene 1997 Vol 15 pp
77. faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes JEG3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 comme contr le positif non illustr xxxvii Coo lt ERAAN ry x amp Ne To O 1 lt no fc x N OO SI S a S 1000 2000 B 3 5 H5S ik H1 3 m H7 25 pGL3 basic f 2 x amp 1 5 ow gt 1 ne 0 5 l 0 JEG3 HELA Jurkat Figure 9 A Sch ma du promoteur du g ne NOD1 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de NOD1 La transfection est faite dans 2 lign es cellulaires diff rentes JEG3 et HeLa Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 comme contr le positif non illustr xxxviii 913 C 913 G Sonde non marqu e He E o o 913 C T 913 G Se AP2 Extrait e e e e ae ae e me prot ique Complexe 1 Complexe 2 aj 1 2 3 4 5 6 F7 o J Figure 10 Retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSN
78. g deregulation Overcome increased Invasion in response to carcinogens of the cell cycle senescence tumour size metastasis chem otherapeutics Loss of p53 Figure 7 La prot ine p53 est un supresseur de tumeur qui agit a divers niveaux afin de bloquer la progression de la carcinogen se Evan 2001 14 Variabilit g n tique Le g nome humain est identique chez les individus a pr s de 99 Redon 2006 Il reste donc 1 de la s quence g nomique qui diff re entre les individus d o la notion de variabilit g n tique On d finie g n ralement les polymorphismes comme tant des variations pr sentes dans l ADN avec une fr quence all lique 1 dans la population Knight 2005 Il existe plusieurs types de polymorphismes dont les polymorphismes de longueur et les polymorphismes simples Les polymorphismes de longueur impliquent des d l tions ou insertions de plusieurs nucl otides et les s quences r p t es en tandem VNTR Variations in the Number of Tandem Repeats Vignal 2002 Ces derniers sont des r p titions variables de s quences de longueurs variables Il y a deux classes de VNTR les microsatellites et les minisatellites Les microsatellites sont lorsque la s quence est de 1 6 bp Ils ne sont g n ralement pas r p t s plus d une vingtaine de fois et sont localis s un peu partout dans le g nome Karlin 1995 Les minisatellites sont des r p tions plus longues environ 10 bp et ils peuvent pour
79. gt A A G G gt C A gt C ArT 0 Cohorte Contr les Patients LLA 1 C C C G A G A A 53 0 50 0 60 0 5 C C T A G G A A 21 0 17 9 30 0 7 A C T G A C A A 16 0 17 9 10 0 1 53 C gt G 4 XX X 685 C gt G 1023 C gt A 1710 A gt G 1725 A gt G 1000 2000 B 80 0 m H1 70 0 E H3 m H4 60 0 pGL3BASIC 50 0 SV40 40 0 S gt 30 0 20 0 10 0 e 0 0 JEG3 x 100 HELA x 100 Jurkat x 1000 Figure 1 A Sch ma du promoteur du g ne BAG1 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de BAG1 La transfection est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes JEG3 HeLa et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 ou 1000 selon indication Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXX A QU lt lt 3 lt dam amp Oo AAA O N ONY N 1 8 RRS 2000 1000 B 100 p lt 0 05 90 p lt 0 005 p lt 0 0005 80 co 70 60 c 50 e S 40 U 2 30 20 10 0 nt Hela JEG3 Figure 2 A Sch ma du promoteur du g ne BAG3 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de BAG3 La transfection est faite dans 2 lign es cellulaires diff rentes HeLa et JEG3 Les r sultats illustr s so
80. ider dans la pr diction de la susceptibilit interindividuelle d velopper un cancer tel que la leuc mie de l enfant Des tudes d association l aide d une cohorte de 350 patients atteints de la LLA et 350 contr les d origine canadienne fran aise sont pr s entement en cours 77 BIBLIOGRAPHIE Adams J M Cory S 1998 The Bcl 2 protein family arbiters of cell survival Science 1998 Vol 281 pp 1322 1326 Adams J M Harris A W Strasser A Ogilvy S Cory S 1999 Transgenic models of lymphoid neoplasia and development of a pan hematopoietic vector Oncogene 1999 Vol 18 38 pp 5268 5277 Aggarwal B G Darnaym B B 1997 Early events in TNF signaling a story of associations and dissociations J Leukoc Biol 1997 Vol 61 pp 559 566 Aitken A 2006 14 3 3 proteins a historic overview Semin Cancer Biology 2006 Vol 16 pp 162 172 Albee L Shi B Perlman H 2007 Aspartic protease and caspase 3 7 activation are central for macrophage apoptosis following infection with E Coli J Leukoc Biol 2007 Vol 81 1 pp 229 237 Alizadeh A A Eisen M B Davis R E and al 2000 Distinct types of diffuse large B cell lymphoma identified by gene expression profiling Nature 2000 Vol 403 pp 503 511 Allen J C Talab F Zuzel M Lin K Slupsky J R 2010 c Abl regulates Mcl 1 gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells Blood 2010 Vol 117 8 pp 2414 2422 Altshuler D Daly M J Lander E S 2008 Ge
81. ieux d finies Une comp tition de liaison avec des sondes non marqu es est effectu e dans un ratio de 50 1 non marqu e marqu e Une sonde non sp cifique et non marqu e appel e AP2 est utilis e pour valider la sp cificit de la liaison observ e Sa s quence correspond la s quence mut e du site de liaison au facteur de transcription AP2 Tableau XI en annexe Mutagen se dirig e Une r action in vitro de mutagen se dirig e vers un site pr cis est une technique efficace pour caract riser l impact d un polymorphisme sur l effet dynamique de la liaison des complexes prot iques l ADN par rapport la r gulation de l expression g nique Des essais de mutagen se dirig e ont t faits pour les g nes YWHAB et YWHAQ a l aide de la trousse QuikChange II Site Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies Cette trousse permet de muter des sites sp cifiques a l int rieur d un vecteur plasmidique double brins l aide d une proc dure rapide utilisant une seule r action en trois tapes avec une efficacit de plus de 80 Figure 13 34 Mutont Strand Synthesis Perform ermal cycling te 1 Deecture DMA tempicte Annecl mulogeric primers comsiring desred mutation 3 Edend primers with Fibre DNA polymerase u _ F 27 Opn I Digestion of Template j A 3 D ger pareric metmyicted and s ee hamimethyicted DNA wit Dpr gt Pp Tronstormoton Tronsiorm mulzied molecule indo competent cells for mick
82. iminution de l apoptose 74 Limitations de l tude Mon projet cherchait a d montrer le lien entre la variabilit g n tique et l activit promotrice diff rentielle Pour ce faire nous avons cibl le promoteur proximal d fini arbitraiement comme une r gion de 2kb en amont de l exon 1 Nous sommes conscients qu il est probable que d autres polymorphismes pr sents l ext rieur de la r gion promotrice puissent influencer le niveau d expression d un g ne Une des limites importantes de notre tude est le contexte in vitro des exp riences I se peut que les r sultats ainsi obtenus ne refl tent pas n cessairement ce que nous pourrions observer in vivo La r gulation de l expression des g nes implique g n ralement plusieurs l ments r gulateurs ainsi que des facteurs et cofacteurs de transcriptions qui peuvent avoir t absent dans notre contexte exp rimental in vitro Les modifications pig n tiques du promoteur sont aussi des l ments importants pouvant influencer la disponibilit de la r gion promotrice lier des facteurs de transcriptions Pour ce qui est de nos exp riences de retard sur gel la liaision des prot ines pr sentes dans les extraits nucl aires pourraient lier ou non diff rement la sonde dans un contexte in vitro vs in vivo Dans la cellule le recrutement de complexes prot iques l ADN n cessite l interaction avec plusieurs facteurs de transcription pour pouvoir venir lier le promote
83. involved in human follicular lymphoma Proc Natl Acad Sci USA 1986 Vol 83 14 pp 5214 5218 TYacoubian A Slone S R Harrington A J Hamamichi S Schieltz J M Caldwell K A Caldwell G A Standaert D G 2010 Differential neuroprotective effects of 14 3 3 proteins in models of Parkinson s disease Cell Death and Disease 2 2010 Vol 1 Tzivion G Vinita Singh G Kaplun L Vitaly B 2006 14 3 3 proteins as potential oncogenes Seminars in Cancer Biology 2006 Vol 16 pp 203 213 Varfolomeev E Vucic D 2011 Inhibitor of apoptosis proteins fascinating biology leads to attractive tumor therapeutic targets Future Oncol 2011 Vol 7 5 pp 633 648 Vasiliev G V Merkulov V M Kobzev V F Merkulova TI Ponomarenko MP Kolchanov N A 1999 Point mutations within 663 666 bp of intron 6 of the human TDO2 gene associated with a number of psychiatric disorders damage the YY 1 transcription factor binding site FEBS 1999 Vol 462 pp 85 88 Vazquez A Grochola L Bond E E Levine A J Taubert H M ller T H W rl P Bond G L 2009 Chemosensitivity Profiles Identify Polymorphisms in the p53 94 Network Genes 14 3 3t and CD44 That Affect Sarcoma Incidence and Survival Molecular and Cellular Pathobiology 8 December 2009 Vol 70 1 pp 172 180 Verhagen A M Ekert P G Pakusch M Silke J Connolly L M Reid G E Moritz R L Simpson R K Vaux D L 2000 Identification of DIABLO a mammalian protein that promotes apoptosis by binding
84. isent les fonctions des prot ines 14 3 3 en amont et en aval de la prot ine p53 Hermeking 2003 66 Les prot ines de la famille 14 3 3 sont connues pour pr venir un d clenchement non d sir du m canisme de l apoptose et aident au maintien du bon d roulement du cycle cellulaire Kuzelova 2009 L affinit des prot ines 14 3 3 pour leur cibles est r gul e par la phosphorylation autant sur les cibles prot iques qu entre eux Obsilova 2008 Fait important l implication des prot ines 14 3 3 dans la r gulation des oncog nes et des g nes suppresseurs de tumeurs sugg re un r le dans l oncogen se Tzivion 2006 Il a t propos que la liaison des prot ines 14 3 3 des ligands pro apoptotiques comme BAD et BAX constitue une tape essentielle la survie cellulaire Samuel 2001 Datta 2000 Master 2001 Subramanian 2001 Yang 2001 Par exemple YWHAQ est connu pour se lier avec BAD une prot ine BCL2 related et ainsi suprimer sa fonction anti apoptose en relocalisant cette prot ine BAD dans le cytoplasme Zha 1996 Hsu 1997 Figure 31 67 Pro apoptotic D es IL 3 IGF1 Ca2 PTEN loss Inactive Anti apoptotic Nature Reviews Cancer Figure 31 M canisme d action anti apoptotique d YWHAQ 14 3 3 lors de sa liaison avec BAD Hermeking 2003 La surexpression des plusieurs isoformes des prot ines de la famille 14 3 3 YWHAB YWHAQ YWHAG
85. iteur 141T non marqu La liaison est sp cifique puisque la comp tition avec la sonde AP2 ne fait pas changer le profil des bandes puits 9 Pour les trois lign es cellulaires les SNPs 730T gt G et 141C gt T ont montr une liaison diff rentielle alors que les quatre autres SNP test s 913C gt G 931C gt T 134T gt C 7G gt T ne montrent pas de diff rence Ceci sugg re que les rSNPs 730T gt G et 141C gt T seraient impliqu s dans l activit promotrice diff rentielle observ e Nous avons fait des analyses in silico pour pr dire l impact de ces 2 rSNPs sur les sites gain ou perte de liaison a des facteurs de transcriptions Pour le SNP 730 T gt G nous observons une liaison diff rentielle pour trois facteurs de transcriptions un site de liaison RXR heterodimer ainsi que 2 sites pour la prot ine p53 tumor suppressor Tableau V Pour le SNP 43 141C gt T nous contemplons une liaison diff rentielle pour deux facteurs de transcriptions un site de liaison pour une prot ine zinc finger et un pour la prot ine PAX 5 B cell specific activator Tableau VI Tableau V Liste des facteurs de transcription pr dits lors des analyses in silico pour le SNP 730 T G du g ne YWHAB par le logiciel MatInspector Facteurs de transcriptions pr dits Matrix All le All le score 730 T 730G Ikaros zinc finger family 0 983 Vv Vv Octamer binding protein 0 877 Vv Vv RXR he
86. l 301 1 pp 101 124 Mhawech Paulette 2005 14 3 3 proteins an update Cell Research 2005 Vol 15 4 pp 228 236 Mignotte B Vayssiere J L 1998 Mitochondria and apoptosis Eur J Biochem 1998 Vol 252 pp 1 15 Mitchison NA 2001 Polymorphism in regulatory gene sequences Genome Biol 2001 Vol 2 1 p COMMENT2001 Morrison Deborah K 2009 The 14 3 3 proteins integrators of diverse signaling cues that impact cell fate and cancer development Trends in Cell Biology 19 2009 Vol 1 pp 16 23 Muslin A J Tanner J W Allen P M Shaw A S 1996 Interaction of the 14 3 3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine Cell 1996 Vol 84 pp 889 897 Nambiar M Kari V Raghavan S C 2009 Chromosomal translocations in cancer Biochimia et Biophysica Acta 2009 Vol 1786 2 pp 139 152 Nuckel H Frey H Bau M Sellmann L Stanelle J Durig J Jockel K H Duhrsen U Siffert W 2007 Association of a novel regulatory polymorphism 938C A in the BCL2 gene promoter with disease progression and survival in chronic lymphocytic leukemia Blood 2007 Vol 109 pp 290 297 Obsilova V Silhan J Boura E Teisinger J Obsil T 2008 14 3 3 Proteins A Family of Versatile Molecular Regulators Physiology Research 57 Suppl 3 2008 pp 11 21 89 Ohsaka Y Nishino H 2010 Polymorphisms in promoter sequences of MDM2 p53 and p16 genes in normal Japanese individuals Genet Mol Biol 2010 Oct 33 4 615
87. l les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue
88. le d identifier le ou les rSNPs fonctionnels l aide des exp riences in vitro r alis es Sur les 6 rSNPs test s lors de ces essais seulement les rSNPs 730T G et 141C T ont montr qu il y avait des liaisons diff rentielles Figure 16 et Figure 17 Les pr dictions de liaisons de facteurs de transcription du rSNP 730 T G ont montr une liaison diff rentielle L all le G H1 peut lier deux l ment p53 tumor supressor tandis que l all le T H8 ne lie pas ces facteurs Tableau V Les scores de la matrice pour ces deux l ments sont de 0 920 et 0 975 ce qui est qualifi un bon match la matrice gt 0 80 selon les normes de MatInspector Cartharius 2005 Selon la lit rature le facteur de transcription p53 r gule l expression des g nes impliqu s dans diff rentes fonctions cellulaires incluant le cycle cellulaire la r paration de l ADN ainsi que l apoptose Vogelstein 2000 P53 peut induire l apoptose en r ponse un dommage a 69 l ADN lorsque les l sions sont tr s tendues ou lorsque le m canisme de r paration l ADN choue Lane 1993 La perte de l activit de l l ment p53 se traduit par une tol rance aux dommages l ADN produits par des agents g notoxiques Irby 1999 Le d veloppement du cancer est ventuellement favoris puisque la cellule n est plus capable d induire l apoptose Ainsi la perte de la liaison du facteur de transcription p53 par l all le T
89. llule Burlacu 2003 Le r le de ces prot ines dans la r gulation de l apoptose de la tumorigen se et dans la r ponse cellulaire en r ponse la th rapie contre le cancer a t grandement tudi dans les derni res d cennies Youle 2008 Les prot ines contenant un motif BH3 only peuvent int ragir avec les prot ines de la famille des BCL 2 afin de promouvoir l apoptose Aouacheria 1996 Kelekar 1998 Wu 2002 Les membres de cette famille int ragissent directement avec la mitochondrie soit constitutivement ou apr s l induction de l apoptose Kuwana 2003 Ils r gulent la mort cellulaire selon leur effet sur la conformation et la perm abilisation de la membrane externe de la mitochondrie Mignotte 1998 La perm abilisation de la membrane est effectu e grace a l ouverture de pores sa surface qui permet ainsi la lib ration du cytochrome c Barry 2002 Ce dernier lib r lie et active APAF 1 apoptotic protease activating factor 1 ainsi que la procaspase 9 pour former un complexe enzymatique nomm apoptosome Hill 2004 Bao 2007 D autres prot ines telles que les caspases 3 et 9 ainsi qu AIF apoptosis inducing factor l endonucl ase G et Smac DIABLO sont aussi relach es lors de cette perm abilisation Du 2000 Mancini 1998 Susin 1999 L association Smac DIABLO stimule l apoptose en inhibant l activit de la prot ine IAP inhibitors of apoptosis proteins Verhagen 2000 Ces prot
90. me 14 3 3 theta sous une nouvelle forme tronqu e en 3 UTR dans les cellules de Sertoli du testicule murin qui influencerait sa fonction cellulaire Chaudhary 2000 Une autre tude a d montr qu YWHAQ tait significativement surexprim e dans le s rum des patients atteint du cancer du poumon comparativement aux individus non atteints Pereira Faca 2007 Ils ont m me propos que cette d tection dans le s rum des patients ouvrait la possibilit d utiliser ce biomarqeur pour discriminer efficacement les diff rents stages du d veloppement du cancer du poumon Une r cente tude sur l identification de variants fonctionnels sur des g nes impliqu s dans le cycle cellulaire et l apoptose a permis de trouver 7 SNPs qui pr sentent des diff rences all liques dans la r ponse cellulaire a un large panel d agents chimioth rapeutiques cytotoxiques Parmis les SNPs trouv s un SNP intronique du g ne YWHAQ rs6734469 P 5 6x10 7 a d montr une forte association avec la faible r ponse aux agents chimioth rapeutiques ainsi qu un faible taux de survie des patients atteints du sarcome des tissus mous Vazquez 2009 73 A notre connaissance il n y a aucune publication qui pr sente la caract risation de la r gion promotrice d YWHAQ En combinant nos r sultats avec la litt rature existante il semble que l haplotype 1 associ a une plus forte activit promotrice favoriserait l apparition du cancer suite une d
91. me de l apoptose est observ e dans plusieurs diff rents types cancers La majorit de ces prot ines sont impliqu es dans la voie intrins que de l apoptose probablement en lien avec la r ponse li e au stress cellulaire BCL 2 a t d couvert gr ce son implication dans la translocation chromosomique t 14 18 commun ment associ e avec le lymphome folliculaire non Hodgkinien Tsujimoto 1986 La surexpression de BCL 2 contrecarre l effet pro apoptose de c MYC favorisant ainsi une prolif ration massive et les lymphomes qui surexpriment ces deux prot ines simultan ment sont tr s aggressifs Evan 1998 L l vation du niveau d expression de la prot ine BCL 2 est retrouv e dans la majorit des malignit s h matopo tiques tels que le my lome multiple MM la leuc mie lymphoblastique chronique CLL la leuc mie lymphoblastique aig e ALL et leuc mie my lo de aig e AML Kitada 2002 12 L inactivation de la prot ine pro apoptotique BAX est observ e dans les tumeurs solides ainsi que dans les tumeurs h matopo tiques Brimmell 1998 Rampino 1997 Le ratio BCL 2 BAX semble influencer le pronostique ainsi que la progession tumorale un raccourcicement du temps de r mission ainsi qu une mort plus rapide pour les leuc mies CLL Pepper 1998b AML Kornblau 2000 et ALL Hogarth 1999 La surexpression de plusieurs g nes anti apoptose membres de la famille BCL 2 a t d montr dans c
92. mentation de l activit promotrice de l haplotype mutant H2 95C 1 8 ni original 1000 2000 515 T 1 3 41 956 1000 2000 1 9 ya 5 H2 Exon 1 original 1000 2000 1 a 2 m l a 1000 2000 Figure 26 Sch ma des constructions utilis es lors des exp riences de mutagen se dirig e pour le g ne YWHAQ 58 L activit promotrice des nouvelles constructions mut es H1 95G et H2 95C a t test e par des essais de g ne rapporteur pour voir l impact des mutations sur l activit promotrice d YWHAQ Le r sultat de la transfection cellulaire dans les trois lign es cellulaires est montr la Figure 27 On constate que tous les promoteurs sous clon s sont actifs puisque ses valeurs de lucif rases sont de 5 95 fois plus lev es que le contr le n gatif pGL3b Une activit diff rentielle est toujours observ e entre les haplotypes H1 et H2 originaux p lt 0 05 dans les trois lign es o l haplotype H1 montre une activit promotrice plus forte que l haplotype H2 le H1 montre une activit de 1 14 1 5 fois sup rieure l haplotype H2 original Par contre aucune activit promotrice diff rentielle n a t obtenue entre les haplotypes originaux et les haplotypes mut s correspondants H1 vs H1 95G et H2 vs H2 95C Le profil similaire a t observ dans toutes les lign es cellulaires test es On observe toujours la pr sence d une activit promotric
93. n e cellulaire JEG 3 Les r sultats illustr s sont tir s d une exp rience repr sentative parmi 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s en ratio de l activit de la Firefly Renilla multipli par 100 Les valeurs p sont calcul s partir de 4 r plicas avec le test Student non pair p lt 0 05 p lt 0 005 p lt 0 0005 49 Puisque les essais de mutagen se dirig e n ont pas permis de valider l effet des rSNPs 730T gt G et 141C gt T sur l activit promotrice diff rentielle de nouvelles constructions raccourcis du promoteur ont t confectionn es L haplotype H8 est celui avec la plus forte activit promotrice Comme il diff re seulement a 2 positions 930C gt G et 730 T gt G avec l haplotype H1 nous avons choisi d exclure ceux ci des nouvelles contructions Ces constructions contenaient seulement les 900 paires de bases et excluaient les deux SNPs 930C gt G et 730 T gt G Le r sultat attendu est que l activit des nouvelles constructions sera quivalente Le sch ma des promoteurs raccourcis d YWHAB est illustr la Figure 20 1 900 141 C 1347 70 INS CGC 531 C 141 C 134 T 7G 900 70 INS CGC Figure 20 Sch ma des haplotypes du promoteur raccourci d YWHAB L activit promotrice des haplotypes raccourcis H1 900bp et H8 900bp a t test e par des essais de g ne rapporteur pour voir leur impact sur l activit promotrice
94. netic Mapping in Human Disease Science 2008 Vol 322 5903 pp 881 888 Amarante Mendes M P McGahon A J Nishioka W K Witte O N Green D R 1998 Bl 2 independent Bcr Abl mediated resistance to apoptosis protection is correlated with up regulation of Bcl xL Oncogene 1998 Vol 16 11 pp 1383 1390 Aouacheria A Brunet E Gouy M 1996 Phylogenomics of life or death switch in multicellular animals Bcl 2 and homodimerizes with Bax via a novel domain BH3 distinct from BH1 and BH2 J Biol Chem 1996 Vol 271 pp 7440 7444 Ashkenazi A Dixit V M 1998 Death receptors signaling and modulation Science 1998 Vol 281 pp 1305 1308 78 Ashkenazi A 2002 Targeting death and decoy receptors of the tumor necrosis factor superfamily Nat Rev Cancer 2002 Vol 2 6 pp 420 430 Bao Q Shi Y 2007 Apoptosome a platfor for the activation of initiator caspases Cell Death Differ 2007 Vol 14 1 pp 56 65 Barry M Bleackley R C 2002 Cytotoxic T lymphocytes all roads lead to death Nat Rev Immunol 2002 Vol 2 pp 401 409 Beckmann J S Estivill X Antonarakis S E 2007 Copy number variants and genetic traits closer to the resolution of phenotypic to genotopic variability Nat Rev Genetic 2007 Vol 8 pp 639 646 B langer H Beaulieu P Moreau C Labuda D Hudson T J Sinnett D 2005 Functional promoter SNPs in cell cycle checkpoint genes Human Molecular Genetics 2005 Vol 14 18 pp 2641 2648 Bhatia K Siraj
95. nt d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXXI 362 A gt G 1002 A gt G 1065 A gt G 1772 T gt C 2016 A gt G E 9 A Le 1 M N D mM 1159 C gt T 1205 C gt T 1350 G gt A 1411 T gt C 1000 2000 H uI Oo o ea x g uI Figure 3 A Sch ma du promoteur du g ne CARD9 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de CARD9 La transfection est faite dans 3 lign es cellulaires diff rentes HeLa JEG3 et Jurkat Les r sultats illustr s sont d une exp rience repr sentative de 3 exp riences ind pendantes Les r sultats sont exprim s comme ratio de la Firefly Renilla multipli par 100 Le vecteur pGL3basic seul est utilis comme contr le n gatif et le vecteur SV40 est utilis comme contr le positif XXXii ma 08 C gt T 343 C gt T 1176 C gt G 1281 G gt A 1750 C gt G 5 EO pGL3BASIC 1000 2000 70 60 50 E SV40 w Firefly Renilla N 10 JEG 3 x 100 HELA x 100 Jurkat x 1000 Figure 4 A Sch ma du promoteur du g ne CD47 B Impact fonctionnel des haplotypes du promoteur de CD47 La transfection est faite dans 3 lign
96. nt lors d un changement entre une purine et une pyrimidine A lt T AC G lt T ou G gt C Jobling 2004 Lors de cette tude 23 8 des SNPs identifi s n taient pas pr sents dans la base de donn es de dbSNP Tableau II R sum des r sultats obtenus pour les promoteurs des 11 g nes tudi s de la voie intrins que de l apoptose G nes CES Nb de SNPs Num ro RS ou position sur chromosome Nb d haplotypes fr quents 25 Activit promotrice Expression diff rentielle AD BAG1 Rs706123 Rs706122 Rs11791605 Rs16919130 Chr9 33 265 215 Oui Non BAG3 Rs61869035 Rs2420641 Rs35117013 Rs34330597 Rs35097693 Rs11199059 Oui Non CARD9 11 Rs3088081 Rs3812560 Chr9 139 269 544 Rs3829111 Rs10781500 Chr9 139 269 292 Rs3829110 Rs3812558 Chr9 139 268 495 Chr9 139 268 453 Chr9 139 268 267 Oui Non CD47 Chr3 107 811 685 Rs326341 Rs7612356 Chr3 107 810 278 Rs62264065 Oui Non 37 CYCS Rs2107123 Chr7 25 165 837 Chr7 25 165 802 Rs3846998 Rs5882962 Oui Non NOD1 Rs5743322 Chr7 30 519 364 Chr7 30 519 030 Rs2075816 Rs2066973 Rs7790806 Rs2108356 Rs2108355 Non Non MAP4K3 Chr2 39 665 589 Rs56128332 Chr2 39 664 535 Oui Non MAPK1 Rs9607343 Chr22 22 223 009 Rs9607340 Rs9610505 Oui Non MAPK8
97. onctionnel de la mutagen se dirig e a partir des haplotypes H1 et H2 du promoteur d YWHAQ Figure 28 Sch ma des haplotypes du promoteur raccourci d YWHAQ Figure 29 Impact fonctionnel des promoteurs raccourcis d YWHAQ Figure 30 Les dommages l ADN induisent les fonctions des prot ines 14 3 3 en amont et en aval de la prot ine p53 Hermeking 2003 Figure 31 M canisme d action anti apoptotique d YWHAQ 14 3 3 lors de sa liaison avec BAD Hermeking 2003 xii LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ADN A MEM ARN ARNm ATP BAG1 BAG3 BCL2 BH bp Co Ca2t CARD9 cDNA CMV CNV CYC dNTPs DLR E Coli EDTA eSNP EtBr FBS fmol gSNP Acide d soxyribonucl ique Alpha Modification Minimal Essential Medium Acide ribonucl ique ARN messager Ad nosine triphosphate BCL2 associated athanogene 1 BCL2 associated athanogene 3 B Cell CLL Lymphoma 2 BCL2 homology paire de base degr s Celsius Calcium caspase recruitment domain family member 9 coding DNA Cytom galovirus Copy Number Variation cytochrome c m lange des quatre d soxyribonucl otides triphosphates Dual Luciferase Reporter Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid SNP exonique bromure d thidium s rum de veau f tal fento mole gramme SNP g nomique HR iSNP kb LB LLA M MAP4K3 MAPK1 MAPK8 mg MgClz miRNA mL mM NaOH ng NOD1 Opti MEM pSNP PBS PCR pmoles qRT PCR rSNP SDS SN
98. pourrait favoriser l expression du g ne YWHAB et accentuer l inabilit de la cellule induire l apoptose ainsi qu intervenir dans la progression du cycle cellulaire normal Les exp riences de mutagen se dirig e sur les SNP 730T G et 141 C T n ont pas permis de valider leur impact direct de ces SNPs sur l activit promotrice diff rentielle observ e pour YWHAB Les essais de transfections cellulaires des contructions raccourcis H1 900bp et H8 900bp du g ne YWHAB ont montr une activit promotrice semblable Figure 21 La perte de l activit promotrice diff rentielle entre ses deux haplotypes permet de sp culer sur le r le d un ou des deux SNPs exclus des contructions 913C G et 730T G La perte de ces SNPs doit emp cher la liaison d un complexe prot ique et ainsi causer la perte l activit promotrice diff rentielle d YWHAB Ceci sugg re que la r gion tronqu e est impliquer dans l activit promotrice diff rentielle ant rieurement avec les constructions de 2kb notre connaissance il n y a aucune publication visant la caract risation de la r gion promotrice d YWHAB Cependant plusieurs tudes ont t r alis sur la quantification de l expression g nique de cet isofome de la famille 14 3 3 Une tude d montr e que ARNm d 14 3 38 tait surexprim dans plusieures 70 lign es cellulaires de tumeurs murines et qu une r duction de 14 3 38 pourrait supprimer la croissance des cellules
99. proteins regulate diverse cellular processes Biochem Journal 2004 Vol 381 Part 2 pp 329 342 Makin G Hickman J A 2000 Apoptosis and cancer chemotherapy Cell Tissue Res 2000 Vol 301 1 pp 143 152 Malaspina A Kaushik N de Belleroche J 2000 A 14 3 3 mRNA is up regulated in amyotrophic lateral sclerosis spinal cord Journal of Neurochemistry 2000 Vol 75 6 pp 2511 2520 Mancini M Nicholson D W Roy S Thornberry N A Peterson E P Casciola Rosen L A Rosen A 1998 The caspase 3 precursor has a cytosolic and mitochondrial distribution implications for apoptotic signaling The Journal of cell biology 1998 Vol 140 pp 1485 1495 Master S C Yang H Datta S R Greenberg M E Fu H 2001 14 3 3 inhibits BAD induced cell death through interaction with serine 136 Molecular Pharmacology 2001 Vol 60 pp 1325 1331 88 Masters S C Fu H 2001 14 3 3 proteins mediate an essential anti apoptotic signal Journal of Biology Chemistry 2001 Vol 276 48 pp 45193 45200 Matlashewski G J Tuck S Pim D Lamb P Schneider J Crawford L V 1987 Primary structure polymorphism at amino acid residue 72 of human p53 Mol Cell Biology 1987 pp 961 963 McConkey D J Hartzell P Nicotera P Orrenius S 1989 Calcium activated DNA fragmentation kills immature thymocytes FASEB 1989 Vol 3 pp 1843 1849 Medh R D Thompson E B 2000 Hormonal regulation of physiological cell turnover and apoptosis Cell Tissue Res 2000 Vo
100. r g n ration les all les associ es une ph notype sont souvent en d s quilibre de liaison avec les SNPs proximit s permettant l utilisation de tagging SNPs Altshuler 2008 Le d s quilibre de liaison cr e alors des blocs d haplotypes dans le g nome qui regroupent les r gions n ayant pas subi de recombinaison Figure 9 Il est donc important dans une tude d association de consid rer la r gion tudi e comme un haplotype un regroupement de SNPs plut t que d tudier l impact individuel de chacun des SNPs Cela permet de se rapprocher davantage du contexte g nomique en tudiant l impact que peut avoir un ensemble de SNPs sur l expression g nique Il a d ailleurs t d montr qu un SNP pouvait jouer un r le diff rent dans un contexte haplotypique comparativement un contexte individuel Redon 2006 24 0900000000 00000000 Figure 9 Types de polymorphismes haplotypes et d s quilibre de liaison Altshuler 2008 25 Hypoth ses Comme l apoptose est une voie biologique hautement r gul e nous proposons que des SNPs dans les r gions promotrices rSNP des g nes d apoptose perturberaient cette voie via la variation des taux de transcrits et des prot ines correspondantes Figure 10 La pr sence de rSNPs modifierait la s quence de reconnaissance de certains facteurs de transcription au niveau du promoteur gain ou perte de liaison alt rant ainsi le niveau d expression des g
101. riants g n tiques fonctionnels semble expliquer en partie la diff rence inter individuelle dans la susceptibilit a d velopper une maladie Dans ce projet mon attention s est port essentiellement sur les SNPs localis s dans la r gion de r gulation des g nes rSNPs Ces polymorphismes peuvent affecter la liaison de facteurs de transcription ce qui engendre des alt rations dans la transcription des g nes correspondants Puisque l limination des cellules par le processus de mort cellulaire programm e apoptose est un m canisme essentiel dans le maintien de l hom ostasie cellulaire il est probable que la pr sence de variants dans cette voie hautement r gul e puisse augmenter le risque de d velopper une maladie complexe notamment le cancer L accumulation de cellules anormales contenant une voie d apoptose d r gul e contribuerait a cr er un environnement propice la tumorigen se Pour ce faire j ai d termin le contenu en SNPs dans la r gion proximale des promoteurs de 11 g nes de la voie intrins que de l apoptose BAG1 BAG3 CARD9 CD47 CYCS MAP4K3 MAPK1 MAPK8 NOD1 YWHAB et YWHAQ L impact fonctionel des rSNPs correspondants et des haplotypes associ s ont t effectu en combinant des essais in vitro et des outils de pr dictions in silico 63 Sommaire des r sultats obtenus L tude des rSNPs dans les promoteurs a permis d identifer 63 rSNPs et 32 haplotypes majeurs dans 11 g nes de
102. rices des g nes MDM2 P53 et P16 diff rent selon les individus et que les polymorphismes peuvent modifier l activit de transcription du g ne Ohsaka 2010 Le SNP309 r sulte dans un changement thymine vs guanine dans le promoteur de l oncog ne MDM2 qui code pour un r gulateur n gative de p53 Chez l homme le SNP309 est associ la formation acc l r e de tumeurs autant dans les cancers h r ditaires que dans les cancers sporadiques Un mod le est propos o le SNP309 sert comme un v nement de limitation de vitesse dans la carcinogen se Bond 2004 Des mutations de TP53 et CHEK2 ont t associ l absence de r ponse l pirubicine en monoth rapie pour traiter le cancer du sein En revanche les mutations de TP53 et l all le 309G de MDM2 conf rent un faible taux de survie pour les patients trait s avec le paclitaxel en monoth rapie primaire Chrisanthar 2011 Des mutations dans plusieurs caspases sont associ es diff rents cancers Le g ne codant pour la caspase 3 poss de un SNP dans la r gion 5 UTR qui est reli au cancer du poumon et aux carcinomes cellules squameuses Jang 2008 Chen 2008 Le g ne CASP 8 poss de deux SNPs dans sa r gion promotrice qui sont associ s au lymphome non Hodgkin sauf dans la population chinoise Alizadeh 2000 Xiao 2011 Le risque de d velopper le cancer du poumon est aussi associ 21 a divers rSNPs pr sents dans le g ne CASP 9 Park 2006 Un
103. rps apoptotiques sont ensuite phagocyt s par des macrophages et n induisent pas de r action inflammatoire Kurosaka 2003 Caspases Les caspases sont des prot ases a cyst ine nomm es ainsi pour Cysteine Aspartyl specific Proteases Cryns 1998 En temps normal les caspases sont retrouv es dans la cellule sous leurs formes inactives zymog ne Degterev 2003 En r ponse un stimulus les zymog nes sont activ s par un processus prot olytique impliquent un r sidu aspartate localis dans le pro domaine Timmer 2007 Albee 2007 Cette activation transforme les caspases sous leur forme d h t rotetramere Lu 2011 Group COOH Casp 11 murine Group Il COOH Casp 8 FLICE MACH MchS z z T COOH Casp 9 ICE LAP6 Mch 6 7 Group III egend co CARD NH En oo Casp 3 Yama CPP32 apopain DEO NH COOH Casp 6 Mch2 DM large catalytic subunit GS small catalytic subunit NH EE COOH Casp 7 ICE LAP3 Mch3 CMH 1 Figure 1 Illustration des diff rentes caspases regroup es selon leur fonction Groupe I les caspases inflammatoires Groupe II les caspases initiatrices de l apoptose et Groupe 3 les caspases effectrices de l apoptose Lavrik ActaNaturae On compte ce jour 14 caspases Figure 1 dont plusieurs ont un r le majeur dans l apoptose tandis que d autres ont un r le dans la r ponse inflammatoire caspase 1 4 5 et 11 a 14 Cohen 1997 Les caspases
104. rrelates with increased sensitivity to killing of human lung cancer cells by ionizing radiation Radiation Reseach 2003 Vol 160 2 pp 217 223 QUIAGEN 2005 QUIAGEN Plasmid Purification Handbook 2005 Ramos Lopez E Zwermann O Segni M Meyer G Reincke M Seissler J Herwig J Usadel K H Badenhoop K 2004 A promoter polymorphism of the CYP27B1 gene is associated with Addison s disease Hashimoto s thyroiditis Graves disease and type 1 diabetes mellitus in Germans European Journal of Endocrinology 2004 Vol 151 pp 193 197 Rampino N Yamamoto H Ionov Y Li Y Sawai H Reed J C Perucho M 1997 Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype Science 1997 Vol 275 5302 pp 967 969 Redon R Ishikawa S Fitch K R Feuk L Perry G H Andrews T D Fiegler H Shapero M H Carson A R Chen W 2006 Global variation in copy number in the human genome Nature 2006 Vol 444 pp 444 454 91 Reed John C 1999 Dysregulation of apoptosis in cancer Journal of Clinical Oncology 1999 Vol 17 9 pp 2941 2953 Riley T Sontag E Chen P Levine A 2008 Transcriptional control of human p53 regulated genes Nat Rev Mol Cell Biol 2008 Vol 9 pp 402 412 Rinkenberger J L Korsmeyer S J 1997 Errors of homeostasis and deregulated apoptosis Curr Opin Genet Dev 1997 Vol 7 5 pp 589 596 Rockman M V Wray G A 2002 Abundant raw material for cis regulatoryevolution in
105. s v nements de duplication regroupement dans une m me g n ration chromosomique de g nes dupliqu s en tandem et d l tion locales c est dire d un ou de quelques g nes souvent suite un enjambement in gal Cette forme de polymorphisme constitue une part importance de la variabilit individuelle Ainsi plus de 12 du g nome humain serait touch par des CNVs Redon 2006 Les CNVs semblent agir non seulement de fa on cis comme les SNPs i e sur la copie du g ne pr sente sur le m me all le que le SNP mais galement de fa on trans Beckmann 2007 Ainsi le CNV semblerait aussi important que le SNP 16 Les SNPs la mutation des nucl otides et l impact de leur localisation Les SNPs sont des mutations qui peuvent produire les changements de nucl otides suivants insertions d l tions ou des substitutions Les substitutions de nucl otides sont de deux types des transitions qui consistent en un changement entre deux purines ou deux pyrimidines ou des transversions qui sont des changements entre une purine et une pyrimidine _ rSNP SNP r gulateur iSNP i SNP intronique CSNP Substitution d acide amin e cSNP Aucune substitution d acide amin e g ne xon le gSNP Figure 8 Localisation des diff rents types de SNPs D pendamment de leur localisation dans le g nome et du changement engendr le SNP peut a
106. s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue Pour tudier l effet des deux SNPs 730T gt G et 141C gt T sur l activit promotrice d YWHAB nous avons r alis des essais de mutagen se dirig e Pour ce faire les constructions plasmidiques des haplotypes H1 et H8 ont t utilis es comme gabarits pour les diff rentes r actions de mutagen se Figure 18 Une r action a permis de transformer l haplotype H8 en haplotype H1 en changement le nucl otide T en G a la position 730 mutant H8 730G Le r sultat attendu est une diminution de l activit promotrice de ce mutant Une seconde r action a permis de muter haplotype H8 en changement le nucl otide Cen T ala position 141 mutant H8 141T 8 v ok 1 m a AT a 8 H1 Le Exon 1 original 2000 1000 re vie 1 pu a m 73 o D gt at H8 si Exon 1 original 2000 1000 1 13C 9 141 C 730G 531 134 T
107. sis International Journal of Oncology 2002 Vol 21 1 pp 165 170 Karlin S Burge C 1995 Dinucleotide relative abundance extremes a genomic signature Trends Genetic 1995 Vol 11 pp 283 290 Kelekar A Thompson C B 1998 BCL 2 family proteins the role of BH3 domain in apoptosis Trends Cell Biol 1998 Vol 8 pp 324 330 Kelliher M A Grimm S Ishida Y Kuo F Stanger B Z Leder P 1998 The death domain kinase RIP mediates the TNF induced NF kappaB signal Immunity 1998 Vol 8 pp 297 303 Kesarwani P Mandal R K Maheshwari R Mittal R D 2011 Influence of caspase 8 and 9 gene promoter polymorphism on prostate cancer susceptibility and early development of hormone refractory prostate cancer BJU Int 2011 Vol 107 3 pp 471 476 King K L Cidlowski J A 1998 Cell cycle regulation and apoptosis Annu Rev Physiol 1998 Vol 60 pp 601 617 85 Kitada S Pedersen I M Schimmer A D Reed J C 2002 Dysregulation of apoptosis genes in hematopoietic malignancies Oncogene 2002 Vol 21 pp 3459 3474 Knight J C Udalova I Hill A V Greenwood B M Peshu N Marsh K Kwiatkowski D 1999 A polymorphism that affects OCT 1 binding to the TNF promoter region is associated with severe malaria Nature Genetics 1999 Vol 22 pp 145 150 Knight JC Keating BJ Kwiatkowski DP 2004 Allele specific repression of lymphotoxin alpha by activated B cell factor 1 Nature Genetics 2004 Vol 36 pp 394 399 Knight J C 2005
108. sis is a cellular mechanism that eliminates damaged cells The operation of this biological pathway is crucial to counter the spread of cells and their genetic abnormalities Deregulation of genes encoding components of the intrinsic pathway of apoptosis is frequently observed in various types of cancers including leukemia We propose that functional polymorphism located in the regulatory region rSNP of genes involved in the intrinsic apoptosis pathway would have a significant impact in oncogenesis by altering the expression levels of these genes In this study we validated using a combination of in silico and in vitro approaches the functional impact of genetic variability analyzed as haplotypes rHap at the proximal promoters of 11 genes encoding components of the intrinsic apoptosis pathway To do this we subcloned the major rHaps in a vector containing the luciferase reporter gene pGL3b These constructs were used in transient transfection assays in three human cell lines HeLa Jurkat and JEG3 We observed that at least 2 rHaps significantly influence the transcriptional activity of a specific allele These rHaps are associated with genes YWHAB and YWHAQ Electrophoretic mobility shift assays EMSA have identified 2 sites for differential DNA protein binding with the rHaps of YWHAB Variability in the level of expression of the genes studied could contribute to interindividual susceptibility to developing cancer such as childhood leuk
109. sity of Washington Seattle qui calcule les haplotypes a partir des donn es de fr quences g notypiques Stephens 2001 Pour les tudes 29 fonctionnelles nous avons concentr nos efforts sur les haplotypes des promoteurs ayant une fr quence gale ou sup rieure 5 pour l tude d impact fonctionnel Etude de l impact fonctionnel des rSNPs rHaplotypes L impact fonctionnel des rSNPs sur l activit promotrice est mesur in vitro par des essais de g nes rapporteurs des essais de retard sur gel et par des exp riences de mutagen se dirig e Essai de g ne rapporteur Les r gions promotrices d int r ts ont t amplifi s partir de l ADN g nomique des individus poss dant les haplotypes fr quents tudi s tel que d crit ci haut Chaque haplotype s lectionn a t sous clon l aide de la technologie Gateway Invitrogen 2004 Cette derni re n cessite une s rie de deux r actions qui utilisent le principe de la recombinaison possible entre deux s quences homologues en pr sence d enzymes sp cifiques La recombinaison est possible entre les s quences sp cifiques attB qui ont t pr alablement ajout s aux extr mit s du fragment du 2kb lors de leur amplification et les s quences attP pr sentes dans le vecteur donneur pDONR Figure 12 Gr ce l enzyme BP Clonase II cette r action BP permet d ins rer un fragment l int rieur du vecteur pDONR Ceci cr e un vecteur pENTR cont
110. t ines est r gul par de nombreuses voies biologiques les polymorphismes r gulateurs peuvent influencer des processus biologiques hautement et contribuer au d veloppement de maladies complexes Pastinen 2004 19 L tude des SNPs contenus dans la r gion promotrice des g nes tend a gagner de l importance gr ce leurs impacts connus sur le niveau d expression des g nes Gazquez 2008 Juhanson 2008 Ober 2008 La suceptibilit interindividuelle aux maladies complexes pourrait tre modul e chez les individus qui poss dent des rSNPs dans des g nes cl s Les rSNPs les plus tudi s sont ceux des r gions promotrices rSNPs qui peuvent influencer le niveau de transcription d un g ne en alt rant le site de liaison a un facteur de transcription Knight 1999 Des tudes d montrent effectivement un impact significatif des rSNPs dans la suceptibilit au cancer en affectant des g nes impliqu s dans le m tabolisme des carcinog nes Sinnett 2006 dans la r gulation du cycle cellulaire Healy 2007 et autres prot ines impliqu es dans la progression du cancer ainsi que la r ponse aux m dicaments contre le cancer Milani 2007 20 SNPs r gulateurs dans les g nes de l apoptose Puisque notre attention porte sur la voie intrins que de l apoptose il est important de r pertorier les rSNPs connus pour les g nes de cette voie Tableau I Une r cente tude a d montr que les s quences promot
111. terodimer binding sites 0 609 Vv Nuclear receptor subfamily 2 factors 0 830 Vv Vv p53 tumor suppressor 0 920 Vv p53 tumor suppressor 0 975 Vv Les facteurs de transcriptions en gris sont ceux poss dant une liaison all lique diff rentielle Tableau VI Liste des facteurs de transcription pr dits lors des analyses in silico pour le SNP 141 C T du g ne YWHAB par le logiciel MatInspector Facteurs de transcriptions pr dits Matrix score All le All le 141C 141T Huntington s disease gene regulatory 0 857 Vv Vv region binding proteins Zinc finger proteins 0 847 Vv GC box factors SP1 GC 0 914 y y Krueppel like transcription factors 0 941 Vv Vv PAX 5 B cell specific activator 0 807 Vv protein Insulinoma associated factors 0 919 y Vv Les facteurs de transcriptions en gris sont ceux poss dant une liaison all lique diff rentielle 44 Sonde non 730 T 730 G marqu e 2 m 5 730T a 730G gt n m AP2 Extrait prot ique lt Complexe 1 lt Complexe 2 lt Complexe 3 lt Complexe 1 2 34 56 789 Figure 16 Exp rience de retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 730 T gt G d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 730 T gt G sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules JURKAT Les puits 1 5 repr sent
112. to and antagonizing IAP proteins Cell 2000 Vol 102 pp 43 53 Vignal A Milan D SanCristobal M Eggen A 2002 A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics Genet Sel Evol 2002 Vol 34 3 pp 275 305 Vogelstein B Lane D Levine A 2000 Surfing the p53 network Nature 2000 Vol 408 pp 307 310 Vopalensky V Masek T Horvath O Vicenova B Mokrejs M Pospisek M 2008 Firefly luciferase gene contains a cryptic promoter RNA 2008 Vol 14 pp 1720 1729 Wajant H 2002 The Fas signaling pathway more than a paradigm Science 2002 Vol 296 pp 1635 1636 Walter N A R McWeeney S K Peters S T Belknap J L Hitzemann R Buck K J 2008 Single nucleotide polymorphism masking Alcohol Research and Health 2008 Vol 31 3 pp 270 271 Wang B Liu K Lin F T Lin W C 2004 A role for 14 3 3 theta in E2F1 stabilization and DNA dammage induced apoptosis Journal of Biology Chemistry 2004 Vol 279 pp 54140 54152 Wang ZY Chen Z 2008 Acrute promyelocytic leukemia form highly fatal to highly curable Blood 2008 Vol 111 5 pp 2505 2515 Waterman M J Stavrid E Si Waterman J L Halazonetis T D 1998 ATM dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14 3 3 proteins Nature Genetics 1998 Vol 19 pp 175 178 Willis T G Jadayel D M Du M Q Peng H Perry A R Abdul Rauf M Price H Karran L Majekodunmi O Wlodarska I Pan L Crook T Hamoudi R Is
113. ts 1 5 repr sentent la sonde marqu 531 C alors que les puits 6 9 repr sentent la sonde 531 T Les sondes non marqu es utilis es pour comp titioner la liaison de prot ines l ADN sont en exc s dans un ratio de 50 1 Des comp titeurs sp cifiques correspondant aux sondes non marqu es des diff rents all les sont utilis s dans les puits 3 4 7 8 alors qu un comp titeur non sp cifique est utilis dans les puis 5 et 9 Les s quences des sondes utilis es sont d crites dans le Tableau XI en annexe Les sondes non li es migrent rapidement au bas du gel alors que les complexes prot ines sondes migrent moins rapidement Les complexes sp cifiques sont identifi s par une fl che rouge tandis que les complexes non sp cifiques sont identifi s par une fl che bleue xl 134 T 134 C Sonde non marqu e a a NN s p o G haar 134 C AP2 Extrait prot ique Complexe 1 a gt Complexe 2 p Complexe 3 nite 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figure 12 Retard sur gel montrant une liaison diff rentielle au niveau du rSNP 134 T gt C d YWHAB Des oligonucl otides double brins et marqu s correspondant aux diff rents all les du SNP 134 T gt C sont incub es avec l extrait nucl aire de cellules HeLa Les puits 1 a 5 repr sentent la sonde marqu 134 T alors que les puits 6 a 9 repr sentent la sonde 134 C Les sondes non marqu es utilis es pour
114. tumorales in vitro et in vivo Sugiyama 2003 Il a t report que l isoforme p est surexprim dans les cellules NIH 3T3 ce qui stimule la croissance cellulaire et la formation des tumeurs chez les souris nude appuyant son potentiel oncog nique Le m canisme d action propos est l augmentation de l activation de Raf 1 ce qui r sulte en un renforcement de l activation de la cascade MAPK Takihara 2000 En consid rant la litt rature existante nos r sultats sugg re que haplotype H8 associ une plus forte activit promotrice augmentant ainsi la quantit de l oncog ne YWHAB anti apoptotique favoriserait le d veloppement d un cancer par une diminion de l apoptose 71 YWHAQ 14 3 3 t 0 YWHAQ est l isoforme th t t 6 de la famille 14 3 3 YWHAQ semble r guler l apoptose directement sous l influence d un stress g notoxique Stavridi 2001 Waterman 1998 YWHAQ est abondamment exprim e dans le cerveau le c ur et le pancr as et des niveaux inf rieurs dans les reins et le placenta Malaspina 2000 Le promoteur de ce g ne contient 2 SNPs qui forment 3 haplotypes communs Tableau VIII Nous avons montr qu il existe une activit promotrice diff rentielle entre les haplotypes du promoteur d YWHAQ Figure 23 L haplotype H1 poss de une activit promotrice plus forte que les deux autres haplotypes H2 et H4 En comparant les s quences des diff rents haplotypes seul le rSNP 95
115. ur chacun des promoteurs tudi s 3 Mesurer l impact fonctionnel des rSNPs et des haplotypes correspondants l aide d une combinaison d approche in vitro et de mutagen se dirig e 27 MATERIELS ET METHODES Lign es cellulaires Les lign es cellulaires suivantes ont t utilis es dans ce projet une lign e de cellules humaines en suspension JURKAT lign e de cellules T leuc miques deux lign es de cellules humaines adh rentes soit les JEG3 cellules de choriocarcinome placentaire et les HeLa cellules canc reuse du col de l ut rus Bron Sous clonage SNPs _ par r action w oes gt Gateway R gion du Amplification aa aA promoteur par PCR du Luc 2kb promoteur de 2k pare a bre Transformation n us vis de la structure dans des bact ries et culture E Isolation de l ADN des clones par Mini Prep Mesure de l mission Essai de de la lucif rase Lucif rase Transfection Isolation de l ADN Permet de d terminer l effet 4 r plicats cellulaire t des clones choisis S qUen age et d un haplotype sur l activit Analyses r gulatrice du promoteur 2kb avec lucif rase ee ee O tudi YWHAB vecteur avec Renilla Peg oe bre rer rel PCT RFC Y Figure 11 Sch ma r sumant l approche exp rimentale utilis e 28 Identification de polymorphismes r gulateurs rSNPs Les promoteurs proximaux environ 2kb en amont de l exon 1 des 1
116. ur Il se peut que la sonde utilis e ne contient pas les sites de liaisons de ces facteurs de transcriptions Cette perte de ces sites de liaison influencera ainsi le recrutement de la prot ine ou du complexe prot ique qui se lie normalement a notre r gion cibl e par notre sonde De plus la force de liaison entre les prot ines et l ADN 75 varient selon le type de prot ines ainsi que les conditions exp rimentales Ainsi il est possible que les liaisons prot iques faibles avec notre sonde ont t perdues lors de la migration physique sur le gel d acrylamide I est important aussi de pr ciser que les conditions utilis es pour tous les essais de retard sur gel tait fixes ce qui permet de suposer que nous avons manqu certaines faibles liaisons prot iques Par exemple l utilisation de plusieurs ratios de comp titeurs auraient pu permettre d optimiser les liaisons prot ines l ADN et ainsi observ un patron de bandes plus repr sentatif du contexte cellulaire 76 CONCLUSION Ce projet a permis d identifier des polymorphismes et des haplotypes pr sents dans les promoteurs des g nes de la voie intrins que de l apoptose Certains des rSNPs notamment ceux dans YWHAB et YWHAQ pourraient avoir un impact sur le niveau d expression des g nes Cette variabilit g n tique semble pouvoir contribuer la suscepbilit interindividuelle dans le processus de tumorigen se Ainsi ces marqueurs g n tiques pourrait a
117. ur position g nomique et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte Tableau VIII Haplotypes fr quents de la r gion promotrice d YWHAQ et leur fr quence all lique observ e dans notre cohorte ix LISTE DES FIGURES Figure 1 Illustration des diff rentes caspases regroup es selon leur fonction Figure 2 Sch ma repr sentant la voie intrins que gauche et la voie extrins que droite de l apoptose Figure 3 Sch ma des diff rentes composantes menant l activation de la voie extrins que de l apoptose Ashkenazi 2002 Figure 4 Sch ma des diff rentes composantes menant l activation de la voie intrins que de l apoptose Ashkenazi 2002 Figure 5 Voie de l apoptose induite par la lib ration des perforines et granzyme B d une cellule lymphocyte T cytotoxique SIGMA ALDRICH Figure 6 Suivi des v nements critiques menant au d veloppement des cancers Figure 7 La prot ine p53 est un supresseur de tumeur qui agit divers niveaux afin de bloquer la progression de la carcinogen se Evan 2001 Figure 8 Localisation des diff rents types de SNPs Figure 9 Types de polymorphismes haplotypes et d s quilibre de liaison Altshuler 2008 Figure 10 Variation des taux de transcrits et des prot ines correspondantes caus e par un rSNP Figure 11 Sch ma r sumant l approche exp rimentale utilis e Figure 12 R actions de recombinaison BP et LR effectu e par
118. ux de r gulation du cycle cellulaire sont perturb s soit par une surprolif ration de cellules et ou une diminution de leur lmination King 1998 Cette d r gulation peut tre caus e par une surexpression des prot ines anti apoptotiques ou par une faible expression des prot ines pro apoptotiques ce qui favorise la survie des cellules non d sir es Evan 2001 Mutation inactivates tumor suppressor gene CELLS PROLIFERATE Mutation inactivates DNA repair gene Mutation of proto oncogene creates an oncogene Mutation inactivates several more tumor suppressor genes CANCER Figure 6 Suivi des v nements critiques menant au d veloppement des cancers 11 Cette d r gulation permet une accumulation cellulaire en ralentissant le rythme du renouvellement des cellules et en cr ant des clones n oplasiques dot s d un avantage de survie s lectif par rapport leurs quivalents cellulaires normaux Reed 1999 Ainsi les d faults au niveau du m canisme cellulaire de l apoptose normal contribuent par de multiples fa ons la progression tumorale Willis 1999 La d r gulation de la mort cellulaire programm e se produit fr quement dans les cellules h matologiques et dans d autres tumeurs malignes Le m canisme de l apoptose est un concept accept universellement en tant que m canisme supresseur de tumeurs L apparition de mutations qui alt rent le niveau d expression de prot ines clefs dans le m canis
119. voir un impact diff rent Figure 8 Les SNPs peuvent tre localis s dans la r gion codante d un g ne cSNP ce moment le SNP peut produire une mutation dite silencieuse qui n affecte pas le code d acides amin s de la prot ine Par contre il peut galement produire une mutation faux sens ou non sens qui a un effet n gatif sur la fonction de la prot ine produite La mutation faux 17 sens est obtenue lorsque le nucl otide mut provoque un chagement de codon codant pour un acide amin diff rent Cette mutation modifie la prot ine pouvant ainsi la rendre non fonctionnelle La mutation non sens survient lorsque le nucl otide substitu transforme le codon normal en un codon d arr t ou lorsqu une insertion ou d l tion d un nucl otide est produite alors le cadre de lecture de 3 nucl otides est d cal et ceci r sulte pour la plupart des fois en un arr t pr matur de la synth se de la prot ine Campbell 1995 La plupart des SNPs se retrouvent dans les s quences non codantes soit les r gions interg niques gSNPs introniques ou encore dans des r gions r gulatrices Les SNPs situ s dans l intron iSNP de la prot ine peuvent galement avoir un impact fonctionnel sur la prot ine Les iSNPs peuvent modifier l pissage du transcrit primaire de la prot ine et ainsi produire une prot ine tronqu e non fonctionnelle Les gSNPs situ s dans la s quence g nomique non codante d un g ne n ont aucun

liste des tableaux

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents