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Epi proColon 2.0 CE pi proColon 2.0 CE

1. iii 5 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 seeesssssessssseessssssrressssssssrreessssssssrreeesssesereeesssssesreeeeessssse 6 Epi proColon Control Kit M35 02 003 suisses dnes asagi e io eiaa er ieii iea S SERD aeea dea 6 Mat riels N cessaires mais non Fournis sesesseeesseessseoeessssseeeesssssssooeeeessssseeecsssssseoeessssssseeeeeessssseeeeee 6 Equipement de Laboratoire G n ral seen 6 Consommables G n raux de Laboratoire et R actifs eseeeseeesseeseeeseesressresrtesrtesressreessressressessreeerereres 6 Equipement Sp cial Requis et Consommables ss 7 Exigences d Installations sitssssss ete tra a a eE EEE E E EA esse nn n e lan ec 0 nan a tnt ee d40 084 8 Mises en Garde et Pr cautions ss 8 Pr cautions de Laboratoire aninion ienie a een ea aa ledit bia enei 8 Etat Microbiologique et Infectieux esse 9 Pr l vement d chantillon et leur Manipulation 9 Pr l vement sanguin et Conservation du Sang ss 9 Pr paration de l Echantillon de Plasma et Conservation du Plasma 9 Proc dure du Testirani iresi inter rendent an ste ne EAE ENESE EEEE 9 Pr paration des R actifs du Test 10 Extraction de l ADN et Conversion au Bisulfite partir de Plasma de Patient 10 Pr paration de la PCR nirre ei eaaa ie in nina the e d Sea e anie iaa 15 Analyse avec l Applied Biosystems 7500 Fast et 7500 Fast Dx PCR Instruments 16 Logiciel Regus rnein itens
2. e Ajouter 60 0 ml d ethanol absolu pour biologie mol culaire gt 99 5 l Epi proColon Wash A Concentrate en utilisant une prouvette gradu e st rile ou une pipette s rologique e Fermer le couvercle m langer soigneusement en retournant la bouteille 5 fois en vitant la formation de mousse Etiqueter le flacon avec la date de dilution et cocher la case Ethanol added e Conserver l Epi proColon Wash A Buffer reconstitu une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 6 semaines au maximum 9 1 2 Pr paration de l Epi proColon Wash B Buffer e Ajouter 40 0 ml d Ethanol Absolu pour biologie mol culaire gt 99 5 l Epi proColon Wash B Concentrate en utilisant une prouvette gradu e st rile ou une pipette s rologique e Fermer le couvercle m langer soigneusement en retournant la bouteille 5 fois en vitant la formation de mousse Etiqueter le flacon avec la date de dilution et cocher la case Ethanol added e Conserver l Epi proColon Wash B Buffer reconstitu une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 6 semaines au maximum 9 2 Extraction de l ADN et Conversion au Bisulfite partir de Plasma de Patient L Epi proColon 2 0 CE contient assez de r actifs pour analyser jusqu 32 chantillons incluant les contr les Un Epi proColon Positive Control et un Epi proColon Negative Control doivent tre inclus dans chaque s rie ind pendante Comme il y a quatre tubes us
3. 3 tapes Cr er un Stage 2 ayant 3 tapes et un Stage 1 et Stage 3 ayant 1 tape Entrer repetitions target temperature et hold time conform ment au Tableau 7 Changer le Ramp Rate conform ment au Tableau 7 D finir Data Collection pour Stage 2 Step 2 55 5 0 35 Confirmer les param tres du protocole du cycle thermique conform ment au Tableau 7 voir Figure 2 Sauvegarder le document du cycle de la plaque sous un nom de fichier appropri Ouvrir le tiroir Placer la plaque PCR dans le cadre position A1 va dans le coin sup rieur gauche veiller ce que la plaque s ins re pr cis ment dans le cadre Fermer le tiroir Cliquer sur Start pour commencer le cycle Tableau 7 Programme du Cycle Thermique pour l Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Program Denaturation Cycling Holding Parameter Stage Stage 1 Stage 2 Stage 3 Repetitions 1 45 1 Step 1 1 2 3 1 Target C 94 62 55 5 93 40 Hold mm ss 20 00 00 05 00 35 00 30 00 05 Auto Increment 0 0 0 Ramp Rate 40 80 80 40 80 Data Collection Stage 2 Step 2 55 5 0 35 Page 17 of 31 Notice d utilisation 27500 Fast System SDS Software Plate Standard Curve RE loj xj a Fie View Tools 21CFRI1 Instrument Analysis Window Help m 1al x Oense ER J Setup Y instrument _Y Resuts Y Auat Tral_Y E Signatures 7 Plate M well Inspector
4. Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Conserver l Epi proColon PCR Mix et l Epi proColon Polymerase 15 C une temp rature comprise entre 25 et 15 C 25 e i Chaque tube d Epi proColon PCR Mix peut tre congel et d congel une seule fois Apr s la premi re utilisation conserver tous les r actifs une temp rature comprise entre 25 et 15 C pendant 6 semaines au maximum Epi proColon Control Kit M5 02 003 15 C Conserver l Epi proColon Control Kit une temp rature comprise 25 C entre 25 et 15 C Mat riels N cessaires mais non Fournis Equipement de Laboratoire G n ral Le mat riel de laboratoire g n ral suivant est n cessaire pour effectuer le test Epi proColon 2 0 CE Tous les quipements de laboratoire doivent tre install s talonn s utilis s et entretenus conform ment aux recommandations du fabricant 6 2 e Portoir pour tubes de 15 ml et de 2 ml par ex VWR International r f rence 211 0200 ou quivalent Agitateur disque rotatif par ex VWR International r f rence 445 2102 Carl Roth GmbH Co KG r f rence Y549 1 ou quivalent Vortex par ex VWR International r f rence 444 1372 ou quivalent Bain thermostatique sec avec agitation par ex Thermomixer comfort Eppendorf r f rence 5355 000 011 avec bloc chauffant pour tube r action de 2 ml Eppendorf r f rence 5362 000 019 ou quivalent Pipettes avec volumes variables de
5. Lysis Binding Buffer et v rifier visuellement l absence de pr cipit s Si des pr cipit s sont pr sents chauffer l Epi proColon Lysis Binding Buffer dans un bain marie 37 C pendant 60 min et agiter doucement jusqu ce que le pr cipit soit compl tement dissous Laisser revenir l Epi proColon Lysis Binding Buffer temp rature ambiante avant utilisation Page 10 of 31 Ajouter dans un tube centrifuger tiquet de 15 ml les l ments suivants o 3 5 ml de plasma ou d Epi proColon Positive Control ou d Epi proColon Negative Control o 3 5 ml d Epi proColon Lysis Binding Buffer Fermer le tube et m langer au vortex Incuber le tube sur la paillasse une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 10 1 min 9 2 3 Liaison de l ADN Remarque Une suspension homog ne de billes dans la suspension Epi proColon Magnetic Beads est indispensable pour une performance optimale Toute variation de la quantit de billes sp cifi e peut donner lieu des r sultats erron s Pour assurer une bonne concentration des particules magn tiques la bouteille doit tre m lang e vigoureusement juste avant le pipetage jusqu ce qu il n y ait plus de s diments visibles au fond de la bouteille Assurez vous galement que la suspension est homog ne entre les tapes de pipetage Ajouter au tube centrifuger de 15 ml dans l ordre suivant o 90 ul d Epi proColon Magnetic Beads fraichement resuspendu o 2 5 ml d ethan
6. Remarque Chaque chantillon d ADN converti au bisulfite ADNbis chantillon de patient ou Epi proColon Positive Control ou Epi proColon Negative Control doit tre test en trois exemplaires Remarque Centrifuger le tube contenant l Epi proColon polym rase avant son utilisation pendant 10 20 sec 1000 150 rcf l aide d une centrifugeuse de paillasse pour liminer les gouttes du couvercle 9 3 1 Pr paration du PCR Master Mix e _D congeler 1 ou 2 tubes d Epi proColon PCR Mix selon le nombre souhait de d terminations des chantillons de patient et de contr le voir Tableau 5 e M langer au vortex le s tube d Epi proColon PCR Mix pendant 10 15 sec Centrifuger bri vement le tube s e Mettre le volume correspondant d Epi proColon PCR Mix et d Epi proColon Polymerase comme indiqu dans le Tableau 5 dans un microtube de 2 0 ml e M langer le PCR Master Mix l aide d un vortex e Centrifuger bri vement le PCR Master Mix pour liminer les gouttes du couvercle Remarque Ne pas conserver le PCR Master Mix utiliser le imm diatement Recongeler l Epi proColon PCR Mix et l Epi proColon Polymerase non utilis s directement apr s usage Remarque Pour une seule PCR 16 ul d Epi proColon PCR Mix et 0 8 ul d Epi proColon Polymerase sont n cessaires Tableau 5 Pr paration du PCR Master Mix Volume pour Volume pour Volume pour Volume pour Composants 8 16 24 32 D terminations D term
7. YEUX Rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer O K DANGER Page 4 of 31 Epi proColon Bisulfite Solution contient une solution aqueuse de bisulfite d ammonium Mentions de danger EUHO31 Au contact d un acide d gage un gaz toxique H314 Provoque des br lures de la peau et des l sions oculaires graves Conseils de prudence P264 Se laver les mains soigneusement ED apr s manipulation P271 Utiliser seulement en plein air ou dans A un endroit bien ventil P280 Porter des gants de protection des DANGER v tements de protection P305 351 338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX Rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer P312 Appeler un CENTRE ANTIPOISON ou un m decin en cas de malaise Epi proColon Protection Buffer contient de l Acide 6 hydroxy 2 5 7 8 t tram thylchromanne 2 carboxylique Alcool T trahydrofurfurylique Mentions de danger H319 Provoque une s v re irritation des yeux Conseils de prudence P305 P351 P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX Rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev e
8. crite dans le manuel du LightCycler 480 Instrument I e Cliquer sur Analysis de la barre du module du logiciel de base LightCycler 480 afin d ouvrir la fen tre Analysis Overview Page 21 of 31 S lectionner Abs Quant Fit Points pour tous les chantillons Activer Epi proColon Color Compensation Activer le Filter Comb 483 533 R gler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur 50 R gler le bruit de fond cliquer sur le bouton bleu Background sur 5 22 en r glant Min Offset sur 4 et Max Offset sur 21 dans la fen tre Cycle Range R gler le seuil du bruit de fond sur Noise Band Fluoresc et r gler le seuil du bruit de fond manuellement sur 1 6 dans la fen tre Noise Band Apr s s lectionner Treshold Manual dans la fen tre Analysis fixer la valeur limite sur 1 6 R gler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fen tre Analysis Cliquer sur Calculate Le Crossing Point CP de SEPT9 pour chaque chantillon est automatiquement calcul et appara t dans le Tableau des Echantillons Remarque Si le bruit de fond est sup rieur 1 6 ou si les courbes d amplification restent en dessous de 1 6 r gler le seuil de fa on ce qu il soit l g rement sup rieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative
9. recommandons une stricte s paration des activit s pr PCR par exemple l extraction de l ADN partir du plasma et sa purification pr paration de la PCR et des activit s post PCR par exemple PCR en temps r el En outre nous recommandons que les plaques PCR utilis es soient dispos es d une mani re ce qu aucun produit de PCR ne peut tre lib r Par exemple les plaques de PCR utilis es doivent tre plac es dans un sac en plastique r f rable imm diatement apr s leur retrait de l appareil de PCR le sac est ferm et limin dans un conteneur d di aux d chets Ne jamais entreposer une plaque de PCR utilis e en dehors de l appareil de PCR Ne jamais ouvrir une plaque de PCR utilis e Page 8 of 31 7 2 Etat Microbiologique et Infectieux Le produit ne contient pas de substances infectieuses ou des agents qui provoquent des maladies chez les humains ou les animaux Les chantillons de sang et de plasma humains analys s avec ce test doivent tre manipul s comme potentiellement infectieux en utilisant des proc dures de laboratoire sures telles que celles d crites dans la Bios curit dans les Laboratoires Microbiologiques et Biom dicaux la directive 2000 54 CE concernant la protection des travailleurs contre les risques li s l exposition des agents biologiques au travail ou dans d autres proc dures de bios curit appropri es 8 Pr l vement d chantillon et leur Manipulation 8 1 Pr l vement
10. restent en dessous de 2 0 r gler le seuil de fa on ce qu il soit l g rement sup rieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent tre consid r es comme n gatives Exporter les valeurs CP en cliquant sur le Tableau des Echantillons en utilisant la touche droite de la souris S lectionner Export Sauvegarder le fichier des donn es sous un nom unique et pertinent Page 25 of 31 12 4 Validit du R sultat du Test Epi proColon pour la S rie ex cut e LightCycler 480 Instrument Il Toute s rie chantillons de patients trait s avec l Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control est consid r e comme valide si les crit res nonc s dans le Tableau 14 sont remplies pour TOUTES LES TROIS 3 r p titions de PCR par contr le Si le r sultat pour l Epi proColon Positive Control ou l Epi proColon Negative Control ou les deux n est pas valide les donn es pour les chantillons des patients trait s en m me temps que les contr les ne peuvent pas tre interpr t es Les essais doivent tre r p t s pour tous les chantillons des patients inclus dans cette s rie Tableau 14 Limites de validit des s ries des Contr les Epi proColon analys s LightCycler 480 Instrument II R sultat du Control D termination R sultat Septin9 R sultat ACTB PCR1 CP lt 40 5 CP lt 30 3 Positive Contr
11. 0 24345 222 Fax 49 30 24345 555 Informations pour le Client En achetant ce produit le client conform ment certains brevets de Roche obtient la permission d utiliser celui ci seulement pour des services de diagnostic in vitro sur l homme Aucun brevet g n ral ou autre licence de tout autre nature que ce droit sp cifique d utilisation de l achat est accord e par les pr sentes Le LightCycler 480 System est une marque d pos e de l entreprise F Hoffmann La Roche Ltd The Applied Biosystems MicroAmp est une marque d pos e de l entreprise Life Technologies Corporation DynaMag est une marque de l entreprise Life Technologies Corporation BD Vacutainer est une marque d pos e de l entreprise Becton Dickinson Inc Corporation S Monovette est une marque d pos e de l entreprise Sarstedt AG amp Co Thermomixer Research Reference Multipette ep Dualfilter T I P S Combitips plus est une marque d pos e de l entreprise Eppendorf AG Safe Lock est une marque de l entreprise Eppendorf AG HandyStep est une marque d pos e de l entreprise Brand GmbH Co KG Page 31 of 31
12. 120 mg ml de globules rouges 0 4 v v de K EDTA 20 mg ml de Cholest rol 5 mg ml d acide urique 0 235 mg ml et de glucose 10 mg ml Page 29 of 31 17 Signification des Symboles utilis s pH Veuillez suivre les instructions R f rence du Kit Destin aux examens diagnostiques in vitro g o Num ro de lot E i Date de p remption Fabricant Conserver la temp rature indiqu e Nombre de tests 4 i a 18 R f rences 1 deVos T et al Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer Clinical Chemistry 55 7 1337 46 2009 2 Lofton Day C et al DNA methylation biomarkers for blood based colorectal cancer screening Clinical Chemistry 54 2 414 423 2008 3 Model F et al Identification and validation of colorectal neoplasia specific methylation markers for accurate classification of disease Mol Cancer Res 5 153 163 2007 4 Eads C A et al MethyLight a high throughput assay to measure DNA methylation Nucleic Acids Research Volume 28 Issue 8 e32 2000 Page 30 of 31 19 Pour nous contacter Epi proColon 2 0 CE est fabriqu par Epigenomics AG Kleine Pr sidentenstrasse 1 10178 Berlin Germany Pour obtenir de plus amples informations et pour toute assistance veuillez adresser un courriel l adresse suivante ou composez le num ro de t l phone suivant support products epigenomics com Phone 49 3
13. 1D 6 4 Exigences d installation L installation l talonnage la v rification des performances et le maintien de l Applied Biosystems 7500 Fast Dx PCR Instrument de l Applied Biosystems 7500 Fast PCR Instrument ou du Roche LightCycler 480 Instrument I ou Il doivent tre effectu s conform ment aux instructions du fabricant Remarque L talonnage mensuel du bruit de fond tel que d crit dans la proc dure de maintenance du constructeur est obligatoire pour l Applied Biosystems 7500 Fast Dx PCR Instrument et l Applied Biosystems 7500 Fast PCR Instrument 7 Mises en Garde et Pr cautions 7 1 Pr cautions de Laboratoire Le respect des bonnes pratiques de laboratoire est essentiel pour minimiser le risque de contamination crois e entre les chantillons pendant et apr s l extraction la conversion au bisulfite et la proc dure de purification de l ADN Evitez l introduction des nucl ases dans les chantillons au cours de la proc dure d extraction Afin d viter toute contamination entre les chantillons des patients nous vous conseillons d utiliser des pipettes usage unique et des pointes de pipettes usage unique Cette proc dure est d di e exclusivement une utilisation en laboratoire professionnel et n cessite une certaine familiarit avec les m thodes d extraction d ADN et de PCR en temps r el Pour viter la contamination par des produits d amplifications g n r s pendant une PCR pr c dente nous
14. 2 0 CE est compos de l Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 l Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 et l Epi proColon Control Kit M5 02 003 2 R sum et Explication Epi proColon 2 0 CE est un test de r action en cha ne par polym rase PCR in vitro pour la d tection qualitative de la m thylation du g ne Septin9 dans de l ADN isol partir de 3 5 ml de plasma de patient Des r sidus de cytosine de la r gion v2 du g ne Septin9 deviennent m thyl s dans un tissu colorectal canc reux CCR contrairement au tissu intestinal normal Cette m thylation anormale peut tre mise en vidence par une amplification sp cifique de l ADN pr sent dans le flux sanguin La d tection de l ADN d un carcinome colorectal CCR dans le plasma utilisant comme biomarqueur la m thylation de Septin9 a t d montr e dans de multiples tudes de cas t moins portant sur des patients souffrant de CCR et sur des groupes de contr le ayant une coloscopie n gative L Epi proColon 2 0 CE effectu partir de sang permet aux patients qui actuellement refusent la coloscopie de d pistage une alternative raisonnable aux options de d pistage non invasif du CCR 3 Principes de la Proc dure L Epi proColon 2 0 CE comporte deux tapes Dans la premi re tape l ADN est extrait partir de plasma suivi d une conversion au bisulfite de l ADN purifi en utilisant l Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Dans la seconde tape l ADN co
15. ADN par ex VWR Thermalseal film tanche pour PCR r f rence 391 1254 ou Eppendorf feuille de stockage auto adh sive r f rence 0030 127889 ou quivalent Applicateur de film pour former un joint tanche entre une microplaque et un film adh sif par ex MicroAmp Adhesive Film Applicator Applied Biosystems r f rence 4333183 Sachets plastiques refermables 10 x 15 cm par ex Carl Roth r f rence P279 2 ou quivalent pour liminer les plaques PCR utilis es Bain marie pour incubation 37 C Cryotube 5 ml qui tiennent droit par ex VWR r f rence 479 0285 ou quivalent Tubes de pr l vement de sang o Tubes de Pr l vement de Sang BD Vacutainer K EDTA 10 ml Becton Dickinson r f rence 367525 ou o S Monovette 9 ml K3E Sarstedt r f rence 02 1066 001 ou o S Monovette 8 5 ml CPDA Sarstedt r f rence 01 1610 001 Equipement Sp cial Requis et Consommables L quipement sp cial et les consommables suivants sont n cessaires pour effectuer le test Epi proColon 2 0 CE et ne peuvent pas tre remplac s par un autre quipement Si le test Epi proColon 2 0 CE est ex cut sur l Applied Biosystems 7500 Fast ou 7500 Fast Dx instruments PCR Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR Instrument avec le logiciel de D tection de S quence SDS v1 4 avec le Module 21 CFR Part 11 Life Technologies Co r f rence 4406984 ou 4406985 ou Applied Biosystems 7500 Fast Real Ti
16. CR e La d tection du cancer colorectal d pend de la quantit de l ADN tumoral circulant dans l chantillon et peut tre affect e par les m thodes de pr l vement de l chantillon et de conservation de l chantillon des facteurs li s au patient savoir l ge d autres maladies et le stade tumoral e Les r sultats ne sont pas des preuves confirmatives de la pr sence ou l absence de cancer colorectal Tout r sultat positif du test Epi proColon 2 0 CE doit tre confirm par coloscopie ou une sigmo doscopie e Les r sultats de tests positifs ont t observ s chez des patients cliniquement diagnostiqu s avec des maladies suivantes gastrite chronique sophagite polyarthrite non rhumato de cancer du poumon cancer du sein et cancer de la prostate e Le r sultat du test Epi proColon 2 0 CE doit tre valu en conjonction avec d autres param tres cliniques 16 Caract ristiques de Performance 16 1 Sensibilit Analytique La sensibilit analytique a t valu e par 3 op rateurs effectuant chacun 4 s ries ind pendantes avec un jeu de 2 x 7 chantillons la limite technique de d tection LDD contenant de l ADN HeLa Septin9 positif des concentrations de 0 6 12 18 25 35 et 50 pg ml r sultant dans 168 d terminations de Septin9 Toutes les d terminations sur l Applied Biosystems 7500 Fast Dx avec SDS v1 4 taient valides 133 des 144 chantillons LDD avec de l ADN HeLa ajout taient pos
17. EPIS ce Notice d utilisation Epi proColon 2 0 CE Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Epi proColon Control Kit M5 02 003 Avant d utiliser ce kit veuillez lire attentivement la notice et suivre pr cis ment les instructions afin de garantir la fiabilit et la pertinence des r sultats li IFU 0009FR rev 2 tous droits r serv s Janvier 2012 Epigenomics AG M5 02 001 MS 02 002 M5 02 003 sel 10178 Bain Alemagne epigenomics Contenu 1 2 3 4 4 1 4 2 5 5 1 5 2 5 3 6 6 1 6 2 6 3 6 4 7 7 1 7 2 8 8 1 8 2 9 9 1 9 2 9 3 10 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 11 11 1 11 2 11 3 11 4 11 5 12 12 1 12 2 12 3 12 4 12 5 13 14 14 1 14 2 15 16 16 1 16 2 16 3 16 4 16 5 17 18 19 Nom et Usage Pr yUssssniiiienn i aa ie itenretenntinirenmntmarntnntirariennionNnerateneltinrares R sum et Explication Principes de la Proc dure niieoee r eresseres ros eees insir senodi aoei see robie testine Korane R Sesak ies rotse essiri tss 3 Mat riels ROUFRIS soinen enaere aee eea eE rene Mesrine se dns ee eE ad lente rene EESE Eaei 4 COMPOSANTS Srei sr etenoa re A LEE nn Re tn te dns EEOAE ct eE 4 Pr cautions sais enene do de Ra re RE dde Me M nt nn ae an ES te a Can a A 4 Conservation et Stabilit nessies ennemi teen R Er S 5 Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001
18. Positif Ct lt 45 Ct lt 32 1 Pas de Ct fourni Septin9 Negatif Undetermined Ct lt 32 1 Invalide Tout r sultat Ct gt 32 1 Cycle threshold Seuil de Cycle Page 20 of 31 11 Analyse avec le Roche LightCycler 480 Instrument I 11 1 Pr paration de la Plaque LightCycler 480 Instrument I e Pr parer la plaque PCR La disposition de la plaque comme indiqu dans le Tableau 6 est recommand e e Mettre 15 ul de PCR Master Mix dans les puits souhait s de la plaque de r action LightCycler 480 Multiwell 96 puits e Centrifuger bri vement la plaque de conservation de l ADNbis cr e dans le paragraphe 9 2 13 pendant 1 min 1000 100 rcf avec une centrifugeuse pour plaque e Ajouter 15 ul de solution d ADNbis dans les puits respectifs de la plaque PCR e Sceller la plaque avec une feuille adh sive LightCycler 480 e Centrifuger bri vement la plaque PCR avec une centrifugeuse pour plaque pendant 1 min 1000 100 rcf Remarque La plaque PCR ainsi pr par e peut tre conserv e une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 4 heures au maximum 11 2 Chargement de la Plaque LightCycler 480 Instrument I Remarque I est recommand de sauvegarder un fichier mod le ixo avec les param tres d finis de cycle et d analyse e D marrer le logiciel version 1 5 x e Cr er une nouvelle exp rience cliquer sur New Experiment e Charger le mod le de fichier d exp rience sp
19. Solution non ouverts Ne pas conserver mais jeter toute solution restante e Ajouter les r actifs suivants dans les microtubes de 2 0 ml contenant l luat 100 ul de solution d ADN o 150 ul d Epi proColon Bisulfite Solution o 25 ul d Epi proColon Protection Buffer e Fermer le tube et m langer la r action bisulfite au vortex e _ Centrifuger bri vement le tube e Placer le tube dans le bain thermostatique sec avec agitation et incuber pendant 45 5 min 80 2 C sans agitation e Sortir le tube du bain thermostatique sec avec agitation imm diatement apr s 45 5 min e R gler la temp rature du bain thermostatique sec avec agitation sur 23 2 C ou r gler un second bain thermostatique agitation sur 23 2 C pour une utilisation ult rieure 9 2 8 Etape de Liaison Remarque Une suspension homog ne de billes dans la suspension Epi proColon Magnetic Beads est indispensable pour une performance optimale Toute variation de la quantit de billes sp cifi e peut donner lieu des r sultats erron s Pour assurer une bonne concentration des particules magn tiques la bouteille doit tre bien m lang e juste avant le pipetage jusqu ce qu il n y ait plus de s diments visibles au fond de la bouteille Assurez vous galement que la suspension est homog ne entre les tapes de pipetage e Centrifuger bri vement le microtube de 2 0 ml contenant la r action de bisulfite e Ajouter les r actifs suivants dans le micro
20. TS x Detector mSEPT9 5 0006 005 tector ms z Line Color Detector Color x Line Color Detector Color 2 4 000e 005 p Analysis Settings f Analysis Settings t Ma 3 000e 005 pon G Manual Ct E amp Manual Ct 5 0e 004 Threshold 5 0e 004 Threshold 5 0e E AT vesi C Auto Baseline C Auto Baseine Manual Baseline 1 000e 005 Manual Baseline Start cycle 10 Start cycle 10 0 000e 000 7 t End cycle 22 End cycle 22 sas 1 000e 005 m aiaia 1 3 5 7 9 111315 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 a 1 3 5 7 9 111315 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 FE P ml Cycle Number Cycle Number Figure 3 Captures d cran des courbes d amplification de Septin9 en utilisant l Applied Biosystems 7500 Fast A Exemples de courbes positives valides B Exemples de courbes n gatives en raison de points de donn es incoh rentes 1 ou forme lin aire de la courbe 2 Page 19 of 31 10 5 Validit de la S rie en utilisant les Contr les Epi proColon Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Toute s rie chantillons de patients trait s avec l Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control est consid r e comme valide si les crit res nonc s dans le Tableau 8 sont remplies pour TOUTES LES TROIS 3 r p titions de PCR par contr le Si le r sultat pour l Epi proColon Positive Control ou l Epi proColon Negative Control ou les deux n est pas valide les do
21. Wells A1 H12 Sample Name Use Detector Reporter auencher Task Quant Coior A 2 EN none Unknown Figure 1 Capture d cran du logiciel SDS v1 4 apr s avoir confirm les param tres dans la fen tre Well Inspector 827500 Fast System SDS Software Plate1 Standard Curve ol x Fie view Tools 21CFR11 Instrument Analysis Window Help l x OHERA 7 Setup Y Instrument Resuts y Audit Trail Y E Signatures r Instrument Control m Temperature Stat Estimated Time Remaining hh mm Sample Heat Sink Cover Block Stop r Cycle Disconnect Status Stage Rep Time mm ss Step Ertendl State m Thermal Cycler Protocol Thermal Profile Auto Increment Ramp Rate Stage 1 Stage 2 Stage 3 Reps 41 Reps Reps 1 Add Cycle _AddHold _AddHold addster Add Dissociation Stage Deiete Help Settings Sample Volume pL 50 Run Mode Standard 7500 Data Colection Stage 2Sep2555 0 2 Ready Disconnected lUser anne Nm z Figure 2 Capture d cran du logiciel SDS v1 4 apr s avoir r gl le programme du cycle de PCR et le mode de d tection Page 18 of 31 10 4 Param tres d Analyse Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Remar que Analyser les s ries de PCR avec la version du logiciel SDS v1 4 seulement Apr s la fin du programme du cycle PCR cliquer sur ok S lectio
22. a plaque comme indiqu dans le Tableau 6 est recommand e e Mettre 15 ul de PCR Master Mix dans les puits souhait s de la plaque de r action 96 puits MicroAmp Fast Optical 96 well e Centrifuger bri vement la plaque de conservation de l ADNbis cr e dans le paragraphe 9 2 13 si n cessaire pendant 1 min 1000 100 rcf avec une centrifugeuse pour plaque e Ajouter 15 ul de solution d ADNbis dans les puits respectifs de la plaque PCR Sceller la plaque avec un film adh sif MicroAmp Optical e _Centrifuger bri vement la plaque avec une centrifugeuse pour plaque pendant 1 min 1000 100 rcf Remarque La plaque PCR ainsi pr par e peut tre conserv e au r frig rateur une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 4 heures au maximum 10 3 Chargement de la Plaque Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Remarque Le PCR Master Mix ne contient pas de ROX ou toute autre colorant de r f rence En cons quence le param tre de r f rence passif doit tre r gl sur none Remarque Il est recommand de sauvegarder un fichier mod le sdt avec les param tres de cycle et d analyse d finis e D marrer la version SDS v1 4 du logiciel e Charger le mod le de fichier d exp rience sp cifi ou cr er un nouveau document de plaque e Cliquer sur Create New Document e D finir le document de la plaque suivant les instructions ci dessous o Assay Standard Curve Absolute Quantification o Co
23. activer la combinaison de filtre 465 510 nm et 533 580 nm et d finir le Reaction Volume sur 30 12 3 Param tres d Analyse LightCycler 480 Instrument lI Remarque Effectuer l analyse des donn es uniquement sur les puits utilis s en cr ant un sous chantillon respectif de la fa on d crite dans le manuel du LightCycler 480 Instrument II e Cliquer sur Analysis de la barre du module du logiciel de base LightCycler 480 afin d ouvrir la fen tre Analysis Overview e S lectionner Abs Quant Fit Points pour tous les chantillons e Activer le Filter Comb 465 510 Page 24 of 31 R gler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur 50 R gler le bruit de fond cliquer sur le bouton bleu Background sur 5 22 en r glant le Min Offset sur 4 et le Max Offset sur 21 dans la fen tre Cycle Range R gler le seuil du bruit de fond sur Noise Band Fluoresc et r gler seuil du bruit de fond manuellement sur 2 0 dans la fen tre Noise Band Apr s s lectionner Treshold Manual dans la fen tre Analysis fixer la valeur limite sur 2 0 R gler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fen tre Analysis Cliquer sur Calculate Le Crossing Point CP de SEPT9 pour chaque chantillon est automatiquement calcul et appara t dans le Tableau des Echantillons Remarque Si
24. age unique d Epi proColon Bisulfite Solution nous vous recommandons de faire jusqu 4 s ries ind pendantes par exemple 4 s ries de 8 chantillons chacun Remarque Une centrifugation br ve des microtubes d fini comme Centrifuger bri vement les tubes est n cessaire plusieurs tapes de cette proc dure pour liminer les gouttes du couvercle ou pour recueillir le liquide restant Il est recommand de centrifuger pendant 10 20 sec 1000 150 rcf l aide d une centrifugeuse de paillasse viter une centrifugation plus forte pour emp cher de compacter le culot des billes magn tiques dans des tapes sp cifiques Remarque M langer les tubes et les r cipients l aide d un vortex est n cessaire plusieurs tapes de cette notice pour assurer un m lange homog ne du liquide Il est recommand d utiliser un vortex r gl vitesse moyenne pendant 5 10 sec 9 2 1 D cong lation des Echantillons de Plasma et des Epi proColon Positive et Negative Control e D congeler un Epi proColon Positive Control et un Epi proColon Negative Control pendant environ 30 min une temp rature comprise entre 15 et 30 C e Si un chantillon de plasma congel est utilis d congeler l chantillon pendant environ 30 min une temp rature comprise entre 15 et 30 C e Commencer la lyse dans les 60 min apr s d cong lation 9 2 2 Lyse Remarque Avant son utilisation secouer bri vement l Epi proColon
25. ans la r action de PCR suivante font la distinction entre les s quences m thyl es et non m thyl L Epi proColon 2 0 CE d tecte une s quence d ADNbis contenant des sites CpG m thyl s dans la r gion v2 du g ne Septin9 et l ADNbis total d une r gion du g ne ACTB La partie du dosage en duplex analysant le g ne Septin9 se compose d amorces qui sont plac s dans les r gions sans dinucl otides CpG Un bloqueur sp cifique des s quences de la r gion non m thyl es et convertis au bisulfite est ajout afin que les s quences m thyl es soient pr f rentiellement ambplifi s Une sonde de d tection fluorescente sp cifique pour les s quences m thyl es de Septin9 est utilis e dans la r action afin d identifier exclusivement des s quences m thyl es amplifi s pendant la r action de PCR Page 3 of 31 4 Mat riels Fournis 4 1 Composants Tableau 1 Composants de l Epi proColon Plasma Quick Kit R actifs R cipients Volume Epi proColon Lysis Binding Buffer 1 bouteille 125 ml Epi proColon Wash A Concentrate 1 bouteille 60 ml Epi proColon Magnetic Beads 1 bouteille 4 ml billes magn tiques Epi proColon Wash B Concentrate 1 bouteille 7 ml Epi proColon Elution Buffer 1 tube 6 ml Epi proColon Bisulfite Solution 4 tubes 1 9 ml chacun Epi proColon Protection Buffer 1 tube 1 ml Tableau 2 Composants de l Epi proColon Sensitive PCR Kit R actifs R cipients Volume Epi proCo
26. ant sur le Tableau des Echantillons au moyen de la touche droite de la souris Choisir Export Sauvegarder le fichier des donn es sous un nom unique et pertinent Page 22 of 31 11 4 Validit de la S rie en utilisant les Contr les Epi proColon LightCycler 480 Instrument I Toute s rie chantillons de patients trait s avec l Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control est consid r e comme valide si les crit res nonc s dans le Tableau 11 sont remplies pour TOUTES LES TROIS 3 r p titions de PCR par contr le Si le r sultat pour l Epi proColon Positive Control ou l Epi proColon Negative Control ou les deux n est pas valide les donn es pour les chantillons des patients trait s en m me temps que les contr les ne peuvent pas tre interpr t es Les essais doivent tre r p t s pour tous les chantillons des patients inclus dans cette s rie Tableau 11 Limites de validit des s ries des Contr les Epi proColon analys s LightCycler 480 Instrument I R sultat du Control D termination R sultat Septin9 R sultat ACTB PCR1 CP lt 40 6 CPS 29 5 Positive Control valide PCR2 CP lt 40 6 CP lt 29 5 PCR3 CP lt 40 6 CP lt 29 5 PCR1 CP lt 36 5 Negative Controle valide PCR2 Pas de CP fourni CP lt 36 5 PCR3 CP lt 36 5 Crossing Point Seuil de Cycle 11 5 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle LightCycler 480 Instrument I Si le
27. capacit suivante 10 100 ul 100 1000 ul par ex Eppendorf Reference pipette volume variable Eppendorf r f rence 4910 000 042 et 4910 000 069 ou quivalent Pipette r p tition capable de distribuer de fa on r p titive des volumes dans une plage de volume r glable par ex Eppendorf Multipette plus Eppendorf r f rence 4981 000 019 ou HandyStep electronic Brand r f rence 705000 705001 ou quivalent Centrifugeuse de paillasse avec rotor pour tubes de 1 5 2 0 ml par ex Centrifuge 5417 R Eppendorf r f rence 5407 000 317 avec rotor F 45 30 11 Eppendorf r f rence 5490 015 002 ou quivalent Pipette multicanaux par ex Eppendorf Research plus 8 Channel 10 100 ul Eppendorf r f rence 3122 000 035 ou quivalent Centrifugeuse pour plaque PCR par ex Centrifuge 4 16 Qiagen r f rence 81320 et 81031 ou quivalent Eprouvette gradu e de 100 ml par ex Carl Roth r f rence C177 2 ou quivalent ou pipette s rologique de 50 ml par ex Fisher Scientific r f rence 10212581 ou quivalent Consommables G n raux de Laboratoire et R actifs Ethanol absolu pour biologie mol culaire gt 99 5 Merck KGaA r f rence 1 08543 0250 Tubes centrifuger en polypropyl ne base conique PP st rile par ex Sarstedt r f rence 62 554 502 ou quivalent Page 6 of 31 6 3 Microtube de 2 0 ml fond rond avec bouchon PP attach et avec un crochet de verr
28. cifi ou d finir l exp rience en fonction des param tres du programme de PCR d crits dans le Tableau 10 ci dessous e Ouvrir le tiroir e Placer la plaque PCR dans le cadre position A1 va dans le coin sup rieur gauche veiller ce que la plaque s ins re pr cis ment dans le cadre Fermer le tiroir e Cliquer sur Start Run pour commencer Table 10 Programme Standard de PCR pour le LightCycler 480 Instrument I Program Parameter Denaturation Cycling Cooling Analysis Mode None Quantification Mode None Cycles 1 50 1 Segment 1 1 2 3 1 Target C 94 62 56 93 40 Hold hh mm ss 00 20 00 00 00 05 00 00 35 00 00 30 00 00 30 Ramp Rate C s 1 0 1 3 1 3 1 3 1 3 Acquisition Mode None None Single None None LightCycler 480 Instrument l choisir le Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe comme format de d tection activer la combinaison de filtre 483 533 nm et 523 568 nm et d finir le Reaction Volume sur 30 11 3 Param tres d Analyse LightCycler 480 Instrument I Remarque Les utilisateurs du LightCycler 480 Instrument I doivent s lectionner Color Compensation sur ON et charger le fichier appropri Epi proColon Color Compensation pour les combinaisons de filtre Filter Comb 483 533 et Filter Comb 523 568 Remarque Effectuer l analyse des donn es uniquement sur les puits utilis s en cr ant un sous chantillon respectif de la fa on d
29. doivent tre consid r es comme n gatives Exporter les valeurs CP en cliquant sur le Tableau des Echantillons en utilisant la touche droite de la souris Choisir Export Sauvegarder le fichier des donn es sous un nom unique et pertinent Activer le Filter Comb 523 568 R gler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur 50 R gler le bruit de fond cliquer sur le bouton bleu Background sur 5 22 en r glant Min Offset sur 4 et Max Offset sur 21 dans la fen tre Cycle Range R gler le seuil du bruit de fond sur Noise Band Fluoresc et r gler seuil du bruit de fond manuellement sur 0 8 dans la fen tre Noise Band Apr s s lectionner Treshold Manual dans la fen tre Analysis fixer la valeur limite sur 0 8 R gler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fen tre Analysis Cliquer sur Calculate Les valeurs CP du g ne ACTB pour chaque chantillon sont automatiquement calcul es et apparaissent dans le Tableau des Echantillons Remarque Si le bruit de fond est sup rieur 0 8 ou si les courbes d amplification restent en dessous de 0 8 r gler le seuil de fa on ce qu il soit l g rement sup rieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent tre consid r es comme n gatives Exporter les valeurs CP en cliqu
30. e pr coce localis s le test Epi proColon 2 0 CE tait positif dans 43 18 de stade I 25 stade Il des 56 patients 77 Le tableau suivant r capitule ces r sultats Tableau 17 R sum des donn es de performance clinique de l Epi proColon 2 0 CE Contr les Carcinomes cohorte de Contr les Tous carcinomes Slorecta x d pi cas t moins colorectaux ne pistage localis s R sultats valides 149 99 98 56 Septin9 positif 1 3 79 43 Septin9 n gatif 148 96 19 13 Positivit 1 3 81 77 16 4 Concordance des deux Appareils de PCR en Temps R el La concordance d Epi proColon 2 0 CE sur le syst me Applied Biosystems 7500 Fast Dx et le LightCycler 480 Instrument I a t d termin e dans une mesure parall le avec 48 chantillons de plasma provenant de patients atteints d un carcinome colorectal de tous les stades histologiquement confirm s et 52 chantillons provenant de sujets sans maladie apparente du c lon qui ont t v rifi s par coloscopie Dans 93 93 100 des cas les deux syst mes de mesure ont g n r des r sultats concordants pour Septin9 16 5 Interf rence Aucune interf rence n a t observ e dans des contr les exp rimentaux et des chantillons non r actifs ou r actifs test s avec des niveaux lev s d ADN g nomique non m thyl 100 ng ml de bilirubine 0 20 mg ml d h moglobine 1 mg ml de triglyc ride 12 mg ml de prot ine Albumine du s rum humain
31. ger bri vement la plaque PCR avec une centrifugeuse pour plaque pendant 1 min 1000 100 rcf Remarque La plaque PCR ainsi pr par e peut tre conserv e au r frig rateur une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 4 heures au maximum 12 2 Chargement de la Plaque LightCycler 480 Instrument II Remarque est recommand de sauvegarder un fichier mod le ixo avec les param tres de cycle et d analyse d finis D marrer le logiciel version 1 5 x Cr er une nouvelle exp rience cliquer sur New Experiment Charger le mod le de fichier d exp rience sp cifi ou d finir l exp rience en fonction des param tres du programme de PCR d crits dans le Tableau 13 ci dessous Ouvrir le tiroir Placer la plaque PCR dans le cadre position A1 va dans le coin sup rieur gauche veiller ce que la plaque s ins re pr cis ment dans le cadre Fermer le tiroir Cliquer sur Start Run pour commencer Tableau 13 Programme PCR Standard pour le LightCycler 480 Instrument II Program Parameter Denaturation Cycling Cooling Analysis Mode None Quantification mode None Cycles 1 50 1 Segment 1 1 2 3 1 Target C 94 62 56 93 40 Hold hh mm ss 00 20 00 00 00 05 00 00 35 00 00 30 00 00 30 Ramp Rate C s 1 0 1 3 1 3 1 3 1 3 Acquisition Mode None None Single None None LightCycler 480 Instrument Il choisir le Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe comme format de d tection
32. ian ar ns db sante rt ter ee et tete entr a tete brand ele nie ln danses 16 Pr paration de la Plaque PCR Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 16 Chargement de la Plaque Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 16 Param tres d Analyse Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 19 Validit de la S rie en utilisant les Contr les Epi proColon AB 7500 Fast Fast Dx 20 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle AB 7500 Fast Fast Dx 20 Analyse avec le Roche LightCycler 480 Instrument 1 21 Pr paration de la Plaque LightCycler 480 Instrument 1 21 Chargement de la Plaque LightCycler 480 Instrument 1 21 Param tres d Analyse LightCycler 480 Instrument 1 21 Validit de la S rie en utilisant les Contr les Epi proColon LightCycler 480 Instrument 1 23 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle LightCycler 480 Instrument 1 23 Analyse avec le Roche LightCycler 480 Instrument 11 ses 24 Pr paration de la Plaque LightCycler 480 Instrument 11 24 Chargement de la Plaque LightCycler 480 Instrument 11 24 Param tres d Analyse LightCycler 480 Instrument 11 24 Validit du R sultat du Test Epi proColon pour la S rie ex cut e LC 480 Instrument Il 26 Interpr
33. inations D terminations D terminations 24 PCRs 48 PCRs 72 PCRs 96 PCRs Epi proColon PCR Mix 383 8 ul 767 7 ul 1151 5 ul 1535 4 ul Epi proColon Polymerase 19 4 ul 38 7 ul 58 1 ul 77 4 ul Tableau 6 Configuration de la Plaque PCR Recommand 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PC PC PC E7 E7 E7 NC NC NC E8 E8 E8 E1 E1 E1 E9 E9 E9 E2 E2 E2 E10 E10 E10 E3 E3 E3 E11 E11 E11 E4 E4 E4 E12 E12 E12 E5 E5 E5 E13 E13 E13 H E6 E6 E6 E14 E14 E14 Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative Control et ma Ple ea Paz Remarque Si la PCR est effectu e avec l appareil de PCR Applied Biosystems 7500 Fast PCR Instrument ou l appareil 7500 Fast Dx PCR Instrument avec le logiciel SDS v1 4 suivre les instructions des paragraphes 10 et 13 Si la PCR est effectu e avec l appareil Roche LightCycler 480 Instrument suivre les instructions des paragraphes 11 et 13 Si la PCR est effectu e avec l appareil Roche LightCycler 480 Instrument Il suivre les instructions des paragraphes 12 et 13 Page 15 of 31 10 Analyse avec l Applied Biosystems 7500 Fast et 7500 Fast Dx PCR Instruments 10 1 Logiciel Requis Ce produit a t valid en utilisant le logiciel SDS v1 4 avec le Module 21 CFR Part 11 10 2 Pr paration de la Plaque PCR Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx e Pr parer la plaque PCR La disposition de l
34. itifs et 24 des 24 chantillons sans ADN Hela ajout ont t n gatifs La LDD estim a t d termin par un mod le de r gression logistique 14 pg mI IC 95 9 pg ml 19 pg ml pour l Epi proColon 2 0 CE Une configuration similaire exp rimentale a t utilis e pour d terminer la sensibilit analytique en utilisant l appareil LightCycler 480 Instrument I La LDD estim e a t d termin e comme tant quivalente 16 2 Reproductibilit La reproductibilit de la proc dure a t v rifi e par la r p tition des essais sur neuf pools d chantillons issus de plasma EDTA humain Six de ces pools de plasma taient constitu s de plasma de patients diagnostiqu s avec un cancer colorectal Les trois autres pools utilis s comme control taient constitu s de plasma de patients sans maladie apparente Chaque pool de plasma tait trait en 6 r p titions par trois op rateurs utilisant diff rents lots de fabrication de l Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 ainsi que l Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Pour 54 des 54 d terminations de Septin9 le r sultat attendu pool cancer Septin9 positif pool non canc reux Septin9 n gatif a t syst matiquement g n r 16 3 Sensibilit et Sp cificit Clinique La performance clinique de l Epi proColon 2 0 CE a t d termin e avec 149 chantillons cliniques ne pr sentant aucun signe de maladie choisis parmi une population de d pistage
35. le bruit de fond est sup rieur 2 0 ou si les courbes d amplification restent en dessous de 2 0 r gler le seuil de fa on ce qu il soit l g rement sup rieur au bruit de fond pour assurer une lecture correcte Les courbes d amplification sans hausse exponentielle significative doivent tre consid r es comme n gatives Exporter les valeurs CP en cliquant sur le Tableau des Echantillons en utilisant la touche droite de la souris Choisir Export Sauvegarder le fichier des donn es sous un nom unique et pertinent Activer le Filter Comb 533 580 R gler le First Cycle sur 1 et le Last Cycle sur 50 R gler le bruit de fond cliquer sur le bouton bleu Background sur 5 22 en r glant le Min Offset sur 4 et le Max Offset sur 21 dans la fen tre Cycle Range R gler le seuil du bruit de fond sur Noise Band Fluoresc et r gler seuil du bruit de fond manuellement sur 2 0 dans la fen tre Noise Band Apr s s lectionner Treshold Manual dans la fen tre Analysis fixer la valeur limite sur 2 0 R gler le nombre de Fit Points sur 2 dans la fen tre Analysis Cliquer sur Calculate Les valeurs CP du g ne ACTB pour chaque chantillon sont automatiquement calcul es et apparaissent dans le Tableau des Echantillons Remarque Si le bruit de fond est sup rieur 2 0 ou si les courbes d amplification
36. lon PCR Mix 2 tubes 800 ul chacun Epi proColon Polymerase 1 tube 85 ul Tableau 3 Composants de l Epi proColon Control Kit R actifs R cipients Volume Epi proColon Negative Control 6 tubes 3 6 ml chacun Epi proColon Positive Control 6 tubes 3 6 ml chacun 4 2 Pr caution Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques toujours porter une blouse de laboratoire et des gants jetables Nettoyer les surfaces contamin es avec de l eau Pour plus d informations consulter s il vous pla t les fiches de donn es de s curit FDS respectives de chaque composant disponibles sur notre site web http www epiprocolon com en laboratories septin9 test safety data sheets html Epi proColon Lysis Binding Buffer et Epi proColon Wash A Concentrate contient du TRITON X 100 et du Thiocyanate de guanidine Mentions de danger EUHO32 Au contact d un acide d gage un gaz tr s toxique H302 Nocif en cas d ingestion H312 Nocif par contact cutan H318 Provoque des l sions oculaires graves H332 Nocif par inhalation H412 Nocif pour les organismes aquatiques entra ne des effets n fastes long terme Conseils de prudence P261 viter de respirer les a rosols P273 viter le rejet dans l environnement P301 P312 EN CAS D INGESTION Appeler un CENTRE ANTIPOISON ou un m decin en cas de malaise P302 P352 EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU Laver abondamment l eau et au savon P305 P351 P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES
37. me PCR Instrument Life Technologies Co r f rence 4351106 or 4351107 avec le logiciel de D tection de S quence SDS v1 4 avec le Module 21 CFR Part 11 Life Technologies Co r f rence 4377355 Page 7 of 31 e Plaque de r action optique 96 puits MicroAmp Fast avec code barre 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co 20 plaques r f rence 4346906 200 plaques r f rence 4366932 e Film adh sif optique pour plaque 96 et 384 puits MicroAmp Applied Biosystems Life Technologies Co 25 feuilles r f rence 4360954 ou 100 feuilles r f rence 4311971 Si le test Epi proColon 2 0 CE est ex cut sur le Roche LightCycler 480 instruments I and Il e _LightCycler 480 Instrument I avec bloc chauffant 96 puits Roche Applied Science r f rence 05015278001 et avec la version du logiciel 1 5 x ou LightCycler 480 Instrument Il avec bloc chauffant 96 puits Roche Applied Science r f rence 05015278001 et avec la version du logiciel 1 5 x e Plaque 96 puits LightCycler 480 avec feuilles adh sives Roche Applied Science r f rence 04729692001 e Feuilles adh sives LightCycler 480 Roche Applied Science r f rence 04729757001 Equipement additionnel requis compatible avec toutes les configurations d instruments de PCR en Temps R el e S parateur Magn tique aimant DynaMagTM 15 Invitrogen r f rence 123 01D e S parateur Magn tique aimant DynaMagTM 2 Invitrogen r f rence 123 2
38. nn es pour les chantillons des patients trait s en m me temps que les contr les ne peuvent pas tre interpr t es Les essais doivent tre r p t s pour tous les chantillons des patients inclus dans cette s rie Tableau 8 Limites de validit des s ries des Contr les Epi proColon analys s avec l Applied Biosystems 7500 Fast 7500 Fast Dx R sultat du Contr le D termination R sultat Septin9 R sultat ACTB PCR1 Ct 41 1 Ct 29 8 Positive Control valide PCR2 Ct 41 1 Ct 29 8 PCR3 Ct 41 1 Ct 29 8 PCRI 3 i Ct 37 2 Negative Control valide PCR2 Pas de Ct ni Ct 37 2 Undetermined PCR3 Ct 37 2 Cycle threshold Seuil de Cycle 10 6 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx L interpr tation d une PCR individuelle est effectu e selon le Tableau 9 Si le r sultat du contr le interne ACTB indique un apport suffisant d ADN pour une PCR individuelle seuil de cycle d ACTB sp cifi dans le Tableau 9 le r sultat de la PCR Septin9 d finit le r sultat pour cette PCR individuelle voir section 13 Une valeur pour ACTB au dessus des valeurs de seuil de cycle Ct indiqu dans le Tableau 9 d termine le r sultat de cette PCR individuelle comme PCR invalide Tableau 9 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx R sultat d une PCR individuelle R sultat Septin9 R sultat ACTB Septin9
39. nner l onglet Results puis s lectionner l onglet Amplification Plot R gler Analysis Setting pour le d tecteur Septin9 de la fa on suivante o Manual Ct Threshold 50000 appears as 5 0e 004 o Manual baseline Start cycle 10 o Manual baseline End cycle 22 R gler Analysis Setting pour le d tecteur ACTB de la fa on suivante o Manual Ct Threshold 25000 appears as 2 5e 004 o Manual baseline Start cycle 10 o Manual baseline End cycle 22 Cliquer sur Analyze Cliquer sur Save Les valeurs Ct de Septin9 et les valeurs Ct d ACTB sont calcul es automatiquement S lectionner les puits analyser Les courbes d amplification sont affich es dans l onglet Amplification Plot Les valeurs de Ct sont affich s dans l onglet Report Remarque Chaque courbe d amplification doit tre inspect e visuellement Les courbes d amplification qui traversent le seuil en raison de points de donn es incoh rentes des pics de bruit de fond ou d une forme la Figu 5 000e 005 4 0006 005 3 0008 005 Delta Rn 1 000e 005 0 000e 000 1 000e 005 2 000e 005 f lin aire de la courbe doivent tre consid r es comme n gatives Des exemples sont fournis dans Delta Rn vs Cycle Delta Rn vs Cycle Data Deta Rn vs Cycle x Data Deta Rn vs Cycle x k 7 Detector mSEP
40. ntainer 96 Well Clear o Template Blank Document ou s lectionner le fichier mod le respectif de l Epi proColon 2 0 CE o Run Mode Standard 7500 e Cliquer sur Next e Cliquer sur New Detector e Cr er un nouveau d tecteur en utilisant les propri t s suivantes o Name Septin9 o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye FAM o Quencher dye none o Color Red e o Cliquer sur Create Another et d finir les propri t s suivantes o Name ACTB o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye JOE o Quencher dye none o Color Green Page 16 of 31 Cliquer sur ok S lectionnez les deux d tecteurs et cliquez sur Add gt gt pour attribuer les d tecteurs au document de la plaque S lectionnez none dans le menu d roulant de Passive Reference Cliquer sur Done Aller l onglet Setup et Plate S lectionner tous les 96 puits de la plaque Aller la commande de menu View et ouvrir le Well Inspector S lectionner les d tecteurs Septin9 et ACTB V rifier que le r glage de la R f rence Passive est sur none voir Figure 1 Cliquer sur Close Allez l onglet Instrument pour programmer les param tres du cycle tel que d crit dans le Tableau 7 Modifier les param tres suivants o Sample Volume 30 yl o Run Mode Standard 7500 o Data Collection Stage 2 Step 2 Cr er un Thermal Profile avec
41. nterne sert mettre en vidence l ADN converti au bisulfite de l ACTB R actine Ce contr le interne co amplifi v rifie la qualit de l chantillon sa pr paration et d termine si la concentration d ADN dans l chantillon est suffisante Le r sultat de la PCR de SEPT9 est li une valeur Ct ou CP de la PCR du g ne ACTB voir Tableau 9 ou Tableau 12 ou Tableau 15 Des valeurs Ct ou CP pour la PCR d ACTB en dehors de la plage sp cifi e invalident le r sultat pour la PCR individuelle du fait que ces valeurs lev es sont associ es une tr s faible teneur en ADNbis ou une inhibition de la PCR Page 27 of 31 15 Limites de la Proc dure e Pour un usage diagnostic in vitro seulement e Ce produit a t valid pour une utilisation combin de l Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 l Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 et l Epi proColon Control Kit MS 02 003 seulement Les composants de ce test ne doivent pas tre remplac s par d autres m thodes d extraction d ADN ou d autres kits de PCR e Ce produit a t valid pour une utilisation avec du plasma d riv de sang recueilli avec des tubes de collecte BD Vacutainer K EDTA S Monovette 9 ml potassium EDTA et S Monovette 8 5 ml CPDA L utilisation d autres types d chantillon et d autres tubes de pr l vement sanguin n ont pas t valid s e L utilisation de ce produit est limit e un personnel exp riment et form aux tests de P
42. nverti au bisulfite ADNbis est analys par une PCR en duplex utilisant l Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 qui d tecte la fois la cible l ADN m thyl Septin9 et un contr le interne l ADN de l ACTB R actine pour valuer l ad quation de la quantit de l ADN d entr e Les contr les fournis dans l Epi proColon Control kit M5 02 003 sont requis comme contr les positifs et n gatifs pour chaque s rie L extraction de l ADN g nomique du plasma d un patient consiste lier l ADN g nomique circulant des petites particules magn tiques qui seront ensuite s par es du plasma l aide d un aimant Pour liminer les impuret s restantes sur les particules magn tiques plusieurs lavages seront effectu s Durant la phase d lution l ADN purifi sera s par des particules magn tiques par l utilisation d un tampon d lution L luat contenant l ADN est ensuite soumis une r action chimique qui modifie sp cifiquement les r sidus cytosine non m thyl s dans l ADN Le traitement au bisulfite est utilis comme m thode de choix pour analyser la m thylation de l ADN La transformation est bas e sur l addition nucl ophile d un ion bisulfite une cytosine et sur la r action de d samination r sultante lors de laquelle se forme du sulfonate d uracile tandis que la cytosine m thyl e la S m thyl cytosine n est pas d samin e et reste donc identique Les bloqueurs et les sondes utilis es d
43. ol absolu pour biologie mol culaire gt 99 5 Fermer le tube et m langer en inversant le tube 5 6 fois Mettre le tube de 15 ml sur un agitateur rotatif Faire tourner vitesse moyenne env 10 20 rpm temp rature ambiante pendant 45 5 minutes Ajuster l angle de rotation environ 35 45 degr s 9 2 4 Lavage de l ADN Remarque Avant de commencer la proc dure de lavage r gler le bain thermostatique sec avec agitation 80 2 C pour une utilisation ult rieure dans les tapes d lution et de conversion au bisulfite Placer le tube de 15 ml dans le portoir magn tique DynaMagTM 15 pendant 5 10 min Eliminer le surnageant avec pr caution en versant le tube Veiller ne pas enlever les particules magn tiques o Ajouter 1 5 ml d Epi proColon Wash A Buffer Remettre compl tement en suspension les particules magn tiques au vortex Transf rer la suspension de particules magn tiques dans un microtube marqu de 2 0 ml en utilisant une pipette de transfert jetable extra longue 22 5 cm Recueillir le reste des particules magn tiques dans le tube de 15 ml avec la pipette de transfert jetable et les transf rer dans le microtube de 2 0 ml Placer le tube dans le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min Enlever autant que possible le tampon l aide d une pipette transfert jetable de 15 cm tandis que le tube est encore dans le portoir magn tique DynaMagTM 2 Veiller ne pas liminer les partic
44. ol valide PCR2 CP lt 40 5 G a 30 3 PCR3 CP lt 40 5 CP lt 30 3 PCR1 CP lt 37 1 Negative Control valide PCR2 pas de CP fourni CP lt 37 1 PCR3 CP lt 37 1 Crossing Point Seuil de cycle 12 5 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle LightCycler 480 Instrument II Si le r sultat du contr le interne ACTB indique un apport suffisant d ADN pour une PCR individuelle seuil de cycle d ACTB sp cifi dans le Tableau 15 le r sultat de la PCR Septin9 d finit le r sultat pour cette PCR individuelle voir section 13 Une valeur pour ACTB au dessus des valeurs de seuil de cycle CP indiqu dans le Tableau 15 d termine le r sultat de cette PCR individuelle comme PCR invalide Tableau 15 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle LightCycler 480 Instrument II R sultat d une PCR individuelle R sultat Septin9 R sultat ACTB Septin9 Positif CP lt 50 CP lt 33 7 Septin9 Negatif Pas de CP fourni CP lt 33 7 Invalide tout r sultat CP gt 33 7 Crossing Point Seuil de cycle Page 26 of 31 13 Interpr tation des R sultats pour un Echantillon de Patient Le r sultat du test pour un chantillon de patient est interpr t selon le Tableau 16 Le r sultat du test pour un chantillon de patient est positif si au moins deux des trois PCR faites en parall le sont Septin9 positives Le r sultat du test pour un chantillon de pa
45. ouillage du couvercle par ex Sarstedt SafeSeal r f rence 72 695 400 ou Eppendorf Safe Lock r f rence 0030 120 094 ou quivalent Embouts pour pipette avec protection contre les a rosols par ex ep Dualfilter T I P S Eppendorf o 2 100 ul r f rence 0030 077 547 ou quivalent o 50 1000 ul r f rence 0030 077 571 ou quivalent Pointes de distribution pour pipette r p tition pour des volumes de 0 5 ml 1 ml 10 ml 25 ml par ex Combitips plus Eppendorf o 0 5 ml r f rence 0030 069 226 ou quivalent o 1 ml r f rence 0030 069 234 ou quivalent o 10 ml r f rence 0030 069 269 ou quivalent o 25 ml r f rence 0030 069 293 ou quivalent Pipettes de transfert jetables non st riles emball es en vrac longueur de 15 cm environ 6 pouces diam tre de la tige de 5 mm une capacit d environ 5 ml par ex VWR pipette de transfert jetable non st rile r f rence 612 4520 ou quivalent Pipettes de transfert jetables non st riles emball es en vrac longueur 22 5 cm environ 9 pouces diam tre de la tige de 5 mm une capacit d environ 5 ml par ex pipette de transfert jetable gradu e Carl Roth r f rence EA61 1 ou quivalent Plaques 96 puits pour la conservation de l ADN par ex MicroAmp Fast 96 Well Reaction Plate 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co r f rence 4346906 ou quivalent Film ou feuille adh sif pour plaque de conservation de l
46. r sultat du contr le interne ACTB indique un apport suffisant d ADN pour une PCR individuelle seuil de cycle d ACTB sp cifi dans le Tableau 12 le r sultat de la PCR Septin9 d finit le r sultat pour cette PCR individuelle voir section 13 Une valeur pour ACTB au dessus des valeurs de seuil de cycle CP indiqu dans le Tableau 12 d termine le r sultat de cette PCR individuelle comme PCR invalide Tableau 12 Interpr tation des R sultats pour une PCR individuelle LightCycler 480 Instrument I R sultat d une PCR individuelle R sultat Septin9 R sultat ACTB Septin9 Positif CP lt 50 CP lt 33 1 Septin9 Negatif Pas de CP fourni CP lt 33 1 Invalide Tout r sultat CP gt 33 1 Crossing Point Seuil de Cycle Page 23 of 31 12 Analyse avec le Roche LightCycler 480 Instrument II 12 1 Pr paration de la Plaque LightCycler 480 Instrument Il Pr parer la plaque PCR La disposition de la plaque comme indiqu dans le Tableau 6 est recommand e Mettre 15 ul de PCR Master Mix dans les puits souhait s de la plaque de r action LightCycler 480 Multiwell 96 puits Centrifuger bri vement la plaque de conservation de l ADNbis cr e dans le paragraphe 9 2 13 pendant 1 min 1000 100 rcf avec une centrifugeuse pour plaque Ajouter 15 ul de solution d ADNbis dans les puits respectifs de la plaque PCR Sceller la plaque avec une feuille adh sive LightCycler 480 Centrifu
47. risque moyen recueillie de fa on prospective et avec 197 chantillons cliniques dans une tude cas t moin comprenant des chantillons provenant de patients avec un carcinome colorectal de tous les stades histologiquement Page 28 of 31 confirm s et des chantillons des individus v rifi s par coloscopie n gative et ne pr sentant aucun signe de maladie L ADN converti au bisulfite a t pr par partir de plasma d riv de sang trait dans un d lai de quatre heures apr s la prise de sang avec des tubes Vacutainer K EDTA Becton Dickinson Des mesures valides pour Septin9 ont t obtenues pour 346 sur 346 sp cimens 100 Dans la cohorte recueillie de fa on prospective 1 chantillon sur les 149 a fourni un r sultat positif au test L estimation de taux de faux positifs dans ce groupe de patients est de 1 IC 95 0 4 Ces chiffres se traduisent par une sp cificit clinique de 99 IC 95 96 100 Parmi les 99 sujets de la cohorte de cas t moins ne pr sentant aucun signe de maladie les contr les 96 sp cimens ont t d termin s d tre Septin9 n gatif r sultant d une sp cificit clinique estim e de 97 IC 95 91 99 voir le Tableau 17 Parmi les 98 sujets diagnostiqu s avec un cancer colorectal 79 sp cimens ont t d termin s d tre positifs pour Septin9 r sultant d une sensibilit clinique estim e de 81 IC 95 72 87 Dans des cancers colorectaux de stad
48. s Continuer rincer ATTENTION L Epi proColon Wash B Concentrate l Epi proColon Elution Buffer l Epi proColon Magnetic Beads l Epi proColon PCR Mix l Epi proColon Polymerase l Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control ne sont pas nocifs 5 Conservation et Stabilit Les r actifs fournis avec l Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 l Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 et l Epi proColon Control Kit M5 02 003 restent stables jusqu la date de p remption indiqu e condition d tre stock s et utilis s conform ment aux instructions Ne pas utiliser les produits au del de la date de p remption Ne pas m langer les composants provenant de diff rents lots de kit 5 1 Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Conserver tous les r actifs de l Epi proColon Plasma Quick Kit une temp rature comprise entre 15 et 30 C uniquement des tubes non ouverts d Epi proColon Bisulfite T Epi proColon Bisulfite Solution est sensible l oxyg ne Utilisez 15 C us Solution Jeter les tubes utilis s Conserver l Epi proColon Wash A Buffer reconstitu et l Epi proColon Wash B Buffer reconstitu une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 6 semaines au maximum Apr s la premi re utilisation conserver tous les r actifs une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 6 semaines au maximum Page 5 of 31 5 2 5 3 6 6 1
49. sanguin et Conservation du Sang Le pr l vement sanguin et la conservation du sang peuvent tre effectu s conform ment aux conditions suivantes e Pour effectuer le pr l vement sanguin utilisez les tubes Vacutainer K EDTA de 10 ml ou S Monovette 9 ml Potassium EDTA Suivez les recommandations du fabricant pour effectuer le pr l vement sanguin Le sang devrait tre trait imm diatement Le sang peut tre conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 24 heures au maximum avant la pr paration de plasma Ne pas congeler l chantillon de sang e Comme alternative le tube S Monovette 8 5 ml CPDA peut tre utilis pour le pr l vement sanguin Suivez les recommandations du fabricant pour effectuer le pr l vement sanguin Le sang devrait tre trait imm diatement Le sang peut tre conserv dans le tube S Monovette de 8 5 ml une temp rature comprise entre 15 et 25 C pendant 72 heures au maximum Ne pas congeler l chantillon de sang 8 2 Pr paration de l Echantillon de Plasma et Conservation du Plasma e Enlever le frein de la centrifugeuse pour viter la rupture des couches cellulaires e Centrifuger le sang dans un tube de collecte de sang 1350 150 rcf pendant 12 min Pour la conversion de rotations par minute rpm en rcf reportez vous au manuel d utilisation de la centrifugeuse e Retirer le tube de collecte de sang de la centrifugeuse e Utiliser une nouvelle pipette de transfert je
50. sans agitation Page 13 of 31 9 2 13 Elution Transf rer le microtube dans un portoir non magn tique et ajouter o 60 ul d Epi proColon Elution Buffer Fermer le tube Resuspendre les particules magn tiques au vortex Incuber pendant 10 1 min 23 2 C dans un bain thermostatique sec avec agitation r gl 1000 100 rpm Centrifuger bri vement le tube Placer le tube sur le portoir magn tique DynaMag 2 pendant 2 6 min Transf rer l luat complet 60 ul de solution d ADN dans une plaque 96 puits en utilisant une pipette de r f rence de 10 100 il et sceller la plaque avec un film adh sif avec un applicateur de film adh sif Pr parer la plaque pour la conservation de l ADNbis en fonction de la disposition recommand e dans le Tableau 4 Tableau 4 Mod le Recommand pour une Plaque d ADNbis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A PC E7 B NC E8 C El E9 D E2 E10 E E3 E11 F E4 E12 G ES E13 H E6 E14 Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative Control 9 2 14 Conservation de l ADN Converti au Bisulfite Lorsque l ADN extrait et trait au bisulfite n est pas utilis imm diatement il peut tre conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 24 heures au maximum ou une temp rature comprise entre 25 et 15 C pendant 72 heures au maximum Page 14 of 31 9 3 Pr paration de la PCR
51. table de 15 cm pour transf rer le plasma du tube de collecte dans un tube centrifuger en polypropyl ne de 15 ml fond conique e Centrifuger le plasma dans le tube centrifuger de 15 ml pendant 12 min 1350 150 rcf e Utiliser une nouvelle pipette de transfert jetable extra longue 22 5 cm ou une pipette s rologique transf rer 3 5 ml de plasma dans un cryotube tiquet ou dans un tube centrifuger e Les chantillons de plasma peuvent tre conserv s une temp rature comprise entre 15 et 25 C pendant 4 semaines au maximum e Lorsque vous utilisez les tubes Vacutainer K EDTA de 10 ml l chantillon de plasma peut tre conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 18 heures au maximum 9 Proc dure du Test Une pipette r p tition est recommand e pour distribuer de fa on r p t e les r actifs suivants l Epi proColon Lysis Binding Buffer l Epi proColon Magnetic Bead Suspension l thanol dans l tape 9 2 3 l Epi proColon Wash A Buffer l Epi proColon Wash B Buffer l Epi proColon Elution Buffer l Epi proColon Bisulfite Solution l Epi proColon Protection Buffer et le PCR Master Mix En outre nous recommandons fortement d utiliser un agitateur disque rotatif et pas un agitateur bascule et de pipeter l ADN extrait et trait au bisulfite avec des pipettes de r f rence Page 9 of 31 9 1 Pr paration des R actifs du Test 9 1 1 Pr paration de l Epi proColon Wash A Buffer
52. tation des R sultats pour une PCR individuelle LC 480 Instrument 11 26 Interpr tation des R sultats pour un Echantillon de Patient 27 Contr le Oua E A PS RE MR ed Er te ne ds ER 27 Controles Externes aertara nt ni nt nn en In tn ne A Et entente ent AEE 27 GEontr les Intern sssssisis mets anne ie Mis Nine te mille fonte ere E N 27 Limites dela Pr c dure nenne Ginette ri ets te ee tite esse tin sstrende done detre 28 Caract ristiques de Performance 3 5cste iesnneietennrssntaneneetienetenenetesesnentt eiseteues 28 Sensibilit Analytiqu 55 8 26e an te E on tee dt EE ES 28 R productibilit s sis di ie nt men n a a dune eee e a 28 Sensibilit et Sp cificit Clinique uses 28 Concordance des deux Appareils de PCR en Temps R el 29 Iter re NCE sorreta ns nr nn Mer dre Di rm mb td TARA eine 29 Signification des Symboles utilis s seen 30 R f rences etrtesn tin format nn en end ner entra d 30 Pourinous contacter s5 55 tnt nn la ESNS ASAS ns arrete sent si nn etre dns create on 31 Page 2 of 31 1 Nom et Usage Pr vu Epi proColon 2 0 CE est un test qualitatif pour la d tection par PCR en temps r el de la m thylation de l ADN Septin9 dans de l ADN converti au bisulfite provenant d chantillons de plasma humain La pr sence de Septin9 m thyl est associ e la pr sence d un cancer colorectal et peut aider d tecter ce type de cancer Epi proColon
53. tient est n gatif si au moins deux des trois PCR faites en parall le sont Septin9 n gatives Le r sultat du test est invalide dans tous les autres cas Tableau 16 Interpr tation des R sultats du Test Epi proColon 2 0 CE R Contr le Positif 2 PAE R sultat du Test A Le Ve R sultats de PCR individuelle Contr le N gatif POSITIF Valide Au moins deux PCRs Septin9 positives NEGATIF Valide Au moins deux PCRs Septin9 n gatives INVALIDE Valide Tout autre cas INVALIDE Invalide n a 14 Contr le Qualit 14 1 Contr les Externes Le kit Epi proColon 2 0 CE contient l Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control M5 02 003 Ces contr les doivent tre utilis s lors de chaque test afin de contr ler la bonne r alisation du test et de garantir la validit des r sultats L Epi proColon Positive Control et l Epi proColon Negative Control doivent se situer dans leurs limites de validit sp cifi es voir Tableau 8 ou Tableau 11 ou Tableau 14 Si un contr le se situe en dehors de ses limites de validit les r sultats des tests aff rents sont invalides et ne peuvent pas tre pris en compte Dans ce cas le test doit tre r p t Si les proc dures de contr le qualit au sein de votre laboratoire exigent une utilisation de contr les plus fr quente pour la v rification des r sultats de tests veuillez respecter ces instructions 14 2 Contr les internes Le contr le i
54. tube o 1000 ul d Epi proColon Wash A Buffer o 20 ul d Epi proColon Magnetic Beads fraichement resuspendu e M langer au vortex e Attendre que le bain thermostatique sec avec agitation ait atteint 23 2 C e Placer le microtube dans le bain thermostatique sec avec agitation r gl sur 1000 100 rpm et incuber 23 2 C pendant 45 5 min e Centrifuger bri vement le tube Page 12 of 31 e Placer le tube sur le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Enlever autant que possible du liquide en utilisant une nouvelle pipette de transfert jetable de 15 cm tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Veiller ne pas pr lever les particules magn tiques 9 2 9 Premier Lavage e Retirer l chantillon du support magn tique pour le lavage et m langer au vortex et ajouter o 800 ul d Epi proColon Wash A Buffer e Resuspendre au vortex e _ Centrifuger bri vement le tube e Placer le tube sur le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Enlever autant que possible du liquide en utilisant une nouvelle pipette de transfert jetable de 15 cm tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Veiller ne pas pr lever les particules magn tiques 9 2 10 Deuxi me Lavage e Retirer l chantillon du support magn tique pour le lavage et m langer au vortex et ajouter o 800 ul d Epi proColon Wash B Buffer e Resuspendre au vortex e _ Centrifuger bri vement le tube e Placer le
55. tube sur le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Enlever autant que possible du liquide en utilisant une nouvelle pipette de transfert jetable de 15 cm tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Veiller ne pas pr lever les particules magn tiques 9 2 11 Troisi me Lavage e Retirer l chantillon du support magn tique DynaMag 2 pour laver et m langer au vortex et ajouter o 400 ul d Epi proColon Wash B Buffer e Resuspendre au vortex e _ Centrifuger bri vement le tube e Placer le tube sur le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Enlever autant que possible du liquide en utilisant une nouvelle pipette de transfert jetable de 15 cm tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Veiller ne pas pr lever les particules magn tiques e _ Centrifuger bri vement le tube e Placer le tube sur le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Enlever autant que possible du liquide en utilisant une pipette de r f rence de 10 100 ul tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Veiller ne pas pr lever les particules magn tiques 9 2 12 S chage Remarque Ne pas augmenter le temps ou la temp rature de s chage Trop s cher peut provoquer une perte de rendement de l ADNbis obtenu e Ouvrir le couvercle du microtube e Placer le microtube dans le bain thermostatique sec avec agitation e Laisser le culot s cher pendant 10 1 min 23 2 C
56. ules magn tiques Centrifuger bri vement le tube Placer le microtube de 2 0 ml dans le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min Enlever autant que possible le tampon r siduel en utilisant une pipette de r f rence de 10 100 ll tandis que le tube est encore sur le portoir magn tique Page 11 of 31 9 2 5 Elution e Transf rer le microtube dans un portoir non magn tique e M langer l Epi proColon Elution Buffer au vortex e Ajouter 100 ul d Epi proColon Elution Buffer chaque tube e Fermer le tube e Remettre en suspension les particules magn tiques au vortex e Placer le microtube dans le bain thermostatique sec avec agitation r gl sur 1000 100 rpm et incuber 80 2 C pendant 10 1 min e Centrifuger bri vement le tube e Placer le microtube dans le portoir magn tique DynaMagTM 2 pendant 2 6 min e Transf rer l luat complet tandis que le tube est encore dans le portoir magn tique 100 ul de solution d ADN dans un nouveau microtube de 2 0 ml e Jeter le microtube de 2 ml contenant les billes magn tiques 9 2 6 Conservation de l ADN Extrait Remarque Si l ADN extrait n est pas utilis imm diatement garder le mat riel une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 24 heures au maximum Ne pas congeler l ADN extrait 9 2 7 Conversion au Bisulfite Remarque L Epi proColon Bisulfite solution est sensible l oxyg ne Utilisez uniquement des tubes d Epi proColon Bisulfite

Epi proColon 2.0 CE pi proColon 2.0 CE

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