Manuel d`utilisation Du microscope confocal Leica TCS SP5
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1. Reflection Transmission TRITC TRITCwide UV VIS YFP User Settings Cy me ry em daruen DAPI Cy3 DAFI DAFImersem Dskedmersem FITC FATCmervem AS GI e Pour cr er une nouvelle configuration Activer l AOTF Visible et ou O WLL en fonction des raies laser dont vous avez besoin Concernant l utilisation du WLL vous pouvez s lectionner jusqu 8 raies Ob simultan ment Activer et D placer chaque curseur selon la raie laser d excitation souhait e D l pi 476 466 496 314 Neit Visible 8 WUL Shuttar d E a HAENBEEN ul b Constant Parcentage 518867 BUINUAAUO 0 LIUMS 13687 1461 244A 01 yamg DN 456 Laser Power R gler les puissances de sortie d AOTF de chacune des raies choisies Ce e T mem CO mmm lr we Ir wc Laica ALEXA 4 DOG CHE EEE EE Laica ALEXA 5 Activer les PMTs d tecteurs dont vous avez besoin Remarque Le confocal dispose de 6 canaux de d tections Seuls les PMT1 PMT3 PMT5 et PMT Trans sont utilisables en imagerie Dans la liste d roulante choisir le spectre d mission de votre fluorochrome O S lectionner la couleur appliquer au PMT D terminer la largeur des fen tres spectrales pour chacun des PMT 8 R gler la largeur du Pinhole de mani re ce qu il soit en Airy 1 Remarque Le r glage du pinhole en Airy 1 lors du changement d objectif se fait de mani re automatique Par pr caution v rifiez q2. TENSION DU SYSTEME V rifier sur le planning en ligne si le syst me est r serv ou non apr s votre session e Si le syst me est r serv apr s votre s ance ou dans les 3h qui suivent vous ne devez pas l teindre compl tement mais proc der de la fa on suivante 1 Remettre le niveau de puissance du laser visible Argon 0 menu Configuration gt Laser mais ne pas d cocher les lasers allum s 2 V rifier que toutes les donn es sont bien sauvegard es 3 Fermer le logiciel LAS AF menu File gt Exit 4 Transf rer ou graver les donn es et les supprimer du disque dur 5 Quitter la session Windows Start gt Log off 6 V rifier que tous les objectifs soient bien nettoy s lentille c t s 7 Baisser les objectifs 8 Remettre la housse du microscope e Si le syst me n est pas utilis apr s vous vous devez l teindre compl tement 1 V rifier que toutes les donn es sont bien sauvegard es en lif et ou tif 2 Eteindre les lasers Menu Configuration gt Laser remettre le niveau de puissance du laser visible Argon 0 puis d cocher tous les lasers allum s 3 Fermer l application LAS AF menu File gt Exit 4 Eteindre l ordinateur s lectionner dans la barre d outils Start Shutdown 5 Mettre les lasers hors tension depuis le poste de commande remettre la clef Laser Emission sur Off le voyant indicateur jeune doit s teindre 6 Eteindre la lampe vapeur de merc
3. de l image et quelques pixels verts l ext rieur de votre chantillon absence de signal 10 Vous pouvez appliquer un moyennage pour am liorer la dynamique de l image line average frame average 11 Cliquer sur Capture Image pour lancer l acquisition d une image 12 Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire voir p29 ACQUERIR UNE COUPE 3D ou SERIE EN Z PLUSIEURS PLANS UNE SEULE COULEUR 1 Proc der de la m me fa on que dans le paragraphe ACQUERIR UNE IMAGE un seul plan une seule couleur pour faire les r glages en prenant soin de les r aliser dans le plan le plus intense 2 Ouvrir le panneau Z stack En mode Live ajuster le Z de fa on tre au plus bas de votre chantillon Cliquer sur Begin pour marquer la position de d part c t lamelle Z Stack 32389 um 276 steps a 0 z Galvo a _ End pm Begin um z Position lpm 23 636 E Mr of steps I SS Z Ston size um z Volume Travel Range 500 um ON System optimized 3 Ajuster nouveau le Z de fa on tre au plus haut de l chantillon et cliquer sur End pour marquer la position de fin oppos de la lamelle 4 D finir le nombre de coupes faire Nr of steps ou entrer la valeur de la distance entre chaque coupe Z step size en tant vigilant sur la valeur de l chantillonnage axial voir page 23 Remarque Ne jamais utiliser le mode system optimized et toujours remettre le no
4. LONNAGE SPATIAL e Echantillonnage lat ral Pour que vos images soient bien chantillonn es la taille du pixel de l image doit tre gale la moiti de la r solution en XY de l objectif utilis crit re de Nyquist Nota Bene au 63x la r solution lat rale de l objectif est de 180 nm Une image bien chantillonn e doit donc avoir des pixels de 90 nm de c t En dessous de cette valeur l image est sur chantillonn e Pour modifier la taille des pixels dans l image vous pouvez modifier le zoom plus le zoom est important plus la taille du pixel image est petite modifier le format de l image le nombre de pixels que contient votre image Pour faire un zoom 3 possibilit s Appliquer le zoom souhait en faisant varier le Zoom factor Cochez la case Zoom in s lectionner l outil rectangle sur l cran de droite et dessiner la zone zoomersur l image Zoomer en utilisant le bouton Zoom Pour modifier le format de l image et donc le nombre de pixels Dans le menu d roulant Format s lectionner une taille d image plus grande 10241024 e Echantillonnage axial De la m me fa on lorsque vous effectuez une s rie Z l intervalle entre 2 coupes optiques doit tre fix en fonction de la r solution axiale de l objectif Selon le crit re de Nyquist l intervalle doit tre gal la moiti de la r solution en XZ de l objectif utilis au 63x la r solution axiale de l ob
5. PMTs sont positionn es de fa on identique dans les 2 s quences L acquisition sera plus rapide puisque qu elle ne n cessitera pas de modifier la position des fentes spectrales 2 Choisir le mode d acquisition le plus appropri entre les modes suivant Between lines pour acqu rir une ligne avec une macro puis la m me ligne avec une autre macro avant de passer la ligne suivante Remarque Dans ce mode les fen tres spectrales de toutes les macros doivent tre identiques Between frames pour acqu rir un plan ou un plan d un stack avec les diff rentes macros avant de passer au plan suivant Remarque Mode conseill pour l acquisition de s ries Z en vue d une tude de co localisation Between stacks pour acqu rir un stack entier avec une macro puis le m me stack avec une autre macro 8 R gler de fa on optimal le ou les canaux de d tection en ajustant le gain et l offset de chaque canal de mani re obtenir quelques pixels bleus saturation sur la zone DS d int r t de l image et des pixels verts l ext rieur de votre chantillon absence de signal en s assurant d tre positionn dans le plan le plus intense si vous faites l acquisition d une s rie Z 8 Eventuellement enregistrer les positions de d but et de fin d une s rie Z ainsi que le nombre de sections voir page 14 9 Lancer l acquisition en cliquant sur le bouton Start 10 Renommer le fichier et sauvegarder le r
6. PTIBC IBISA FR3209 CNRS UMR 7561 CNRS UHP PlaTeforme d Imagerie et de Biophysigue ellulaire et Tissulaire Manuel d utilisation Du microscope confocal Leica TCS SP5 X AOBS mont sur DMI6000 etipilot par LAS AF Table des Mati res APERCU oV O TEME ee a ea ea me no on 3 DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME 4 LANCEMENT DU LOGICIEL LAS AR ea action 5 PRESENTATION DU STATIF TIR ALA rene aaa E E E 6 PRESENTATION DU MENU ACQUISITION aasossassssnsnnsnnrnnrnnrnnrnnrrnrnnrnnrrnrrnrnnrrnrnnrrnrrnnns 9 CHOIX ET CREATION D UNE CONFIGURATION MACHINE 10 CONFIGURATION DES BOUTONS DE REGLAGE ee 12 ACQUERIR UNE IMAGE UN SEUL PLAN UNE SEULE COULEUR 13 ACQUERIR UNE COUPE 3D SERIE EN Z PLUSIEURS PLANS UNE SEULE COULEUR 14 ACQUERIR UNE IMAGE MULTI CANAL MULTI MARQUAGES SIMULTANNEMENT 15 ACQUERIR UNE IMAGE MULTI CANAL MULTI MARQUAGES SEQUENTI ELLEMENT 16 ACQUISITION D IMAGES EN TRANSMISSION anossesssnnssnannnnnrnnrnnrrnrrnrrnrrnrrnrrnrrnr nnne 17 VISUALISATION E Ee EI EE 18 ECHANTILLONNAGE ER E EE 18 ACQUISITION DE SERIES D IMAGES SPECTRALES s ries Lambda 19 gt SEPARATION DE DEUX FLUOROCHROMES SPECTRALEMENT PROCHES 19 gt DETECTER LA PRESENCE D AUTOEFLUORESCENCE acce 21 QUANTIFICATION DE KE TEE 21 ENREGISTREMENT DES IMAGES EE 22 MIS HORS TENSION DU SYSTEME ea ea aa een ae ram nr es 24 APERCU SYSTEME DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME l A
7. boutons dont la fonction vous est inutile il existe une position vide tout en haut de la liste d roulante ACQUERIR UNE IMAGE UN SEUL PLAN UNE SEULE COULEUR Remarque Avant toute acquisition d images confocales la m me proc dure sera appliqu e pour toute observation de lame tapes 1 4 1 Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point et choisir un champ par les oculaires soit en mode lumi re transmise soit en mode fluo 2 Remettre droite la t te du microscope 3 Fermer le shutter de fluorescence par le panneau avant du microscope 4 Passer en mode Scan via le bouton Change CS sur le cot gauche du statif ou en lan ant une acquisition en cliquant sur le bouton Live dans LAS AF 5 S lectionner une macro Leica ou User dans la liste des macros 6 Cliquer sur l ic ne Q LUT pour visualiser l image en fausses couleurs cran de droite Le bleu repr sente les pixels satur s niveau 255 gain le vert repr sente une sensibilit insuffisante pour d tecter un signal niveau 0 offset 7 Se d placer en Z pour trouver le plan d int r t bouton Z position 8 Un zoom autour d une structure d int r t est possible tant que l chantillonnage spatial de l image respecte les crit res de Niquist 9 Un r glage optimal du ou des canaux de d tection correspond ajuster le gain et l offset de chaque canal de mani re obtenir quelques pixels bleus saturation sur la zone d int r t
8. hutter de fluorescence dl non disponible Commutation d un grossissement compl mentaire l autre O non disponible Grossissement compl mentaire 1x OG Choix du bloc filtre de fluorescence D Type d illumination fluorescence transmission DIC Objectif utilis Pourcentage d intensit lumineuse 4 Configuration des ports O D placement en Z de la cr maill re des objectifs oystick Q R glage de la mise au point Z Touches pour r glage de la vitesse du d placement en Z PRESENTATION DU MENU ACQUISITION Leica Microsystems LAS AF TCS SP5 v DB nn WW ach Poin EI Set Background es Zoomin Image Size 246 03 pm 246 03 um Pixel Size 481 47 nm 481 47 nm Line Average CHED onbe een vn O Diff rents modes d acquisition XYZ XYT XYA AXYA Le mode par d faut est XYZ Ic ne d activation du mode s quentiel R glage des param tres de l image taille de l image en pixels vitesse d acquisition en Hz facteur de zoom types d average appliqu s R glages des conditions d acquisition d une s rie Z ic nes de lancement arr t des acquisitions O R glages des conditions de d tection CHOIX ET CREATION D UNE CONFIGURATION MACHINE e Pour utiliser une configuration pr tablie il vous suffit d utiliser le menu d roulant Load Save single settings et de s lectionner une macro dans la liste Load Save single setting g
9. isition largeur de BP Abeg Aend step doivent tre identiques celles de acquisition de la GFP Sur la lame doublement marqu e GFP YFP Acqu rir un spectre rigoureusement dans les m mes conditions Pour s parer les spectres 1 Aller dans le menu Process Dye separation Spectral 2 S lectionner les spectres de la GFP et de la YFP r alis s pr c demment dans Select Spectrum from Database 3 Appuyer sur Apply Le r sultat de la s paration spectrale s affiche sur l cran de droite Deux images sont cr es l une repr sente le marquage GFP l autre le marquage YFP 4 Enregistrer les images voir p29 gt DETECTER LA PRESENCE D AUTOFLUORESCENCE Lorsqu un marquage fluorescent pr sente une intensit faible il est conseill de v rifier si la fluorescence observ e correspond au fluorochrome utilis ou si celle ci n est pas due de l autofluorescence Pour le v rifier faire un spectre de l chantillon L absence de spectre correspondant celui du fluorochrome utilis indique que la fluorescence observ e est probablement due de l autofluorescence QUANTIFICATION DE SIGNAL Pour quantifier un signal de fluorescence les diff rentes conditions d exp rience doivent tre acquises avec les m mes conditions d acquisition m me puissance laser m me gain et Offset pour les PMTs Si possible les conditions d acquisition doivent tre r gl es sur l chantillon dont le signa
10. jectif est de 640nm L intervalle optimum entre 2 coupes optiques est donc de 320 nm Vous trouverez toutes les valeurs de taille des pixels et d intervalle entre 2 coupes optiques dans le tableau affich dans la pi ce du confocal ACQUISITION DE SERIES D IMAGES SPECTRALES s ries Lambda gt SEPARATION DE DEUX FLUOROCHROMES SPECTRALEMENT PROCHES Lors de l acquisition d images avec deux fluorochromes poss dant des spectres tr s proches il est n cessaire de s parer les deux fluorochromes gr ce au mode de d tection spectrale du confocal scan Le principe est d acqu rir les spectres de chacun des fluorochromes situ s sur des lames distinctes puis d acqu rir le spectre d une lame doublement marqu e Par traitement logiciel les deux marquages seront s par s spectralement Exemple d un double marquage GFP YFP fluorochromes dont les pics d mission sont distants de 20 nm Sur la lame exclusivement GFP 1 S lectionnez le mode d acquisition en xyA 2 Activer l AOTF visible et s lectionner la raie laser 488 nm 3 AU niveau de l onglet Scan Range Properties s lectionner le PMT utiliser 4 Indiquer les valeurs de d but Begin et de fin End de la s rie Lambda 5 Indiquer la taille de la bande passante Band With 6 Indiquer le nombre d images spectrales No of steps ou le pas entre 2 images spectrales Lambda stepsize 7 S il est connu se placer au maximum du spectre d mission du fl
11. l de fluorescence est le plus intense De cette fa on les autres chantillons n atteindront pas la saturation Pour plus de pr cision dans la mesure de la quantification les images doivent tre acquises en 12 bits Pour cela dans le menu Configuration Setting Resolution s lectionner 12bits R gler les conditions d acquisition Gain Offset et puissance laser voir p13 Sans modifier les conditions d acquisition passer tous les chantillons Dans le cas ou un ou plusieurs chantillons saturent il faut modifier seulement la valeur de gain du PMT Les images pourront ensuite tre corrig es gr ce la r alisation d une gamme de PMT intensit en fonction du voltage ENREGISTREMENT DES IMAGES La fen tre de gestion des images se trouve dans l onglet Experiments situ sur l cran de gauche A chaque fois que vous effectuez une acquisition d une s rie Z ou d une image le logiciel l indique dans cette fen tre Un dossier Experiment est cr automatiquement l ouverture du logiciel dans lequel seront stock es les images acquises 1 Renommer le fichier clic droit Rename 2 Cliquer sur l ic ne Save all La premi re fois que vous sauvez le r pertoire une boite de dialogue intitul e Save as s affiche Remonter dans l arborescence jusqu trouver la place du dossier Experiment D Users LABO Nom Encadrant Nom de l utilisateur Le nom de votre dossier utilisateur doit tre affich dan
12. llumez la lampe fluorescence boitier sur la table optique Mettre le variateur d intensit sur la premi re position et v rifier que le bouton Shutter soit bien en position open Shutter remote SL open D Intensity e II Au niveau du poste de commande Microscope Mettre en marche la station de travail TCS bouton vert PC Microscope le syst me d exploitation d marre automatiquement Le microscope le PC et les 2 crans s allument Dans la boite de dialogue Login choisir la session TCS Users 2 Allumer le scanner bouton vert Scanner Power La mise sous tension des Lasers se fait en deux tapes actionner bouton vert Laser Power et tourner la cl Laser Emission sur ON 1 L allumage d finitif des lasers se fait via le logiciel voir le chapitre suivant LANCEMENT DU LOGICIEL LAS AF 1 Ex cuter le logiciel de pilotage du confocal en cliquant sur l ic ne LAS AF 2 D marrer le logiciel en cliquant sur le bouton OK CHBITETUME Cd v i Dach Gegen Pk L Remarque Assurez vous que les objectifs soient en position la plus basse 3 Le logiciel LAS AF se r partit sur les deux crans celui de gauche d di aux r glages des acquisitions celui de droite d di l affichage des images Str keem e S wn ES 8 Em CE nm E e Lu 4 Allumage des lasers Dans le menu Configuration gt Laser allumer les lasers do
13. mbre de coupes 1 si vous ne voulez plus faire d acquisition en Z 5 Lancer l acquisition de la s rie Z avec l ic ne Start 6 Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire voir p29 ACQUERIR UNE IMAGE MULTI CANAL MULTI MARQUAGES SIMULTANNEMENT 1 Proc der de la m me fa on que pour un simple marquage cr er une macro dans laquelle les raies lasers utiles sont activ es et activer autant de PMTs n cessaires 2 Un r glage optimal du ou des canaux de d tection correspond ajuster le gain et l offset de chaque canal de mani re obtenir quelques pixels bleus saturation sur la zone d int r t de l image et des pixels verts l ext rieur de votre chantillon absence de signal 3 Vous pouvez appliquer un moyennage pour am liorer la dynamique de l image line average frame average 4 Enregistrer les positions de d but et de fin d une s rie Z ainsi que le nombre de sections le cas ch ant voir page 14 5 Lancer l acquisition avec Capture image pour une image simple ou Start pour une s rie Z 6 Renommer le fichier et sauver le r pertoire voir p29 Exemple d un co marquage FITC TRITEC Excitation 488 nm pour le FITC et 561 nm pour le TRITC Le premier canal d acquisition PMT1 sera utilis pour imager le FITC Le second canal d acquisition PMT3 sera utilis pour imager le TRITC DS a Au niveau de l AOTF visible mettre 0 la raie poss dant la longueur d onde la pl
14. nt vous avez besoin Le laser Argon doit tre mis une puissance d environ 20 C est suffisant dans la majorit des cas mais il peut tre pouss au del si le signal observ s av re vraiment trop faible Remarque Ne jamais travailler avec une puissance laser 0 Configuration Acquire Process Hardware Configuration x EAA Microscope bjective Laser Beam Path Standby Re ES Max ft E Ctrl Panel Settings Super IPS Masks PRESENTATION DU STATIF DMI 6000B Le statif DMI6000B est enti rement motoris Sur le cot qauche 1 Choix du mode de contraste en lumi re blanche E Fluo passage en mode fluorescence Cube choix du bloc fluo dl Change Cs passage en mode confocal vis de mise au point O Ouverture fermeture du diaphragme d ouverture Z R glage de l intensit lumineuse en lumi re blanche ou en fluorescence O Ouverture fermeture du diaphragme de champ Passage du mode r fl chi fluo au mode transmis lumi re blanche Sur le c t droit mise au point lectronique vis de mise au point Changement d objectif Appuyer sur le bouton du haut pour un passage vers un grossissement sup rieur sur le bouton du bas pour un passage vers un grossissement inf rieur ER Touches de r glage de la vitesse de d placement en Z En fa ade O 100 de lumi re vers les oculaires S lection des ports Ouverture fermeture du s
15. pertoire voir p29 Remarque Pour appliquer des moyennages diff rents pour chacun des scans aller dans le menu Configuration IPS masks et s lectionner Confocal sequential frame S lectionner Average line et Average Frame dans la liste ACQUISITION D IMAGES EN TRANSMISSION l Faire la mise au point sur votre chantillon 2 Sur le statif appuyer sur TL IL pour passer en mode lumi re transmise 3 Appuyer sur CHG TL jusqu ce que TL DIC s affiche sur l cran du statif mode DIC 4 S lectionner ou cr er ou une macro Transmission Activer l AOTF visible et s lectionner la raie 488 nm Cliquer sur Additional Channels et activer PMT Trans S lectionner le mode de contraste dans la liste d roulante Scan BF pour faire des images en transmission simple Scan DIC pour faire des images en DIC 5 Lancer un scan en Live et faire les r glages d AOTF de gain d offset et de Z mise au point 6 Appliquer un moyennage et acqu rir l image en cliquant sur Capture Image 8 Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire voir p29 VISUALISATION DES IMAGES ACQUISES Sur l cran de droite diff rents ic nes vous permettent d acc der aux diff rents modes de visualisation de vos datas Nombre de canaux actifs Superposition des diff rents canaux Projection maximum des plans d une s rie Z Visualisation des sections XZ et YZ d une s rie Z Visualisation des diff rents plans sous forme de galerie ECHANTIL
16. s la fen tre Save in Indiquer le nom du fichier Experiment dans la fen tre File Name en commen ant par Ann eMoisDate NOM Valider en cliquant sur Save all 3 Pour sauver toutes les autres images et s ries Z r alis es par la suite les renommer et cliquer sur l ic ne Save all Attention Les donn es sont automatiquement effac es 15 jours apr s leur acquisition Pensez les graver ou les transf rer sur le serveur rapidement Le dossier Experiment est sauvegard en format lif Pour r cup rer les donn es en format tif il faut les exporter Pour cela faire un clic droit sur le dossier exporter puis s lectionner Export Ae Tiff Dans la fen tre Export As Tif cocher Save Raw Data et Use Directory Si la case Overlay channels est coch e seuls les overlays seront sauv s pas les images brutes 37 NB est fortement conseill de conserver les dossiers en lif pour pouvoir r cup rer les param tres d acquisition ult rieurement Le logiciel LAS AF Lite est disponible sur les PC de traitement d images de la plateforme Un CD d installation est galement votre disposition Cette version du logiciel permet galement d exporter les fichiers en tif Il est conseill de cr er un r pertoire Experiment par condition d exp rience Pour cr er un nouveau dossier cliquer sur l ic ne New Pour ouvrir un dossier d j existant cliquer sur l ic ne Open MISE HORS
17. ue vous tes bien en Airy 1 chaque changement d objectif Pinhole Feiereisen PAU 9 Une fois tous les param tres modifi s enregistrez votre configuration en cliquant sur Save dans le module Load Save single setting CONFIGURATION DES BOUTONS DE REGLAGE La fonction ainsi que la valeur associ e est affich e au dessus de chaque bouton Pour chaque bouton vous pouvez modifier sa fonction et sa sensibilit Pour modifier un bouton deux possibilit s Dans la fen tre principale cliquer sur Control Panel ou dans l onglet Configuration s lectionner Ctrl Panel S lectionner le bouton modifier puis choisir dans les 2 menus d roulants la fonction et la sensibilit appliquer Vous pouvez enregistrer votre panel de boutons cliquez sur Save en bas gauche et donnez un nom votre panel Lors de votre prochaine session vous pouvez le charger en le s lectionnant dans la liste d roulante Remarque Les deux petits boutons noirs la gauche des boutons du panel servent lancer un scan en mode Live droite s lectionner un PMT l cran lorsque le mode Smart Gain est actif gauche Quelques astuces Pour le r glage des PMT utiliser la fonction Smart Gain et Smart Offset qui vous permettront de r gler le gain et l offset de tous les PMTs Pour s lectionner le PMT modifier cliquer sur l image correspondante elle doit tre entour e de pointill s blancs D sactivez les
18. uorochrome et faire les r glages de puissance laser de gain et d offset 8 Lancer l acquisition en cliquant sur Start 9 Enregistrer le spectre d mission du fluorochrome Aller dans le menu Process Dye separation Spectral Le spectre de l chantillon est repr sent automatiquement Mettre l chelle de l axe Y en mode Auto clic droit sur l axe Scaling a D placer la ROI sur l image pour la placer sur une zone d int r t Augmenter la taille de la ROI en fonction de la taille de la zone d int r t Remarque plus la ROI est grande moins le spectre sera bruit b Exporter les valeurs du spectre clic droit sur le graphique Export Excel un fichier csv est cr c Eventuellement exporter l image du spectre clic droit sur le graphique Export Tiff ou J peg d Cliquer sur Save Current Spectrum e La fen tre Spectrum DataBase s ouvre Dans la liste Table of Spectra faire un clic droit puis New f Cliquer sur Get Data Point 9 Dans la fen tre Text Loader cliquer sur Browse h et chercher le fichier csv qui vient d tre enregistr Valider en cliquant sur User text shown i Rentrer les informations concernant le spectre dans la Spectra Database j Cliquer sur Save k Le nom du spectre appara t dans la liste de la Spectra Database Sur la lame exclusivement YFP R aliser exactement les m mes tapes que pour la lame exclusivement GFP N B Les conditions d acqu
19. ure 7 V rifier que tous les objectifs soient bien nettoy s lentille c t s 8 Baisser les objectifs 9 Eteindre la station de travail TCS bouton vert PC Microscope 10 Eteindre le scanner bouton vert Scanner Power 11 Au bout de 15 min teindre l extraction d air et l alimentation des lasers bouton vert Laser Power 12 Remettre la housse du microscope
20. us grande ici 561 nm en laissant les 2 PMTs activ s b En mode Live faire les r glages pour le marquage FITC PMT1 puissance laser minimum gain et offset de fa on ce qu il n y ait pas de d bordement dans le PMT2 S il subsiste une image du FITC dans le PMT2 diminuer le gain du PMT2 jusqu disparition du signal FITC c Allumer la raie 561 nm et effectuer les r glages sur le PMT2 sans augmenter le gain du PMT2 Remarque S il est impossible de supprimer les d bordements vous devez obligatoirement travailler en mode s quentiel ACQUERIR UNE IMAGE MULTI CANAL MULTI MARQUAGES SEQUENTIELLEMENT 1 Cliquer sur le bouton Sequential puis cr er une configuration pour un seul canal avec une ou plusieurs longueur s d onde d excitation Sequential Scan scan scan d A between lines V haten between stacks Remarque Le bouton ajoute une s quence en recopiant la s quence pr c dente Vous pouvez ajouter autant de s quences que vous le souhaitez Le bouton enl ve la derni re s quence ajout e Astuce Dans un premier temps activez toutes les raies et tous les PMTs dont vous avez besoin Positionner galement les bandes passantes pour chaque PMT D sactiver ce qui est inutile pour la 1 re s quence Passez sur la 2 me s quence et d sactiver activer les lasers PMTS utiles la 2 me s quence sans toucher aux bandes passantes des PMTs De cette fa on les bandes passantes des
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