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1. RIA gnost TBG E Octobre 2009 Mod le 05 Trousse pour la d termination radioimmunologique de la globuline fixant la thyroxine TBG s rique Contenu de la trousse 1 flacon de I TBG humaine lt 54 kBq lyophilis 1 flacon d antis rum de mouton anti TBG lyophilis 6 flacons de standards de TBG contenant chacun 0 5 ml de s rum de cheval lyophilis concentration allant de 0 80 ug ml TBG humaine 1 flacon de s rum de contr le de TBG contenant 0 5 ml de s rum humain lyophilis concentration indiqu e sur l tiquette 1 flacon de solution de poly thyl ne glycol pr te l emploi 110 ml 1 mode d emploi Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur Eviter toute absorption des r actifs ainsi que tout contact avec la peau ou les muqueuses 1 Introduction La Thyroxine Binding Globuline TBG est une inter a globuline de poids mol culaire 60 000 Elle contient 13 d hydrates de carbone La TBG est synth tis e dans le foie sa demi vie biologique est de 5 jours La concentration de la TBG s rique n est donc pas soumise de fortes variations mais n est pas non plus constante L apport de thyroxine endog ne ou exog ne l ge et dans une plus faible mesure le sexe influent sur le taux de la TBG s rique La TBG est la prot ine de transport sp cifique quantitativement importante de la thyroxine T4 et de la triiodothyronine T3 Une mol cule de TBG pe
2. correspondant et attendre la reconstitution compl te du lyophilisat environ 10 minutes Pour aider la dissolution et l homog n isation de la solution agiter le flacon en tra ant des cercles et ou le rouler entre les mains Ouvrir les autres flacons avec la m me pr caution reconstituer le traceur I TBG et l anti s rum anti TBG dans 20 ml d eau distill e chacun Aider la dissolution des lyophilisats en agitant les flacons de fa on concentrique Pour l eau distill e utiliser de pr f rence des pipettes de la grandeur appropri e ZCIS r E CIS0IO Member of IBA group RIA gnost TBG C E Octobre 2009 Mod le 05 4 3 Remarques g n rales Les r actifs provenant de diff rentes trousses d un m me lot peuvent tre rassembl s si l on fait un grand nombre de dosages Ne tracer alors qu une seule courbe standard pour tous les chantillons Apr s reconstitution on peut conserver les r actifs 2 8 Il est d conseill de conserver les r actifs plus de deux semaines cause du risque de contamination microbienne 4 4 Pr paration des s rums doser Apr s le pr l vement sanguin pr parer le s rum ou le plasma selon le proc d habituel Distribuer le s rum directement dans les tubes ou le conserver 24 heures au maximum 2 8 C Au del de 24 heures le conserver 20 Il est alors conseill de constituer des aliquotes car des cong lations et des d cong lations r p t es peuvent a
3. de p remption inscrite sur l tiquette Aucune r action crois e significative de l antiserum anti TBG avec des globulines ou o ni avec l inhibiteur de l inter a trypsine n a pu tre mise en vidence avec les m thodes employ es actuellement Une comparaison des taux de la TBG s rique obtenus en radioimmunologie immuno lectrophor se technique de Laurel et immunodiffusion radiale a donn dans la plupart des cas une bonne corr lation 2 Int r t clinique du dosage quantitatif de la TBG Etant donn que seules les hormones thyro diennes libres dont on sait que la concentration s rique est nettement inf rieure 1 jouent un r le dans le m tabolisme il est n cessaire d estimer la liaison prot ique de la thyroxine pour valuer la fonction thyro dienne Le renseignement le plus int ressant fourni par le dosage de la TBG est le rapport T4 TBG qui rend possible un diagnostic diff rentiel entre euthyro die hypothyro die et hyperthyro die Le dosage quantitatif de la TBG seule n a de valeur strictement diagnostique que pour les rares patients souffrant d une anomalie de la TBG le plus souvent h r ditaire 3 R sultats cliniques de la trousse RIA gnost TBG 3 1 Valeurs normales de la TBG Chez 368 euthyro diens sains de 17 60 ans la valeur moyenne de concentration de la TBG s rique est de 20 6 4 8 ug ml le domaine de mesure tant compris entre 10 et 42 ug ml La diff rence entre les valeurs des hommes et
4. en vigueur dans le pays de l utilisateur L application des r gles de base de radioprotection assure une s curit ad quate Un aper u en est donn ci dessous Les produits radioactifs seront stock s dans leur conteneur d origine dans un local appropri Un cahier de r ception et de stockage de produits radioactifs sera tenu jour La manipulation de produits radioactifs se fera dans un local appropri dont l acc s doit tre r glement zone contr l e Ne pas manger ni boire ni fumer ni appliquer des cosm tiques en zone contr l e Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection Le mat riel de laboratoire et la verrerie qui ont t contamin s doivent tre limin s au fur et mesure afin d viter une contamination crois e de plusieurs isotopes Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra tre r solu selon les proc dures tablies Toute limination de d chets radioactifs se fera conform ment aux r glementations en vigueur A ZCISbIO 6 ioassays Ge of IBA ee
5. celles des femmes est n gligeable 4 19 7 5 5 21 1 5 8 ug TBG ml En revanche la concentration de la TBG d pend nettement de l ge Sur 596 euthyro diens sains le taux de la TBG est son maximum dans la premi re ann e de la vie puis diminue progressivement jusqu l ge adulte ge ann es 1 10 11 16 17 60 gt 60 TBG ug ml x 31 5 24 1 20 5 19 9 1s 14 6 5 4 8 6 0 ZCISbIO Le a Member of IBA group RIA gnost TBG E Octobre 2009 Mod le 05 La prise de contraceptifs oraux contenant des strog nes augmente la valeur moyenne de la TBG s rique qui passe 28 0 5 0 ug ml Pendant la grossesse la TBG s rique augmente entre la 10 et la 30 semaine et passe 50 ug ml puis reste ce niveau jusqu la fin de la grossesse Les patients porteurs d un goitre euthyro dien ont une TBG s rique normale 20 8 4 6 ug ml ainsi que ceux ayant une hyperthyroxin mie x 19 5 5 0 ug ml Par contre les patients souffrant d hypothyr ose ont un taux l g rement augment x 25 3 4 8 ug ml 3 2 Importance du rapport T4 TBG Les donn es publi es dans la litt rature et les r sultats des examens cliniques effectu s avec la trousse RIA gnost TBG ont permis de constater que le rapport T4 TBG est bien corr l avec la T4 libre ng T4 mi x 1000 Le rapport est de 4 3 1 2 pour une euthyro die ug TBG ml En cas d hypothyroxin mi
6. e le rapport tombe 1 1 0 9 et passe 11 2 3 6 pour le groupe de personnes tudi jusqu pr sent pour une hyperthyro die Quant aux cas limites entre l hypothyro die et l euthyro die pour lesquels il est difficile d tablir un d ficit le rapport T4 TBG permet de les diff rencier facilement Une forte augmentation de la TBG lors d une grossesse par exemple est galement beaucoup mieux mise en vidence par ce rapport que par les m thodes indirectes de dosage utilis es jusqu pr sent Une augmentation endog ne ou exog ne due des strog nes grossesse ou contraceptifs oraux ne conduit pas forc ment une augmentation correspondante de T4 La valeur moyenne du rapport T4 TBG peut donc tre r duite ce qui explique que les valeurs extr mes peuvent parfois se trouver dans le domaine limite de l hypothyro die Dans ces cas l il faut en relation avec l image clinique r fl chir sur l opportunit d effectuer un test TRH permettant de prendre des mesures th rapeutiques ad quates Rapport T4 TBG dans diff rentes situations cliniques Euthyro die Hypothyro die Hyperthyro die contraceptifs oraux X 4 3 1 1 11 2 3 6 1 DS 1 2 0 9 3 6 0 8 Domaine 3 1 5 2 0 2 2 0 7 6 14 8 2 4 4 4 3 3 Anomalies de la TBG Un taux de TBG s rique inf rieur 10 ug ml indique une anomalie g n tique Le faible nombre de cas tudi s n a pas encore permis de d terminer dans quelle mesure le dosage du rapp
7. ffecter la qualit des chantillons On peut galement utiliser des chantillons plasmatiques le dosage n tant pas influenc par l h parine ni par l EDTA 4 5 Mise en garde et pr cautions d emploi Les mati res premi res d origine humaine contenues dans les r actifs de cette trousse ont t test es avec des trousses agr es et trouv es n gatives en ce qui concerne les anticorps anti HIV 1 anti HIV 2 anti HCV et l antig ne HBs Cependant aucune m thode d analyse ne permet ce jour de garantir totalement qu une mati re premi re d origine humaine soit incapable de transmettre l h patite le virus HIV ou toute autre infection virale Aussi faut il consid rer toute mati re premi re d origine humaine y compris les chantillons doser comme potentiellement infectieuse 4 6 Protocole de dosage cf tabl 2 Num roter les tubes incubation 3 5 ml comme le montre le tableau 2 6 standards le s rum de contr le les chantillons et l activit totale Placer les tubes dans des portoirs appropri s Apr s reconstitution v rifier l absence de particules en suspension homog n iser les standards et distribuer des aliquotes de 20 pl dans chacun des tubes correspondants n4 12 Il e st recommand de changer d embout pour chaque standard Distribuer apr s homog n isation 20 ul de s rum de contr le dans chacun des tubes 13 et 14 Homog n iser les chantillons et distribuer des aliquotes de 20 ul dans les t
8. ort T4 TBG est aussi int ressant dans ces cas extr mes Il est probable que ce sont l albumine et la pr albumine qui dans ces cas l se chargent du transport des hormones thyro diennes 4 Mode d emploi 4 1 Mat riel n cessaire Tubes essai 3 5 ml micropipettes avec embout plastique interchangeable de 20 ul 200 ul et 500 ul pipette avec embout interchangeable de 1 ml ou bien distributeurs de 200 ul 500 ul et de 1 ml pipettes et prouvettes gradu es 20 ml agitateur type vortex centrifugeuse de pr f rence r frig r e 1500 g minimum g 1 11 x 10 x tpm x rayon en cm compteur gamma r gl pour la mesure de l iode 125 4 2 Pr paration des r actifs Reconstituer avec pr caution les r actifs de la trousse par de l eau distill e suivant le tableau 1 l exception de la solution de poly thyl ne glycol pr te l emploi Tabl 1 reconstitution des r actifs du coffret R actifs Eau distill e standards So S5 500 ul s rum de contr le 500 ul traceur 11 TBG 20 ml antis rum anti TBG 20 ml 110 mi de poly thyl ne glycol pr t l emploi D coller ventuellement les particules de lyophilisat qui adh rent au bouchon en tapant les flacons de standard et de s rum de contr le sur une surface dure Ouvrir avec pr caution et poser le bouchon plat sur la paillasse Reconstituer avec exactement 500 ul d eau distill e l aide d une micropipette appropri e reboucher avec le bouchon
9. ubes appropri s 15 16 17 18 etc Changer d embout pour chaque s rum La pr cision des pipetages de 20 lil est capitale Distribuer 200 ul de traceur 12351 TBG dans tous les tubes y compris ceux destin s au comptage de l activit totale M langer au vortex Distribuer 200 ul d antis rum anti TBG dans tous les tubes except s ceux de l activit totale Agiter de nouveau Boucher chacun des tubes d un bouchon ou recouvrir le tout de parafilm et laisser incuber pendant 0 5 heures temp rature ambiante 17 27 C l abri de la lumi re Le temps d incubation peut aller jusqu 4 heures Les tapes suivantes doivent s encha ner sans interruption Distribuer dans chacun des tubes sauf ceux de l activit totale 1 ml de PEG temp rature ambiante Utiliser un distributeur automatique appropri ou bien des pipettes dont on peut agrandir le trou en le coupant Agjiter tous les tubes except s ceux de l activit totale plusieurs fois au vortex et v rifier que l mulsion est bien r alis e Centrifuger le pr cipit pendant 20 minutes 1500 g et 5 27 Si le surnageant n est pas clair r p ter le dosage de l chantillon Aspirer le surnageant apr s la centrifugation Tenir pour cela les tubes l g rement inclin s Le surnageant peut galement tre d cant Dans ce cas poser les tubes 10 minutes l envers sur papier absorbant pour liminer le restant de poly thyl ne glycol Compter tous les tubes
10. ut lier une mol cule de T4 ou de T3 l affinit de la liaison tant plus grande pour T4 que pour T3 La capacit de fixation de la TBG est de 20 ug de thyroxine pour 100 ml de s rum et donc trois fois sup rieure la concentration normale en thyroxine L albumine et la pr albumine ne contribuent dans les conditions normales que de fa on minime au transport de la thyroxine La trousse RIA gnost TBG permet de doser la Thyroxine Binding Globuline s rique in vitro selon le principe de la technique par comp tition La TBG s rique et le traceur TBG marqu l iode 125 sont en comp tition vis vis d une quantit limit e de sites de fixation d anticorps hautement sp cifiques Apr s incubation la s paration de la TBG libre et du complexe anticorps TBG se fait par pr cipitation de ce dernier avec du PEG Apr s centrifugation du pr cipit le surnageant est aspir ou d cant et l activit du traceur marqu l iode 125 qui est pr sent dans le pr cipit est mesur e La quantit de TBG contenue dans le s rum est estim e partir de la gamme construite l aide de standards trait s de fa on analogue Le domaine de mesure est compris entre 0 et 80 ug de TBG mI de s rum avec un maximum de pr cision entre 7 et 50 ug ml Les r actifs sont tous lyophilis s sauf le poly thyl ne glycol Ils doivent tre conserv s une temp rature inf rieure 6C A cette temp rature la trousse peut tre utilis e jusqu la date
11. xploitation des r sultats La figure 1 repr sente une courbe standard type tablie l aide de la trousse RIA gnost TBG Relever toutes les valeurs mesur es y compris la valeur z ro elles repr sentent le traceur I TBG qui est li l anticorps Reporter sur papier millim tr ad quat d une part le nombre de coups par minute des standards So Ss et d autre part les concentrations de TBG correspondantes ug ml Les points servent tracer la courbe standard Marquer les valeurs du s rum de contr le et des s rums doser puis lire sur la courbe d talonnage la concentration de TBG Il est d autre part conseill de calculer le rapport de chacun des standards S4 S5 au standard So et de reporter la valeur moyenne du rapport relatif de So 100 en ordonn e On portera en abscisse la concentration de TBG Les points serviront galement tracer la courbe standard a e S x a E Il n existe actuellement aucun standard TBG international servant de valeur de r f rence aux valeurs mesur es 5 R gles de base de radioprotection Ce produit radioactif ne peut tre re u achet d tenu ou utilis que par des personnes autoris es cette fin et dans des laboratoires couverts par cette autorisation Cette solution ne peut en aucun cas tre administr e ni l homme ni aux animaux L achat la d tention l utilisation et l change de produits radioactifs sont soumis aux r glementations
12. y compris ceux de l activit totale l aide d un compteur gamma pendant 60 secondes On compte 20 000 40 000 cpm pour les tubes de l activit totale suivant l ge de la trousse et le rendement de l appareil de mesure Tab 2 Protocole de dosage de la TBG Standards ul S rum de contr le ul Echantillons ul Activit totale ul N des tubes essai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Jetc Standards So 20 20 Si 20 20 S2 20 20 S3 20 20 S4 20 20 S5 20 20 S rum de contr le 20 20 Echantillons 1 20 Echantillons 2 etc 20 Jetc Traceur I TBG ee 200 pl gt Antis rum anti TBG qQ 200 l gt M langer recouvrir de parafilm incuber 0 5 heures jusqu 4 h temp rature ambiante 17 27 Poly thyl ne glycol PEG e DE a E E Mere gt M langer aussit t centrifuger 20 min gt 1500 g 5 27 Aspirer ou d canter le surnageant Compter le pr cipit Compter la solution q CIS bi O 5 ioassays Member of IBA se RIA gnost TBG E Octobre 2009 Mod le 05 Fig 1 Exemple de courbe d talonnage Groupe de cpm B T B Bo pe PER tubes moyens x 100 x 100 Hg RE A PE EE Case ors ere o o ant s ore or Csanaae orse ee oa Csaneaus cee ooo 20 RSR oer r 4 7 E

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