ALK Break Apart DNA-FISH Probe Sonde “Break Apart”
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1. 541kb 556kb D ETR BE NRI IERE Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH ALK Break Apart Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les r gions couvertes par les sondes approximativement l chelle GRCh37 Hg19 2009 Les sondes directement marqu es ALK 5 rouge et ALK 3 verte flanquent les points de cassure du g ne Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri de la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation im2. Micropipettes 1 200mL HCIIN Microscope pifluores Parafilm MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Lames plus NaSCN 1M Hotte aspirante Colle de caoutchouc SSC 20X Gants Plateau pour lames Formaline 10 Chambre humidifi e Thermom tre calibr DAPI et Antifade Huile d immersion 37 C to 80 C Eau distill e Incubateur Plaque chauffante Pepsine Lampe mercure 100 watts Bain marie 20 Tween Microcentrifugeuse Citrisolv est une marque enregistr e de Fisherbrand Pr paration des r actifs Remarque Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL 0 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un ta
3. traite ment facultatif la pepsine Pr traitement facultatif des lames la pepsine 1 Pr chauffer 50 mL de HCI 0 01N 37 C 2 Ajouter 10 15 uL de solution m re de pepsine 0 4 aux 50 mL de HCI 0 01N pr chauff s et incuber la lame pendant 5 10 min 37 C dans la pepsine Remarque sur la proc dure Certains sp cimens peuvent n cessiter des temps de digestion plus longs dans la pepsine 3 Laver deux fois la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X tem p rature ambiante TA 4 Incuber la lame pendant 5 min dans du formald hyde 1 TA 5 Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X TA Suite la page suirante Proc dure Standard for FISH 6 D shydrater la lame dans de l thanol 70 85 et 100 TA pendant 1 min chacun 7 Laisser s cher la lame l air libre Remarque sur la proc dure V rifier la morphologie de l chantillon l aide d un microscope contraste de phase avant l hybridation Ne pas hybrider en cas de compromission de la morphologie nucl aire D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer bri vement la sonde DNA FISH et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse pendant 30 secondes 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH sur la zone cible sur la lame et la recouvrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus pe
4. J Thorac Oncol 2011 6 4 p 774 80 Cancer Genetics Italia S r l Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia wWwWw cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Cancer Genetics Italia S r l 2012 Cancer Genetics Italia S r l Version 05 31 12
5. de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis correspond des sections FFPE de 4 5 um d paisseur Les lames doivent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Remarque sur la proc dure Simultan ment aux coupes s ri es utilis es pour l analyse FISH une ou des coupe s doivent tre pr par es pour coloration l h matoxyline et l osine H amp E 1 Les coupes pour essai FISH doivent tre mont es sur des lames Plus en rob es 2 Cuire les lames sur la nuit 12 18 heures 55 C avant l hybridation Utilise sous 3 jours Pr traitement des lames r aliser sous une hotte aspiration 1 D paraffiner la lame dans 3 bains de CitriSolv de 10 min chacun TA Remarque sur la proc dure Les bocaux de CitriSolv peuvent tre utilis s deux fois Toutefois le troisi me bocal doit contenir du r actif encore inutilis 2 D shydrater la lame en l incubant dans deux bains d thanol 100 de 5 min chacun TA S cher l air peut rester a TA pendant plusieurs heures Remarque sur la proc dure La lame peut tre conserv e s che TA pendant plus ieurs heures Incuber la lame dans du HCI 0 2N pendant 20 min TA 4 Rincer la lame dans un bain d eau distill e pend
6. ALK Break Apart DNA FISH Probe Sonde Break Apart Bicolore 21 002 Ek Mode d emploi 1 Sg Usage pr vu La sonde ALK Break Apart de Cancer Genetics Italia est con ue pour d tecter la translocation entre le g ne ALK situ en 2p23 et l un de ses 14 loci partenaires de translocation par hybridation in situ en fluorescence FISH La translocation du g ne ALK se produit dans environ 50 des cas de lym phome anaplasique grandes cellules ALCL avec une translocation t 2 5 p23 q35 d termin e par cytog n tique conventionnelle dans de tels cas la pr sence de la translocation t 2 5 p23 q35 supporte un pronostic globale ment meilleure pour les patients ALCL La translocation du g ne ALK a t observ e dans les tumeurs v sicales inflammatoires myofibroblastique IMT de la vessie gt 66 4 et sert de biomarqueur pour le diagnostic diff rentiel de l IMT partir de l sions sarcomateuses La translocation du g ne ALK est observ e dans environ 5 16 des cas de cancer du poumon non petites cellules sous la forme d inv 2 p21p23 d termin e par FISH et sert de bio marqueur pour la r ponse th rapeutique La pr sence de la translocation ALK chez les patients atteints de cancer du poumon non petites cellules est corr l e avec une sensibilit marqu e aux traitements de incluant du peme trexed et du crizotinib ITALIA Er ALK ALK 2p23 t lom re 5 DE 3 centrom re A
7. ant 1 min TA et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 5 Incuber la lame dans une solution de NaSCN 1M pr chauff e pendant 10 min 80 C Remarque sur la proc dure Certain types de tissus tel le tissue mammaire n ces sitent un temps d incubation plus long 30 60 minutes 6 Rincer la lame dans un bain d eau distill e et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 7 Mettre la lame soit dans une chambre humide ou dans un Thermobrite Couvrir la zone cible avec au moins 100 mL de pepsine 0 4 garder la lame en cours d incubation dans des conditions humides Ne pas laisser l chantillon se dess cher 8 Incuber pendant 10 min 37 C Remarque sur la proc dure Cette dur e peut devoir tre ajust e en fonction des conditions de fixation et de l ge de la coupe 9 Rincer la lame pendant 5 min dans de l eau distill e TA 10 Rincer la lame en deux bains de SSC 2X de 5 min chacun TA Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air Ww 11 Incuber la lame dans du formol neutre tamponn 10 pendant 15 min TA 12 Rincer la lame en 2 changements de SSC 2X de 5 min chacun TA 13 Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer la sonde DNA FISH pendant 2 3 secondes et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH la zone cible sur la lame et la recou vrir
8. d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 5 min 90 C sur une plaque chauffante temp rature contr l e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Ne pas laisser la lame s cher avant la fin des lavages 1 1 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 2 Tremper la lame dans la solution SSC 2X TA et retirer la lamelle couvre objet 3 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C Rincer la lame en la trempant dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe 6 Appliquer 20 uL de DAPI antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm Remarque sur la proc dure Selon la fixation l ge de la coupe et les conditions de pr traitement on peut apercevoir un bruit de fond vert Si le bruit de fond vert est excessif ou interf re avec l attribution de score les lames peuvent tre re
9. lav es de mani re plus stringente U Avant le relavage retirer l antifade en enlevant la lamelle couvre objet et en proc dant au lavage en deux changements de solution SSC 2X Tween 20 0 1 de 5 min chacun avec agitation TA Proc der imm diatement au relavage ne pas laisser la lame s cher La stringence peut tre accrue en ajoutant une tape de lavage de 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C Une stringence sup pl mentaire peut tre obtenue en augmentant la dur e de lavage et ou la tem p rature jusqu 65 C Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe les 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation mission a ax Verte DAPI Suite la page suirante Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c es
10. mpon phosphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tournoyant Conserver TA MgCl 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de MgCl2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure Standard for FISH Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul e un e technologiste m dical e familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis est du sang p riph rique et la moelle osseuse Les lames doi vent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Toutes les lames fra chement pr par es doivent tre vieillies pendant 1 heure et demie 45 50 C avant l hybridation Si l hybridation n a pas lieu le m me jour que la pr paration conserver les lames 4 C ou 20 C Les lames avec des cellules cytoplasme visible peuvent n cessiter un pr trai tement l aide d un enzyme prot olytique du type pepsine voir pr
11. propre peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler tous les r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Le formamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mutag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPI estun irritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus 5 ALK rouge et au fluoro phore pour le locus 3 ALK vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microtube centrifuger tanol 100 Lamelles couvre objets 0 5 mL PBS 10X 22x22 e 25x25
12. ssu pr vu L utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissent faibles La technique FISH sur m taphase est recommand e pour caract riser les variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques Le test FISH est consid r comme une adjonction la cytog n tique classique caryotype Les r sultats de ces tests doivent tre interpr t s dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d cision m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sultats du test FISH Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in D Risques biologiques vitro REF Num ro de catalogue 4N Conserver l abri de la lumi re du A Attention consulter la documenta soleil tion d accompagnement M Fabricant CE Marquage CE de conformit X Limite sup rieure de temp rature Y Contient suffisamment pour 10 tests Utiliser avant le Bibliographie 1 Huret J L et al www AtlasGeneticsOncology org 2 Drexler H G et al Leukemia 2000 14 9 p 1533 59 3 Freeman A et al Mod Pathol 2004 17 7 p 765 71 4 Sukov W R et al Mod Pathol 2007 20 5 p 592 603 5 Kim H R et al Cancer 2011 June 30 6 Gerber D E et al Cancer Cell 2010 18 6 p 548 51 7 Camidge D R et al
13. t pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans les noyaux normaux en interphase et les chromosomes en m ta phase la sonde DNA FISH ALK Break Apart g n re deux signaux de fusion rouge vert ou jaune correspondant aux deux chromosomes 2 normaux Dans les cellules avec r arrangements chromosomiques mettant en jeu le g ne ALK le mod le le plus couramment observ est un signal de fu sion repr sentant le chromosome 2 normal ainsi qu un signal rouge et un signal vert repr sentant les chromosomes d riv s Recommendations and limitations Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de sang p riph rique et de moelle osseuse et FFPE confor m ment aux m thodes cytog n tiques courantes Le fabricant garantit que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensibilit sp cificit reproductibilit et intervalle de validit tablies sur du sang p riph rique normal ou des tissus pr vus Chaque nouveau lot de sonde DNA FISH doit tre test pour la sp cificit du locus sur un sp cimen de sang p riph rique normal et sur le tissu pr vu pour v rifier la bonne performance du r actif Il incombe au labo ratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de controle positifs et n gatifs du ti
14. tites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 3 min 80 C sur une plaque chauffante temp rature control e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Eviter de faire s cher la lame avant que le lavage soit fini 1 Pr chauffer les solutions de SSC 2X Tween 20 0 1 et de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 2 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 3 Tremper bri vement la lame dans la solution de SSC 2X TA Retirer la lamelle couvre objet 4 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C 5 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 6 Rincer bri vement la lame dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe 8 Appliquer 20 uL de DAPI Antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm N Proc dure pour section FFPE Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul un e technologiste familiaris e avec les m thodes
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