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4.3.2 Le G-CSF - Papyrus

1. 126 90 Hodohara K Fujiji N Yamamoto N et Kaushansky K Stromal cell derived factor 1 SDF 1 acts together with thrombopoietin ti enhance the development of megakaycytic progenitor cells CBlood 2000 95 p 769 775 Lataillade JJ Clay D Dupuy C Rigal S Jasmin C Bourin P Le Bousse Kerdiles MC Chemokine SDF 1 enhances circulating CD34 cells proliferation in synergy with cytokines Possible role in progenitor survival Blood 2000 95 p 756 768 Voermans C Kooi MLK Rodenhuis S van der Lelie H van der Shoot CE et Gerritsen WR n vitro migratory capacity of CD34 cells in related to hematopoietic recovery after autologous stem cell transplantation Blood 2001 97 p 799 804 Ara T Itoi M Kawabata K Egawa T Tokoyoda K Sugiyama T Fujii N Amagai T et NAgasawa T role of CXC chemokine ligand 12 stromal cell derived factor l pre b cell growth stimulating factor and its receptor CXCR4 in fetal and adult T cell development in vivo J Immunol 2003 170 p 4649 4655 Fassas A Fox M Calandra G et Tricot G Successful mobilization of peripheral blood stem cell PBSCs with ADM3100 in patients failing to collect with hematopoietic growth factors HGF and or chemotherapy ASCO Meeting Abstract 2004 22 Zhong R Law P Wong D Merzouk A Salari H et Ball ED Small peptide analogs to stromal derived factor 1 enhance chemotactic migration of human and mouse hematopoietic cells Exp Hematol 2004 32 p 470
2. 46 MATERIALS AND METHODS Mice Eight to 12 week old female C57BL 6J mice were purchased from Charles River Wilmington MA All mice were allowed to acclimate at least one week prior to their use for experimentation All in vivo manipulations were approved by the Comit Institutionnel des Bonnes Pratiques Animales en Recherche of CHU Ste Justine protocol number S10 32 Isolation purification and characterization of mesenchymal stromal cells Bone marrow was collected by flushing tibias femurs and iliacs from C57BL 6J mice in phosphate buffer solution Cleaned bones were next cut in small fragments of 1 2 mm and digested for 45 minutes with 0 25 collagenase type 1 Sigma St Louis MO Bone marrow derived stromal cells were isolated based on their property to attach to polystyrene following culture for 7 days in a MEM containing 10 fetal bovine serum and 1 penicillin streptomycin Stromal population was then expanded for 2 4 passages corresponding to 6 12 population doublings in 3 oxygen and its phenotype confirmed by flow cytometry using the following antibodies Ter119 CD31 CD45 CD44 CD90 and CD105 all purchased from BioLegend SanDiego CA Otherwise fresh non cultured bone marrow derived stromal cells were isolated using the EasySep amp negative selection kit for mesenchymal progenitors StemCell Technologies Vancouver BC from tibias and femurs of C57BL 6 mice Procedure was followed as recommanded by the manu
3. MSC TET CTR ens ERLEM mE MSC 40000 30000 20000 10000 Fortin and al figure 2 66 KKK N anwiay Bd 4S9 Dw 2d 1w CTR Fortin and al Figure 3 67 A 0 601 pb 812pb az G CSFR Extracellular region Intracellular region 0 601pb D Soluble G CSFR Extracellular region B Lysate CM CR GLSFRSIGCSFR COR G CSFR soiG CSFR G CSFR SFR solG CSFR Actin 100 ng ml 32 o 02 2 20 E C Kami JS m GCS a CMMSCsolG CSFR gt CMMSC x 60 PER 40 5 M 20 ot 0 2 2 20 G CSF ng ml Fortin and al figure 4 68 EN DO D1 D2 IR 8 Gy Sacrifice WBM c CFSE MSC G CSFR solG CSFR G CSFR e n e Absolute number of CFSE cells femur CTR MSC solG CSFR CFSE cells femur Absolute number of Fortin and al figure 5 69 SUPPLEMENTARY MATERIAL Negative selection of CD45 Ter119 cells Mesenchymal progenitor enriched cells suspension 4 0x10 3 0 1095 3 2 0x10 40000 20000 Count cell mouse BP AP MSC Figure S1 Isolation and purification of mouse mesenchymal progenitors A EasySep negative selection kit procedure for mesenchymal progenitors purification StemCell Technologies Vancouver BC B Count of cells per mouse obtained from collagenase treated bone before purification BP in comparison with the cell recovery after purif
4. la moelle osseuse 203 204 Suite une co transplantation il a aussi t d montr que les cellules stromales de la moelle demeure d origine du receveur dans la majorit des patients 201 205 207 Finalement plusieurs r sultats mettent en vidence l implication des CSM dans la prise de greffe h matopoi tique Cependant d autres tudes devront tre men es afin de mieux comprendre les m canismes induits par les CSM CHAPITRE VI 6 1 HYPOTH SES DE TRAVAIL La r paration de tissus endommag s par l utilisation de cellules souches d riv es de la moelle osseuse ou du sang repr sente une approche novatrice en m decine r g n rative Lors de greffes h matopo tiques le patient est conditionn par de la chimioth rapie et de l irradiation afin d liminer les cellules h matopo tiques et souvent canc reuses du receveur Malheureusement ces traitements endommagent aussi l os du receveur dont les CSM ayant la capacit de se diff rencier en plusieurs types cellulaires formant une niche osseuse aux cellules h matopoi tiques Les causes mol culaires impliqu es dans le nichage des cellules h matopoi tiques la moelle sont encore inconnues Cependant nous avons remarqu la s cr tion d une cytokine G CSF dans l espace m dullaire suite l irradiation Notre hypoth se de travail est que l alt ration du microenvironnement osseux aurait un impact limitant sur la prise de greffe h matopoi
5. O Reilly M et Gamelli RL Indomethacin augments granulocyte macrophage colony stimulating factor induced hematopoiesis following 5 FU treatment Exp Hematol 1990 18 9 p 974 978 Lu L Pelus LM et Broxmeyer HE Modulation of the expression of HLA DR la antigens and the proliferation of human erythroid BFU E multipotential CFU GEMM progenitor cells by prostaglandin E Exp Hematol 1984 12 9 p 741 748 Pelus LM Broxmeyer HE Kurland JI et Moore MA Regulation of macrophage and granulocyte proliferation specificities of prostaglandin E and lactoferrin J Exp Med 1979 150 p 277 292 Pelus LM Broxmeyer HE et Moore MA Regulation of human myelopoiesis by prostaglandin E and latoferrin Cell Tissue Kidnet 1981 14 p 515 526 Gentile P Byer D et Pelus LM Jn vivo modulation of murine myelopoiesis following intravenous asministration of prostaglandin E2 Blood 1983 62 p 1100 1107 Lu L Pelus LM Piacibello W et al Prostaglandin E acts two levels o enhance colony formation in vitro by erythroid BFU E progenitor cells Exp Hematol 1987 15 p 765 771 Yoshida K Oida H Kobayashi T et al Stimulation of bone formation and prevention of bone loss by prostaglandin E EP4 rceptor activation Proc Natl Acad Sci U S A 2002 99 7 p 4580 4585 Chyun YS et Raisz LG Stimulation of bone formation by prostaglandin E2 prostagladins 1984 27 1 p 97 103 Jee WS Ueno K Deng YP et Woodbury DM The effects
6. 37 Puisque les CSM expriment normalement la forme membranaire du r cepteur du G CSF il se pourrait que cela emp che mais de fa on limit e l effet mobilisateur du G CSF De plus le ph notype s cr toire des CSM tant peu connu il est fort probable que les CSM par le biais d autres mol cules pourraient am liorer le nichage des CSH Cependant d autres tudes devront tre effectu es afin de d terminer quelles sont les voies impliqu es dans ce processus Malgr ces r sultats encourageant il a y encore place optimisation car nous somme encore une fois loin de retrouver le niveau basal de nichage sans irradiation Vu la quantit de cellules inject es soit de 15x10 il est peu concevable de vouloir am liorer la th rapie en augmentant le nombre de cellules Cependant il serait possible de modifier g n tiquement les CSM afin qu elles produisent davantage la prot ine d int r t De plus d autres essais TT doivent tre effectu s en ce qui attrait au temps d injection apr s irradiation En effet nous avons d montr in vitro les CSM solG CSFR produisait le solG CSF cependant nous n avons pas d montr que cette mol cule est synth tis e in vivo pour toute la p riode pr c dant la transplantation h matopoi tique Il serait int ressant de refaire cette exp rience avec diff rents temps d injections de CSM solG CSFR afin d valuer la p riode optimale favorisant le nichage h matopoi tique
7. 605 631 84 Spradling A Drummond Barbosa D et Kai T Stem cells find their niche Nature 2001 414 p 98 104 85 Lin H The stem cell niche theory lessons from flies Nat Rev Genet 2002 3 p 931 940 86 Schofiels R The relationship between the spleen colony forming cell and the hematopoietic stem cell Blood Cells 1978 4 p 7 25 87 Muguruma Y et al Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mensenchymal stem cells in th emurine bone marrow compartment Blood 2006 107 p 1878 1887 88 Lapidot T Dar A et Kollet O How do stem cells find thier way home Blood 2005 106 p 1901 1910 89 Cancelas JA et Williams DA Stem cell mobilization by beta2 agonist Nat med 2006 12 p 278 279 90 Devine MJ Mierish CM Jang E Anderson PC et Balian G Transplanted bone marrow cells localize to fracture callus in a mouse model J Orthop Res 2002 20 p 1232 1239 91 Tong Yin et Linheng Li The stem cell niches in bone J Clin Invest 2006 116 5 p 1995 1201 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 88 Taichman RS Reilley MJ et Emerson SG Human osteoblasts support human hematopoietic progennitor cells in vitro bone marrow cultures Blood 1996 87 p 518 524 Taichman R Reilly M Verma R Ehrenman K et Emmerson S Hepatocyte growth factor is secreted by osteoblasts and cooperatively permits the survival of h
8. Afin d valuer plus pr cis ment le rendement du nichage h matopo tique via le blocage du G CSF et de contrer la probl matique de la quantit de cellules pouvant tre inject e chez la souris nous avons reproduit le principe du mod le exp rimental pr c dant en rempla ant l injection de CSM par du milieu conditionn s cr t par celles ci Les r sultats d montrent une diff rence significative d am lioration du nichage h matopoi tique avec une th rapie de milieu conditionn de CSM solG CSFR comparativement au contr le sans milieu conditionn N anmoins cette approche confirme notre hypoth se selon laquelle le G CSF a un impact limitant sur le nichage h matopo tique Cependant contrairement au mod le pr c dent la th rapie base de milieu conditionn de CSM non modifi es g n tiquement n am liore pas de facon significative le nichage des CSH la moelle osseuse Cela pourrait s expliquer par le fait que les r cepteurs du G CSF exprim s en surface des CSM sont absents dans le milieu conditionn s cr t par celles ci et n ont donc aucun impact sur le nichage h matopoi tique Encore une fois il y a place optimisation Avec l utilisation de milieu conditionn il y a une augmentation du nichage de 35 comparativement 90 pour la th rapie cellulaire de CSM solG CSFR Cette diff rence pourrait s expliquer par le fait qu on ne connait pas le temps de demi vie du r cepteur soluble ni son affin
9. Les agents alkylants sont nomm s ainsi car ils ont la capacit d ajouter un groupe alkyle aux groupes lectron gatifs pr sents dans les cellules canc reuses et les cellules normales Ils arr tent la croissance de la tumeur en liant ensemble les nucl otides guanines dans la double h lice d ADN Ce mode d action place les cellules dans l incapacit de r pliquer leur ADN donc de se diviser 44 45 Ces agents n agissent g n ralement pas de facon sp cifique 11 De plus certains n cessitent une conversion in vivo en substances actives le cyclophosphamide par exemple 46 47 Les alcaloides bloquent la division cellulaire en emp chant la synth se des microtubules et la formation du fuseau mitotique La croissance tumorale est alors arr t e puisque que ce fuseau est vital pour la division cellulaire 48 Les inhibiteurs de topoisom rases sont des enzymes essentielles qui maintiennent la topologie de l ADN L inhibition de la topoisom rase de type I ou de type II g nent a la fois la transcription et la r plication de l ADN en alt rant le superenroulement de l ADN Ce type d agent bloque le cycle cellulaire en phase S G2 48 Les antim tabolites sont des mol cules qui prennent la place des nucl otides purines ou pirimidines des composantes l mentaires de l ADN Ces l ments s incorporent l ADN lors de la phase S du cycle cellulaire ce qui a pour effet d arr ter le d veloppement et la division cel
10. Mabuchi Y Kubota Y Nagai Y Niibe K Hiratsu E Suzuki S Miyauchi Hara C Nagoshi N Sunabori T Shimmura S Miyawaki A Nakagawa T Suda T Okano H et Matsuzaki Y Prospective identification isolation and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murin bone marrow J Exp Med 2009 206 11 p 2483 2496 Cilloni D CArl Stella C Falzetti F Sammarelli G Regazzi E Colla S et al Limited engrafiment capacity of bone marrow derived mesenchymal cells following T cell depleted hematopoietic stem cell transplantation Blood 2000 96 p 3637 3643 Pozzi S Lisini D Podest M Bernardo ME Sessarego N Piaggio G et al Donor multipotent mesenchymal stromal cells may engraft in pediatric patients given either cord blood or bone marrow transplantation Exp Hematol 2006 34 p 934 942 Horwitz EM Prockop DJ Fitzpatrick LA Koo WW Gordon PL Neel M et al Transplantability and therapeutic effects of bone marrow derived mesenchymal cells in children with osteogenesis omperfecta Nat med 1999 5 p 309 313 Hart C Drewel D Mueller G Grassinger J Zaiss M Kunk Schughart LA Andreesen R Reichle A Holler E et Hennemann B Expression and function of homing essential molecules and enhanced in vivo homing ability of human peripheral blodd derived hematopoietic progenitor cells after stimulation with stem cell factor Stem Cells 2004 22 p 580 589 Spencer A Jackson J et Baulch Brown C Enumeration of bone
11. Rohde E et al Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical scale expansion of functional mesenchymal stromal cells Transfusion 2007 47 p 1436 1446 M ller I Kordowich S Spano C Isensee G Staiber A Veibaln S Gieseke F Langer H Horwitz EM Conte P Handgretinger R et Dominici M Animal serum free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM Cytotherapy 2006 8 5 p 437 444 Soncini M Vertua E Gibelli L et al solation and characterization of mesenchymal cells from human fetal membranes Journal Of Tissue Engineering And Regenerative Medicine 2007 1 p 296 305 Hou L Cao H Wang D et al Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron like cells in vitro International Journal of Hematology 2003 78 p 256 261 Yang XS Wu HX et Xiao B Human mesenchymal stem cells differentiate into neuron like cells and show SMN protein expression Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2005 85 p 1125 1128 Aurich H Sgodda M Kaltwasser P et al Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from human adipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo Gut 2009 58 p 570 581 Aggarwal S Pittenger MF Human mesenchymal stem cells modulate allogenic immune cell responses Blood 2005 105 p 1815 1822 Ankrum J Karp JM Mesenchymal stem cell therapy Two steps forward one step back Mol Med 2010 16 p 203
12. cette proc dure ne permet d obtenir qu un nombre limit de cellules purifi d environ 2 3x10 par souris Comme des tudes montrent que la culture de CSM leur fait perdre certaines de leur caract ristiques souches 204 l utilisation de cellules fra ches non cultiv es in vitro est un facteur restreignant quant la quantit que nous pouvons injecter lors de nos exp rimentations Cependant afin d obtenir de meilleurs r sultats il serait int ressant d effectuer une th rapie avec un plus grand nombre de CSM afin de pouvoir d terminer si nous pouvons am liorer davantage le nichage h matopoi tique N anmoins avec aussi peu de CSM nous avons obtenu des r sultats encourageant ce qui d montre l importance et l efficacit des CSM au microenvironnement osseux D autres essais devraient tre effectu s dans le but d optimiser le mode le exp rimental En effet nous avons suppos qu une p riode de 5 jours tait n cessaire et suffisante pour que les CSM inject es aient le temps de migrer la niche osseuse et de r g n rer le microenvironnement endommag par l irradiation Cependant si cette p riode est trop longue la repopulation h matopoi tique se fera partir des cellules h matopoi tiques de l h te au 75 d triment des cellules transplant es ce qui va diminuer les r sultats de nichage Si cette p riode est trop courte peut tre que nous n obtenons qu un aper u partiel des capacit
13. g n ration tissulaire dans plusieurs organes tels que le foie 136 le c ur 137 138 le cerveau 139 les reins 140 et de la peau 141 28 4 3 2 Le G CSF Le G CSF aussi connu sous nom de colony stimulating factor 3 CSF 3 a t reconnu et purifier pour la premi re fois en 1983 chez la souris 142 tandis que la forme humaine n a t clon e qu en 1986 143 144 Le g ne du G CSF contient 4 introns et m ne la formation de 2 polypeptides par pissage diff rentiel de l ARNm 143 Le r cepteur du G CSF est une prot ine transmembranaire avec une large r gion extracellulaire incluant les domaines immunoglobuline like trois domaines fibronectines de type III et le domaine d homologie des r cepteurs de cytokines CRH poss dant une signature de r sidus de cyst ines et un motif de 5 acides amin s W S X W S caract ristique de la classe I de la superfamille des r cepteurs de cytokine 145 Domaine Ig cc Domaine cc CRH R gion WSXWS extracellulaire Domaines fibronectine type III R gion transmembranaire Boite 1 Boite 2 R gion Y intracellulaire Boite 3 Y Y Figure 6 Structure du r cepteur du G CSF 145 29 La r gion intracellulaire n a pas d activit tyrosine kinase intrins que mais contient 2 motifs conserv s de la membrane proximale Box 1 et Box 2 induisant l activation de la kinase Jak ainsi que le motif distal Box 3 commun la sous f
14. pour tout le plaisir qu on a eu ensemble Je remercie galement Oahn notre assistante de recherche pour sa disponibilit et support constant Je remercie aussi tous les autres membres du laboratoire Basma Vimal et Genevi ve ainsi que toute l quipe du Dr Haddad pour tous les bons moments pass s ensemble CHAPITRE I INTRODUCTION G N RALE 1 1 MISE EN CONTEXTE En 2011 il est estim qu il y aura au Qu bec 46 500 nouveaux cas de cancer et plus de 20 000 d c s qui y sont reli s Le nombre de nouveaux cas continu de croitre mesure que la population augmente et vieillit car le risque d tre atteint d un cancer augmente drastiquement avec l ge 1 Les patients atteints du cancer re oivent des traitements base de drogues chimioth rapie et de radiations ionisantes radioth rapie Ces r gimes sont utilis s seuls ou en combinaison pour leur effet anti tumoral visant enrayer les cellules canc reuses De plus ils sont pratiqu s comme conditionnement pour leur effet immunosuppresseur liminant les cellules du syst me immunitaire Des probl matiques observ es lors du r tablissement des patients atteints du cancer est que le conditionnement induit des complications telles que le d veloppement d un second cancer et des retards de r g n ration et r parations tissulaire Plusieurs tudes voquent l impact majeur du conditionnement quant aux effets secondaires long terme De plus les cellules s
15. 209 Murphy A Cancedda R et Quarto R Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model Nat Immunol 2000 11 p 674 680 Mahmood A Lu D Lu M et Choop M Treatment of traumatic brain injury in adult rats with in adult rats with intravenous asministration of human marrow stromal cells Neurosurgery 2003 53 697 702 87 78 Block GJ Ohkouchi S Fung F Frenkel J Gregory C Pochampally R DiMattia G Sullivan DE et Prockop DJ Multipotent stromal cells are activated to reduce apoptosis in part by upregulation and secretion of stanniocalcin 1 Stem Cells 2009 27 p 670 681 79 Chen L Tredget EE Wu PY et Wu Y Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing PLoS One 3 2008 e1886 80 Karp JM and Leng Toe GS Mesenchymal stem cell homing the devil is in the details Cell Stem Cell 2009 4 p 206 216 81 Asari S Itakura S Ferreri K Liu CP Kuroda Y Kandeel F et Mullen Y Mesenchymal stem cells suppress B cell terminal differentiation Exp Hematol 2009 37 p 604 615 82 Arinzeh TL Peter SJ Archambault MP van den Bos S Gordon S Kraus K Smith A et Kadiyala S Allogenic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical sized canine segmental defect J Bone Joint Surg Am 2003 85 A p 1927 1935 83 LiL et Xie T Stem cell niche structure and function 2005 21 p
16. 67 Il n y a pas de marqueur sp cifique aux CSM cependant une panoplie de marqueurs est utilis e pour d finir cette population cellulaire Les CSM doivent exprimer leur surface des mol cules telles que le CD29 CD73 CD90 CD105 CD106 CD140 et CD166 mais ne doivent en aucun cas exprimer de CD31 CD45 CD34 CD14 CD133 et de CMH de classe II 68 70 Les CSM sont multipotentes c est dire qu elles peuvent se diff rencier en plusieurs types cellulaires cellules nerveuses de cartilage etc et elles ont en plus la capacit d auto renouvellement 71 73 Au niveau de la moelle osseuse les CSH constituent une population rare de prog niteurs multipotents capables de soutenir l h matopoi se par leur diff renciation en ost ocytes chondrocytes cellules musculaires lisses et adipocytes formant le microenvironnement osseux 74 Les CSM isol es d autres tissus d montrent cette m me capacit de diff renciation selon les conditions in vitro 75 Par leur potentiel de diff renciation multipotente les CSM peuvent aussi r parer les tissus et organes en rempla ant les cellules endommag es 76 77 De plus en r ponse une l sion tissulaire les CSM peuvent migrer au site endommag et aider sa r paration par la production de mol cules telles que des facteurs de croissances des cytokines et des antioxydants leur procurant la capacit de moduler la r ponse immunitaire 78 80 En culture il a t d mont
17. A 1 2 Injection of conditioned media containing solG CSFR decoy did not improve hematopoietic reconstitution post IR in NOG mice model NOG irradiated 6 Gy mice were injected intraperitoneally or not with conditioned media containing solG CSFR decoy prior to transplantation of 1x10 CD34 cord blood derived cells Peripheral blood engraftment 6 weeks following transplantation was determined by flow cytometry analysis of the proportion of CD45 CD19 and CD3 cells using hCD45 hCD19 and hCD3 antibodies Biolegend SanDiego CA n 6 7 mice per group
18. CJ Functional differences between transplantable human hematopoietic stem cells from fetal liver cord blood and adult marrow Exp Hematol 1999 27 p 1418 1427 Wang JC Doedens M Dick JE Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mibilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID repopulating cell assay Blood 1997 89 p 3919 3924 Lord BI Woolford LB et Wood LM Mobilization of early hematopoietic progenitor cells with BB 1000 A genetically engineered variant of human macrophage inflammatory protein 1 alpha Blood 1995 85 p 3412 3415 Trentin JJ Influence of hematopoietic organ stroma hematopoietc inductive microenvironments on stem cell diffrentiation In GordonA ed Regulation of Hematopoiesis New York Appleton Century Crafts 1970 8 p 469 500 Wolf NS The haematopoietic microenvironment Clinical haematology 1979 8 p 469 500 Larochelle A Vormoor J Hanenberg H et al dentification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating NOD SCID mouse bone marrow Implications for gene therapy Nat med 1996 2 p 1329 1337 Peled A Petit I Kollet O et al Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of nOD SCID mice on CXCR4 Science 1999 283 p 845 848 Kollet O Petit I Kahn J et al Human CD34 CXCR4 sorted cells harbor intracellular CXCR4 which can be functionally expressed and pr
19. ageing Mutat Res 2011 728 p 12 22 Kohn KW Beyong DNA crossing linking history and prospects of DNA targeted cancer treatment fifteenth Cancer Res 1996 56 p 5533 5546 Hurley LH DNA and its associated processes as targets for cancer therapy Nat Rev Cancer 2002 2 p 188 200 Matalon ST Ornoy A Lishner M Review of the potential effects of three commonly used antineoplastic and immunosuppressive drugs cyclophosphomide azathiioprine doxobicin on the embryo and placenta Reprod Toxicol 2004 18 2 p 219 230 Scott RB Cancer chemotherapy The first twenty five years British Med Journal 1970 4 p 259 265 Pazdur R Wagman LD Camphausen KA Hoskins WJ Cancer management multidisciplinary approach Cancer Management Handbook 2008 11 Ortho Multicenter Transplant Study Group A randomized clinical trial of OKT3 monoclonal antibody for acute rejection of cadaveric renal transplant N Engl J Med 1985 313 p 337 342 Vincenti F Current use and future trends in induction therapy Saudi J Kidney Dis Transplan 2005 16 4 p 506 513 Fausel C Targeted chronic myeloid leukemia therapy seeking a cure J Manag Care Pharm 2007 13 p 8 12 Storb R Raff FR Appelbaum FR et al Appelbaum FR et al What irradiation dose for DLA identical canine marrow grafts Blood 1988 72 p 1300 1304 33 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 85 Storb R Raff
20. cellules souches h matopo tiques endommag es lors des traitements de chimioth rapie et radioth rapie Dans les cas de maladies h matologiques et cancers sanguins ces traitements ont pour but d radiquer les cellules pathologiques de la moelle osseuse avant d effectuer la transplantation h matopoi tique Dans les autres cas de cancers la transplantation est n cessaire car la chimioth rapie et radioth rapie visant les cellules canc reuses ont aussi pour effet d alt rer les cellules h matopo tiques saines du patient Le tissu h matopoi tique tant tr s sensible ces traitements m ne une diminution en cellules sanguines et plaquettes et augmente ainsi la susceptibilit aux infections et h morragies 10 La transplantation a alors pour but de reconstituer les CSH chez les patients subissant la chimioth rapie et ou la radioth rapie Les greffes de moelle osseuse sont des proc dures difficiles D abord le nombre de cellules souches greffer est un facteur limitant qui peut compromettre la r ussite de la greffe h matopoi tique En clinique les CSH transplant es proviennent de pr l vements de sang p riph rique mobilis de sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse Le sang de cordon ombilical comme source de CSH est tr s int ressante et poss de plusieurs avantages comparativement la moelle osseuse Notamment il y a l acc s et la disponibilit du mat riel biologique une fr quenc
21. cules m diant le signalement et les interactions lors de l adh sion entre les cellules souches et leurs niches peuvent influencer le comportement des CSH directement ou indirectement via leur action sur leur niche Les mol cules impliqu es dans la signalisation r gulant la niche sont par exemple SCF c Kit Jagged Notch angiopoi tine 1 Tie2 Ang l Tie2 et le r cepteur sensible au Ca CaR 59 95 105 107 mais d autres mol cules sont connues pour jouer un r le dans la r gulation des cellules souches telles que Wnt BMP TPO IL 3 et IL 6 Les mol cules d adh sion d terminantes pour la fonctionnalit de la niche osseuse incluent N cadh rine D cat nine vascular cell adhesion protein integrin VCAM int grine et ost opontine int grine b1 60 83 108 Ces mol cules jouent un r le pour l attachement ou la migration des cellules souches la niche Par exemple la N cadh rine et la B cat nine sont localis es l interface entre les CSH et la niche ost oblastique ce qui facilite l ancrage des CSH cette niche 57 Des tudes ont d montr le r le des int grines dans la m diation de la migration et du nichage de CSH l aide d anticorps bloquant 109 Par exemple il a t d couvert que l ost opontine contribue la migration des CSH de la moelle osseuse vers la r gion de l endoste via leurs interactions avec l int grine p 60 108 26 4 3 LES CYTOKINES 4 3 1 Le facteur de diff renciation
22. l irradiation L irradiation perturbe le d roulement du cycle cellulaire dans la phase plus radiosensible soit G2 et M 40 41 De par l interf rence avec la mitose ce sont les tissus qui se r g n rent le plus rapidement qui sont principalement touch s comme la moelle osseuse la peau l intestin les gonades les ovocytes et les voies respiratoires Il existe des syst mes de d fense cellulaire afin de r parer ces dommages Souvent la r paration sera efficace Cependant dans les cas o les r parations sont imparfaites les dommages l ADN induits par la gamma irradiation peuvent conduire la s nescence Ce ph nom ne implique l arr t permanent et irr versible de la prolif ration cellulaire en phase G1 42 Aussi les cellules peuvent aller jusqu d clencher un cancer des ann es apr s l irradiation De plus si les d g ts sont trop importants les cellules seront limin es via le processus de mort cellulaire programm e l apoptose 43 de tr s fortes doses d irradiation les syst mes de d fense ne sont plus assez efficaces et l importante mortalit cellulaire perturbe les fonctions vitales pouvant aller jusqu au d c s Donc malgr que ce type de conditionnement soit tr s efficace pour enrayer les cellules canc reuses les traitements my loablatifs par irradiation de forte intensit sont malheureusement associ s une toxicit importante qui restreint leur utilisation seulement chez le
23. low level of these cells returning back to the marrow approximately 1 a term referred to as homing can translate into an increased risk of graft failure and delayed hematopoietic engraftment 2 Low level homing is observed independently of the source of HSC injected and therefore numerous efforts have been made to enhance this important physiological process Our comprehension of homing is limited to the role of some adhesion molecules and cytokines In particular the stromal cell derived factor 1 alpha SDF 1a a chemoattractive cytokine present in the marrow niche has an important role in homing of HSC 3 4 Conversely injection of the granulocyte cell stimulating factor G CSF a cytokine playing an essential role in granulopoiesis induces rapid stem cell mobilization and thus the egress of HSC from the bone marrow 5 6 Different approaches are being investigated to increase homing and engraftment The injection of a higher number of HSC through the recent development of ex vivo expansion techniques although an attractive strategy will likely face safety issues 7 Alternatively some have tried to increase homing by inhibiting a specific peptidase CD26 responsible for the truncation and inactivation of SDF la 8 9 Others have looked into injecting HSC directly into the iliac crest as a way to circumvent the need for homing 10 11 The results from these approaches most of which are currently being tested in phase I
24. marrow homing haematopoietic stem cell from G CSF mobilised normal donors and influence on engraftment following allogenic transplantation 2001 28 11 p 1019 1022 Oostendorp RAJ Ghaffari S et Eaves CJ Kinetics of in vivo homing and recruitment into cycle of hematopoietic cells are organ specific but CD44 independent Bone Marrow Transplant 2000 26 5 p 559 566 Gyurkocza B Rezvani et Storb RF Allogeneic hematopoietic transplantation the state of the art Expert Rev Hematol 2010 3 3 p 285 299 Qiu Y Zhuang D MacRae A et Dong F The G CSF receptor carboxyl terminus truncated in AML SCN is required for induction of a Stat5 protease activity Leuk Res 2005 29 p 1153 1162 Cao S Wu C Yang Y Sniderhan LF Maggirwar SB Dewhurst S et Lu Y Lentiviral vector mediated stable expression of sTNFR Fc in human macrophage and neuronal cells as a potential therapy for neuroAIDS J Neuroinflammation 2011 8 214 215 216 217 218 99 Ito M et al NOD SCID ynull mouse an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells Blood 2002 100 9 p 3175 3182 Shimoji K Yuasa S Onizuka T Hattori F Tanaka T Hara M Ohno Y Chen H Egasgira T Seki T Yae K Koshinizu U Ogawa S et Fukuda K G CSF promotes the proliferation of developing cardiomyocytes in vivo and in derivation from ESCs ans iPSCs Cell Stem Cell 2010 6 p 227 237 Abkowitz JL Robinson AE Kale S Long MW et Chen J M
25. of prostaglandin E2 in growing rats increased metaphyseal hard tissue and cortico endosteal bone formation Calcif Tissue Int 1985 37 2 p 148 157 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 95 Jee WS Ueno K Kimmel DB Woodbury DM Price P et Woodbury LA The role of bone cells in increasing metaphyseal hard tissue in rapidly growing rats treated with prostaglandin E2 Bone 1987 8 3 p 171 178 Mori S Jee WS Li XJ Chan S et Kimmel DB Effects of prostaglandin E2 on production of new cancellous bone in the axial skeleton of ovariectomized rats Bone 1990 11 2 p 103 113 Jee WS Ke HZ et Li XJ Long term effects of prostaglandin E2 on tibial diaphyseal bone in male rats Bone Miner 1991 15 1 p 33 55 Yang RS Liu TK et Lin Shiau SY Increased bone growth by local prostaglandin E2 in rats Calcif Tissue Int 1993 52 1 p 57 61 Weired M Suponitzky I et Keila S Systemic administration of an anabolic dose of PGE2 in young rats increases the osteogenic capacity of bone marrow Bone 1997 20 6 p 521 526 Rodan SB Rodan GA Simmons HA Walenga RW Feinstein MB et Raisz LG Bone resorptive factor produced by osteosarcoma cells with osteoblastic features is PGE2 Biochem Biophys Res Commun 1981 102 4 p 1358 1365 Ono K Kaneko H Choudhary S et al Biphasic effect of prostaglandin E2 on osteoclast formation in spleen cell cultures role of the EP2 rece
26. s des CSM am liorer le nichage h matopo tique Une mise au point de la p riode optimale entre l injection de CSM et la greffe h matopoi tique devrait tre effectu e afin d obtenir de meilleurs rendements de nichage Bien que plusieurs vidences laissent sugg rer que l efficacit de nichage h matopoi tique d pend du dommage au microenvironnement il semble que la r paration de celui ci par les CSM ne soit pas la seule strat gie pour am liorer le nichage h matopoi tique Au cours de ce projet de recherche nous avons d montr que le niveau de la cytokine G CSF tait augment dans la moelle osseuse suite l irradiation Comme le G CSF est connu pour tre un mobilisateur des CSH nous croyons que l augmentation de cette cytokine dans l espace m dullaire pourrait avoir un impact limitant sur le nichage des CSH Notre objectif tait donc de d terminer si le blocage transitoire du G CSF pourrait am liorer le nichage h matopoi tique Pour ce faire nous avons modifi g n tiquement des CSM afin qu elles surexpriment le r cepteur soluble du G CSF solG CSFR Le but tant que le solG CSFR soit s cr t par les CSM afin de s questrer transitoirement le G CSF circulant Nous avons d abord v rifi la fonctionnalit in vitro du solG CSFR en d montrant que cette mol cule avait la capacit d inhiber la signalisation du r cepteur du G CSF En pr sence de la cytokine G CSF les cellules poss dant son r cepteur e
27. stromal 1 SDF 1 Le SDF 1 est une chimiokine de la famille C X C qui a t isol e pour la premi re fois d une lign e de cellules de la moelle osseuse murine 110 Cette cytokine est exprim e sous 2 isoformes presque identiques d rivant d un pissage alternatif soit le SDF 1a et le SDF 1B dont la diff rence se trouve dans les 4 derniers acides amin s de SDF 1 absent chez SDF la Les diff rences fonctionnelles et biologiques entre les isoformes de SDF 1 ne sont pas clairement d crites 111 Le SDF 1 joue plusieurs r les importants via l activation de prot ines G coupl es son r cepteur CXCRA 112 114 Cette cytokine est exprim e dans plusieurs tissus durant le d veloppement souvent avec une expression juxtapos e de son r cepteur le CXCR4 115 Dans la moelle osseuse le SDF 1 est impliqu dans la mobilisation le nichage la colonisation et la prolif ration des CSH et est troitement associ la reconstitution h matopoi tique apr s une transplantation de moelle osseuse 116 121 Les cellules endoth liales les ost oblastes et les cellules stromales expriment constitutivement le SDF 1 et toutes les CSH expriment le CXCRA 122 124 Le SDF 1 est un chimioattractant puissant pour les cellules h matopoi tiques exprimant l antigene CD34 125 Il a t d montr dans un mod le de souris NUDE que la surexpression de CXCR4 par les cellules prog nitrices h matopoi tiques humaines et autres cellule
28. tique De plus G CSF tant une cytokine impliqu e dans la mobilisation cellulaire l augmentation de son expression dans l espace m dullaire est fort possiblement nuisible la prise de greffe 40 6 2 OBJECTIFS Notre projet de recherche a t labor dans le but d am liorer la prise de greffe h matopo tique suite l exposition aux radiations ionisantes e Notre premier objectif a t de d terminer si la r g n ration du microenvironnement osseux par th rapie cellulaire pouvait faciliter la restauration de l h matopo se e Notre deuxi me objectif tait d valuer si le blocage transitoire du G CSF emp chant son activit mobilisatrice sur le CSH favoriserait le nichage h matopo tique l aide d un mod le de prise de greffe chez la souris nous avons tudi le potentiel des CSM g n tiquement modifi es ou non dans le processus d am lioration de la prise de greffe Afin de r pondre ces objectifs nous avons voulu d terminer si l injection de CSM avait un effet b n fique sur le nichage h matopoi tique des CSH suite l irradiation De plus nous avons voulu valuer si l injection de CSM augmentait le nichage en absence de dommage au stroma induit par l irradiation Finalement nous avons v rifi l effet du blocage de la mobilisation cellulaire induite par le G CSF via l injection de CSM modifi es g n tiquement pour surexprimer et s cr ter le r cepteur soluble re
29. une dur e de vie limit e ce qui n cessite un r approvisionnement constant via la diff renciation des CSH multipotentes 56 La survie et la croissance des CSH sont r gul s via des interactions avec la moelle osseuse notamment avec les ost oblastes 57 58 et les cellules endoth liales vasculaires lesquels font parti int grante de la niche de support des CSH 57 59 60 17 3 2 LES CELLULES SOUCHES M SENCHYMATEUSES C est dans les ann es 1960 1970 que la pr sence de cellules stromales et de cellules formant de l os dans la moelle osseuse a t d crite pour la premi re fois 61 63 Une sous population de cellules de la moelle osseuse d montrant un potentiel ost og nique a t caract ris e selon son adh rence rapide au plastique des p tris de culture son apparence fibroblastique 61 64 et sa capacit d unit formant des colonies UFC Cette capacit d UFC permet le d nombrement de ces cellules lors de la culture in vitro En fait les cellules vivantes adh rent au plastique et croissent pour former un regroupement de cellules facilement distinguable C est le m me principe que la notion d UFC lors du d nombrement de bact ries en p tri Figure 3 Aspect de la morphologie typique des CSM 65 18 Les CSM ont t isol es de plusieurs sources humaines et animales et de plusieurs tissus incluant le sang de cordon ombilical le tissus adipeux le muscle la moelle osseuse et le foie 66
30. 005 6 p 314 322 Visnjic D et al Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency Blood 2004 103 p 3258 3264 Kopp HG Avecilla ST Hooper AT et Rafi i S The bone marrow vascular niche home of HSC differentiation and mobilization Physiology 2005 20 p 349 356 Abkowitz JL Robinson AE Kale S Long MW et Chen J Mobilization of hematopietic stem cells during homeostasis and after cytokine exposure Blood 2003 102 p 1249 1253 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 89 Avecialla ST et al Chemokine mediated interaction of hematopoietic progenitors wih the bone marrow vascular niche is required for thrombopoiesis Nat med 2004 10 p 64 71 Arai F et al Tie2 angiopoietin 1 signaling regulates hematopoietic stem cell niche quiescence in the bone marrow niche Cell 2004 118 p 149 161 Adams GB et al Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified bu the calcium sensing receptor Nature 2006 439 p 599 603 Driessen RL Johnston HM et Nilsson SK Membrane bound stem cell factor is a key regulatoor in the initial lodgment of stem cells within the endosteal marrow region Exp Hematol 2003 31 p 1284 1291 Nilsson SK et al Osteopontin a key component of the hematopoietic stem cell niche and regulator of primitive hematopoietic progenitor cells Blood 2005 106 p 1232 1239 Papayannopoulou T Curre
31. 475 Tashiro K Tada H Heilker R Shirozu M Nakano T et Honjo T Signaling sequence trap A cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins Science 1993 261 p 600 603 Peled A et al The chemokine SDF 1 stimulates integrin mediated arrest of CD34 cells on vascular endotheliu under shear flow J Clin Invest 1999 104 p 1199 1211 Kortesidia A et al Stromal derived factor l promotes the growth survival and development of human bone marrow stromal stem cells Blood 2005 105 p 3793 3801 Imai K Kobayashi M Wang J Ohiro Y Hamada J Cho Y et al Selective transendothelial migration of hematopoietic progenitor cells a role in homing of progenitor cells Blood 1999 93 1 p 149 156 Petit I et al G CSF induces stem cell mobilization by decreasing bone marrow SDF 1 and up regulating CXCR4 Nat Immunol 2002 3 7 p 687 394 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 9 Ponomaryov T Peled I Taichman RS Habler L Sandbank J et al Increased production of SDF 1 following treatment with DNA damaging agents relevance of human stem cell homing and repopulation of NOD SCID mice J Clin Invest 2000 106 11 p 1331 1339 Sun YX Schneider A Jung Y Wang J Dai J Wang J et al Skeletal localization and neutralization of the SDF 1 CXCL12 CXCR4 axis blocks prostate cancer metastasis and growth in osseous sites in vivo J Bone Miner Res 2005 2 p 31
32. 58 159 93 Metcalf D The molecular control of cell division differentiation commitment and maturation in haematopoietic cells Nature 1989 339 Yuo A Kitagawa S Ohsaka A Saito M et Takaku F Stimulation and priming of human neutrophils by granulocyte colony stimulating factor and granulocyte macrophage colony stimulating factor quantitative differences Biochem Biophys 1990 171 Shimoda K Okamura S Harada N Okamura T et Niho Y Identification of a functional raceptor for granulocyte colony stimulating factor on platelets J Clin Invest 1993 91 Ward AC The role of the granulocyte colony stimulating factor receptor _G CSFR R in disease Front Biosci 2007 12 p 608 618 Christopher MJ et Link DC Regulation of neutrophils homeostasis Curr Opin Hematol 2007 14 p 3 8 Christopher MJ Liu F Hilton MJ Long F et Link DC Suppression of CXCL12 production by bone marrow homeostasis in a commom and critical pathway for cytokine induced mobilization Blood 2009 114 p 1331 1339 Sung L et Dror Y Clinical applications of granulocyte colony stimulating factor Front Biosci 2007 12 p 1988 2002 Schneider A Kr ger C Steigleder T Weber D Pitzer C Laage R Aronowski J Maurer MH Gassler N Mier W Hasselblatt M Kollmar R Schwab S sommer C Bach A Kuhn HG et Sch bitz WR The hematopoietic factor G CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drivers neurogenesis J Clin Inves
33. 8 329 Katayama Y et al PSGL 1 participates in E selectin mediated progenitor homing to bone marrow evidence for cooperation between E selectin lignads and alpha4 integrin Blood 2003 102 p 2060 2067 Yang FC et al Rac and Cdc42 GTPases control hematopoietic stem cell shape adhesion migration and mobilization Proc Natl Acad Sci U S A 2001 98 p 5614 5618 Larochelle A Krouse A Metzger M Orlic D Donahue RE Fricker S Bridger G Dunbar CE et Hematti P 4DM3100 mobilized hematopoietic stem cells with long term repopulating capacity in non human primates Blood 2006 Broxmeyer HE Orschell CM Clapp DW Hangoc G Cooper S et al Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100 a CXCR4 antagonist J Exp Med 2005 201 p 1307 1318 Larochelle A Krouse A Metzger M Orlic D Donahue RE Fricker S Bridger G Dunbar CE et Hematti P AMD3100 mobilizes hematopoietic stem cells with long term repopulating capacity in nonhuman primates Blood 2006 107 p 3772 3778 Wynn R Hart C Corradi Perini C O Neill L Evans C Wraith J et al small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionaly active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow Blood 2004 104 p 2643 2645 Dar A Goichberg P Shinger V Kalinkovich A Kollet O Netzer N et al Chemokine receptor CXCR4 dependent internalization and resecretion of functional chemokine SDF 1
34. Direct Intramyocardial Injection of Mesenchymal Stromal Cells on the Development of New Myocardium and Blood Vessels in Patients With Heart Failure ClinicalTrials gov 2008 Wang FS Phase I II Study of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stem Cells UC MSCs for Treatment of Liver Failure ClinicalTrials gov 2010 Allay JA Dennis JE Haynesworth SE Majumdar MK Clapp DW Shultz LD Caplan AI et Gerson SL LacZ and interleukin 3 expression in vivo after retroviral transduction of marrow derived human 195 196 197 198 199 200 201 202 203 97 osteogenic mesenchymal progenitors Hum Gene Ther 1997 8 12 p 1417 14427 Bartholomew A Sturgeon C Siatskas M Ferrer K McIntosh K Patil S et al Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo Exp Hematol 2002 30 p 42 48 Noort WA Kruisselbrink AB in t Anker PS Kruger M van Bezooijen RL de Paus RA et al Mesenchymal stem cell promote engraftment of human umbilical cord blood derived CD34 cells in NOD SCID mice Exp Hematol 2002 30 p 870 878 Hiwase SD Dyson PG To LB et Lewis ID Cotransplantation of placental mesenchymal stromal cells enhances single and double cord engrafiment in nonobese diabetic severe immune deficient mice Stem cell 2009 27 p 2293 2300 Masuda S Ageyama N Shibata H Obara Y Ikeda T Takeuchi K et al Cotransplantation with MSCs improves e
35. FC VCAM VLA 4 WBM WNT Ganciclovir Gray Graft versus host disease Human leucocyte antigen Interleukine Janus kinase Leukocyte function associated antigen 1 Metalloprotease de la matrice Neutrophilic elastase Non obese diabetic severe combined immunodeficiency Proteine 53 suppresseur de tumeur Peripheral blood Prostaglandine E2 Phosphoinositide 3 kinase PTH PTHrP receptors Parathyroid hormone Soluble kit ligand Stem cell factor Stromal derived growth factor 1 Soluble G CSF receptor Signal transducers and activators of transcription Thymidine kinase Thrombopoi tine Tumor necrosis factor Unit formant des colonies Vascular cell adhesion protein Very late antigen 4 Whole bone marrow Wingless xi REMERCIEMENTS Ce projet n aurait pas t possible sans le soutien de ma famille amis et coll gues lesquels je remercie sinc rement de leur appui et de m avoir motiv pers v rer tout au long de cette tape importante de ma vie acad mique Je voudrais remercier mon directeur de recherche le Dr Christian Beaus jour de m avoir accueillie dans son laboratoire et de m avoir permis d accomplir ce projet d envergure De par sa passion pour les sciences et sa disponibilit r pondre mes questions il a su me motiver et me donner un environnement de travail stimulant Je voudrais aussi remercier Cynthia qui a t ma partenaire de laboratoire toujours l pour m aider me donner des commentaires pertinents et
36. FR Appelbaum FR et al DLA identical bone marrow grafts after low dose total body irradiation the effect of canine recombinant hematopoietic growth factors Blood 1994 84 p 3558 3566 Yu C Storb R Mathey B et al DLA identical bone marrow grafts after low dose total body irradiation effects of high dose corticosteroids and cyclosporine on engraftment Blood 1995 86 p 4376 4381 Storb R Yu C Wagner JL et al Stable mixed hematopoietic chimerism in DLA identical littermate dogs given sublethal total body irradiation before and pharmacological immunosuppression after marrow transplantation Blood 1997 89 8 p 3048 3054 Kondo M Wagers AJ Manz MG et al Biology of hematopoietic stem cells and progenitors implications for clinical application Annu Rev Immunol 2003 21 p 759 806 Zhang J Niu C Ye L Huang H et al Identification of hematopoietic stem cell niche and control of the niche size Nature 2003 425 p 836 841 Nilsson SK Johnson HM et Coverdale JA Spatial localization of transplanted hematopoietic stem cells interferences for the localization of stem cell niches Blood 2001 97 p 2293 2299 Calvi LM Adams GB Weibrecht KW et al Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche Nature 2003 425 841 846 Nilsson SK et al Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size J Exp Med 2005 201 p 1781 1791 Friedenste
37. II clinical trials are thus far either not available or disappointing 12 45 Further studies have investigated the co transplantation of bone marrow derived stromal cells often referred to as MSC together with hematopoietic cells to improve homing and engraftment 13 15 This idea stems from the generally accepted concept that exposure to conditioning drugs i e ionizing radiation IR and or busulfan damages the stromal microenvironment preventing adequate homing and retention of the injected HSC 16 While the co transplantation of stromal cells was shown to be safe in humans it was not shown to promote homing engraftment convincingly This is in contrast to previous work done in mouse models where co transplantation of stromal cells was showed to be beneficial 17 19 Altogether these various approaches have in most cases only slightly improved homing and engraftment suggesting that novel strategies need to be explored Intriguingly the extent to which homing is reduced as a result of IR induced damage to the microenvironment and then restored by stromal cell therapy is not known Here we report that homing is severely impaired following exposure to IR and that stromal cell therapy only partially restores this defect Moreover we identified an increase in the level of G CSF in the marrow eluates of irradiated mice and provide evidence that expression of a soluble G CSF decoy receptor is a novel approach to promoting homing
38. LES CYTOKINES ctt titu eset ton eueeet tee teoer ever rrea rrer DESEE 26 4 3 1 Le facteur de diff renciation stromal 1 SDF 1 26 ACA E qr d A E EEE E E AE EE 28 4 3 3 La Prostaglandine Ex PGBs suceuse rre rine 32 CHAPITRE V 2 oucosceseiiusedtubern madens eleie s M din FH ERE EM 33 5 1 L UTILISATION DES CSM EN CLINIQUE eee 33 52 LES CSM EN TANT QU AGENT TH RAPEUTIQUE POUR AM LIORER LA PRISE DE GREFFE HEMATOPOIETIQUE 36 CHAPITRE WU iat este ese av e eb UITAE TE Poil reseed 39 6 1 HYPOTHESES DE TRAVAIL cree 39 o 2 DEBIEC LIES a de ea nee an 40 CHAPITRE Vi to ei 42 TIRESULIA TS Lascia diosa mda etie s Io UE 42 Article Injection of a G CSF decoy receptor as an alternative strategy to stromal cell therapy to increase homing CHAPITRE VIII cccsccsceccscescscscsccscsscscscscssceccscascesesceceses 72 8 1 DISCUSSION ET PERSPECTIVES eee 72 CHAPITRE EX IP rivi eb qvod iras er Ent deri Eei 80 0 1 CONCLUSION erroris Iabtuecsotpi ae pee pevsx el eee verae Deuce pis et esuuus 80 BIBLIOGRAPHIE ccccscescscoscsccsceccscscsccsceccsceasessoscesssassascoss 81 ANNEXE eect RETRO ER En Navet xii Al R SULTATS SUPPL MENTAIRES eee xii A2 ACCORD DES COAUTELRS sua xiv viii LISTE DES FIGURES Figure 1 Registre des donneurs de sang de cordon ombilical 5 Figure 2 Sch ma de lh matopo se 32g anses ere 15 Figure 3 Aspect de la morphologie typique des cel
39. S Pilbeam CC Liu Y Herschman HR et Kream BEE Parathyroid hormone inccreased prostaglandin G H synthase 2 transcription by a cyclic adenosin 3 5 monophosphate mediated in murine osteocalstic MC3T3 E1 cells Endocrinology 1997 138 9 p 3594 3600 Du X et Weng JY Safety and efficacy study of allogenic mesenchymal stem cells to treat extensive chronic graft versus host disease ClinicalTrials gov 2009 Du X A Phase II Randomized Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Ex Vivo Cultured Allogenic Mesenchymal Stem Cells For the Treatment of Extensive Chronic Graft Versus Host Disease ClinicalTrials gov 2009 Hillard M et Lazarus MD Donor Mesenchymal Stem Cell Infusion for Treatment of Graft Versus Host Disease A Phase I Trial ClinicalTrials gov 2010 Monroy R A Phase II Randomized Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Prochymal Ex vivo Cultured Adult Human Mesenchymal Stem Cells For the Treatment of aGVHD in Patients Who Receive Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation ClinicalTrials gov 2009 Lee SH A Randomized Open label Multicenter Trial for the Safety and Efficacy of Intracoronary Adult Human Mesenchymal Stem Cells After Acute Myocardial Infarction ClinicalTrials gov 2011 Roncalli J Administration of Mesenchymal Stem Cells in Patients With Chronic Ischemic Cardiomyopathy ClinicalTrials gov 2011 Kastrup J A Single Centre Randomised Controlled Study of the Effect of NOGA Guided
40. SFR humain 215 Malheureusement les r sultats suppl mentaires ajout s en annexe de ce m moire voir figure Al 1 d montrent que la prise de greffe 6 semaines post transplantation n est pas am lior e Pour cette exp rience la quantit de cellules CD34 transplant es a t valu e de fa on accorder une prise de greffe limit e permettant de facilement observer s il y a ou non am lioration suite la th rapie Ces r sultats pourraient alors s expliquer soit par un mauvais dosage du milieu conditionn de CSM sol G CSFR inject soit par des temps d injections non optimaux Sinon ces r sultats pourraient s expliquer par le fait que nous avons transplant des cellules humaines dans un mod le murin Des tudes ont d montr que la mobilisation de cellules murines dans un mod le murin tait induite par le G 19 CSF 216 de m me que des cellules humaines dans un mod le humain 152 217 218 Cependant rien n indique que le G CSF murin a un effet mobilisateur sur les CSH humaines dans un mod le murin Donc avant d affirmer que les donn es pr c dentes contredisent notre hypoth se nous avons r p t cette exp rience dans un mod le murin voir les r sultats suppl mentaires en A1 2 Les r sultats laissent croire que la prise de greffe est am lior e gr ce la th rapie base de milieu conditionn de MSC solG CSFR Cependant l impact long terme de cette th rapie sur la prise
41. Universit de Montr al Am lioration de la prise de greffe h matopo tique par une th rapie cellulaire base de cellules souches m senchymateuses par Audrey Fortin D partement de pharmacologie Universit de Montr al Facult de m decine M moire pr sent la Facult des tudes sup rieures en vue de l obtention du grade de Maitre es Sciences M Sc en pharmacologie option pharmacog nomique Aout 2011 O Audrey Fortin 2011 Universit de Montr al Facult des tudes sup rieures et postdoctorales Ce m moire intitul Am lioration de la prise de greffe h matopo tique via une th rapie cellulaire base de cellules souches m senchymateuses Pr sent par Audrey Fortin a t valu par un jury compos des personnes suivantes Dr Jean Fran ois Gauchat pr sident rapporteur Dr Christian Beaus jour directeur de recherche Dr Borhane Annabi membre du jury R SUM Le traitement du cancer l aide d une exposition aux radiations ionisantes peut mener au d veloppement de plusieurs effets secondaires importants dont un retard de r paration et de r g n ration du tissu h matopoi tique Les m canismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus ce qui limite le d veloppement de nouvelles approches th rapeutiques l aide d un mod le murin de prise de greffe nos r sultats d montrent que l endommagement du microenvironnement par l irradi
42. a in first remisson N Engl J Med 1979 301 p 597 599 Peffault de Latour R Cabrespine Faugeras A et Bay JO volution des condtitionnements des greffes allog niques de cellules souches h matopoi tiques chez l adulte depuis 10 ans Bull Cancer 2008 95 1 p 87 97 Brocklhurst B Radiation damage in DNA possible role of higher triplet states Radiat Res 2001 155 p 637 Mothersill C et Seymour C Radiation induced bystander effects past history and future directions Radiat Res 2001 155 p 759 Khodarev NN Sokolova IA et Vaughan ATM Mechanisms of induction of apoptotic DNA fragmentation Int J Radiat Biol 1997 73 p 455 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 84 Blank KR Rudoltz MS Kao GD Muschel RJ et Gillies McKenna W The molecular regulation of apoptosis and implications for radiation oncology Int J Radiat Biol 1997 71 p 455 Terasima T et Tolmach LJ X ray sensitivity and DNA synthesis in synchronous population of HeLa cells Science 1963 140 p 490 492 Sinclair WK et Morton RA X ray sensitivity during the cell generation cycle of cultured Chinese hamster cells Radiat Res 1966 29 p 450 474 Beausejour CM Krtolica A Galimi F et al Reversal of human cellular senescence role of the p52 ans p16 pathways EMBO J 2003 22 p 4212 4222 Freitas AA de Magalhaes JP A review and appraisal of the DNA damage theory of
43. adiated mice that received stromal cell therapy an observation that may be explained in several ways First it is well known that exposure to IR leads not only to the apoptosis of hematopoietic cells but also to the destruction of the bone marrow vasculature 25 a phenotype that certainly prevents the proper distribution of cells injected intravenously In that effect we have tried preventing IR induced damage by using pifithrin a an inhibitor of p53 who was showed to inhibit apoptosis in irradiated mice 26 27 Unfortunately the injection of pifithrin a at a dose reported to efficiently prevent apoptosis in mice did not improve homing as determined in absolute cells counts in our model data not shown Whether the injection of pifithrin a can efficiently preserves the bone marrow vascular network remains however to be determined Secondly it is very likely that the amount of stromal cell injected in our model 5x10 is insufficient to fully restore homing This limitation originates from the fact that we worked with a stromal cell population that had not been 54 previously expanded in vitro and thus for which only a very limited number of cells can be obtained Indeed the purification procedure we used only allowed a very limited number of stromal cells to be purified and labelled from one donor mouse about 2 3x10 cells from collagenase treatment of long bones from tibias and femurs see Fig S1 Still we believe that using n
44. adini D Kulkarni A Callaghan M Tepper O Bastidas N Kleinman M et al Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients throughHIF 1 induction of SDF 1 Nat med 2004 10 p 858 864 Metcalf D 7he granulocyte macrophage colony stimulating factors Science 1985 229 p 16 22 Nagata S Tsuchiya M Asano S Kaziro Y Yamazaki T Yamamoto O Hirata Y Kubota N Oheda M et Nomura H Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony stimulating factor Nature 1986 319 p 415 418 Souza LM Boone TC Gabrilove J Lai PH Zsebo KM Murdock DC Chazin VR Bruszewski J Lu H Chen KK Barendt J Platzer E Moore MAS Mertelsmann R et Welte K Recombinant human granulocyte colony stimulating factor effects on normal and leukemic myeloid cells Science 1986 232 p 61 65 Liongue C Wright C Russell AP et Ward AC Granulocyte colony stimulating factor receptor Stimulating granulopoiesis and much more Int J Biochem and Cell Biol 2009 41 p 2372 2375 Touw IP et van de Geijn GJ Granulocyte colony stimulating factor and its receptor in normal myeloid cell development leukemia and related blood cell disorders Front Biosci 2007 12 p 800 815 O Sulivan LA Liongue C Lewis RS Stephenson SEM et Ward AC Cytokine receptor signaling through the Jak Stat Socs pathway in disease Mol Immunol 2007 44 p 2497 2506 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 1
45. aematopoietic progenitors Br J Haematol 2001 112 p 438 448 Gong JK Endosteal marrow a rich source of hematopoietic stem cell Science 1978 199 p 1443 1445 Heissig B et al Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP 9 mediated release of kit ligand Cell 2002 109 625 637 Mishina Y sttarbuck MW Gentile MA Fukuda T Karparcova V Seedor JG Hnaks MC Amling M Pinero GJ et Dehringer RR Bone morphogenetic protein type IA receptor signaling regulates postnatal osteoblast function and bone remodeling J Biol Chem 2004 279 26 p 27560 27566 Wilson A Murphy MJ Oskarsson T et al c Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self renewal and differentiation Genes Dev 2004 18 p 2747 2763 Kamiya N Ye L Kobayashi T Mochida Y Yamauchi M Kronenberg HM Feng JQ et Mishina Y BMP signaling negatively regulates bone mass through sclerostin by inhibiting the canonical Wnt pathway Development 2008 135 p 3801 3811 Murray TM Rao LG Divieti P et Brindhurst FR Parathyroid hormone secretion and action Evidence for discrete receptors for the carboxyl terminal region and related biological actions of carboxyl terminal ligands Endocr Res 2005 26 1 Duncan AW Rattis FM DiMascio LN Congdon KL Pazianos G Zhao C Yoon K Cook MJ Willert K Gaiano N et Reya T Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance Nat Immunol 2
46. amille des glycoprot ines 130 CD130 et des r sidus de tyrosines sp cifiques importants pour la transduction de signal 146 147 Le r cepteur du G CSF est exprim par plusieurs cellules du syst me h matopoi tique incluant les CSH les prog niteurs my lo des les granulocytes les neutrophiles les monocytes et lymphocytes mais est aussi exprim par les cellules des tissus non h matopoi tiques telles que les cardiomyocytes les pr curseurs neuronaux les cellules endoth liales et le tissu placentaire 146 La liaison du r cepteur et de son ligand le G CSF m ne la multim risation du r cepteur et l activation de plusieurs cascades de signalisation intracellulaires incluant les voies Jak Stat Socs Ras Raf Erk et PI3 kinase Akt lesquelles m nent ultimement des changements transcriptionnels qui ont un impact sur la survie la migration la prolif ration et la diff renciation cellulaire 146 Cellule musculaire Cellule G CSFR nerveuse r g n ration m Migration survie mobilisation prolif ratio amp Granulocyte qi entiation gt Oo l CSH Prog niteur E Monocyte my lo de es Macrophage Figure 7 Impact de la signalisation du r cepteur du G CSF sur l activit cellulaire 145 30 Plusieurs tapes de l h matopo se sont m di es via l action du G CSF Entre autre cette cytokine supporte la formation de colonies my lo des immatures pouvant se diff re
47. anguines sont tr s sensibles ces traitements impliquant que suite ces th rapies il est vital de transplanter de la moelle osseuse aux patients afin de r g n rer les cellules h matopoi tiques Cependant la technique de greffe h matopoi tique couramment utilis e pr sente des taux de r ussite de prises de greffe assez faible L optimisation de nouvelles m thodes de transplantation de moelle osseuse et de conditionnement sont en d veloppement afin am liorer la qualit et l esp rance de vie de des patients atteints du cancer 1 2 CONTENU DU M MOIRE Le sujet de mon projet de recherche porte sur l am lioration de la prise de greffe de moelle osseuse chez les patients pr conditionn s par l exposition aux irradiations Nous voulions laborer une th rapie cellulaire afin de favoriser la r g n ration de la moelle osseuse Pour ce faire notre premier objectif tait de favoriser le nichage des cellules transplant es la moelle osseuse en effectuant une th rapie cellulaire afin de r g n rer le microenvironnement osseux endommag par l irradiation Notre deuxi me objectif a t d augmenter le nichage des cellules h matopoi tiques par le blocage d une cytokine mobilisatrice Un mod le de prise de greffe chez la souris a t d velopp au laboratoire afin de r pondre ces 2 objectifs Les prochains chapitres contiennent une revue de litt rature couvrant des sujets pertinents dans le cadre de mo
48. ar exemple Notch est exprim par les CSH primitives et Jagged 1 son ligand est exprim par les ost oblastes et les cellules stromales de la moelle osseuse Des tudes ont d montr que l activation de PPR un r cepteur impliqu dans l hom ostasie ionique osseuse et min rale 99 peut avoir pour effet d augmenter le nombre de cellules ost oblastiques ce qui augmentera l activit Jagged 1 Notch et favorisera ainsi la prolif ration des CSH 59 De plus il a aussi t d montr que la signalisation de Notch inhibait les programmes de diff renciation induits par Wnt ce qui favoriserait la r tention des CSH dans la niche osseuse 100 Des vidences additionnelles supportent le r le de la niche ost oblastique dans le maintient des CSH Une tude a t r alis e l aide d un mod le murin transg nique exprimant la thymidine kinase TK du virus de l herp s sous le contr le du promoteur du collag ne al permettant l expression conditionnelle de la TK par un traitement inductible au ganciclovir GCV Il a t d montr que l expression de la TK d clenchait l ablation des ost oblastes 23 ce qui menait une diminution substantielle du nombre absolu de CSH et la r duction de la cellularit de la moelle osseuse 101 De plus cette tude a montr e qu avec le retrait du GCV les ost oblastes r apparaissaient dans l os et que l h matopo se reprenait dans la moelle osseuse Ces observations su
49. ation a un impact limitant sur le nichage h matopo tique Parce que le microenvironnement est compos principalement de cellules d riv es des cellules souches m senchymateuses CSM nous avons valu le potentiel des CSM r g n rer le tissu h matopoi tique par la reconstitution de la niche osseuse Cette th rapie a men une augmentation remarquable du nichage h matopoi tique chez les souris irradi es Les causes mol culaires impliqu es dans le nichage h matopoi tiques sont encore inconnues mais nous avons remarqu l augmentation de la s cr tion de la cytokine granulocyte colony stimulating factor G CSF dans l espace m dullaire suite l irradiation Le G CSF est impliqu dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible une prise de greffe Nous avons valu le potentiel d une th rapie base de CSM s cr tant le r cepteur soluble du G CSF afin de s questrer le G CSF transitoirement et les r sultats obtenus d montrent que le blocage du G CSF favorise le nichage h matopoi tique Globalement les donn es pr sent es dans ce m moire d montrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage h matopoi tique et que la baisse du potentiel de r g n ration du tissu h matopoi tique suite l irradiation peut tre renvers e l aide d une th rapie cellulaire de CSM g n tiquement modifi es ou non Mots c
50. bre d ost oblastes dans la moelle corr lait avec une augmentation similaire de CSH 57 59 Les tudes sur le bone morphogenetic protein receptor type IA Bmprla et PTH PTHrP receptors PPR ont procur des aper us m canistiques de l expansion des CSH m di e par les ost oblastes En effet les prot ines morphog niques de l os Bmp r priment la voie de signalisation de Wingless WNT pour maintenir les populations de cellules souches stables Les signaux transduits par le Bmprla ne sont pas essentiels pour la formation ou prolif ration des ost oblastes mais sont n cessaires en ce qui attrait au d p t de la matrice extracellulaire 96 D autres tudes impliquant l ablation conditionnelle de Bmprla chez la souris ont permis d identifier un sous ensemble d ost oblastes exprimant N cadh rine une mol cule d adh sion formant un complexe N cadh rine b cat nine avec les CSH m diant l attachement ou l adh sion des CSH leur niche 57 Il a aussi t d montr que les CSH en diff renciation expriment c Myc un r gulateur n gatif de N cadh rine ce qui favoriserait leur d placement hors de la niche 97 Signal RANKL OPG Ost oblaste Ost oclastog n se LD Ost oclaste Ost oblastog n se Figure 5 Mod le de la signalisation entre BMPRIA et Wnt dans l os 98 D autres mol cules de la niche ost oblastique sont impliqu es dans la localisation des CSH quiescentes P
51. by bone marrow endothelial and stromal cells Nat Immunol 2005 6 p 1038 1046 Kucia M Ratajczak J Reca R Janowska Wieczorek A et Ratajczak M Tissue specific muscle neural and liver stem progenitor cells reside in the bone marrow repond to an SDF 1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury Blood Cells Mol Dis 2004 32 p 52 57 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 92 Abbott J Huang Y Liu D Hickey R Krause D et Giordano F Stromal cell derived factor la plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury Circulation 2004 110 p 3300 3305 Ma J Ge J Zhang S Sun A shen J Chen L et al Time course of myocardial stromal cell derived factor 1 expression and beneficial effects of intravenously asministred bone marrow stem cells in rats with experimental myocardial infarction Basis Res Cardiol 2005 100 p 217 223 Ji J He B Dheen S et Tay S Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration od mesenchymal stem cells to the impaired stie in the brain after hypoglossal nerve injury Stem Cells 2004 22 p 415 427 Togel F Isaax J Hu Z Weiss K et Wesenfelder C Renal SDF 1 signals mobilization and homing of CXCR4 positive cells to the kidney after ischemic injury Kidney Int 2005 67 p 1772 1784 Cer
52. ch condition of G CSF supplementation Data were correted with pERK ERK ratio before inhibition analysis Figure 5 Injection of a soluble G CSF decoy receptor as a tool to increased homing A Schematic of the experiment Mice were sublethally irradiated 8 Gy and were injected intraperitoneally or not with 15x10 MSC or MSC solG CSFR The day after mices were transplanted with 5x10 WBM CFSE cells 1 day prior to sacrifice B Homing was determined by absolute number of CFSE cells present in femurs whole bone marrow WBM of mice n 6 12 15 mice per group Expression of solG CSFR decoy was demonstrated by western blot analysis of conditionned media secreted by MSC non transfected CTR MSC transfected with G CSF receptor G CSFR or soluble G CSFR solG CSFR C Irradiated mice were injected or not with conditionned media of MSC or MSC solG CSFR and were transplanted with 5x10 WBM CFSE cells the day after Homing was determined by absolute number of CFSE cells present in femurs whole bone marrow WBM of mice 1 day following transplantation n 9 7 10 mice per group One way ANOVA p lt 0 05 64 40000 de ANUS SI89 9Z2HHd Jo Jaquinu aynjosqy 5d kkkk e o EL o 96 1nuuej sie 9ZHHd Jo uonJgodouJg 5d 2d Fortin and al Figure 1 DO 65 DS D6 _ ns ES ce A MSC cA Absolute number of PKH26 cells femur MSC Sacrifice WBM C s PKH26 MSC
53. combinant du G CSF Les r sultats obtenus au cours de ce projet de recherche sont pr sent sous forme d un article qui est pr sentement en r daction Ceux ci d montrent que l irradiation endommage le microenvironnement osseux et augmente le niveau de G CSF dans la moelle osseuse et que ce sont les principales causes 41 diminuant l efficacit du nichage h matopoi tique Fort heureusement la th rapie base de CSM peut renverser les effets n fastes dus l irradiation CHAPITRE VII 7 1 R SULTATS Injection of a G CSF decoy receptor as an alternative strategy to stromal cell therapy to increase homing 2 Audrey Fortin Cynthia L Carbonneau Basma Benabdallah and Christian M Beaus jour Centre de recherche du CHU Ste Justine D partement de pharmacologie Universit de Montr al Montr al Qu bec Canada Corresponding author Christian M Beaus jour Ph D CHU Ste Justine 43 ABSTRACT Patients treated for cancer therapy using ionizing radiation have delayed tissue repair and regeneration The mechanisms mediating these defects remain unknown thus limiting the development of therapeutic approaches Using an engraftment model we investigated the mechanisms by which irradiation exposure limits hematopoietic tissue regeneration Our results show that microenvironment damage by irradiation limits hematopoietic homing in irradiated mice compared to non irradiated mice Because the micro
54. ct limitant sur la prise de greffe h matopo tique plus pr cis ment sur le nichage de cellules h matopoi tiques la moelle osseuse Au cours de ce projet de recherche nous avons d abord d termin si l irradiation endommageait le microenvironnement osseux ce qui pourrait expliquer les faibles taux de nichage h matopoi tique Pour ce faire nous avons compar des groupes de souris irradi es ou non et transplant es 2 ou 5 jours post irradiation Les r sultats obtenus ont d abord d montr que la m thode d analyse de r sultats de nichage par proportion 96 208 210 c est dire la quantit de cellules greff es d nombr es dans la moelle par rapport au nombre total de cellules dans la moelle refl tait inad quatement le nichage En effet ce calcul tient compte de la quantit totale de cellules dans la moelle qui est diminu e apr s l irradiation Donc pour un m me nombre de cellules greff es ayant nich es le r sultat en pourcentage sera plus lev dans une moelle irradi es comparativement une moelle non irradi e Des tudes pr c dentes utilisant la m thode par proportion laissaient croire que l irradiation serait b n fique au nichage h matopoi tique sous l hypoth se que l irradiation d truirait les cellules du microenvironnement osseux pour laisser la place aux cellules nouvellement transplant es 211 Cependant nous avons d termin que l approche permettant d analyser le nichage en c
55. de greffe devra tre confirm en effectuant d autres essais afin d tre confiant de nos r sultats CHAPITRE IX 9 1 CONCLUSION En r sum les r sultats pr sent s dans ce m moire apportent de consid rables connaissances quant aux nouvelles avenues th rapeutiques pouvant am liorer la prise de greffe h matopo tique Plus pr cis ment nos travaux ont permis de d terminer que le conditionnement par irradiation endommageait le microenvironnement osseux au niveau cellulaire et au niveau de l quilibre de la cytokine G CSF Nous avons d abord d montr qu une th rapie cellulaire base de CSM pouvait partiellement corriger les dommages cellulaires du microenvironnement osseux ce qui am liorait le nichage h matopoi tique De plus nous avons d montr qu une th rapie bloquant le G CSF via l injection de CSM modifi es g n tiquement surexprimant le solG CSFR ou l injection du milieu conditionn s cr t par celle ci limitait la mobilisation des cellules transplant es ce qui favoriserait le nichage h matopoi tique long terme tout porte croire que ces th rapies de CSM ou de bloqueur du G CSF pourraient am liorer la prise de greffe h matopoi tique et ainsi favoriser la survie et le r tablissement des patients trait s contre le cancer 10 11 81 BIBLIOGRAPHIE Soci t canadienne du cancer Le cancer au Qu bec et au Canada les faits en brefs 2011 Holyoake TL Nicolini FE et Eaves
56. e to work with this stromal population given that we had previously determined it gets damaged following exposure to IR Carbonneau et al as well as to obtain a sufficient number of cells without the need to expand them in vitro Indeed Rambout and Ploemacher showed that in vitro expansion of bone marrow stromal cells compromises their functions at the niche an observation that has subsequently been confirmed by others 21 23 Following exposure to IR mice were injected intravenously with 5x10 purified stromal cells or PBS alone and then allowed a short 5 days regeneration period before homing was evaluated Fig 2a Using this protocol we observed that the injection of stromal cells could increase homing by as much as 135 p 0 01 in mice exposed to IR Fig 2b Surprisingly injection of stromal cells using the same procedure was also found to modestly increase homing by 45 p 0 05 in non irradiated mice Fig 2b Overall MSC have potential to increase homing of HSC to the bone marrow This powerfull potential is really interesting to use MSC as therapeutic agent Increased levels of G CSF in the marrow of irradiated mice Of high interest is also the observation that despite a very significant benefit from the injection of stromal cells in previously irradiated mice homing was still approximately 3 fold lower than the baseline level observed in non irradiated mice This suggests that alternative strategies to stromal cell th
57. e et de la rate L avantage du traitement base d anticorps anti lymphocytes T par rapport l irradiation corporelle totale est que cela affecte non seulement les lymphocytes du receveur mais aussi ceux du donneur Cependant avant d liminer les cellules T l OKT3 active initialement les cellules T ce qui r sulte en la rel che de cytokines tel que l IL 2 l interf ron y l IL 6 et le TNF Ces cytokines causent ce que l on appelle le syndrome du rel chement de cytokines qui consiste en des fi vres frissons maux de t te complications gastro intestinales et moins souvent en des m ningites aseptiques et des enc phalopathies Vu la disponibilit d autres agents d induction et la s v rit des effets secondaires associ s avec le syndrome de rel chement de cytokines il en r sulte une diminution de l utilisation de l OKT3 De plus il est maintenant connu que l OKT3 est immunog nique chez l homme et qu approximativement 50 des patients d veloppent des anticorps suite un court traitement 50 Le Bulsulfan est un autre exemple d agent chimioth rapeutique toxique Cette drogue utilis e depuis 1959 est un des agents anticanc reux les plus efficace pouvant cependant mener de nombreuses complications tel que la fibrose pulmonaire 51 13 2 2 2 Le conditionnement intensit r duite Du aux effets secondaires n fastes li s la forte toxicit des traitements standards des m thodes de conditionneme
58. e plus lev de CSH et une production plus lev e de prog niteurs pour un nombre quivalent de CSH 2 3 La cr ation de banques publiques de sang de cordons a augment l accessibilit des unit s de sang de cordon pour la transplantation voir graphique ci dessous Millions of donors registered gt 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Figure 1 Registre des donneurs de sang de cordon ombilical donn es tir es du US National Marrow Donor Program Cependant il existe un facteur limitant principal de cette source qui est le faible volume de sang de cordon qui r sulte en un nombre insuffisant de cellules souches pour la prise de greffe chez un adulte L injection d un nombre restreint de cellules n est pas conseill puisqu il a t d montr qu il existe un lien direct entre le nombre de cellules inject es et l efficacit de la prise de greffe 11 12 Une autre probl matique la transplantation de moelle osseuse est le risque de d velopper la maladie du greffon contre l h te GvHD qui est une r action des cellules immunitaires greff es contre les cellules de l h te La GvHD est une des complications les plus fr quentes et les plus s rieuses suivant une transplantation allog nique Cette maladie r sulte en dommages induits immunologiquement aux tissus de l h te 13 14 Ces dommages sont dus des interaction
59. ed from stromal cells secreting or not the decoy receptor Using a protocol where 250 ul of concentrated CM 15 fold see methods was injected intraperitoneally twice 1 and 16 hours before homing we were able to confer a 35 increase in homing an effect not observed using CM collected from non transduced stromal cells Fig 5c These results suggest that the solG CSFR can favour homing independently of the action of stromal cells and could therefore represent a novel therapeutic strategy to be used alone or in combination with stromal cell therapy 53 DISCUSSION Homing of hematopoietic cells to the bone marrow microenvironment is a complex physiological process for which the cellular and molecular determinants are not fully understood Here we provide evidences that homing is severely impaired post exposure to IR a phenotype that can be partially rescued by the injection of bone marrow stromal cells Intriguingly the injection of stromal cells could increase homing in both irradiated and non irradiated mice suggesting that one mechanism by which stromal cells benefit homing is independent of their expected role in regenerating the niche How exactly the injection of stomal cells positively impact homing in absence of damage is not known but may arise from an apparent increase in the size of the osteoblastic niche which was showed to correlate with homing 24 Our results also revealed that homing is still severely impaired in irr
60. ematopoietic tissue regeneration potential following irradiation can be reversed by cellular therapy using MSC genetically modified or not Key words MSCs hematopoietic homing irradiation G CSF bone marrow microenvironment vi TABLE DES MATIERES LISTE DES FIGURES scsi ones nes m estesesesd osesestantenec ses viii LISTE DES ABBREVIATIONS eese eene ente ix REMERCIEMENTS eskskszassbaerkusvbrk sata ra RARE FL SERV Fo YPR Pepe va P tete xi CHAPITRE Sd na de ee NEUE 1 1 1 MISE EN CONTEXTE eeeeeceeeeeeeeeeceeueceeeeeeeeeceene 1 1 2 CONTENU DU M MOIRE reeeeeeeeeeeeeueeeeueeeueeeeueceueeue 3 CHAPITRE I oom be en en ee dad 4 2 1 LA PROBL MATIQUE DE LA GREFFE HEMATOPOIETIQUE 4 2 2 LE CONDITIONNEMENT eee 8 2 2 1 Le conditionnement standard 2 8 2 2 A Ll Ta r diothetdplo le ed ss 8 2 2 1 2 Tia chimioth rapie ieuocsi ee ade Liam RES 4E EUR ER Soiias 10 2 2 2 Le conditionnement intensit r duite 13 CHAPITRE III es cut EAR EUH ME DUDEN eau 15 3 1 LES CELLULES SOUCHES H MATOPO TIQUES 15 3 2 LES CELLULES SOUCHES M SENCHYMATEUSES 17 CHAPITRE IV ME 19 4 1 LA NICHE DES CSH eee 19 4 1 1 La niche osteoblastiqUe cua Diei reete hi En 4a a EX ER Rex Rape 20 4 1 2 La niche vasculaire 2 24 4 2 LES MOLECULES DE SIGNALISATION ET D ADH SION 25 vii 4 3
61. environment is mainly composed by mesenchymal stem cells MSCs derived cells we evaluated the potential of MSCs to improve hematopoietic tissue regeneration by bone marrow niche reconstitution in irradiated mice Injection of MSCs led to remarkable enhancement of hematopoietic homing in mice exposed to irradiation We also found that increase G CSF level a cytokine implicated in cellular mobilization in the medullary space following irradiation may possibly be harmful to engraftment We evaluated the potential of MSCs secreting a soluble G CSF decoy receptor therapy to sequester G CSF transiently and results obtained show that G CSF blocking improved hematopoietic homing Overall our findings indicate that bone marrow microenvironment and G CSF level are important in hematopoietic homing processes and that the decline in hematopoietic tissue regeneration potential following irradiation can be reversed by cellular therapy of MSCs genetically modified or not Key Words MSCs hematopoietic homing irradiation G CSF bone marrow microenvironment 44 INTRODUCTION Umbilical cord blood UCB cells are being increasingly used as an alternative source for hematopoietic stem cell transplantation review by Rocha and Broxmeyer 1 Despite several advantages such as greater availability and immune tolerance the UCB contains a limited number of hematopoietic stem cells HSC available for transplantation Limited HSC supply combined with the
62. erapy need to be explored so as to restore homing The profile of secreted cytokines within the bone marrow microenvironment is known to be modified in response 51 to IR an example would be the increased expression of SDF 1a 4 Among cytokines whose expression could negatively impact homing G CSF is certainly a strong candidate Whether the level of G CSF within the niche varies following exposure to IR however is not known To answer this question we measured by ELISA the level of G CSF in the marrow eluate of irradiated and to non irradiated mice femurs Two days after irradiation levels of G CSF were increased by as much as 70 p 0 001 an increase we found was transient given those levels returned to control values one week post IR Fig 3 and data not shown Quantitative real time PCR analysis performed on purified marrow stromal and hematopoietic cells did not reveal any variation at the mRNA level suggesting the absence of G CSF transcriptional regulation data not shown Based on this finding and given the potential of G CSF as a mobilizing agent we made the hypothesis that inhibition of G CSF may have the potential to increase homing Expression of a G CSF decoy receptor as a novel strategy to increase homing One method by which inhibition of G CSF could be achieved is through the expression of a soluble G CSF decoy receptor solG CSFR which if expressed at sufficiently high level could sequester G CSF Accordingly
63. erme Selon les statistiques le tiers des patients ne r agissent pas la premi re ligne de th rapie consistant en une combinaison de corticoide et d inhibiteur de calcineurine ce qui donne un prognostique peu encourageant ces patients 186 Pour aider la pr vention de la GvHD des tudes cliniques visent utiliser une th rapie base de CSM pour leur propri t immunomodulatrice unique incluant l inhibition de la prolif ration des cellules T stimul es par des allo antig nes et mitog nes et la pr vention de l activit cytotoxique des cellules T Par exemple une tude en phase II en cours a pour objectif d valuer la s curit et l efficacit d infusions de CSM cultiv es ex vivo pour le traitement de patients ayant d velopp la GvHD 187 D autres tudes cliniques utilisent les CSM dans le traitement des GvHDs comme c est le cas des investigations men es afin de d terminer les effets secondaires et la meilleure dose de CSM dans le traitement de la GvHD 34 aig e ou chronique chez les patients subissant une transplantation de cellules souches 188 190 Les CSM sont aussi utilis es en clinique dans les traitements d infarctus du myocarde Plusieurs tudes cliniques sont en cours car les maladies cardiovasculaires sont consid r es comme tant une des plus grandes causes de mortalit Les cardiomyopathies isch miques se d finissent par des dommages permanents dans certaines aires du c ur qui s
64. es court moyen et long terme Le fractionnement de la dose a permis de r duire la toxicit reli e cette proc dure 35 La radioth rapie aussi appel e irradiation est une technique utilisant le rayonnement g n ralement les rayons gamma y afin d liminer les cellules via la mutation de leur ADN ce qui les rend incapables de se d velopper et de se diviser Les rayonnements y sont des ondes lectromagn tiques tr s nerg tiques mis par des atomes radioactifs lors de leur d sint gration L unit de dose absorb e par la mati re est le Gray Gy qui est quivalent un Joule absorb par kilogramme de mati re Dans les conditionnements standards en association avec du cyclophosphamide l irradiation corporelle totale est actuellement utilis e des doses de l ordre du 12 Gy 35 L action indirecte du rayonnement y se produit via l interaction entre les mol cules biologiques et les radicaux libres Les radicaux libres apparaissent suite l excitation et la radiolyse de l eau c est dire l ionisation de mol cules d eau Plusieurs tudes ont r sum les voies mol culaires et les m canismes de blessures induites par irradiation 36 39 L irradiation affecte directement l ADN l expression g n tique et la production prot ique Au niveau tissulaire les effets tels que le d peuplement cellulaire l atrophie et la d gradation des fonctions tissulaires se manifestent dans les jours aux semaines suivant
65. es J Exp Med 2006 203 p 2021 2031 Ferrara JL et Reddy P Pathophysiology of graft versus host disease Semin Hematol 2006 43 p 3 10 Ruggeri L Mancusi A Burchielli E et al Natural killer cell alloreactivity and haplo identical hamatopoietic transplantation Cytotherapy 2006 8 p 554 558 Ferrara JL Advances in the clinical management of GVHD Best Pract Res Clin Heamatol 2008 21 p 677 682 Szabolcs P The immunobiology of cord blood transplantation Korean J Hematol 2010 45 4 p 224 235 Rocha V Gluckman E et Eurocord and European Blood and Marrow Transplant Group Clinical use of ombilical cord blood hematopoietic stem cells Biol Blood Marrow Transplant 2006 12 p 34 41 Rocha V Labopin M Sanz G et al Transplants of umbilical cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia N Engl J Med 2004 351 p 2276 2285 Kurtzberg J Cater SL Baxter Lowe LA et al Results of the cord blood transplantation study COBLT Clinical outcomes of 193 unrelated donor umbilical cord blood transplantation in pediatric patients with malignant conditions Biol Blood Marrow Transplant 2005 11 Mohty M et Apperley JF Long term physiological side effects after alloggenic bone marrow transplantation Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010 p 229 236 Thomas ED Buckner CD Clift RA Fefer A Johnson FL Neiman PE et al Marrow transplantation for acute nonlymphoblastic leukemi
66. es not reduce the risk of graft failure in pediatric patients undergoing allogeneic umbilical cord blood transplantation Bone Marrow Transplant 2011 46 2 200 7 Koc ON Gerson SL Cooper BW Dyhouse SM Haynesworth SE Caplan AI et al Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous blood stem cells and culture expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high dose chemotherapy J Clin Oncol 2000 18 2 307 16 Bernardo ME Cometa AM Locatelli F Mesenchymal stromal cells a novel and effective strategy for facilitating engraftment and accelerating hematopoietic recovery after transplantation Bone Marrow Transplant 2011 Chan SL Choi M Wnendt S Kraus M Teng E Leong HF et al Enhanced in vivo homing of uncultured and selectively amplified cord blood CD34 cells by cotransplantation with cord blood derived unrestricted somatic stem cells Stem Cells 2007 25 2 529 36 Nakao N Nakayama T Yahata T Muguruma Y Saito S Miyata Y et al Adipose tissue derived mesenchymal stem cells facilitate hematopoiesis in vitro and in vivo advantages over bone marrow derived mesenchymal stem cells Am J Pathol 2010 177 2 547 54 19 20 21 22 23 24 60 Noort WA Kruisselbrink AB in t Anker PS Kruger M van Bezooijen RL de Paus RA et al Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood derived CD34 cells in NOD SCID mice Exp Hemat
67. facturer except that 3 treatments of 0 25 collagenase Type I solution were performed to improve cell recovery Stromal cell purity was determined by flow cytometry using CD45 and Ter119 antibodies and evaluated at 80 90 47 Production of a soluble G CSF decoy receptor Full length and truncated sequences of the G CSF receptor G CSFR were amplified by PCR using the pCR Blunt II TOPO plasmid containing the full G CSFR cDNA purchased from OpenBiosystems Huntsville AL as a template PCR amplicons were cloned into pENTRIA destination plasmid Invitrogen Burlington ON and used to generate lentivectors pLentiCMV TO G CSFR and pLentiCMV TO solG CSFR using Gateway recombinaison technology Invitrogen Burlington ON The 3 generation lentivector backbone was obtained from Dr Eric Campeau ericcampeau com Lentivirus production was performed using the standard method of transfection in 293T cells as previously described Naldini et al 8602510 Finally MSCs and 293T cells were transduced with lentivectors expressing the full and truncated forms of the G CSFR Their expression in MSCs and 293T cells was confirmed by western blot using G CSFR antibody sc 9173 Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz CA Conditionned media Conditionned media was collected from MSC MSC G CSFR and MSC solG CSFR cultured at 80 of confluence in 100 mm dish Briefly cells were first rinced with phosphate buffered saline twice and then transfer in
68. hs mice Fig S2 Given it is well described that aged mice have a higher number of circulating HSC in blood compared to young mice 30 it is tempting to speculate that variations in the endogenous level of G CSF may be sufficient to favour the egress of cells out of the marrow 55 We also demonstrated that a soluble G CSF decoy receptor can improve homing when delivered in mice using marrow stromal cell as a delivery vehicle or when injected directly in the form of conditioned media The impact of our decoy receptor on homing was superior to the action of a G CSF blocking antibody which when injected at a dose of 10 ug per mouse a dose reported to inhibit the action of G CSF in mice 31 did not significantly increase homing see Fig S3 Unfortunately it was not possible to increase engraftment following the injection of conditioned media containing the solG CSFR twice intraperitoneally as in our homing protocol data not shown Nonetheless we believe the experimental conditions used in our study may be further optimized by the future development of a purified recombinant version of the G CSF decoy receptor which could then be injected at a higher concentration and thus potentially have a greater impact on homing and engraftment Also the development of a recombinant decoy receptor with a greater affinity to G CSF compared to the endogenous receptor may be advantageous In conclusion our results demonstrate that homing is severel
69. iabetic severe combined immunodeficiency mice Stem Cells Dev 2007 16 3 347 54 Christopherson KW Hangoc G Mantel CR Broxmeyer HE Modulation of hematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26 Science 2004 305 5686 1000 3 Castello S Podesta M Menditto VG Ibatici A Pitto A Figari O et al Intra bone marrow injection of bone marrow and cord blood cells an alternative way of transplantation associated with a higher seeding efficiency Exp Hematol 2004 32 8 782 7 Frassoni F Gualandi F Podesta M Raiola AM Ibatici A Piaggio G et al Direct intrabone transplant of unrelated cord blood cells in acute leukaemia a phase I II study Lancet Oncol 2008 9 9 831 9 Brunstein CG Barker JN Weisdorf DJ Defor TE McKenna D Chong SY et al Intra BM injection to enhance engraftment after myeloablative umbilical cord blood transplantation with two partially HLA matched units Bone Marrow Transplant 2009 43 12 935 40 Ball LM Bernardo ME Roelofs H Lankester A Cometa A Egeler RM et al Cotransplantation of ex vivo expanded mesenchymal stem cells 14 15 16 I7 18 59 accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation Blood 2007 110 7 2764 7 Bernardo ME Ball LM Cometa AM Roelofs H Zecca M Avanzini MA et al Co infusion of ex vivo expanded parental MSCs prevents life threatening acute GVHD but do
70. ication AP by negative selection of CD457 Ter119 cells and the purity of bone marrow derived stromal cells MSC determined by flow cytometry using CD45 and Ter119 antybodies BioLegend SanDiego CA 70 G CSF pg ml Age of mice months Figure S2 Increased level of G CSF in serum of mice without exposure to IR ELISA analysis of G CSF secreted in serum of mice aged 20 months compared to young 3 months mice n 8 7 mice per group Student f test p 0 05 71 Absolut number of CFSE cells femur IgG G CSF Ab Figure S3 Injection of G CSF antibody did not increased homing in irradiated mice model C57BL 6 irradiated 8 Gy mice were injected intraperitoneally with G CSF antibody AF 414 NA R amp D Systems Minneapolis MN or goat IgG G 202 C R amp D Systems Minneapolis MN at a dose of 10 ug per mouse prior to transplantation of 5x10 WBM CFSE cells Mice were sacrified the day after and homing was determined by the absolute number of CFSE cells present in femurs whole bone marrow WBM of mice n 5 6 mice per group Student test p lt 0 05 CHAPITRE VIII 8 1 DISCUSSION ET PERSPECTIVES Nos travaux ont permis d apporter de nouvelles connaissances sur des nouvelles avenues th rapeutiques pouvant contrer les effets ind sirables de la chimioth rapie et ou de la radioth rapie chez les patients trait s pour le cancer Nous avons d termin que le conditionnement par irradiation avait un impa
71. il a t d montr que la PGE2 inhibait la croissance des granulocytes et des macrophages humains in vitro 165 166 et la my lopo se in vivo 167 mais stimulait l rythropo se et les cellules prog nitrices de lign es multiples de facon dose d pendante 164 168 La PGE2 peut aussi stimuler les ost oblastes humains et murins 169 176 vu son implication dans la r sorption osseuse 177 et peut la fois inhiber ou stimuler les cellules ost oclastiques d pendamment du mod le exp rimental utilis 178 181 De plus l hormone parathyroide PTH connue pour favoriser la prolif ration indirecte des CSH via son effet sur les cellules ost oblastiques dans la moelle osseuse est en fait un des principaux stimulateurs de la PGE2 182 185 CHAPITRE V 5 1 L UTILISATION DES CSM EN CLINIQUE La r paration de tissus endommag s par l utilisation de cellules souches d riv es de la moelle osseuse ou du sang repr sente une approche novatrice en m decine r g n rative Les CSM sont utilis es en clinique en tant qu outil th rapeutique gr ce leur capacit d auto renouvellement de diff renciation et d immunomodulation Plusieurs tudes cliniques visent traiter la GvHD l aide de CSM La GvHD chronique est une des plus grandes limitations au succ s des greffes allog niques de CSH Afin de pr venir la GvHD les patients recevant une allogreffe doivent subir des traitements immunosuppressifs long t
72. in AJ Gorskaja JF Kulagina NN Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs Exp Hematol 1976 4 p 267 274 Becker AJ McCulloch EA et Till JE Cytological Demonstration of the Clonal Nature of Spleen Colonies Derived from Transplanted Mouse Marrow Cells Nature 1963 197 4866 p 452 454 Siminovitch L McCulloch EA et Till JE The distribution of colony forming cells among spleen colonies Journal of Cellular and Comparative Physiology 1963 62 3 p 327 336 Friedenstein AJ Deriglasova UF Kulagina NN et al Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method Exp Hematol 1974 2 p 83 92 Rochefort GY Vaudin P Bonnet N Pages N Domenech J Charbord P et Eder V Influence of hypoxia on the domiciliation of mesenchymal 66 67 68 69 70 7L T2 Va 74 F5 76 TH 86 stem cells afier infusion into rats possibilities of targeting pulmonary artery remodeling via cells therapies Repiratory research 2005 6 125 da Silva ML Chasgastelles PC et Nardi NB Mesenchymal stem cells reside in virtually post natal organs and tissue J Cell Sci 2006 199 p 2204 2213 Kern S Eichler H stoeve J Kl ter H et Bieback K Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow umbilical cord blood or adipose tissue Stem Cells 2006 24 p 1294 1301 Schallmoser K Bartmann C
73. ine SDF 1 via son r cepteur CXCR4 De plus il a t d montr que le G CSF provoque la diminution du niveau de SDF 1 dans la moelle osseuse relativement au sang et autres tissus ce qui tabli un gradient chimioattrantant facilitant la mobilisation cellulaire 153 En clinique le G CSF est largement utilis pour r colter des CSH et cellules prog nitrices n cessaires aux transplantations de moelle osseuse 154 31 Plusieurs applications du G CSF en m decine r g n rative sont en mergence comme par exemple l utilisation de cette cytokine en tant que neuroprotecteur stimulant de la neurog n se et inhibant l apoptose et l inflammation 155 156 32 4 3 3 La Prostaglandine E PGE Une autre mol cule de signalisation pouvant affecter la niche osseuse est la PGE2 Les prostaglandines sont d riv es de l acide arachidonique produit via l activation des cyclooxyg nases 1 et 2 COX 1 et COX 2 dans plusieurs tissus o elles sont impliqu es dans les processus physiologiques et pathologiques 157 La PGE2 est l cosano de le plus abondant et le m diateur de plusieurs syst mes physiologiques 158 La PGE2 peut cibler les composantes stromales et h matopo tiques de la moelle osseuse Elle est connue pour avoir des effets la fois inhibiteurs et stimulateurs sur la diff renciation des prog niteurs h matopoi tiques 159 164 ce qui lui conf re plusieurs r les dans l h matopoi se Par exemple
74. inetics and survival of quiescent and cycling human CD34 cells transplanted into conditioned NOD SCID recipients Blood 2002 99 5 1585 93 Aiuti A Webb IJ Bleul C Springer T Gutierrez Ramos JC The chemokine SDF 1 is a chemoattractant for human CD34 hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34 progenitors to peripheral blood J Exp Med 1997 185 1 111 20 Ponomaryov T Peled A Petit I Taichman RS Habler L Sandbank J et al Induction of the chemokine stromal derived factor 1 following DNA damage improves human stem cell function J Clin Invest 2000 106 11 1331 9 Petit I Szyper Kravitz M Nagler A Lahav M Peled A Habler L et al G CSF induces stem cell mobilization by decreasing bone marrow SDF 1 and up regulating CXCR4 Nat Immunol 2002 3 7 687 94 Sato N Sawada K Takahashi TA Mogi Y Asano S Koike T et al A time course study for optimal harvest of peripheral blood progenitor cells by granulocyte colony stimulating factor in healthy volunteers Exp Hematol 1994 22 10 973 8 10 tt 12 13 58 Boitano AE Wang J Romeo R Bouchez LC Parker AE Sutton SE et al Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells Science 2010 329 5997 1345 8 Campbell TB Hangoc G Liu Y Pollok K Broxmeyer HE Inhibition of CD26 in human cord blood CD34 cells enhances their engraftment of nonobese d
75. ise de greffe et pr venir la GvHD mais jusqu un certain point Lors de cette tude le conditionnement pr greffe intensif tait remplac avec une immunosuppression post transplantation de mani re progressive Il a t d montr que les lymphocytes T sont sensibles l irradiation et que la dose minimale n cessaire pour avoir une prise de greffe 14 avec succ s tait de 9 2 Gy chez 92 des receveurs sans immunosuppression additionnelle 52 53 une dose de 4 5 Gy l ajout de cyclosporine CSP tait n cessaire pour atteindre une prise de greffe substantielle 54 Cependant quand la dose d irradiation corporelle totale tait diminu e une dose sub l tale de 2 Gy l immunosuppression post greffe avec de la CSP seule tait inefficace et toutes les greffes avaient t rejet es 55 Finalement les nouvelles m thodes d intensit r duite pr sentant une diminution de toxicit tout en conservant leur potentiel de prise de greffe laissent entrevoir l applicabilit de cette approche des populations de plus en plus g es ou dont l tat g n ral repr sentait jusqu maintenant une contre indication la greffe avec conditionnement CHAPITRE III 3 1 LES CELLULES SOUCHES H MATOPO TIQUES La CSH est responsable de l h matopo se un processus physiologique permettant la cr ation et le renouvellement de toutes les cellules sanguines En tant que cellules souches elles sont ca
76. it et la dur e d interaction ligand r cepteur Il serait int ressant de cr er une mol cule plus stable en fusionnant par exemple une 78 partie Fc d immunoglobuline et de v rifier si cela am liore l effet b n fique sur le nichage 213 Aussi vu que la quantit de cellules inject es est norme l effet des r cepteurs membranaires s questrant le G CSF s additionne l effet anti G CSF procur par le r cepteur soluble s cr t De plus le nichage moins lev avec l injection de milieu conditionn pourrait tre du au fait que le milieu conditionn inject repr sente une quantit moindre de solG CSFR comparativement la quantit s cr t s par les CSM in vivo Il serait alors int ressant de r p ter cette exp rience avec diff rents temps et quantit d injection de milieu conditionn Finalement comme le but de mon projet de ma trise tait d am liorer la prise de greffe h matopo tique nous avons voulu d terminer si l am lioration du nichage se traduisait long terme par une meilleure prise de greffe Pour ce faire nous avons utilis le mod le murin NOG 214 auquel nous avons transplant des CSH humaines exprimant le CD34 Nous avons voulu d terminer si la th rapie bloquant l effet mobilisateur du G CSF via l injection de milieu conditionn contenant du solG CSFR tait b n fique la prise de greffe Il a d j t d montr que le G CSF murin agissait sur le G C
77. l s CSM nichage h matopoi tique irradiation G CSF microenvironnement osseux ABSTRACT Cancer treatment using ionizing radiation may lead to significant side effects including delayed hematopoietic tissue repair and regeneration The mechanisms mediating these defects remain unknown thus limiting the development of new therapeutic approaches Using a mouse engraftment model our results show that microenvironment damage by irradiation limits hematopoietic homing Since the microenvironment is mainly composed of mesenchymal stem cells MSCs derived cells we evaluated the potential of MSCs to improve hematopoietic tissue regeneration by bone marrow niche reconstitution This therapy led to remarkable enhancement of hematopoietic homing in irradiated mice The molecular causes involved in hematopoietic homing remain unknown but we noticed an increased in granulocyte colony stimulating factor G CSF secretion within the medullary space after irradiation G CSF is involved in cellular mobilization and may possibly be harmful to engraftment We evaluated the therapeutical potential of MSC genetically engineered to secrete a soluble G CSF decoy receptor that would transiently sequester G CSF Results obtained show that G CSF blocking improved hematopoietic homing Overall the findings presented in this thesis indicate that bone marrow microenvironment and G CSF levels are important in hematopoietic homing process and that the decline in h
78. lulaire De plus les antim tabolites inhibent l action de certaines enzymes essentielles la formation de nucl otides et nucl osides 47 Afin de diminuer les risques de mortalit reli s la GvHD la chimioth rapie peut aussi tre utilis e comme traitement immunosuppresseur post greffe ayant pour but d inactiver ou d liminer les cellules T du donneur Habituellement ce genre de traitement consiste combiner deux immunosuppresseurs tels que la cyclosporine A un inhibiteur des calcineurines bloquant l expression de l IL 2 qui est impliqu e dans la diff renciation et la prolif ration des lymphocytes T et le m thotrexate un inhibiteur de la dihydrofolate r ductase bloquant la synth se des purines 18 La d pl tion des cellules T peut aussi tre induite via l utilisation d anticorps tel que l alemtuzumab anti CD52 18 et l OKT3 anti CD3 12 Ces traitements my loablatifs par chimioth rapie de forte intensit sont malheureusement associ s une toxicit importante restreignant aussi leur utilisation aux jeunes patients Par exemple l OKT3 un anticorps monoclonal IgG2 murin ciblant la cha ne CD3 un r cepteur membranaire des cellules T a t approuv en 1986 pour le traitement des rejets de greffe 49 Apr s l injection d OKT3 les cellules T disparaissaient de la circulation r sultats de l opsonisation et de leur retrait de la circulation m di par les cellules mononucl es du foi
79. lules souches M senchymateuseS ra ne ne UNDE 17 Figure 4 Sch ma de la niche osseuse supportant l h matopo se 20 Figure 5 Mod le de signalisation entre BMPRIA et Wnt dans l os 22 Figure 6 Structure du r cepteur du G CSF 4 28 Figure 7 Impact de la signalisation du r cepteur du G CSF sur l activit DIDIGOTUUO accused dm Lee ee te ee ae 29 Ang 1 Tie2 ADN AP ARNm ATG Bmp Bmprla BP Ca CaR CD CFSE CPU COX CPA CHR CM CSF3 CSM CSH CSP CTR C X C CXCR4 G CSF G CSFR GTP ix LISTE DES ABBR VIATIONS Angiopoi tine 1 Tie2 Acide desoxyribonucleique After purification Acide ribonucl ique messager Anti T lymphocyte globulins Bone morphogenetic protein Bone morphogenetic protein receptor type IA Before purification Ion calcium Ca2 sensing receptor Cluster of differentiation Carboxyfluorescein succinimidyl ester Colony forming unit Cyclooxyg nase Cellule pr sentatrice d antig ne Cytokine receptor homology Conditonned media Colony stimulating factor 3 Cellule souche m senchymateuse Cellule souche h matopoi tique Cyclosporine Control Cyst ine X cyst ine R cepteur de SDF 1 Granulocyte colony stimulating factor Granulocyte colony stimulating factor receptor Guanine triphosphate GVC Gy GvHD HLA IL JAK LFA 1 MMP NE NOD SCID p53 PB PGE2 PIBK PPR PTH sKitL SCF SDF 1 solG CSFR Stat TK TPO TNF U
80. n projet de recherche Tout d abord le chapitre II contient des notions au sujet du conditionnement standard et d intensit r duite Au chapitre III j y traite des cellules souches h matopoi tiques CSH et des cellules souches m senchymateuses CSM Ensuite au chapitre IV j enchaine avec les concepts de niche ost oblastique et vasculaire des mol cules de signalisation et d adh sion puis des cytokines impliqu es dans le processus de greffe h matopoi tique Le chapitre V quant lui est consacr une r vision des tudes cliniques utilisant des CSM comme outil th rapeutique pour traiter diff rentes pathologies dont les d fauts de r paration tissulaire Les objectifs g n raux de mon projet de recherche seront abord s au chapitre VI Le chapitre VII contiendra un article en r daction portant sur les r sultats exp rimentaux obtenus tout au long de ma maitrise La discussion des r sultats se fera dans le chapitre VIII Finalement au chapitre IX j labore sur la conclusion et les perspectives par rapport aux r sultats obtenus CHAPITRE II 2 1 LA PROBL MATIQUE DE LA GREFFE H MATOPO TIQUE La transplantation de moelle osseuse a t d velopp e dans le but de traiter les immunod ficiences cong nitales et les d sordres h matologiques 2 3 Cette technique est maintenant aussi utilis e dans le traitement des maladies auto immunes et du cancer 4 9 La transplantation de moelle osseuse vise remplacer les
81. ncier en toutes les lign es my lo des induire la prolif ration et la diff renciation des cellules de lign es my lomonocytiques 144 148 et augmente la fonction des neutrophiles et des plaquettes matures 149 150 De plus l implication du G CSF dans la neutropo se a t d montr e l aide de souris d ficientes en G CSF ou de son r cepteur 146 et chez les patients exprimant constitutivement des mutants hypomorphiques du r cepteur du G CSF 151 mod les exhibant tous une neutrop nie Le G CSF est aussi connu pour tre impliqu dans la my lopo se En effet une d ficience en prog niteurs de granulocytes et de macrophages a t observ e chez les souris G CSF 146 La signalisation du G CSF r gule aussi la mobilisation des CSH hors de la moelle osseuse 152 via un signal de transactivation indirecte c est dire ind pendant de l expression du r cepteur du G CSF sur ces cellules 152 La mobilisation induite par le G CSF est m di e par 3 m canismes distincts probablement inter reli s Premi rement par l induction d enzymes prot olytiques telles que l lastase des neutrophiles NE la cathepsine G et les m talloprot inases 2 et 9 MMP 2 et MMP 9 lesquelles inactivent SDF 1 via un clivage de sa s quence en N terminal Deuxi mement par l att nuation de la fonction des mol cules d adh sion cl s comme les int grines Et troisi mement par la perturbation de la signalisation de la cytok
82. nclenchent une voie de signalisation dont l une des tapes est la phosphorylation de la prot ine ERK 1 2 212 l aide de CSM en culture nous avons illustr par immunobuvardage qu un conditionnement avec du solG CSFR inhibait la formation de pERK 1 2 en r ponse la stimulation par le G CSF 76 Ensuite nous avons voulu d terminer l effet d une th rapie cellulaire bloquant le G CSF par l injection de CSM surexprimant le solG CSFR CSM solG CSFR chez des souris irradi es avant la transplantation h matopo tique Les r sultats d montrent une augmentation du nichage de 90 lors de l injection de CSM solG CSFR comparativement au groupe contr le sans CSM ce qui confirme notre hypoth se selon laquelle le G CSF limiterait le nichage h matopo tique Nous avons effectu une th rapie cellulaire base de CSM modifi es g n tiquement pour surexprimer le r cepteur complet du G CSF titre de contr le Les r sultats observ s d montrent aussi une augmentation du nichage 55 donn es non pr sent es Cela pourrait tre du au fait qu en surexprimant le r cepteur leur surface les CSM s questrent suffisamment de G CSF circulant ce qui causerait un d s quilibre du niveau de cette cytokine et emp cherait partiellement son effet mobilisateur sur les CSH tonnamment un contr le o les souris ont t inject es avec des CSM non modifi es g n tiquement d montre une am lioration notable du nichage
83. ngrafiment of HSCs after autologous intra bone marrow transplantatio in nonhuman primates Exp Hematol 2009 37 p 1250 1257 Koc ON Gerson SL Cooper BW Dyhouse SM Haynesworth SE Caplan AI et al Rapid hematopoietic recovery after co infusion of autologous blood stem cells in advanced breast cancer patients receiving hogh dose chemotherapy J Clin Oncol 2000 18 p 307 316 Lazarus HM Koc ON Devine SM Curtin P Maziarz RT Holland HK et al Cotransplantation of HLA identical sibling culture expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients Biol Blood Marrow Transplant 2005 11 p 389 398 Ball LM Bernardo ME Roelofs H Lankester A Cometa A Egeler RM et al Co transplantation of ex vivo expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation Blood 2007 110 p 2764 2767 Gonzalo Daganzo R Regidor C Martin Donaire T Rico MA Bautista G Krsnik I et al Results of a pilot study on the use of third party mesenchymal stromal cells in cord blood transplantation in adults Cytotherapy 2009 11 p 278 288 Rombouts WJ et Ploemacher RE Primary murine MSC show highly homing to the bone marrow but lose homing ability following culture Leukemia 2003 17 1 p 160 170 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 98 Morikawa S
84. ns la structure osseuse Une portion de ces cellules h matopo tiques peut tre trouv e c t de la surface de l endoste de l os lequel est bord principalement par les ost oblastes Cellules T CLP Cellules B a Cellules NK Monocyte T AD GMP zu ees C Granulocyte hip of HSCs MPP CMP lt Erythrocyte FH MKEP M gacaryocyte Cellule 2 SNO s N cadherin 2 CD45 lt Chondrocyte Ost oclaste 2 Fibroblaste MSCs Adipocyte Myocyte Cellule endoth liale TBA Ost oclastes Figure 4 Sch ma de la niche osseuse supportant l h matopo se 91 Macrophage Ost oclaste Cet arrangement anatomique sugg re une communication r ciproque entre ces 2 types cellulaires et le r le potentiel des ost oblastes dans la r gulation des CSH 83 Cette notion est support e par le fait que les ost oblastes sont connus pour produire une vari t de facteurs de croissance h matopo tiques tel que l IL 6 c kit G CSF et le facteur de croissance des 21 h patocytes 92 93 Plusieurs vidences supportent un mod le selon lequel les CSH r sidant c t de la surface de l endoste de l os produisent des prog niteurs qui eux migrent aux vaisseaux sanguins au centre de la cavit osseuse leur maturit et s y diff rentient 58 94 95 L importance de cette communication a t d montr e dans diff rentes tudes transg niques o l augmentation du nom
85. nt mechanistic scenarios in hematopoietic stem progenitor cell mobilization Blood 2004 103 p 1580 1585 Nagasawa T Nakajima T Tachibana K lizasa H Bleul CC Yoshie O et al Molecular cloning and characterization of a murine pre B cell growth stimulating factor stromal cell derived factor 1 receptor a murine homolog of the human immunodeficiency virus 1 entry coreceptor fusin Proc Natl Acad Sci U S A 1996 93 25 p 14726 14729 Shirozu M N T Inazawa J Tashiro K Tada H Shinohara T et Honjo T Structure and chromosomal localization of the human stromal cell derived factor 1 SDF 1 gene Genomics 1995 28 p 495 500 Shirozu M Nakano T Inazawa J Tashiro K Tada H Shinohara T et Honjo T Molecular cloning and structure of a pre B cell growth stimulating factor Proc Natl Acad Sci U S A 1994 91 p 2305 2309 Bleul C Farzan M Choe H Parolin C Clark Lewis I Sodroski J et al The lymphocyte chemoattractant SDF 1 is a ligand for LESTR fusin and blocks HIV 1 entry Nature 1996 382 p 829 833 Feng Y Broder C Kennedy P et Berger E HIV 1 entry cofactor functional cDNA cloning of a seven transmembrane G protein coupled receptor Science 1996 272 p 872 277 McGrath KE Koniski AD Maltby KM McGann JK et Palis J Embryoic expression and function of the chemikine SDF 1 and its receptor CXCR4 Dev Biol 1999 213 2 p 442 456 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125
86. nt non my loablatif ont t labor es Depuis les ann es 1990 une vari t de conditionnement intensit r duite a t tudi e combinant chimioth rapie r duite avec ou sans irradiation La plupart de ces conditionnements chimioth rapeutiques sont bas s sur l administration de fludaradine et d un agent akylant melphalan cyclophosphamide ou busulfan et aussi avec l addition d anticorps anti lymphocyte T tel que l ATG ou l alemtuzumab 35 Des tudes cliniques ont permis d observer un effet durable de greffe versus leuc mie chez les patients d veloppant une GvHD aig e ou chronique post transplantation Ces donn es encouragent le d veloppement de m thodes non my loablatives car elles d montrent que l radication partielle des cellules h matopoi tiques allog niques transplant es est b n fique puisqu en plus de restaurer la my oablation ces cellules m nent l radication des cellules canc reuses 37 39 Cependant le conditionnement intensit r duite est limit par l augmentation du risque de rejet d allogreffe En effet sans un traitement my loablatif complet les cellules T du donneur et du receveur peuvent engendrer des r actions greffe versus h te et h te versus greffe Il a t d montr dans une tude pr clinique l aide d un mod le canin que l immunosuppression post greffe tait en mesure de moduler simultan ment les r actions h te versus greffe facilit la pr
87. obilization of hematopoietic stem cells durieng hematopoiesis and after cytokine exposure Blood 2003 102 Petit I Szyper Kravitz M Nagler A Lahav M Peled A Habler L Ponomaryov T Taichman RS Arenzana Seisdedos F Fuji N Zipori D Lapidot T G CSF induce stem cell mobilization by decreasing bone marrow SDF 1 and up regulating CXCR4 Nat Immunol 2002 3 p 687 694 Pelus LM Horwitz D Cooper SC et King AG Peripheral blood stem cell mobilization A role of CXC chemokines Crit Rev Oncol Hematol 2002 43 p 257 275 xii ANNEXE A1 R SULTATS SUPPL MENTAIRES Absolute count of CD45 1 cells CTR MSC solG CSFR 100 Porportion of CD45 1 cells 8 8 N e CTR MSC solG CSFR Figure A 1 1 Injection of bone marrow stromal cells MSC expressing solG CSFR improved hematopoietic reconstitution post IR CD45 2 irradiated 10 Gy recipients mice were injected intravenously tail vein or not control CTR with 5x10 MSC solG CSFR 5 days prior to transplantation of 5x10 CD45 1 whole bone marrow cells Peripheral blood engraftment 6 weeks following transplantation was determined by flow cytometry analysis of the absolute number A and the proportion B of CD45 1 cells using CountBright xiii absolute counting beads Invitrogen Burlington ON and CD45 1 antibody Biolegend SanDiego CA m C1 MSC EB MSC solG CSFR u os ce 40 Sm ra a 9t 6 2 20 EE o CD45 CD19 CD3 Figure
88. ol 2002 30 8 870 8 Collis SJ Neutzel S Thompson TL Swartz MJ Dillehay LE Collector MI et al Hematopoietic progenitor stem cell homing in mice lethally irradiated with ionizing radiation at differing dose rates Radiat Res 2004 162 1 48 55 Morikawa S Mabuchi Y Kubota Y Nagai Y Niibe K Hiratsu E et al Prospective identification isolation and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow J Exp Med 2009 206 11 2483 96 Rombouts WJ Ploemacher RE Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture Leukemia 2003 17 1 160 70 Wang L Liu Y Kalajzic Z Jiang X Rowe DW Heterogeneity of engrafted bone lining cells after systemic and local transplantation Blood 2005 106 10 3650 7 Calvi LM Adams GB Weibrecht KW Weber JM Olson DP Knight MC et al Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche Nature 2003 425 6960 841 6 25 26 24 28 29 30 31 6l Kopp HG Avecilla ST Hooper AT Rafii S The bone marrow vascular niche home of HSC differentiation and mobilization Physiology Bethesda 2005 20 349 56 Komarov PG Komarova EA Kondratov RV Christov Tselkov K Coon JS Chernov MV et al A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy Science 1999 285 5434 1733 7 Strom E Sathe S Komarov PG Chernova OB Pavlo
89. ometry analysis of the absolute number or the proportion of labelled cells per femur using CountBright absolute counting beads Invitrogen Burlington ON Where indicated marrow stromal cells purified as described above were also injected either intravenously tail vein or intraperitonealy prior to the injection of labelled hematopoietic cell Statistical analysis Statistical analyses were performed with the Graph Pad 5 0 software using unpaired Student test and one way ANOVA test Results were considered statistically significant with p values 0 05 49 RESULTS Exposure to IR reduces homing to the bone marrow of mice Whether exposure to chemoradiotherapy benefits bone marrow transplantation by creating niche space and triggering the secretion of chemoattractive cytokines such as SDF 1a is controversial To that effect we used flow cytometry and absolute cell counts of fluorescently labelled hematopoietic cells to examine the impact of IR on homing Our results clearly demonstrate that homing to the bone marrow of mice is severely compromised following exposure to IR 8 Gy an effect we found was even more pronounced 5 days post IR when compared to day post IR p 0 0001 vs p 0 05 Fig la These results obtained using absolute cell counts are in sharp contrast to what we observed looking at the proportion of labelled cells over the total number cells in the marrow Fig 1b highlighting the importance of using the appr
90. ompte absolu refl tait 23 davantage la r alit Cette technique permet de calculer la quantit de cellules ayant nich es la moelle sans tenir compte du nombre total de cellules dans la moelle Nos r sultats pr sent s ainsi d montrent que l irradiation est en fait n faste au nichage h matopoi tique et que plus la p riode entre l irradiation et la transplantation tait longue plus le dommage au microenvironnement tait important ce qui s illustrait par une diminution de la cellularit de la moelle osseuse Notre premier objectif tait de d terminer si la r g n ration du microenvironnement osseux par une th rapie cellulaire a base de cellules stromales d riv es de la moelle pouvait faciliter la restauration de l h matopoi se Par le fait m me nous avons voulu d terminer si un dommage la moelle osseuse est n cessaire pour l effet b n fique de cette th rapie cellulaire sur le nichage h matopoi tique Pour ce faire nous avons d abord d montr que l injection de CSM am liorait le nichage h matopo tique suite l irradiation Les r sultats s expliquent par le fait que les CSM ont un effet b n fique en r g n rant la niche endommag e par l irradiation En effet il est connu que les CSM peuvent migrer aux sites endommag s par irradiation 78 80 et qu elles ont la capacit de s y installer pour reformer le microenvironnement osseux et ainsi r tablir la fonction de la niche afin de favorise
91. on cultured stromal cell populations is highly preferable given we found the injection of bone marrow stromal cells obtained following in vitro expansion see Landry et al 28 had no beneficial impact on homing data not shown While it is difficult to compare expanded stromal cell populations with more heterogeneous freshly sorted cells these results underline the importance of developing in vitro expansion protocols that would preserve the cellular functions and or properties of marrow stromal cells 21 23 Noteworthy marrow stromal cells obtained following in vitro expansion could still modestly increase homing when injected intraperitoneally at a dose of 15x10 Fig 5b suggesting these cells albeit the large number injected still retained some capacity in enhancing homing Looking for alternative strategies to restore homing post IR we made the observation that the level of G CSF is increased in marrow eluates shortly after IR Fig 3 This increase was transient and did not appear to be transcriptionnaly regulated suggesting that G CSF may have been released in the marrow space from dying cells We believe that an increase in the level of G CSF post IR could have a long lasting impact on homing through for instance the known effects of G CSF on osteoblasts homeostasis and the SDF la CXCR4 axis 5 29 It is also worth mentioning that we also observed an increase in G CSF levels in serum of aged 20 months compared to young 3 mont
92. ont priv es de sang lors d une attaque cardiaque Le r tablissement apr s une attaque cardiaque peut tre g r via une m dication et des changements au style de vie mais ces traitements ne peuvent pas renverser tous les dommages g n r s au c ur Les CSM sont consid r es comme des agents th rapeutiques int ressants pour une th rapie cellulaire via une injection intracoronarienne Des tudes sont en cours pour valuer si cette m thode est s curitaire pour r parer les dommages caus s lors d un infarctus du myocarde 191 192 Les CSM peuvent aussi tre utilis es lors de traitements d une d faillance du foie Cette maladie pr sente des sympt mes cliniques dramatiques pouvant aller jusqu des n croses massives des cellules du foie ce jour la transplantation du foie est la seule option th rapeutique disponible pour les patients Cependant le manque de donneurs les complications chirurgicales et les co ts lev s causent de s rieux probl mes Des tudes ont d montr que les CSM d riv es de la moelle osseuse pouvaient remplacer les h patocytes du foie endommag et restaurer la d faillance du foie puis contribuer sa r g n ration Une tude clinique est pr sentement en cours afin d valuer la s curit et l efficacit d un traitement via une transfusion intraveineuse de CSM de sang de cordon ombilical pour les patients pr sentant une d faillance du foie 193 35 Les CSM sont pr sentement
93. opriate method to correctly assess homing These data are in accordance with previous work by Collis and colleagues 20 and provide further evidence that the marrow niche is severely impaired post exposure to IR Injection of bone marrow stromal cells partially restores homing post exposure to IR Alteration of the bone marrow stromal microenvironment has been proposed as a mechanism by which homing is reduced post IR This hypothesis is supported by data showing that injection of bone marrow stromal cells increases homing and or engraftment in mice 17 19 Yet some of these reports have showed increased homing in situations where the niche had no time to regenerate such as when stromal cells are injected simultaneously with hematopoietic cells 17 19 These observations led us to wonder if the injection of stromal cells post IR can restore homing to the level observed in the absence of irradiation and whether it could even promote homing in a situation where the microenvironment had not been damaged 50 We first determined the extent by which the injection of bone marrow stromal cells can increase homing in conditions where the recipient mice had been exposed or not to IR To that effect we used a population of fresh uncultured bone marrow derived stromal cells obtained from collagenase treated bone phenotypically defined as CD45 CD31 CD44 CD90 and expressing osteoblast specific genes Fig S1 and Carbonneau et al We chos
94. ovide NOD SCID repopulation Blood 2002 100 p 2778 2786 Coleman CN Stone HB Moulder JE Mededine Pellmar TC Modulation of radiation injury Science 2004 304 p 693 6394 Gluckman E Rocha V Boyer Chammard A et al Outcome of cord blood transplantation from related and unrelated donnors Eurocord Transplant Group ans the European Blood and Marrow Transplantation Group N Engl J Med 1997 337 p 373 381 12 13 14 15 16 I7 18 19 20 21 22 23 24 82 Rubinstein P Carrier C Scaradavou A et al Outcomes among 562 recipients of placental blood transplants from unrelated donors N Engl J Med 1998 339 p 1565 1577 Blazar BR Murphy WJ Bone marrow transplantation and approchaches to avoid graft versus host disease GVHD Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2005 360 p 1747 1767 Welniak LA Blazar BR et Murphy WJ Immunology of allogenic hematopoietic stem cell transplantation Annu Rev Immunol 2007 25 p 139 170 Antin JH et Ferrara G Cytokine dysregulation and acute graft versus host disease Blood 1992 80 p 2964 2968 Gluckman E et Rocha T Cord blood transplantation state of the art Haematologica 2009 94 4 p 451 454 Mohty M Dentritic cells and acute graft versus host disease after allogenic stem cell transplantation Leuk Lymphoma 2007 48 p 1696 1701 Nachbaur D et Kircher B Dentritic cells in allogenic hematopoietic stem cell transplan
95. pables d auto renouvellement De plus elles poss dent un caract re multipotent leur permettant de se diff rencier et de donner naissance aux prog niteurs des lign es my lo des et lymphoides Ces prog niteurs ont alors la capacit d engendrer apr s diff renciation tous les types de cellules sanguines voir le sch ma ci dessous w Lymphocyte T P v w Lymphocyte B v ee we rythrocyte CSH Nu a PAN de M gakaryocyte Plaquette Ru It Basophile CPM Mastocyte QW as N Eu osinophyle 3 Neutrophile Monocyte Macrophage Cellule de Kupffer Mags x Cellule de Langerhans Cellule dentritique Figure 2 Sch ma de l h matopoi se tir de Sigma Aldrich Hematopoietic Stem Cell Pathway 16 Du point de vue de la morphologie cellulaire les CSH ressemblent n importe quel lymphocyte soit une petite cellule ronde non adh rente avec un noyau rond et un petit cytoplasme par rapport au noyau Il n y a pas de facon directe pour identifier les CSH Cependant l utilisation de marqueurs de surface permet l identification d une population enrichie en CSH Les principaux marqueurs de surface de ces cellules sont le CD34 CD38 CD90 CD133 CD105 CD45 et c kit Il existe des diff rences entre les marqueurs murins et humains des CSH cependant un marqueur couramment utilis pour identifier et isoler une population de cellules prog nitrices est le CD34 Les cellules sanguines matures ont
96. pportent le r le des ost oblastes dans le maintient des CSH et la r gulation de l h matopoi se 24 4 1 2 La niche vasculaire L h matopo se et la vascularisation ont lieu de fa on concurrentielle durant le d veloppement Comparativement la niche ost oblastique favorisant la quiescence des CSH la niche vasculaire est un microenvironnement alternatif favorisant leur prolif ration et diff renciation 102 Des tudes sugg rent que l endoth lium sinuso dal favorise la prolif ration et diff renciation des cellules souches et prog nitrices en leur procurant un microenvironnement plus riche en nutriments avec une concentration en facteurs de croissance et oxyg ne plus lev e et dans lequel les cellules sanguines matures sont ultimement rel ch es dans la circulation p riph rique 102 103 Par exemple il a t d montr l aide d un mod le murin mutant pour la thrombopoi tine TPO une hormone stimulant la thrombopoi se que les CSH taient recrut es la surface endoth liale et s y diff renciaient pour g n rer des plaquettes sanguines En effet cette tude a montr que les CSH quittaient la niche ost oblastique et transloquaient la niche vasculaire et s y diff renciaient en m gacaryocytes Cette action impliquerait la m talloprot inase MMP 9 laquelle m dierait le rel chement du ligand kit soluble sKitL 102 104 25 42 LES MOL CULES DE SIGNALISATION ET D ADH SION Les mol
97. ptor J Bone Miner Res 2005 20 1 p 23 29 Kobayashi Y Mozoguchi T Take I Kurihara S Udagawa N et Takahashi N Prostaglandin E2 enhances osteoclastic differentiation of precursor cells through protein kinase A dependent phosphorylation of TAKI J Biol Chem 2005 280 12 p 11395 11403 Take I Kobayashi Y Yamamoto Y et al Prostaglandin E2 strongly inhibits human osteoclast formation Endocrinology 2005 146 12 p 5204 5214 Kaneko H Mehrotra M Alander C Lerner U Pilbeam C et Raisz L Effects of prostaglandin E2 and lipopolysaccharide on osteoclastogenesis in RAW 264 7 cells Prostagladins Leukot Essent Fatty Acids 2007 77 3 p 181 186 Klein Nulend J Pilbeam CC Harrison JR Fall PM et Raisz LG Mechanism of regulation of prostaglandin production by parathyroid hormone interleukin 1 and cortisol in cultured mouse parietal bones Endocrinology 1991 128 5 p 2503 2510 Raisz LG et Simmons HA Effects of parathyroid hormone and cortisol on prostaglandin production bu neonatal rat calvaria in vitro Endocr Res 1985 11 1 p 59 74 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 96 Kawaguchi H Raisz LG Vozensensky OS Alander CB Hakeda Y et Pilbeam CC Regulation of the two prostaglandin G H synthases by parathyroid hormone interleukin 1 cortisol and prostaglandin E2 in cultured neonatal mouse calvariae Endocrinology 1994 135 3 p 1157 1164 Tetrais
98. que lors de transplantations de moelle osseuse dans le but de pr venir le rejet de greffe et de faciliter la restauration h matopoi tique Cependant les r sultats chez l homme sont contradictoires Le premier essai clinique utilisant des CSM pour acc l rer la r g n ration h matologique a t effectu chez des patients atteints du cancer du sein via leur co infusion avec des CSH d riv es de sang p riph rique Aucune toxicit reli e aux CSM n a t rapport e et une reconstitution h matopoi tique rapide a t not e 199 Apr s ces r sultats plusieurs tudes de phase I et II ont t men es afin d valuer la s curit de l infusion de CSM chez les patients atteints de d sordres h matologiques recevant une transplantation de CSH allog nique 200 Les r sultats d montrent encore que la co infusion de CSM n a pas t associ e avec des effets d l t res que la reconstitution h matopoi tique est rapide pour la plupart des patients et que les temps de prise de greffe de neutrophiles et de plaquettes et qu une GvHD mod r e s v re est observ e seulement chez 28 des patients Cependant d autres tudes p diatriques valuant la s curit et l efficacit de la co transplantation de CSM avec des CSH d riv s de sang de cordon ombilical ont t men es Les r sultats d montrent que cette technique est faisable et s curitaire mais cette fois ci aucune diff rence n a t observ e en ce q
99. r que les CSM supportaient le d veloppement h matopoi tique 81 Les CSM produisent un grand nombre de cytokines et de prot ines de la matrice extracellulaire et expriment des mol cules d adh sion cellulaires lesquelles sont toutes impliqu es dans la r gulation de l h matopo se 81 82 CHAPITRE IV 4 1 LA NICHE DES CSH Une niche de cellules souches est un site sp cifique selon le tissu adulte o les cellules souches r sidentes y subissent l auto renouvellement et la diff renciation Structurellement la niche est form e par des cellules de support procurant un microenvironnement pour les cellules souches ainsi que par des signaux manant des ces cellules de support 83 85 Le concept de niche des CSH est le premier tre propos en 1978 par Schofiels R et son quipe pour d crire le microenvironnement limit dans lequel ces cellules r sident 86 Dans la moelle osseuse les CSH utilisent soit la niche ost oblastique soit vasculaire selon les circonstances L habilet des CSH mobiliser et retourner homing la niche repose sur des reconnaissances mol culaires sp cifiques l adh sion d sengagement cellule cellule la migration transendoth liale et finalement l ancrage la niche de la moelle osseuse 87 90 4 1 1 La niche ost oblastique 20 Chez les mammif res la moelle osseuse est principalement compos e de cellules h matopo tiques quiescentes encastr es da
100. r le nichage h matopo tique et le maintient des cellules h matopo tiques la moelle Ensuite nous avons remarqu que les CSM ont un effet b n fique sur le nichage h matopoi tique sans m me qu il n y ait de dommage reli l irradiation Cela pourrait s expliquer par le fait qu en condition normale le microenvironnement est constamment sujet des dommages et que m me si peu nombreux ceux ci peuvent avoir un impact limitant sur le nichage h matopoi tique Nous pouvons alors supposer que leur correction par les CSM peut tre un facteur am liorant le nichage h matopoi tique Une autre 74 hypoth se est que les CSM s cr tent des cytokines chimioattractantes pour les CSH ce qui aurait aussi pour effet d am liorer leur nichage Cependant d autres tudes devront tre effectu es afin d approfondir nos connaissances quant aux voies impliqu es dans ce processus M me si la th rapie de CSM d montre une augmentation du nichage h matopo tique suite l irradiation cette technique laisse place am lioration En effet les r sultats d montrent que nous sommes loin d avoir restaur les niveaux de nichage de base observ s sans irradiation Cela pourrait s expliquer par le fait que la quantit de CSM que nous avons inject e tait trop faible En raison de la technique d isolation et purification des CSM fastidieuse et peu rentable il tait impensable d en injecter davantage En effet
101. ronnement osseux Plusieurs vidences montrent que les CSM peuvent faciliter ces processus Plusieurs tudes utilisant les CSM en tant qu agents th rapeutiques pour l am lioration de la prise de greffe h matopo tique ont t men es dans diff rents mod les animaux Par exemple les r sultats d infusions syst miques de CSM allog niques d riv es de la moelle osseuse de babouins ont montr une suppression de la prolif ration des lymphocytes et le prolongement de la survie des greffes allog niques comparativement aux animaux ne recevant pas de th rapie cellulaire base de CSM 195 D autres tudes sur des souris NOD SCID montrent que la co infusion de CSM et de CSH d riv es de sang de cordon et de placenta exprimant le CD34 est associ e avec l augmentation de la prise de greffe h matopoi tique 196 197 Il est noter que l am lioration de la prise de greffe via une th rapie cellulaire de CSM a lieu lorsque les doses de CSH transplant es sont particuli rement faibles D autre tudes chez les primates non humains ont d montr que la co transplantation de CSM am liorait la prise de greffe de CSH apr s une transplantation intra osseuse autologue 198 Les r sultats exp rimentaux obtenus par les exp riences in vitro et dans les mod les animaux concernant les propri t s immunomodulatrices et l am lioration de la prise de greffe des CSM ont g n r un int r t quant leur 37 application clini
102. s au receveur ge th rapie pr c dente conditionnement exposition aux infections ant rieures 29 La mortalit reli e aux infections est observ e dans plus de 50 des d c s apr s une transplantation de sang de cordon ombilical dont la majorit surviennent dans les 100 premiers jours post transplantation 12 30 32 D autres effets physiologiques long terme sont observ s chez les patients ayant subi des traitements de conditionnement pr greffe incluant la dysfonction d organes ou de tissus non malins et des risques plus lev s de d velopper des cancers secondaires 33 2 2 LE CONDITIONNEMENT Le conditionnement associe habituellement plusieurs mol cules de chimioth rapie avec ou sans radioth rapie et il n est pas rare d ajouter des anticorps monoclonaux La dose de chaque composante du traitement d finie le caract re plus ou moins intensif du conditionnement 2 2 1 Le conditionnement standard 2 2 1 1 La radioth rapie La radioth rapie irradiation corporelle totale tait auparavant utilis e seule puis associ e ensuite une chimioth rapie de type cyclophosphamide 34 Par la suite d autres agents chimioth rapeutiques y ont t associ s au cours des ann es Plusieurs tudes ont permis d identifier les doses maximales utilisables avec la chimioth rapie L irradiation corporelle totale tait initialement r alis e en une seule fois quelle que soit la dose menant des effets secondair
103. s entre les cellules T du donneur et les cellules pr sentatrices d antig nes CPA de l h te puis l induction subs quente de cytokines proinflammatoires et d effecteurs cellulaires 15 Ces interactions se produisent lorsque les antig nes des leucocytes humains HLA de la greffe sont incompatibles avec ceux du receveur Lors d une transplantation de sang de cordon il est recommand d avoir au maximum 1 2 disparit s sur 6 sinon les risques de GvHD sont augment s et la probabilit de la prise de greffe diminu e 16 Les CPAs de l h te sont critiques pour l induction de la GvHD par l activation des cellules CD4 et CD8 du donneur Les observations cliniques supportent le r le des APCs dans le d veloppement de la GvHD 17 18 et donc de cibler les CPAs de l h te pourrait tre une strat gie prometteuse pour pr venir la GvHD 19 La GvHD peut avoir lieu selon 3 conditions lors de la transplantation cellulaire allog nique i le receveur est immunocompromis par le conditionnement pr greffe radiation chimioth rapie lui causant des dommages tissulaires incluant l alt ration de la barri re pith liale intestinale et le rel chement de cytokines inflammatoires ii le donneur et le receveur sont diff rents antig niquement ce qui active les CPAs et les facteurs inflammatoires iii et la greffe du donneur contient des cellules effectrices les cellules T immunologiquement actives 20 Plusie
104. s jeunes patients 10 2 2 1 2 La chimioth rapie La chimioth rapie est un traitement syst mique m dicamenteux ralentissant ou bloquant le d veloppement la multiplication et la propagation des cellules canc reuses Il existe de nombreux agents chimioth rapeutiques employ s seuls ou en association Par exemple la chimioth rapie standard de forte intensit consiste en une combinaison de cyclophosphamide de busulfan et ou de fludarabine Chaque agent poss de une structure chimique unique et diff re dans son principe d action dans son mode d emploi et dans les effets secondaires qu il peut engendrer Les agents antin oplasiques agissent de fa on syst mique et peuvent s administrer par voie orale intraveineuse ou intramusculaire La majorit de ces substances fonctionnent de mani re non sp cifique par arr t de la mitose phase M ce qui permet de cibler pr f rentiellement les cellules canc reuses qui ont la caract ristique de se diviser rapidement D autres agents sont sp cifiques la phase S du cycle cellulaire tels que l arabinoside et le m thotrexate De plus il existe des substances qui ne sont pas sp cifiques au cycle cellulaire tels que les agents alkylants On compte plusieurs classes d agents antin oplasiques les agents alkylants les antim tabolites les alcalo des les inhibiteurs de la topo som rase les antibiotiques et autres agents dont les interf rons et les hormones
105. s sanguines augmente la prise de greffe de moelle osseuse alors que des anticorps dirig s contre le CXCR4 l inhibent 8 De plus il a t d montr que les ost oblastes et les cellules endoth liales de la moelle expriment SDF 1 ce qui permet de localiser les cellules prog nitrices h matopoi tiques la moelle 126 128 Le SDF 1 a 27 aussi un r le dans la migration transendoth liale des CSH m di e par E et P s lectine 129 L activation des mol cules d adh sion comme very late antigen 4 VLA 4 et leukocyte function associated antigen 1 LFA 1 est aussi requise pour ce processus et pour la migration subs quente la surface des ost oblastes 102 Les GTPases Rho Rac et Rac2 en r ponse aux signaux de SDF 1 sont aussi impliqu es dans la r gulation de la mobilisation et du nichage des CSH 130 Par ailleurs un traitement avec AMD 3100 un antagoniste sp cifique de CXCRA induit rapidement et drastiquement la mobilisation des CSH hors de la niche ost oblastique autant chez l homme que chez la souris 131 133 SDF 1 joue aussi un r le important par rapport aux fonctions biologiques et physiologiques des CSM 134 135 Lorsqu un site est endommag l augmentation de l expression du SDF 1 agit comme chimioattractant recrutant les CSM circulantes lesquelles sont n cessaire pour la r paration tissulaire Il a t observ e que le rel chement local de SDF 1 favorisait le recrutement des CSM et la r
106. serum free media a MEM for 72 hours Conditionned media was collected and concentrated about 15 fold using Centricon amp Plus 70 columns Millipore Billerica MA and conserved at 4 C until used Where indicated 250 ul of concentrated conditioned media was injected intraperitoneally solG CSFR decoy fonctionnality assay MSC expressing endogenous levels of the G CSFR were cultured at 80 confluence and starved in serum free media for 24 hours Cells were then stimulated for 5 minutes with conditionned media collected from MSC or MSC secreting the solG CSFR and supplemented with either 0 0 2 2 or 20 ng ml G 48 CSF Cells were then washed with phosphate buffered saline and resuspended in lysis buffer containing proteinase inhibitors After incubation on ice for 30 minutes lysates were cleared by centrifugation and supernatants collected for western blots analysis using ERK1 2 and pERK1 2 antibodies ab17942 and ab50011 Abcam Cambridge MA Homing CS7BL 6 mice were exposed or not to a unique sublethal dose of 8 Gy total body irradiation using cobalt 60 as a source One or five days post exposure to IR 5x10 nucleated bone marrow cells stained according to the manufacturer instructions with 0 54M carboxyfluorescein succinimidyl ester Invitrogen Burlington ON or 4 uM PKH26 Sigma St Louis MO were injected into the tail vein 16 hours later recipient mice were sacrificed and femoral bone marrow harvested for flow cyt
107. t to IR 8 Gy and were injected or not with 5x10 MSC 5 days later mice were transplanted with 5x10 WBM PKH26 cells and sacrified the day after B Homing was determined by the absolute number of PKH26 cells present in femurs whole bone marrow WBM of mice n 8 6 12 10 mice per group CTR a and MSC m Student test p 0 05 p lt 0 01 compared to CTR mice Figure 3 Increased level of G CSF in the bone marrow following exposure to IR A ELISA analysis of G CSF secreted in femur of mice exposed to IR 8 Gy 2 days and 1 week prior to sacrifice compared to CTR mice non irradiated n 18 12 10 10 mice per group One way ANOVA test p 0 001 Figure 4 Generation of a secreted G CSF decoy receptor A Schematic of the G CSF receptor and G CSF decoy receptor lacking transmembrane and extracellular domains B Westen blot analysis of G CSF receptor expression in cell lysates and conditionned media CM of 293T cells non transfected CTR transfected with full length G CSFR receptor G CSFR or soluble G CSF decoy receptor solG CSFR C Western blot analysis of pERK1 2 and ERK1 2 expression in cell lysates of MSC stimulated with conditionned media of MSC or MSC solG CSFR and next supplemented either with 0 0 2 2 or 20 ng ml G CSF Proportion of pERK inhibition by solG CSFR decoy was 63 determined by band intensity comparison of cells stimulated with MSC solG CSFR versus MSC conditionned media for ea
108. t 2005 115 8 p 2083 2098 Pitzer C Kr ger C Plaas C Kirsch F Dittgen T M ller R Laage R Kastner S Suess S Spoelgen R Henriques A Ehrenreich H Sch bitz WR Bach A et Schneider A Granulocyte colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Brain 2008 131 p 3335 3347 Narumiya S Sugimoto Y et Ushikubi F Prostanoid receptors structures properties and functions Physiol Rev 1999 79 4 p 1193 1126 Miller SB Prostaglandins in health and disease an overview Semin Arthritis Rheum 2006 36 p 37 49 Kurland JI Bockman RS Broxmeyer HE et Moore MA Limitation of excessive myelopoiesis by intrinsic modulation of macrophage derived prostaglandin E Science 1978 199 p 552 555 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 94 Kurland JI Broxmeyer HE Pelus LM Mockman RS et Moore MA Role for monocyte macrophage derived colony stimulating factor and prostaglandin E in the positive and negative feedback control of myeloid stem cell proliferation Blood 1978 52 2 p 388 407 Taniguchi S Shibuya T Harada M et Niho Y Prostaglnadin mediated suppression of in vitro growth of erythroid progenitor cells Kidney Int 1989 36 4 p 712 718 Vore SJ Eling TE Danilowicz M Tucker AN et Luster MI Regulation of murine hematopoiesis by arachidonic acid metabolites Int J Immunopharmacol 1989 11 5 p 435 442
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110. ui attrait aux taux de prise de greffe et aux vitesses de r g n ration h matologique entre les groupes de patients trait s ou non avec des CSM 196 201 De plus il a t d montr que chez des patients recevant une transplantation de sang de cordon auxquels on administrait des CSM au moment de la transplantation ne pr sentaient aucun effet sur la cin tique des cellules greff es tout comme sur la pr vention de la GvHD 202 Ces derniers r sultats indiquent que la co transplantation de CSH et de CSM est s curitaire mais il reste incertain que les CSM soient r ellement 38 efficaces dans l am lioration de la prise de greffe h matopoi tique et pour l acc l ration de la vitesse de reconstitution h matologique Les r sultats exp rimentaux contradictoires entre les mod les in vivo et in vitro pourraient tre attribu s l h t rog n it des populations cellulaires de CSM d pendamment de la source tissulaire animale et humaine De plus les m canismes par lesquels les CSM pourraient favoriser la prise de greffe h matopo tique lors d une co transplantation restent controvers s En fait si l action des CSM est de moduler la prise de greffe h matopo tique via des m canismes immunomodulateurs ou de r g n ration du microenvironnement osseux la pr sence des CSM transplant es dans la niche osseuse devrait tre n cessaire Cependant un grand nombre d tudes ont document que les CSM ne nichent pas
111. urs approches sont tudi es afin de r duire les cytokines proinflammatoires initiant la GvHD 21 incluant le d veloppement de m thodes non my loablatives et le blocage du TNF tr s t t apr s la transplantation 22 Les r les des cytokines inflammatoires suivant un conditionnement my loablatif ont t confirm s dans des mod les de transplantation murins et des observations cliniques Les r sultats des mod les murins d montrent le rel chement de cytokines inflammatoires post irradiation 23 25 augmentant l activation des CPAs 26 27 tandis que les donn es cliniques mettent en vidence l augmentation des niveaux de TNF a chez les receveurs transplant s et l utilit clinique des drogues bloquant le TNF 28 Finalement la transplantation de moelle osseuse est une technique risqu e plusieurs effets secondaires peuvent en d couler d butant de fa on pr coce dans les 3 mois post transplantation et d autre devenant apparents seulement des ann es ou des d cennies plus tard Les infections opportunistes le plus souvent d origine virale sont la cause majeure de mortalit reli e la transplantation durant les 6 premiers mois apr s la transplantation caus e principalement par un d lai dans la reconstitution immunitaire La r g n ration du syst me immunitaire est un processus tr s complexe influenc autant par la greffe dose cellulaire histocompatibilit s rologie du donneur que par des facteurs reli
112. utilis es d autres essais cliniques notamment pour l laboration de traitements pour de la maladie de Crohn le diab te de type I et des scl roses multiples 75 Finalement beaucoup d tudes portant sur l application de techniques de modifications g niques des CSM d montrent que ces cellules peuvent tre utilis es comme un outil de th rapie cellulaire tr s int ressant La capacit d auto renouvellement et la possibilit d amplifier les CSM in vitro sont des atouts permettant facilement leur utilisation en laboratoire De plus plusieurs tudes ont d montr es que les CSM sont faciles transduire avec une vari t de vecteurs et que cela ne semble pas affecter leur croissance Les CSM sont consid r es comme d excellents v hicules pour le transfert de g ne dans les essais cliniques Il a t rapport dans plusieurs mod les animaux que les CSM conservaient leur activit biologique apr s une transfection g nique via des vecteurs r troviraux et qu elles avaient la capacit d exprimer le g ne d int r t par exemple l IL 3 les facteurs humains VIII et IX et l rythropoi tine humaine et ce pour de longue p riodes in vivo 194 36 5 2 LES CSM EN TANT QU AGENT TH RAPEUTIQUE POUR AM LIORER LA PRISE DE GREFFE H MATOPOI TIQUE Pour la transplantation h matopoi tique il est primordial d acqu rir un tat de tol rance ou d insensibilit immunologique et de r g n rer le microenvi
113. vska I Shyshynova I et al Small molecule inhibitor of p53 binding to mitochondria protects mice from gamma radiation Nat Chem Biol 2006 2 9 474 9 Landry Y Le O Mace KA Restivo TE Beausejour CM Secretion of SDF lalpha by bone marrow derived stromal cells enhances skin wound healing of C57BL 6 mice exposed to ionizing radiation J Cell Mol Med 2010 14 6B 1594 604 Christopher MJ Rao M Liu F Woloszynek JR Link DC Expression of the G CSF receptor in monocytic cells is sufficient to mediate hematopoietic progenitor mobilization by G CSF in mice The Journal of experimental medicine 2011 208 2 251 60 Morrison SJ Wandycz AM Akashi K Globerson A Weissman IL The aging of hematopoietic stem cells Nature medicine 1996 2 9 1011 6 Shojaei F Wu X Zhong C Yu L Liang XH Yao J et al Bv8 regulates myeloid cell dependent tumour angiogenesis Nature 2007 450 7171 825 31 62 FIGURE LEGENDS Figure 1 Impaired homing to the bone marrow following exposure to IR A Absolute number and B proportion average SEM of PKH26 cells present in femurs whole bone marrow WBM of mice transplanted with 5x10 WBM PKH26 cells and exposed or not to IR 8 Gy 2 or 5 days prior to sacrifice n 6 20 8 10 mice per group Student f test p lt 0 05 p lt 0 0001 Figure 2 Injection of bone marrow stromal cells MSC partially restores homing post IR A Schematic of the experiment Mice were exposed or no
114. we have engineered a truncated version of the G CSFR lacking 211 amino acids on the C terminus corresponding to the transmembrane and intracellular domains see Fig 4a Cloning of the full and truncated versions of the G CSFR in lentiviral vectors confirmed their stable expression at the expected molecular weight Fig 4b Importantly the presence of the soluble receptor was only detected in the supernatant of cells transduced with the truncated form of the G CSFR latter referred as solG CSFR see Fig 4b The capacity of the solG CSFR to sequester G CSF was demonstrated in vitro by showing reduced ability of recombinant G CSF to induce ERK1 2 phosphorylation in the presence of conditioned media CM containing the decoy receptor Fig 4c 52 As a first attempt to sequester G CSF systemic we used cultured bone marrow derived stromal cells as a delivery vehicle to express the solG CSFR in mice We used an experimental protocol in which 15x10 stromal cells were injected intraperitoneally immediately after exposure of mice to IR and only one day before homing was determined see Fig 5a We found the injection of stromal cells secreting the solG CSFR to increase homing by as much as 90 when compared to mice who did not receive any cells Fig 5b In comparison injection of stromal cells alone conferred only a 37 increase in homing Fig 5b The benefit from the secretion of the solG CSFR was also reproduced using this time only CM collect
115. y compromised in a time dependent manner following exposure to IR a phenotype we think is currently overlooked in the clinic We believe it may be beneficial to develop bone marrow transplantation protocols in which HSC are injected rapidly after exposure to IR Our results also suggest that a better knowledge of cytokines released in the bone marrow microenvironment following IR induced damage such as G CSF could lead to the development of novel strategies improving homing 56 ACKNOWLEDGMENTS We would like to thank Vimal Krishnan for his critical reading of the manuscript and Denise Carrier for her help with mice This work was supported by grants from the Canadian Institute of Health Research CIHR MOP 102709 and the Fonds de la recherche en sant du Qu bec FRSQ to C M B B B has been supported by a student fellowship from the FRSQ C L C by a studentship from the CIHR A F and C M B have been supported respectively by a studentship from the Fondation des toiles and a scientist award by the FRSQ CONFLICT OF INTEREST DISCLOSURE No financial interest relationships with financial interest relating to the topic of this article have been declared 57 REFERENCES Rocha V Broxmeyer HE New approaches for improving engraftment after cord blood transplantation Biol Blood Marrow Transplant 2010 16 1 Suppl 8126 32 Jetmore A Plett PA Tong X Wolber FM Breese R Abonour R ef al Homing efficiency cell cycle k

4.3.2 Le G-CSF - Papyrus

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