Tubes Leucosep - Oxford Immunotec
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1. Tubes Leucosep LTK 615 NOTICE Pour test diagnostique in vitro OC Oxford 360 Immunotec Harnessing the power of T cell measurement PI LT 615 FR V3 Instructions Utilisation vis e Les tubes Leucosep sont con us pour tre utilis s en vue du recueil et de la s paration des cellules mononucl es du sang p riph rique PBMC a partir de sang entier Ces tubes facilitent la s paration des PBMC a partir de sang entier au moyen de la proc dure FICOLL PAQUE PLUS avant utilisation de ces cellules lors de tests ELISPOT Introduction La technique ELISPOT utilise des cellules T dans les PBMC qui ont t s par es du sang entier L une des m thodes de s paration de ces cellules n cessite l utilisation de FICOLL PAQUE PLUS Cette proc dure implique un certain nombre d tapes qui devront tre r alis es avec soin pour assurer des r sultats optimaux L utilisation des tubes Leucosep diminue le nombre d tapes rend la proc dure plus robuste et raccourcit le d lai n cessaire a la proc dure de s paration Principe de la m thode Les tubes Leucosep ont t concus pour r aliser la s paration optimale des PBMC a partir de sang entier humain au moyen d une centrifugation en gradient de densit Les tubes Leucosep sont constitu s d un tube de polypropyl ne transparent comprenant une barri re poreuse Cette barri re biologiquement inerte est compos e de poly thyl ne de qualit sup rieure L ut2. sanguin n est pas a temp rature ambiante 18 25 C Le sang n est pas dilu Renversement de l chantillon sang l int rieur du tube Leucosep Centrifugation inad quate S paration des chantillons incompl te S assurer que le sang est transport une temp rature comprise entre 18 et 25 C ou entre 10 et 25 si le r actif T Cell Xtend est utilis Laisser le tube de pr l vement sanguin se stabiliser temp rature ambiante S assurer que le sang est dilu selon la proc dure S assurer que le tube Leucosep reste en position verticale avant la centrifugation S assurer que les consignes de centrifugation sont suivies V rifier que la centrifugeuse est en mesure de maintenir une temp rature comprise entre 18 et 25 C V rifier que le frein de la centrifugeuse est en position arr t Allonger l tape de centrifugation de 10 min Aucune couche d finie ou distincte de cellules mononucl es S paration des chantillons incompl te La centrifugeuse n est pas ad quatement calibr e Centrifugation inad quate Echantillon hyperlipid mique Allonger tape de centrifugation de 10 min Faire calibrer la centrifugeuse S assurer que les consignes de centrifugation sont suivies Recueillir un chantillon de sang jeun R sultats non valides Un certain nombre de probl mes de manipulation de l chantillon peuvent tre l origine de r sultats n
3. chantillon a t trait par d p t manuel sur une couche de FICOLL Le deuxi me chantillon a t trait en utilisant un tube Leucosep En utilisant les deux m thodes un nombre suffisant de cellules a t obtenu pour que les chantillons puissent tre utilis s dans un test ELISPOT et les cellules obtenues de tous les chantillons taient fonctionnelles dans le test Solutions en cas de probl mes lors du recueil et de la s paration des PBMC en vue d un test ELISPOT Probleme Cause potentielle Solution possible Faible rendement cellulaire Leucop nie Ajouter un tube de pr levement sanguin suppl mentaire Recueil sanguin inad quat Les tubes de pr l vement CPT ou contenant de l EDTA ne sont pas compatibles avec les tubes Leucosep Le tube de pr levement Laisser le tube de pr levement sanguin n est pas a sanguin se stabiliser a temp rature ambiante temp rature ambiante 18 25 C Le sang n est pas conserv S assurer que le transport du la temp rature voulue sang s effectue a une temp rature comprise entre 18 et 25 C ou entre 10 et 25 C si le r actif T Cell Xtend est utilis Utilisation de dilutions ou de S assurer que les consignes volumes autres que ceux ad quates sont suivies recommand s Notice Leucosep Page 4 sur 6 PI LT 615 FR V3 Contamination par des globules rouges Le sang n est pas conserv a la temp rature voulue Le tube de pr l vement
4. V ou RPMI dans un tube de centrifugation de 15 mL Renverser le tube de centrifugation plusieurs fois pour m langer 4 Verser le sang dilu directement dans le tube Leucosep et centrifuger a 1 000 x g pendant 10 minutes a 18 25 C sans frein 5 Aspirer la couche trouble de PBMC et compl ter jusqu environ 10 mL avec l AIM V ou RPMI dans un tube de centrifugation de 15 mL Renverser le tube de centrifugation pour m langer 6 Centrifuger 600 x g pendant 7 minutes Eliminer le surnageant 7 Resuspendre le culot cellulaire avec de l AIM V ou RPMI compl ter jusqu environ 10 mL avec de l AIM V ou du RPMI puis centrifuger 350 x g pendant 7 minutes 8 Eliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans le volume d AIM V ne pas utiliser de RPMI n cessaire pour le test ELISPOT 9 Si des cellules sont n cessaires pour une stimulation antig nique lors d un test ELISPOT diluer les cellules le cas ch ant avec de l AIM V ne pas utiliser de RPMI Limites 1 Comme avec d autres milieux de s paration les tubes Leucosep peuvent alt rer la proportion de certaines sous populations de PBMC ex cellules T et B par rapport celles dans le sang total non s par On estime que cette alt ration est relativement insignifiante dans les cas normaux Contr le de la qualit Des tests internes n ont montr aucune diminution significative du rendement de PBMC lorsque l on compare FICOLL PAQUE PLUS en ut
5. expiration de la date de p remption indiqu e sur la bo te Conserver le produit ouvert a temp rature ambiante 18 25 C et utiliser dans les 12 semaines qui suivent louverture de l emballage ext rieur ou au plus tard avant la date de p remption indiqu e sur la bo te soit avant la premi re de ces deux ch ances quipement et mat riel requis mais non fournis Tubes de pr l vement sanguin h parines Milieux de culture cellulaire AIM V et RPMI Tubes de centrifugation de 15 mL Centrifugeuse pour le fractionnement des PBMC capable d au moins 1000 x g et de maintenir les chantillons temp rature ambiante 18 25 C Enceinte de s curit biologique de niveau BL2 recommand e Pipettes et embouts de pipette st riles Kit ELISPOT Le r actif T Cell Xtend sera n cessaire si des chantillons vieux de plus de 8 heures sont utilis s PA D CONDO Proc dure Remarque Les tapes suivantes doivent tre r alis es selon les principes des Bonnes Pratiques de Laboratoire 1 S assurer de placer le nombre n cessaire de tubes Leucosep temp rature ambiante 18 25 C avant utilisation 2 Si le FICOLL PAQUE PLUS s est d plac au dessus de la barri re poreuse centrifuger les tubes Leucosep a 350 x g pendant une minute pour d placer le FICOLL PAQUE en dessous de la barri re 3 Renverser l chantillon de sang entier puis diluer raison de 5 parts de sang pour 3 parts de milieu de culture AIM
6. fugation et ou les temp ratures peut alt rer la puret des PBMC et influencer les r sultats des tests 6 Ne pas pr lever le sang sur des tubes CPT Cell Preparation Tubes Becton Dickinson ou EDTA car ceux ci sont incompatibles avec les tubes Leucosep 7 Ne pas r frig rer ni congeler les chantillons de sang total Conserver et transporter les chantillons sanguins au laboratoire entre 18 et 25 C ou entre 10 et 25 si les chantillons doivent tre trait s avec le r actif T Cell Xtend 8 Le sang ne doit pas tre conserv pendant plus de 8 heures ou pendant plus de 32 heures s il est trait ensuite avec le r actif T Cell Xtend 9 Nvutiliser que des contenants jetables pour le recueil de l chantillon de sang veineux 10 Ne pas utiliser apr s la date de p remption 11 Observer des techniques aseptiques lors de l utilisation de ce produit 12 Conserver les tubes Leucosep l abri de la lumi re directe 13 Ne pas utiliser si les tubes Leucosep sont endommag s ou le FICOLL PAQUE PLUS est d t rior comme l indique l apparition d une couleur jaune caract ristique ou de particules dans la solution limpide Notice Leucosep Page 2 sur 6 PI LT 615 FR V3 Mat riel fourni Chaque boite contient 50 tubes Leucosep pr remplis de FICOLL PAQUE PLUS CD contenant la notice et la fiche signal tique des donn es de s curit Conservation et stabilit Conserver non ouvert entre 4 et 30 C jusqu l
7. ilisant des tubes Leucosep En tant que partie int grante des activit s de contr le de la qualit d un laboratoire individuel les m thodes de num ration cellulaire Notice Leucosep Page 3 sur 6 PI LT 615 FR V3 doivent tre con ues et valid es afin de s assurer que suffisamment de PBMC ont t obtenues pour le syst me de test appropri De plus les activit s de contr les de la qualit doivent faire usage de contr les positifs et n gatifs con us pour garantir la performance attendue des cellules T dans le syst me de test appropri Caract ristique de la performance Sang conserv avec le r actif T Cell Xtend Deux chantillons de sang de 6 ml ont t obtenus aupr s de 46 donneurs Un chantillon de sang de chaque donneur a t trait dans les 8 heures qui ont suivi la ponction veineuse par d p t manuel sur une couche de FICOLL Le deuxi me chantillon a t trait en utilisant un tube Leucosep apr s 29 a 32 heures de conservation avec le r actif T Cell Xtend En utilisant les deux m thodes un nombre suffisant de cellules a t obtenu pour que les chantillons puissent tre utilis s dans un test ELISPOT et les cellules obtenues de tous les chantillons taient fonctionnelles dans le test Sang frais Deux chantillons de 6 ml ont t obtenus aupr s de 52 donneurs Les deux chantillons de chaque donneur ont t trait s dans les 8 heures qui ont suivi la ponction veineuse Le premier
8. ilisation des tubes Leucosep permet d liminer la t che longue et laborieuse du d p t de l chantillon sur FICOLL PAQUE PLUS Le sang entier anticoagul est m lang au milieu de culture puis vers dans un tube Leucosep La barri re poreuse vite que le sang ne se m lange au milieu de s paration FICOLL PAQUE PLUS Lors de la centrifugation les PBMC sont isol es des rythrocytes non d sir s gr ce a leur diff rence de densit Elles sont recueillies dans l interface au dessus du milieu de s paration Lorsque la s paration est termin e la barri re vite la recontamination de la couche de PBMC lors de son pr l vement Avertissements et pr cautions 1 Pour test diagnostique in vitro seulement Pour utilisation professionnelle seulement Les techniciens doivent tre form s l utilisation de cette proc dure 3 Les chantillons sanguins doivent tre consid r s comme potentiellement dangereux Des pr cautions doivent tre prises lors de la manipulation de produits d origine humaine 4 La manipulation lors de l utilisation de la conservation et de l limination des chantillons de sang total et des composants des tests doit tre effectu e en conformit avec les proc dures d finies dans les directives ou r glements nationaux relatifs a la s curit en cas de risque biologique 5 Tout cart par rapport aux proc dures recommand es vis a vis des techniques de pipetage de lavage les temps de centri
9. on valides Se r f rer aux rubriques ci dessus Notice Leucosep Page 5 sur 6 PI LT 615 FR V3 Glossaire des symboles g utiliser avant Date de p remption An Mois Jour LOT Num ro de lot REF Num ro de catalogue Attention voir le mode d emploi wd Fabricant v Suffisant pour n tests IVD Dispositif de diagnostic in vitro t Limite de temp rature A conserver entre CA Se r f rer au mode d emploi T Cell Xtend et le logo d Oxford Immunotec sont des marques de commerce d Oxford Immunotec Limited AIM V est une marque de commerce d Invitrogen CPT est une marque de commerce de Becton Dickinson FICOLL et FICOLL PAQUE sont des marques de commerce des soci t s du groupe GE L utilisation du r actif T Cell Xtend est prot g e par les brevets et brevets en instance suivants EP2084508 US13 253 598 CN101529221 AU2007 303994 JP2009 530943 IN2165 DELNP 2009 CA2665205 Oxford Immunotec Limited 2013 Tous droits r serv s Fabricant Oxford Immunotec Ltd 94C Innovation Drive Milton Park Abingdon Oxfordshire OX14 4RZ R U 44 0 1235 442796 www oxfordimmunotec com Oxford Immunotec Ltd 888 Oxford asec i i 600 Immunotec Fax dA 1298 442701 Email info oxfordimmunotec com Harnessing the power of T cell measurement www oxford immunotec com Notice Leucosep Page 6 sur 6 PI LT 615 FR V3
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