ProSpecT Shiga Toxin E.coli (STEC) Microplate
Contents
1. ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Centre 1 Ind Ind 12 2 0 12 2 1 156 4 161 Ind 0 0 Ind 0 0 Total des 176 176 chantillons Sensibilit 92 3 92 3 Sp cificit 98 7 98 7 R sultats initiaux R sultats r solus ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Centre 2 Ind Ind 8 3 0 8 3 0 2 186 6 2 193 Ind 0 0 1 Ind 0 0 0 Total des 206 206 chantillons Sensibilit 80 0 80 30 Sp cificit 98 4 98 5 R sultats initiaux R sultats r solus ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Combin s Ind z Ind 20 5 0 20 5 0 3 342 10 354 Ind 0 1 1 Ind 0 0 0 Total des 382 382 chantillons Sensibilit 87 0 87 0 66 4 97 2 66 4 97 2 Sp cificit 98 6 98 6 96 7 99 5 96 6 99 5 Corr lation 95 0 97 9 92 3 97 0 95 9 99 1 Les chiffres entre parenth ses repr sentent les intervalles de confiance 95 Les colonnes R sultats r solus contiennent les r sultats des tests EIA r p t s sur les chantillons qui taient initialement ind termin s Comme le montre le tableau 1 il existe une corr lation de 97 9 pour la m thode par analyse directe des chantillons en ce qui concerne les donn es r solues apr s limination des r sultats ind termin s entre le test de d termination d E coli2. Karmali M A M Petric C Lim P C Fleming G S Arbus 18 2 18 3 and H Lior 1985 The Association Between Haemolytic Uremic Syndrome and Infection by Verotoxin Producing Escherichia coli J Infect Dis 151 5 775 782 18 4 Karmali M B 1987 Laboratory Diagnosis of Verotoxin Producing Escherichia coli Infections Clin Microbiol Newsletter 9 9 65 70 Kleanthous H H R Smith S M Scotland R J Gross B Rowe C M Taylor and D V Milford 1990 Haemolytic uraemic syndrome in the British Isles 1985 8 association with Verocytotoxin producing Escherichia coli Part 2 Micriobiological aspects Am J Dis Child 65 722 727 18 5 18 6 Konowalchuk J Speirs and S Stavric 1977 Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli Infect Immun 18 3 775 779 Konowalchuk J N Dickie S Stavric and J I Speirs 1978 Properties of an Escherichia coli Cytotoxin Infect Immun 20 575 577 18 7 18 8 Konowalchuk J N Dickie S Stavric and J I Speirs 1978 Comparative Studies of Five Heat labile Toxic Products of Escherichia coli Infect Immun 22 644 648 O Brien A D G D LaVeck M R Thompson and S B Formal 1982 Production of Shigella dysenteriae type 1 like Cytotoxin by Escherichia coli J Infect Dis 144 6 763 769 18 10 O Brien A D T A Lively M E Chen S W Rothman and S B Formal 1983 Escherichia coli
3. 0157 H7 Strains Associated with Haemorrhagic Colitis in the United States Produce a Shigella dysenteriae Shiga like Cytotoxin Lancet pp 702 18 9 18 11 O Brien A D and R K Holmes 1987 Shiga and Shiga like Toxins Microbiol Rev 51 2 206 220 18 12 Pai C H R Gordon HY Sims and L E Bryan 1984 Sporadic Cases of Haemorrhagic Colitis Associated with Escherichia coli 0157 H7 Ann Intern Med 101 738 742 18 13 Pai C H N Ahmed H Lior W M Johnson HV Sims and D E Woods 1988 Epidemiology of Sporadic Diarrhoea Due to Verocytotoxin Producing Escherichia coli A Two year Prospective Study J Infect Dis 157 5 1054 1057 18 14 Riley L W R S Remis S D Helgerson H B McGee J G Wells B R Davis R J Hebert E S Olcott L M Johnson N T Hargrett P A Blake and M L Cohen 1983 Haemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype N Engl J Med 308 12 681 685 18 15 Scotland S M H R Smith and B Rowe 1985 Two Distinct Toxins Active on Vero Cells from Escherichia coli 0157 Lancet pp 885 886 18 16 Strockbine N L Marques J Newland H Williams Smith R K Holmes and A D O Brien 1986 Two Toxin Producing Phages from Escherichia coli 0157 H7 Strain 933 Encode Antigenically Distinct Toxins with Similar Biologic Activities Infect Immun 53 1 135 140 18 17 Karch H etal 1996 Isolation of Enteroh
4. 13 ejeleINie me BIRIN IN IN ER IN 0166 1 Total des types 19 16 10 2 3 de toxine Tableau 4 Tests positifs la Shiga toxine en fonction de la consistance des selles Consistance des selles Aqueuse Molle MuqueusesAqueuse Molle Sang Muqueuses Muqueuses Nombre 119 134 41 17 50 30 d chantillons Shiga toxine 8 5 5 0 2 7 Cytotoxine 10 5 5 1 3 7 Sensibilit analytique Le test de d tection d E coli producteurs deShiga toxines STEC ProSpecT permet de d tecter environ 52 pg ml de Stx1 et 126 pg ml de Stx2 Reproductibilit Le coefficient de variation C V entre tests du coffret de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT a t valu en s lectionnant un chantillon n gatif et trois chantillons positifs pr sentant des mesures de densit optique variables Chaque chantillon a t test dans 24 puits par session pendant trois jours cons cutifs Le C V moyen entre tests tait de 8 69 ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Centre 1 Ind Ind 12 1 0 12 1 0 O 160 3 0 163 Ind 0 0 Ind 0 0 0 Total des 176 176 chantillons Sensibilit 100 100 Sp cificit 99 4 99 4 R sultat
5. ce qui concerne les donn es r solues apr s limination des r sultats ind termin s entre le test de d tection d E coli producteurs de Shigatoxines STEC sur microplaque et le test de cytotoxine apr s combinaison des r sultats de tous les centres Divers s rotypes de souches d E coli producteurs de Shiga toxines test s avec le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT ont r agi la m thode par analyse directe ainsi qu celle des coprocultures sur bouillon d enrichissement La liste cidessous recense les s rotypes test s le nombre d chantillons r agissant un s rotype sp cifique et dans la mesure du possible le type de toxine produit par chaque souche chantillon D O moyenne cart type CV 1 0 065 0 0101 15 61 2 0 264 0 0176 6 67 3 0 675 0 0270 4 00 4 0 830 0 0703 8 48 Le C V intra test a t valu en testant 24 puits contenant chacun 4 chantillons Le C V moyen intra test tait de 4 59 chantillon D O moyenne cart type CV 1 0 069 0 0055 8 01 2 0 274 0 0134 4 90 3 0 563 0 1490 2 65 4 1 226 0 0340 2 78 R activit crois e Aucune r action crois e n a t constat e lorsque divers germes de la microflore du c lon humain ont t analys s avec le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines sur microplaque ProSpecT Les tests ont t r alis s en ensemen ant des germes dont la liste figu
6. et ne doit en aucun cas tre remis dans le flacon compte gouttes Diluer au dixi me le concentr de tampon de lavage 10x en ajoutant un volume de concentr 9 volumes d eau distill e ou d min ralis e Le tampon de lavage dilu reste stable pendant un mois conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C La date de p remption de chaque coffret est indiqu e sur l emballage Conserver tous les composants entre 2 et 8 C Les bandes de microplaque inutilis es doivent tre conserv es dans le sachet m tallis refermable qui contient un agent dessiccatif pour liminer l humidit Le substrat color doit tre vers directement depuis le flacon prot geant de la lumi re dans lequel il est fourni et doit y tre conserv entre deux utilisations Une portion aliquote de substrat color pr lev e dans le flacon original pour quelque raison que ce soit ne doit en aucun cas y tre revers e 8 PR L VEMENT DES ECHANTILLONS DE SELLES Les chantillons frais ou sur milieu de transport de Cary Blair doivent tre conserv s entre 2 et 8 C ou congel s une temp rature ne d passant pas 20 C imm diatement apr s le pr l vement Les chantillons destin s la mise en culture doivent tre plac s dans un bouillon une deux heures apr s leur r ception au laboratoire Si les cultures ne peuvent pas tre r alis es dans ce laps de temps les chantillons frais ou pr serv s sur milieu de Cary Blair
7. utilis s d tacher des bandes le nombre de puits n cessaires REMETTRE LES PUITS INUTILIS S DANS LE SACHET ET REFERMER LE SACHET HERM TIQUEMENT POUR LIMINER L HUMIDIT 12 2 Ajouter 4 gouttes 200 ul de contr le n gatif dans le premier puits Ajouter 4 gouttes 200 ul de contr le positif dans un second puits 12 3 l aide d une pipette de transfert ajouter 4 gouttes 200 ll d chantillon dilu ou d chantillon non dilu sur milieu de transport de Cary Blair par puits Remarque Placer l embout de la pipette de transfert juste l int rieur des puits pour viter toute claboussure dans les puits adjacents 12 4 Couvrir la microplaque et incuber temp rature ambiante pendant 60 minutes Commencer chronom trer une fois le dernier chantillon ajout 12 5 Vider les puits en les secouant ou en en aspirant le contenu Laver chaque puits en le remplissant compl tement de tampon de lavage dilu 350 400 ul par puits Apr s chaque lavage vider les puits de tout liquide en les secouant ou en en aspirant le contenu Au total proc der 3 lavages Apr s le dernier lavage liminer tout contenu r siduel en tapotant la plaque sur des serviettes en papier propres ou par aspiration liminer autant de tampon de lavage que possible sans jamais laisser les puits s ass cher compl tement 12 6 Ajouter 4 gouttes 200 ul de conjugu enzymatique dans chaque puits 12 7 Co
8. Key Code TSMX7834 wwWw oxoid com ifu Europe 800 135 79 135 US 1 855 2360 190 CA 1 855 805 8539 ROW 31 20 794 7071 ProSpecT Shiga Toxin E coli STEC Microplate Assay RAM 48 Tests R2474096 e 96 Tests FR 1 INDICATION Le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT a t con u pour la d tection qualitative des Shiga toxines Stx1 et Stx2 dans les extraits aqueux de mati res f cales et dans les coprocultures sur bouillon d enrichissement Le test a pour fonction d aider diagnostiquer les infections par E coli ent roh morragique EHEC 2 R SUM ET EXPLICATION DU TEST Les diverses vari t s d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sont consid r es comme des agents tiologiques importants de la diarrh e responsables de graves pid mieset de cas isol s de colites h morragiques et de syndrome h molytiqu eur mique mena ant le pronostic vital SU gt 3 13 14 Les souches d E coli produisant ces effets ont t d crites pour la premi re fois par Konowalchuk et son quipe qui ont identifi une cytotoxine ayant un effet cytopathog ne sur les cellules Vero d o son appellation de v rotoxine 1 67 La proche parent entre cette cytotoxine et la Shiga toxine a t mise en vidence par O Brien et son quipe qui qualifient cette toxine de Shiga Like SLT Deux formes de la toxine ont t identifi es Stx1 et Stx2 et la product
9. attention particuli re au lavage La D O du contr le positif doit tre gt 0 500 sur un spectrophotom tre une ou deux longueurs d onde et elle doit tre gale ou sup rieure la r action 2 dans le cas d une observation visuelle Si le contr le positif pr sente une couleur jaune d intensit inf rieure 2 sur la fiche de proc dure prendre contact avec l assistance technique 14 R SULTATS Consulter la fiche de proc dure jointe pour l interpr tation des couleurs Examen visuel 14 1 Observer les r sultats en les comparant aux couleurs de r action de la fiche de proc dure Positif couleur jaune d intensit minimale 1 N gatif incolore Ind termin couleur jaune p le r action inf rieure 1 14 2 Interpr tation des r sultats visuels Positif Si une couleur jaune d une intensit au moins gale 1 se d veloppe dans le puits l chantillon contient la toxine Stx1 ou Stx2 ou les deux et le test est positif N gatif L absence de couleur r v le un r sultat n gatif et indique que l chantillon test ne contient pas de toxine Stx1 ou Stx2 ou en contient une proportion ind tectable Ind termin Si une couleur jaune p le d une intensit inf rieure 1 se d veloppe le r sultat du test est ind termin Dans ce cas le test doit tre r p t Si au second test les r sultats sont positifs l chantillon est positif Si les r sultats sont n gatifs l chantillo
10. chantillon dans le diluant des chantillons bact riens et laisser la pipette de transfert dans le tube 11 A 2 B Selles solides ajouter 0 3 g environ 6 mm de diam tre l aide d un b tonnet applicateur mulsionner l chantillon dans le diluant des chantillons bact riens et placer une pipette de transfert dans le tube 11 A 2 C Les chantillons sur milieu de transport de Cary Blair doivent tre plac s directement dans le puits de la microplaque sans autre dilution 11 A 2 D Passer l chantillon en suspension au m langeur vortex B M THODE DU BOUILLON DE CULTURE 11 B 1 Inoculer 50 ul ou 50 ug volume de la grosseur d un petit pois de selles fra ches ou sur milieu de transport de Cary Blair dans 5 ml de milieu TSB bouillon trypticase soja de mTSB bouillon trypticase soja modifi ou de bouillon MacConkey 11 B 2 Incuber 37 C pendant 18 24 heures 11 B 3 Ajouter 0 6 ml de diluant des chantillons bact riens dans un tube propre de 12 x 75 mm 11 B 4 Transf rer 0 3 ml de bouillon de culture dans 0 6 ml de diluant des chantillons bact riens l aide d une pipette de transfert Laisser la pipette de transfert dans le tube 12 MODE OP RATOIRE 12 1 Ouvrir le sachet m tallis sortir le nombre requis de bandes de microplaques les et placer sur un porte bande de microplaque Utiliser un puits pour le contr le n gatif et un pour le contr le positif Si moins de huit puits sont
11. con anticorps monoclonal de souris anti Shiga toxines 12 25ml 12 m1 25 ml de type 1 amp 2 marqu la peroxydase de raifort contenant 0 01 de thiomersal Contr le positif 1 Flacon surnageant de culture surnageante d E coli Ati contenant des 4 ml Shiga toxines 1 amp 2 du s rum bovin foetal du s rum de lapin et 0 02 de thiomersal Contr le n gatif 1 Flacon solution tamponn e contenant du s rum de lapin 4ml et 0 02 de thiomersal Diluant des chantillons bact riens 1 Flacon solution tamponn e contenant du s rum de lapin 110 ml et 0 02 de thiomersal Tampon de lavage 1 Flacon solution tamponn e concentr e 10x contenant 0 1 110 ml de thiomersal Substrat color 1 Flacon TMB dans le tampon 25 ml Solution d arr t 1 Flacon acide sulfurique 1 N 6ml Remarque Les r actifs provenant de coffrets portant des num ros de lot diff rents ne sont pas interchangeables 6 AVERTISSEMENTS ET PR CAUTIONS 6 1 Les r actifs sont fournis dos s pr ts l emploi l exception du concentr de tampon de lavage Ne pas diluer les r actifs sauf instruction contraire Uniquement pour usage diagnostique IN VITRO 6 2 Ne pas utiliser les r actifs apr s les dates de p remption Ces dates sont imprim es sur l tiquette de chaque r actif L utilisation de r actifs au del de la date de p remption risque d alt rer la pr cision des r sultats 6 3 La contamination microbienne des r actifs peut dimin
12. doivent tre congel s une temp rature ne d passant pas 20 C Dans le cas de l analyse directe des selles les r sultats optimaux sont obtenus lorsque le test a lieu d s r ception des chantillons au laboratoire Si le test a lieu dans les 48 heures suivant le pr l vement d chantillons frais ou dans les 7 jours pour les chantillons sur milieu de transport de Cary Blair les chantillons peuvent tre conserv s entre 2 et 8 C sinon ils doivent tre congel s une temp rature ne d passant pas 20 C Des cycles r p t s de cong lation d cong lation peuvent entra ner la d gradation de la toxine Les chantillons dilu s dans le diluant des chantillons bact riens peuvent tre conserv s entre 2 et 8 C pendant un maximum de 48 heures avant le test 9 REMARQUES CONCERNANT LA PROC DURE e Lire attentivement et suivre scrupuleusement toutes les instructions de cette notice e Laisser aux r actifs et aux chantillons dilu s le temps d atteindre la temp rature ambiante 20 25 C e Respecter le m me ordre d ajout des r actifs dans les puits de test tout au long de la proc dure Pour viter toute contamination ne pas toucher le liquide contenu dans les puits avec l extr mit des flacons e Chronom trer avec pr cision toute p riode d attente Commencer compter partir du moment o le r actif a t plac dans le dernier puits de chaque microplaque tester Pour assurer la pr cis
13. ducteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT a t class comme produit hautement complexe 16 VALEURS ATTENDUES Il existe au moins 50 s rotypes d E coli producteurs de Shiga toxines STEC associ s la production de cytotoxines et au d veloppement de pathologies mena ant le pronostic vital telles que la colite h morragique et le syndrome h molytique ur mique SHU ce dernier est une complication majeure dont les cons quences sont l insuffisance r nale la thrombop nie et l an mie Bien que les jeunes enfants constituent la population ayant le risque le plus lev de d velopper un SHU cause d une infection par E coli producteur de Shiga toxine d autres sous groupes tels que les personnes g es et les patients immunod prim s sont galement menac s par cette infection Comme le montrent les r sultats des essais cliniques r alis s avec le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT un ventail de diff rents s rotypes taient pr sents dans la population test e La recherche d infections par STEC ne doit pas se limiter aux tests sp cifiques pour la souche 0157 H7 Il convient galement de remarquer qu il n existe pas toujours de corr lation directe entre les r sultats des analyses pratiqu es directement sur les selles et ceux des analyses avec bouillon d enrichissement Les raisons peuvent tre les suivantes liste non limitativ
14. e 16 4 A la toxine peut tre pr sente dans l chantillon dans une proportion d tectable mais les cellules de STEC ne sont plus cultivables 16 4 B les souches isol es d E coli 0157 dans les coprocultures des patients ont un rapport inversement proportionnel l intervalle entre la survenue de la diarrh e et la culture microbiologique 7 16 4 C la toxine peut tre pr sente dans l chantillon dans une proportion ind tectable par le test mais les cellules de STEC sont quand m me cultivables et 16 4 D le traitement antibiotique peut influer sur la cultivabilit des cellules de STEC 17 CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCE Sensibilit et sp cificit Le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT a t valu dans trois centres cliniques g ographiquement distincts aux tats Unis au Canada et en Allemagne savoir respectivement un h pital d un grand centre urbain de Virginie un h pital p diatrique de Toronto et un grand centre de microbiologie Les populations repr sent es dans les groupes d chantillons taient des patients symptomatiques appartenant des populations adultes et p diatriques pr valence normale Les chantillons soumis taient non pr serv s ils ont t analys s avec le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT en utilisant des chantillons frais et des copr
15. emorrhagic Escherichia coli 0157 Strains from Patients with Hemolytic Uremic Syndrome by Using Immunomagnetic Separation DNA Based Methods and Direct Culture JCM March 1996 34 3 516 519 CE IFU X7834 r vis Mai 2012 Remel Europe Ltd Clipper Boulevard West Crossways Dartford Kent DA2 6PT UK ul Pour une assistance technique contacter le distributeur local
16. ion d une ou des deux cytotoxines par des isolats d E coli STEC a t d montr e gt 16 E coli 0157 H7 est le s rotype d EHEC le plus fr quemment identifi et il peut tre isol et reconnu par la plupart des laboratoires cliniques 12 22 4 Toutefois il existe au moins 50 s rotypes d E coli associ s la production de cytotoxines et au d veloppement de SHU et ou de colite h morragique 6 1 Karmali 4 a d crit un teste de cytotoxine permettant la d tection de la toxine mais celui ci prend beaucoup de temps et exige de grandes comp tences techniques de l op rateur pour confirmer la pr sence de cytotoxine Le test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT est un test immuno enzymatique permettant la d tection directe des toxines Stx1 et Stx2 dans les chantillons de selles ou les coprocultures sur bouillon d enrichissement 3 PRINCIPES DU TEST Le test de d tection d E coli producteurs de Shigatoxines STEC ProSpecT est un test immuno enzymatique en phase solide pour la d tection des Shiga toxines On d pose les pr l vements de selles dilu s dans les puits d tachables de la microplaque sur lesquels sont fix s les anticorps polyclonaux de lapin anti Shigatoxine de type 1 amp 2 La toxine ventuellement pr sente est captur e par l anticorps fix Les puits sont incub s puis lav s pour liminer toute mati re non fix e On ajoute le conj
17. ion du chronom trage ne pas traiter simultan ment plus de trois plaques de 96 puits Tout cart par rapport la proc dure tablie risque de nuire l exactitude du test 10 MODE OPERATOIRE l ments n cessaires fournis R actifs Pipettes de transfert Porte bande de microplaque et couvercle Fiche de proc dure avec couleurs de r action l ments n cessaires non fournis R cipient pour pr l vements de selles Minuteur Pissette pour tampon de lavage Eau distill e ou d min ralis e l ments facultatifs non fournis Lecteur de microplaque compatible avec spectrophotom tre talonn 450 nm ou 450 630 nm Coton tige ou b tonnet applicateur embout recouvert de rayonne Micropipette pour les volumes jusqu 200 ul Tubes essai usage unique en plastique ou en verre M langeur vortex avec adaptateur de microplaque ou agitateur secoueur suppl mentaire 110mL Tampon de lavage R2450002 suppl mentaire 1L Tampon de lavage R24500011 11 PR PARATION DES CHANTILLONS POUR LE TEST Al ANANLYSE DIRECTE DES SELLES 11 A 1 Ajouter 0 6 ml de diluant des chantillons bact riens dans un tube propre de 12 x 75 mm 11 A 2 M langer l chantillon de selles aussi compl tement que possible et diluer comme suit 11 A 2 A Selles liquides ou semi solides ajouter 0 3 ml troisi me marque partir de l embout de la pipette fournie l aide d une pipette de transfert M langer compl tement l
18. n est n gatif Si les r sultats restent ind termin s obtenir un nouvel chantillon et refaire le test Examen au spectrophotom tre 14 3 Observer les r sultats sur une longueur d onde 450 nm ou deux longueurs d onde 450 ou 630 650 nm 14 4 Lire les r sultats du test 14 4 A Une longueur d onde Positif D O gt 0 150 N gatif D O lt 0 100 Ind termin D O 0 100 0 150 14 4 B Deux longueurs d onde Positif D O gt 0 100 N gatif D O lt 0 070 Ind termin D O 0 070 0 100 14 5 Interpr tation des r sultats enregistr s au spectrophotom tre Positif Une D O sup rieure 0 150 une longueur d onde ou 0 100 deux longueurs d onde est un r sultat positif indiquant la pr sence de toxine Stx1 et ou Stx2 N gatif Une D O inf rieure 0 100 une longueur d onde ou 0 070 deux longueurs d onde r v le un r sultat n gatif et indique que l chantillon test ne contient pas de toxine Stx1 ou Stx2 ou en contient une proportion ind tectable Ind termin Une D O comprise entre 0 100 et 0 150 une longueur d onde ou entre 0 070 et 0 100 deux longueurs d onde r v le un r sultat ind termin Dans ce cas le test doit tre r p t Si au second test les r sultats sont positifs l chantillon est positif Si les r sultats sont n gatifs l chantillon est n gatif Si les r sultats restent ind termin s obtenir un nouvel chantillon et refaire le test Remarque Si un
19. ocultures enrichies pendant la nuit On a galement recherch la pr sence de Shiga toxines dans tous les chantillons l aide d un test de cytotoxine CTA Les chantillons positifs pour la Shiga toxine ont t isol s et s rotyp s voir tableau 3 Tous les chantillons dont les r sultats taient positifs ou divergents ont t soumis un test d amplification en cha ne par polym rase PCR pour usage exp rimental seulement afin afin de v rifier la pr sence du g ne de Shigatoxine Les r sultats de chacun des centres sont pr sent s dans les tableaux 1 et 2 Selon la m thode par analyse directe il y avait 20 chantillons positifs EIA CTA PCR Trois taient EIA CTA PCR Cinq taient EIA CTA PCR Tous les r sultats ind termin s se sont r v l s comme tant de vrais n gatifs Trois cent cinquante quatre chantillons taient n gatifs selon les deux m thodes EIA CTA Les performances avant et apr s r solution des r sultats ind termin s du coffret de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT sont pr sent es ci dessous dans le tableau 1 Tableau 1 D tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT compar e un test de cytoxine r alis directement sur les chantillons de selles Analyse directe de l chantillon R sultats initiaux R sultats r solus
20. on exposition la lumi re doit tre jet 6 10 Les op rateurs atteints de daltonisme ou de d ficience visuelle peuvent avoir des difficult s interpr ter le test visuellement et doivent utiliser les mesures relev es au spectrophotom tre pour interpr ter les r sultats 6 11 Jeter le tampon de lavage inutilis dans un conteneur adapt aux produits pr sentant un risque biologique 6 12 Le tampon de lavage 0 1 le diluant des chantillons bact riens 0 02 le conjugu enzymatique 0 01 et les contr les positif et n gatif 0 02 contiennent du thiomersal 6 13 La toxine Shiga 1 et la toxine produite par la souche Shigella dysenteriae de type I toxine Shiga sont presque identiques Par cons quent le test sur microplaque ProSpecT Shiga Toxin E Coli STEC peut tre positif d s lors qu une quantit d tectable de toxine Shiga est pr sente dans l chantillion 7 PR PARATION DES R ACTIFS STOCKAGE ET MANIPULATION Avant utilisation amener tous les r actifs temp rature ambiante 20 25 C et m langer doucement Remettre les r actifs au r frig rateur apr s utilisation l exception du tampon de lavage tous les r actifs sont fournis pr ts l emploi dans des flacons Les r actifs peuvent tre dispens s directement depuis les flacons compte gouttes ou vers s au pr alable dans des pipettes multicanaux Si trop de r actif a t vers l exc s doit tre jet
21. producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque et le test de cytotoxine apr s combinaison des r sultats des deux centres Selon la m thode des coprocultures sur bouillon d enrichissement il y avait 63 chantillons positifs ElA CTA PCR Trois taient EIA CTA PCR Apr s r p tition du test CTA 2 sur 3 se sont r v l s comme tant de vrais n gatifs Dix taient ElA CTA PCR Tous les r sultats ind termin s se sont r v l s comme tant de vrais n gatifs apr s r p tition des tests Sept cent soixante et onze taient n gatifs selon les deux m thodes EIA CTA Les performances avant et apr s r solution des r sultats ind termin s du test de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT sont pr sent es ci dessous dans le tableau 2 Tableau 2 D tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT compar s un test de cytoxine r alis sur coprocultures sur bouillon d enrichissement Coprocultures sur bouillon d enrichissement R sultats initiaux R sultats r solus Tableau 3 Nombre de s rotypes diff rents de souches d E coli producteurs de Shiga toxines isol s dans des chantillons positifs Anzahl der isolierten St mme Stx2 Stx1 amp 2 Stx2c Inconnu S rotype S rotypes 08 H9 026 H11 7 030 088 H5 091 0103 H2 0111 NM 0118 0128 0145 0153 H2 0157 H7 Z 9 2 Stx1 1 3
22. puits apparaissant limpide l examen visuel offre une lecture de D O ne co ncidant pas avec l interpr tation visuelle il faut y rechercher l existence de bulles ou de petites particules Les liminer essuyer le fond des puits et relire la D O Si la divergence persiste r p ter le test 15 LIMITES DE LA PROC DURE 15 1 La validit des r sultats de la d tection d E coli producteurs de Shigatoxines STEC sur microplaque ProSpecT d pend de la conformit de la r action des contr les avec les r actions attendues Voir la section Contr le qualit 15 2 Un r sultat de test n gatif n exclut pas la possibilit de la pr sence de Shiga toxines et peut provenir de la pr sence dans l chantillon d un taux d antig ne inf rieur au taux de d tection du test Aucune corr lation n a t tablie entre la quantit d antig ne pr sente dans un chantillon et la forme clinique 15 3 Comme pour tout test de diagnostic in vitro les r sultats doivent tre interpr t s par le clinicien conjointement avec les observations cliniques et ou les autres r sultats de laboratoire 15 4 La qualit du pr l ve ent et du traitement des chantillons est essentielle pour la pr cision du dosage Les r sultats optimaux sont obtenus sur les chantillons test s aussit t que possible apr s le pr l vement Voir la section pr l vement des chantillons de selles Le coffret de d tection d E coli pro
23. re ci dessous dans des chantillons de selles n gatifs et positifs pour la Shiga toxine Les bact ries ont t ensemenc es des concentrations gt 1 x 107 UFC ml d chantillon Des souches pathog nes d E coli non producteurs de Shiga toxines EPEC ETEC EIEC ont galement t analys es avec le test ProSpecT et se sont r v l es n gatives Campylobacter jejuni ATCC 29428 Klebsielia pneumoniae ATCC 27736 Citrobacter braaki ATCC 43162 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Proteus vulgarus ATCC 33420 Enterococcus faecalis ATCC 49149 Salmonella typhimurium SA972229 Escherichia coli VT negative ATCC 25922 Serratia liquefacians ATCC 27592 Escherichia coli EPEC ATCC 12014 055 NM Shigella dysenteriae ATCC 49347 Escherichia coli EPEC ATCC 33780 0111 NM Shigella flexneri ATCC 25929 Escherichia coli ETEC EPEC ATCC 43887 0111 NM Shigella sonnei ATCC 25931 Escherichia coli EIEC ATCC 43893 0124 NM Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 33660 Yersinia enterocolitica ATCC 2371516 18 BIBLIOGRAPHIE 18 1 Johnson W M H Lior and G S Bezanson 1983 Cytotoxic Escherichia coli 0157 H7 Associated with Haemorrhagic Colitis in Canada Lancet pp 76 Karmali M A B T Steele M Petric and C Lim 1983 Sporadic Cases of Haemolytic Uremic Syndrome Associated with Faecal Cytotoxin and Cytotoxin Producing Escherichia coli Lancet pp 619 620
24. s initiaux R sultats r solus ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Centre 2 Ind Ind 9 0 0 9 0 0 1 192 4 1 196 0 Ind 0 0 0 Ind 0 0 0 Total des 206 206 chantillons Sensibilit 90 0 90 0 Sp cificit 100 100 R sultats initiaux R sultats r solus ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Centre 3 Ind Ind 42 9 0 42 9 _ 2 yolo 412 Ind 0 0 0 Ind 0 0 0 Total des 463 463 chantillons Sensibilit 100 100 Sp cificit 97 9 97 9 R sultats initiaux R sultats r solus ProSpecT Test de cytotoxine ProSpecT Test de cytotoxine Combin s Ind Ind 63 10 0 63 10 0 3 762 7 771 0 Ind 0 0 Ind 0 0 0 Total des 845 845 chantillons Sensibilit 95 5 98 4 87 3 99 1 91 6 100 Sp cificit 98 7 98 7 97 6 99 4 97 7 99 4 Corr lation 97 6 98 7 96 4 98 5 97 7 99 3 Les chiffres entre parenth ses repr sentent les intervalles de confiance 95 Les colonnes R sultats r solus contiennent les r sultats des tests EIA r p t s sur les chantillons qui taient initialement ind termin s Noter que pour le centre n 3 il y avait au d part 2 r sultats faussement positifs CTA qui se sont r v l s n gatifs apr s r p tition du test CTA Comme le montre le tableau 2 il existe une corr lation de 98 7 pour la m thode des coprocultures sur bouillon d enrichissement en
25. uer la pr cision du test Pour viter la contamination microbienne des r actifs utiliser des pipettes st riles usage unique pour pr lever des portions aliquotes dans les flacons de r actif 6 4 Les r actifs sont pr par s partir de mat riaux biologiques et doivent tre consid r s au cours de leur manipulation comme potentiellement infectieux Eliminer en respectant les proc dures relatives au risque biologique 6 5 Ne pas pr lever de produits dans une pipette par aspiration buccale Porter des gants jetables et des lunettes de s curit pendant la manipulation des chantillons et l ex cution du test Se laver soigneusement les mains la fin du test 6 6 Les bandes de microplaques doivent tre conserv es dans le sachet m tallis refermable pour prot ger les micropuits de l humidit 6 7 Les chantillons peuvent contenir des agents potentiellement infectieux et doivent tre manipul s conform ment aux proc dures de bios curit de niveau 2 BSL 2 expos es dans le manuel publi par le CDC et le NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th Edition 6 8 Les pr l vements de selles doivent tre compl tement m lang s avant tout traitement de l chantillon pour garantir sa parfaite repr sentativit NE PAS CONCENTRER LES CHANTILLONS AVANT LE TEST 6 9 Le substrat color est sensible l exposition la lumi re Tout r actif fixant la couleur lors de s
26. ugu enzymatique anticorps monoclonal de souris anti Shiga toxine de type 1 amp 2 marqu avec l enzyme peroxydase de raifort Les puits sont incub s puis lav s pour liminer le conjugu enzymatique non fix Si la r action est positive la toxine fixe l enzyme dans le puits On ajoute le substrat de l enzyme t tram thylbenzidine TMB Si la r action est positive l enzyme fix e au puits par la toxine convertit le substrat en produit de r action color La fixation de la couleur peut tre d tect e visuellement ou l aide d un spectrophotom tre Si la r action est n gative il n y a pas de toxine ou il y en a trop peu pour fixer au puits le conjugu enzymatique et aucun produit de r action color ne se d veloppe 4 D FINITION DES SYMBOLES Num ro de r f rence Dispositif m dical de diagnostic in vitro Utilisation en laboratoire Consulter le mode d emploi Limite de temp rature temp rature de conservation Code de lot num ro de lot A utiliser avant le date de p remption Fabriqu par 1 EESS 5 CTIFS Le coffret de d tection d E coli producteurs de Shiga toxines STEC sur microplaque ProSpecT comprend suffisamment de r actifs pour effectuer 48 ou 96 tests R actifs 48 96 TESTS Mikrotiterplatte 8 puits par recouvertes d anticorps polyclonaux de lapin 6 bande bandes 12 bandes anti Shiga toxine de type 1 amp 2 6 12 bandes Conjugu enzymatique 1 Fla
27. uvrir la microplaque et incuber temp rature ambiante pendant 30 minutes 12 8 Transvaser ou aspirer le contenu de chaque puits puis laver 5 fois comme l tape 5 12 9 Ajouter 4 gouttes 200 ul de substrat color dans chaque puits 12 10 Couvrir la microplaque et incuber temp rature ambiante pendant 10 minutes 12 11 Ajouter 1 goutte 50 ul de solution d arr t dans chaque puits Tapoter les puits ou utiliser bri vement le m langeur vortex jusqu ce que la couleur jaune soit uniforme Lire les r sultats dans les 10 minutes suivant l ajout de la solution d arr t 12 12 Observer les r actions visuellement ou les lire au spectrophotom tre 450 ou 450 630 650 nm 13 CONTR LE QUALIT Les contr les positif et n gatif doivent tre inclus chaque test Ils font la fois office de contr le des r actifs et de la proc dure Ces contr les ont pour objet de r v ler tout chec substantiel des r actifs Le contr le positif ne garantit pas la pr cision au seuil de positivit La densit optique D O du contr le n gatif doit tre lt 0 100 sur un spectrophotom tre une longueur d onde et lt 0 070 sur un spectrophotom tre deux longueurs d onde le contr le n gatif doit tre incolore l examen visuel Si le contr le n gatif pr sente une couleur jaune d intensit gale ou sup rieure 1 sur la fiche de proc dure le test doit tre effectu nouveau en pr tant une
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