TP spécialité A 2005
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1. Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Deuxi me exp rience Des cellules MDCK ont t trait es comme pr c demment pendant 100 min par le facteur 3 en absence photos a et d ou en pr sence de deux drogues inhibant la contraction de l actine la latrunculine photos b et e et Y 27632 photos c et f Les cellules ont ensuite t fix es et une immunofluorescence anti actine a t r alis e L actine est r v l e par une fluorescence rouge l ADN est color gr ce un intercalant fluorescent vert Les photos a b et c repr sentent les cellules observ es au microscope contraste de phase Les photos d e et f repr sentent les cellules observ es au microscope confocal fluorescence La barre repr sente 10 um Quel ph nom ne induit le facteur 3 Quel est l int r t d utiliser les drogues bloquant la contraction de l actine 15 Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Cinqui me partie 10 points Le r cepteur du facteur 1 a t caract ris Il s agit d une prot ine transmembranaire La liaison du facteur 1 sur son r cepteur induit la dim risation du r cepteur et l autotransphosphorylation de son domaine intracellulaire Les sites phosphoryl s servent alors de site de fixation pour la phospholipase C gammal PLC y1 Il a t montr que l association de la PLC y1 au r cepteur est n cessaire l expression de2. Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place AGREGATION DES SCIENCES DE LA VIE SCIENCES DE LA TERRE ET DE L UNIVERS Concours externe 2005 Epreuve de Travaux Pratiques de Sp cialit A Dur e totale 6 heures Nombre total de pages 22 Cette preuve est centr e sur un th me unique mais elle a t subdivis e en 5 parties Avant de vous lancer dans les manipulations lisez le sujet en entier Vous constaterez que la partie 2 ne peut tre r alis e qu apr s la partie 1 Bien que compl mentaires des parties 1 et 2 les parties 3 4 et 5 peuvent tre trait es avant les parties 1 et 2 et dans un ordre quelconque Evaluez le temps que vous pensez passer pour chaque partie de fa on organiser vos 6 heures de travail Le bar me de points attribu s chaque partie est donn titre indicatif Tenez compte de temps potentiels d attente pour l utilisation du spectrophotom tre Vous trouverez dans le document un certain nombre d indications pratiques vous permettant de r aliser les exp riences demand es Cependant ces indications laissent place votre initiative personnelle vous par exemple de choisir l objectif qui permettra l observation microscopique la plus adapt e ou vous de concevoir dans les r gles de l art un protocole de mesure d absorbance Pour toute utilisation d appareillage commun la salle appelez un surveillant qui au besoin pourra tre amen
3. tablir une liste d attente et limiter votre temps d utilisation A certaines tapes de vos manipulations vous devrez faire valuer vos r sultats par un enseignant responsable Pensez y R pondez directement sur les feuilles dans les cadres pr vus cet effet Indiquez vos nom et num ro de place sur chaque feuille M me si vous ne r pondez pas rendez la totalit de vos feuilles Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Un laboratoire de recherche sp cialis dans l tude des facteurs de croissance et des cytokines a purifi quatre facteurs num rot s 1 2 3 et 4 Vous allez dans un premier temps reproduire quelques unes des exp riences pr liminaires qui ont t r alis es afin de caract riser leurs effets biologiques Dans un second temps vous analyserez des r sultats d tudes plus pouss es Premi re partie 20 points Vous allez valuer l effet biologique des quatre facteurs sur des cellules pith liales de rein de chien MDCK Madin Darby canine kidney Il s agit de cellules tablies en lign e mais qui ont conserv des caract ristiques de cellules pith liales non transform es Le jour J 2 des bo tes de culture ont t ensemenc s avec des cellules MDCK dans un milieu de culture ad quat et plac es dans une tuve 37 C Le jour J 1 les facteurs ont t ajout s au milieu de culture et les bo tes remises l tuve Une bo te contr le not
4. e C sans facteur ajout a t conserv e Exp rience r aliser le jour J de l preuve Attention avant de vous lancer dans les manipulations lisez le protocole en entier pr parez toutes vos solutions et r fl chissez aux questions pos es afin de concevoir vos protocoles de la meilleure fa on Tant que les cellules ne sont pas fix es vous devez travailler avec des gants et jeter les milieux de culture et autres solutions ainsi que les pipettes ou c nes dans un bac d eau de Javel Afin que les cellules vivantes ne s alt rent pas sur votre paillasse temp rature ambiante vous devez r aliser l tape de fixation en priorit Protocole Vider les milieux de culture Laver deux fois avec 2 mL de tampon phosphate salin PBS que vous aurez pr parer voir cadre page suivante Fixer l thanol 95 ajoutez 1 mL d thanol par bo te videz rajoutez de nouveau 1 mL d thanol et laissez fixer pendant 5 min Vider l thanol et laisser s cher les bo tes lair libre Pour faciliter cette tape vous pouvez retourner vos bo tes sur du papier absorbant et les tapoter Vous pouvez conserver vos bo tes sec le temps que vous voulez Une fois l thanol bien vapor colorer par 1 mL de cristal violet pendant 10 min bo tes ferm es La solution de cristal violet est fournie Laver l eau du robinet au moins 3 fois Attention ne pas utiliser un jet trop puissant La
5. de ac tique glacial c est dire pur 99 9 et d eau du robinet Expliquez ci dessous votre protocole de pr paration Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Expliquez l int r t de l acide ac tique Que permet de mesurer ce protocole Pr sentez et justifiez votre protocole de mesure d absorbance Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Collez ici vos r sultats bruts de mesure d absorbance Traitez vos chiffres bruts de mesure d absorbance de la mani re qui vous para tra la plus ad quate pour bien mettre en valeur les r sultats Une calculette avec son mode d emploi et du papier millim tr sont disponibles Pr sentez vos r sultats dans le cadre ci dessous et page suivante Analysez et concluez Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place 10 Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Si vous disposiez d un laboratoire de culture cellulaire et du mat riel pr sent en salle aujourd hui que changeriez vous au plan d exp rience de ces deux premi res parties pour rendre les observations et les mesures plus fiables Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Troisi me partie 5 points Afin de confirmer ou d infirmer les effets du facteur 2 observables dans la premi re partie une immunofluorescence ant
6. e concentr e 10 fois et d eau distill e Expliquez ci dessous votre protocole de pr paration Pourquoi doit on utiliser des gants et jeter les milieux et solutions dans l eau de Javel tant que les cellules n ont pas t fix es Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Observer les cellules color es tous les grossissements qui vous para tront ad quats Faites dans les espaces ci dessous un compte rendu de l effet compar des diff rents facteurs sous les formes que vous jugerez les plus adapt es sch mas dessins texte Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Deuxi me partie 20 points Attention cette deuxi me partie ne peut tre engag e qu une fois que vous avez compl tement achev la premi re partie En effet elle utilise les m mes bo tes de cellules qu elle d truit interdisant toute nouvelle observation microscopique Pour proc der cette deuxi me partie vos bo tes color es au cristal violet doivent tre parfaitement s ches si vous avez r alis un montage sous lamelle pour observer l objectif 100 vous devez enlever les lamelles Pour ce faire rajouter d licatement de l eau au fond de la bo te de fa on faire flotter la lamelle et r cup
7. el est le mode de transduction du signal de la PLC y1 5 Sur le m me principe exp rimental proposez une exp rience compl mentaire ou t moin permettant d appuyer vos conclusions Pr sentez le principe de l exp rience et exposez le r sultat attendu ou les r sultats possibles Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place 20 Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Conclusion g n rale Faites le bilan des effets des 4 facteurs En fonction de ces effets proposez un nom pour chacun de ces facteurs 21 Nom Num ro de salle Pr nom Num ro de place 22
8. i cadh rine a t r alis e sur des cellules contr le et des cellules trait es par le facteur 2 pr par es de la m me mani re que pr c demment Les r sultats sont pr sent s sur les documents photographiques ci dessous photo C cellules contr le photo 2 cellules trait es par le facteur 2 Expliquez le principe et d crivez bri vement le protocole d une exp rience d immunofluorescence Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Quel est le r le principal des cadh rines dans les cellules pith liales Analysez les r sultats et concluez quant l effet biologique du facteur 2 Qu apporte cette exp rience par rapport vos observations de la premi re partie Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place Quatri me partie 5 points Premi re exp rience Des cellules MDCK ont t cultiv es comme pr c demment puis trait es au facteur 3 Des photographies des cellules ont t r alis es l aide d un microscope contraste de phase au bout de 60 photo c 80 photo d et 100 min photo e de traitement Apr s les 100 min de traitement le tapis de cellules a t pr par pour tre observ au microscope lectronique balayage photo f Les barres repr sentent 10 um D crivez l effet du facteur 3 Qu apporte cette exp rience par rapport celles que vous avez r alis es
9. isser s cher les bo tes l air libre Vous pouvez nouveau conserver vos bo tes le temps que vous voulez dans cet tat Fa tes v rifier le r sultat de la coloration par un enseignant Observation des r sultats Vous pouvez observer le r sultat des colorations l il nu petit grandissement l aide de l objectif 4 de votre microscope ou l aide de la loupe binoculaire ou plus fort grandissement l aide des objectifs 10 40 et 100 de votre microscope Vous pouvez proc der aux observations microscopiques m me si les bo tes ne sont pas compl tement s ches Les observations microscopiques l aide des objectifs 4 10 et 40 peuvent tre r alis es sans Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place mettre de lamelle En revanche l utilisation de l objectif 100 n cessite de d poser une goutte d eau et une lamelle au fond de la bo te de fa on pouvoir mettre l objectif 100 immersion dans l huile sans que l huile ne vienne au contact direct des cellules color es Attention cause du rebord des bo tes de culture le passage d un objectif l autre n cessite de rabaisser pr alablement la platine du microscope Prenez bien soin des bo tes et des cellules qu elles contiennent car ce sont ces m mes bo tes que vous utiliserez pour la deuxi me partie de l preuve Pr paration du tampon phosphate salin A r aliser partir d une solution m r
10. n pr sence ou en absence d IP3 et DAG perm ants Apr s ces 24h on fixe les cellules et on proc de une exp rience de double immunofluorescence permettant de r v ler en rouge la BrdU et en vert la prot ine microinject e Les r sultats sont pr sent s sur les figures 2 et 3 Nom Pr nom Num ro de salle Num ro de place 20 cellules BrdU positives 0 Facteur 1 DAG IP3 PLC y1 SH2 SH2 SH3 inject e Figure 2 Les cellules BrdU positives sont d nombr es dans la population totale pour les deux premi res conditions et uniquement dans la population microinject e pour les deux derni res conditions les deux colonnes de droite Figure 3 Micrographies repr sentatives des r sultats correspondant aux deux colonnes de droite de l histogramme de la figure 2 des cellules ont t microinject es avec la prot ines PLC YI restreinte aux domaines SH2 et SH3 puis cultiv es en absence A ou en pr sence B d IP3 et DAG une double immunofluorescence anti BrdU rouge et anti PLC YI vert a t r alis e La barre repr sente 10 um Analyse des r sultats et conclusions 1 Reformulez les deux hypoth ses relatives cette tude sous forme d un sch ma 2 Quel est l effet biologique du facteur 1 mis en vidence dans cette tude 3 Comment agit la prot ine PLC y1 tronqu e Que peut on conclure du r le de la prot ine PLC y1 endog ne 4 Qu
11. rez cette derni re l aide d une pince sans toucher les cellules laissez ensuite s cher vos bo tes Vous pouvez acc l rer le temps de s chage en rajoutant 1 mL d thanol 95 par puits videz et laissez s cher l air libre Protocole Rajouter par bo te 1 mL d acide ac tique 33 vol vol que vous aurez pr parer voir cadre ci dessous Fermer les bo tes car l acide ac tique est volatile Agiter d licatement Concevez un protocole de mesure de l intensit de la couleur de la solution obtenue dans chaque bo te Cette intensit peut tre mesur e par absorbance 570 nm l aide d un spectrophotom tre Vous disposez de tubes Eppendorf de 1 mL pour pr parer vos chantillons Vous transvaserez ensuite 100 uL de chaque chantillon dans les puits d une plaque 96 puits Notez le plan de votre plaque Celle ci sera lue par un surveillant qui vous remettra les r sultats imprim s et en m me temps les v rifiera Apr s lecture le contenu des puits sera jet et les puits seront nettoy s de fa on ce qu un autre candidat puisse r utiliser la plaque Cependant au besoin vous pourrez refaire une autre lecture Vous devez concevoir votre protocole de mesure d absorbance en tenant compte des r gles d utilisation d un spectrophotom tre et de fa on avoir des mesures les plus fiables possibles Pr paration de l acide ac tique 33 vol vol A r aliser partir d aci
12. s effets biologiques du facteur 1 La PLC y1 contient deux domaines SH2 et un domaine SH3 ainsi que deux domaines catalytiques PLC capables d hydrolyser le phosphatidylinositol 4 5 bis phosphate en inisitol 1 4 5 triphosphate IP3 et diacylglycerol DAG Deux hypoth ses quant au mode d action de la PLC y1 sont envisag es 1 La PLC y1 transduit les effets du facteur 1 en produisant de l IP3 et du DAG qui eux m mes iront activer des cibles comme la prot ine kinase C 2 Gr ce ses domaines SH2 et SH3 la PLC yl agit comme une prot ine adaptatrice capable d interagir d une part avec le r cepteur et d autre part avec d autres prot ines qui seront alors activ es Afin de trancher entre ces deux hypoth ses l exp rience suivante a t r alis e l Par g nie g n tique on construit un ADNc codant une prot ine PLC y1 restreinte aux domaines SH2 et SH3 appel e PLC y1 SH2 SH2 SH3 sur la figure 1 On produit et on purifie cette prot ine PLC SH2 SH2 SH3 PLC Figure 1 Repr sentation sch matique des domaines composant la prot ine PLC yl enti re et la prot ine PLC Y1 restreinte aux domaines SH2 et SH3 2 On cultive des cellules MDCK pendant 48h On microinjecte quelques cellules avec la prot ine PLC y1 SH2 SH2 SH3 forte concentration Puis on cultive les cellules pendant 24 h en pr sence de bromod soxyuridine BrdU un analogue de thymidine en pr sence ou en absence de facteur 1 e
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