Université Libre de Bruxelles Biophysique Travaux pratiques de
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1. Etudier le comportement d un circuit RC utilis comme filtre passe bas Etudier le comportement d un circuit simulant la r ponse passive d un axone un stimulus de faible intensit Etudier le comportement d un amplificateur op rationnel 2 2 Mat riel Une alimentation combin e 2 2 Mat riel 10 Un oscilloscope Une r sistance un condensateur variable un circuit simulant la r ponse passive d un axone et un amplificateur op rationnel 2 2 1 Mise la terre Comme nous l avons vu au cours la masse est le point de potentiel de r f rence 0 V par convention Le fait de raccorder la masse la terre fixe le potentiel de ce point et assure une protection vis vis d ventuelles fuites de courant La sonde de l oscilloscope comporte un contact la masse Prenez garde dans vos diff rents montages de connecter tous les contacts la masse ensemble en un seul point Ne pas le faire risquerait de mener des court circuits et des mesures incorrectes 2 2 2 Mode d emploi de l alimentation combin e Les nombres en italiques se r f rent la figure 1 2 Le g n rateur de fonction FUNCTION GENERATOR Cet appareil constitue la partie inf rieure gauche de l alimentation com bin e La mise sous tension de cet appareil s effectue en deux tapes il faut d abord allumer l appareil l aide du bouton ON OFF correspondant l arri re du boitier et ensuite utiliser le bou2. Mesure du potentiel membranaire suite l injection d chelons de cou rant de 150 ms d intensit croissante avec 5 ms de d lai D terminez le seuil d apparition des potentiels d action entre 0 nA 0 05 nA de cou rant inject et r alisez un graphique donnant la fr quence des potentiel d action en fonction de l intensit du courant inject Mesure de l amplitude d un potentiel d action suite l injection d un chelon de courant de 150 ms l intensit seuil dans la condition contr le Nales 140 mM et dans une condition o le Na extracellulaire a t en grande partie substitu Nales 14 mM Les lois de l excitation nerveuse r gissent l apparition et la propagation des potentiels d action Ces lois font intervenir notamment les notions de rh obase et de chronaxie La mise en vidence de ces param tres est l objet de cet exercice Ils sont d finis comme suit Rh obase valeur minimale de l intensit du stimulus lectrique sus ceptible de provoquer l apparition d un potentiel d action le stimulus tant un courant en chelon rectangulaire Une fois tablie dans des conditions donn es cette valeur peut tre utilis e comme chelon de mesure de l inten sit cf d finition de la chronaxie Relation intensit dur e Si on applique des courants en chelon rec tangulaire de dur es variables On constate que l intensit de courant seuil diminue quand la dur e de l chelon rectangulaire
3. Vous allez mesurer l amplitude du signal de sortie en fonction de l am plitude du signal d entr e Portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 2 4 Questions Expliquez les points suivant dans le rapport Dans le cadre de l tude du circuit RC justifiez par calcul votre choix de fr quence pour le signal carr Dans le cadre de l tude du circuit RC expliquez pourquoi In V t est lin aire et comparez la valeur de la constante de temps obtenue par vos mesures celles obtenue en mesurant la r sistances et la capacit avec le multim tre Dans le cadre des mesures sur le circuit RC comme filtre calculez la bande passante 3 dB th orique et comparez avec vos r sultats Dans le cadre des mesures r alis es sur le circuit quivalent de l axone comparez la valeur de obtenue par vos mesures la valeur th orique R JR 2 4 Questions 17 Dans le cadre des mesures r alis es avec l amplificateur expliquez ce que vous observez pour les grandes valeurs de l amplitude d entr e et interpr tez ce r sultat Laboratoire III Canaux ioniques 3 1 Introduction L existence d une diff rence de potentiel transmembranaire et l excitabi lit trouvent leur origine dans deux propri t s cellulaires une perm abilit membranaire s lective pour certaines esp ces ioniques li e l existence de canaux ioniques l
4. d apr s l chelon de potentiel rectangulaire La temp rature pour ces simulations est de 20 C On vous demande r aliser les exp riences suivantes Mesure du courant membranaire suite un saut de potentiel impos de 65 mV 130 mV et 65 mV 0 mV pour une dur e de 15 ms Mesure du courant membranaire suite une s rie de sauts de potentiel impos de potentiels croissants partant de 70 mV et augmentant de 20 mV jusqu 90 mV A l aide de la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle r alisez un graphique com portant deux courbes courants potentiels donnant l intensit du pic de courant entrant transitoire et du courant sortant soutenu en fonction du potentiel impos Mesure du courant membranaire suite un saut de potentiel impos de 65 mV 0 mV dans la condition contr le Na 140 mM et dans une condition o le Na extracellulaire a t en grande partie substitu Nalext 14 mM Mesure des conductances maximales de la membrane suite une s rie de sauts de potentiel impos de valeurs croissantes partant de 70 mV et augmentant de 20 mV jusqu 90 mV lorsque les canaux Na sensibles au potentiel et la conductance de fuite sont bloqu s gy 0 S cm et g 0 S cm R alisez un graphique donnant la conductance maximale en fonction du potentiel impos durant l chelon rectangu laire Mesure des conductances maximales de la membrane suite une s rie
5. Diode Ampoule Self G n rateur de Amp rem tre tension variable FIGURE 1 1 Symboles lectriques Symboles couramment utilis s dans les sch mas lectriques Une alimentation combin e compos e d un g n rateur de tension conti nue ou alternative V t Un multim tre digital 1 2 1 Pr cautions d usage Deux pr cautions importantes doivent tre respect es lors des mesures lectriques pour ne pas endommager les quipements vous effectuez les c blages hors tension et demandez le passage de l enseignant avant la mise sous tension Lors d une mesure de courant avec un multim tre il convient imp rativement de ne pas d passer le courant fond d chelle A priori vous ne connais sez pas l ordre de grandeur de la variable mesurer Dans ce cas il faut commencer la mesure en prenant l chelle la moins sensible 1 2 2 Mode d emploi de l alimentation combin e Le g n rateur de tension continue POWER SUPPLY Cet appareil constitue la partie inf rieure droite de l alimentation com bin e fig 1 2 Il sera utilis comme g n rateur de tension continue Il est muni d un bouton POWER 38 poss dant deux positions ON et OFF Il comporte deux sorties tension constante 5 V et 15 V ainsi qu une sortie tension variable 0 30 V 42 43 et 44 Chaque sortie est caract ris e par une borne positive en rouge et une borne n gative en noir Lors de l uti lisation de la sortie
6. de sauts de potentiel impos de valeurs croissantes partant de 70 mV et augmentant de 20 mV jusqu 90 mV lorsque les canaux K sensibles au potentiel et la conductance de fuite sont bloqu s gx 0 S cm et g 0 S cm R alisez un graphique donnant la conductance maximale en fonction du potentiel impos durant l chelon rectangu laire Mesure des conductances maximales de la membrane suite une s rie de sauts de potentiel impos 15 mV d une dur e de 5 ms pr c d s de niveaux de conditionnement de potentiels croissants de m me dur e partant de 75 mV et augmentant de 5 mV jusqu 40 mV lorsque 4 8 Simulations num riques les canaux sensibles au potentiel et la conductance de fuite sont bloqu s gx 0 S cm et gj 0 S cm R alisez un graphique donnant la conductance maximale en fonction du potentiel impos durant le conditionnement 4 3 2 Mise en vidence des lois de l excitation nerveuse Pour r aliser des simulations d exp riences li es l tude de l excitabilit choississez IClamp dans la fen tre I V Clamp Electrode Vous avez alors acc s aux param tres suivants le d lai la dur e et l intensit de l chelon de courant inject dans l l ment de membrane La temp rature pour ces simulations est de 16 3 C Les conductances doivent avoir leurs valeurs par d faut gy 0 12 S cm gj 0 036 S cm et g 0 0003 S cm On vous demande r aliser les simulations suivantes
7. le r glage horizontal base de temps et le r glage du d clenchement trigger 2 2 3 Mode d emploi de l oscilloscope Voici la description des principales fonctions de l oscilloscope que vous allez tre amen utiliser au laboratoire Le panneau avant de l appareil est illustr la figure 2 5 La mise sous tension de l appareil se fait l aide du bouton 0 T situ au dessus de l appareil Un oscilloscope sert a mesurer des diff rences de potentiel variables au cours du temps signaux Ecran L cran de l oscilloscope est illustr la figure 2 6 Il s agit ici d un os cilloscope deux canaux c d que l on peut observer simultan ment deux signaux l un provenant de l entr e CH1 et l autre de l entr e CH2 Dans le cadre de ces travaux pratiques les seuls param tres utiles sont les facteurs d chelle de l amplitude pour chacun des canaux 8 la base de temps 10 et les marquers indiquant les point de r f rence de masse des signaux affich s 6 R glages verticaux La d viation verticales des traces permet de mesurer l amplitude des si gnaux Les r glages suivants fig 2 7 vous seront utiles 2 2 Mat riel 12 1 2 3 4 Tek AIL Tria d M Pos 130 0 us Pa 6 2 Voltage Invert CHig1 00VBy CH2 1 004 M 100us W 100ms CH1 O 00v 750mV 15 CHENG gie to Setup 5 ii ii ent z 17 7 8 9 10 16 11 1213 14 FIGURE 2 6 Ecran de l oscilloscope L cran affiche l
8. variable 0 30 V le r glage de tension s effectue l aide du bouton VOLTAGE 39 La diff rence de potentiel ainsi obtenue est aff fich e sur l cran incorpor dans l appareil 37 Cette valeur est cependant trop peu pr cise pour tre utilis e dans vos mesures Cet appareil peut aussi 1 2 Mat riel FREQUENCY COUNTER x EUU 5 mmm Gil Len KO i as ATE NE 40S 15 01 0 015 f FUNCTION GENERATOR o on CxmEQ Puzza 1O QI METEN CON ERSAL ERST MS 9140 17 18 FIGURE 1 2 Sch ma de l alimentation combin e tre utilis comme g n rateur de courant le bouton 41 est alors enfonc Les autres fonctions ne seront pas utilis es et ne sont donc pas d taill es ce stade Le multim tre DIGITAL MULTIMETER Cet appareil constitue la partie inf rieure droite de l alimentation com bin e Il est muni d un bouton POWER poss dant deux positions ON et OFF 22 Les informations donn es ci dessous sont galement valables pour l autre multim tre qui est votre disposition boitier jaune Comme son nom l indique cet appareil permet diff rents types de mesures inten sit de courant et diff rence de potentiel continu DC ou alternatif AC r sistance et capacit La s lection du type de mesure 26 30 ainsi que l chelle 36 doit se faire avant de commencer la mes
9. A 1 nM dans chaque com partiment reconstituez la membrane Rm amp 100GQ Cm amp 200pF observez le courant traversant la bicouche AV 120mV oscil loscope sur 100 mV div et 500 ms div amplificateur sur gain 100 mV pA et filtre passe bas sur 16 Hz Vous devriez pouvoir observer les variations de courant correspondants l ouverture et la fermeture des pores de gramicidine fig 3 12 B Enregistrez le courant l aide de l or dinateur et de l interface NI USB 6008 pour cela utlisez l application nidatalogger et choisissez une fr quence d chantillonnage de 100 Hz Vos mesures apparaitront sous forme d un fichier Excel situ dans Do 3 4 Questions 23 A B gramicidin A 2 pA FIGURE 3 12 La gramicidine A A Dans une bicouche lipidique les mol cules de gramicidine A peuvent former des dim res qui constituent alors des canaux ioniques s lectif pour les ions monovalents positifs B Variations de courant correspondant aux ouvertures et fermetures al atoires de quatre canaux de gramicidine A dans la bicouche lipidique plane observ es un potentiel impos de 120 mV et en condition ionique sym trique enregistre ment r alis par des tudiants lors de la s ance cuments LabView Data Renommez ce fichier en courantunitaire xls faites varier le potentiel transmembranaire et mesurez le courant uni taire Indiquez l intensit du courant unitaire et la conductance cor respondante dans la feuil
10. Universit Libre de Bruxelles Facult de M decine Biophysique Travaux pratiques de laboratoire version du 28 novembre 2012 David Gall Ann e acad mique 2012 2013 Objectifs Nous proposons une s rie de quatre s ances de travaux pratiques ayant pour ambition de vous permettre d appr hender de mani re concr te les no tions physiques de bases en lectricit et leur application la compr hension de la physiologie des tissus excitables Les s ances de travaux pratiques sont centr es sur la mise en vidence exp rimentale l chelle mol culaire du courant unitaire produit par un canal ionique Le choix de cette manipu lation exp rimentale repose sur le fait que c est l existence de ces prot ines sp cialis es qui permet d expliquer les propri t s particuli res des cellules excitables D s lors nous voulons vous permettre d approcher directement cette th matique qui est essentielle au niveau du cours th orique Au travers de trois s ances de laboratoire nous aborderont successivement Laboratoire I la mesure et l instrumentation Il s agit d une s ance d introduction aux diff rents appareils n cessaires la mise en vidence exp rimentale du courant unitaire produit par un canal ionique oscil loscope g n rateur de fr quences et leur utilisation dans le cadre de mesures de caract ristiques lectriques de circuits r sistifs lin aires et non lin aires r sistance ampoule e
11. amplificateur B Chambre exp rimentale permettant la reconstitution d une bicouche lipique artificielle Elle comporte deux com partiments remplis de NaCl 1M s par s par un film de t flon perc e d un trou La chambre est munies de deux lectrodes Ag AgCl connect s lam plificateur Mettre en vidence les courant unitaires produit par un canal ionique gramicidine Etudier le comportement ohmique de ce canal en pr sence de gradients ioniques diff rents 3 2 Mat riel La mise en vidence du courant unitaire produit par un canal ioniques dans une bicouche lipidique artificielle sera r alis e l aide du mat riel sui vant un amplificateur permettant la mesure du courant en potentiel im pos gain r glable 1 10 et 100 mV pA muni d un filtre passe bas de fr quence de coupure variable 1000 Hz 100 Hz et 16 Hz un circuit quivalent d un l ment de membrane comportant une r sistance 1 GQ et un condensateur de 220 pF fig 3 10 A une chambre comportant deux compartiments remplis de NaCl 1M 3 3 Mesures s par s par un film de t flon perc e d un trou La chambre est munies de deux lectrodes Ag AgCl pour la connexion l amplificateur fig 3 10 B un oscilloscope pr r gl pour la mesure initiale base de temps 1 ms DIV CH1 2 mV DIV CH2 2 V DIV mode DC sur les deux canaux un g n rateur de signaux configur pour fournir le signal triangulaire
12. aph Vector Window Tashtego 1 emperature RunControl Z Location fm ECURIES e Init mV f 2 65 isi Roma ja memi ProgWinXOP Conditioning Level Stop Continue til ms jai po 1s duration ms Continue for ms ef jm i in amplitude 0 mV ni r Single Ste Testing Level le Ste ONCE T Ej duration ms 2 t A amplitude mV E3 1 pdf Graph 1 x 5 5 5 temp stop me i 5o Return Level dt ms f 0 025 duration ms R9 1 Electrode 0 vc i Points plottedims J n ei F55 31 amplitude mV 4 Sern update im s _ 005 5 Mi Vip graph Real Time s 0 08 NEURON Demonstrati j EI IL Y p i 1 11 at Axon_Guide pdf 1 L um 31931 Ra ohmcm j 53 sj d diamu mo 4 em rema d VariableTimeStep A Use variable at sl E NEURON Release 7 8 Absolute Tolerance j 0001 E Duke Yale and the ELDSBFAMIPFSTEEMNCERETOR ENST 2000 ibar hh Semai 072 E QNauro062008 doc See http www neuron yale edu credits htnl B gnaber n Sema 4 fo tei Mol Scale Tooi Detais bar hh Sicm2 _ 0 036 F iosilrg sesirane vectes froh ppl teap fons ERO rere rry enr lc gLhh Sim2 00003 s Additional mechonisms from files cobpuap od cachant mod canchan nod copuap tod invLfire mod Khhchan aod mcna aod nac aex mod nachan mod release mod Fr ma acaccepted downl
13. ariations de la diff rence de potentiel Portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle Mesurez les r sistances R et R2 2 l aide de l ohmm tre Pour compa rez les valeurs obtenues par vos mesures celles obtenues en mesurant ces r sistances avec l ohmm tre 1 3 Mesures A B C Parall le S rie diviseur de tension FIGURE 1 4 Montages 1 3 3 Montage en parallele en s rie et diviseur de ten sion R alisez les montages A et B tels que propos s fig 1 4 Mesurez le courant traversant le circuit pour une dizaine de valeurs de la diff rence de potentiel de 10 V 10 V maximum Portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle R alisez le montage C fig 1 4 Mesurez la diff rence de potentiel aux bornes de A pour trois valeurs de la diff rence de potentiel de 10 V 10 V maximum Refaites cette mesure en rempla ant la r sistance R par R2 2 Mesurez la valeur de R avec l ohmm tre Calculez le gain en tension pour les deux valeurs de r sistances R et R3 2 Portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle Sur le montage correspondant la figure 1 4 C connectez la r sistance variable R3 en parall le aux bornes de R Mesurez le potentiel aux bornes de R3 Calculez le gain en
14. arier les caract ristiques choisies sur le g n rateur de sinaux savoir la forme FUNCTION 17 l amplitude AMP 11 et la fr quence les sept boutons FREQUENCY et le vernier 16 Entrainez vous mesurer l amplitude de chacun des signaux ainsi que leur forme fr quence et p riode Mesurez le signal envoy sur le c ble labo et sp cifiez le type de signal carr triangle ainsi que sa fr quence et son amplitude dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 2 3 2 Etude du circuit RC Effectuez le montage tel qu illustr la figure 2 8 avec la r sistance variable en position 9 et le condensateur variable en position 5 Placez un connecteur BNC en T la sortie du g n rateur de fonctions et connectez une sortie l entr e CH1 de l oscilloscope et l autre l entr e du circuit RC c d entre les points O et W du sch ma l aide du c ble avec un connecteur BNC une extr mit et deux fiches l autre 2 3 Mesures 14 Generateur de signaux FIGURE 2 8 Sch ma du circuit RC extr mit Connectez la sonde de l oscilloscope la sortie du circuit RC c d entre les points T et W du sch ma et l entr e CH2 de l oscilloscope Faites v rifier votre montage l entr e du circuit imposez un signal de forme carr e dont vous choi sissez la fr quence de fagon bien voir la charge et la d charge du condensateur s
15. ations intra et extracellulaires en Na et K nai nao ki et ko La fen tre RunControl permet de lancer et de contr ler les simu lations num riques En particulier le bouton Init amp Run permet de d marrer l int gration des quations du mod le La valeur Continue til ms correspond au temps o la simulation s arr te la valeur Tstop ms contr le l affichage du r sultat sur le graphique La fen tre I V Clamp Electrode permet de choisir de simuler des mesures de courant en potentiel impos VClamp ou des mesures de potentiel en courant impos IClamp Les deux fen tres graphiques vous donnent respectivement le courant et le potentiel membranaire Vous pouvez effectuer des mesures direc tement sur les graphiques en cliquant sur la trace la valeur correspon dante s affiche alors dans la barre de titre de la fen tre 4 3 Simulations num riques 4 3 1 Etude des courants ioniques sensibles au poten tiel par la technique du potentiel impos Pour r aliser des simulations d exp riences en potentiel impos choissis sez VClamp dans la fen tre I V Clamp Electrode Vous avez alors acc s 4 8 Simulations num riques 28 aux param tres suivants la dur e et le potentiel du niveau de conditionnement c d avant le saut de potentiel la dur e et le potentiel du niveau test c d l chelon de potentiel rectangulaire la dur e et le potentiel du niveau de retour c
16. d Universit Virtuelle connectez la chambre aux bornes de l amplificateur fig 3 11 A imposez un potentiel triangulaire dont la fr quence est de 500 Hz et l amplitude 10 mV peak to peak pr levez 2 ul de la solution de lipide et injectez la pr s du trou entre les 3 3 Mesures 21 Black lipid membrane FIGURE 3 11 Sch ma du dispositif exp rimental A La bicouche est ob tenue au niveau du trou s parant les deux compartiments L amplificateur mesure le courant traversant la bicouche tout en imposant une diff rence de potentiel entre les deux compartiments technique du potentiel impos B Reconstitution d une bicouche lipidique artificielle La bicouche est obtenue en injectant une petite quantit de lipides au niveau du trou situ dans le film en t flon s parant les deux compartiments 3 3 Mesures 22 2 compartiments fig 3 11 B et observez le courant Gain 1 mV pA filtre passe bas 1000 Hz Lorsque l amplitude du signal est stable enre gistrez le courant l aide de l ordinateur et de l interface NI USB 6008 pour cela utilisez l application nidatalogger et choisissez une fr quence d chantillonnage de 10 kHz Vos mesures apparaitront sous forme d un fichier Excel situ dans Documents LabView Data Renommez ce fi chier en capacitance xls Gr ce la calibration r alis e pr c dement avec le circuit test valuez la capacit de la bicouche lipidique Vous devez obtenir un
17. demand une source de tension continue variable AV 120mV une interface NI USB 6008 permettant la conversion num rique du signal avec une pr cision de 12 bits dans un intervalle de 10 V 10 V deux pipettes 1 ml et 10 ul une solution contenant un lipide 3 sn phosphatidylcholine dilu dans du n octane 20 mg ml une solution stock de 1 nM de gramicidine La gramicidine A forme des canaux ioniques s lectif pour les ions monovalents positifs fig 3 12 A 3 3 Mesures 3 3 1 Bicouche lipidique artificielle et courants unitaires connectez le circuit RC aux bornes de l amplificateur Gain 1 mV pA filtre passe bas 1000 Hz Allumez le g n rateur de signaux et l aide de l oscilloscope v rifiez que vous imposez un potentiel triangulaire dont la fr quence est de 500 Hz et l amplitude 10 mV peak to peak Observez le courant traversant le circuit et utilisez ce r sultat pour estimer la capacit du circuit test Indiquez cette valeur dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle Placez l interrupteur situ l arri re de la source de tension en position haute Mesurez la r sistance du circuit l aide du g n rateur de tension continue AV 120mV oscilloscope CH2 sur 100 mV div ampli sur gain 1 mV pA et filtre passe bas sur 16 Hz Indiquez la r sistance du circuit test dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg
18. e membrane dont la capacit est de l ordre 200 pF Sachant que la capacit sp cifique d une bicouche lipidique est de l ordre de 1 yF cm estimez le rayon de la bicouche partir du signal observ Indiquez la capacit et le rayon de votre bicouche lipique dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle Placez l interrupteur situ l arri re de la source de tension en position haute Mesurez la r sistance de la bicouche l aide du g n rateur de tension variable AV 120mV oscilloscope CH2 sur 100 mV div ampli sur gain 100 mV pA et filtre passe bas sur 16 Hz Vous devez obtenir une membrane telle que la r sistance observ e est de l ordre 100 GQ Enregistrez le courant l aide de l ordinateur et de l interface NI USB 6008 pour cela utilisez l application nidatalogger et choisissez une fr quence d chantillonnage de 100 Hz Vos mesures apparaitront sous forme d un fichier Excel situ dans Documents LabView Data Renommez ce fichier en resistance xls partir de cette valeur de courant calculez la r sistance de votre bicouche lipique Connais sant sa surface et sachant que son paisseur est de 100 nm calculez galement sa r sistivit sp cifique Indiquez les valeurs de r sistance et de r sistivit sp cifique dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle d stabilisez la membrane obtenue injectez 1 ul de la solution de gramicidine
19. es deux traces corres pondant au deux entr es CH1 et CH2 ainsi que de nombreux param tres de r glages HORIZONTAL Posirio oO OFO Q x E oO OOO E Tous les mod les mod le illustr 4 voies FIGURE 2 7 Panneau des r glages verticaux gauche et horizontaux droite 2 3 Mesures 13 POSITION CH1 et CH2 positionne un signal verticalement CH1 et CH2 MENU permet d afficher les options du menu vertical et d activer et de d sactiver l affichage du signal provenant du canal correspondant VOLTS DIV permet de s lectionner les facteurs d chelle verticaux Par exemple la position 2 V signifie qu une division verticale c d la hauteur d un carr l cran correspond 2 V R glages horizontaux La d viation horizontale sert mesurer le temps Les r glages suivants vous seront utiles POSITION permet de r gler la position horizontale de tous les si gnaux HORIZ MENU permet d afficher les options du menu horizontal SEC DIV permet de s lectionner le facteur de temps pour les deux canaux Par exemple la position 1 ms signifie qu une division horizon tale c d la largeur d un carr l cran correspond 1 ms 2 3 Mesures 2 3 1 Maniement de l oscilloscope Connectez la sortie du g n rateur de fonctions l entr e CH1 de l oscil loscope Observez les signaux obtenus sur l cran de l oscilloscope en faisant v
20. existence de gradients ioniques transmembranaires entretenus par la cellule Les canaux ioniques constituent une cible pharmacologique importante et peuvent galement tre li s certaines pathologies myasth nie mucovisci dose L objectif de cette s ance est de vous permettre appr hender concr tement la notion de potentiel d quilibre ainsi que la th orie des circuits dans un cadre biologique par la mise en vidence exp rimentale des courants unitaires pro duits par l ouverture et la fermeture d un canal ionique Cette s ance a t concue et r alis e en collaboration avec Vadim Shlyonsky et Freddy Dupuis 3 1 1 Pr requis Afin de pr parer cette s ance de travaux pratiques vous devez revoir la section 3 3 du syllabus Une vid o pr sentant le mat riel et l exp rience r aliser est galement disponible dans l Universit Virtuelle 3 1 2 Objectifs de la s ance de laboratoire n 3 Etudier le comportement d un circuit RC en parall le soumis un signal p riodique triangulaire Etudier le comportement d une bicouche lipidique artificielle soumise un signal p riodique triangulaire 3 2 Mat riel 19 senti r ug 4 5 2 FIGURE 3 10 Mat riel li l tude des bicouches lipidiques artificielles A Circuit RC quivalent un l ment de membrane comportant une r sistance 1 GQ et un condensateur de 220 pF Le circuit est muni de deux connec teurs ins rer dans l
21. l isol dans des conditions o les valeurs de potentiel membranaire ne permettent pas l activation des canaux potentiel d pendants Dans ces conditions on peut caract riser l axone par une r sistance lon gitudinale une r sistance de membrane et les propri t s capacitives des pa rois On d finit la constante de longueur comme tant la longueur de la fibre nerveuse telle que la r sistance longitudinale est gale l ar sistance de membrane c d que sur cette longueur la m me quantit de courant aura parcouru la fibre et travers la paroi La figure 2 9 repr sente le sch ma quivalent d un axone d crivant ses propri t s lectriques passives Dans ce sch ma l axone a t divis en petits modules l mentaires de r sistance R et R et de capacit C dans lesquels R repr sente la r sistance longitudinale ou axoplasmique R la r sistance transversale ou membranaire et C la capacite d un l ment de membrane Dans le cadre de ce circuit quivalent la constante de longueur sera exprim e en terme de nombre de modules Dans chaque module R 470 R 1200 et C 20 5uF Effectuez le montage tel qu illustr la figure 2 9 placez un connecteur BNC en T la sortie du g n rateur de fonctions et connectez une sortie l entr e CH1 de l oscilloscope et l autre l entr e du circuit c d entre les points A et la terre du sch ma l aide du c ble avec un connecteur BNC une extr
22. le de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle R p tez la mesure en pr sence de d un gradient de concentration de sodium NaCl 1M 0 1 M Estimez le potentiel d inversion du courant et indiquez cette valeur dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 3 4 Questions Expliquez les points suivant dans le rapport Pourquoi lorsque l on impose une variation de potentiel triangulaire au circuit RC on observe un courant correspondant un signal carr 3 4 Questions 24 Expliquez en quoi l amplitude de ce signal carr est li la valeur de la capacit du condensateur pr sent dans le circuit remarque l amplifi cateur inverse le signal Sachant que la capacit sp cifique d une bicouche lipidique est de l ordre de 1 uF cm expliquez le calcul permettant d estimer le rayon de la bicouche partir du signal observ Connaissant la r sistance et la surface de la bicouche lipidique plane et sachant que son paisseur est de 100 nm expliquez le calcul permettant d estimer sa r sistivit sp cifique Comparez la valeur mesur e du potentiel d inversion la valeur th orique attention joignez galement vos fichiers de mesure de courants lors de la soumission du rapport et de la feuille de calcul Vous devez donc d poser au minimum quatre fichiers dans Universit Virtuelle rapport feuille de calcul mesure de la capacit et
23. mesure de la r sistance de la bicouche li pidique Laboratoire IV potentiels d action 4 1 Introduction L objectif de cette s ance est de vous permettre d appr hender le mod le de Hodgkin et Huxley au travers de la r alisation de simulations num riques Ces simulations illustrent l approche exp rimentale bas e sur la technique du potentiel impos qui est la base de la compr hension du m canisme per mettant la g n ration des potentiels d action De plus vous serez galement amen a tudier les lois de l excitation r gissant l apparition des potentiels d action dans un axone 4 1 1 Pr requis Afin de pr parer cette s ance de travaux pratiques vous devez revoir les sections 4 5 et 5 3 du syllabus 4 1 2 Objectifs de la s ance de laboratoire n 4 Les simulations num riques bas es sur le mod le de Hodgkin Huxley vont nous permettre d tudier les courants cellulaires dus aux canaux Na et KT sensibles au potentiel en potentiel impos d tudier le comportement excitable de l axone de calmar en mettant en vidence les lois r gissant l apparition des potentiels d action 4 2 Logiciel Le logiciel libre NEURON est un environnement de simulation utilis pour la mod lisation th orique de neurones isol s et de r seaux neuronaux 4 2 Logiciel 26 Capture Fichier dition Capture Fen tre Aide Ws 31 jeu 14 19 DavidGall Q T NEURON Main Menu m File Edit Build Tools Gr
24. mit et deux fiches l autre extr mit l entr e du circuit imposez un signal de forme carr e dont la fr quence est d environ 100H z Observez la diff rence de potentiel aux bornes des diff rents modules l aide de la sonde de l oscilloscope connect s l entr e CH2 de l appa 2 4 Questions 16 reil attention respectez la convention pour le potentiel de r f rence utilis e en lectrophysiologie Mesurez pour chacun des dix modules les valeurs des diff rences de potentiel maximales atteintes et portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 2 3 5 Amplification Vous allez tudier le comportement d un circuit actif il s agit ici d un amplificateur non inverseur dont les bornes d alimentation externes sont 4 9 V et 9 V piles situ es dans le boitier Mettez l interrupteur de l amplificateur sur ON Connectez le connecteur BNC en T la sortie du g n rateur de fonctions l entr e CH1 de l oscilloscope et l autre l entr e de lam plificateur IN g n rateur R glez le g n rateur de signaux sur un signal de forme sinusoidale d am plitude minimale et de fr quence d environ 100 Hz Observez la diff rence de potentiel la sortie de l amplificateur l aide de la sonde de l oscilloscope connect s l entr e CH2 R glez l amplificateur sur un gain sup rieur 1 l aide du bouton Pot
25. nnant la conductance maximale mesur e lorsque les canaux Na sensibles au potentiel sont bloqu s en fonction du potentiel impos durant l chelon rectangulaire Quel m canisme pr sent dans le mod le de Hodgkin amp Huxley observe t on Expliquez le graphique donnant la conductance maximale mesur e lorsque les canaux A sensibles au potentiel sont bloqu s en fonction du potentiel impos durant l chelon rectangulaire Quel m canisme pr sent dans le mod le de Hodgkin amp Huxley observe t on Expliquez le graphique montrant les conductances maximales de la membrane suite une s rie de sauts de potentiel impos 15 mV pr c d s de niveaux de conditionnement de potentiels croissants lorsque les canaux A sensibles au potentiel sont bloqu s Quel m canisme pr sent dans le mod le de Hodgkin amp Huxley observe t on Expliquez l effet de la substition du Na extracellulaire sur l amplitude des potentiels d action Expliquez en quoi la chronaxie d pend elle des param tres lectriques passifs de la membrane de l axone
26. oad html FIGURE 4 13 L interface graphique de l environnement de simulation NEU RON dans le cadre de la simulation du modele de Hodglin amp Huxley 4 8 Simulations num riques 27 Il peut tre gratuitement t l charg du site http www neuron yale edu et fonctionne avec les syst mes d exploitations les plus courants MSWindows 98 et au del UNIX Linux et Mac OS X Nous allons utiliser cet ou til d informatique afin d tudier plus en d tail la dynamique du mod le de Hodgkin et Huxley Pour d marrer le logiciel cliquez sur l ic ne neurondemo situ e dans le dock Ensuite s lectionnez l option Patch HH dans la fen tre NEURON Demonstrations Enfin dans la fen tre NEURON Main Menu ouvrez le menu Tools Distributed Mechanisms Viewers Name Values et double cliquez sur soma La fen tre soma 0 1 Parameters apparait alors Dans cette configuration les fen tres et options suivantes nous seront utiles La fen tre NEURON Demonstrations qui permet de s lectionner diff rentes types de simulations de d monstrations Lafen tre Temperature qui permet de choisir la valeur de la temp rature La fen tre soma 0 1 Parameters qui permet de modifier les pa ram tres du mod le de Hodgkin amp Huxley En particulier les conduc tances maximales des canaux Na et K sensibles au potentiel gna bar hh et gkbar hh de la conductance de fuite gl hh et les concen tr
27. s bas es sur le mod le de Hodgkin et Huxley Laboratoire I la mesure et l instrumentation 1 1 Introduction Il s agit d une s ance d introduction aux diff rents appareils n cessaires la mise en vidence de diff rences de potentiel et de courants et leur utilisation dans le cadre de mesures de caract ristiques lectriques de circuits r sistifs lin aires et non lin aires r sistance ampoule et diode en courant continu 1 1 1 Pr requis Afin de pr parer cette s ance de travaux pratiques vous devez revoir les sections 3 2 5 2 2 et 5 2 3 du syllabus 1 1 2 Objectifs de la s ance de laboratoire n 1 Apprendre utiliser le multim tre pour mesurer respectivement le cou rant traversant un conducteur et la diff rence de potentiel V aux bornes d un conducteur Mesurer les caract ristiques V de diff rents conducteurs et obser ver que certains ob issent la loi d Ohm alors que d autres on un comportement diff rent Apprendre monter deux r sistances en s rie en parall le et en divi seur de tension pr voir la caract ristique de ce circuit et contr ler exp rimentalement le mod le th orique 1 2 Mat riel cinq l ments r sistifs passifs trois r sistances R1 R2 2 et R5 une ampoule filament 12V et une diode 1 2 Mat riel Se ne PR AE Fil de r sistance R sistance Condensateur G n rateur de Voltm tre n gligeable tension continue Masse
28. stimulateur augmente et que le seuil d apparition des potentiels d action est atteint d autant plus ra pidement que l intensit de l chelon est grande 4 4 Questions 30 On vous demande de construire la courbe intensit dur e donnant la valeur de l intensit de courant seuil en fonction de la dur e de stimu lation r alis e avec 5 ms de d lai Cette courbe permet de d terminer un param tre d int r t en physiologie la chronaxie qui est la dur e minimale d un chelon rectangulaire d intensit double de le la rh obase permettant l apparition d un potentiel d action L int r t de cette no tion est qu elle varie peu en fonction des conditions exp rimentales et caract rise bien la vitesse de conduction d une fibre qui est d environ 1 cm chronaxie La mesure de la chronaxie peut tre r alis e en clinique afin de mettre en vidence des alt rations de la conduction nerveuse 4 4 Questions Expliquez les points suivant dans le rapport Commentez la diff rence entre les courants observ s durant un saut de potentiel impos de 65 mV 130 mV et 65 mV 0 mV Commentez la diff rence entre les deux courbes courants potentiels donnant l intensit du pic de courant entrant transitoire et du courant sortant soutenu en fonction du potentiel impos Expliquez l effet de la substitution du Na extracellulaire sur le courant membranaire mesur durant un saut de potentiel d polarisant Expliquez le graphique do
29. t diode Laboratoire II propri t s passives et actives de la membrane cel lulaire Il s agit l aide des instruments d j pr sent s d analyser le comportement lectrique de circuits quivalents simulant les propri t s lectriques passives de la membrane cellulaire charge et d charge du condensateur notion de constante de temps circuit simulant la r ponse passive d un axone notion de constante d espace et d tudier le com portement d un circuit actif amplificateur Laboratoire III canaux ioniques Vous serez amen s r aliser une bi couche lipidique artificielle et y ins rer des canaux ioniques grami cidine A afin d observer les courants unitaires produits par l ouverture et la fermeture de ces canaux Au travers de cette exp rience vous pourrez appr hender concr tement les notions de th orie des circuits dans un cadre biologique Laboratoire IV potentiel d action et excitabilit Il s agit d tudier l approche exp rimentale bas e sur la technique du potentiel impos qui est la base de la compr hension du m canisme permettant la g n ration des potentiels d action De plus les lois de l excitation ner veuse d couvertes empiriquement au d but du vingti me si cle r gissant l apparition des potentiels d action dans un axone sont galement mises en vidence dans cette s ance Ces diff rents aspects seront abord au travers de la r alisation de simulations num rique
30. tension correspondant pour R3 en position 3 position 6 et position 11 Mesurez les r sistances correspon dant aux trois positions de A utilis es l aide de l ohmm tre 1 4 Questions 1 4 Questions Parmi les quatre l ments tudi s lesquels ont un comportement oh mique Peut on parler de la r sistance d une ampoule Si oui dans quelles conditions Peut on parler de la r sistance d une diode Si oui dans quelles condi tions Concernant les montages en parall le en s rie et en diviseur de tension avec les deux valeurs de R vos r sultats sont ils en accord avec la th orie Expliquez l effet que vous observez vous en faisant varier R3 dans le dernier montage Laboratoire II propri t s passives et actives de la membrane cellulaire 2 1 Introduction L objectif de cette s ance est de vous familiariser avec la mesure de si gnaux lectriques qui voluent au cours du temps Dans ce but vous ap prendrez a utiliser un oscilloscope qui est un instrument de base dans tout laboratoire de physiologie 2 1 1 Pr requis Afin de pr parer cette s ance de travaux pratiques vous devez revoir le chapitre 4 et la section 5 2 du syllabus 2 1 2 Objectifs de la s ance de laboratoire n2 Apprendre utiliser l oscilloscope pour mesurer une diff rence de po tentiel V qui varie au cours du temps Etudier le comportement d un circuit RC soumis un signal p riodique carr
31. ton POWER 36 du g n rateur de tension continue Cet appareil est utilis comme g n rateur de signaux al ternatifs La sortie du signal se fait l aide d un c ble de type BNC c ble coaxial de type British National Cable qui sera connect en OUTPUT 10 Vous devez choisir les caract ristiques de votre signal savoir Sa forme FUNCTION 17 Son amplitude AMP 11 qui est un bouton non gradu Il vous faut donc utiliser l oscilloscope pour connaitre l amplitude du signal de sortie Sa fr quence les sept boutons FREQUENCY 18 permettent de choisir une plage de fr quence par exemple X10 donne acc s des fr quences allant de 1 18 Hz Le vernier 16 permet le r glage fin dans la plage choisie La fr quence s lectionn e peut tre lue directe ment sur le fr quencem tre Les autres fonctions ne seront pas utilis es au laboratoire Veillez cepen dant ce que la sortie se fasse en 50 bouton 19 non enfonc et ce que le bouton DISPLAY soit en position enfonc e 2 2 Mat riel 11 Kk 668 0 oO Q GE a eee S9 wear 52 8 no Ras son e oO De CH1 CH2 EXTERNE Fil T E ust Z A Le es nn FIGURE 2 5 Panneau avant de l oscilloscope A droite de l cran on dis tingue les deux connecteurs d entr e CH1 et CH2 les r glages verticaux am plitude pour les deux canaux
32. ur une p riode R glez l oscilloscope de fa on visualiser la d charge du condensateur avec une pr cision maximale Relevez l cran les coordonn es de la courbe de d charge V t Portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 2 3 3 Le circuit RC comme filtre Comme nous l avons vu au cours le circuit RC peut tre utilis comme un filtre en fr quence att nuant les hautes fr quences mais pas les basses fr quences l entr e du circuit imposez un signal de forme sinusoidale dont vous r glez l amplitude au maximum et la fr quence au minimum Faites ensuite augmenter la fr quence sans modifier le r glage d amplitude et observez l amplitude du signal de sortie Relever une dizaine de va leurs d amplitude pour des valeurs de fr quences croissantes de fa on couvrir l enti ret de la plage de fr quence disponible sur le g n rateur Calculez le gain en tension pour chaque fr quence et portez vos mesures dans la feuille de travail Excel que vous avez t l charg d Universit Virtuelle 2 3 Mesures lt gt G n rateur de signau re Module 1 Module 2 Module 10 FIGURE 2 9 Sch ma du circuit quivalent de l axone 2 3 4 Propri t s passives et circuit quivalent de l axone Comme nous l avons vu au cours l axone non my linis peut tre compar un cable lectrique ma
33. ure Pour la mesure d une capacit les bornes du condensateur sont reli es au multim tre dans les entr es sp cifiques not es CAP 35 ou Cx Pour toutes les autres me sures une borne est connect e l entr e de r f rence not e COM 33 et l autre l entr e ad quate suivant la mesure effectuer 31 32 ou 34 1 3 Mesures conducteur FIGURE 1 3 Mesure de la r sistance 1 3 Mesures 1 3 1 Contr le de la source de tension variable Connectez le voltm tre aux bornes du g n rateur de tension variable 0 30 V de l alimentation attention aux polarit s Choisissez l chelle appropri e sur le voltm tre Faites varier la tension o VOLTAGE et v rifiez l aide du voltm tre l exactitude de la valeur affich e sur l cran du g n rateur de tension 1 3 2 Mesures des caract ristiques de diff rents conduc teurs R alisez le montage propos fig 1 3 en utilisant le multim tre de l alimentation combin e comme amp rem tre entr e 20 A et utilisation du bouton 6 en position x20000 et le multim tre ind pendant comme voltm tre Faites v rifier votre montage Mesurez successivement pour chacun des quatre l ments passifs Ri R2 2 ampoule et diode vingt paires de valeurs de I et V sur une plage de tension allant de 10 V 10 V maximum sauf pour la diode entre 2 V et 1 V maximum en prenant plus de points quand le courant varie fortement pour de faibles v
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