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(type 8) (latent nuclear antigen)

1. H
2. 7 TBS 1 5 8 op 10 9 10 TBS 2 x 5 11 12 TBS 2 x 5 13
3. NCL HHV8 LNA Page 36 Oi
4. C Tia XPWHOVOVO
5. Ol IHC XPWHOVOVO H rou
6. TO HUG TOES
7. ro a Kaposi
8. TOU H 15 mM MSDS O WG
9. 13B10 Avoooy vo C TEMKOU HHV8 LNA 1 8 15 mM O Ig 1961 1 0 8 0 g L
10. rou NCL HHV8 LNA H va
11. TO ABC HRP 3 3 DAB 0 HE 1 ESSEN B 1 25 C 2 H Novocastra
12. 13B10 n 28 O 13B10 avriy vo 1 8 7 7 Kaposi n 65 NCL HHV8 LNA LNA 8 Kaposi H IHC H
13. ion 31 5 mg L ELISA Ig 1 25 1 50 60 25 C 0 01 M pH 6 0 2 8 C
14. TOU 2 8 C 20 C 2 8 C 10
15. Kontroller at pakken er ubeskadiget f r brug www LeicaBiosystems com NCL HHV8 LNA Page 1 Novocastra Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Product Code NCL HHV8 LNA Intended Use For in vitro diagnostic use NCL HHV8 LNA is intended for the qualitative identification by light microscopy of Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen molecules in paraffin sections The clinical interpretation of any staining or its absence should be complemented by morphological studies using proper controls and should be evaluated within the context of the patient s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist Principle of Procedure Immunohistochemical IHC staining techniques allow for the visualization of antigens via the sequential application of a specific antibody to the antigen primary antibody a secondary antibody to the primary antibody and an enzyme complex with a chromogenic substrate with interposed washing steps The enzymatic activation of the chromogen results in a visible reaction product at the antigen site The specimen may then be counterstained and coverslipped Results are interpreted using a light microscope and aid in the differential diagnosis of pathophysiological processes which may or may not be associated with a particular anti
16. Leica Biosystems Newcastle Ltd H 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P NCL HHV8 LNA Page 37 2 Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicin
17. 3 rou TOY 0 01 M pH 6 0 3 84 g 1 8 L pH 6 0 1 M NaOH 2 L EDTA 1 mM pH 8 0 0 37 g EDTA E 5134 SIGMA 1 L pH 8 0 0 1 M NaOH 20 mM Tris 0 65 mM EDTA 0 0005 Tween 20 pH 9 0 14 4 g Tris 271197K BDH 1 44 g EDTA E 5134 SIGMA 0 55 L TO pH 9 1 M HCI
18. ABC HRP 14 TBS 2 x 5 NCL HHV8 LNA Page 39 15 ETTW OTE DAB 16 17 18 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 40 Novocastra Lyophiliseret Monoklonalt Museantistof Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Produktkode NCL HHVS LNA Tilsigtet Anvendelse Til in vitro diagnostisk anvendelse NCL HHV8 LNA er beregnet til kvalitativ identifikation af Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen molekyler i paraffinsnit ved lysmikroskopi Klinisk fortolkning af farvning eller mangel derp skal suppleres med morfologiske unders gelser under anvendelse af passende kontroller og b r evalueres i sammenh ng med patientens kliniske historie og andre diagnostiske tests af en kvali
19. 0 3 ml Tween 20 P 1379 SIGMA 0 6 L 10x 0 15 L 1 35 L Oi 25 C 1 2 3 4
20. 0 5 v v 10 5 6 1 5 L rou OUVIOTWNEVOU o 1
21. 4 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 5 Hong A Davies S and Lee S Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 R ttelser Av Tidigare Utgivning Galler inte Utgivningsdatum 18 juni 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 33 Immunhistokemisk metodologi f r anv ndning av Novocastra antikroppar p paraffininb ddad v vnad med h g temperatur antigen tervinningstekniken A Reagens som kr vs men ej tillhandah lls 1 Standard l sningar som anv nds inom immunhistokemi 0 5 v v V teperoxid 50 mM Trisbuffrad salt TBS pH 7 6 Antigen tervinningsl sning ar se Rekommendationer vid anv ndning Antikroppsutsp dningsmedel optimalt sp tt normalt serum Normal sera fr n arterna i vilka den sekund ra antikroppen odlas Sekund r biotinylerad antikropp bered enligt tillverkarens rekommendationer Avidin Biotin komplex pepparrotsperoxidas ABC HRP bered enligt tillverkarens rekommendationer 3 3 Diaminobenzidin tetrahydroklorid DAB bered enligt tillverkarens rekommendationer 0 Hematoxylin kontrastf rgning bered enligt tillverkarens rekommendationer 1 Monteringsmedel bered enligt tillverkar
22. Les contr les doivent tre des sp cimens frais provenant d autopsies de biopsies ou d interventions chirurgicales fix s au formol trait s et inclus en cire de paraffine d s que possible de la m me facon que le s chantillon s de patient Tissu de Contr le Positif Il est utilis pour indiquer que les tissus ont t pr par s correctement et que les techniques de marquage taient appropri es Un contr le tissulaire positif doit tre inclus dans toute op ration de marquage pour chaque ensemble de conditions d analyse Un tissu pr sentant un marquage faiblement positif est plus adapt un contr le de qualit optimal qu un tissu pr sentant un marquage fortement positif et il permet de d tecter de moindres niveaux de d gradation du r actif Le tissu de contr le positif recommand est le sarcome de Kaposi Si le tissu de contr le positif ne pr sente pas de marquage positif les r sultats des sp cimens analys s doivent tre consid r s comme invalides Tissu de Contr le N gatif Il doit tre examin apr s le tissu de contr le positif afin de v rifier la sp cificit du marquage de l antig ne cible par l anticorps primaire Les muscles squelettiques constitue le tissu de contr le n gatif recommand Sinon la diversit des types cellulaires pr sents dans la plupart des tissus permet de disposer fr quemment de sites de contr le n gatif mais ils doivent tre v rifi s par l utilisateur S il es
23. Order code M29 P Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 Hong A Davies S and Lee S Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Correcciones A La Publicaci n Anterior No aplicable Fecha De Publicaci n 18 de junio de 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 23 Metodologia inmunohistocitoquimica para utilizar anticuerpos Novocastra sobre tejido incluido en parafina mediante la t cnica de recuperaci n de ant geno por alta temperatura A Reactivos necesarios que no se incluyen 1 Disolventes est ndar utilizados en inmunohistocitoqu mica 0 5 v v Per xido de hidr geno Soluci n salina tamponada Tris TBS 50 mM pH7 6 Soluci n es recuperadora s de ant geno ver Recomendaciones de Uso Disolvente de anticuerpo suero normal en diluci n ptima S
24. au choix la fixation et au traitement des tissus la pr paration des lames IHC et l interpr tation des r sultats du marquage Le marquage des tissus d pend de leur manipulation et de leur traitement avant le marquage Une fixation une cong lation une d cong lation un lavage un s chage un chauffage une coupe incorrects ou une contamination par d autres tissus ou d autres liquides sont susceptibles de conduire la production d artefacts au pi geage de l anticorps ou des r sultats faussement n gatifs Des variations dans les m thodes de fixation et d inclusion ainsi que des irr gularit s propres au tissu peuvent conduire des r sultats incoh rents Une coloration de contraste excessive ou incompl te peut g ner l interpr tation correcte des r sultats NCL HHV8 LNA Page 7 L interpr tation clinique de tout marquage ou absence de marquage doit tre compl t e par des tudes morphologiques utilisant des contr les appropri s et doit tre valu e par un pathologiste qualifi la lumi re des ant c dents cliniques du patient et d autres analyses diagnostiques Les anticorps de Leica Biosystems Newcastle Ltd sont destin s selon les besoins tre utilis s sur des coupes incluses en paraffine ou des coupes congel es et conform ment des exigences particuli res en mati re de fixation Une expression antig nique inattendue est susceptible de se produire en particulier au niveau des n
25. Lavare in tampone TBS per 2 x 5 minuti scuotendo delicatamente 13 Incubare i vetrini in ABC POD 14 Lavare in tampone TBS per 2 x 5 minuti scuotendo delicatamente 15 Incubare i vetrini in DAB NCL HHV8 LNA Page 14 16 Sciacquare i vetrini 17 Controcolorare con ematossilina 18 Disidratare pulire e montare le sezioni E Modifiche alla pubblicazione precedente Sono state apportate correzioni solo al layout Il testo non ha subito alcuna variazione rispetto alla versione precedente F Data di pubblicazione 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 15 Novocastra Lyophilisierter Monoklonaler Maus Antik rper Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Produkt Nr NCL HHV8 LNA Verwendungszweck F r in vitro Diagnostik NCL HHV8 LNA ist f r den qualitativen Nachweis der Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Molek le in Paraffinschnitten mittels Lichtmikroskopie gedacht Die klinische Bewertung einer vorliegenden bzw fehlenden F rbung sollte durch morphologische Studien mit entsprechenden Kontrollen erg nzt und im Kontext der Krankengeschichte des Patienten und anderer diagnostischer Tests von einem qualifizierten Pathologen vorgenommen werden Verfahrensgrundlage Immunhistochemische IHC F rbetechniken gestatten die optische Darstellung von Antigenen mittels sequentieller Anwendung eines spezifischen Antik rpers zum Antigen prim rer Antik rper eines sekund ren Antik rp
26. oplasmes L interpr tation clinique de toute coupe tissulaire marqu e doit comporter une analyse morphologique et l valuation des contr les appropri s Bibliographie G n rale 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 Hong A Davies S and Lee S Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Amendements Apport s la Version Pr c dente Non applicable Date de Publication 18 juin 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 8 M thodologie immunohistochimique d utilisation des anticorps Novocastra sur les tissus inclus en paraffine l
27. pH 8 0 0 37 g EDTA SIGMA produktkode E 5134 tils ttes til 1 destilleret vand pH justeres til 8 0 vha 0 1 m NaOH 20 mm Tris 0 65 mm EDTA 0 0005 Tween 20 genvindingsoplosning pH 9 0 14 4 g Tris BDH produktkode 271197K og 1 44 g EDTA SIGMA produktkode E 5134 opl ses i 0 55 I destilleret vand pH justeres til 9 med 1 m og tils ttes 0 3 ml Tween 20 SIGMA produktkode P 1379 Der laves op til 0 6 I med destilleret vand Dette er et 10x koncentrat som skal fortyndes med destilleret vand efter behov f eks 0 15 I fortyndet med 1 35 I destilleret vand D Metodik For denne metodik tages i brug skal brugere vaere opl rt i immunohistokemiteknikker Kunder skal fastleegge optimale fortyndinger for antistoffer Med mindre andet er anf rt skal alle trin udf res ved stuetemperatur 25 C Snittene sk res og monteres p objektglas coatet med en passende v vsadh siv Snittene deparaffineres i xylen og xylensurrogater Rehydreres gennem klassificeret alkohol Endogenperoxidase neutraliseres vha 0 5 v v brintoverilte metanol i 10 minutter MR NM Objektglassene vaskes under rindende vand fra hanen Snittene forbehandles p folgende m de 6 1 5laf den anbefalede genvindingsoplesning se Anbefalinger vedr anvendelse saettes i kog i en trykkoger L get leegges p men l ses ikke fast Objektglassene placeres i farvningsstativerne af metal objektglassene m naturligvis ikke st for t t da farvningen s p
28. rbeergebnisse Die Gewebef rbung h ngt von der Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor dem F rben ab Unsachgem es Fixieren Einfrieren Auftauen Waschen Trocknen Erw rmen Schneiden oder eine Kontamination mit anderen Geweben oder Fl ssigkeiten kann zu Artefakten Antik rper Trapping oder falsch negativen Ergebnissen f hren Abweichende Ergebnisse k nnen aufgrund von Unterschieden bei der Fixierung und Einbettung oder intrinsischen Unregelm igkeiten im Gewebe selbst entstehen Eine exzessive oder unvollst ndige Gegenf rbung kann die korrekte Bewertung von Ergebnissen gef hrden Die klinische Bewertung einer vorliegenden bzw fehlenden F rbung sollte durch morphologische Studien mit entsprechenden Kontrollen erg nzt und im Kontext der Krankengeschichte des Patienten und anderer diagnostischer Tests von einem qualifizierten Pathologen vorgenommen werden Antik rper von Leica Biosystems Newcastle Ltd sind wo angezeigt f r die Verwendung entweder auf gefrorenen oder in Paraffin eingebetteten Schnitten mit spezifischen Fixierungsanforderungen bestimmt Es kann insbesondere bei Neoplasmen zu einer unerwarteten Antigenexpression kommen Die klinische Bewertung eines gef rbten Gewebeschnitts muss eine morphologische Analyse und die Auswertung der entsprechenden Kontrollen einschlie en Literatur Allgemein 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases
29. 10 minuti 5 Lavare i vetrini con acqua corrente Pretrattare le sezioni come segue 6 Riscaldare 1 5 L della soluzione di smascheramento raccomandata vedere Raccomandazioni per l uso fino alla bollitura in una pentola a pressione Coprire senza chiudere ermeticamente il coperchio Posizionare le sezioni in rastrelli di colorazione metallici non mettere i vetrini troppo vicini l uno all altro perch ci potrebbe provocare una colorazione irregolare e calarle nella pentola a pressione assicurandosi che i vetrini siano completamente immersi nella soluzione di smascheramento Chiudere ermeticamente il coperchio Quando la pentola raggiunge temperatura e pressione di esercizio calcolare un minuto di tempo se non diversamente indicato in Raccomandazioni per l uso Allontanare la pentola a pressione dal fuoco e metterla sotto l acqua fredda con il coperchio ancora chiuso NON APRIRE IL COPERCHIO FINO A QUANDO L INDICATORE NON SEGNALI LA CADUTA DELLA PRESSIONE Aprire il coperchio estrarre i vetrini e metterli immediatamente sotto l acqua corrente 7 Lavare le sezioni in TBS per 1 x 5 minuti scuotendole delicatamente 8 Ricoprire le sezioni con siero normale diluito per 10 minuti 9 Incubare le sezioni con anticorpo primario diluito in maniera ottimale vedere Raccomandazioni per l uso 10 Lavare in tampone TBS per 2 x 5 minuti scuotendo delicatamente 11 Incubare le sezioni con l anticorpo secondario biotinilato appropriato 12
30. av fixerings och inb ddningsmetoder eller p naturliga oregelbundenheter i v vnaden verfl dig eller ofullst ndig kontrastf gning kan f rsv ra en korrekt tolkning av resultatet Den kliniska tolkningen av all f rgning eller dess fr nvaro b r kompletteras med morfologiska unders kningar som anv nder korrekta kontroller och utv rderas av kvalificerad patolog inom ramen f r patientens kliniska anamnes och andra diagnostiska tester Antikroppar fr n Leica Biosystems Newcastle Ltd r till f r anv ndning s som anges p antingen frysta eller paraffininb ddade snitt med specifika fixeringskrav Ov ntat antigenuttryck kan ske speciellt i neoplasmer Morfologisk analys och utv rdering av l mpliga kontroller m ste ing i den kliniska tolkningen av alla f rgade v vnadssnitt Bibliografi Allm n 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P 2 Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia NCL HHV8 LNA Page 32 3 Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and its pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767
31. clinica del paziente e delle altre metodiche diagnostiche adoperate Principio Della Procedura Le tecniche di colorazione immunoistochimica IHC consentono la visualizzazione degli antigeni mediante l applicazione sequenziale di un anticorpo specifico per l antigene anticorpo primario di un anticorpo secondario che lega l anticorpo primario e di un complesso enzimatico con un substrato cromogeno l applicazione dei tre reagenti intervallata da fasi di lavaggio L attivazione enzimatica del cromogeno produce una reazione visibile in corrispondenza del sito antigenico Il campione biologico pu quindi essere controcolorato e montato risultati vengono interpretati mediante un microscopio ottico e sono utili nella diagnosi differenziale di processi fisiopatologici che possono essere pi o meno associati ad un particolare antigene Clone 13B10 Immunogeno Proteina ricombinante procariotica corrispondente a una porzione della regione C terminale della molecola di antigene nucleare latente 1di HHV8 Specificit Antigene nucleare latente 1 LNA 1 dell Herpes virus umano di tipo 8 Composizione Del Reagente NCL HHV8 LNA un supernatante liofilizzato di coltura tissutale contenente 15 mM di sodio azide come conservante L utente deve ricostituire il contenuto del flacone con il volume appropriato di acqua distillata sterile come indicato sull etichetta del flacone stesso Classe Ig IgG1 Concentrazione Proteica Totale
32. control As with any immunohistochemical test a negative result means that the antigen was not detected not that the antigen was absent in the cells tissue assayed If necessary use a panel of antibodies to identify false negative reactions Results Expected Normal Tissues Clone 13B10 gave no staining in a range of normal tissues evaluated n 28 Abnormal Tissues Clone 13B10 detected the human herpesvirus type 8 latent nuclear antigen 1 in the nucleus of 7 7 Kaposi s sarcomas No staining was observed in a variety of additional tumors evaluated n 65 NCL HHV8 LNA is recommended for the detection of the latent nuclear antigen LNA of human herpesvirus 8 in Kaposi s sarcoma General Limitations Immunohistochemistry is a multistep diagnostic process that consists of specialized training in the selection of the appropriate reagents tissue selection fixation and processing preparation of the IHC slide and interpretation of the staining results Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining Improper fixation freezing thawing washing drying heating sectioning or contamination with other tissues or fluids may produce artefacts antibody trapping or false negative results Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods or to inherent irregularities within the tissue Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of re
33. dei tipi cellulari presenti nella maggior parte delle sezioni tissutali offre spesso siti di controllo negativo ma questo va verificato dall utente La colorazione aspecifica se presente assume di solito aspetto diffuso La colorazione sporadica del tessuto connettivo pu anche manifestarsi in seguito ad iperfissazione di sezioni di tessuto in formalina Per l interpretazione dei risultati della colorazione usare cellule intatte Le cellule necrotiche o degenerate si colorano spesso in maniera aspecifica Si possono osservare risultati falsamente positivi dovuti a legame non immunologico delle proteine o a prodotti di reazione del substrato Tali falsi positivi possono essere anche causati da enzimi endogeni quali la pseudoperossidasi eritrociti la perossidasi endogena citocromo C o la biotina endogena es fegato mammella cervello rene a seconda del tipo di immunocolorazione usato Per differenziare l attivit enzimatica endogena o il legame enzimatico aspecifico dall immunoreattivit specifica possono essere colorati ulteriori tessuti del paziente esclusivamente con substrato cromogeno o con complessi enzimatici avidina biotina streptavidina polimero marcato e substrato cromogeno Se nel controllo negativo del tessuto compare una colorazione specifica i risultati sui campioni biologici ottenuti dal paziente devono essere considerati non validi Controllo Negativo Del Reagente Usare un controllo negativo aspecifico del re
34. endogenous peroxidase using 0 5 v v hydrogen peroxide methanol for 10 minutes 5 Wash slides in running tap water Pretreat the sections as follows 6 Heat 1 5 L of the recommended retrieval solution see Recommendations on Use until boiling in a pressure cooker Cover but do not lock lid Position slides into metal staining racks do not place slides close together as uneven staining may occur and lower into pressure cooker ensuring slides are completely immersed in retrieval solution Lock lid When the pressure cooker reaches operating temperature and pressure time for 1 minute unless otherwise indicated in Recommendations on Use Remove pressure cooker from heat source and run under cold water with lid on DO NOT OPEN LID UNTIL THE INDICATORS SHOW THAT PRESSURE HAS BEEN RELEASED Open lid remove slides and place immediately in cool tap water 7 Wash sections in TBS for 1 x 5 minutes with gentle rocking 8 Cover sections with diluted normal serum for 10 minutes 9 Incubate sections with optimally diluted primary antibody see Recommendations on Use 10 Wash in TBS buffer for 2 x 5 minutes with gentle rocking 11 Incubate sections in appropriate biotinylated secondary antibody 12 Wash in TBS buffer for 2 x 5 minutes with gentle rocking 13 Incubate slides in ABC HRP 14 Wash in TBS buffer for 2 x 5 minutes with gentle rocking 15 Incubate slides in DAB 16 Rinse slides in water 17 Counterstain with hematoxylin 18
35. la tinci n Una fijaci n congelaci n descongelaci n lavado secado calentamiento o seccionamiento incorrectos o la contaminaci n con otros tejidos o l quidos pueden generar artefactos atrapamiento del anticuerpo o falsos negativos La aparici n de resultados incoherentes puede deberse a variaciones en los m todos de fijaci n y de inclusi n o a irregularidades inherentes al tejido Una contratinci n excesiva o incompleta puede poner en peligro la interpretaci n correcta de los resultados NCL HHV8 LNA Page 22 La interpretaci n clinica de cualquier tinci n o de su ausencia debe complementarse con estudios morfol gicos con el uso de los controles adecuados y un anatomopat logo cualificado debe evaluarla en el contexto del historial clinico del paciente y de otras pruebas diagn sticas Los anticuerpos de Leica Biosystems Newcastle Ltd son para utilizarlos seg n se indique con secciones congeladas o incluidas en parafina con requisitos de fijaci n especificos Puede producirse una expresi n inesperada del antigeno especialmente en las neoplasias La interpretaci n clinica de cualquier secci n de tejido te ida debe incluir un an lisis morfol gico y la evaluaci n de los controles apropiados Bibliografia General 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9
36. nelle tecniche in uso presso il laboratorio dell utente possono produrre una discrepanza significativa nei risultati rendendo necessaria la regolare esecuzione di controlli interni in aggiunta alle procedure descritte di seguito I controlli devono essere costituiti da campioni biologici freschi autoptici bioptici chirurgici e devono essere il pi rapidamente possibile fissati in formalina processati ed inclusi in paraffina allo stesso modo dei campioni biologici ottenuti dal paziente Controllo Positivo Del Tessuto E usato per indicare tessuti correttamente preparati e tecniche di colorazione appropriate Per ogni gruppo di condizioni del test e ogni volta che viene eseguita la colorazione deve essere incluso un controllo positivo del tessuto Un tessuto a debole colorazione positiva pi adatto di uno a colorazione positiva intensa per un ottimale controllo qualit e per mettere in evidenza anche minimi livelli di degradazione del reagente Il tessuto raccomandato per il controllo positivo il sarcoma di Kaposi Se il controllo positivo del tessuto non dimostra colorazione positiva i risultati con i campioni biologici del test vanno considerati non validi Controllo Negativo Del Tessuto Va esaminato dopo il controllo positivo per verificare la specificit nei confronti dell antigene bersaglio da parte dell anticorpo primario Il tessuto raccomandato per il controllo negativo il muscolo scheletrico In alternativa la variet
37. ogni sezione tissutale colorata deve includere l analisi morfologica e la valutazione dei controlli appropriati Riferimenti Bibliografici Di Base 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 Hong A Davies S and Lee 5 Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Modifiche Alla Pubblicazione Precedente Non applicabile Data Di Pubblicazione 18 giugno 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 13 Metodologia immunoistochimica per l uso di anticorpi Novocastra su tessuto incluso in paraffina utilizzando la tecnica di smascheramento antigenico ad alta tempera
38. rberahmen aus Metall einbringen Objekttr ger nicht zu dicht aneinander legen da eine ungleichm ige F rbung auftreten k nnte und in den Druckkochtopf legen Dabei muss sichergestellt werden dass die Objekttr ger vollst ndig in die Retrieval L sung eintauchen Deckel verriegeln Nachdem der Druckkochtopf die Betriebstemperatur und den Betriebsdruck erreicht hat 1 Minute lang warten sofern nicht in den Gebrauchsempfehlungen anderweitig vermerkt Druckkochtopf von der Platte entfernen und bei verriegeltem Deckel unter laufendem Kaltwasser abk hlen DER DECKEL DARF ERST DANN GE FFNET WERDEN WENN LAUT ANZEIGE DER INNENDRUCK ABGEBAUT WORDEN IST Den Deckel ffnen die Objekttr ger entnehmen und unverz glich in kaltes Leitungswasser legen 7 Schnitte in TBS 1 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung sp len 8 Die Schnitte 10 Minuten lang mit verd nntem Normalserum bedecken 9 Die Schnitte mit optimal verd nntem prim ren Antik rper inkubieren siehe Gebrauchsempfehlungen 10 Die Schnitte in TBS Puffer 2 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung sp len 11 Die Schnitte mit einem entsprechend biotinylierten sekund ren Antik rper inkubieren 12 Die Schnitte in TBS Puffer 2 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung sp len 13 Die Objekttr ger in ABC HRP inkubieren 14 Die Schnitte in TBS Puffer 2 x 5 Minuten lang mit sanfter Kippbewegung sp len 15 Die Objekttr ger in DAB inkubieren NCL HHV8 LNA Page 19 16 Die
39. recommand Ceci n est donn qu titre indicatif et les utilisateurs doivent d terminer leurs propres dilutions de travail optimales Conservation et Stabilit Conserver l anticorps non ouvert 2 8 C Dans ces conditions il n y a pas de perte de performance significative du produit jusqu la date de p remption qui figure sur l tiquette du flacon Ne pas utiliser apr s la date de p remption indiqu e sur l tiquette du r cipient L anticorps reconstitu est stable pendant au moins deux mois s il a t conserv 2 8 C Pour une conservation long terme il est recommand de congeler les aliquotes d anticorps 20 C l utilisation de cong lateurs d givrage automatique n est pas conseill e Ne pas congeler et d congeler de fa on r p t e Pr parer les dilutions de travail le jour m me de leur utilisation Remettre imm diatement 2 8 C apr s utilisation Les conditions de conservation autres que celles qui sont sp cifi es ci dessus doivent faire objet d une v rification par l utilisateur Pr paration des Sp cimens Le fixateur recommand est le formol 1096 tamponn neutre pour coupes tissulaires incluses en paraffine Mises en Garde et Pr cautions Ce r actif a t pr par partir du surnageant d une culture cellulaire Du fait de sa nature de produit biologique sa manipulation doit aire l objet du plus grand soin Dans ce r actif la molarit de l azide de sodium est de 15 mM Un
40. siehe D Vorgehensweise auf Paraffinschnitten Empfohlene Verd nnung 1 25 1 50 ber einen Zeitraum von 60 minuten bei 25 C Es wird empfohlen das Hochtemperatur Antigen Retrieval mit 0 01 mol l Citrat Retrieval L sung pH Wert 6 0 zu verwenden Dies ist nur eine Empfehlung und die Benutzer sollten ihre eigenen optimalen Arbeitsverd nnungen bestimmen Lagerung und Stabilit t Unge ffneten Antik rper bei 2 8 C lagern Unter diesen Bedingungen kommt es bis zum Ablauf des auf dem Produktetikett angegebenen Verfallsdatums zu keiner bedeutenden Verschlechterung der Produktleistung Nach Ablauf des Verfallsdatums auf dem Beh lteretikett darf das Produkt nicht mehr verwendet werden Der rekonstituierte Antik rper bleibt bei einer Lagertemperatur von 2 8 C mindestens zwei Monate lang stabil F r eine langfristige Lagerung wird empfohlen Aliquoten des rekonstituierten Antik rpers bei 20 C einzufrieren frostfreie Gefrierschr nke werden nicht empfohlen Wiederholtes Einfrieren und Auftauen muss vermieden werden Die Arbeitsverd nnungen m ssen am Tag ihrer Verwendung angesetzt werden Nach Gebrauch sofort wieder bei 2 8 C lagern Lagerbedingungen die von den oben genannten Bedingungen abweichen m ssen vom Benutzer verifiziert werden Probenvorbereitung F r paraffineingebettete Gewebeschnitte ist das empfohlene Fixativ 10 neutral gepuffertes Formalin Warnhinweise und Sicherheitsma nahmen Dieses Reagenz wurde aus Zellkultur
41. v vssnit skal indbefatte morfologisk analyse og evaluering af passende kontroller Bibliografi Generelt 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P 2 Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia NCL HHV8 LNA Page 42 3 Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 4 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 5 Hong A Davies S and Lee S Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Rettelser Til Tidligere Udgave Ingen rettelser Udgivelsesdato 18 Juni 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 43 Metodik for immunohistokemi ved anvendelse af Novocastra antistoffer p paraffinindst bte v v vha antigen genvindingsteknik ved h j temperatur A N dvendige reagenser som ikke e
42. 1 0 8 0 g l Consultare l etichetta del flacone per la concentrazione proteica totale specifica del lotto Concentrazione Anticorpale Superiore o uguale a 31 5 mg l come determinato mediante test ELISA Consultare l etichetta del flacone per la concentrazione di lg specifica del lotto Raccomandazioni Per L uso Immunoistochimica vedere D Metodologia sulle sezioni in paraffina Diluizione raccomandata 1 25 1 50 per 60 minuti a 25 C Si raccomanda lo smascheramento antigenico ad alta temperatura in tampone citrato 0 01 M pH 6 0 Queste raccomandazioni costituiscono delle semplici linee guida spetta al singolo utente stabilire la diluizione di lavoro ottimale Conservazione E Stabilit Conservare l anticorpo nella confezione ancora integra a 2 8 C In queste condizioni il prodotto non subisce perdite significative di prestazione fino alla data di scadenza indicata sull etichetta del flacone Non usare dopo la data di scadenza indicata sull etichetta del flacone L anticorpo ricostituito rimane stabile per almeno due mesi se conservato a 2 8 C Per la conservazione a lungo termine si raccomanda di congelare aliquote dell anticorpo a 20 C non si raccomanda l uso di congelatori frost free cio senza brina Evitare di congelare e scongelare ripetutamente Preparare le diluizioni di lavoro il giorno stesso dell utilizzazione Immediatamente dopo l uso raffreddare di nuovo a 2 8 C Condizioni di conservazione diverse da quell
43. Dehydrate clear and mount sections E Amendments to Previous Issue Amendments have been made to layout only No text has been altered from the previous issue F Date of Issue 4 February 2008 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 5 Novocastra Anticorps Monoclonal Lyophilis de Souris Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen R f rence du Produit NCL HHV8 LNA Utilisation Pr vue Diagnostic in vitro Le NCL HHV8 LNA est destin l identification qualitative par microscopie optique de la mol cules Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen sur des coupes en paraffine L interpr tation clinique de tout marquage ou absence de marquage doit tre compl t e par des tudes morphologiques utilisant des contr les appropri s et doit tre valu e par un pathologiste qualifi la lumi re des ant c dents cliniques du patient et d autres analyses diagnostiques Principe de la Proc dure Les techniques de marquage immunohistochimique IHC permettent la visualisation des antigenes via l application s quentielle d un anticorps sp cifique sur un antig ne anticorps primaire d un anticorps secondaire sur l anticorps primaire et d un complexe enzymatique comportant un substrat chromog ne avec des tapes de lavage intercal es L activation enzymatique du chromog ne se traduit par la pr sence d un produit de r action visible au niveau du site de l antig ne Le sp cimen peut ensuite faire l objet d u
44. EDTA 0 65 mM Soluci n recuperadora Tween 20 al 0 0005 pH 9 0 Disolver 14 4 g de Tris c digo BDH de producto 271197K y 1 44 g de EDTA c digo SIGMA de producto E 5134 en 0 55 L de agua destilada Ajustar el pH a 9 con HCI 1 M y a adir 0 3 ml de Tween 20 c digo SIGMA de producto P 1379 Completar hasta 0 6 L con agua destilada Se trata de un concentrado 10x que debe diluirse con agua destilada seg n necesidad por ejemplo 0 15 L diluido con 1 35 L de agua destilada D Metodolog a Antes de utilizar esta metodolog a los usuarios deben seguir una formaci n en t cnicas de inmunohistocitoqu mica Los clientes deben determinar las diluciones ptimas para los anticuerpos Salvo si se indica especialmente todos los pasos se efect an bajo temperatura ambiente 25 C 1 Cortar y montar las secciones sobre portaobjetos tratados con un adhesivo adecuado para tejidos 2 Eliminar la parafina de las secciones con xileno o con sustitutos del xileno 3 Rehidratar mediante alcoholes graduados 4 Neutralizar la peroxidasa end gena utilizando per xido de hidr geno metanol al 0 5 en v v durante 10 minutos 5 Lavar los portaobjetos con agua corriente del grifo Pretratar las secciones como se describe a continuaci n 6 Calentar en una olla a presi n 1 5 L de la soluci n recuperadora recomendada ver Recomendaciones de Uso hasta la ebullici n Cubrir pero no sujetar la tapa Colocar los portaobjetos en bastidores met licos d
45. For at differentiere mellem endogen enzymaktivitet eller uspecifik enzymbinding og specifik immunreaktivitet kan yderligere patientvaev eventuelt farves udelukkende med henholdsvis substratkromogen eller enzymkomplekser avidin biotin streptavidin maerket polymer og substratkromogen Hvis der optr der specifik farvning i den negative v vskontrol skal resultaterne af patientproverne kasseres Negativ Reagenskontrol Anvend en uspecifik negativ reagenskontrol i stedet for det prim re antistof p et v vssnit af hver patientprove for at vurdere uspecifik farvning og muligg re bedre fortolkning af specifik farvning p antigenstedet Patientvav Eksaminer patientprover farvet med NCL HHV8 LNA sidst Intensiteten af positiv farvning b r vurderes i sammenh ng med eventuel uspecifik baggrundsfarvning af den negative reagenskontrol Som med alle immunhistokemiske tests betyder et negativt resultat at antigenet ikke blev p vist Ikke at antigenet var frav rende i de analyserede celler eller det analyserede v v Om n dvendigt anvendes et panel af antistoffer til identifikation af falske negative reaktioner Forventede Resultater Normalt v v Klon 13B10 frembragte ingen farvning i en r kke forskellige unders gte normale v v n 28 Tumorv v Klon 13B10 p viste det humane herpesvirus type 8 latente kerneantigen 1 i kerner fra 7 7 Kaposis sarkomer Der observeredes ingen farvning i en r kke forskellige andre unders gte tumorer n 65 NCL
46. HHV8 LNA anbefales anvendt til p visning af det latente kerneantigen LNA fra human herpesvirus 8 i Kaposis sarkom Generelle Begr nsninger Immunhistokemi er en diagnostisk proces best ende af mange trin der omfatter specialiseret uddannelse i valg af passende reagenser v vsselektion fiksering og behandling samt fremstilling af IHC objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne V vsfarvning er afh ngig af h ndteringen og behandlingen af v vet inden farvning Forkert fiksering frysning opt ning vask t rring opvarmning sektionering eller kontaminering med andet v v eller andre v sker kan frembringe artefakter indfangning af antistof eller falske negative resultater Inkonsistente resultater kan skyldes variationer i fikserings og indst bningsmetoder eller irregulariteter indeholdt i v vet For kraftig eller ukomplet kontrastfarvning kan g re korrekt fortolkning af resultaterne vanskelig Klinisk fortolkning af farvning eller mangel derp skal suppleres med morfologiske unders gelser under anvendelse af passende kontroller og b r evalueres i sammenh ng med patientens kliniske historie og andre diagnostiske tests af en kvalificeret patolog Antistoffer fra Leica Biosystems Newcastle Ltd er som angivet beregnet til anvendelse p enten frosne eller paraffinindst bte v vssnit med specifikke krav til fiksering Der kan forekomme uventet antigenekspression navnlig i neoplasmer Den kliniske fortolkning af alle farvede
47. Objekttr ger mit Wasser absp len 17 Mit H matoxylin gegenf rben 18 Die Schnitte dehydrieren s ubern und aufbringen E nderungen zur vorhergehenden Ausgabe nderungen wurden nur am Layout vorgenommen Der Text der vorherigen Ausgabe wurde nicht ge ndert F Ausgabedatum 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 20 Novocastra Anticuerpos Monoclonal Liofilizado de Rat n Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen C digo De Producto NCL HHV8 LNA Indicaciones De Uso Para uso diagn stico in vitro NCL HHV8 LNA est indicado para la identificaci n cualitativa en secciones de parafina mediante microscop a ptica de mol culas de Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen La interpretaci n cl nica de cualquier tinci n o de su ausencia debe complementarse con estudios morfol gicos con el uso de los controles adecuados y un anatomopat logo cualificado debe evaluarla en el contexto del historial cl nico del paciente y de otras pruebas diagn sticas Principio Del Procedimiento Las t cnicas de tinci n inmunohistocitoqu mica IHQ permiten la visualizaci n de ant genos mediante la aplicaci n secuencial de un anticuerpo espec fico dirigido contra el ant geno anticuerpo primario un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario y un complejo enzim tico con un sustrato cromog nico con pasos de lavado intercalados La activaci n enzim tica del crom geno produc
48. Pathology 1980 73 626 NCL HHV8 LNA Page 3 5 Hong A Davies S and Lee 5 Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Amendments to Previous Issue Not applicable Date of Issue 18 June 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 4 Immunohistochemistry methodology for using Novocastra antibodies on paraffin embedded tissue utilizing the high temperature antigen retrieval technique with ABC technique A Reagents required but not supplied 1 Standard solvents used in immunohistochemistry 0 5 v v hydrogen peroxide 50 mM Tris buffered saline TBS pH 7 6 Antigen retrieval solution s see Recommendations on Use Antibody diluent optimally diluted normal serum Normal sera from the species in which the secondary antibody is raised Secondary biotinylated antibody prepare as recommended by manufacturer Avidin Biotin Complex Horseradish peroxidase ABC HRP prepare as recommended by manufacturer 9 3 3 Diaminobenzidine tetrahydrochloride DAB prepare as recommended by manufacturer 10 Hematoxylin counterstain prepare as recommended by manufacturer 11 Mounting medium use as recommended by manufacturer NO gs Oc B Equipment required but not supplied 1 Incubator set to 25 C 2 Stainless Steel Pressure cooker Novocastra recommends that the gaskets are changed at regular intervals to mainta
49. a o desigual e mergulhar na panela de press o certificando se de que as l minas ficam completamente submersas na solu o de recupera o Engatar a tampa Uma vez que a panela de press o tenha alcan ado a temperatura e press o operacional marcar 1 minuto a n o ser que verifique recomenda o em contr rio nas Recomenda es sobre a Utiliza o Retirar a panela de press o da fonte de calor e colocar sob a corrente de gua fria de uma torneira com a tampa em posi o N O ABRIR A TAMPA ATE QUE OS INDICADORES MOSTREM QUE A PRESS O BAIXOU Abrir a tampa retirar as l minas e coloc las imediatamente sob a corrente de gua fria de uma torneira 7 Lavar as sec es em TBS durante 1 x 5 minutos agitando as levemente 8 Cobrir as sec es com soro normal dilu do durante 10 minutos 9 Incubar as sec es com anticorpo prim rio optimamente dilu do ver Recomenda es sobre a Utiliza o 10 Lavar em tamp o TBS durante 2 x 5 minutos agitando levemente 11 Incubar as sec es num anticorpo secund rio biotinilado apropriado 12 Lavar em tamp o TBS durante 2 x 5 minutos agitando levemente 13 Incubar as l minas em ABC HRP 14 Lavar em tamp o TBS durante 2 x 5 minutos agitando levemente 15 Incubar as l minas em DAB 16 Enxaguar as l minas em gua NCL HHV8 LNA Page 29 18 Contrastar com hematoxilina 18 Desidratar soltar e montar as secg es E Emendas da Edi o Anterior Apenas a dispos
50. agente in luogo dell anticorpo primario con una sezione di ogni campione biologico del paziente per valutare la colorazione aspecifica e per consentire una migliore interpretazione della colorazione specifica in corrispondenza del sito antigenico Tessuto Del Paziente Successivamente esaminare i campioni biologici del paziente colorati con NCL HHV8 LNA L intensit della colorazione positiva va analizzata nel contesto di qualsiasi colorazione aspecifica di fondo del controllo negativo del reagente Come per tutti gli altri test immunoistochimici un risultato negativo significa che l antigene non stato determinato ma non necessariamente che fosse assente dalle cellule o dal tessuto esaminato Se necessario usare un pannello di anticorpi per identificare reazioni falsamente negative Risultati Attesi Tessuti normali Il clone 13B10 non ha prodotto alcuna colorazione in una variet di tessuti normali esaminati n 28 Tessuti tumorali Il clone 13B10 ha messo in evidenza l antigene nucleare latente 1 dell Herpes virus umano di tipo 8 nel nucleo di 7 di 7 sarcomi di Kaposi Non stata osservata alcuna colorazione in una variet di altri tumori n 65 Si raccomanda l uso di NCL HHV8 LNA nell identificazione dell antigene nucleare latente LNA dell Herpes virus umano di tipo 8 nel sarcoma di Kaposi Limitazioni Generali L immunoistochimica un procedimento diagnostico a pi passi multistep che richiede un esperien
51. aide de la technique de restauration des antig nes haute temp rature A R actifs n cessaires mais non fournis 1 Solvants standard utilis s en immunohistochimie 0 5 v v Peroxyde d hydrog ne Tampon Tris TBS 50 mM pH 7 6 Solution s de restauration des antigenes voir Recommandations d utilisation Diluant anticorps s rum normal dilu de fa on optimale S rums normaux provenant de diverses esp ces chez lesquelles l anticorps secondaire est cultiv Anticorps secondaire biotinyl pr parer selon les recommandations du fabricant Complexe Avidine Biotine Peroxydase de raifort ABC HRP pr parer selon les recommandations du fabricant T trachlorhydrate de 3 3 diaminobenzidine DAB pr parer selon les recommandations du fabricant 0 H matoxyline colorant de contraste pr parer selon les recommandations du fabricant 1 Milieu de montage utiliser selon les recommandations du fabricant 2390900991 PB 9 N B quipements n cessaires mais non fournis Incubateur r gl 25 C 1 2 Autocuiseur en acier inoxydable Novocastra recommande de changer les joints intervalle r gulier pour conserver des conditions de d masquage optimales 3 quipements g n raux d un laboratoire d immunohistochimie Remarque relative la s curit Pour garantir une utilisation correcte et s re de votre autocuiseur LIRE S IL VOUS PLAIT LES INSTRUCTIONS FOURNIES PAR LE FABRICANT C Solution
52. berstand zubereitet Das Reagenz ist ein biologisches Produkt und sollte mit entsprechender Vorsicht gehandhabt werden Die Molarit t des Natriumazids in diesem Reagenz betr gt 15 mmol l Ein Sicherheitsdatenblatt MSDS f r Natriumazid ist auf Anfrage erh ltlich Die entsprechenden nationalen und lokalen Bestimmungen und Vorschriften zur Entsorgung potentiell giftiger Komponenten sind einzuhalten NCL HHV8 LNA Page 16 Vor und nach der Fixierung sind die Proben sowie alle Materialien die mit ihnen in Kontakt gekommen sind als potentiell infekti s zu behandeln und daher mit entsprechender Vorsicht zu entsorgen Reagenzien d rfen niemals mit dem Mund pipettiert werden und jeglicher Kontakt der Reagenzien und Proben mit Haut und Schleimh uten ist zu vermeiden Falls Reagenzien oder Proben mit empfindlichen Bereichen in Kontakt gekommen sind m ssen diese mit reichlich Wasser gesp lt werden rztlichen Rat einholen Die mikrobielle Verunreinigung von Reagenzien ist zu minimieren da ansonsten eine erh hte unspezifische F rbung auftreten kann Falls die spezifizierten Inkubationszeiten oder temperaturen nicht eingehalten werden kann es zu fehlerhaften Ergebnissen kommen Jegliche Abweichungen von den angegebenen Werten m ssen vom Benutzer verifiziert werden Qualit tskontrolle Unterschiede bei der Gewebebearbeitung und den technischen Verfahren im Labor des Benutzers k nnen zu signifikanten Schwankungen bei den Ergebnissen f hre
53. coupe de chaque sp cimen du patient afin d valuer le marquage non sp cifique et de permettre une meilleure interpr tation du marquage sp cifique au niveau du site antig nique Tissu du Patient Examiner les chantillons du patient marqu s au NCL HHV8 LNA en dernier lieu L intensit du marquage positif doit tre valu e la lumi re du bruit de fond du marquage non sp cifique du r actif de contr le n gatif Comme pour toutes les analyses immunohistochimiques un r sultat n gatif signifie que l antig ne n a pas t d tect mais ne signifie pas qu il est absent des cellules tissus test s Si n cessaire employer un panel d anticorps pour identifier les r actions faussement n gatives R sultats Attendus Tissus normaux Le clone 13B10 n a produit aucun marquage dans les divers tissus normaux valu s n 28 Tissus tumoraux Le clone 13B10 a d tect l antig ne nucl aire de latence 1 LNA 1 de l herp svirus humain de type 8 dans le noyau de 7 sarcomes de Kaposi sur 7 Aucun marquage n a t observ dans diverses autres tumeurs valu es n 65 L utilisation du NCL HHV8 LNA est recommand e pour la d tection de l antig ne nucl aire de latence LNA de l herp svirus humain de type 8 dans les sarcomes de Kaposi Limites G n rales L immunohistochimie est un processus diagnostique constitu de plusieurs tapes qui n cessite une formation sp cialis e relative au choix des r actifs appropri s
54. dido uma folha de dados de seguran a de materiais MSDS sobre a azida de s dio Consultar a legisla o aplic vel em rela o ao descarte de quaisquer componentes potencialmente t xicos NCL HHV8 LNA Page 26 As amostras antes e depois da sua fixag o bem como todos os materiais expostos s mesmas devem ser manipulados como se tivessem a capacidade de transmitir infec es e devem ser descartados com as devidas precau es N o pipetar nunca os reagentes com a boca e evitar o contacto entre a pele e membranas mucosas e os reagentes e amostras Caso os reagentes ou amostras entrem em contacto com reas sens veis lavar com grandes quantidades de gua Consultar um m dico Minimizar a contamina o microbiana dos reagentes para evitar a possibilidade do aumento da colora o n o espec fica Os per odos de incuba o ou temperaturas diferentes dos que foram especificados poder o dar azo a resultados errados Todas as altera es desse tipo devem ser validadas pelo utilizador Controlo Da Qualidade As diferen as entre os diferentes m todos e t cnicas de processamento de tecidos no laborat rio do utilizador podem causar uma grande variabilidade de resultados requerendo a realiza o frequente de controlos internos suplementares aos procedimentos que se seguem Os controlos devem ser amostras de aut psia biopsia cirurgia frescas fixadas em formol processadas e envolvidas em cera paraf nica logo que poss vel da mes
55. e 1983 14 767 4 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 5 Hong A Davies S and Lee 8 Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 w 18 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 38 Novocastra GE LOTO 1 0 5 v v 50 mM Tris TBS pH 7 6
56. e fiche toxicologique MSDS relative l azide de sodium est disponible sur demande Consulter les r glementations nationales r gionales ou locales en vigueur relatives l limination de tous les l ments potentiellement oxiques NCL HHV8 LNA Page 6 Les sp cimens avant et apr s fixation ainsi que toutes les matieres ayant t en contact avec eux doivent amp tre manipul s comme s ils taient susceptibles de transmettre une infection et tre limin s en respectant les pr cautions appropri es Ne jamais pipeter les r actifs avec la bouche et viter tout contact des r actifs et des sp cimens avec la peau et les membranes muqueuses Rincer avec de grandes quantit s d eau en cas de contact des r actifs ou des sp cimens avec des zones sensibles Consulter un m decin Minimiser la contamination microbienne des r actifs sinon un accroissement du marquage non sp cifique est susceptible de se produire Des dur es et des temp ratures d incubation diff rentes de celles qui ont t sp cifi es sont susceptibles de conduire des r sultats erron s Toutes les modifications doivent tre valid es par l utilisateur Contr le de Qualit Des diff rences de traitement des tissus et de proc dures techniques du laboratoire de l utilisateur sont susceptibles de conduire une variabilit significative des r sultats ce qui rend n cessaire la mise en uvre de contr les en interne en plus des proc dures suivantes
57. e polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 Hong A Davies S and Lee S Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 Emendas Da Edi o Anterior N o aplic vel Data De Emiss o 18 de Junho de 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 28 Metodologia de imunohistoquimica para utiliza o de anticorpos Novocastra em tecido envolvido em parafina por meio da t cnica de recupera o de ant genos a alta temperatura A Reagentes necess rios mas n o fornecidos 1 Solventes comuns utilizados em imunohistoqu mica 0 5 v v Per xido de hidrog nio Solu o salina tamp o Tris TBS 50 mM pH 7 6 Solu o solu es para a recupera o de ant geno ver Recomenda es sobre a Utiliza o Diluente do anticorpo soro normal dilu do a um n vel ptimo Soros normais da esp cie em que o anticorpo secund rio tenha sido desenvolvido Anticorpo secund rio biotinilado preparar co
58. e sopra specificate vanno verificate dall utente Preparazione Del Campione Biologico Il fissativo raccomandato la formalina tamponata neutra al 10 per sezioni tissutali incluse in paraffina Avvertenze E Precauzioni Questo reagente stato preparato dal supernatante di coltura cellulare Trattandosi di un prodotto biologico va maneggiato con cautela La molarit della sodio azide nel reagente corrisponde a 15 mM Su richiesta disponibile una scheda dei dati di sicurezza del materiale MSDS per la sodio azide Fare riferimento alla normativa federale statale o locale per lo smaltimento dei componenti potenzialmente tossici Prima e dopo la fissazione i campioni biologici e tutti i materiali ad essi esposti vanno trattati come potenzialmente infettanti e smaltiti con le appropriate precauzioni Non pipettare i reagenti con la bocca ed evitare il contatto dei reagenti e dei campioni biologici con la pelle e con le mucose Se i reagenti o i campioni biologici vengono a contatto con zone sensibili sciacquare abbondantemente le parti interessate Consultare il medico NCL HHV8 LNA Page 11 Ridurre al minimo la contaminazione microbica dei reagenti allo scopo di evitare un aumento di colorazione aspecifica Tempi o temperature d incubazione diversi da quelli specificati possono condurre a risultati non veritieri Tali variazioni devono essere convalidate dall utente Controllo Qualit Differenze nella processazione del tessuto e
59. e tinci n no colocar los portaobjetos muy juntos para evitar la tinci n desigual e introducirlos en la olla a presi n asegur ndose de que los portaobjetos quedan completamente sumergidos en la soluci n recuperadora Cerrar bien la tapa Cuando la olla a presi n alcanza la temperatura y presi n de funcionamiento cronometrar 1 minuto a menos que se indique diferente en Recomendaciones de Uso Sacar la olla a presi n de la fuente de calor y enfriarla bajo agua corriente con la tapa cerrada NO ABRIR LA TAPA HASTA QUE LOS INDICADORES MUESTREN QUE LA PRESI N YA SE HA LIBERADO Abrir la tapa extraer los portaobjetos y colocarlos inmediatamente en agua fresca del grifo T Lavar las secciones en TBS durante 1 x 5 minutos balanceando suavemente 8 Cubrir las secciones con suero normal diluido durante 10 minutos 9 Incubar las secciones con anticuerpo primario en diluci n ptima ver Recomendaciones de Uso 10 Lavar en tamp n TBS durante 2 x 5 minutos balanceando suavemente 11 Incubar las secciones en el anticuerpo secundario biotinilado apropiado 12 Lavar en tamp n TBS durante 2 x 5 minutos balanceando suavemente 13 Incubar los portaobjetos en ABC HRP 14 Lavar en tamp n TBS durante 2 x 5 minutos balanceando suavemente 15 Incubar los portaobjetos en DAB 16 Enjuagar los portaobjetos con agua NCL HHV8 LNA Page 24 17 Contratefiir con hematoxilina 18 Deshidratar aclarar y montar las secciones E Corr
60. e una reacci n visible en el lugar en que se encuentra el ant geno Luego se puede contrate ir la muestra y cubrirla con un cubreobjeto Los resultados se interpretan utilizando un microscopio ptico y son de ayuda en el diagn stico diferencial de los procesos fisiopatol gicos que pueden estar o no vinculados a un determinado ant geno Clon 13B10 Inmun geno Prote na recombinante procari tica correspondiente a una porci n del extremo carboxiterminal de la mol cula de ant geno latente nuclear 1 del HHV8 Especificidad Ant geno latente nuclear 1 LNA 1 del herpesvirus humano de tipo 8 Composici n Del Reactivo NCL HHV8 LNA es un sobrenadante de cultivo tisular liofilizado que contiene azida s dica 15 mM como conservante El usuario debe reconstituir el contenido del vial con el volumen correcto de agua destilada est ril que se indica en la etiqueta del vial Clase de lg IgG1 Concentraci n Total De Prote na 1 0 8 0 g L Consulte la etiqueta del vial para ver la concentraci n total de prote na espec fica del lote Concentraci n De Anticuerpo Igual o superior a 31 5 mg L seg n se ha determinado mediante ELISA Consulte en la etiqueta del vial la concentraci n de Ig espec fica del lote Recomendaciones De Uso Inmunohistocitoqu mica ver D Metodolog a con secciones de parafina Diluci n sugerida 1 25 1 50 durante 60 minutos a 25 C Se recomienda realizar recuperaci n de ant geno a alta temperat
61. ecciones a la Publicaci n Anterior S lo se han realizado cambios en la presentaci n No se ha modificado el texto con respecto a la publicaci n anterior F Fecha de publicaci n 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 25 Novocastra Anticorpo Monoclonal Lofilizado de Ratinho Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen C digo Do Produto NCL HHV8 LNA Utiliza o prevista Para utiliza o em diagn sticos in vitro NCL HHV8 LNA foi concebido para efectuar a identifica o qualitativa da mol culas de Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen por microscopia ptica em sec es parafinizadas A interpreta o cl nica de qualquer colora o ou da sua aus ncia deve ser complementada por estudos morfol gicos empregando os devidos controlos e deve ser avaliada por um patologista qualificado dentro do contexto do historial cl nico do doente e de outros testes de diagn stico Princ pio Do Procedimento As t cnicas de colora o imunohistoqu mica IHC permitem que se fa a a visualiza o de ant genos por meio da aplica o sequencial de um anticorpo espec fico do ant geno o anticorpo prim rio de um anticorpo secund rio ao anticorpo prim rio e de um complexo enzim tico com um substrato cromog nico e etapas de lavagem de permeio A activa o enzim tica do cromog nio resulta num produto de reac o vis vel no local do ant geno A amostra pode ent o ser contrastada e coberta com
62. ectriz e o utilizador deve determinar qual a diluig o ideal para o trabalho espec fico Armazenamento E Estabilidade Armazenar o anticorpo em embalagem n o aberta a 2 8 C Nessas condi es n o se regista uma redu o significativa no desempenho do produto at ao prazo de validade indicado no r tulo da ampola N o utilizar ap s o prazo de validade indicado no r tulo do recipiente O anticorpo reconstitu do permanece est vel durante pelo menos dois meses desde que seja armazenado a uma temperatura entre 2 8 C Em caso de armazenamento a longo prazo recomenda se que as al quotas do anticorpo reconstitu do sejam armazenadas congeladas a 20 C n o se recomenda a utilizag o de congeladores do tipo auto descongelador Deve evitar se congelar e descongelar repetidamente o produto Preparar as dilui es de trabalho no pr prio dia do seu emprego Retornar temperatura de 2 8 C imediatamente ap s a utiliza o As condi es de armazenamento que diferirem das que se encontram especificadas acima devem ser verificadas pelo utilizador Prepara o Das Amostras O fixador recomendado formol tamponado neutro a 10 para sec es de tecido envolvidas em parafina Avisos E Precau es Este reagente foi preparado a partir do sobrenadante de cultura celular Visto ser um produto biol gico deve ser manuseado com o devido cuidado A molaridade da azida de s dio neste reagente de 15 mM Encontra se dispon vel mediante pe
63. ekommenderas det att alikvoter av den sp dda antikroppen f rvaras frysta vid 20 C frostfria frys rekommenderas ej Upprepad nedfrysning och upptinande b r undvikas F rbered bruksl sningar samma dag som de skall anv ndas terg till 2 8 C direkt efter anv ndning F rvaringsf rh llanden som skiljer sig fr n de ovann mnda m ste kontrolleras av anv ndaren Preparation Av Prov Rekommenderat fixeringsmedel f r paraffininb ddade v vnadssnitt r 10 neutralbuffrat formalin Varningar Och F rsiktighets tg rder Reagenset har f rberetts fr n supernatanten av v vnadsodlingar Eftersom det r en biologisk produkt b r sk lig f rsiktighet iakttas vid hantering Natriumazidens molaritet i reagenset r 15 mM Varuinformationsblad MSDS f r natriumazid finns att f p beg ran F r kassering av potentiellt toxiska komponenter h nvisas till nationella eller lokala best mmelser F re och efter fixering b r prover och alla material som har varit utsatta f r dem hanteras som om det finns risk f r att de kan verf ra infektioner och kasseras med iakttagande av f rsiktighet Pipettera aldrig reagenser med munnen och se till att huden och slemhinnorna inte kommer i kontakt med reagens och prover Om reagens eller prover kommer i kontakt med k nsliga omr den tv tta med rikliga m ngder vatten R dg r med l kare Minimera mikrobisk kontaminering av reagens annars kan en kning av ospecifik f rgning ske Inkubat
64. en Liegt eine unspezifische F rbung vor hat diese gew hnlich ein diffuses Erscheinungsbild Eine sporadische F rbung des Bindegewebes kann ebenfalls in Schnitten von berm ig formalinfixierten Geweben beobachtet werden Zur Bewertung der F rbeergebnisse intakte Zellen verwenden Nekrotische oder degenerierte Zellen werden oft unspezifisch gef rbt Falsch positive Ergebnisse k nnen aufgrund einer nichtimmunologischen Bindung von Proteinen oder Substratreaktionsprodukten beobachtet werden In Abh ngigkeit von der Art der verwendeten Immunf rbung k nnen solche Ergebnisse auch durch endogene Enzyme wie Pseudoperoxidase Erythrozyten endogene Peroxidase Zytochrom C oder endogenes Biotin beispielsweise Leber Mamma Gehirn Niere hervorgerufen werden Um eine endogene Enzymaktivit t bzw eine unspezifische Enzymbindung von einer spezifischen Immunreaktivit t zu unterscheiden k nnen zus tzliche Patientengewebe ausschlie lich mit Substratchromogen bzw mit Enzymkomplexen Avidin Biotin Streptavidin markiertes Polymer plus Substratchromogen gef rbt werden Falls im negativen Kontrollgewebe eine spezifische F rbung auftritt sollten die Ergebnisse mit den Patientenproben als ung ltig betrachtet werden Negative Reagenzkontrolle Zur Beurteilung einer unspezifischen F rbung und zur besseren Bewertung einer spezifischen F rbung an der Antigenstelle ist mit einem Schnitt jedes Patientenpr parates anstelle des prim ren Antik rpers ei
65. ens rekommendationer 2330 0 NOOUoAS 9m B Utrustning som kr vs men ej tillhandah lls Inkubator inst lld p 25 C 1 2 Tryckkokare av rostfritt st l Novocastra rekommenderar att packningen byts ut med regelbundna intervaller f r att uppr tth lla optimala f rh llande f r demaskering 3 Allm n immunhistokemisk laboratorieutrustning Notering om s kerhet F r att f rs kra er om korrekt och riskfri anv ndning av er tryckkokare VAR GOD L S TILLVERKARENS INSTRUKTIONER C Antigen tervinningsl sningar se Rekommendationer vid anv ndning 0 01 M citrat tervinningsl sning pH 6 0 Tills tt 3 84 gram citronsyra vattenfri till 1 8L destillerat vatten Justera till pH 6 0 med 1 M NaOH Blanda ihop till 2 L med destillerat vatten 1mM EDTA tervinningsl sning pH 8 0 Tills tt 0 37 g EDTA SIGMA produktkod E 5134 till 1 L destillerat vatten Justera pH till 8 0 med 0 1 M NaOH 20mM Tris 0 65mM EDTA 0 0005 Tween 20 tervinningsl sning pH 9 0 L s upp 14 4 g Tris BDH produktkod 271197K och 1 44 g EDTA SIGMA produktkod E 5134 till 0 55 L destillerat vatten Justera pH till 9 med 1 M HCL och tills tt 0 3 ml Tween 20 SIGMA produktkod P 1379 Blanda ihop till 0 6 L med destillerat vatten Detta r ett 10 x koncentrat som b r sp das med destillerat vatten enligt behov t ex 0 15 L sp tt med 1 35 L destillerat vatten D Metodologi Innan denna metodologi till mpas m ste anv ndare utbildas i im
66. ent usually has a diffuse appearance Sporadic staining of connective tissue may also be observed in sections from excessively formalin fixed tissues Use intact cells for interpretation of staining results Necrotic or degenerated cells often stain non specifically False positive results may be seen due to non immunological binding of proteins or substrate reaction products They may also be caused by endogenous enzymes such as pseudoperoxidase erythrocytes endogenous peroxidase cytochrome C or endogenous biotin eg liver breast brain kidney depending on the type of immunostain used To differentiate endogenous enzyme activity or non specific binding of enzymes from specific immunoreactivity additional patient tissues may be stained exclusively with substrate chromogen or enzyme complexes avidin biotin streptavidin labeled polymer and substrate chromogen respectively If specific staining occurs in the negative tissue control results with the patient specimens should be considered invalid Negative Reagent Control Use a non specific negative reagent control in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate non specific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site Patient Tissue Examine patient specimens stained with NCL HHV8 LNA last Positive staining intensity should be assessed within the context of any non specific background staining of the negative reagent
67. er Vedr rende Anvendelse Immunhistokemi se D Metodologi p paraffinsnit Foresl et fortynding 1 25 1 50 ved 60 minutter ved 25 C Antigengenfinding ved h j temperatur ved anvendelse af 0 01 M citratgenfindingsopl sning pH 6 0 anbefales Disse retningslinier er vejledende og brugeren b r selv bestemme egne optimale brugsopl sninger Opbevaring Og Holdbarhed Opbevar det u bnede antistof ved 2 8 C Under disse betingelser er der ingen betydende tab af produktets ydeevne indtil udl bsdatoen angivet p h tteflaskens etikette M ikke anvendes efter udl bsdatoen angivet p h tteflaskens etikette Det rekonstituerede antistof er stabilt i mindst to m neder n r opbevaret ved 2 8 C Ved langtidsopbevaring anbefales det at udportionere det rekonstituerede antistof og opbevare portionerne nedfrosset ved 20 C frostfri frysere anbefales ikke Gentagen opt ning og frysning skal undg s Fremstil brugsopl sninger p dagen for anvendelsen S ttes tilbage til 2 8 C umiddelbart efter brug Andre opbevaringsbetingelser end de ovenfor angivne skal verificeres af brugeren Pr veklarg ring Det anbefalede fiksativ er 10 neutralbufferjusteret formalin til paraffinindst bte v vssnit Advarsler Og Forholdsregler Dette reagens er fremstillet ud fra supernatanten af en cellekultur Da det er et biologisk produkt skal der tages fornuftige sikkerhedsforanstaltninger ved dets h ndtering Molariteten af natriumazid i dette reagens e
68. ers zum prim ren Antik rper und eines Enzymkomplexes mit einem chromogenen Substrat jeweils getrennt durch dazwischen liegende Waschschritte Die enzymatische Aktivierung des Chromogens f hrt zu einem sichtbaren Reaktionsprodukt am Ort des Antigens Die Probe kann dann gegengef rbt und mit einem Deckglas versehen werden Die Ergebnisse werden mithilfe eines Lichtmikroskops interpretiert und unterst tzen die Differentialdiagnose pathophysiologischer Prozesse die mit einem bestimmten Antigen assoziiert sein k nnten Klon 13810 Immunogen Prokaryotisches rekombinantes Protein das einem Teil des C Terminus des latenten nuklearen Antigen 1 Molek ls von HHV8 entspricht Spezifit t Latentes nukleares Antigen 1 LNA 1 des humanen Herpesvirus Typ 8 Reagenzzusammensetzung NCL HHV8 LNA ist ein lyophilisierter Gewebekultur berstand der 15 mmol l Natriumazid als Konservierungsmittel enth lt Der Benutzer muss den Inhalt des Fl schchens mit dem korrekten Volumen sterilen destillierten Wassers entsprechend den Angaben auf dem Produktetikett rekonstituieren Ig Klasse IgG1 Gesamtproteinkonzentration 1 0 8 0 g l Siehe Angaben auf dem Produktetikett bez glich der chargenspezifischen Gesamtproteinkonzentration Antik rperkonzentration Gr er als oder gleich 31 5 mg l laut ELISA Bestimmung Hinsichtlich der chargenspezifischen Ig Konzentration siehe Angaben auf dem Produktetikett Gebrauchsempfehlungen Immunhistochemie
69. ertem Wasser geben Mit 0 1 mol l NaOH auf pH 8 0 titrieren 20 mmol l Tris 0 65 mmol l EDTA 0 0005 Tween 20 Retrieval L sung pH 9 0 14 4 g Tris BDH Produkt Nr 271197K und 1 44 g EDTA SIGMA Produkt Nr E 5134 zu 0 55 I destilliertem Wasser geben Den pH mit 1 mol I HCL auf 9 titrieren und 0 3 ml Tween 20 SIGMA Produkt Nr P 1379 hinzugeben Mit destilliertem Wasser auf 0 6 I auff llen Dies ist ein 10x Konzentrat das mit destilliertem Wasser nach Bedarf verd nnt werden sollte z B 0 15 I mit 1 35 I destilliertem Wasser verd nnt D Vorgehensweise Vor Anwendung dieser Methodik m ssen die Benutzer mit immunhistochemischen Techniken vertraut sein Kunden sollten die optimale Verd nnung f r die Antik rper bestimmen Sofern nicht anderweitig vorgegeben werden alle Schritte bei Raumtemperatur 25 C durchgef hrt 1 Das Pr parat schneiden und auf Objekttr ger aufbringen die mit einem geeigneten Gewebekleber beschichtet sind Schnitte mit Xylol oder Xylolersatzstoffen von Paraffin s ubern Mit abgestuft konzentriertem Alkohol rehydrieren Die endogene Peroxidase mit 0 5 volumetrisch Wasserstoffperoxid Methanol 10 Minuten lang neutralisieren Die Objekttr ger unter laufendem Leitungswasser absp len m ON Die Schnitte wie folgt vorbehandeln 6 1 51 der empfohlenen Retrieval L sung siehe Gebrauchsempfehlungen in einem Druckkochtopf zum Kochen bringen Deckel auflegen aber nicht verriegeln Die Objekttr ger in F
70. eua BIOSYSTEMS Novocastra Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Product Code NCL HHV8 LNA Leica Biosystems Newcastle Ltd Balliol Business Park West cae Benton Lane Newcastle Upon Tyne NE12 8EW United Kingdom C EN FR IT DE ES PT SV EL DA 44 191 215 4242 Instructions for Use Please read before using this product Mode d emploi lire avant d utiliser ce produit Istruzioni per L uso Si prega di leggere prima di usare il prodotto Gebrauchsanweisung Bitte vor der Verwendung dieses Produkts lesen Instrucciones de Uso Por favor leer antes de utilizar este producto Instrug es de Utiliza o Leia estas instrug es antes de utilizar este produto Instruktioner vid Anv ndning Var god l s innan ni anv nder produkten Brugsanvisning L s venligst f r produktet tages i brug Check the integrity of the packaging before use Verifier que le conditionnement est en bon tat avant I emploi Prima dell uso controllare l integrit della confezione Vor dem Gebrauch die Verpackung auf Unversehrtheit berpr fen Comprobar la integridad del envase antes de usarlo Verifique a integridade da embalagem antes de utilizar o produto Kontrollera att paketet r obrutet innan anv ndning
71. f rgningsintensitet b r utv rderas inom ramen f r all ospecifik bakgrundsf rgning av den negativa reagenskontrollen Som vid alla immunhistokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenet inte uppt cktes och inte att det inte f rekom i de analyserade cellerna v vnaderna Anv nd vid behov en antikroppspanel f r att identifiera falskt negativa reaktioner F rv ntade Resultat Normal v vnad Klon 13B10 gav ingen f rgning i en m ngd normala v vnader som utv rderades n 28 Tum rv vnader Klon 13B10 uppt ckte det humana herpesviruset typ 8 latenta nukle ra antigen 1 i k rnan hos 7 7 Kaposis sarkom Ingen f rgning observerades i en m ngd ytterligare utv rderade tum rer n 65 NCL HHV8 LNA rekommenderas f r detektionen av det latenta nukle ra antigenet LNA till humant herpesvirus 8 i Kaposis Allm nna Begr nsningar Immunhistokemi r en diagnostisk process i flera steg som kr ver specialiserad utbildning i urvalet av l mpliga reagens val av v vnad fixering och bearbetning f rberedelse av IHC objektglaset samt tolkning av f rgningsresultaten V vnadsf rgning p verkas av hantering och bearbetning av v vnaden f re f rgningen Felaktig fixering nedfrysning upptining tv ttning torkning uppv rmning snittning eller kontaminering av andra v vnader eller v tskor kan framst lla artefakter inf ngande av antikroppar eller falskt negativa resultat Mots gelsefulla resultat kan bero p variationer
72. ficeret patolog Procedureprincip Immunhistokemiske IHC farvningsteknikker muligg r visualisering af antigener via sekventiel tils tning af et specifikt antistof mod antigenet prim rt antistof et sekund rt antistof mod det prim re antistof og et enzym kompleksbundet til et kromogent substrat med indskudte vasketrin Den enzymatiske aktivering af kromogenet resulterer i et synligt reaktionsprodukt p antigenstedet Pr ven kan derefter kontrastfarves og d kkes med et d kglas Resultaterne fortolkes ved anvendelse af et lysmikroskop og medvirker til differentiel diagnose af patofysiologiske processer som muligvis kan v re associeret med et bestemt antigen Klon 13B10 Immunogen Prokaryot rekombinant protein svarende til en del af C terminalen af det latente kerneantigen 1 molekyle fra HHV8 Specificitet Humant herpesvirus type 8 latent kerneantigen 1 LNA 1 Reagenssammens tning NCL HHV8 LNA er en lyophiliseret v vskultursupernatant indeholdende 15 mM natriumazid som konserveringsmiddel Brugeren skal rekonstituere indholdet i h tteflasken med det korrekte volumen sterile destillerede vand som angivet p h tteflaskens etikette Ig klasse IgG1 Totalproteinkoncentration 1 0 8 0 g l Se etiketten pa h tteflasken for lotspecifik totalproteinkoncentration Antistofkoncentration St rre end eller lig med 31 5 mg l som bestemt ved ELISA Se etiketten pa h tteflasken for lotspecifik Ig koncentration Anbefaling
73. gen Clone 13B10 Immunogen Prokaryotic recombinant protein corresponding to a portion of the C terminus of the latent nuclear antigen 1 molecule of HHV8 Specificity Human herpesvirus type 8 latent nuclear antigen 1 LNA 1 Reagent Composition NCL HHV8 LNA is a lyophilized tissue culture supernatant containing 15 mM sodium azide as a preservative The user is required to reconstitute the contents of the vial with the correct volume of sterile distilled water as indicated on the vial label Ig Class IgG1 Total Protein Concentration 1 0 8 0 g L Refer to vial label for lot specific total protein concentration Antibody Concentration Greater than or equal to 31 5 mg L as determined by ELISA Refer to vial label for batch specific Ig concentration Recommendations On Use Immunohistochemistrv see D Methodology on paraffin sections Suggested dilution 1 25 1 50 for 60 minutes at 25 C High temperature antigen retrieval using 0 01 M citrate retrieval solution pH 6 0 is recommended This is provided as a guide and users should determine their own optimal working dilutions Storage and Stability Store unopened antibody at 2 8 C Under these conditions there is no significant loss in product performance up to the expiry date indicated on the vial label Do not use after expiration date indicated on the vial label The reconstituted antibody is stable for at least two months when stored at 2 8 C For long term storage it i
74. i o sofreu altera es O texto da edi o anterior n o foi emendado de forma nenhuma F Data de Emiss o 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 30 Novocastra Frystorkad Monoklonal Musantikropp Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Produktkod NCL HHVS LNA Avsedd Anv ndning F r in vitro diagnostisk anv ndning NCL HHV8 LNA r avsedd f r kvalitativ identifiering med ljusmikroskopi av Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen molekyler i paraffinsnitt Den kliniska tolkningen av all f rgning eller dess fr nvaro b r kompletteras med morfologiska unders kningar som anv nder korrekta kontroller och utv rderas av kvalificerad patolog inom ramen f r patientens kliniska anamnes och andra diagnostiska tester Metodens Princip Immunhistokemiska IHC f rgningstekniker till ter visualisering av antigener genom sekvenstill mpning av en specifik antikropp till antigenet prim r antikropp en sekund r antikropp till den prim ra antikroppen och ett enzymkomplex med ett kromogent substrat med inlagda tv ttsteg Den enzymatiska aktiveringen av kromogenet resulterar i en synlig reaktionsprodukt p antigenomr det Proverna kan d kontrastf rgas och f rses med t ckglas Resultaten tolkas med ljusmikroskop och bidrar till differentialdiagnosen av patofysiologiska processer som eventuellt kan associeras till ett s rskilt antigen Klon 13B10 Immunogen Prokaryotiskt rekombinant prote
75. in motsvarande en portion av C terminus fr n den latenta nukle ra antigen 1 molekylen av Specificitet Humant herpesvirus typ 8 latent nukle rt antigen 1 LNA 1 Reagensinneh ll NCL HHV8 LNA r en frystorkad supernatant fr n v vnadsodling som inneh ller 15 mM natriumazid som konserveringsmedel Anv ndaren m ste sp da flaskans inneh ll med den korrekta volymen sterilt destillerat vatten enligt anvisningarna p flaskans etikett Ig klass IgG1 Total Proteinkoncentration 1 0 8 0 g l Se flaskans etikett f r total specifik proteinkoncentration f r satsen Antikroppskoncentration St rre n eller lika med 31 5 mg l fastst llt genom ELISA Se flaskans etikett f r specifik Ig koncentration f r satsen Rekommendationer Vid Anvandning Immunhistokemi se D Metodologi p paraffinsnitt F reslagen spadning 1 25 1 50 i 60 minuter vid 25 C Antigen tervinning vid h g temperatur med 0 01 M citrat tervinningsl sning pH 6 0 rekommenderas Detta ar endast en riktlinje och anv ndare b r sj lva fastst lla den optimala brukssp dningen Forvaring Och Stabilitet F rvara o ppnad antikropp vid 2 8 C Vid dessa f rh llanden sker ingen betydelsefull nedg ng i produktens utf rande fram till utgangsdatumet pa flaskans etikett Anvand ej efter det utgangsdatum som anges pa flaskans etikett Den spadda antikroppen haller sig stabil i minst tv m nader om den f rvaras vid 2 8 C Vid l ngvarig f rvaring r
76. in optimum unmasking conditions 3 General immunohistochemistry laboratory equipment Safety Note To ensure the correct and safe use of your pressure cooker PLEASE READ THE MANUFACTURER S INSTRUCTIONS C Antigen retrieval solutions see Recommendations on Use 0 01 M citrate retrieval solution pH 6 0 Add 3 84 grams Citric acid anhydrous to 1 8 L distilled water Adjust to pH 6 0 using 1 M NaOH Make up to 2 L with distilled water 1 mM EDTA retrieval solution pH 8 0 Add 0 37 g EDTA SIGMA product code E 5134 to 1 L of distilled water Adjust pH to 8 0 using 0 1 M NaOH 20 mM Tris 0 65 mM EDTA 0 0005 Tween 20 retrieval solution pH 9 0 Dissolve 14 4 g Tris BDH product code 271197K and 1 44 g EDTA SIGMA product code E 5134 in 0 55 L distilled water Adjust pH to 9 with 1 M and add 0 3 mL Tween 20 SIGMA product code P 1379 Make up to 0 6 L with distilled water This is a 10x concentrate which should be diluted with distilled water as required eg 0 15 L diluted with 1 35 L distilled water D Methodology Prior to undertaking this methodology users must be trained in immunohistochemical techniques Customers should determine optimal dilutions for antibodies Unless indicated all steps are performed at room temperature 25 C 1 Cutand mount sections on slides coated with a suitable tissue adhesive 2 De paraffinize sections in xylene or xylene substitutes 3 Re hydrate through graded alcohols 4 Neutralize
77. ionstider eller temperaturer som skiljer sig fr n dem som specificeras kan ge felaktiga resultat Alla s dana f r ndringar m ste kontrolleras av anv ndaren NCL HHV8 LNA Page 31 Kvalitetskontroll Skillnader i v vnadsbehandling och tekniska metoder i anv ndarens laboratorium kan ge stor variation i resultaten vilket kan g ra det n dv ndigt att genomf ra regelbundna interna kontroller ut ver f ljande metoder Kontroller b r vara f rska obduktions biopsi kirurgiprover som snarast m jligt formalinfixeras bearbetas och paraffininb ddas p samma s tt som patientprover Positiv V vnadskontroll Anv nds f r att ange korrekt f rberedda v vnader och r tt f rgningstekniker En positiv v vnadskontroll b r ing i varje upps ttning av testf rh llanden vid varje f rgningsk rning En v vnad med svag positiv f rgning r mer l mplig f r optimal kvalitetskontroll och f r att uppt cka l ga niv er av reagensdegradering n en v vnad med stark positiv f rgning Kaposis sarkom rekommenderas som positiv kontrollv vnad Om den positiva v vnadskontrollen inte uppvisar positiv f rgning b r resultat med testproverna anses vara ogiltiga Negativ V vnadskontroll B r unders kas efter den positiva v vnadskontrollen f r att fastst lla specificiteten f r m rkningen av m lantigenet med den prim ra antikroppen Skelettmuskel rekommenderades som negativ kontrollv vnad Alternativt ger ofta en m ngd olika cell
78. ivalents de xyl ne Rehydrater par l interm diaire d alcools titr s Neutraliser la peroxydase endog ne l aide d une solution peroxyde d hydrogene methanol 0 5 v v pendant 10 minutes Laver les lames l eau du robinet Pr traiter les coupes comme suit 6 Chauffer 1 5 de la solution de restauration recommand e voir Recommandations d utilisation jusqu bullition dans un autocuiseur Couvrir sans verrouiller le couvercle Placer les lames sur des portoirs de marquage m talliques ne pas placer les lames trop pr s les unes des autres afin d viter l apparition d un marquage irr gulier et introduire l ensemble dans l autocuiseur en s assurant que les lames soient compl tement immerg es dans la solution de restauration Verrouiller le couvercle Quand l autocuiseur atteint sa temp rature et sa pression de fonctionnement compter 1 minute sauf mention contraire dans Recommandations d utilisation loigner l autocuiseur de la source de chaleur et le passer sous l eau froide le couvercle restant en place NE PAS OUVRIR LE COUVERCLE JUSQU CE QUE LES INDICATEURS SIGNALENT QUE LA PRESSION A T VACU E Ouvrir le couvercle retirer les lames et les placer imm diatement dans de l eau du robinet froide 7 Laver les coupes dans du tampon TBS pendant 5 minutes sous agitation l g re 8 Couvrir les coupes avec du s rum normal dilu pendant 10 minutes 9 Incuber les coupes avec l anticorps primaire dilu de faco
79. l ant geno Tejido Del Paciente Examine las muestras del paciente o pacientes te idas con NCL HHV8 LNA al final La intensidad de la tinci n positiva debe valorarse en el contexto de cualquier tinci n de fondo no espec fica del control de reactivo negativo Como con cualquier prueba inmunohistocitoqu mica un resultado negativo significa que no se ha detectado ant geno y no que el ant geno est ausente en las c lulas o tejido probados Si es necesario use un panel de anticuerpos para identificar falsas reacciones negativas Resultados esperados Tejidos normales El clon 13B10 no produjo tinci n alguna en una variedad de tejidos normales evaluados n 28 Tejidos tumorales El clon 13B10 detect el ant geno latente nuclear 1 del herpesvirus humano de tipo 8 en el n cleo de 7 de 7 sarcomas de Kaposi No se observ tinci n en una variedad de otros tumores evaluados n 65 NCL HHV8 LNA est recomendado para detectar el ant geno latente nuclear LNA del herpesvirus 8 humano en el sarcoma de Kapo Limitaciones Generales La inmunohistocitoqu mica es un proceso de diagn stico en varias fases que abarca la formaci n especializada en la selecci n de los reactivos apropiados la selecci n fijaci n y procesamiento de tejidos la preparaci n del portaobjeto para IHQ y la interpretaci n de los resultados de la tinci n La tinci n de los tejidos depende de la manipulaci n y el procesamiento del tejido previos a
80. ma maneira que a s amostra s do s doente s Controlo De Tecido Positivo Usado para assinalar os tecidos correctamente preparados e as t cnicas de colora o indicadas Cada conjunto de condi es de testes em cada processo de colora o deve incluir um controlo de tecido positivo Os tecidos com uma colora o positiva fraca s o mais indicados do que os t m uma colora o positiva forte para proporcionarem um controlo de qualidade ptimo bem como para detectar n veis reduzidos de degrada o dos reagentes O tecido de controlo positivo recomendado o sarcoma de Kaposi Se o controlo de tecido positivo n o demonstrar uma colora o positiva os resultados obtidos com as amostras de testes devem ser considerados inv lidos Controlo De Tecido Negativo Este deve ser examinado depois do controlo de tecido positivo para verificar a especificidade da marca o do ant geno objectivado pelo anticorpo prim rio O controlo de tecido negativo recomendado o m sculo esquel tico Alternativamente a variedade de diferentes tipos de c lulas presentes na maioria das sec es de tecidos oferece muitas vezes locais de controlo negativo mas isto deve ser verificado pelo utilizador A colora o n o espec fica caso ocorra tem geralmente um aspecto difuso A colora o espor dica do tecido conjuntivo pode amb m ter lugar em sec es de tecido excessivamente fixado em formol Devem utilizar se c lulas intactas para a inte
81. mente con formol puede observarse tambi n una tinci n espor dica del tejido conectivo Utilice c lulas intactas para la interpretaci n de los resultados de la tinci n A menudo las c lulas necr ticas o degeneradas quedan te idas de forma no espec fica Tambi n pueden observarse falsos positivos causados por la uni n no inmunol gica a prote nas o a productos de reacci n del sustrato Estos falsos positivos pueden estar causados tambi n por enzimas end genas tales como la pseudoperoxidasa eritrocitos la peroxidasa end gena citocromo C o la biotina end gena por ejemplo de h gado mama cerebro ri n en funci n del tipo de inmunotinci n utilizada Para diferenciar la actividad de las enzimas end genas o los enlaces no espec ficos de las enzimas de la inmunorreactividad espec fica pueden te irse otros tejidos del paciente exclusivamente con crom geno sustrato o con complejos enzim ticos avidina biotina estreptavidina pol meros marcados y crom geno sustrato respectivamente Si se produce una tinci n espec fica del control tisular negativo los resultados de las muestras de los pacientes deben considerarse no v lidos Control De Reactivo Negativo Utilice un control de reactivo negativo no espec fico en lugar del anticuerpo primario con un corte de cada muestra del paciente a fin de evaluar la tinci n no espec fica y obtener una mejor interpretaci n de la tinci n espec fica en el lugar en que se encuentra e
82. munhistokemiska tekniker Kunder b r fastst lla optimal sp dning f r antikroppar Alla steg utf rs vid rumstemperatur 25 C om inget annat anges 1 Sk r och montera snitten p objektglas kl dda med l mpligt v vnadsklister 2 Avparaffinera snitten i xylen eller xylen ers ttningspreparat 3 terhydratisera genom olika grader av sprit 4 Neutralisera endogent peroxidas med 0 5 v v v teperoxid metanol i 10 minuter 5 Tv tta objektglasen under rinnande kranvatten F rbehandla snitten enligt f ljande 6 V rm 1 5 L av den rekommenderade tervinningsl sningen se Rekommendationer vid anv ndning i en tryckkokare tills den kokar T ck men l s ej locket S tt objektglasen i f rgningshyllorna av metall s tt ej objektglasen t tt ihop eftersom det kan leda till oj mn f rgning och s nk ned i tryckkokaren se till att objektglasen r helt neds nkta i tervinningsl sning L s locket N r tryckkokaren uppn r driftstemperatur och tryck ta tiden under en minut om ej annat anges i Rekommendationer vid anv ndning Ta bort tryckkokaren fr n v rmek llan och l t rinna under kallt vatten med locket p PPNA EJ LOCKET F RR N INDIKATORERNA VISAR ATT TRYCKET HAR SL PPT ppna locket ta bort objektglasen och placera omedelbart i svalt kranvatten 7 Tv tta snitten i TBS i 1 x 5 minuter och gunga f rsiktigt 8 T ck snitten med normalt sp tt serum i 10 minuter 9 Inkubera snitten med optimalt sp dd prim r antik
83. n Antik rper Verd nnungsmittel optimal verd nntes Normalserum Normalseren der Spezies in denen der sekund re Antik rper gez chtet wird Sekund rer biotinylierter Antik rper gem den Empfehlungen des Herstellers ansetzen Avidin Biotin Komplex Meerrettich Peroxidase Avidin Biotin Complex Horseradish Peroxidase ABC HRP gem den Empfehlungen des Herstellers ansetzen 9 3 3 Diaminobenzidintetrahydrochlorid DAB gem f den Empfehlungen des Herstellers ansetzen 10 H matoxylin Gegenf rbung gem den Empfehlungen des Herstellers ansetzen 11 Aufbringungsmedium gem den Empfehlungen des Herstellers zu verwenden so N D OR wn B Zus tzlich ben tigte aber nicht mitgelieferte Ausr stung 1 Inkubator auf 25 C eingestellt 2 Druckkochtopf aus rostfreiem Stahl f r optimale Demaskierungsbedingungen empfiehlt Novocastra den regelm igen Dichtungswechsel 3 bliche immunhistochemische Laborausstattung Sicherheitshinweis F r den sicheren und korrekten Betrieb Ihres Druckkochtopfs BITTE DIE ANWEISUNGEN DES HERSTELLERS BEACHTEN C Antigen Retrieval L sungen siehe Gebrauchsempfehlungen 0 01 mol l Citrat Retrieval L sung pH 6 0 3 84 Gramm Zitronens ure wasserfrei zu 1 8 destilliertem Wasser geben Mit 1 mol l NaOH auf pH 6 0 titrieren und mit destilliertem Wasser auf 2 auff llen 1 mmol l EDTA Retrieval L sung pH 8 0 0 37 g EDTA SIGMA Produkt Nr E 5134 zu 1 destilli
84. n Daher ist es wichtig zus tzlich zu den folgenden Verfahren regelm ige laborinterne Kontrollen durchzuf hren Die Kontrollen sollten mit frischen Autopsie Biopsie chirurgischen Proben vorgenommen werden die so bald wie m glich und auf dieselbe Weise wie die Patientenprobe n in Formalin fixiert behandelt und in Paraffin eingebettet worden sind Positive Gewebekontrolle Zeigt korrekt vorbereitete Gewebe und korrekte F rbetechniken an In jedem F rbelauf sollte f r jeden Satz Testbedingungen eine positive Gewebekontrolle durchgef hrt werden Gewebe mit schwach positiver F rbung ist f r die optimale Qualit tskontrolle und den Nachweis kleiner Minderungen in der Reagenzleistung besser geeignet als ein Gewebe mit stark positiver F rbung F r die positive Gewebekontrolle wird Kaposi Sarkom Gewebe empfohlen Falls das positive Kontrollgewebe keine positive F rbung nachweisen kann sollten die mit den Testproben erzielten Ergebnisse als ung ltig betrachtet werden Negative Gewebekontrolle Die negative Gewebekontrolle sollte nach der positiven Gewebekontrolle erfolgen um die Spezifit t der Zielantigenmarkierung durch den prim ren Antik rper zu verifizieren F r die negative Gewebekontrolle wird Skelettmuskelgewebe empfohlen Alternativ bietet die Vielfalt unterschiedlicher Zelltypen die in den meisten Gewebeschnitten vorliegen h ufig Stellen f r eine negative Kontrolle Jedoch sollte dies vom Benutzer verifiziert werd
85. n optimale voir Recommandations d utilisation 10 Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois 5 minutes sous agitation l g re 11 Incuber les coupes dans l anticorps secondaire biotinyl appropri 12 Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois 5 minutes sous agitation l g re 13 Incuber les lames dans l ABC HRP 14 Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois 5 minutes sous agitation l g re 15 Incuber les lames dans le DAB Qm oU c NCL HHV8 LNA Page 9 16 Rincer les lames l eau 17 Proc der la coloration de contraste avec l h matoxyline 18 D shydrater ass cher et monter les coupes E Amendements apport s la version pr c dente Les amendements ont t apport s uniquement la mise en page Aucun texte de la version pr c dente n a t modifi F Date de publication 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 10 Novocastra Anticorpo Monoclonale Murino Liofilizzato Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen Codice Del Prodotto NCL HHV8 LNA Uso Previsto Per uso diagnostico in vitro NCL HHV8 LNA destinato all identificazione qualitativa in microscopia ottica della molecole Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen in sezioni incluse in paraffina L interpretazione clinica di ogni colorazione o della sua assenza va integrata da studi morfologici che utilizzino i controlli appropriati e deve essere valutata da un patologo qualificato nel contesto della storia
86. ne coloration de contraste et tre plac sous une lamelle Les r sultats sont interpr t s l aide d un microscope optique et participent au diagnostic diff rentiel des processus physiopathologiques susceptibles ou non d tre associ s un antig ne particulier Clone 13B10 Immunog ne Prot ine procaryote recombinante correspondant la partie C terminale de la mol cule d antig ne nucl aire de latence 1 du HHV8 Sp cificit Antigene nucl aire de latence 1 de l herp svirus humain de type 8 LNA 1 Composition du R actif Le NCL HHV8 LNA est un surnageant de culture tissulaire lyophilis contenant une solution d azide de sodium 15 mM comme conservateur L utilisateur doit reconstituer le contenu du flacon avec un volume correct d eau distill e st rile comme indiqu sur l tiquette du flacon Classe d lg IgG1 Concentration Totale en Prot ines 1 0 8 0 g l La concentration totale en prot ines sp cifique du lot figure sur l tiquette du flacon Concentration en Anticorps Sup rieure ou gale 31 5 mg l d termin e par la m thode ELISA La concentration totale en Ig sp cifique du lot figure sur l tiquette du flacon Recommandations d utilisation Immunohistochimie voir D M thodologie sur des coupes en paraffine Dilution pr conis e 1 25 1 50 pendant 60 minutes 25 C L emploi d une solution de citrate 0 01 M pH 6 0 pour la restauration des antig nes haute temp rature est
87. ne unspezifische negative Reagenzkontrolle zu verwenden Patientengewebe Die mit NCL HHV8 LNA gef rbten Patientenproben m ssen zuletzt untersucht werden Eine positive F rbeintensit t ist im Kontext einer unspezifischen Hintergrundf rbung der negativen Reagenzkontrolle zu bewerten Wie bei jedem immunhistochemischen Test bedeutet ein negatives Ergebnis dass das Antigen nicht nachgewiesen wurde Ein negatives Ergebnis bedeutet jedoch nicht notwendigerweise dass das Antigen in den getesteten Zellen im getesteten Gewebe nicht vorlag Bei Bedarf sollte zur Identifizierung falsch negativer Reaktionen eine Gruppe von Antik rpern verwendet werden Erwartete Ergebnisse Normale Gewebe Klon 13B10 wies bei einer Reihe untersuchter normaler Gewebe n 28 keine F rbung auf Tumorgewebe Klon 13B10 wies das latente nukleare Antigen 1 des humanen Herpesvirus Typ 8 im Nukleus von 7 7 Kaposi Sarkomen nach Bei einer Reihe zus tzlich untersuchter Tumoren n 65 wurde keine F rbung beobachtet NCL HHV8 LNA wird f r den Nachweis des latenten nuklearen Antigens LNA des humanen Herpesvirus 8 im Kaposi Sarkom empfohlen NCL HHV8 LNA Page 17 Allgemeine Beschr nkungen Die Immunhistochemie ist ein mehrstufiger diagnostischer Prozess der eine spezialisierte Ausbildung auf den folgenden Gebieten erfordert Auswahl der entsprechenden Reagenzien Gewebeauswahl fixierung und verarbeitung Vorbereitung des IHC Objekttr gers sowie Bewertung der F
88. nforme recomendado pelo fabricante Complexo de Avidina Biotina Peroxidase de r bano silvestre ABC HRP preparar conforme recomendado pelo fabricante 3 3 Tetracloridrato de diaminobenzidina DAB preparar conforme recomendado pelo fabricante 0 Contraste de hematoxilina preparar conforme recomendado pelo fabricante 1 Meio de montagem usar conforme recomendado pelo fabricante 230790 91 NM B Equipamento necess rio mas n o fornecido 1 Incubador regulado para 25 C 2 Panela de Press o de A o Inoxid vel a Novocastra recomenda a mudan a dos vedantes a intervalos regulares a fim de manter n veis ptimos de recupera o 3 Equipamento geral de laborat rio de imunohistoqu mica Nota de seguran a LEIA AS INSTRU ES DO FABRICANTE DA PANELA DE PRESS O para utilizar a mesma de forma correcta e segura C Solu es de recupera o de ant geno ver as Recomenda es sobre a Utiliza o Solu o de recupera o citrato a 0 01 M pH 6 0 Adicionar 3 84 gramas de cido c trico anidro a 1 8 I de gua destilada Ajustar at um pH de 6 0 usando 1 M NaOH Juntar gua destilada at obter um volume de 2l Solu o de recupera o EDTA a 1 mM pH 8 0 Adicionar 0 37 g de EDTA c digo de produto SIGMA E 5134 a 1 de gua destilada Ajustar at um pH de 8 0 usando 1 M NaOH Solu o de recupera o Tris 0 65 mM EDTA 0 0005 Tween 20 20 mM pH 9 0 Dissolver 14 4 g de Tris c dig
89. ntroles deben ser muestras frescas de autopsia biopsia o quir rgicas fijadas en formol procesadas e incluidas en parafina lo antes posible de manera id ntica a la utilizada para la muestra o muestras del paciente o pacientes Control Tisular Positivo Se utiliza para indicar la preparaci n correcta de los tejidos y las t cnicas de tinci n adecuadas Debe incluirse un control tisular positivo por cada conjunto de condiciones de ensayo en cada tinci n o serie de tinciones realizada Un tejido con una tinci n positiva d bil es m s adecuado que un tejido con una tinci n positiva intensa para lograr un control de calidad ptimo y para detectar niveles bajos de degradaci n del reactivo El tejido de control positivo recomendado es sarcoma de Kaposi Si el tejido de control positivo no muestra tinci n positiva los resultados de las muestras analizadas deben considerarse no v lidos Control Tisular Negativo Debe examinarse despu s del control de tejido positivo a fin de verificar la especificidad del marcado del ant geno diana por el anticuerpo primario El tejido de control negativo recomendado es m sculo esquel tico O bien la variedad de diferentes tipos de c lulas presentes en la mayor a de los cortes de tejido ofrece con frecuencia lugares de control negativo pero esto debe ser verificado por el usuario Si aparece una tinci n no espec fica sta tiene generalmente aspecto difuso En cortes de tejido fijados excesiva
90. nvendt korrekte farvningsteknikker Der b r inkluderes en positiv v vskontrol for hvert s t testbetingelser i hver farvekgrsel Svagt positivt farvet v v er mere egnet end kraftigt positivt farvet v v til optimal kvalitetskontrol og p visning af sm niveauer af reagensnedbrydning Anbefalet positivt kontrolvaev er Kaposis sarkom Hvis den positive vaevskontrol ikke udviser positiv farvning skal resultater af testproverne kasseres Negativ V vskontrol Skal unders ges efter den positive vaevskontrol for at sikre at det prim re antistof m rker m lantigenet specifikt Det anbefalede negative kontrolvaev er skeletmuskel Alternativt frembyder de mange forskellige celletyper der er til stede i de fleste vaevssnit ofte negative kontrolsteder men dette skal verificeres af brugeren Uspecifik farvning har hvis til stede ofte et diffust udseende Sporadisk farvning af bindev v kan ligeledes observeres i vaevssnit af v v der er fikseret for kraftigt i formalin Anvend intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne Nekrotiske eller degenererede celler farves ofte mere uspecifikt Der kan eventuelt ses falske positive resultater der skyldes non immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter Dette kan ligeledes skyldes endogene enzymer s som pseudoperoxidase erytrocytter endogen peroxidase cytochrom eller endogent biotin f eks lever bryst hjerne nyre afh ngigt af den anvendte type immunfarve
91. o de produto BDH 271197K e 1 44g de EDTA c digo de produto SIGMA E 5134 em 0 551 de gua destilada Ajustar at um pH de 9 usando 1 M HCI e adicionar 0 3 ml de Tween 20 c digo de produto SIGMA P 1379 Juntar gua destilada at obter 0 6 I Este produto concentrado 10x e deve ser dilu do com gua destilada conforme necess rio p ex 0 15 dilu do com 1 35 de gua destilada D Metodologia Antes de intentar esta metodologia o utilizador deve ter recebido a devida forma o em t cnicas de imunohistoquimica O cliente deve determinar quais as f rmulas de dilui o ptimas para os anticorpos A n o ser indica o em contr rio todas as etapas devem ser efectuadas temperatura ambiente 25 C 1 Cortar e montar sec es em l minas revestidas de um tecido adesivo apropriado 2 Desparafinizar as sec es em xileno ou substitutos de xileno 3 Reidratar atrav s de lcoois graduados 4 Neutralizar a peroxidase end gena por meio de per xido de hidrog nio metanol a 0 5 v v durante 10 minutos 5 Lavar as l minas em gua corrente de torneira Pr tratar as sec es da seguinte maneira 6 Aquecer 1 5 da solu o de recupera o recomendada ver Recomenda es sobre a Utiliza o numa panela de press o at ao ponto de ebuli o Cobrir com a tampa mas n o engatar Posicionar as l minas nos suportes de metal para colora o n o colocar as l minas pr ximas umas das outras para evitar uma color
92. r 15 mM Der kan efter anmodning leveres et datablad for materialesikkerhed MSDS for natriumazid Konsulter landsd kkende og lokale love og regler vedr rende bortskaffelse af alle potentielt toksiske komponenter Pr ver skal f r og efter fiksering lige som alle materialer eksponeret mod pr verne h ndteres som potentielt smittefarlige og bortskaffes under iagttagelse af passende forholdsregler Pipetter aldrig reagenser med munden og undg at reagenser og pr ver kommer i kontakt med huden eller slimhinder Hvis reagenser eller pr ver kommer i kontakt med f lsomme omr der skal der skylles efter med rigelige m ngder vand S g l ge Minimer mikrobiel kontaminering af reagenserne da der ellers kan forekomme get uspecifik farvning NCL HHV8 LNA Page 41 Inkubationstider eller temperaturer andre end de specificerede kan give fejlagtige resultater Alle s danne ndringer skal valideres af brugeren Kvalitetskontrol Forskelle i behandlingen af vaev og forskelle i tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan frembringe betydeligt varierende resultater og nadvendiggare regelm ssig udf relse af kontroller p stedet ud over nedenst ende procedurer Kontrollerne skal v re friske autopsier biopsier kirurgiske pr ver fikseret i formalin og behandlet og indstobt i paraffin s hurtigt som muligt p samme m de som patientprover Positiv V vskontrol Anvendes til p visning af at v vet er fremstillet korrekt og at der er a
93. r inkluderet 1 Standard opl sningsmidler der anvendes i immunohistokemi 0 5 v v Brintoverilte 50 mm Tris bufferet saltvand TBS pH 7 6 Antigen genvindingsopl sning er se Anbefalinger vedr anvendelse Antistofsolvens optimal opl sning af normalt serum Normale sera fra de arter i hvilke det sekund re antistof dyrkes Sekund rt biotinyleret antistof forberedes if lge producentens anbefalinger Avidin biotin kompleks peberrodsperoxidase ABC HRP forberedes if lge producentens anbefalinger 3 3 diaminobenzidin tetrahydrochlorid DAB forberedes if lge producentens anbefalinger Hematoxylin kontrastfarve forberedes if lge producentens anbefalinger Monteringsmedium anvendes if lge producentens anbefalinger 2330 0009918 BEN 2 B Nodvendigt udstyr som ikke er inkluderet 1 Inkubator sat til 25 C 2 Trykkoger af rustfrit st l Novocastra anbefaler at pakningerne udskiftes j vnligt for at sikre optimal rensningsprocedure 3 Almindeligt laboratorieudstyr til immunohistokemi Sikkerhedsbem rkning For at sikre korrekt og sikker anvendelse af jeres trykkoger L S VENLIGST FABRIKANTENS BRUGSANVISNING C Antigen genvindingsoplosninger se Anbefalinger vedr anvendelse 0 01 m citrat genvindingsoplesning pH 6 0 3 84 gram citronsyre vandfri tils ttes til 1 8 I destilleret vand pH justeres til 6 0 vha 1 m NaOH Der laves op til 2 I med destilleret vand 1 mm EDTA genvindingsoplesning
94. r smascheramento 0 01 M pH 6 0 Aggiungere 3 84 grammi di acido citrico anidro a 1 8 L di acqua distillata Aggiustare a pH 6 0 usando NaOH 1M Aggiustare il volume a 2 L con acqua distillata Soluzione EDTA per smascheramento 1 mM pH 8 0 Aggiungere 0 37 g di EDTA codice prodotto SIGMA E 5134 a 1 L di acqua distillata Aggiustare a pH 8 0 usando NaOH 0 1 M Soluzione per smascheramento Tris 20 mM EDTA 0 65 mM Tween 20 0 0005 pH 9 0 Aggiungere 14 4 g di Tris codice prodotto BDH 271197K e 1 44 g di EDTA codice prodotto SIGMA E 5134 a 0 55 L di acqua distillata Aggiustare a pH 9 con HCI 1M ed aggiungere 0 3 ml di Tween 20 codice prodotto SIGMA P 1379 Aggiustare il volume a 0 6 L con acqua distillata Si ottiene cos un concentrato 10x da diluire con acqua distillata a seconda dei casi es 0 15 L diluiti con 1 35 L di acqua distillata D Metodologia Prima di intraprendere questa metodologia l utente deve acquisire esperienza con le tecniche immunoistochimiche Gli utenti devono determinare le diluizioni ottimali degli anticorpi Se non indicato diversamente tutte le fasi vanno condotte a temperatura ambiente 25 C 1 Tagliare e montare le sezioni sui vetrini ricoperti con un adatto adesivo tissutale 2 Deparaffinare le sezioni mediante xilene o liquidi analoghi 3 Reidratare mediante passaggi in alcool a differenti gradazioni 4 Neutralizzare la perossidasi endogena usando perossido di idrogeno metanolo 0 5 v v per
95. ropp se Rekommendationer vid anv ndning 10 Tv tta snitten i TBS buffert i 2 x 5 minuter och gunga f rsiktigt 11 Inkubera snitten i l mplig biotinylerad sekund r antikropp 12 Tv tta snitten i TBS buffert i 2 x 5 minuter och gunga f rsiktigt 13 Inkubera objektglasen i ABC HRP 14 Tv tta snitten i TBS buffert i 2 x 5 minuter och gunga f rsiktigt 15 Inkubera objektglasen i DAB 16 Sk lj objektglasen i vatten 17 Kontrastf rga med hematoxylin 18 Dehydratisera r j och montera snitten NCL HHV8 LNA Page 34 R ttelser av tidigare utgivning ndringar har gjorts endast i layout Texten har inte f r ndrats sedan f rra utg van Utgivningsdatum 23rd June 2004 CEprotokoll HTAUT NCL HHV8 LNA Page 35 Novocastra Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen NCL HHVS LNA Tia in vitro To NCL HHV8 LNA Human Herpesvirus type 8 latent nuclear antigen H
96. ros tecidos ou fluidos podem produzir artefactos reten o de anticorpos ou resultados falso negativos Os resultados inconsistentes podem dever se a varia es nos m todos de fixa o e envolvimento ou a irregularidades inerentes ao tecido Uma contrasta o excessiva ou incompleta pode comprometer a correcta interpreta o dos resultados NCL HHV8 LNA Page 27 Ainterpreta o clinica de qualquer colora o ou da sua aus ncia deve ser complementada por estudos morfol gicos empregando os devidos controlos e deve ser avaliada por um patologista qualificado dentro do contexto do historial clinico do doente e de outros testes de diagn stico Os anticorpos da Leica Biosystems Newcastle Ltd destinam se a serem utilizados conforme indicado em secg es de tecido ou congeladas ou envolvidas em parafina com requisitos de fixa o especificos Pode ocorrer uma express o inesperada de antigeno especialmente em neoplasmas A interpreta o cl nica de qualquer sec o de tecido colorido dever incluir a an lise morfol gica e a avalia o de controlos apropriados Bibliografia Geral 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and thre
97. rpreta o dos resultados da colora o As c lulas necr ticas ou degeneradas causam muitas vezes uma colora o n o espec fica Podem verificar se resultados positivos falsos devido liga o n o imunol gica de prote nas ou de produtos da reac o do substrato Esses resultados podem tamb m ser causados por enzimas end genas tais como a pseudoperoxidase eritr citos a peroxidase end gena citocromo C ou a biotina end gena ex no f gado mama c rebro ou rim dependendo do tipo de imunocolora o utilizado Para diferenciar entre a actividade das enzimas end genas e as liga es n o espec ficas de enzimas de imunoreactividade espec fica podem colorir se tecidos adicionais dos doentes exclusivamente com substrato cromog nio ou com complexos de enzimas avidina biotina estreptavidina pol mero marcado e substrato cromog nio respectivamente Se ocorrer a colora o espec fica no controlo de ecido negativo os resultados dos testes feitos com as amostras do doente devem ser considerados inv lidos Controlo De Reagente Negativo Utilizar um controlo de reagente negativo n o espec fico em vez do anticorpo prim rio com uma sec o de cada amostra de doente para avaliar a colora o n o espec fica e permitir uma melhor interpreta o da colora o espec fica no local do ant geno Tecido Do Doente Examinar as amostras do doente coloridas com NCL HHV8 LNA em ltimo lugar A intensidade da colora o positi
98. s de restauration des antigenes voir Recommandations d utilisation Solution de restauration citrate 0 01 M pH 6 0 Ajouter 3 84 g d acide citrique anhydre 1 8 d eau distill e Ajuster le pH 6 0 l aide de NaOH 1 M Compl ter 2 0 avec de l eau distill e Solution de restauration EDTA 1 mM pH 8 0 Ajouter 0 37 g d EDTA SIGMA r f rence du produit E 5134 1 d eau distill e Ajuster le pH 8 0 l aide de NaOH 0 1 M Solution de restauration Tris 20 mM EDTA 0 65 mM Tween 20 0 0005 pH 9 0 Dissoudre 14 4 g de Tris BDH r f rence du produit 271197K et 1 44 g d EDTA SIGMA r f rence du produit E 5134 dans 0 55 d eau distill e Ajuster le pH 9 avec de L HCI 1 M et ajouter 0 3 ml de Tween 20 SIGMA r f rence du produit P 1379 Compl ter 0 6 I avec de l eau distill e La solution obtenue est une solution concentr e qui devra tre dilu e au besoin avec de l eau distill e diluer 0 15 I de la solution avec 1 35 d eau distill e par exemple D M thodologie Avant d utiliser cette m thodologie les utilisateurs doivent avoir t form s aux techniques immunohistochimiques Les utilisateurs doivent d terminer les dilutions optimales des anticorps Sauf mention contraire toutes les tapes sont r alis es temp rature ambiante 25 C Couper et monter les coupes sur des lames rev tues d un adh sif appropri aux tissus D paraffiner les coupes dans le xyl ne ou des qu
99. s must be validated by the user NCL HHV8 LNA Page 2 Quality Control Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may produce significant variability in results necessitating regular performance of in house controls in addition to the following procedures Controls should be fresh autopsy biopsy surgical specimens formalin fixed processed and paraffin wax embedded as soon as possible in the same manner as the patient sample s Positive Tissue Control Used to indicate correctly prepared tissues and proper staining techniques One positive tissue control should be included for each set of test conditions in each staining run Atissue with weak positive staining is more suitable than a tissue with strong positive staining for optimal quality control and to detect minor levels of reagent degradation Recommended positive control tissue is Kaposi s sarcoma If the positive tissue control fails to demonstrate positive staining results with the test specimens should be considered invalid Negative Tissue Control Should be examined after the positive tissue control to verify the specificity of the labeling of the target antigen by the primary antibody Recommended negative control tissue is skeletal muscle Alternatively the variety of different cell types present in most tissue sections frequently offers negative control sites but this should be verified by the user Non specific staining if pres
100. s recommended that aliquots of the reconstituted antibody are stored frozen at 20 C frost free freezers are not recommended Repeated freezing and thawing must be avoided Prepare working dilutions on the day of use Return to 2 8 C immediately after use Storage conditions other than those specified above must be verified by the user Specimen Preparation The recommended fixative is 10 neutral buffered formalin for paraffin embedded tissue sections Warnings and Precautions This reagent has been prepared from the supernatant of cell culture As it is a biological product reasonable care should be taken when handling it The molarity of sodium azide in this reagent is 15 mM A Material Safety Data Sheet MSDS is available upon request for sodium azide Consult federal state or local regulations for disposal of any potentially toxic components Specimens before and after fixation and all materials exposed to them should be handled as if capable of transmitting infection and disposed of with proper precautions Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens If reagents or specimens come in contact with sensitive areas wash with copious amounts of water Seek medical advice Minimize microbial contamination of reagents or an increase in non specific staining may occur Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results Any such change
101. sults The clinical interpretation of any staining or its absence should be complemented by morphological studies using proper controls and should be evaluated within the context of the patient s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist Antibodies from Leica Biosystems Newcastle Ltd are for use as indicated on either frozen or paraffin embedded sections with specific fixation requirements Unexpected antigen expression may occur especially in neoplasms The clinical interpretation of any stained tissue section must include morphological analysis and the evaluation of appropriate controls Bibliography General 1 National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P 2 Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia 3 Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 4 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical
102. t pr sent le marquage non sp cifique prend habituellement une apparence diffuse Un marquage sporadique du tissu conjonctif peut galement tre observ sur des coupes de tissus qui ont t fix es par un exc s de formol Utiliser des cellules intactes pour l interpr tation des r sultats du marquage Les cellules n crotiques ou d g n r es sont souvent marqu es de facon non sp cifique Des r sultats faussement positifs peuvent tre observ s en raison d une liaison non immunologique des prot ines ou des produits de r action du substrat Ils peuvent galement tre provoqu s par des enzymes endog nes comme la pseudoperoxydase rythrocytes la peroxydase endogene cytochrome C ou la biotine endog ne foie sein cerveau rein par exemple selon le type d immunomarquage utilis Pour diff rencier l activit des enzymes endog nes ou la liaison non sp cifique d enzymes de l immunor activit sp cifique des tissus suppl mentaires du patient peuvent tre marqu s exclusivement avec le substrat chromog ne ou par des complexes enzymatiques avidine biotine streptavidine polym re marqu et le substrat chromog ne respectivement Si un marquage sp cifique se produit dans le tissu de contr le n gatif les r sultats des sp cimens du patient doivent tre consid r s comme invalides R actif de Contr le N gatif Utiliser un r actif de contr le n gatif non sp cifique la place de l anticorps primaire avec une
103. transmitted by blood and tissue proposed guideline Villanova P A 1991 7 9 Order code M29 P 2 Battifora H Diagnostic uses of antibodies to keratins a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies Progress in Surgical Pathology 6 1 15 eds Fenoglio Preiser C Wolff CM Rilke F Field amp Wood Inc Philadelphia 3 Nadji M Morales AR Immunoperoxidase part I the techniques and pitfalls Laboratory Medicine 1983 14 767 4 Omata M Liew CT Ashcavai M Peters RL Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen a possible source of error in immunohistochemistry American Journal of Clinical Pathology 1980 73 626 5 Hong A Davies S and Lee 5 Immunohistochemical detection of the human herpes virus 8 HHV8 latent nuclear antigen 1 in Kaposi s sarcoma Pathology 2003 35 5 448 450 nderungen zur vorhergehenden Ausgabe Keine Ausgabedatum 18 Juni 2008 NCL HHV8 LNA CE UK NCL HHV8 LNA Page 18 Immunhistochemisches Vorgehen beim Einsatz von Novocastra Antik rpern f r Paraffinschnitte in der Hochtemperatur Antigen Retrieval Technik A Zus tzlich ben tigte aber nicht mitgelieferte Reagenzien 1 In der Immunhistochemie bliche Standardl sungsmittel 0 5 v v Wasserstoffperoxid 50 mmol l Tris gepufferte physiologische Kochsalzl sung Tris Buffered Saline TBS pH7 6 Antigen Retrieval L sung en siehe Gebrauchsempfehlunge
104. tura A Reagenti necessari ma non forniti 1 Solventi standard utilizzati in immunoistochimica 0 5 Perossido di idrogeno Tampone Tris salino TBS 50 mM a pH 7 6 Soluzione i per smascheramento antigenico vedere Raccomandazioni per l uso Diluente anticorpale siero normale diluito in maniera ottimale Sieri normali delle specie da cui si ottenuto l anticorpo secondario Anticorpo secondario biotinilato preparare secondo le raccomandazioni del produttore Complesso avidina biotina Perossidasi di rafano ABC POD preparare secondo le raccomandazioni del produttore 3 3 diaminobenzidina tetraidrocloruro DAB preparare secondo le raccomandazioni del produttore 0 Controcolorazione all ematossilina preparare secondo le raccomandazioni del produttore 1 Mezzi di montaggio usare secondo le raccomandazioni del produttore 2 20 a B Attrezzature necessarie ma non fornite 1 Setincubatore a 25 C 2 Pentola a pressione in acciaio inossidabile Novocastra raccomanda di sostituire le guarnizioni a regolari intervalli di tempo allo scopo di mantenere condizioni ottimali di smascheramento 3 Attrezzature di base del laboratorio di immunoistochimica Nota di sicurezza Per garantire un uso corretto e sicuro della pentola a pressione SI PREGA DI LEGGERE ATTANTAMENTE LE ISTRUZIONI FORNITE DAL PRODUTTORE C Soluzioni per smascheramento antigenico vedere Raccomandazioni per l uso Soluzione citrata pe
105. typer som finns i de flesta v vnadssnitt negativa kontrollomr den men detta b r kontrolleras av anv ndaren Ospecifik f rgning om det f rekommer har ofta ett diffust utseende Sporadisk f rgning av bindv v kan ocks observeras i snitt fr n verfl digt formalinfixerade v vnader Anv nd intakta celler f r tolkning av f rgningsresultat Nekrotiska eller degenererade celler f rgar ofta ospecifikt Falskt positiva resultat kan uppst p g a icke immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter De kan ocks orsakas av endogena enzymer som pseudoperoxidas erytrocyter endogent peroxidas cytokrom C eller endogent biotin t ex lever br st hj rna njure beroende p typ av immunf rgning som anv nds F r att skilja endogen enzymaktivitet eller ospecifik enzymbindning fr n specifik immunreaktivitet kan ytterligare patientv vnader f rgas exklusivt med respektive substratkromogen eller enzymkomplex avidin biotin streptavidin m rkt polymer och substrat kromogen Om specifik f rgning sker i den negativa v vnadskontrollen b r resultat med patientprover anses vara ogiltiga Negativ Reagenskontroll Anv nd en ospecifik negativ reagenskontroll ist llet f r den prim ra antikroppen med ett snitt fr n varje patientprov f r att utv rdera ospecifik f rgning och till ta b ttre tolkning av specifik f rgning p antigenomr det Patientv vnad Unders k patientprover f rgade med NCL HHV8 LNA sist Positiv
106. uero normal de las especies en las que se ha criado el anticuerpo secundario Anticuerpo secundario biotinilado preparar seg n la recomendaci n del fabricante Complejo Avidina Biotina peroxidasa de r bano ABC HRP preparar seg n la recomendaci n del fabricante 3 9 Tetraclorhidrato de diaminobenzidina DAB preparar seg n la recomendaci n del fabricante 0 Contratefiido de hematoxilina preparar seg n la recomendaci n del fabricante 1 Medio de montaje utilizar seg n la recomendaci n del fabricante Ados DT ON 2 90 Equipo necesario pero incluido 1 Incubadora graduada a 25 C 2 Olla a Presi n de Acero Inoxidable Novocastra recomienda que las juntas se cambien peri dicamente para mantener las ptimas condiciones de desenmascarado 3 Equipo general para laboratorio de inmunohistocitoquimica Nota de seguridad Para garantizar la utilizaci n correcta y segura de la olla a presi n POR FAVOR LEER LAS INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE C Soluciones para la recuperaci n de ant geno ver Recomendaciones de Uso Soluci n recuperadora de citrato 0 01 M pH 6 0 A adir 3 84 gramos de cido c trico anhidro a 1 8 L de agua destilada Ajustar el pH a 6 0 utilizando NaOH 1 M Completar hasta 2 L con agua destilada Soluci n recuperadora EDTA 1 mM pH 8 0 A adir 0 37 g de EDTA c digo SIGMA de producto E 5134 a 1 L de agua destilada Ajustar el pH a 8 0 utilizando NaOH 0 1M Tris 20mM
107. uma lamela Os resultados s o interpretados por meio de um microsc pio ptico e ajudam a formular o diagn stico diferencial dos processos fisiopatol gicos os quais podem ou n o estar associados a ant genos espec ficos Clone 13B10 Imunog nio Prote na de fus o recombinante procari tica correspondendo a uma parte do terminal C da mol cula do ant geno 1 nuclear latente do HHV8 Especificidade Ant geno 1 nuclear latente LNA 1 do herpesv rus humano tipo 8 Composig o Do Reagente NCL HHV8 LNA um sobrenadante liofilizado de uma cultura de tecido contendo 15 mM de azida de s dio como produto conservante O utilizador deve reconstituir o conte do da ampola com o volume correcto de gua destilada esterilizada conforme indicado no r tulo da ampola Classe De Ig IgG1 Concentrag o Total De Proteina 1 0 8 0 g L Consultar a etiqueta da ampola para determinar a concentrag o total de proteina do lote especifico Concentrag o De Anticorpo Maior que ou igual a 31 5 mg L conforme determinado por ELISA Consultar a etiqueta da ampola para determinar a concentra o de Ig do lote especifico Recomenda es Sobre A Utiliza o Imunohistoqu mica ver D Metodologia em sec es de parafina Dilui o sugerida 1 25 1 50 durante 60 minutos a 25 C Recomenda se a recuperac o de ant genos a alta temperatura utilizando 0 01 M de solu o de citrato de recuperag o pH 6 0 Esta recomendac o apenas uma dir
108. ura utilizando soluci n de recuperaci n citrato 0 01 M pH 6 0 sta es tan solo una pauta y cada usuario debe determinar sus propias diluciones de trabajo ptimas Almacenamiento Y Estabilidad Almacene el anticuerpo sin abrir a una temperatura de 2 8 C Bajo estas condiciones no hay p rdida significativa de la eficacia del producto hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial No lo utilice despu s de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial El anticuerpo reconstituido es estable durante al menos dos meses si se almacena a una temperatura de 2 8 C Para el almacenamiento de larga duraci n se recomienda almacenar al cuotas del anticuerpo reconstituido congeladas a 20 C no se recomiendan los congeladores libres de escarcha frost free Debe evitar congelar y descongelar repetidamente el producto Prepare las diluciones de trabajo el d a en que las vaya a utilizar Devu lvalo a 2 8 C inmediatamente despu s de su uso Cualesquiera condiciones de almacenamiento que no sean las arriba especificadas deben ser verificadas por el usuario Preparaci n De Las Muestras El fijador recomendado para secciones de tejido incluidos en parafina es formol tamponado neutro al 10 Advertencias Y Precauciones Este reactivo se ha preparado a partir del sobrenadante de un cultivo celular Como se trata de un producto de origen biol gico debe manipularse con precauci n La molaridad de la azida s dica en este reacti
109. va deve ser avaliada dentro do contexto de qualquer colora o n o espec fica de fundo do controlo de reagente negativo Tal como com qualquer teste imunohistoqu mico um resultado negativo significa que o ant geno n o foi detectado e n o que o ant geno se encontrava ausente das c lulas ou tecido analisados Se necess rio deve utilizar se um painel de anticorpos para identificar reac es falso negativas Resultados Previstos Tecidos normais O clone 13B10 n o produziu nenhuma colora o numa variedade de tecidos normais avaliados n 28 Tecidos tumorais O clone 13B10 detectou o ant geno 1 nuclear latente do herpesvirus tipo 8 humano no n cleo de 7 7 sarcomas de Kaposi N o se observou evid ncia de colora o numa s rie de tumores adicionais tamb m avaliados n 65 NCL HHV8 LNA recomendado para a detec o do ant geno nuclear latente LNA do herpesvirus 8 humano nos sarcomas de Kaposi Limita es Gerais A imunohistoquimica um processo diagn stico em m ltiplas etapas que consta de uma forma o especializada na selec o dos reagentes apropriados selec o fixa o e processamento de tecidos prepara o das l minas de IHQ e interpreta o dos resultados das colora es A colora o de tecidos depende do seu manuseamento e processamento antes da sua colora o A fixa o congela o descongela o lavagem secagem aquecimento ou corte incorrectos das amostras ou a sua contamina o com out
110. ve F Udgivelsesdato 23rd June 2004 CEprotocol HTAUT NCL HHV8 LNA Page 45 NCL HHV8 LNA Page 46 Leica Biosystems Newcastle Ltd Balliol Business Park West pal Benton Lane Newcastle Upon Tyne NE12 8EW United Kingdom d 44 191 215 4242 18 June 2008 Leica Biosystems Newcastle Ltd 95 8156 Rev A NCL HHV8 LNA
111. virkes de s nkes ned i trykkogeren og det kontrolleres at objektglassene er fuldst ndig neds nket i genvindingsoplosningen L get l ses N r trykkogeren n r driftstemperatur og tryk tages der tid i et minut medmindre andet er anfort i Anbefalinger vedr anvendelse Trykkogeren tages af varmen og holdes under koldt rindende vand med l get p LAGET M IKKE BNES FOR INDIKATORERNE VISER AT TRYKKET ER UDL ST L get bnes objektglassene tages ud og placeres straks i koldt vand fra hanen 7 Snittene vaskes i TBS i 1 x 5 minutter imens de vugges stille og roligt frem og tilbage 8 Snittene d kkes med fortyndet normalt serum i 10 minutter 9 Snittene inkuberes med optimalt fortyndet primaert antistof se Anbefalinger vedr anvendelse 10 Vaskes i TBS buffer i 2 x 5 minutter idet de vugges stille og roligt frem og tilbage 11 Snittene inkuberes i passende biotinyleret sekund rt antistof 12 Vaskes i TBS buffer i 2 x 5 minutter idet de vugges stille og roligt frem og tilbage 13 Objektglassene inkuberes i ABC HRP 14 Vaskes i TBS buffer i 2 x 5 minutter idet de vugges stille og roligt frem og tilbage 15 Objektglassene inkuberes i DAB NCL HHV8 LNA Page 44 16 Objektglassene skylles i vand 17 Kontrastfarves med h matoxylin 18 Snittene dehydreres renses og monteres E Rettelser til tidligere udgave Der er kun lavet ndringer i layouten Der er ingen ndringer i teksten i forhold til den tidligere udga
112. vo es 15 mM Si la solicita existe una hoja de informaci n sobre la seguridad del material MSDS azida s dica a su disposici n Consulte las normativas nacionales estatales provinciales o municipales acerca de c mo desechar cualquier componente potencialmente t xico NCL HHV8 LNA Page 21 Las muestras antes y despu s de ser fijadas asi como todos los materiales expuestos a ellas deben manipularse como susceptibles de transmitir una infecci n y se deben desechar tomando las precauciones adecuadas No pipetee nunca los reactivos con la boca y evite el contacto de la piel y de las membranas mucosas con los reactivos y las muestras Si los reactivos o las muestras entran en contacto con zonas delicadas lave stas con abundante agua Acuda inmediatamente al m dico Reduzca al m nimo la contaminaci n microbiana de los reactivos de lo contrario podr a producirse un aumento de la tinci n no espec fica Cualquier tiempo o temperatura de incubaci n que no sean los aqu especificados pueden conducir a resultados err neos Cualquier cambio de tal naturaleza debe ser validado por el usuario Control De Calidad Las diferencias en el procesamiento de los tejidos y en los procedimientos t cnicos del laboratorio del usuario pueden producir una variabilidad significativa en los resultados por ello es necesario que ste lleve a cabo regularmente los controles de su propio laboratorio adem s de los siguientes procedimientos Los co
113. za specifica nella selezione dei reagenti appropriati nella selezione fissazione e processazione dei tessuti nella preparazione di vetrini IHC e nell interpretazione dei risultati della colorazione La colorazione del tessuto dipende dalle modalit di manipolazione e di processazione del tessuto stesso adottate prima della colorazione La fissazione il congelamento lo scongelamento il lavaggio l asciugatura il riscaldamento o la sezione condotti in modo non corretto o la contaminazione con altri tessuti o liquidi possono produrre artefatti intrappolamento trapping anticorpale o risultati falsi negativi Risultati incompatibili possono essere dovuti a modifiche dei metodi di fissazione e di inclusione o ad irregolarit intrinseche al tessuto Una controcolorazione eccessiva o incompleta pu compromettere la corretta interpretazione dei risultati L interpretazione clinica di ogni colorazione o della sua assenza va integrata da studi morfologici che utilizzino i controlli appropriati e deve essere valutata da un patologo qualificato nel contesto della storia clinica del paziente e delle altre metodiche diagnostiche adoperate NCL HHV8 LNA Page 12 Gli anticorpi di Leica Biosystems Newcastle Ltd sono destinati all uso quando indicato su sezioni congelate o incluse in paraffina con specifici requisiti fissazione Un espressione antigenica inattesa pu manifestarsi in particolare nelle neoplasie L interpretazione clinica di

(type 8) (latent nuclear antigen)

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