(Polyplus-transfection) en Corning® HYPERFlask® Cell
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1. contr les n est plus n cessaire Si vous choisissez d utiliser un format de plaque diff rent pour les contr les veuillez modifier les volumes de r actifs en quivalence ml cm Lire enti rement le protocole avant de commencer la manipulation D p t des cellules CONSEIL Pour la manipulation des HYPERFIask se r f rer au mode d emploi correspondant REMARQUE Utilisez des cultures fraiches 5 20 passages avec 80 90 de confluence 1 Ensemencer 20 000 cellules cm dans 0 326 ml cm de milieu de croissance 6 13x1 o cellules ml dans les flacons HYPERFask Cat n 10010 et les plaques 24 puits Cat n 3524 voir le Tableau 1 Ces concentrations cellulaires doivent tre optimis es pour votre lign e Les cultures doivent tre 80 de confluence 24 heures apr s l ensemencement Tableau 1 Surface de Volume de milieu ml Concentration croissance cm2 cellulaire HYPERFIask 1720 flacon 560 ml flacon 34 4x107 flacon Plaque 24 puits 2 puits 0 650 ml puits 4 0x107 puits Conseil utile Nous recommandons la mise en place de contr le en plaque de culture de 24 puits ou similaires pour suivre l efficacit de transfection Les contr les doivent int grer des t moins n gatifs et positifs de transfection ainsi que des contr les sur la grande quantit de pr cipit pr par e pour la transfection en HYPERFask 2 Incuber une nuit 37 C incubateur humidifi 5 de CO Jour 2 Pr parati2. plaque par rotation pour bien m langer Volume final par puits plaque 24 puits Par HYPERFJask ml 0 650 560 ml cm 0 326 0 326 3 Incuber l HYPERFask et la plaque 24 puits 2 37 C incubateur humidifi 5 de CO pendant 48 heures 4 Utiliser les cellules transfect es selon les besoins
3. HYPERFask Cell Culture Vessel 1 1 Vider l HYPERFIask en versant d licatement tout le milieu dans une bouteille de stockage st rile ou une fiole Erlenmeyer st rile de 500ml Aspirer le milieu contenu dans les puits de la plaque de contr le 1 2 Retirer 86 2 ml du milieu conserv dans le flacon de stockage et en conserver 40ml dans un tube st rile de 50 ml 1 3 Lentement tout en m langeant ajouter 86 2 mI du complex jetPEI ADN dans le flacon de 500 ml contenant le milieu retir de l HYPERFIask 1 4 Verser d licatement le m lange de transfection dans l HYPERFIask CONSEIL PRATIQUE Si n cessaire utilisez le milieu conserv dans le tube de 50 ml pour compl ter le volume de milieu dans l HYPERFIask jusqu au niveau ad quat premier cran du pas de vis 1 5 Reboucher le flacon et tapotez doucement pour recueillir toutes les bulles d air dans le pi ge air 1 6 Retirer 0 650ml puit de milieu de l HYPERF ask et ajouter les dans trois puits de contr le de la plaque 24 puits Note Jusqu 3 puits t moins peuvent tre r alis s sans interf rer avec l efficacit de la transfection en HYPERFIask 2 Plaque 24 puits de contr le positif et n gatif 2 1 Pr lever 100 uL de milieu de tous les puits de contr le positif et n gatif 2 2 Lentement goutte goutte ajouter 100 uL du complex jetPEI ADN dans les puits de contr le positif et du milieu seul mock solution dans les puits de contr le n gatifs Agiter la
4. Protocole CLS AN 111 Protocole de transfection standard avec le jetPEI Polyplus transfection en Corning HYPERFJask Cell Culture Vessel CORNING Introduction Un des outils les plus utiles dans la recherche en biologie cellulaire est la transfection l introduction d ADN tranger dans une cellule eucaryote Dans de nombreux travaux de recherche aujourd hui la transfection de grandes quantit s de cellules est de plus en plus fr quente Le jetPEI de Polyplus Transfection est un r actif de transfection de haute efficacit faible toxicit polym re soluble dans l eau il peut tre utilis en pr sence de s rum dans le milieu de culture Ceci limine les tapes de remplacement du milieu avant et apr s la transfection cette caract ristique en fait la m thode id ale pour les transfections grande chelle en HYPERFIask Corning Le protocole a t optimis sur des cellules HeLa mais a t appliqu e avec succ s d autres types cellulaires notamment les cellules CHO Chinese hamster ovary Le protocole est con u comme un point de d part et peut tre optimis avec vos propres lign es cellulaires Jour 1 La proc dure ci dessous est adapt e l utilisation des HYPER Flask ainsi qu des plaques de culture 24 puits La plaque 24 puits sert de contr le pour suivre l efficacit de transfection standard et dans les conditions grande chelle Une fois le protocole optimis la multiplication des
5. on du complexe jetPEITM ADN REMARQUE Cette partie du protocole doit tre r alis e sous hotte en conditions st riles REMARQUE Ces tapes ont t modifi es par rapport au protocole standard du kit de transfection jetPEI Polyplus Part n 101 40N optimis pour 1 ug d ADN avec un ratio jetPEI N P de 5 1 Solution d ADN Solution A Solution A T moin n gatif T moin positif Par HYPERFask par puits plaque 24 par puits plaque 24 560 ml flacon puits 0 650 ml puits puits 0 650 ml puits ADN 0 5 ug cm 1ug 0 5 ug cm 860 ug 150 mM NaCl 50 ul qsp 50 ul qsp 43 1 ml Volume final 50 ul 50 ul 43 1 ml pr parer dans un tube pouvant contenir 2 fois le volume final 2 Solution B JetPEITM Solution B T moin n gatif T moin positif Par HYPERFJask par puits plaque 24 par puits plaque 24 560 ml flacon puits 0 650 ml puits puits 0 650 ml puits R actif JetPEl 2ul 2ul 1 72 ml 150 mM NaCl 48 ul 48 ul 41 4 ml Volume final 50 ul 50 ul 43 1 ml Optimis pour un ratio N P de 5 8 Rapidement tout en m langeant d licatement ajouter la solution jetPEI B la solution A d ADN bien m langer par vortex Note importante Ne pas ajouter dans l ordre inverse Volume final par puits plaque 24 puits Par HYPERFJask Complexe JetPEI DNA 100 ul 86 2 ml 4 Incuber temp rature ambiante pendant 30 min La solution peut appara tre turbide Transfection 1
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