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1. gt p o w x B a a aR z _ E d j p Es 6 7 8 9 10 o ae 3 s amp i 11 12 13 14 15 ne g S a N l zy OK B 16 7 18 L K NE ff i a Ps Mie fe a LE 73 ing z hai Pe Fi 19 20 21 22 Fig 11 Technique de coloration de la constriction secondaire du 9 Remarquer aussi la coloration d autres r gions h t rochromatiques bras long de l Y bras courts d acrocentriques etc soude Dans celle de Gagn et Laberge la solution de Giemsa 2 p 100 est faite dans une solution 0 1 p 100 de Na HPO 12 H 0 r gl e pH 11 6 par addition de soude Les lames sont color es dans cette solution pendant 5 minutes R sultats fig 11 Cette technique qui colore fortement la cons triction secondaire du chromosome 9 colore galement d autres r gions h t rochromatiques bras courts des acrocentriques r gion distale du bras long de l Y r gion centrom trique des chromosomes 1 5 7 10 17 et 19 d Coloration de certaines r gions h t rochromatiques par le DA DAPI Un grand nombre de fluorochromes ou d antibiotiques 33258 Hoechst Actinomycine D Chromomycine Olivomycine Netropsine Daunomycine Mithramycine suppos s avoir des affinit s particuli res pour certaines Techniques sur pr parations fix es 41 Fig 12 Coloration au DA DAPI Cellule masculine Dr B No l Centre d partemental de tr
2. LUCIANI J M MorazzAni M R STAHL A 1975 Identification of pachy tene bivalents in human male meiosis using G banding techniqu Chro mosoma Berl 52 275 Mac Grecor H Mizuno S 1976 In situ hybridization of nick transla ted 3H ribosomal DNA to chromosomes from Salamanders Chromo soma Berl 54 15 Moore K L BARR M L 1955 Smears from the oral mucosa in the detection of chromosomal sex Lancet i 57 MooRHEAD P S Nowe ct P C MELLMAN W J Battips D M HUNGERFORD D A 1960 Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood Exp Cell Res 20 613 PALMER C G 1970 5 bromodeoxyuridine induced constrictions in human chromosomes Canad J Genet Cytol 12 816 Bibliographie 83 PARDUE M L GALL J 1975 Nucleic acid hybridization to the DNA of cytological preparations In Methods in enzymology 10 pp 1 16 PEARSON P L BoBROoW M Vosa C G 1970 Technique for identifying Y chromosomes in human interphase nuclei Nature 226 78 PERRY P EVANS H L 1975 Cytological detection of mutagen exposure by sister chromatid exchange Nature 258 121 PERRY P WoLFF S 1974 New Giemsa method for the differential stai ning of sister chromatids Nature 251 156 PRIEUR M DUTRILLAUX B LEJEUNE J 1973 Planches descriptives des chromosomes humains Analyse en bandes R et nomenclature selon la conf rence de Paris
3. mm sm ms mm ms Observation microscopique 2 6 536 03 40 LL WEVA GANS AAA OR a wR Observation en lumi re ordinaire Observation en fluorescence 2 Microphotographie 3680 605 TE He MOR Oe RS 6 Nomenclature des chromosomes normaux et des principales aber rations mm mm Formules chromosomiques normales et pathologiques Classification chromosomique et nomenclature des bandes Nomenclature des remaniements de structure Bibliographie mn mm msn Index alphab tique 2 22 eee ss Fournisseurs mm am mn mm mt ms 70 72 72 72 73 75 75 78 79 65 87 Introduction La cytog n tique est pratiquement n e avec ce si cle Elle est encore consid r e comme une discipline jeune en raison sans doute des progr s r cemment accomplis qui en ont transform les m thodes et les applica tions Apr s qu on se soit longtemps content d analyser les tissus montrant spontan ment des cellules en mitose tel l pith lium s minif re un premier progr s a t r alis la culture cellulaire qui permet d obtenir un grand nom bre de figures mitotiques Le choc hypotonique d couvert en 1952 par Hsu devait tre une seconde tape d cisive puisqu il permet un gonflement cellulaire et donc une meilleure r partition des chromosomes Il fallut toutefois attendre 1
4. Lorsque laur ole de croissance est suffisante g n ralement entre la 2 et la 3 semaine les explants sont retir s et ventuellement transf r s dans un autre flacon Une trypsination est effectu e afin d assurer une meilleure r partition des cellules et une multiplication plus rapide apr s rejet du milieu le flacon est d abord rapidement rinc par une solution de trypsine 0 2 p 100 ensuite 1 ml de la solution de trypsine est ajout et le flacon est remis l tuve Solution de trypsine 0 2 g 100 ml trypsine 1 250 Difco 0 2 g milieu de Eagle MEM 100 ml ajuster le pH a 7 6 par addition de tampon Tris a 2 p 100 filtrer sur filtre Millipore 0 22 y La d sagr gation des amas cellulaires par la trypsine est surveill e au microscope invers et lorsqu elle est jug e satisfaisante en g n ral au bout 14 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques de 5 minutes 5 ml de milieu de croissance sont ajout s Un pipetage nergi que est effectu afin d achever la dissociation des cellules et d assurer leur r partition La confluence est le plus souvent atteinte dans les 72 heures c Divisions de la culture passages Lorsque la confluence est atteinte le flacon est trypsin comme ci dessus mais quand le d collement des cellules est complet l action de la trypsine est neutralis e par l addition de seulement 1 ml de milieu de culture Ces 2 mi de suspension cellulai
5. par une lettre p bras court et q bras long et subdivis en r gions de 1 4 Les r gions qui sont d limit es par des rep res cytologiques bandes tr s ou tr s peu color es sont subdivis es en bandes Ainsi la 2 bande de la 3 r gion du bras court du chromosome 1 se d fi nira par 1 p 32 La num rotation des bandes et des r gions s effectue des centrom res vers les t lom res Les bandes elles m mes peuvent tre subdivis es en sous bandes les quelles peuvent tre encore subdivis es par exemple 1 p 32 12 Nomenclature des remaniements de structure 79 Les subdivisions des bandes sont indiqu es par un point dans la for mule Elles s av rent n cessaires lorsque des chromosomes prophasiques sont tudi s Nomenclature des remaniements de structure Les translocations r sultant le plus souvent d un change de segments entre 2 chromosomes se symbolisent par t t rcp signifie translocation r ciproque t Rob signifie translocation robertsonienne appel e aussi fusion centri que Les translocations se d finissent encore par les num ros des chromoso mes atteints et leurs points de cassure trep 5 7 p 13 q 22 Les num ros des chromosomes sont indiqu s dans la premi re paren th se ies points de ca sure dans la seconde et dans le m me ordre t Rob 13q 14q indique la translocation entre un 13 et un 14 avec des points de cassure non d finis exactement mais si geant pr
6. 1971 Ann G n t 16 39 SANCHEZ O YUNIS J J 1974 The relationship between repetitive DNA and chromosoma bands in man Chromosoma Berl 48 191 SAUNDERS G F Hsu T C Getz M J Simes E L ARRIGHI F E 1972 Locations of human satellite DNA in human chromosomes Nature New Biol 236 244 SCHERES J M J C 1976 CT banding of human chromosomes The role of cations in the alkaline pretreatment Hum Genet 33 167 SCHNEDL W 1971 Banding pattern of human chromosomes Nature New Biol 233 93 SCHWEITZER D AMBROS P ANDRLE M 1978 Modification of DAPI ban ding on human chromosomes by prestaining with a DNA binding oligo peptid antibiotic distamycin A Exp Cell Res 111 327 SEABRIGHT M 1971 A rapid banding technique for human chromoso mes Lancet ii 971 SEHESTED J 1974 A simple method for R banding of human chromoso mes showing a pH dependent connection between R and G bands Humangenetik 21 55 SHAFER D A 1973 Banding human chromosomes in culture with actino mycin D Lancet i 828 Skovey F 1975 Nomenclature Additional chromosome bands Clin Genet 7 21 SOBELL H M JAIN S C 1972 Stereochemistry of actinomycin binding to DNA Il Detailed molecular model of actinomycin DNA complex and its implication J Mol Biol 68 21 STEFFENSEN D M 1977 Human gene localization by RNA DNA hybridization jn situ In
7. Technique La thymidine triti e d activit sp cifique de 5 curies par millimole thymidine m thyle 3H TMM 79 B CEA est plac e dans le milieu de culture de fa on obtenir une activit de 1 C par mi Le reste dela culture le mode d obtention des pr parations et la coloration des lames s effectuent tout fait normalement cf p 10 La seule contrainte impor tante concerne la manipulation et le rejet du milieu de culture contenant le tri tium qui doit s effectuer en prenant les pr cautions d usage pour le rejet de produits radioactifs Les mitoses sont rep r es et ventuellement photographi es La m tho de autoradiographique est ensuite comparable a celle d crite pour I hybrida tion in situ cf p 29 Seule diff re la dur e de l exposition qui peut durer de 1 4 semaines M thodes de traitement par le BrdU Progressivement d velopp es depuis une dizaine d ann es Zakharov et Egolina 1968 Palmer 1970 Zakharov et Egolina 1972 les m thodes fai sant intervenir une incorporation de BrdU 5 bromod oxyuridine ont pris une place de tout premier rang dans l analyse chromosomique Marquage avec traitement des cellules vivantes 47 Fig 15 Autoradiographie d une cellule f minine apr s incorporation de thymidine triti e en phase S tardive pendant les 7 derni res heures de culture La fl che indique X de replication tardive Principe g n ral a Le BrdU analogue de la thy
8. es L orc ine a t l un des colorants les plus utilis s Nous en d crirons bri vement le mode d emploi Les lames sont recouvertes de la solution colorante pr par e comme suit M langer Orc ine 1g Acide ac tique pur 45 ml Dissoudre en chauffant laisser refroidir et ajouter 55 ml d eau distill e Filtrer Les pr parations sont rinc es l eau distill e et s ch es Les chromoso mes apparaissent color s en rouge pourpre fonc Hybridation in situ et autoradiographie a Hybridation in situ Bien que cette technique ne soit pas l heure actuelle de pratique courante dans les laboratoires de cytog n tique il nous a paru utile de la mentionner compte tenu de l importance qu elle sera pro bablement amen e prendre dans l avenir Toutefois il n est pas possible de d crire ici les m thodes d extraction de l ADN et de pr paration des sondes radioactives Dans son principe cette technique consiste en un premier temps for mer des duplex ARN ADN ou ADN ADN par hybridation de segments marqu s d ARN ou d ADN monocatenaire de nature connue sur l ADN chromosomique in situ Dans un second temps les sites d hybridation sont r v l s sur les pr parations chromosomiques par autoradiographie 28 Colorations et marquage chromosomiques R f rences Elles sont tr s nombreuses et varient avec le mat riel tudi mais la plupart des techniques actuellement emp
9. s des centrom res Les inversions repr sentent un deuxi me grand groupe d anomalies structurales inv 4 p 12 q 31 caract rise une inversion p ricentrique du 4 apr s cassures dans les bandes p 12 et q 31 inv 5 q13 q32 caract rise une inversion paracentrique 2 cassures du bras long Parmi les autres anomalies les d l tions fde et les anneaux fr sont les moins rares en pathologie humaine Les dicentriques fdic et dans une certaine mesure les anneaux sont des anomalies acquises apr s irradiation par exemple ll existe une quantit d autres aberrations mais il est hors de propos de les citer toutes ici Pour une connaissance pr cise de la nomenclature on se rapportera au ISCN 1978 cit plus haut Blhlonrepnie ANGEL R R JacoBs P A 1975 Lateral asymmetry in human constitutive heterochromatin Chromosoma Berl 51 301 ARRIGHI F E HSU T C 1971 Localisation of heterochromatin in human chromosomes Cytogenetics 10 81 BELLS Wo irr S 1966 Effects of FUdR and thymidine on incorporation of deoxycytidine into DNA of Vicia faba Exp Cell Res 42 408 BLooM S E GOODPASTURE C 1976 An improved technique for silver staining of nucleolar organizer regions in human chromosomes Hum Genet 34 199 Bosprow M CoLLACOTT H E A L Mapan K 1972 a Chromosome ban ding with acridine orange Lancet ii 1311 Bogrow M Mapan K PEARSON P L 1972b St
10. se conserve peu Cette coloration faible et instable sous lumi re ultraviolette n est plus utili s e telle quelle que pour des applications particuli res mais reste tr s impor tante comme premi re tape pour la coloration au Giemsa apr s illumination Marquage avec traitement des cellules vivantes eer 49 Fig 16 M taphase f minine ayant incorpor le BrdU pendant la p riode toute terminale de la phase S 4 derni res heures de culture Coloration l acridine orange Les r gions h t rochromatiques et les bandes G les plus tardives sont sombres La fl che indique FX de replication tardive U V d crite ci apr s technique F P G Fluorochrome Plus Giemsa apr s coloration par le Hoechst 33258 les lames sont expos es durant une nuit ala lumi re ultraviolette mise par un tube germicide U V plac 10 cm envi ron Elles sont ensuite trait es par le SSC X 2 chlorure de sodium 0 3 M citrate trisodique 0 03 M durant 2h 60 C Enfin elles sont color es par le Giemsa Cette m thode d crite par Perry et Wolff 1974 a subi de nombreu ses modifications de d tail Quels que soient les colorants ou les traitements les chromosomes ou les segments de chromosomes seront d une facon g n rale d autant moins color s qu ils auront plus incorpor de BrdU Pour des raisons de pr f rence personnelle nous d crirons toutes les applications et les r sultats obtenus apr s coloration par l acr
11. L YASMINEH W G LEE J C 1971 Staining of satel lite DNA in metaphase chromosomes Nature 231 532 Yunis J J SAWYER J R BALL D W 1978 The characterization of high resolution G banded chromosomes of man Chromosoma Berl 67 293 ZAKHAROV A F EGOLINAN A 1968 Asynchrony of DNA replication and mitotic spiralization along heterochromatic portions of Chinese hamster chromosomes Chromosoma Berl 23 365 ZAKHAROV A F EGOLINAN A 1972 Differential spiralisation along mam malian mitotic chromosomes Chromosoma Berl 38 341 Index eleohsbatique A Acridine orange 25 Actinomycine D 60 Am thopt rine 63 Amniotiques cellules 14 ASG technique 33 Asym trie chromatidienne 54 Autoradiographie 29 Bandes Q 31 4G 33 RK T 36 et 37 C 38 CT 38 N 42 Biopsie testiculaire 18 Bromod oxyuridine BrdU 46 C bandes 38 Cellules amniotiques 14 Cellules germinales 18 Colchicine 10 Corpuscule de Barr 69 Corpuscule Y 70 DA DAPI 40 Diacin se 19 E Earle solution 35 Echanges de chromatides 54 Etalement 11 F Feulguen coloration 26 Fibrobiastes culture 12 Fixation 11 Fluorescence acridine orange 26 quinacrine 32 FPG coloration 49 Ganglions 17 Giemsa 24 Giemsa 11 39 H Hoechst 33258 48 Hybridation jn situ 27 Hypotonique traitement 10 11
12. Le traitement par l actinomycine D ne constitue donc pas une bonne m thode de marquage mais est int ressant pour l tude de la richesse en bases G C et pour l tude de la condensation chromatidienne Traitements par la 5 azacytidine La 5 azacytidine 5 ACR est un analogue de la cytidine D abord exp ri ment e chez les plantes Fucik et coll 1970 elle s av re efficace pour modi fier la structure chromosomique des mammif res Viegas P quignot et Dutrillaux 1976 a Technique M thode d obtention de bandes R la 5 ACR est utilis e la concen tration finale de 5 10 104M pendant les 5 7 derni res heures de culture Le d faut de condensation des bandes G qui en r sulte induit un marquage R assez typique Une association entre chromosomes acrocentriques et entre t lom res de non acrocentriques est souvent constat e Malheureusement comme pour l actinomycine D la 5 ACR ne change pas la coloration des chromoso mes ni par le Giemsa ni par les divers fluorochromes exp riment s De la sorte elle demeure une technique de marquage d un int r t pratique limit Dans les conditions pr cit es la 5 ACR agit par substitution la cytidine mais ne caract rise que les segments de replication tardive qui l ont incorpo r e bandes G et h t rochromatine ind pendamment de leur richesse en bases A T ou G C Marquage avec traitement des cellules vivantes CT Fig 24 M taphase de Cebus capu
13. Les mitoses int ressantes sont photographi es et leurs coordonn es rele v es Ensuite dans un premier temps l huile immersion est retir e par pas sage dans plusieurs bains de tolu ne Puis la lame est d color e par passage dans des bains d thanol 70 puis 50 La lame est pr te pour la r alisation d une coloration par la moutarde de quinacrine Les m mes mitoses sont nouveau photographi es bandes Q Techniques sur pr parations fix es 45 Fig 14 Colorations successives de la m me mitose par trois techniques diff rentes En 1 coloration au Giemsa en 2 bandes Q en 3 bandes R coloration l acridine orange La lamelle est alors soigneusement retir e Si de l huile immersion demeure sous la lame fluorescence par transmission elle est essuy e le mieux possi ble avec un chiffon de cellulose La pr paration est alors directement plong e dans le bain de Earle pH 6 5 a 87 C sans d coloration pour la r alisation des bandes R Les temps de d naturation sont un peu inf rieurs ce qu ils auraient t sans coloration a la quinacrine et irradiation UV pr alables Une coloration habituelle au Giemsa ou par l acridine orange est ensuite effectu e Cette derni re a l avantage de permettre la comparaison des deux marquages Q et R par deux m thodes de fluorescence Enfin une technique de coloration de l h t rochromatine habituelle ment les bandes C peut tr
14. Molecular structure of human chromosomes J J Yunis ed pp 59 88 Academic Press New York SUMNER A T 1972 A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin Exp Cell Res 75 304 SUMNER A T EVANS H J BUCKLAND R A 1971 A new technique for distinguishing between human chromosomes Nature New Biol 232 31 BF Bibliographie SzABO P ELDER R ULLENBECK O 1975 The kinetics of in situ hybridiza tion Nucleic Ac Res 2 647 VERMA R S Lugs H A 1975 A simple R banding technic Am J Hum Genet 27 110 VIEGAS P QUIGNOT E 1981 Condensation et segmentation des chromo somes Rapport R 5 059 C E A France VIEGAS P QUIGNOT E DUTRILLAUX B 1976a Segmentation of human chromosomes induced by 5 ACR 5 azacytidine Hum Genet 34 247 VIEGAS PEQUIGNOT E DUTRILLAUX B 1976b Modification sp cifique des bandes Q et R par le 5 bromod oxyuridine et l actinomycine D Exp Cell Res 98 338 VIEGAS PEQUIGNOT E DUTRILLAUX B 1978 Une m thode simple pour obtenir des prophases et des prom taphases Ann G n t 21 122 VIEGAS PEQUIGNOT E DUTRILLAUX B 1981 Detection of G C rich heterochromatin by 5 Azacytidine in mammals Hum Genet 57 134 XEROS N 1962 Deoxyriboside control and synchronization of mitosis Nature 194 682 Yunis J J 1976 High resolution of human chromosomes Science 191 1268 Yunis J J ROLDAN
15. U D R C R Acad Sci Paris 276 3179 DUTRILLAUX B LEJEUNE J 1971 Sur une nouvelle technique d analyse du caryotype humain C R Acad Sci Paris 272 2638 DUTRILLAUX B VIEGAS PEQUIGNOT E 1981 High resolution of R and G banding on the same preparation Hum Genet 57 93 EVANS E P BRECKON G FORD C E 1974 An air drying method for meiotic preparation from mammalian tests Cytogenetics 3 289 FONATSCH C 1979 A technique for simultaneous demonstration of G bands and sister chromatid exchanges Cytogenet Cell Genet 23 144 FRANCKE U OLIVER N 1978 Quantitative analysis of high resolution trypsin Giemsa bands on human prometaphase chromosomes Hum Genet 45 137 Fucik W MICHAELIS A RIEGER R 1970 On the induction of segment extension and chromatid structural changes in Vicia faba chromosomes after treatment with 5 azacytidine and 5 azadeoxyuridine Mutation Res 9 599 FUNAKIN MATSUIS SASAKI M 1975 Location of nucleolar organizers in animal and plant chromosomes by means of an improved N banding technique Chromosoma Berl 49 357 82 Bibliographie GAGNE R LABERGE C 1972 Specific cytological recognition of the hete rochromatic sement of number 9 chromosome in man Exp Cell Res 73 239 GALL J PARDUE M L 1971 Nucleic acid hybridization in cytological preparations In Methods in Enzymology 21 pp 470 480 GERMAN J L 1
16. addendum Il ne nous appartient pas de donner le d tail de cette nomenclature ici puisque cela n cessiterait un volume entier La figure 29 repr sente la nomenclature des chromosomes m taphasiques en bandes R et en bandes Q Nous donnerons simplement les principes g n raux de cette nomencia ture et quelques exemples d application la pathologie Formules chromosomiques normales et pathologiques La formule chromosomique d un individu se caract rise par le nombre diploide de ses chromosomes suivi de sa formule sexuelle soit 46 XX et 46 XY pour la femme et l homme normaux respectivement Les diff rentes trisomies autosomiques viables se symbolisent ainsi 47 XY 21 47 XX 18 47 XX 13 47 XY 8 Les aneuplo dies sexuelles les plus caract ristiques sont 47 XXY syndrome de Klinefelter 45 X syndrome de Turner 47 XXX 48 XXXX 48 XXXY 49 XXXXY 47 XYY homme double Y 76 Nomenclature Fig 29 Nomenclature du caryotype humain d apr s Prieur et coll 1973 Chromosomes en bandes R gauche et en bandes Q droite Nomenclature des remaniements de structure Fig 29 Suite 78 Nomenclature Les aneuploides autosomiques ou sexuelles peuvent s observer en mosaique c est a dire dans une fraction seulement des cellules 46 XX 47 XX 21 une lign e normale et une trisomique 21 46 XY 47 XXY une lign e normale et une XXY Klinefelter 45 X 46 XX 47 XXX
17. germinales r pandues sur toute la surface de la lamelle Apr s coagulation il suffit de placer la lamelle dans un tube contenant 2 cm de milieu de Eagle Les cellules peuvent tre maintenues 36 C pen dant plusieurs semaines Les figures en division sont observ es apr s choc hypotonique 30 mn et fixation habituelle directement sur la lamelle avec le coagulum c Analyse de la m iose femelle Tr s peu d analyses de la m iose femelle ont t entreprises dans notre esp ce Ceci tient essentiellement aux Techniques directes et cultures a tr s court terme 23 difficult s de pr levement Pour tudier les stades les plus pr coces jusqu au dictyot ne il est n cessaire d tudier des embryons ou des f tus apr s avortement Pour tudier les stades ult rieurs il faut apr s biopsie ovarienne r cup rer les follicules en maturation les diss quer afin de pr le ver les ovocytes qui seront plac s dans du milieu physiologique l tuve pendant 24 48 h selon le stade que l on veut analyser La raret et la difficult de telles manipulations chez notre esp ce ne justifie donc pas une descrip tion d taill e dans un ouvrage d int r t g n ral Colorations et aarqueage Elneenosenlieues Techniques sur pr parations fix es Avant d aborder la description des techniques de marquage les plus uti lis es nous rappelerons les techniques de coloration simples qui g n rale ment n induisent
18. marquages en bandes Q sont plus al atoires mais restent int ressants pour la reconnaissance de certains segments h t rochromatiques dont celui du bras long de l Y humain en particulier b M thode diff r e d tude de la m iose m le Quelques essais ont t effectu s pour maintenir en survie voire pour cultiver les cellules germi nales Les cellules peuvent tre maintenues 36 C en suspension ou du moins en phase liquide pendant 48 72 h apr s dilac ration effectu e st rile ment Le milieu utilis est constitu de liquide de Eagle addition de 10 p 100 de s rum de veau foetal Le simple maintien du fragment biopsique non dilac r dans ce m me milieu permet encore d observer des images m iotiques apr s 8 jours 2 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques 4 e Fig 3 M taphase de spermatogonie Coloration au Giemsa Des maintiens sur coagulum ont t obtenus galement Dutrillaux 1971 avant toute dilac ration on pr l ve d licatement quelques segments de tubes s minif res que l on d pose sur une lamelle couvre objet o l on a pr alablement d pos une goutte de plasma de coq et une goutte d extrait d embryon de poulet On dilac re alors rapidement les tubes s minif res dans la goutte de plasma de coq puis on retire les r sidus de tubes vides Les deux gouttes sont ensuite m lang es et tal es et le coagulum qui se forme contient les cellules
19. pas de marquage mais peuvent permettre d en r v ler un apr s divers traitements Techniques de coloration de base a Coloration classique au Giemsa C tait la coloration la plus large ment utilis e avant la d couverte des techniques de bandes Actuellement elle conserve son int r t parce qu elle donne une id e exacte de la morpholo _ gie g n rale des chromosomes Par contre elle n en permet pas une tude fine Elle est par ailleurs largement utilis e car elle permet la r v lation du marquage induit par de nombreux traitements pr alables LJ Technique La solution colorante est pr par e extemporan men comme suit eau distill e 94 ml tampon phosphates M 15 pH 6 7 3 ml Giemsa R 3 ml Cette solution est instable et doit tre renouvel e apr s une heure Les lames sont plong es dans la solution colorante pendant 10 minutes puis sont rinc es abondamment l eau courante Le s chage est spontan ou acc l r l air chaud R sultats fig 4 Les chromosomes apparaissent uniform ment color s toutefois les r gions h t rochromatiques centrom res constric tions secondaires des 1 9 et 16 bras courts des grands et petits acrocentri ques r gion distale du bras long de l Y prennent moins le colorant Techniques sur pr parations fix es 25 22 Fig 4 Coloration au Giemsa Caryotype masculin b Coloration par l acridine orange Bien qu a
20. soit de traiter les lames par le SSC X 2 60 C pendant une ou deux heures am lioration des bandes G surtout soit de les traiter par du Earle pH 6 5 87 C pendant 20 60 secondes am lioration des bandes R surtout Plusieurs traitements colorations successifs peuvent tre effectu s en cas de besoin On peut encore faire varier soit la dur e ou le mode de l exposition aux U V soit la dur e de la coloration au Giemsa ou la concentration de celui ci soit la dur e des traitements thermiques Ces diff rentes variantes ne doivent pas faire croire que la technique est difficile ou al atoire Elle est finalement de r alisation tr s simple tres adaptable et permet d obtenir chaque fois des images chromosomiques d une qualit sup rieure O S Braonen ce ls echreneatine Sexueale Corpuscule X corps de Barr Bien qu il ne s agisse pas proprement parler d un examen chromoso mique la recherche du corpuscule de Barr fait souvent partie de l examen caryotypique Elle doit son int r t au fait qu elle permet d explorer la garni ture gonosomique d un tissu l pith lium de la muqueuse jugale dont le caryotype n est habituellement pas tudi L Techniques Elles sont tr s nombreuses Celle que nous d cri vons est d riv e de celle de Moore et Barr 1955 Le pr l vement est fait par grattage de la face interne de la joue a l aide d une spatule m tallique ou d une lame de verre Les amas cellul
21. surnageant ajouter du milieu de rin age PBS par exemple 37 C remettre en suspension et effectuer un second rin age Remettre du milieu complet TC 199 s rum Des cellules en prophase ou prom taphase 67 14 ee A oa h y Gf gt s ry fE a EL T SF g E Eai a w y P 4 ve lt pF og ag t e ki F tg va Le L 1 va 3 4 5 u as p yy eof n gs a v of ms si g TE on kS nas PY a i f3 6 7 8 9 10 m O3 Ea 5 a je 4 d a e an i A 4 is c si 11 12 13 14 15 A Ta 16 7 18 X 5 PR ba x 4 a a B 6 19 20 21 22 Fig 27 Prom taphase en bandes R obtenue apr s le m me traitement que pour la figure 26 Bien que ce traitement permette d obtenir aussi de nombreuses prophases ce stade n a pas t illustr car il n cessiterait de trop grandes figures enrichi de thymidine 3 g par mi et laisser 37 C pendant 5 7 h Plus de prophases sont obtenues pour 5h plus de mitoses divers stades sont obte nues pour 7 h Faire le choc hypotonique s rum 1 vol eau 5 vol pendant une ving taine de minutes Apr s une premi re fixation de 10 15 min au Carnoy II chloroform effectuer 3 ou 4 fixations de 10 min successives au Carnoy thanol ac tique Etaler sur lames froides et humides Colorer par l acridine orange cf p 25 ou encore par une modification de la technique FPG 68 Techniques d obtention et de marqua
22. tions par chauffage et action prot olytique Les lames sont chauff es 3 jours 55 C ou une nuit 65 C ou encore 10 20 min 90 C Apr s refroidis sement elles sont trait es 15 60 sec par une solution de trypsine 0 05 p Des cellules en prophase ou prom taphase 65 100 dans du chlorure de sodium isotonique Les lames sant rinc es rapide ment dans deux bains de chlorure de sodium ou d thanol 95 Elles sont s ch es puis color es 90 sec a 2 min au colorant de Wright ou au Giemsa Synchronisation par la thymidine et incorporation de BrdU Par rapport la m thode de synchronisation par la thymidine d crite plus haut il suffit d ajouter du BrdU la dose de 10 ng par mi de milieu final durant les 6 7 derni res heures Viegas P quignot et Dutrillaux 1978 Ceci permet d obtenir apr s coloration par l acridine orange cf p 25 ou colora tion FPG cf p 49 un tr s beau marquage en bandes R fig 25 Pour cette technique il n est pas possible de remplacer les rincages par l addition de 2 d oxycytidine En plus des deux colorations cit es ci dessus on peut encore effectuer une coloration au Giemsa des cellules observ es apr s coloration par l acri dine orange II faut pour cela effectuer un bref traitement thermique 87 C pendant 15 60 secondes dans une solution de Earle pH 6 5 avant la colo ration au Giemsa Dutrillaux et coll 1980 Ce traitement rend les pr para tio
23. un marqueur h t rochromatique tr s fluorescent r gion p ricentrom rique du 3 par exemple gt Observation nicoscopique el aierophotographic Observation microscopique Observation en lumi re ordinaire Pour les observations en fond clair les mitoses sont recherch es au fai ble grossissement x 10 analys es et photographi es avec un objectif de grossissement x 100 On a int r t avoir un objectif muni d un diaphragme a iris indispensabile pour la fluorescence voir plus loin Pour l observation en lumi re ordinaire l iris sera ouvert au maximum on utilisera un filtre vert Pour les observations et la photographie en contraste de phase on emploiera de pr f rence un filtre orange Observation en fluorescence Celle ci n cessite un appareillage parfaitement adapt au mat riel et aux fluorochromes employ s Actuellement deux syst mes d excitation sont disponibles Syst me d excitation par transmission C est le plus ancien Le rayonnement provenant de la source une lampe vapeur de HBO 200 W le plus souvent est filtr filtres d excitation traverse la pr paration chemine un moment avec le rayonnement de fluorescence jusqu aux filtres d arr t qui ne laissent passer que ce dernier Ce syst me n cessite l immersion dans l huile de la lentille frontale du condenseur et un parfait r glage en hauteur de celui ci afin d obtenir une focalisation optimale du rayonnement incident Par ailleu
24. une lign e haplo X Turner une lign e normale et une lign e triplo X Classification chromosomique et nomenclature des bandes La classification du caryotype humain par groupes de G adopt e un temps est tomb e en d su tude depuis l utilisation du marquage qui permet de reconna tre chaque paire de chromosomes Cette classification est bien d finie chez l homme et les figures de cet ouvrage montrant des caryotypes en sont autant d exemples ll n existe pas de r gle absolue pour tablir la classification du caryotype d une esp ce non tudi e ant rieurement Les principaux crit res restent la taille relative des chromosomes et la position du centrom re Celle ci d termine la forme m tacentrique centro m re m dian acrocentrique centrom re distal et sub m tacentrique cen trom re en position interm diaire A ces deux crit res s ajoute bien sur le marquage qui est devenu le seul v ritable moyen d identification G n ralement on classe d abord les m ta ou sub m tacentriques par ordre de taille d croissante puis les acrocentriques L absence de r gle stricte cr e une grande confusion et le caryotype d une m me esp ce peut conna tre plusieurs classifications La nomenclature des bandes ne conna t pas une plus grande homog n it d une esp ce l autre aussi faut il savoir se satisfaire de la quasi unanimit concernant les chromosomes humains Chaque bras est symbolis
25. 0 et ventuellement filtre d att nuation du rouge 65 en fond clair ou bien BG 38 filtre interf rentiel KP 500 et les m mes filtres d arr t en fond noir Pour l observation et la microphotographie le diaphragme iris de l objectif x 100 est ferm de la quantit juste n cessaire pour liminer le rayonnement diffus sans trop diminuer l intensit de l image fluorescente l ouverture est en g n ral diminu e de moiti Microphotographie On doit utiliser des films grain fin Nous mentionnerons ici deux films qui donnent de bons r sultats et leurs conditions de d veloppement 74 Observation microscopique et microphotographie KODAK RECORDAK AHU 5786 r v l 8 minutes 20 dans le r v lateur KODAK PL 12 utilis la dilution 1 9 AGFA ORTHO 25 r v l 10 minutes 20 dans le r v lateur RODI NAL utilis la dilution 1 24 La sensibilit de ces deux films dans les conditions de prise de vue microphotographique se situe aux environs de 25 ASA En d pit de cette faible sensibilit ces deux films sont utilis s aussi bien pour la photographie en lumi re ordinaire qu en fluorescence On pr f rera toutefois le film AGFA l g rement plus sensible pour la microphotographie en fluorescence par transmission Contrairement une id e r pandue il ne faut pas utiliser un film rapide pour la photographie en fluorescence sous pr texte que l image est de faible intensit le ga
26. 14 15 17 Leuc mies 16 Liquide amniotique 14 Lymphocytes culture 9 M M ose 18 Microphotographie 73 Microscopie 72 Mo lle osseuse 16 Milieu de culture lymphocytes 10 fibroblastes 13 cellules amniotiques 14 N bandes 42 Nomenclature 75 NOR coloration 75 O Orc ine ac tique 27 Organisateurs nucl olaires 42 P Pachyt ne stade 21 Phytoh maglutinine 9 Index alphab tique Prom taphases 62 g 64 et 65 R 65 Q bandes 31 Quinacrine 31 R R bandes 34 Remaniements 79 R plication 54 S SCE 54 Spermatogonie 21 Synchronisation Thymidine 62 Am thopt rine 63 T bandes 36 Thymidine triti e 46 Trypsination 13 Trypsine bandes G 33 X X corpuscule 69 Y Y corpuscule 70 O FPournisseucs Liste non limitative Tubes de culture Ets Rossignol 59 rue de Turenne 75003 Paris R actifs de culture PHA C 1 B F 35 av Jean Jaur s 92390 Villeneuve la Garenne PHA P Trypsine 1 250 Difco U S A Thymidine m thyle triti e C E A service des mol cules mar qu es B P 2 91190 Gif sur Yvette Colorants Giemsa R R A L 35 av Jean Jaur s 92390 Villeneuve la Garenne Stains all Serva Allemagne F d rale Produits photographiques Kodak Path 8 14 rue Villiot 75012 Paris MASSON Editeur 120 Bd St Ger
27. 956 pour que la formule chromosomique de l homme soit pr cis e par Tjio et Levan et 1959 pour que la premi re anomalie chromosomique soit d crite par Lejeune et ses collaborateurs La mise au point des cultures sanguines devait faciliter beaucoup les analyses et fut sans doute responsable du grand essor de la cytog n tique moderne depuis 1960 Moorhead et coll Enfin la d couverte des bandes chromatidiennes Caspersson et coll 1970 Dutrillaux et Lejeune 1971 Summer et coll 1971 changeait radicale ment les potentialit s d analyse et faisait entrer la cytog n tique dans sa phase actuelle Dans cet ouvrage nous allons successivement consid rer les diff rentes m thodes permettant d obtenir des cellules en division par culture sans n gliger toutefois la possibilit d observer les chromosomes sur des tissus non cultiv s telles la mo lle osseuse et l pith lium s minif re Les m thodes purement cytologiques pour obtenir des talements chromosomiques seront d taill es Un d veloppement tout particulier sera donn la description des nom breuses m thodes de marquage 8 Techniques d obtention Ges pr parations CONSO NIQUES Bien que les pr parations chromosomiques puissent tre obtenues directement sur des tissus spontan ment en division active mo lle osseuse tissu testiculaire tissus n oplasigues on a le plus souvent recours la culture de cellules lymphocytes fibroblastes ce
28. 964 The pattern of DNA synthesis in the chromosomes of human biood cells J Cell Biol 20 37 GOSDEN J R BUCKLAND R A CLAYTON R P Evans H J 1975 Chromosomal localisation of DNA sequences in condensed and disper sed human chromatin Exp Cell Res 92 138 ISCN An International System for Chromosome Nomenclature Birth Defects Original Article Series The National Foundation March of Dimes Vol XIV n 8 1978 Jones K W 1973 The method of in situ hybridisation In New techni ques in biophysics and cell biology R H Pain et J Smith ed pp 29 66 John Wyley Chichester Sussex KORENBERG J R F FREEDLENDER E F 1974 Giemsa Ft for the detection of sister chromatid exchanges Chromosoma Berl 48 355 LATT S A 1973 Microfluorometric detection of deoxyribonucleric acid replication in human metaphase chromosomes Proc Nat Acad Sci Wash 70 3395 LATT S A DAVIDSON R L LIN M S GERALD P S 1974 Lateral asym metry in the fluorescence of human Y chromosome stained with 33258 Hoechst Exp Cell Res 87 425 LATT S A STETTEN G JUERGENS L A BUCHANAN G R GERALD P S 1975 Induction by alkylating agents of sister chromatid exchanges and chromatid breaks in Fanconi anemia Proc Nat Acad Sci Wash 72 A066 LIN M S LATT S A DAVIDSON R L 1974 Microfluorometric detection of asymmetry in centromeric region of mouse chromosome Exp Cell Res 86 392
29. 975a Sur fa nature et l origine des chromosomes humains Monographie des Annales de G n tique L Expansion Scienti fique Paris DUTRILLAUX B 1975b Obtention simultan e de plusieurs marquages chromosomiques sur les m mes pr parations apr s traitement par le BrdU Hum Genet 30 297 DUTRILLAUX B COUTURIER J Fosse A M 1980 The use of high resolu tion banding in comparative cytogenetics comparison between man and Lagotrix lagotricha Cytogenet Cell Genet 27 45 DUTRILLAUX B COUTURIER J RICHER C L VIEGAS P QUIGNOT E 1976 Sequence of DNA replication in 277 R and Q bands of human chromo somes using a BrdU treatment Chromosoma Berl 58 51 DUTRILLAUX B Covic M 1974 Etude des facteurs influencant la d naturation thermique m nag e Exp Cell Res 85 143 DUTRILLAUX B Fosse A M PRIEUR M LEJEUNE J 1974 Analyse des changes de chromatides dans les cellules somatiques humaines Traite ment au BUDR 5 bromod oxyuridine et fluorescence bicolore par l acridine orange Chromosoma Berl 48 327 DUTRILLAUX B GROUCHY J de Finaz C LEJEUNE J 1971 Mise en vi dence de la structure fine des chromosomes humains par digestion enzymatique pronase en particulier C R Acad Sci Paris 273 587 DUTRILLAUX B LAURENT C COUTURIER J LEJEUNE J 1973 Coloration par l acridine orange des chromosomes pr alablement trait s par le 5 bromod oxyuridine B
30. 978 Bien qu elle puisse tre mise d embl e on pr f re ajouter la thymidine apr s 48 72 h de culture la concentration finale de 0 3 mg par ml de milieu Les cultures sont laiss es ainsi 37 C pendant 15 h environ durant la nuit Puis le milieu contenant la thymidine est retir apr s centrifugation et pipetage et remplac par un milieu de rin age constitu d une solution physiologique saline PBS par exemple Les cellules sont remises en suspen sion par pipetage nouveau centrifug es et le milieu de rin age est limin Apr s un deuxi me rin age semblable au premier du milieu complet TC 199 s rum est remis pendant les 5 7 derni res heures de culture Pour viter les rincages on peut simplement ajouter de la 2 d oxycytidine la dose de 0 5 mg par ml et laisser la culture voluer ainsi 5 7 h de plus Viegas P quignot 1981 Le reste de la technique est identique ce qui a t d crit plus haut On a cependant int r t multiplier les fixations 4 6 pour obtenir un meilleur talement Culture de fibroblastes D une facon g n rale il est plus d licat d obtenir une bonne synchronisation des cultures de fibroblastes La thymidine est ajout e 8 h apr s la division la concentration finale de 1 mg par mi Le reste de la technique est identique celle des lymphocytes Selon la qualit des cultures le cycle cellulaire peut varier sensiblement et il
31. TIERYTHROCYTAIRES par Ph ROUGER et Ch SALMON 1981 116 pages 18 figures Autres ouvrages DICTIONNAIRE DE G N TIQUE par P L HERITIER Collection de dictionnaires sp cialis s de m decine et de biologie sous la direction de A MaAnuILA 1978 272 pages 6 figures BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EVOLUTION par F AYALA 1981 136 pages 60 figures a parai tre LE POLYMORPHISME BIOCHIMIQUE ET LES FACTEURS DE SON MAINTIEN par G LUCOTTE 1977 72 pages 19 figures MANUEL PRATIQUE D EMBRYOLOGIE EXP RIMENTALE par J SCHILT A M Bautz et A Bautz 1981 144 pages G N TIQUE ET AMELIORATION DES PLANTES par Y DEMARLY Collection Sciences Agrono miques 1977 304 pages 175 figures v ocnnig ess SS SDO Loio 12 LA PRATIQUE DE L AMALSE CHROMOSOMAUE Bernard Dutrillaux J r me Couturier Maitre de recherche Charg de recherche au CNRS au CNRS MASSON Paris New York Barcelone Milan Mexico Rio de Janeiro 1981 Tous droits de traduction d adaptation et de reproduction par tous proc d s r serv s pour tous pays La loi du 11 mars 1957 r autorisant aux termes des alin as 2 et 3 de l article 41 d une part que les copies ou reproductions strictement r serv es usage priv du copiste et non destin es a une utilisation collective et d autre part que les analyses et les Courtes citations dans un but d exemple et d illustration toute repr sentation ou reproduction int grale ou partielle faite
32. aining of some specific regions of human chromosomes particularly the secondary constriction of n 9 Nature New Biol 238 122 Bou J NICOLAS H BARICHARD F BOU A 1979 Le clonage des cellu les du liquide amniotique aide dans l interpr tation des mosa ques chro mosomiques en diagnostic pr natal Ann G n t 22 3 CARPENTIER S DUTRILLAUX B LEJEUNE J 1972 Effets du milieu ionique sur la d naturation thermique m nag e des chromosomes humains Ann G n t 15 203 CASPERSSON T ZECH L JOHANSSON C 1970 Analysis of human meta phase chromosome set by aid of DNA binding fluorescent agents Exp Cell Res 62 490 COUTURIER J CUNY G HUDSONA P DUTRILLAUX B BERNARDI G 1981 Cytogenetical and biochemical characterization of a dG dc rich satel lite DNA in the primate Cebus capucinus Soumis pour publication a Eur J Biochem COUTURIER J DUTRILLAUX B LEJEUNE J 1973 Etude des fluorescen ces sp cifiques des bandes R et des bandes Q des chromosomes humains C R Acad Sci Paris 276 339 CRAIG HOLMES A P SHAW M W 1971 Polymorphism of human constitutive heterochromatin Science 174 702 DUTRILLAUX B 1971 La culture de cellules germinales males m thodes et applications Ann G n t 14 157 Bibliographie 81 DUTRILLAUX B 1973 Nouveau syst me de marquage chromosomique les bandes T Chromosoma Berl 41 395 DUTRILLAUX B 1
33. aires ainsi ramen s sont rapidement ta l s en une mince couche sur une lame porte objet propre Celle ci est imm diatement plong e dans du fixateur de Carnoy pendant 30 minutes puis s ch e spontan ment l air Hydrolyser par passage dans HCI 5 N la tem p rature ambiante pendant 20 minutes Rincer 3 minutes l eau courante puis plonger les lames dans une solution aqueuse 0 5 de violet de cresyle pendant 5 minutes Rincer l eau courante et laisser s cher On peut employer aussi comme colorant le bleu de toluidine 0 1 en solution aqueuse R sultat La chromatine sexuelle appara t sous a forme d un cor puscule bleu fonc accoll la membrane nucl aire On compte en g n ral sur un total de 200 noyaux ceux qui sont porteurs d un ou plusieurs cor puscules Il existe au maximum autant de corpuscules bar noyaux que de chromosomes X moins un dans la constitution du sujet Seule une fraction 70 Examen de la chromatine sexuelle Fig 28 Noyau de fibroblaste en interphase color par l acridine orange montrant le corpuscule de Barr fl che Les nucl oles N sont color s en rouge des cellules montre ce corpuscule entre 5 et 30 p 100 pour l pith lium jugal entre 70 et 90 p 100 des fibroblastes en culture chez une femme nor male On peut appr cier aussi des anomalies de taille du corpuscule Bien qu il s agisse d un examen de r alisation fort simple la lectu
34. ansfusion sanguine Chamb ry sequences de bases du DNA ou avoir des rendements de fluorescence diff rents selon ces sequences ont t test s sur des pr parations chromosomi ques Les r sultats de ces exp riences ne sont pas univoques et ont permis jusqu pr sent peu d applications pratiques Il n est pas possible de les d tailler dans un ouvrage de base Nous ne d crivons ici que la technique de coloration la Distamycine A et au 4 6 Di Amidino 2 Phenyl Indole DA DAPI qui est relativement facile mettre en uvre et qui peut par exemple permettre d affirmer la nature h t rochromatique de certains seg ments chromosomiques paraissant au premier abord tre en exc s L R f rence Schweizer et coll 1978 Technique Les pr parations sont color es par une solution de distamycine A HCI 0 2 mg ml en tampon Mac llvaine a pH 7 0 33 M Na pendant 15 minutes Elles sont rinc es avec le m me tampon et color es nouveau avec la solution de DAPI 0 4 ng ml dans ce tampon pH 7 pendant 15 minutes Un rin age est alors fait avec ce tampon puis avec un tampon pH 7 5 La lame est enfin mont e avec une lamelle en tampon pH 7 5 L exc s de tampon est enlev par pression entre deux feuilles de papier filtre L observa tion est faite en lumi re ultraviolette Le pic d absorption du complexe DNA DAPI seul compos des deux tre fluorescent se situe 355 nm et le pic 42 CC OfOrations et mar
35. ant une dizaine d heures rincer et remettre du milieu normal durant les 7 derni res heures Le marquage obtenu est l inverse du pr c dent les segments de replica tion tardive tant vert brillant O Analyse du temps de r plication des bandes Parmi les bandes R qui effectuent donc la r plication de leur ADN en phase S pr coce et parmi les bandes G qui effectuent la r plication en phase S tardive il existe des dif f rences de chronologie il suffit donc de faire des traitements de dur es interm diaires entre 3 et 7 heures pour diff rencier les bandes G entre elles et interm diaires entre 7 et 12 heures avant la fin de la culture pour diff rencier les bandes R entre elles Ceci permet d tablir une carte de la s quence de r plication qui apporte un l ment suppl mentaire pour l identification des structures chro mosomiques fig 20 Dutrillaux et coll 1976 c Traitements par le BrdU durant 2 cycles cons cutifs L incorpora tion de BrdU durant deux cycles cons cutifs aboutit une r partition in qui table du BrdU sur les chromatides s urs En raison de la r plication semi conservative de l ADN chaque chromatide sera en effet constitu e apr s un cycle entier d incorporation de BrdU d une mol cule d ADN dont 1 brin sera substitu et l autre non Apr s un nouveau cycle d incorporation seul un brin sur 4 sera non substitu l chelle chromosomique cela signifiera qu une chromatid
36. ases S l incorporation ne se fera pas sur certains segments de chro matides Ainsi si l incorporation commence seulement au milieu de la pre mi re phase S les bandes R d j r pliqu es n incorporeront le BrdU qu au second cycle Il en r sultera un marquage de type R surtout visible sur la chromatide la plus color e Ceci permet de reconna tre les chromosomes tout en effectuant l analyse des SCE Toutefois le taux des SCE peut diminuer d autant que l incorporation de BrdU aura t moindre Seules les cultures de cellules sanguines chappent cette difficult si le traitement par le BrdU est commenc d s le d but de la culture Les cultures de 60 72 h donnent une bonne proportion de cellules ayant effectu 2 cycles entiers sous BrdU La pr sence de BrdU ne semble pas g ner beaucoup la transformation des lymphocytes en culture d Traitement par le BrdU durant plus de 2 cycles Le traitement par le BrdU peut tre maintenu durant plusieurs cycles de sorte que le nombre de brins d ADN ne l ayant pas incorpor devienne tr s faible Apr s 3 cycles d incorporation il y aura statistiquement 3 4 des chro matides bi substitul es fig 22 Apr s 4 cycles il y en aura les 7 8e Marquage avec traitement des cellules vivantes 57 Fig 22 Cellule ayant incorpor le BrdU durant les trois derniers cycles de synth se de l ADN Coloration l acridine orange Le quart seulement de la longueur des c
37. ble sur certains segments Chez Cebus capucinus par exemple de longs segments d h t rochromatine R positive sont relativement moins modifi s que euchromatine fig 23 Ces segments sont porteurs d un ADN satellite riche en G C Coutu rier et Coll 1981 Cette d tection de segments h t rochromatiques riches en G C a t tendue a d autres esp ces Technique on ajoute le BrdU 10 pg par mi durant les derni res 15 18 h de culture Coloration par l acridine orange Une bonne diff rencia tion par irradiation ultra violette est n cessaire 1 Diff renciation des segments euchromatiques Dans les condi tions habituelles la coloration longitudinale des chromatides est peu pr s Marquage avec traitement des cellules vivantes 59 Fig 23 M taphase de Cebus capucinus ayant incorpor le BrdU pendant a totalit de la derni re phase de synth se de l ADN 20 derni res heures de culture Coloration I acridine orange Les chromosomes sont sombres sur toute leur longueur except certains segments qui demeurent relativement fluorescents s agit de r gions h t rochromatiques par ticuli rement riches en s quences G C incorporant par cons quent moins le BrdU homog ne apr s l incorporation de BrdU durant une ou plusieurs phases S enti res Ceci peut s interpr ter par une r partition homog ne des bases A T et G C ou par des diff rences de r partition insuffisantes pour t
38. cellulaire ainsi obtenue est plac e a la pipette dans un tube centrifuger Cette op ration est r p t e aussi longtemps que le liquide reste opalescent apr s dilac ration Elle n cessite au plus 5 minutes La suspension recueillie sera laiss e en attente une dizaine de minutes avant d tre centrifug e 1 000 1 500 t mn 400 600 g pendant 5 minutes Le liquide surnageant sera ensuite limin et remplac par du fixateur La fixation et l talement sont identiques ceux d crits pour les cellules mitotiques Cette m thode permet l observation de cellules en diacin se et en m taphases et Il de bonne qualit et en grand nombre fig 1 et 2 Elle diff re tr s peu de la description originale de Evans et coll 1964 enr Fig M taphase de spermatocyte ll En haut coloration au Giemsa en bas marquage de la m me cellule en bandes T coloration par l acridine orange image en miroir Le marquage permet la recon naissance des chromosomes Techniques directes et cultures a tres court terme 21 e Variante pour l obtention de mitoses spermatogoniales L utilisa tion d un milieu de transport physiologique telle la solution de Earle de Hanks etc dans lequel est aussi effectu la dilac ration et d un liquide hypotonique constitu de s rum humain dilu au tiers dans de l eau distill e permet d obtenir plus de figures mitotiques et de meilleure qualit fig 3 e Variante
39. cinus ayant subi un traitement par la 5 Azacytidine a tr s faible dose pendant les 7 derni res heures de culture ce qui emp che la condensation de l h t rochromatine riche en G C Coloration au Giemsa Caract risation de l h t rochromatine riche en guanine cytosine G C fig 24 Utilis e dose moindre 10 5 106 M la 5 ACR ne modifie pas la condensation chromosomique des cellules humaines ni celle de beau coup d autres esp ces de mammif res Par contre chez les esp ces poss dant de l h t rochromatine riche en G C comme Cebus capucinus une forte elongation des r gions correspondantes est constat e Viegas P quignot et Dutrillaux 1981 Une tr s bonne sp cificit semble exister rendant la m thode utile pour cette application Toutefois la 5 ACR rapidement m ta bolis e et dont l incorporation d pend sans doute de nombreux param tres est d un emploi d licat O v Oblbenbllon el DBtqQueage aes eallules en prophnese OU MoOn laphIse Avec le marquage chromosomique dont nous venons de voir les princi pales m thodes il est possible de d nombrer des structures essentiellement bandes R ou G dont le nombre est assez proportionnel la longueur des chromatides Ainsi en m taphase sur des chromosomes condens s il est possible de distinguer environ 300 bandes par lot haplo de Si l on s lectionne les mitoses dont les chromosomes sont les plus longs on peut d nombrer de 400 600 bande
40. dant 5 minutes Il est difficile de donner une indication pr cise quand la concen tration de la sonde celle ci pouvant tre tr s variable selon son activit sp ci fique la s quence tudi e etc Gall et Pardue 1971 consid rent que l acti vit minimum utilisable est de 105 cpm ug Les concentrations habituelle ment utilis es sont de l ordre de 0 1 1 ug ml Certains auteurs Steffensen 1977 Mac Gregor et Mizuno 1976 recommandent la pr sence dans la solu tion d hybridation de 30 50 de formamide La lame est recouverte d une lamelle 22 x 22 mm et mise a incuber en chambre humide pendant en g n ral 15 heures Cette dur e peut varier elle aussi en fonction des sondes utilis es La d termination de cette dur e tait jusqu il y a peu de temps empirique mais la cin tique de hybridation est maintenant mieux connue Szabo et coll 1975 Apr s hybridation la lamelle est retir e et la lame abondamment rinc e au SSC X 2 a 65 C puis d shy drat e par passage dans les alcools de titre croissant Dans le cas d hybrida tion avec de l ARN il est n cessaire avant d shydratation de passer par une tape d limination des complexes non sp cifiques par traitement de la lame la RNase 20 ug ml en SSC X 2 pendant une heure a 37 C b Autoradiographie La m thode que nous d crivons s applique aussi bien l hybridation n situ qu aux techniques d incorporation de pr cur seu
41. du bras l alcool 70 puis l ther C Infiltration sous cutan e de xylocaine 1 p 100 Attendre l installa tion de l anesth sie locale LI Pr l vement emporte pi ce de 4 mm une profondeur de 1 mm est suffisante Saisir la pince le fragment d tach et couper le p dicule le retenant au tissu sous cutane Le pr l vement peut tre aussi effectu au bistouri un petit bourrelet d piderme form par une pince est d coup au dessus de celle ci sur une hauteur de 1 mm et une longueur de 2 mm Le pr l vement fait tamponner la compresse le l ger coulement san glant pouvant se produire rapprocher les deux l vres de l incision l aide de Steri strips et faire un pansement l g rement compressif qui sera laiss en place une semaine L Les fragments biopsiques sont recueillis dans des tubes st riles con tenant du milieu de culture ou une solution saline HIDE solution de Hanks par exemple b tablissement de la culture C R alisation des explants L chantillon est plac dans une bo te de Petri avec une petite quantit de milieu de culture Il est ensuite d coup en petits fragments cubiques de 0 5 mm de c t environ l aide d un scal pel L Mise en culture Dix de ces fragments environ sont transf r s l aide d une pipette Pasteur dans un flacon plastique de 25 cm ou ils sont r guli rement r partis On ajoute alors la quanti
42. duit par un traitement par le BrdU 66 n n a oo Techniques d obtention et de marquage re i ji a i o t a F i Y Te If 4 T w 3 ha i u i a A os Ge nN QG ee 2 gt o rs K _ 2e g gt j aa g n Vra 3 Fa p vi n H i Le g y Le 6 7 8 9 10 4 OE mA Ee l pg aA s w 3 mu SR E Toe 5 4 11 12 13 14 15 4s Le am peo 6 Ff aN 4 w a i 16 17 18 X 5 2 a t e p ae es Fe uk 19 20 21 22 Fig 26 Prom taphase en bandes G obtenue apr s synchronisation par BrdU et culture avec thymidine durant les 7 derni res heures Coloration par le Giemsa FPG L X de replication tardive est gauche durant les 3 4 derni res heures cf p 50 Enfin un faible pourcentage de mitoses montre une asym trie chromatidienne associ e un marquage G Cette m thode de synchronisation par le BrdU donne donc sur les m mes pr parations un tr s beau marquage G un tr s beau marquage R et divers autres aspects nous para t tr s probable qu elle tiendra un r le pr pond rant dans la cytog n tique future Pour cette raison nous allons en donner tous les d tails m me si cela entra ne quelques redites Technique d taill e Apr s 48 72 h de culture de cellules sangui nes le BrdU est ajout la concentration finale de 0 2 mg par mi Laisser pendant une nuit environ 15h Centrifuger retirer le
43. e Les conditions de culture sont identiques celles de la mo lle toutefois on omettra le tube pour examen direct les mitoses tant tr s rares avec le sang p riph rique La quantit de sang ensemencer est fonction du nom bre de leucocytes par exemple pour un nombre de 100 000 leucocytes par Techniques directes et cultures tr s court terme __ 17 mm on ensemencera 0 1 ml de sang par tube Parall lement on effectuera une culture de 72 heures en pr sence de PHA afin d tablir le caryotype constitutionnel du patient et d affirmer la nature acquise d un remaniement constat dans la mo lle ou dans les cultures de sang p riph rique sans PHA c Etude des cellules des tissus lymphoides Nous allons d crire la m thode d analyse de cellules de ganglions lymphoides la technique pou vant tre adapt e la rate par exemple Le fragment biopsique est plac dans un milieu physiologique st rile pour le transport A l arriv e au laboratoire il sera transf r dans une petite bo te de Petri avec 1 ml de milieu TC 199 par exemple Le reste du milieu est centrifug et s il existe un culot celui ci sera trait comme les cellules obtenues par dilac ration de la biopsie Apr s avoir partag la biopsie en deux parties gales l une des parties est dilac r e l aide de deux bistouris dans du liquide physiologique celui ci tant pr lev la pipette pasteur et remplac trois fois de suit
44. e afin de r cu p rer les cellules mises en suspension Centrifuger le liquide ainsi pr lev Faire un choc hypotonique de 20 mn 37 C dans 20 mi de citrate de sodium 1 p 100 ou du chlorure de potassium 0 56 p 100 Centrifuger et remettre le culot en suspension dans 0 5 ml Ajouter quelques gouttes de fixateur de Carnoy sans chloroforme puis ajouter nouveau 1 mI Apr s 5 mn centrifuger nouveau et changer le fixateur Centrifuger nouveau apr s 30 minutes et remettre les cellules en suspension dans une petite partie du liquide surnageant ftaler une goutte sur la lame et v rifier la concentration en cellules au microscope en contraste de phase On ajustera ensuite ventuellement la concentration de la suspension avant de proc der l talement de l ensem ble La seconde moiti de la biopsie est dilac r e E et les cellules mises en suspension sont r cup r es comme ci dessus pour tre plac es dans des tubes de culture en pr sence de milieu TC 199 s rum h pa rine phytoh maggiutine comme du sang oa tube pourra tre pr par sans phytoh magglutinine Mettre a l tuve 37 C et remplacer le milieu par du milieu frais apr s 24 h Remettre l tuve pour 24 h Apr s ces 48 h de culture proc der la m me M chRiQuE que pour l exa men direct Les fragments tissulaires r siduels apr s dilac ration peuvent tre plant s comme
45. e Giemsa et d une observation classique Un troisi me proc d consiste faire une digestion enzymatique des chromosomes suivie d une coloration au Giemsa Enfin un dernier groupe de techniques consiste modifier le chromo some dans la cellule vivante par incorporation d un analogue d une base de l ADN par exemple et observer les cons quences sur la condensation chromosomique Tous ces proc d s reposent sur des principes biochimiques divers fai sant intervenir les diff rents composants chromosomiques ADN et prot i nes ainsi que la dynamique de la r plication de l ADN et de la condensation des chromatides Les structures mises en vidence par ces m thodes on t d ment r pertori es et classifi es Leur nomenclature sera envisag e au chapitre 6 _ Toutefois pr cisons d s maintenant qu il existe 3 types principaux de mar quage deux pour l euchromatine c est dire les segments non variables repr sentant chez la plupart des esp ces la quasi totalit de la longueur des chromatides Ce sont d une part les bandes Q et G de m me localisation et qui colorent environ 50 p 100 de l euchromatine et d autre part les bandes R qui colorent le reste L euchromatine est donc constitu e de l alternance des bandes Q ou G et R un pour l h t rochromatine qui correspond chez la plupart des mam mif res au marquage C localis le plus souvent aux r gions centrom tri ques Il existe toutefois de no
46. e aura un ADN bi substitu et que l autre n aura du BrdU que sur un seul brin Un traitement d une trentaine d heures par le BrdU une dose com prise entre 1 et 10 ng par ml permet d obtenir cette diff renciation qui devient apparente dans les m mes conditions que pour les traitements plus brefs Latt 1973 Dutrillaux et coll 1974 Ci Applications La distinction entre les 2 chromatides s urs fig 21 met en vidence les changes survenus entre elles changes de chromatides s urs sister chromatid exchanges SCE On ne sait pas encore avec certitude quel est le taux spontan de SCE par division cellulaire En effet le BrdU qui sert de r v lateur en induisant le nombre moyen d changes est proportionnel la dose utilis e D autre part l importance de Marquage avec traitement des cellules vivantes 55 Fig 21 Cellule ayant incorpor le BrdU durant les deux derniers cycles de synth se de l ADN 36 derni res heures de culture En haut coloration l acridine orange Les chro matides brillantes ont incorpor le BdrU sur un seul des brins de leur cha ne d ADN les sombres sur les deux brins Les fl ches indiquent des changes entre chromatides s urs En bas technique FPG 56 Colorations et marquage chromosomiques incorporation d pend certainement aussi de la composition du milieu de culture utilis est donc difficile de donner une valeur absolue ce taux de SCE Pour u
47. e fraction de phase S et plusieurs phases S donc plusieurs cycles cellulaires cons cutifs La dose de BrdU utilis e pour les cellules en culture est g n ralement 10 ug par ml de milieu final Des doses plus fortes d abord utilis es indui sent un marquage plus fort mais s av rent toxiques et ralentissent pour le moins le cycle cellulaire Les doses plus faibles jusqu 1 ug par ml peuvent tre utilis es mais induisent un marquage parfois insuffisant Nous verrons plus loin comment faire varier les temps de traitement en fonction de l application recherch e Le BrdU est dissout dans une solution physiologique avant d tre ajout aux cultures et peut se conserver ainsi environ une semaine 4 C Cette solution est filtr e sur filtre Millipore 0 22 x en cas de traitement prolong des cultures La fin de la culture et l obtention des pr parations chromosomiques est identique a celles d crites pr c demment cf p 10 c Coloration et diff renciation des chromosomes Giemsa voir p 24 Acridine orange voir p 25 La diff renciation de la coloration sous U V est une tape tr s importante Pour acc l rer cette diff renciation on peut irradier la mitose a analyser en retirant tous les filtres se trouvant sur le fais ceau Prendre soin de retirer les yeux des oculaires Hoechst 33258 colorer pendant 12 15 minutes dans une solution 0 5 g par mi d eau distill e ou de PBS Le colorant dilu
48. e r alis e apr s d graissage de la lame mais sans d coloration pr alable Le traitement par Ba OH doit tre r duit de moiti 46 CC lorations et marquage chromosomiques La technique de coloration des organisateurs nucl olaires est plus diffi cile r ussir apr s bandes Q et bandes R par contre elle est relativement ais e obtenir apr s coloration la quinacrine seule Il est encore possible d obtenir successivement des bandes G technique ASG puis des bandes R Les r sultats nous paraissent toutefois moins reproductibles que par l utilisation successive des bandes Q et des bandes R M thodes de marquage faisant intervenir un traitement des cellules vivantes incorporation de thymidine triti e L incorporation de thymidine triti e suivie de la m thode autoradiogra phique fut pendant longtemps la seule technique de marquage chromosomi que De r alisation assez simple dans son principe elle consiste a mettre de la thymidine triti e dans le milieu de culture pendant des temps variables en fonction des buts recherch s Toutefois c est en fin de culture durant les derni res heures qu elle a t le plus utilis e German 1964 La figure 15 montre un marquage autoradiographique obtenu apr s une incorporation durant les 7 derni res heures Les segments ayant repliqu leur ADN tardivement sont ainsi mis en vidence Dans cette cellule femelle lX tardif est particuli rement reconnaissable C
49. eau distill e et mises la temp rature de la glace fondante Les tubes sont centrifug s et le fixateur est en partie rejet on laisse une quantit variable avec l importance du culot en moyenne 5 6 mm au dessus de celui ci Les cellules sont remises en suspension dans ce volume Cette suspension est reprise la pipette Pasteur on laisse tomber d une hauteur de 3 4 cm l une c t de l autre deux gouttes sur une lame froide recouverte d un fin film d eau pour ce faire la lame est soigneuse ment drain e sur champ sur un papier filtre D autres lames sont ainsi pr par es jusqu puisement de la suspension en moyenne six lames par tube 12 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques peuvent tre ainsi obtenues On laisse les pr parations s cher spontan ment l air Elles peuvent tre ensuite soit simplement color es au Giemsa soit trait es pour obtenir des marquages Fibroblastes Les biopsies cutan es sont la source la plus habituelle de fibroblastes pour l obtention de cultures cellulaires en vue de la d termination du caryotype Cependant des fragments de nombreux autres tissus apon vrose muscles reins gonades peuvent tre aussi utilis s pour initier des cultures cellulaires a Biopsie cutan e Toutes les manipulations d crites doivent tre bien entendu effectu es st rilement Lj Nettoyage de la r gion choisie habituellement la face interne
50. ement afin d viter la formation de bulles d air Replacer au bain marie Les lames sont 30 Colorations et marquage chromosomiques plong es une une sorties rapidement goutt es puis laiss es s cher Lorsqu elles sont presque s ches elles sont plac es dans des portoirs dans une chambre noire travers e par un courant d air durant une quinzaine d heures pour achever la dessication Elles sont ensuite plac es dans des bo tes tanches la lumi re contenant un dessicant et mises 4 C La dur e de l exposition varie bien entendu selon les exp riences Dans la prati que on r alise dans les m mes conditions plusieurs pr parations qui seront d velopp es des temps diff rents par exemple de 3 jours plusieurs semaines Traitement D veloppement KODAK D 19 dilution 1 1 4 mn 15 C sans agita tion Arr t Immersion de 30 secondes dans un bain d eau distill e Fixation KODAK Unifix dilution 1 3 5 mn Rin age l eau courante pendant 5 mn Passer l eau distill e et laisser s cher spontan ment l air C Coloration Elle constitue un probl me d licat en particulier dans le cas de l hybridation jn situ En effet la morphologie chromosomique est souvent tr s alt r e par les traitements subis pour l hybridation et pour le d veloppement de l mulsion Par ailleurs la coloration a lieu travers celle ci laquelle prend elle m me plus ou moins le colorant De
51. ement de ce dernier peut tre plus sp cifique Si le second syst me para t s imposer th oriquement en pratique sa sup riorit est moins vidente en tous cas pour certaines applications cyto g n tiques En effet les r sultats de la coloration la moutarde de Quina crine sont bons par contre ceux de l acridine orange sont inconstants on assiste fr quemment un affaiblissement rapide de la fluorescence emp chant parfois la photographie Par ailleurs pour les colorations par l acridine orange apr s incorporation de BrdU en particulier une certaine matura tion de l image est n cessaire afin d obtenir une bonne diff renciation des r gions vert brillant et des r gions rouge sombre Celle ci est effectu e par une irradiation assez prolong e de l ordre de une deux minutes par le fais ceau d excitation Cette maturation n a souvent pas le temps de se pro duire avec l quipement de fluorescence par r flexion et l affaiblissement de l image survient rapidement Ceci est probablement d aux caract ristiques mal adapt es aux pr parations chromosomiques des filtres d excitation pro pos s actuellement par les fabricants et malheureusement le choix des combinaisons disponibles est tr s restreint Finalement selon notre exp rience les meilleurs r sultats pour l acridine orange sont donn s par l qui pement par transmission avec filtres d excitation BG 38 BG 12 et filtre d arr t 5
52. ence est sp cifique d une paire donn e Les constrictions secondaires sont sombres Certaines r gions h t rochromatiques sont tr s brillantes r gion centrom rique du 3 parfois du 4 du 13 certains bras courts d acrocentriques et surtout la r gion distale du bras long de l Y Ces marqueurs sont le si ge de variations physiologiques Techniques sur pr parations fix es 33 Fig 6 Variations normales de l Y bandes Q Les diff rences de longueur de l Y selon les individus sont dues des variations de la r gion fluorescente du bras long fig 6 La coloration la moutarde de quinacrine est d un grand int r t pour leur tude La fluorescence du bras long de l Y est souvent tellement intense qu elle peut tre reconnue m me sur des noyaux interphasiques frottis buc caux fibroblastes cellules ammiotiques spermatozo des On devra cepen dant se m fier de la possibilit de faux positifs du fait de l existence de mar queurs automosiques eux m mes tr s fluorescents b Bandes G Giemsa L R f rences Elles sont tr s nombreuses nous ne d taillerons que les techniques les plus utilis es actuellement M thodes de d naturation Sumner et coll 1971 Schnedl 1971 M thodes prot olytiques Dutrillaux et coll 1971 Seabright 1971 L Techniques ASG Acetic Saline Giemsa Summer et coll 1971 Incuber les lames dans une solution de SSC X 2 NaCl 0 3 M c
53. er une technique de culture en foyers et d analyser les chromosomes n situ a Mise en culture Le laboratoire re oit en g n ral un pr l vement de 10 20 ml de liquide amniotique pr lev par ponction entre la 16 et la 19 semaine apr s les derni res r gles Les cultures sont faites dans des bo tes de Petri de 35 mm de diam tre au fond desquelles est plac e une lamelle de verre de 30 mm de diam tre Deux milieux de croissance sont utilis s parall lement pour chaque pr l vement RPMI et HAM F 10 ils comportent des antibiotiques et sont suppl ment s avec 20 p 100 de s rum de veau foetal Techniques directes et cultures tr s court terme _ Ci Chaque boite contenant 1 5 ml de milieu de croissance est ensemenc e avec 1 5 ml de liquide amniotique non centrifug Par ailleurs 2 ml de liquide amniotique sont ensemenc s dans un flacon contenant 4 ml de milieu de croissance Ce flacon constitue une s curit et ventuellement peut servir a un contr le b Croissance Les bo tes de Petri et le flacon sont mis incuber 37 C dans une tuve circuit d air CO permettant de maintenir le pH du milieu 7 3 Les bo tes sont laiss es ainsi pendant 5 jours Le milieu est alors aspir la pipette et remplac par du milieu de croissance frais Les change ments de milieu suivants ont lieu ensuite tous les deux jours D s que les premiers foyers de cellules sont suffisamment abondants en mo
54. es DOPISY VE PPSS HA KK AA GR AN AA HA LA PRATIQUE DE L ANALYSE CHROMOSOMIQUE AA AA NA AN AN AA HA HA RN KA BN AK AR HA hh AK NA GA AN A DA m MASSON LA PRATIAUE DE VAMAWEE CHROMOSOMIAUE CHEZ LE MEME EDITEUR Dans fa m me collection 1 LA PRATIQUE DE L IMMUNO LECTROPHOR SE par M KAmINSKI 1979 88 pages 34 figu res 2 LA PRATIQUE DE L ULTRACENTRIFUGATION ANALYTIQUE par G BATELIER 1979 88 pages 40 figures 3 LA PRATIQUE DU MICROSCOPE LECTRONIQUE A BALAYAGE EN BIOLOGIE par D GUILLAUMIN 1980 128 pages 51 figures 4 LA PRATIQUE DU MICROSCOPE LECTRONIQUE CONVENTIONNEL par R et J HAGEGE 1980 128 pages 28 figures 21 planches 5 INTRODUCTION A L EMPLOI DES RADIOELEMENTS EN BIOLOGIE ET EN BIOCHIMIE par S APEL GOT 1981 80 pages 32 figures 6 LA PRATIQUE DE L AGGLUTINATION DES ERYTHROCYTES ET DU TEST DE COOMBS par Ph ROUGER et Ch SALMON 1981 88 pages 22 figures 7 LE RAT DE LABORATOIRE par G Jabor 1 R actif biologique 1981 96 pages 11 figu res 8 LES M THODES DE PURIFICATION ET D ANALYSE DES PROT INES par J M Frere et Ch GERDAY 1981 128 pages 42 figures 9 LA PRATIQUE DE L LECTROPHOR SE APPLIQUEE A LA DETECTION DES POLYMORPHISMES HUMAINS par J SeGer et G LUCOTTE 1981 116 pages 63 figures 10 LA PRATIQUE DES GROUPES ET GROUPAGES ERYTHROCYTAIRES par Ph RouGer et Ch SALMON 1981 120 pages 6 figures 11 LA PRATIQUE DES AUTO ET ALLO ANTICORPS AN
55. ge Colorer par le Hoechst 33258 1 mg pour 100 mi d eau distill e pendant 15 min Rincer monter avec du SSC X 2 Placer la lame dans une bo te de Petri contenant du papier filtre recou vert de SSC X 2 Mettre la bo te de Petri sur le faisceau de lumi re mise par une lampe vapeur de mercure type HBO 200 On prendra par exemple un luminaire habituellement utilis pour la microscopie en fluorescence Afin de maintenir la lampe verticale ce qui est recommand pour son utilisation et de placer la bo te de Petri plat on interposera un miroir inclin 45 sur le trajet lumi neux Le trajet total du faisceau peut tre de l ordre de 30 40 cm On peut encore utiliser un tube fluorescent type lumi re noire moins on reux que la lampe vapeur de mercure Les lames sont alors plac es 10 cm environ du tube Plusieurs lames peuvent tre superpos es pour tre irradi es simultan ment La bo te de Petri pos e sur un fond noir mat atteindra une temp rature de plus de 50 C apr s quelques minutes d irradiation Elle sera maintenue environ 1 h sous le faisceau lumineux Rin er les lames l eau courante et colorer au Giemsa 1 5 p 100 pen dant 7 min Ce seul traitement permet d obtenir les diff rentes figures dont nous avons parl plus haut ll peut arriver que les chromosomes soient trop color s par le Giemsa Dans ce cas il suffit apr s les avoir d graiss es au tolu ne
56. hromatides est brillant existe des changes non r ciproques et des chromosomes enti rement sombres Remarquer qu un l ger marquage R persiste sur des chromosomes enti rement sombres fl ches sur les deux chromosomes 7 Mis part l int r t th orique confirmant le mode semi conservatif de la replication de l ADN et montrant la survie possible des cellules ces incorpo rations prolong es de BrdU n ont pas re u d application pratique e Marquage des chromosomes asym triques Pour analyser la posi tion des changes de chromatides il peut tre utile d induire un marquage des chromatides Plusieurs possibilit s existent coloration par la moutarde de quinacrine Latt et coll 1975 traitement thermique pour obtenir des 56 CC Oations et marquage chromosomiques bandes R Dutriliaux et coll 1974 ou traitement par le SSC X2 pendant une vingtaine d heures 58 C suivi d une coloration au Giemsa pour obte nir des bandes G Fonatsch 1979 En plus de ces m thodes il est possible de jouer sur le temps de traite ment par le BrdU de fa on obtenir un marquage li une incorporation incompl te soit lors de l avant derni re phase S comme nous l avons vu plus haut soit lors de la derni re phase S Dans cette derni re ventualit il suffit de changer le milieu de culture 7 h avant la fin et de le remplacer par un milieu normal sans BrdU Les chromosomes sont alors marqu s en bandes de type G avec u
57. i la pipette Pasteur et ensemenc directement dans le milieu 10 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques L Pr l vement veineux 5 10 ml de sang sont pr lev s la serin gue et rejet s dans un flacon contenant 100 U I d h parine sans conserva teur h parine s che Choay par exemple Le flacon a l avantage de permet tre l exp dition facile du pr l vement La mise en culture peut tre retard e de 5 jours au maximum sans affecter notablement le r sultat final Dans ces conditions le stockage ou le transport doivent avoir lieu une temp rature comprise entre 4 et 20 C Le pr l vement peut tre aussi simplement effectu la seringue h parin e 100 U I b Culture O Mat riel Les cultures sont effectu es dans des tubes de verre ou de plastique ayant une contenance de 9 10 ml Les tubes sont munis d un bouchon vis et pr sentent un m plat afin de pouvoir tre dispos s horizon talement dans l tuve Le tube Rossignol a de surcro t un fond conique ce qui permet d effectuer sans transvasement toutes les op rations de centrifu gation O Milieu de culture Chaque tube est rempli avec le milieu suivant TC 199 avec antibiotiques p nicilline 100 U l ml streptomycine 100 ng ml 6 ml s rum humain 2 ml h parine 100 U I phytoth maglutinine PHA C I B F ou PHA P Difco 0 05 ml Dans certains cas particuliers
58. i mettent en vidence des structures que l on ne peut int grer dans les deux grands syst mes de ban des Q ou G et R a Bandes C Centrom re Coloration de l h t rochromatine consti tutive L R f rences Elles sont assez nombreuses citons Arrighi et Hsu 1971 Craig Holmes et Shaw 1971 Yunis et coll 1971 Summer 1972 Technique Celle que nous d crivons est une l g re modification de celle de Sumner et donne des r sultats r guliers Les lames sont plong es dans HCI 0 2N pendant une heure la temp ra ture ambiante rinc es l eau distill e et trait es pendant 30 secondes une minute dans une solution d hydroxyde de baryum 0 3N 50 C Elles sont rinc es l eau distill e puis plong es dans une solution de SSC X 2 NaCl 0 3 M citrate trisodique 0 03 M a 60 C pendant une heure Apr s un nouveau rin age l eau distill e les lames sont color es au Giemsa pendant 5 minu tes R sultats fig 10 Les chromatides sont uniform ment pales l observation est de pr f rence faite en contraste de phase seules apparais sent fortement color es les r gions centrom riques les constrictions secon daires et la partie distale du bras long de l Y Des chromatides trop color es et par cons quent un mauvais con traste des bandes C indiquent un traitement insuffisant par l hydroxyde de baryum il y a lieu de le prolonger de 30 secondes environ Inversement des chr
59. idine orange 50 Colorations et marquage chromosomiques Fig 17 Cellule f minine ayant incorpor le BrdU pendant la totalit de la phase S sauf sa p riode toute terminale 4 derni res heures de culture Coloration l acridine orange Les r gions h t rochromatiques et les plus tardives des bandes G sont seules bril lantes L X de replication tardive Xt pr sente plus de bandes brillantes que l X pr coce Xp Applications a Mise en vidence des segments de r plication tr s tardive segments h t rochromatiques iJ Pulse terminal fig 16 Le BrdU est ajout au milieu pendant les 4 derni res heures de culture Une fraction importante des cellules envi ron la moiti montre une longation caract ristique de certains segments qui mettent une fluorescence rouge sombre tandis que le reste des chro matides met une fluorescence vert brillant Marquage avec traitement des cellules vivantes 51 Fig 18 Cellule f minine ayant incorpor le BrdU pendant les 7 derni res heures de culture Coloration l acridine orange Les bandes G ainsi que l X tardif X sont sombres les bandes R autosomiques et celles de I X pr coce X brillantes J Pulse pr coce fig 17 Le BrdU est plac dans le milieu durant la nuit soit environ 14 15 h Le milieu est ensuite remplac par un milieu sans BrdU o les cellules sont laiss es pendant 4 h Le changement de m
60. ilieu s effectue apr s centrifugation pour les cultu res de cellules sanguines et par transvasement et pipetage pour les cultures de fibroblastes Un ou deux rincages sont n cessaires avant de mettre le milieu final Les manipulations doivent tre effectu es aussi vite que possible avec des milieux 37 C tout refroidissement excessif tendant ralentir le cycle cellulaire 52 Colorations et marquage chromosomiques Fig 19 Cellule ayant incorpor le BrdU seulement pendant la premi re moiti de la phase S la deuxi me moiti 7 derni res heures de culture s tant d roul e en milieu normal Coloration l acridine orange Les bandes G et les r gions h t rochro matiques sont brillantes les bandes R sont sombres Les mitoses ont des aspects h t rog nes en raison des vitesses diff rentes des cycles cellulaires Une large proportion toutefois se caract rise par la faible fluorescence jaun tre de l ensemble des chromosomes l exception des segments qui n avaient pas encore effectu la r plication de leur ADN au moment du rin age Ceux ci mettent une fluorescence vert brillant Une forte irradiation U V est souvent n cessaire pour obtenir une bonne diff renciation arrive fr quemment qu aucun marquage ne soit d celable au d but de l observation sous lumi re U V b Diff renciation des segments euchromatiques de r plication tardive et pr coce O Pulse terminal fig 18 Tra
61. in en mise au point permis par l exposition plus courte ne compensant pas la mauvaise r solution de ces films haute sensi bilit Afin que le film recoive le plus de lumi re possible il faut que le micros cope soit pourvu d un dispositif permettant apr s la mise au point le renvoi de la totalit de l image fluorescente vers le film La fin de l exposition est d clench e manuellement ou automatiquement selon les mod les Les dur es d exposition sont de l ordre de 3 minutes pour la moutarde de quina crine et les bandes T color es par l acridine orange de l ordre de la minute pour les pr parations ayant incorpor le BrdU color es aussi par l acridine Le tirage est fait sur papier KODABROM ou quivalent en g n ral de format 18 x 24 cm Les n gatifs sont agrandis 7 fois environ ce qui donne un agrandissement final de 2 800 fois Pour les images en lumi re ordinaire on utilise la gradation G2 normal pour la fluorescence et coloration par l acridine orange G3 et pour la coloration par la moutarde de quinacrine G5 plus dur las Nenenclakuce La nomenclature actuellement utilis e dans la plupart des laboratoires a t d finie et pr cis e au cours de multiples r unions d experts Denver 1961 Chicago 1966 Paris 1971 Stockhoim 1977 L essentiel des r gles adopt es a t regroup en un volume ISCN 1978 Seule la nomenclature des chromosomes en prophase ou prom ta phase fait l objet d un
62. it comporter une turbine d agitation et pouvoir maintenir la temp rature un degr pr s Les lames sont plong es dans la solution pendant des temps variables selon leur fraicheur des pr parations tal es le jour m me seront trait es entre 1 et 2 heures des pr parations de 8 jours entre 15 et 45 minu tes A la fin du traitement les pr parations sont rapidement rinc es l eau courante et color es au Giemsa L observation microscopique au fort gros sissement et la photographie sont faites en contraste de phase avec un filtre orange la coloration tant en effet normalement assez p le R sultats fig 8 Les chromosomes pr sentent une alternance de bandes sombres et claires dont la topographie est r ciproque de celle des bandes Q ou G les bandes color es sont celles qui taient sombres avec la moutarde de quinacrine Un aspect g n ral trop color entra nant l apparition de points r frin gents en contraste de phase est le t moin d un traitement thermique insuffi sant Il est possible dans ce cas apres d graissage au tolu ne de replonger la lame dans le bain de d naturation sans d coloration pour prolonger le traitement La coloration habituelle est ensuite nouveau effectu e Inverse ment des chromosomes tr s p les ne pr sentant que peu de bandes indi quent un traitement trop prolong Au lieu d employer le Giemsa il est possible d effectuer une coloration l acridine orange et d ob
63. iter durant les 6 7 derni res heures 6 AO IA TT 1 16 BEE F T meak m S E een wees EEE Li a a s HAX ia f jl xi eae es 6l LA saii AS Oil moe Wwe eco li u gS AL Witz Pee ie ok E Uarra at Mn t et ent Bile A BTE Ell 8l ma a et k ma 4 He i mo fi Wie TO m 1X iT Le zt x ee UE i hag Carte de la chronologie de la r plication des bandes autosomiques RTE NOM me Nm Eur LS de piel ALES Fig 20 lication pr ep r 18 groupes de r plication ont t d finis chiffres romains le groupe tant le plus pr coce le groupe XVIII le pius tardif Les bandes R a g der font de r plication tardive 1 coce font partie des groupes IX les bandes G a d partie des groupes IX XVIIL 54 Colorations et marquage chromosomiques de culture Tous les segments correspondant aux bandes G et a l h t rochro matine s tant repliqu s en pr sence de BrdU mettent une fluorescence rouge sombre Les bandes R restent vert brillant C est donc un marquage R qui appara t Dans les cellules femelles la distinction entre les deux chromosomes X est tr s ais e l un tant de r plication tardive met presque enti rement une fluorescence faible et rouge tre L autre de r plication pr coce se com porte comme un autosome C Pulse pr coce fig 19 Traiter par le BrdU dur
64. itrate trisodique 0 03 M pendant une heure a 60 C Rincer a l eau distill e et colorer 1 heure 30 dans une solution de Giemsa 2 tamponn e pH 6 8 Trypsine Seabright 1971 Plusieurs auteurs ont propos depuis de l g res modifications de cette technique prot olytique mais le principe demeure le m me On pr pare une solution de trypsine 0 25 trypsine 1 250 Difco dans du NaCl isotonique ou mieux dans du PBS modifi sans calcium ni magn sium NaCl 8 000 mg l KCI 200 mg l NaH PO 2H 0 1 440 mg l KH PO 200 mg l A Colorations et marquage chromosomiques FE 4 2 3 6 7 8 9 10 A h E p k 11 12 13 14 15 i yY d 16 17 18 a 4 LEE a a i 19 20 21 22 Fig 7 Bandes G Coloration au Giemsa Caryotype masculin Les lames sont plong es pendant 10 45 secondes dans cette solution la temp rature ambiante rin es au NaCl isotonique ou au PBS et color es au Giemsa Cette technique prot olytique est l une des m thodes de mar quage les plus employ es actuellement CL R sutats fig 7 Les chromosomes pr sentent une alternance de bandes sombres et claires dont la topographie est identique a celle des ban des Q les bandes color es sont celles qui taient tr s brillantes avec la mou tarde de quinacrine Cependant des diff rences existent au niveau des r gions h t rochromatiques c Bandes R Reverse R f rences Dutrillaux et Leje
65. itu et autoradiographie Techniques de marquage 0 Marquage de l euchromatine c 005 dsce eer sneecmaae evn dinde Marquage de l h t rochromatine Obtention de plusieurs marquages sur BS m mes pr parations mie M thodes de marquage faisant intervenir un traitement des pullnies vivantes Incorporation de la thymidine triti e M thodes de traitement par le BrdU 1 Traitement par l actinomycine D 2 Traitement par la 5 azac ytidine ahd hea Goa ane ea Ree Oe ae estes 3 Techniques d obtention et de marquage des cellules en prophase ou prom taphase ms on Synchronisation par la thymidine Synchronisation par l am thopt rine Marquage des cellules en prophase ou prom taphase Synchronisation par la thymidine et incorporation de BrdU Synchronisation par le BrdU CCC anean n yuy gary gmu M agU p ANOO N a ma Lea 16 d R SSSR RSEQSVRA RB R R R 8B Bv 4 Examen de la chromatine sexuelle Corpuscule X corps de Barr Corpuscule Y 5 Donn es g n rales sur l observation microscopique et la micro photographie
66. lles Les tubes sont ensuite nouveau remis l tuve pour 7 minutes C Fixation Le milieu hypotonique est d cant par centrifugation et le surnageant rejet par aspiration la pipette Pasteur toutefois une hau teur de 2 mm de milieu est laiss e au dessus du culot qui est d licatement remis en suspension dans ce faible volume Le premier fixateur est alors ajout fixateur de Carnoy thanol absolu 6 vol chloroforme 3 vol acide ac tique 1 vol tous les r actifs sont du degr de puret pour analyses Dans un premier temps les cellules sont remises en suspension dans seulement 1 ml de fixateur environ puis le tube est enti rement rempli La dur e de cette premiere fixation est de 20 minutes Les tubes sont alors centrifug s et le premier fixateur rejet Ils sont remplis moiti avec le deuxi me fixateur thanol ac tique thanol absolu 3 vol acide ac tique 1 vol La dur e de cette seconde fixation est de 15 minutes au moins mais peut tre prolong e sans inconv nient permettant ainsi si besoin de diff rer l talement d un jour l autre Etalement Les lames auront t pr par es au pr alable de la facon suivante des lames tr s propres sont frott es une une entre le pouce et l index sous l eau courante de fa on ce qu un film d eau puisse se main tenir parfaitement dessus Elles sont ensuite plac es dans un B cher d
67. llules ammiotiques Techniques de culture Les types cellulaires partir desquels les caryotypes sont le plus souvent tudi s sont les lymphocytes et les fibroblastes Chacun requiert des condi tions de culture particuli res Les m thodes de culture sont extr mement nombreuses celles que nous d crirons sont celles qui nous paraissent don ner les r sultats les meilleurs et les plus reproductibles Lymphocytes Depuis la d couverte des propri t s mitog niques de la phytoth mag glutinine PHA les lymphocytes par la simplicit de leur pr l vement sont le mat riel de choix pour l obtention des pr parations chromosomiques La technique d crite est d riv e de celle de Moorhead et coll 1960 La culture peut tre effectu e apr s isolement des lymphocytes toutefois ce proc d ne para t pas am liorer la qualit des pr par tions chromosomiques ainsi dans la technique habituelle on ensemence le sang total a Pr l vement Deux modes de pr l vement peuvent tre em ploy s chez le nourrisson le micro pr l vement de sang capillaire chez l adulte le pr l vement veineux Dans tous ler cas ce GE doit tre bien entendu effectu st rilement 1 Micro pr l vement de sang sapillare Une pulpe digitale ou le talon est d sinfect l alcool 70 puis l ther Apr s s chage une scari fication est effectu e l aide d un vaccinostyle st rile Le sang est recueill
68. loy es sont d riv es de la technique originale de Gall et Pardue 1971 citons Saunders et coll 1972 Jones 1973 Sanchez et Yunis 1974 Pardue et Gall 1975 Gosden et coll 1975 Steffensen 1977 E Technique Pr parations chromosomiques d une fa on g n rale il n est pas n cessaire d employer des m thodes de fixation particuli res pour les pr pa rations destin es I hybridation in situ On utilisera seulement de pr f rence des lames fra ches Des techniques de marquage non agressives pour la structure chromosomique comme une coloration par la moutarde de quina crine ou par l acridine orange apr s incorporation de BrdU peuvent tre effectu es avant l hybridation pour permettre une bonne reconnaissance des chromosomes Le colorant est limin ensuite par rin age prolong l eau courante Le s chage se fait spontan ment l air Elimination de l ARN l ARN cellulaire risquant d entrer en comp ti tion avec la sonde marqu e est limin par un traitement des lames par la RN ase 100 ug ml pendant une heure 37 C Cette tape est fr quem ment omise en particulier elle n est pas n cessaire lorsque l on tudie des s quences d ADN satellites puisque celles ci ne sont pas transcrites Elimination des prot ines et d naturation de l ADN chromosomique les m thodes de d naturation varient beaucoup selon ies auteurs Essentiel lement trois types de proc d s sont em
69. main 75280 Paris Cedex 06 D p t l gal 3 trim 1981 Imprim en France 4160 Imprimerie Bayeusaine 6 12 rue Royale 14401 Bayeux D p t l gal n 4545 3 trim 1981 Au cours de la derni re d cennie l analyse chromoso mique a t totalement r nov e tant pour ce qui concerne les techniques utilis es que pour les applications innombra bles qui en ont d coul Les auteurs ont grandement initi cette r volution technologique mettant au point personnellement bon nombre des m thodes expos es dans cet ouvrage Cette position privil gi e leur permet d en indiquer tous les d tails toujours si importants lors de l application de tech niques quelque peu d licates B Dutrillaux Ma tre de Recherche au CNRS et J Cou turier Charg de Recherche au CNRS travaillent l Insti tut de Progen se Universit Ren Descartes ISBN 2 225 74052 6
70. mbreuses exceptions et de nombreuses vari t s de coloration de l h t rochromatine Marquage de l euchromatine a Bandes Q Quinacrine C R f rence Caspersson et coll 1970 O Technique Elle est voisine de celle utilis e pour l acridine orange Les lames sont pass es dans des bains successifs d thanol de titre d gressif rinc es l eau distill e puis plong es pendant 5 minutes dans un bain de tampon phosphates pH 6 7 La coloration est faite dans une solution de moutarde de quinacrine raison de 5 mg 100 ml dans de l eau distill e durant 20 minutes Les lames sont rin es par passage dans un nouveau bain de tampon phosphates et mont es avec une lamelle dans le m me tampon 32000 Colorations et marquage chromosomiques Fig 5 Coloration par la moutarde de quinacrine bandes Q Caryotype masculin Remarquer la fluorescence particuli rement intense du bras long de l Y et de cer taines autres r gions h t rochromatiques comme la r gion p ricentrom rique du 3 L observation est faite au microscope en fluorescence Le pic d absorption de la quinacrine s tale de 430 460 nm le pic d mission de 480 530 nm environ Les combinaisons de filtres employ es sont les suivantes Type de filtres Excitation Arr t Verre color BG 12 50 Interf rentiel BP 436 8 LP 475 L R sultats fig 5 Les chromosomes pr sentent une alternance de bandes sombres et brillantes dont la s qu
71. men se fait au microscope en fluorescence Le pic d absorption de l acridine orange se situe aux environs de 470 nm il existe deux pics d mis sion l un 530 nm l autre 650 nm On peut employer des combinaisons de filtres d excitation et d arr t soit avec verres color s soit avec filtres interf rentiels Type de filtres Excitation Arr t Verre color BG 12 50 65 Interf rentiel BP 450 490 BP 520 560 d nominations allemandes Plus amples indications pratiques sur la microscopie de fluorecence seront donn es plus loin R sultats Les chromosomes pr sentent une fluorescence homo g ne jaune vert Comme nous l avons dit cette technique employ e seule ne pr sente pas d int r t en pratique mais sera utilis e pour certaines techni ques de marquage Par ailleurs appliqu e sur des noyaux interphasiques cette coloration permet de mettre en vidence les nucl oles fluorescence rouge et le corpuscule de Barr dans les cellules femelles jaune vert brillant c Coloration de Feulgen La coloration de Feulgen n est pas utilis e de fa on courante en cytog n tique elle est en effet de mise en uvre rela tivement complexe et ne donne pas pour la simple coloration des chromoso mes des r sultats sup rieurs aux colorants moins sp cifiques dont nous venons de parler Par contre sa sp cificit pour l ADN d ailleurs discut e fait qu elle peut tre int ressante dans des cas particuliers q
72. mes sont incub es 96 C dans une solution molaire de Na H PO ajust e pH 4 2 avec de la soude normale pendant 15 minutes Elles sont ensuite abondamment rinc es l eau distill e et color es pendant 20 minutes dans une solution de Giemsa 4 p 100 dans du tampon phosphates 1 15 M pH 7 Elles sont enfin rinc es l eau courante et s ch es l air Li R sultats Les chromatides sont dans l ensemble assez pales seules sont color es les r gions porteuses de l ADN ribosomique chez l homme les bras courts des acrocentriques quoique la technique colore plus probablement des prot ines chromosomiques que l ADN Coloration par le nitrate d argent O R f rence Bloom et Goodpasture 1976 C Technique Deux m thodes peuvent tre employ es l une est directe l autre suivie d une tape de r v lation Technique directe elle pr sente l avantage d tre plus simple de don ner une coloration plus homog ne sur la lame par contre le contraste est souvent faible Elle consiste simplement recouvrir les lames avec une solu tion de nitrate d argent 50 p 100 dans l eau distill e Couvrir par une lamelle et mettre en chambre humide pour viter la dessication durant 4 heures 50 C ou 15 heures 37 C Au bout de ce temps les lames sont rinc es l eau distill e s ch es et peuvent tre observ es Si le contraste des chro Techniques sur pr parations fix es 2 43
73. midine L incorporation de BrdU dans l ADN s effectue toujours au cours de la r plication Pour l instant seule incorporation au cours de la synth se programm e ou phase S a donn des r sultats Le BrdU dont la formule est la suivante O Br HN N d soxyribose 48 Colorations et marquage chromosomiques est incorpor la place de la thymidine dans des proportions qui d pendent de la dose utilis e Il n est incorpor qu en substitution de la thymidine exo g ne non synth tis e par la cellule de sorte que le taux de substitution sem ble tre toujours inf rieur 20 p 100 Le rendement peut toutefois tre aug ment si la voie de synth se endog ne de thymidine est bloqu e ou ralentie C est ce qui peut tre r alis par l adjonction de FudR 5 fluorod oxyuridine Bell et Wolff 1966 L incorporation de BrdU est assez rapide et des traite ments brefs de l ordre d une heure entrainent d ja un effet d celable La modification chromosomique induite est g n ralement assez faible C est pourquoi la m thode n est devenue applicable que du jour o cet effet a t potentialis d abord par des colorants acridine orange Dutrillaux et coH 1973 Hoechst 33258 Latt 1973 puis par des traitements suivis d une coloration au Giemsa Perry et Wolff 1974 Korenberg et Freedlender 1974 b Conditions du traitement par le BrdU Il peut intervenir pendant des temps variant entre un
74. mosomes est faible il est possible de faire une coloration au Giemsa 2 p 100 pendant 15 secondes Technique avec r v lation trois solutions doivent tre pr par es au pr alable solution d AgNO 50 p 100 dans l eau distill e solution de nitrate d argent ammoniacal AgNO 4g Eau distill e l 5 ml NH 0H 28 p 100 5 ml Agiter jusqu disparition du pr cipit solution de formol Fig 13 Mise en vidence des r gions porteuses des organisateurs nucl olaires NOR Coloration l argent 44 Colorations et marquage chromosomiques Pr parer une solution de formol 3 p 100 3 ml de solution de for mald hyde a 30 p 100 dans 97 ml d eau distill e Amener pH 7 sous pH m tre par addition de cristaux d ac tate de sodium puis ajuster pH 4 5 par quelques gouttes d acide formique Les lames sont recouvertes de la solution d AgNO 50 p 100 et d une lamelle et mises incuber 15 minutes 50 C en chambre humide Elles sont ensuite rinc es l eau distill e et s ch es Puis chaque lame est recouverte de 4 gouttes de la solution de nitrate d argent ammoniacial et de la m me quantit de formol On recouvre d une lamelle L volution de la coloration est d s lors surveill e sous microscope On assiste au bout d un temps de l ordre de la minute un brunissement des noyaux interphasiques et des chromosomes La coloration est interrompue par rin age l ea
75. ne dose de BrdU de 10 yg par mi dans du milieu TC 199 20 p 100 de s rum on d nombre en moyenne autour de 8 SCE par cellule ce qui signifie qu il s est produit une moyenne de 4 SCE par cycle Des taux plus fai bles peuvent tre mis en vidence en baissant la dose de BrdU Il semble qu on ne puisse gu re descendre en dessous de 2 3 SCE par cellule La sur venue des SCE semble li e au processus de r paration de l ADN Leur analyse est devenue l une des m thodes les plus utilis es pour tester l effet des mutag nes Perry et Evans 1975 Latt et coll 1975 L Technique n vitro il suffit de mettre 10 g de BrdU par mi de milieu pendant une trentaine d heures Les colorations sont les m mes que pour les traitements plus brefs Chez l animal des traitements n vivo peu vent tre effectu s existe ainsi des implants que l on peut placer dans le tissu sous cutan On peut encore r aliser une perfusion et injecter le BrdU en solution la dose d sir e calcul e en fonction du poids de l animal Pour des animaux petits ou vivant en milieu liquide on peut faire ing rer le BrdU Mis part la perfusion qui peut tre dos e pr cis ment il faut savoir que les traitements sur le vivant aboutissent des fluctuations de la dose de BrdU et de grandes pr cautions doivent tre prises pour l interpr tation du taux de SCE Signalons enfin que si le traitement ne recouvre pas int gralement les deux ph
76. ne forte coloration de l h t rochromatine une diff rencia tion des X de replication pr coce et tardive et les changes de chromatides peuvent tre localis s Dutrillaux 1975 b f Diff renciation des segments chromosomiques en fonction de leur richesse en bases A T ou G C En tant qu analogue de la thymidine le BrdU peut tre incorpor proportionnellement la richesse en ce nucl otide dans un chromosome donn CT Asym trie du chromosome Y humain et de quelques autres seg ments h t rochromatiques Chez l homme l incorporation de BrdU durant la seule derni re phase S induit un aspect asym trique de l Y des bras courts des acrocentriques et des constrictions secondaires des chromo somes 1 et 16 Ceci d abord reconnu pour l Y a t interpr t comme r sultant d une distribution in quitable de la thymine et de l ad nine sur l un et l autre brins de la mol cule d ADN Latt et coll 1974 Chez la souris le m me aspect d asym trie tait reconnu peu pr s en m me temps au niveau de toutes les r gions juxta centrom triques Lin et coll 1974 Ces asym tries sont assez faciles d tecter en utilisant diff rents colo rants Hoechst 33258 Giemsa Angel et Jacobs 1975 ou acridine orange 1 Mise en vidence de l h t rochromatine riche en G C Le traite ment par le BrdU durant toute une phase S montre clairement chez certai nes esp ces une incorporation relativement fai
77. ns d finitives et am liore le marquage de certaines mitoses Synchronisation par le BrdU Le 5 bromod oxyuridine forte dose induit le m me blocage que la thymidine et le m thotrexate en milieu de phase S En utilisant cette pro pri t et la modification chromatidienne r sultant de son incorporation dans les bandes R qui effectuent leur replication avant le blocage on obtient apr s coloration par l acridine orange ou technique FPG un tr s beau mar quage G des prophases et prom taphases Dutrillaux et Viegas P quignot 1981 L Principe A une culture de cellules sanguines on ajoute pendant une nuit 15 h environ du BrdU forte concentration Apr s rin age les cel lules sont remises dans un milieu normal R sultats La figure 26 montre une mitose en prom taphase mar qu e en bandes G apr s coloration FPG Ce type de mitose est nettement pr pond rant Toutefois il semble exister d autres points de blocage du cycle cellulaire de sorte qu une petite partie des mitoses porte un autre mar quage Ainsi un second aspect observe correspond un Marquage R typique dont la figure 27 donne un apercu Ceci correspond vraisemblablement un blocage en fin de phase S de cellules qui se trouvaient en milieu de phase S au moment o le traitement par le BrdU a t commenc Le troisi me aspect correspond un marquage de l h t rochromatine et des bandes G les plus tardives Il est semblable celui in
78. o lle 1 Pr l vement La mo lle est pr lev e au trocart de Mallarm comme pour un examen h matologique un pr l vement de 0 5 ml est suffi sant C Ensemencement Les tubes employ s sont identiques ceux uti lis s pour la culture des lymphocytes d crite pr c demment Ils sont remplis avec le m me milieu que pour celle ci en omettant simplement d ajouter de la PHA Trois tubes seront ensemenc s chacun par 0 1 ml de mo lle imm diatement apr s le pr l vement l un comportant de la colchicine la con centration habituelle est destin l examen direct un autre sera mis l tuve durant 24 heures 37 C le dernier durant 48 heures O R colte des cellules Dans chaque cas les cellules sont r colt es apr s deux heures de traitement par la colchicine selon la technique d crite pour les lymphocytes Les r sultats sont variables selon les patients c est la raison pour laquelle il est n cessaire de pr voir trois tubes r colt s a des moments diff rents En moyenne c est la culture de 24 heures qui donne les mitoses les mieux analysables b Etude du sang p riph rique Dans les cas o existent des cellules blastiques circulantes il est utile de faire un examen partir du sang p riph rique Celui ci pr sente en effet deux avantages les mitoses observ es con trairement a celles de la mo lle sont coup s r pathologiques d autre part leur qualit est souvent meilleur
79. omosomes tr s p les pratiquement sans marquage indiquent un traite ment trop long par l hydroxyde de baryum b Bandes CT R f rence Scheres 1976 Technique Les lames sont plac es dans une solution satur e de Ba OH 60 C pendant 10 minutes Elles sont rinc es l eau distill e puis mises incuber dans une solution de SSC X 2 60 C pendant 30 minutes Techniques sur pr parations fix es 39 Fig 10 Bandes C Coloration au Giemsa Apr s rin age a l eau distill e les lames sont color es pendant 10 minutes dans une solution 0 005 p 100 de Stains all Serva 4 5 4 5 dibenzo 3 3 diethyl 9 methyl thiacarbocyanine bromide dans un m lange 1 1 formamide eau Elles sont enfin rinc es l eau distill e et s ch es R sultats Les bandes C et les bandes T sont color es simultan ment c Coloration de r gions portant certains types d ADN satellite cons triction secondaire du 9 en particulier R f rences Gagn et Laberge 1972 Bobrow et coll 1972b Technique Les deux techniques sont tr s voisines Celle de Bobrow est la plus simple et consiste a colorer les lames pendant 8 minutes dans une solution de Giemsa 2 p 100 amen e pH 11 par addition de 40 Colorations et marquage chromosomiques a aj o og a BTG ni t A p ma i3 Li f h j es a 4 3 3 1 2 3 4 5 hy
80. on peut tre amen a employer d autres lectines mitog nes concanavaline A pokeweed mitogen O Mise en culture Le sang total est ensemenc a raison de 0 6 ml par tube chez l adulte ou 0 4 mi chez l enfant Les tubes sont plac s hori zontalement a I tuve 37 C L incubation a lieu en r gle durant 72 h mais peut tre prolong e 24 h de plus sans inconv nient Elle peut tre raccourcie galement de 24 h si l on veut analyser les mitoses de premi re g n ration Dans ce cas la quantit de mitoses recueillies est beaucoup moindre c R colte des mitoses C Accumulation des m taphases Deux heures avant la fin de la culture les divisions sont arr t es par l addition dans chaque tube de 0 1 mi d une solution de colchicine 4 pg mi Les tubes sont remis l tuve a 37 C O Traitement hypotonique A la fin du traitement par la colchicine les tubes sont centrifug s 5 min a 400 g comme pour toutes les centrifuga tions suivantes Le surnageant est rejet par aspiration la pipette Pasteur et les tubes sont alors remplis du milieu hypotonique suivant maintenu a 97 6 Techniques de culture 17 s rum humain 1 vol eau distill e 5 vol D autres laboratoires pr f rent employer comme solution hypotonique le KC 0 075 M Le culot est soigneusement remis en suspension par aspira tion et refoulement la pipette Pasteur munie d une t tine sans provoquer la formation de bu
81. peut tre n cessaire de faire plusieurs essais pour ajuster les temps Synchronisation par l am thopt rine Dans les cultures de cellules sanguines l am thopt rine est ajout e apr s 72 h la concentration finale de 107 M Yunis 1976 Apr s une nuit environ 15h le milieu est remplac apr s rincages comme pour la thymi dine par un milieu normal pendant 5 7 h Marquage des cellules en prophase ou en prom taphase Les prom taphases et prophases obtenues par les m thodes de synchronisation sont ensuite trait es pour obtenir un marquage comme s il s agissait de mitoses ordinaires Pour obtenir des bandes R il faut faire un traitement thermique un peu plus court que pour les m taphases 64 Techniques d obtention et de marquage 20 21 22 Fig 25 Prom taphase en bandes R obtenue apr s synchronisation par la thymidine et incorporation de BrdU durant les 7 derni res heures Coloration par l acridine orange L X de replication tardive est droite J Variantes pour l obtention des bandes G Yunis et coll 1978 obtiennent des bandes G sans pr traitement par simple coloration des pr parations par le colorant de Wright Celui ci est pr par ainsi 1 volume de la solution m re a 0 25 p 100 dans du m thanol est dilu dans 3 volumes de tampon phosphates 0 06 M pH 6 8 Les lames sont color es pendant 3 mn 3 mn 30 Francke et Oliver 1978 recommandent un pr traitement des pr para
82. ploy s traitement alcalin par NaOH 0 07 N pendant 2 minutes la temp rature ambiante Gall et Pardue 1971 traitement acide par HCI 0 2 N pendant 30 minutes la temp rature ambiante ou traitement par une solution SSC formamide haute temp rature San chez et Yunis 1974 De toutes ces m thodes il semble que ce soit le trai ment acide par HCI 0 2 N qui donne les meilleurs r sultats cytologiques apr s recoloration des chromosomes Les lames sont ensuite rapidement d shy drat es par passage dans des bains d thanol 50 70 90 et absolu et enfin s ch s l air Variante pour les chromosomes ayant incorpor du BrdU il est possible de d naturer sp cifiquement les segments chromosomi ques ayant incorpor le BrdU en effectuant tout d abord une coloration par acridine orange puis une irradiation ultra violette sous le microscope per mettant de rep rer et de photographier les mitoses enfin une d naturation thermique 30 a 60 secondes dans la solution de Earle pH 6 5 a 87 C Les pr parations sont ensuite d shydrat es comme ci dessus Couturier et coll 1981 BrdU 5 Bromod oxyuridine SSC NaCl 0 15 M citrate trisodique 0 015 M Techniques sur pr parations fix es 23 Hybridation 40 pl de la solution contenant la sonde marqu e dilu e dans SSC X 2 sont d pos s sur chaque lame Si cette sonde est un ADN elle est d natur e au pr alable par incubation au bain marie 100 C pen
83. pour l obtention de stades pachyt nes Pour am liorer la dispersion des chromosomes des cellules au stade pachyt ne durant lequel les chromosomes montrent spontan ment des structures caract ristiques plusieurs auteurs ont propos des variantes techniques Nous d crirons celle propos e par Luciani et coll 1975 placer les fragments biopsiques dans une solution de KCI 0 44 p 100 et les laisser ainsi durant 8 10 heures la temp rature ambiante transf rer les fragments dans du fixateur compos d alcool m thyli que 3 vol et d acide ac tique 1 vol o ils s journeront 12 18 heures avant de les y dilac rer r cup rer la suspension pour la centrifuger rediluer le culot dans de l acide ac tique glacial dilu 45 p 100 et centrifuger imm diatement avant de proc der l talement du culot remis en suspension dans quelques gouttes de surnageant L Marquage des cellules germinales Le marquage et la coloration des cellules germinales ne pr sente aucune difficult particuli re Toutefois la qualit des chromosomes tant en g n rale assez pauvre les r sultats obtenus ne sont pas aussi beaux que pour les cellules somatiques Les tech niques utilisables sont strictement superposables celles utilis es pour les cellules somatiques qui seront d crites plus loin D apr s notre exp rience les marquages en bandes C et T donnent des r sultats tr s reproductibles Les
84. quage chromosomiques d mission a 450 nm le choix des filtres d excitation et d arr t doit tre fait en cons quence La principale difficulte de la technique r side dans extinc tion rapide de la fluorescence pendant l irradiation UV Celle ci semble att nu e par un s jour des lames d une quinzaine d heures au r frig rateur apr s la coloration Ce fait a t observ aussi pour d autres fluorochromes R sultats Les chromatides sont dans l ensemble tr s peu fluo rescentes par contre les r gions h t rochromatiques des 1 9 et 16 le bras court du 15 et la r gion distale de l Y sont tr s brillants fig 12 Certains cen trom res sont aussi relativement fluorescents Apr s irradiation prolong e les r gions brillantes tendent s effacer et appara t un marquage de type Q interpr t comme tant li la fluorescence propre du DAPI e Coloration des r gions porteuses des organisateurs nucl olaires NOR Ces r gions peuvent tre mises en vidence par deux types de m thodes m thodes de d naturation bandes N et m thode de pr cipi tation argentique Bandes N C R f rence Funaki et coll 1975 O Technique La technique initiale faisant intervenir en traitement des pr parations par l acide trichlorac tique et l acide chlorhydrique a chaud a t modifi e Celle que nous d crivons ci dessous donne d apr s les auteurs de meilleurs r sultats Les la
85. que est variable avec age des lames Il est peu pr s du m me ordre que pour les bandes R Apr s rin age l eau courante les lames peuvent tre soit color es simplement au Giemsa soit mieux color es l acridine orange et observ es en lumi re ultra violette Dans ce cas on omet l tape de la r hydratation par les alcools C R sultats fig 9 Apr s Giemsa en contraste de phase les mito ses apparaissent tr s p les et les chromosomes pr sentent seulement quel ques bandes color es situ es pour la plupart leurs extr mit s Particuli rement marqu es par exemple sont les extr mit s du bras court des 4 7 du bras long des 8 9 17 Quelques bras courts d acrocentriques peuvent tre aussi intens ment color s il s agit de segments dont les variations sont sans incidence pathologique 38 Coforations et marquage chromosomiques Apr s coloration l acridine orange le contraste est particuli rement bon les bandes T jaune brillant se d tachent sur le reste des chromatides rouge sombre Si le traitement thermique est insuffisant les chromosomes apparais sent trop color s et un grand nombre de bandes R persistent Pour ce marquage comme pour les bandes R il semble que les pr para tions obtenues apr s choc hypotonique au s rum dilu d crit plus haut donnent les meilleurs r sultats Coloration de l h t rochromatine Nous pr f rons citer part ces techniques qu
86. re d tect es L utilisation d une dose plus faible de BrdU de l ordre de 5 wg par mi durant 1 2 ou 3 phases S suivie d une coloration par l acridine orange per met d obtenir un l ger marquage de type R fig 22 Dans ces conditions limites il semble donc bien y avoir une incorpora tion plus grande au niveau des bandes Q cela peut s interpr ter comme une 60 _ Colorations et marquage chromosomiques richesse plus grande en G C au niveau des bandes R mais on ne peut exclure que le marquage r sulte de la persistance d un stock de thymidine intra cellulaire incorpor au niveau des bandes R au tout d but de la r plication et rapidement puis ensuite Traitement par l actinomycine D L actinomycine D est un antibiotique qui se lie sp cifiquement aux bases G C entre lesquelles elle s intercale Sobell et Jain 1972 A forte dose elle bloque les cultures cellulaires A faible dose elle modifie simplement la struc ture des chromatides en retardant ou emp chant la condensation des ban des R Shafer 1973 Viegas P quignot et Dutrillaux 1976 b O Technique L actinomycine D est mise la concentration de 0 05 1 ug par ml pendant les 2 a 6 derni res heures de culture Le reste de la technique est identique la m thode de base Apr s coloration au Giemsa les chromosomes peu condens s au niveau des bandes R ont un marquage G souvent imparfait en raison de l atteinte incompl te des bandes R
87. re des pr parations est d licate et donne souvent lieu des interpr tations erro n es Pour les cellules en culture fibroblastes une coloration par l acridine orange cf p 25 donne une meilleure diff renciation entre le corpuscule et le reste de la chromatine et permet de localiser celui ci par rapport au nucl ole fig 28 Corpuscule Y Nous avons vu qu apr s coloration par la moutarde de quinacrine ban des Q le chromosome Y chez l homme pr sente un segment tr s fluores cent au niveau de son bras long Ce segment peut tre d tect l interphase sous la forme d un corpuscule brillant corpuscule Y Le corpuscule Y peut tre mis en vidence dans un grand nombre de tissus frottis buccaux cellu les amniotiques fibroblates spermatozo des Pearson et coll 1970 Corpuscule Y 71 Dans le cas de frottis les pr parations sont fix es 30 mn au Carnoy gout t es et laiss es s cher La technique de coloration est identique celle que nous avons d crite pour les bandes Q cf p 31 L observation en fluores cence montre un ou plusieurs corpuscules brillants accoll s ou non la mem brane nucl aire On observe dans chaque cellule autant de corpuscules Y que le sujet tudi poss de de chromosomes Y dans sa garniture chromoso mique L interpr tation des images est parfois d licate en effet on devra se m fier de la possibilit de faux positifs du fait de l existence ventuelle d
88. re sont r partis dans deux nouveaux fla cons de 25 cm ou un flacon de 75 cm2 Le milieu est renouvel deux fois par semaine 6 ml pour les flacons de 25 cm 18 mi pour ceux de 75 cm2 Lorsque la confluence est nouveau atteinte une nouvelle division de la culture est effectu e d Pr parations chromosomiques D s que l on a obtenu deux flacons de 25 cm l un peut tre destin la d termination du caryotype l autre per mettant de poursuivre la culture de la souche La r colte des cellules est effectu e de pr f rence le lendemain d un passage Un volume de 0 1 ml d une solution de colchicine 4 ng ml est ajout dans le flacon Deux heures apr s le milieu de culture est r cup r dans un tube centrifuger de 10 mi et les cellules adh rant au flacon sont trypsin es 37 C par addition d 1 mi de la solution de trypsine Lorsqu elles sont bien individualis es la suspension est reprise a la pipette Pasteur et transf r e dans le tube a centrifuger Les tapes suivantes choc hypotonique fixation talement sont exac tement identiques celles de la technique utilis e pour les lymphocytes san guins Cellules amniotiques La technique d crite est celle de Bou et coll 1979 Afin d assurer le diagnostic chromosomique d aider la diff renciation des mosa ques cons titutionnelles et des pseudo mosaiques li es des accidents de culture in vitro il est recommand d utilis
89. rs compte tenu de l intensit de ce rayonnement d excitation et de la proximit ventuelle des pics d absortion et d mission du fluorochrome il est difficile avec ce dispositif de supprimer totalement le fond sans diminuer l intensit du rayonnement de fluorescence L utilisation du fond noir devrait s imposer en transmission pour pallier cet inconv nient mais il requiert de grandes nergies d excitation qui ne sont possibles qu avec les filtres interf rentiels Observation microscopique _ OZ Syst me d excitation par r flexion ou epifluorescence Le terme de r flexion est impropre il vient du fait que les rayonnements d excitation et de fluorescence empruntent en partie le m me chemin mais en sens oppos En effet le faisceau d excitation apr s avoir t filtr est r fl chi par l inter m diaire d un miroir dichroique l int rieur de l objectif et tombe sur la face sup rieure de la pr paration Le rayonnement de fluorescence est repris par l objectif traverse le miroir dichroique et les filtres d arr t qui suppriment la fraction du rayonnement d excitation ayant pu tre diffus e dans cette direc tion Ce dispositif pr sente th oriquement plusieurs avantages l objectif agit sur le rayonnement d excitation comme un condenseur et la focalisation opti male est obtenue quand l image est au point En second lieu le rayonnement d excitation et de fluorescence cheminant en sens inverse l isol
90. rs radioactifs thymidine triti e par exemple L mulsion Il existe deux sortes d mulsions les stripping films type KODAK AR 10 et les mulsions liquides type KODAK NTB Le stripping film pr sente l avantage d avoir une paisseur constante 5 u de bien se pr ter aux tudes quantitatives et de pouvoir tre utilis au fur et mesure des besoins Son montage sur la lame est par contre assez d licat L mulsion liquide a plusieurs avantages par dilution on peut r gler son paisseur et obtenir ainsi des couches plus fines qu avec le stripping film Le contact entre le film et la pr paration est plus intime qu avec le stripping film Le rev tement de la lame est aussi plus rapide par I mulsion liquide Par contre la conservation de celle ci est limit e et de grandes pr cautions doivent tre prises pour viter la contamination R alisation des pr parations autoradiographiques Nous d cri rons ici le mode d emploi de mulsion liquide dont l utilisation tend se g n raliser Le maniement de mulsion par exemple KODAK NTB doit tre fait sous clairage inactinique lampe 15 watts avec filtre KODAK n 2 plac e au moins 1 20 m La bouteille est plac e au bain marie 45 C jusqu liqu faction com pl te 45 minutes environ L mulsion est en g n ral utilis e dilu e 50 p 100 dans l eau distill e Prendre soin d homog n iser tr s douc
91. s Prieur et al 1973 Skovby 1975 A cet gard l utilisation d un milieu compos de s rum dilu pour r a liser le choc hypotonique est un l ment important pour obtenir de longs chromosomes Cependant l obtention de cellules en prophase demeurant al atoire on a maintenant recours des m thodes de synchronisation qui permettent d atteindre le but recherch De nombreux agents sont susceptibles de bioquer une phase donn e le cycle cellulaire de fa on r versible Parmi d autres citons le fluorod oxyu ridine FudR l am thopt rine ou m thotrexate la thymidine et le 5 bromod oxyuridine BrdU Seuls les trois derniers ont t efficacement utilis s Synchronisation par la thymidine La thymidine bloque le cycle cellulaire pendant la phase S par inhibition de synth se de la 2 d oxycytidine Xeros 1962 lorsqu elle est mise en exc s dans le milieu de culture D apr s les essais r alis s avec un double traite ment de thymidine et de BrdU le blocage principal survient au milieu de la phase S soit apr s r plication de l ADN des bandes R et avant celle des bandes G Dutrillaux 1975 b Viegas P quignot et Dutrillaux 1978 Des cellules en prophase ou prom taphase 63 Ceci signifie que pour obtenir un maximum de cellules en prophase ou prom taphase il faut les r colter 5 7 h apr s la lev e du blocage L Technique Culture de cellules sanguines Viegas P quignot et Dutrillaux 1
92. s ensuite peuvent tre appli qu es ces pr parations d D termination du caryotype foetal Elle est r alis e par l analyse de quelques m taphases dans plusieurs colonies d une m me bo te et ceci dans plusieurs bo tes Techniques directes et cultures tr s court terme Dans des cas particuliers lorsque l examen porte sur des tissus sponta n ment en division l on peut obtenir des pr parations chromosomiques sans 16 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques passer par le stade de la culture ou bien en effectuant une culture tr s court terme On peut tre amen pratiquer ce genre de technique dans deux ordres de circonstances l tude de n oplasies des leuc mies en parti culier o l on analysera la mo lle osseuse et m me parfois le sang p riph ri que et l tude des cellules germinales partir de biopsies testiculaires tude des leuc mies Celle ci vise essentiellement mettre en vidence les remaniements acquis au cours du processus n oplasique Il faut insister ici sur la difficult de ces tudes li e d une part au fait que la fr quence des cellules porteuses du remaniement acquis est souvent faible et d autre part la qualit fr quem ment m diocre des m taphases anormales C est principalement dans la mo lle osseuse et en cas de my l mie dans le sang p riph rique cultiv sans mitog ne que seront retrouv es les anomalies a tude de la m
93. sans le consentement de l auteur ou de ses ayants droit ou ayants cause est illicite alin a 1 de l article 40 Cette representation ou reproduction par quelque proc d que ce soit constitue rait donc une contrefa on sanctionn e par les articles 425 et suivants du Code p nal Masson Paris 1981 ISBN 2 225 74052 6 ISSN 0240 2351 MASSON S A 120 bd St Germain 75280 Paris Cedex 06 MASSON PUBLISHING U S A Inc 133 East 58 th Street New York N Y 10022 TORAY MASSON S A Balmes 151 Barcelona 8 MASSON ITALIA EDITORI S p A Via Giovanni Pascoli 55 20133 Milano MASSON EDITORES Dakota 383 Colonia Napoles Mexico 18 DF EDITORA MASSON Do BRASIL Ltda R da Quitanda 20 s 301 Rio de Janeiro R J yeable des Introduction mati res mm nm mn ms mm 1 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques Techniques de culture Lymphocytes Fibroblastes Cellules amniotiques mm mm tm mu mm ss mn mans as mes ares ns essasresessssss RS ms mn sa Techniques directes et cultures tr s court terme tude des leuc mies mm mn Etude des cellules germinales 2 Techniques de coloration et de marquage chromosomiques Techniques sur pr parations fix es Techniques de coloration de base Hybridation in s
94. server les pr parations en fluorescence Bobrow et coll 1972a Verma et Lubs 1975 Pour ce faire les lames sortant du bain de d naturation sont directement plong es apr s un bref rin age l eau dis till e dans la solution d acridine cf p 25 Les bandes R apparaissent de couleur jaune vert les bandes G rouge sombre En r gle g n rale ce pro c d ne pr sente pas de sup riorit par rapport la coloration habituelle au Giemsa Par contre il peut permettre d obtenir un meilleur r sultat lorsque le contraste est faible du fait d un traitement thermique trop prolong Dans ce cas la lame color e au Giemsa est d graiss e au tolu ne puis d color e par immersion durant une quinzaine de minutes dans l alcool 70 rinc e l eau distill e et plong e dans la solution d acridine d Bandes T Terminales C R f rence Dutrillaux 1973 L Technique Elle est d riv e de la technique des bandes R Elle permet de caract riser certaines de ces bandes particuli rement r sistantes la d naturation Les pr parations sont plong es dans une solution de Earle sans bicarbo nate non ajust e soit pH voisin de 5 2 a 87 C Techniques sur pr parations fix es 37 Fig 9 Bandes T Coloration l acridine orange Remarquer les variations normales dans la longueur et dans la fluorescence des bras courts des chromosomes acrocentriques Ici aussi la dur e du traitement thermi
95. t de milieu de d marrage juste suffisante pour baigner les explants sans les faire flotter soit environ 0 7 ml par flacon de 25 cm Techniques de culture 13 Milieu de d marrage milieu de Eagle MEM base Hanks 80 p 100 s rum de veau foetal 20 p 100 p nicilline 100 U I ml kanamycine 100 pg ml mycostatine 100 ng ml facultatif Chaque flacon est gaz de m me que lors des tapes suivantes avec un m lange air 95 p 100 CO 5 p 100 herm tiquement ferm et mis l tuve a 37 C Au bout de deux jours les explants doivent adh rer au fond du flacon le milieu est retir et remplac par 2 ml de milieu frais Les flacons sont ensuite laiss s tels quels une semaine Le milieu est ensuite renouvel deux fois par semaine environ et d s que la multiplication cellulaire est active virage rapide du rouge de ph nol au jaune le milieu de d marrage est remplac par le milieu de croissance Milieu de croissance milieu de Eagle MEM base Earle 90 p 100 s rum de veau 10 p 100 antibiotiques comme milieu de d marrage Fr quemment la premi re pousse cellulaire partir de biopsies cuta n es est de type pith lial Il a t remarqu que bien que rarement tr s g nante celle ci pouvait tre vit e par une mise en culture diff r e des biopsies une attente de 3 4 jours 4 C dans le milieu de culture donne de bons r sultats
96. tr s nombreux colorants ont t propos s pour l autoradiographie Le plus courant reste le Giemsa La coloration est faite pendant 20 minutes dans une solution com pos e ainsi Giemsa 10 ml Tampon phosphates pH 6 7 M 15 10 ml Eau distill e 80 ml La lame est abondamment rinc e l eau courante et laiss e s cher spontan ment l air Les mitoses pr alablement rep r es sont photographi es nouveau Il est souvent possible apr s observation d enlever l mulsion sans alt rer les pr parations chromosomiques Pour cela on d graisse la lame au tolu ne puis apr s s chage on l immerge pendant un temps prolong dans un bac d eau distill e L mulsion gonfle puis tend se d coller de la lame il ne reste qu l enlever prudemment la pince Techniques de marquage Les techniques de marquage correspondent l ensemble des proc d s permettant de mettre en vidence des structures appel es bandes sur les chromosomes mitotiques ou m iotiques Ces proc d s sont tr s divers et il est difficile de les d crire selon un plan enti rement rationnel Techniques sur pr parations fix es ee 8 La premi re m thode fut bas e sur une coloration sp cifique et une observation de la fluorescence mise par les chromosomes apr s irradiation ultra violette Un second groupe de m thodes d coula du traitement thermique en milieu salin des pr parations suivi d une coloration par l
97. u distill e d s que le contraste est suffisant Cette seconde technique plus rapide et don nant souvent des marquages contrast s pr sente l inconv nient de ne pas donner une coloration homog ne sur la lame ceci est probablement d au fait que le m lange entre le nitrate d argent ammoniacal et la solution de for mol est imparfait R sultats fig 13 Ils sont peu pr s identiques ceux donn s par la technique des bandes N Les grains d argent sont situ s sur les bras courts des acrocentriques chez l homme porteurs du DNA ribosomique Les nucl oles des noyaux interphasiques portent aussi de nombreux grains Obtention de plusieurs marquages sur les m mes pr parations Nous avons vu que l ensemble des marquages chromosomiques pouvait se r soudre trois grands syst mes de bandes deux syst mes r ciproques les bandes Q ou G et les bandes R qui concernent l euchromatine et les bandes C qui repr sentent l h t rochro matine constitutive Il peut tre utile par exemple pour pr ciser les points de cassure d un remaniement localiser les centrom res d un dicentrique de pouvoir met tre en vidence toutes ces structures sur la m me mitose Ceci est possible fig 14 condition de respecter un ordre dans le d roulement des techni ques successives et de n utiliser que des lames pr par es au moins 10 15 jours plus t t L on peut commencer par effectuer une coloration classique au Giemsa
98. uand on veut d tecter lectivement cet acide nucl ique ou en faire une analyse quantita tive par spectrophotom trie C Principe Cette r action comporte plusieurs tapes Techniques sur pr parations fix es 27 En premier lieu une hydrolyse acide s pare de l ADN les bases puriques aboutissant un acide apurinique Dans un second temps les groupements aldh hydes du d soxyribose lib r s vont r agir avec la fuchsine de Schiff d color e donnant un compos de couleur magenta caract ristique R alisation La fixation au Carnoy convenant pour la r action de Feulgen on peut utiliser des lames pr par es selon les m thodes habituelles Hydrolyser par HCI N 60 C pendant 8 minutes Rincer l eau distill e Colorer dans le r actif de Schiff pendant 2 heures S cher Passer dans 3 bains successifs de 5 minutes chacun de solution sulfureuse fra chement pr par e ainsi m tabisulfite de potassium 10 5 ml eau distill e 100 ml Rincer l eau distill e Laisser s cher Q R sultats L ADN est color en rose rouge magenta d Autres colorations De nombreux colorants ont t employ s pour les chromosomes Il convient de dire que depuis la mise au point des techniques de marquage la plupart de ces techniques de coloration ont perdu beaucoup de leur int r t et ont t supplant s par le Giemsa qui est d utilisation tr s simple et qui donne des images contrast
99. une 1971 Carpentier et coll 1972 Dutrillaux et Covic 1974 Sehested 1974 Verma et Lubs 1975 L Technique interpr t e comme une d naturation m nag e des chromosomes la technique d crite par Dutrillaux et Covic 1974 et Dutril faux 1975 a consiste traiter les pr parations dans un milieu physiologique Techniques sur pr parations fix es 35 ac i ye i ic me 3 4 b Be ee g3 ae _ 4 3 y SE ve w w 8 9 10 _ ee x TA an w HH Mi 6 13 14 r 15 r s LA TE o y 8a ste eR g 18 wr i X 8 SE wk as 80 21 22 Fig 8 Bandes R Coloration au Giemsa Caryotype f minin initialement un tampon phosphates pH 6 5 87 C Elle est particuli re ment adapt e une utilisation de routine On pr pare tout d abord une solution de Earle sans bicarbonate partir des sels ou des milieux concentr s du commerce ou bien par pes es Nous donnons ici la composition de cette solution NaCl KCI NaH PO H 0 MgSO 7 H 0 glucose CaCl 6 800 mg l 400 mg l 140 mg l 200 mg l 1 000 mg l 200 mg l Cette solution de pH voisin de 5 2 est ajust e pH 6 5 sous pH m tre par addition de cristaux de Na H PO Des bacs en porcelaine d une conte 36 TC Colorations et marquage chromosomiques nance de 100 ml sont remplis de cette solution et mis au bain marie 87 C La temp rature est un param tre critique de la technique le bain marie do
100. une biopsie pour culture tissulaire 18 Techniques d obtention des pr parations chromosomiques a a Fig 1 M iose masculine diacin se a coloration au Giemsa La fl che indique le bivalent sexuel b caryotype ordonn d une diacin se apr s technique de bandes T Coloration l acridine orange tude des cellules germinales a tude directe de la m iose m le Bien qu ayant t sur un plan historique la premi re permettant l analyse chromosomique la m thode d analyse de cellules m iotiques n a pas suivie les m mes progr s que celle des chromosomes mitotiques Lj Pr l vement Biopsie ou ponction au trocart peuvent tre toutes deux utilis es en milieu chirurgical La biopsie est toutefois nettement pr f rable car les risques d h morragie sont moindres et elle permet d obtenir plus de mat riel Transport Aussi bref que possible il peut toutefois durer jusqu pr s d une heure temp rature ambiante sans inconv nient majeur Le frag ment biopsique est plac dans du citrate trisodique 1 p 100 fra chement pr par Obtention des cellules Les tubes s minif res sont dilac r s soit l aide de petits ciseaux soit avec des aiguilles mont es Cette manipulation se fait dans le milieu de transport plac dans une petite bo te de Petri ou dans un verre de montre Techniques directes et cultures tr s court terme 19 La suspension
101. yant dans des condi tions particuli res une l g re tendance faire appara tre un marquage chro mosomique elle n est pratiquement pas utilis e seule en effet elle ne donne habituellement pas de renseignements suppl mentaires par rapport la colo ration au Giemsa alors qu tant une technique de fluorescence elle est de mise en uvre plus d licate Par contre par la m tachromasie de fluores cence de acridine orange et sa bonne sp cificit cette coloration est une _ technique de choix pour r v ler les marquages induits par certains traite ments pr alables 1 Technique Couturier et coll 1973 Les lames sont tout d abord hydrat es par passage dans des alcools de titre d gressif 90 70 50 3 26 m Colorations et marquage chromosomiques minutes dans chaque bac Elles sont ensuite rinc es l eau et plong es 20 minutes dans la solution colorante ainsi compos e acridine orange 5 mg tampon phosphates M 15 pH 6 7 100 ml Cette solution est tr s stable et se conserve au moins une semaine la temp rature ordinaire L utilisation d une solution m re a 1 mg par m d eau distill e stable pendant plusieurs mois vite des pes es r p t es Les lames sont ensuite rinc es abondamment l eau courante des lames insuffisam ment rinc es pr senteront une dominante rouge l examen Elles sont enfin mont es dans le tampon pH 6 7 et recouvertes d une lamelle L exa
102. yenne vers le 8 amp 12e jour de culture On peut faire des pr parations chromosomiques Les lamelles sont pr lev es st rilement et transf r es dans une nouvelle bo te de Petri contenant du milieu frais Le lendemain on contr le au micros cope invers le moment o les mitoses sont nombreuses en g n ral 20 22 heures apr s le transfert et les pr parations sont alors trait es Les bo tes de Petri dans lesquelles les lamelles avaient t initialement plac es sont conser v es et remises l tuve titre de s curit c R alisation des pr parations chromosomiques Les lamelles sont directement soumises au traitement hypotonique sans utilisation pr alable de colchicine Celle ci n est pas n cessaire compte tenu de la relative synchronisation induite par les changements de milieu on obtient ainsi une moindre condensation chromosomique ce qui augmente la d finition de l analyse apr s marquage Le milieu hypotonique est constitu de 5 ml de solution de Hanks dilu e dans 95 ml d eau pH 7 et port 37 C Le milieu de culture est rejet la bo te est rinc e rapidement avec le milieu hypotonique remplie nouveau et mise incuber ainsi 15 minutes 37 C Au bout de ce temps les lamelles sont fix es par immersion dans du Carnoy chloroform voir technique sur lymphocytes durant une heure On les laisse ensuite s cher spontan ment l air Toutes les techniques de marquage d crite

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