Végétal : pomme de terre (Solanum tuberosum), détection de virus
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1. Ta t moin tampon 2 puits TS t moin sain 2 puits TC T moin contamin 2 puits N 1 27 chantillons Eau permut e bordure T moin blanc substrat z ro D O remplir d eau chaque tape sauf la derni re o ils seront remplis de substrat Bordures remplir d eau permut e chaque tape du test Ta TS et TC sont r partis al atoirement sur la plaque ils recevront tous les produits comme les chantillons sauf l tape du d p t des extraits v g taux le t moin Ta recevra du tampon d extraction sans extrait v g tal le t moin contamin TC recevra de l extrait v g tal issu d une plante reconnue infect e le t moin sain recevra de l extrait v g tal issu d une plante reconnue saine VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 16 17 ANNEXE VII Transmission des chantillons au x laboratoire s de confirmation Dans le cas des virus de quarantaine de l Union Europ enne o le test ELISA est dit positif des analyses compl mentaires peuvent tre r alis es sur l chantillon conserv au frais et non broy au laboratoire de confirmation Virologie Pomme de Terre la Station Quarantaine Pomme de Terre Le Rheu Une fiche de renseignements accompagne l chantillon Avertissement il convient de garder et de conserver dans des conditions appropri es l chantillon pour analyse lorsqu il s agit de tubercules ou l chantillon pour laboratoire pour les plan2. nes dans l environnement Ainsi comme pour toute autre manipulation d organismes phytopathog nes on veillera inactiver ceux pr sents dans les v g taux extraits v g taux supports de culture effluents liquides par une proc dure appropri e destruction chimique ou chaleur avant de les rejeter 0 Introduction Cette m thode est directement li e la Directive G n rale Techniques qualitatives immuno enzymatiques de type ELISA DAS et d riv s r f rence DG1 98 a qui est disponible au Laboratoire de r f rence Ces deux documents sont compl mentaires La m thode ne peut tre appliqu e qu en respectant la directive g n rale Cette m thode uniquement qualitative permet de trier les chantillons c est dire de s parer ceux qui ne sont pas contamin s ou pour lesquels la contamination est inf rieure au seuil de d tection de la technique de ceux qui sont susceptibles d tre contamin s par le virus Les chantillons pour lesquels une r ponse n gative est obtenue sont consid r s comme indemnes de la maladie ou contamin s un niveau trop faible pour tre mis en vidence par la m thode Les chantillons pour lesquels une r ponse positive est obtenue sont consid r s comme contamin s Une analyse compl mentaire peut tre r alis e en particulier lorsqu il s agit d organismes de quarantaine voir Annexe VII 1 Objet La pr sente m thode permet la d tection des virus et des phytopl
3. d sinfectant p ex eau de Javel puis laisser s cher l air Dans la mesure o les tubercules sont propres le lavage avant analyse peut tre supprim Pour chaque tubercule proc der comme suit Au moyen d un scalpel d un couteau ou d une cuill re melon propre et d sinfect pr lever sur chaque tubercule la couronne ou une partie de celle ci la couronne est situ e l oppos du talon ou de la zone d insertion du stolon ou ventuellement au niveau du talon pour le PLRV le pr l vement sera constitu d au moins un oeil et fera 1 3 cm d paisseur L outil de pr l vement sera d sinfect entre chaque chantillon pour laboratoire soit en le trempant dans l thanol 70 ou un d tergent de type DDN 50 puis dans l eau soit en st rilisant le scalpel par trempage dans l thanol 70 suivi d un s chage ventuel la flamme soit en le trempant dans une solution de Javel 1 C1 puis dans l eau Les fragments de tubercules pr lev s sont trait s avec de l acide gibb rellique 0 003 mM annexe IV afin d obtenir une germination rapide et homog ne Ils sont immerg s dans cette solution pendant 10 min minimum et 16 C minimum Un m me bain de solution d acide gibb rellique pourra tre utilis au maximum pour traiter 60 chantillons pour laboratoire dans la mesure ou ils ne pr sentent aucune pourriture Les retirer du bain les laisser s cher puis les disposer dans des bacs contena
4. me stade physiologique que les prises d essai La R f rence non infect e TS sera de m me nature que l chantillon analyser 7 2 Le plan de plaque Des exemples de plans de plaque sont donn es en annexe VI VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 7 17 Pour les volumes des d p ts suivre les pr conisations des fournisseurs 7 3 D roulement du test 7 3 1 D p t de la premi re couche d anticorps Incuber T 37 3 C pendant 2 4 h 7 3 2 Rin age Faire au moins 2 lavages successifs de 2 3 minutes chacun avec du tampon de rin age PBS Tween cf annexe Il 7 3 3 D p t des chantillons Couvrir la plaque et incuber plus de 16 heures 5 C 4 C ou 2 heures 37 C 3 C 7 3 4 Rin age Un lavage optionnel l eau permut e ou sous robinet peut tre pratiqu dans un premier temps Faire au moins 3 lavages successifs de 2 3 minutes chacun au tampon de rin age PBS Tween Dans le cas d un lavage effectu avec un laveur de plaque le temps de rin age peut tre diminu 3 x 10 secondes ou 3 x 8 secondes par plaque 7 3 5 D p t de l anticorps conjugu ou de l anticorps de 2 couche Incuber dans les conditions pr conis es en 7 3 1 7 3 6 Rin age idem 7 3 2 7 3 7 D p t des anticorps de 3 couche TAS ELISA Incuber dans les conditions pr conis es en 7 3 1 7 3 8 Rin age idem 7 3 2 7 3 9 D p t du substrat Se r f rer aux pr conisat
5. positivit Le responsable technique doit tout mettre en uvre pour obtenir un r sultat positif ou n gatif nouvelles analyses nouveaux r actifs confirmation dans un autre laboratoire Expression des r sultats Les r sultats sont exprim s par un tableau ou par une phrase du type Test ELISA n gatif gt Virus ou phytoplasme x non d tect dans l chantillon analys par la technique ELISA Test ELISA positif Pour les organismes de quarantaine Virus ou phytoplasme x d tect dans l chantillon analys par la technique ELISA pour les chantillons analys s sans groupage Pour les autres organismes nuisibles Virus ou phytoplasme x d tect sur l chantillon analys avec x de contamination par la technique ELISA pour les chantillons analys s par groupage Les l ments n cessaires l obtention du pourcentage seront pr cis s nombre de tests positifs nombre de tests r alis s importance du groupage Rappel r glementaire du Code rural Titre V Chapitre ler Section 2 Art L 951 6 Toute personne qui sur un fond lui appartenant ou cultiv par elle ou sur des produits ou mati res qu elle d tient en magasin constate la pr sence d un organisme nuisible nouvellement apparu dans la commune doit en faire imm diatement la d claration soit au maire de la commune de sa r sidence lequel doit la transmettre au service charg de la protection des v g taux soit directe
6. pour laboratoire sont constitu s de tubercules fanes ou vitroplants Les tubercules sont stock s en chambre froide 5 C 4 C ou temp rature ambiante hors gel selon la dur e pr vue de conservation Les chantillons frais fanes doivent tre conserv s au frais au maximum 48 heures jusqu leur pr paration et les vitroplants sont conserv s en chambre climatis e viter tout risque ventuel de contamination de lot lot conditions de stockage en annexe V 6 2 Pr paration de l chantillon pour analyse 6 2 1 Tubercules sans sympt mes Dans le cas d chantillons constitu s de tubercules il est r alis au pr alable une lev e de dormance par utilisation de gibb relline afin d acc l rer et d homog n iser la germination En effet la r partition du parasite est al atoire dans les tubercules et sa concentration peut tre faible le seuil de d tection de la m thode ELISA peut ne pas tre atteint La mise en germination des tubercules va permettre la multiplication du ou des parasite s ventuellement pr sent s Cette tape peut toutefois tre vit e dans le cas de virus ayant des taux de multiplication importants dans le tubercule PVX par exemple ou dans le cas de tubercules sympt mes o l analyse peut tre effectu e directement sur ceux ci cf 6 2 2 VHe 01 04 a LNPV SDQPV DGAL 5 17 Laver les tubercules l eau courante ventuellement additionn e d un d tergent et d un
7. quivalente 4 3 7 Couvercles de plaques de microtitration ou couvercles adh sifs 5 Appareillage Appareillage courant dans un laboratoire de virologie notamment mat riel faisant d j partie de la liste de la Directive G n rale ELISA VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 4 117 gt Petit mat riel 5 1 Outil de pr l vement scalpel lames jetables couteau ou cuill re melon 5 2 Flaconnages plastiques divers 5 3 Pissettes 5 4 Pipettes et c nes adapt es gt Gros mat riel 5 5 Chambre climatis e ou serre 5 6 Syst me de production d eau permut e ou d eau distill e 5 7 Balance de pr cision et pH m tre 5 8 R frig rateur cong lateur et incubateur 5 9 Syst me de lavage des plaques de microtitration manuel semi automatique ou ventuellement automatique 5 10 Autoclave destruction des parasites de quarantaine 5 11 Lecteur ELISA Et selon la m thode utilis e pour l extraction gt Broyage dans un sachet tanche 5 12 Broyeur billes manuel moteur ou mont sur perceuse 5 13 Sachets de mac ration jetables r sistants par exemple de type Stomacher de 105 mm x 150 mm gt Presse rouleaux 5 14 Presse rouleaux cannel s ou lisses gt Extracteur fraise 5 15 Extracteur de jus v g taux l aide d une fraise Plant sap extractor 6 Echantillons 6 1 R ception et stockage des chantillons pour laboratoire Les chantillons
8. Minist re de l Agriculture de l Alimenation de la P che et des Affaires rurales Direction G n rale de l Alimentation Sous Direction de la Qualit et de la Protection des V g taux LNPV Le V g tal pomme de terre Solanum tuberosum N asional de la d tection de virus et phytoplasmes De d s par la technique s rologique ELISA V g taux R f M thode VHe 02 04 version a LNPV Station de Quarantaine de la Pomme de terre de Rennes Le Rheu La Motte au Vicomte 35650 LE RHEU T l 02 23 48 51 15 VEGETAL POMME DE TERRE So anum tuberosum DETECTION DE VIRUS ET PHYTOPLASMES PAR LA TECHNIQUE SEROLOGIQUE ELISA Sommaire AVerlissementel pr cautions de S CUPILS issiro siocrinnnar nan enarak E EE EEE EE E EE Rai 3 DOU ON aider a A EE E E E SA 3 ODE e a E E E E E E 3 2 Domaine ADD AC om de 3 D D MOS eap i a i e n N ide 3 4 R actifs produits et co sommabl S srci enoras Enara i 4 S ADD RS te E E E un 4 6 Echantillons eacecren en e e 5 6 1 R ception et stockage des chantillons ss snsnsisitsetidismndetes 5 6 2 Pr paration de l chantillon pour analyse senstagmnennersenuoredisaaiencsss 5 a E E E 6 AMOR OR a de ee E E E 8 Tel Echantillons de TefEreNC E serondsreoisinisseson arniarna anodin Osi KONEEN 8 T2 Le plan de DIOQUS nan n a a AEE A 8 1 22 D roulement des ane E E men 8 8 Validation et interpr tation des T SUItats nisssemneenhenenntsnmaisethens 9 9 Expression des T sSultatS
9. asmes de la pomme de terre Solanum tuberosum pour lesquels il existe des r actifs s rologiques sp cifiques au virus ou au phytoplasme recherch notamment ceux de quarantaine r pertori s par l Union Europ enne et l OEPP ainsi que les virus de la pomme de terre dits de qualit et les virus et phytoplasmes r pertori s par la FAO IPGRI cf liste en annexe I Elle est utilisable notamment dans le cadre des contr les phytosanitaires r glementaires pour ces organismes en surveillance du territoire l importation et l exportation ainsi que dans le cadre de la certification du plant de pomme de terre 2 Domaine d application La m thode s applique des v g taux pr sentant ou non des sympt mes de la maladie principalement aux organes a riens de la pomme de terre tissus foliaires L analyse directe des tubercules ou des germes peut s av rer n cessaire pour certains virus VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 3 17 3 D finitions Souches non europ ennes des virus europ ens de la pomme de terre l origine g ographique du mat riel contamin est consid rer s il n existe aucun autre moyen technique reconnu de v rifier le caract re non europ en de la souche Groupage prise d analyse rassemblant plusieurs unit s du m me chantillon pour laboratoire 4 R actifs produits et consommables 4 1 R actifs et consommables 4 1 1 Choix des r actifs s rologiques Utiliser des r actifs sp cif
10. au de Javel stock V 1 J en litre Quantit d eau ajouter compl ter 1 litre avec de l eau permut e Volume final pr par 1 litre Exemple Stock de Javel 48 degr s chlorom trique Volume de Javel concentr 1 48 0 021 litre de Javel concentr 48 degr s chlorom trique compl ter 1 litre avec de l eau permut e pour obtenir de l eau de Javel 1 degr chlorom trique VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 14 17 ANNEXE IV Pr paration de la solution d acide gibb rellique 0 003 mM COMPOSITION 1X Acide gibb rellique 1 mg Eau permut e qsq 1 litre Une solution stock concentr e peut ventuellement tre pr par e avec une dur e de conservation maximum de 1 semaine temp rature ambiante ANNEXE V Exigences relatives aux locaux de stockage des chantillons en cours d analyses 1 Cas des tubercules Stockage au sec dans des locaux ventil s Temp rature ambiante ou r frig r e hors gel selon la dur e pr vue viter tout risque ventuel de contamination de lot lot 2 Cas des fanes de pomme de terre Temp ratures de 5 C 4 C ou d faut l abris de la chaleur Traitement rapide de l chantillon VHe 01 04 a LNPV SDQPV DGAL 15 17 ANNEXE VI Plan de plaque exemples Plan recommand par la Directive G n rale 6 9 7 8 ls 23 IZOnmOUOwu gt IZOnmOoOw gt
11. au des sympt mes 6 2 3 Cas des feuilles fanes et vitroplants Cas des feuilles des fanes ou de plantes enti res pr lever au moins une foliole par fane ou par plante enti re pour les analyses Ces feuilles sont pr lev es pr f rentiellement dans la moiti sup rieure de l appareil v g tatif Pour les chantillons de plus de 50 fanes un groupage par 5 est possible pour le broyage Cas des vitroplants l chantillon pour analyse consiste en les vitroplants entiers tiges feuilles sans les racines ni la g lose VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 6 17 Cas d analyses effectu es pour la d tection de phytoplasmes la prise d essai se fera sur des racines ou des tissus vasculaires tiges p tioles 6 2 4 Conservation Il est possible de conserver au maximum 1 mois les pr l vements par cong lation avant broyage 6 3 Broyage Selon la nature du mat riel v g tal utiliser un rapport poids de mat riel v g tal en g volume de tampon d extraction en ml de 1 5 1 10 pour les germes et les tubercules et de 1 0 2 1 10 pour les feuilles et vitroplants Utiliser le tampon d extraction d crit en annexe II sauf indication contraire du fournisseur Dans tous les cas utiliser le m me ratio jus brut tampon d extraction pour les chantillons et pour les t moins Utiliser une des trois proc dures suivantes 6 3 1 Broyage avec un broyeur billes manuel moteur ou mont sur une perceu
12. bumine 4 Tampon conjugu COMPOSITION PBS Tween PVP G latine st rile 5 ou 5 Tampon de substrat COMPOSITION Di thanolamine NaN facultatif Eau permut e Solution 1X 1 litre 20 g 10 g Solution 1X 18 ml 2 ml Ovalbumine 0 072g 4 g L Solution 1X Ajuster le pH 9 8 0 2 avec HCI Attention une grande quantit HC est n cessaire ajuster le pH et compl ter le volume ensuite dans une prouvette Conserver de pr f rence l obscurit VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 13 17 ANNEXE Ill Pr paration d un litre d alcool 70 GL Alcool utilis en stock dosant K GL Alcool pr parer au taux de 70 GL Formule de calcul pour pr parer 1 litre d alcool 70 GL Quantit d alcool stock V 70 K en litre Quantit d eau ajouter compl ter 1 litre avec de l eau permut e Volume final pr par 1 litre Exemple Stock 96 GL Volume d alcool stock 70 06 0 73 litre d alcool 96 GL compl ter 1 litre avec de l eau permut e Pr paration d un litre d eau de Javel 1 degr chlorom trique Eau de Javel utilis e en stock dosant J degr chlorom trique Les teneurs habituelles sont de 48 degr s chlorom triques pour les concentr s ou de 12 degr s chlorom triques pour des semi concentr s Formule de calcul pour pr parer 1 litre d eau de Javel 1 degr chlorom trique Quantit d e
13. ent non de quarantaine OEPP ANNEXE I Listes des virus et phytoplasmes de la pomme de terre r pertori s par parasite non r glement Parasite de quarantaine pour l Union Europ enne lt Organisme r glement non de quarantaine T OEPP gt Parasite non r glement Annexe I A I Annexe II AH Liste Al Liste A2 Phytoplasmes Potato Stolbur phytoplasme X X Aster Yellow Potato Marginal Flavescence Potato Phyllody Potato Purple Toproll Potato Witches Broom a D gt Potato Purple top Wilt phytoplasme Virus Alfalfa Mosaic alfamovirus Andean Potato Latent tymovirus Andean Potato Mottle comovirus Arrachaca nepovirus B Oca strain Beet Curly Top curtovirus Cucumber Mosaic cucumovirus Eggplant Mottled Dwarf nucleorhabdovirus Potato Aucuba Mosaic potexvirus Potato Black Ringspot Nepovirus ou Tobacco Ringspot Nepovirus potato calico strain Potato Deforming Mosaic begomovirus Potato Latent carlavirus ou Red la Soda carlavirus Potato Leaf Roll Virus souche non europ enne Potato Leaf Roll Virus souche europ enne Potato Mop Top Pomovirus Potato Rough Dwarf carlavirus Potato A Potyvirus souche non europ enne Potato A Potyvirus souche europ enne Potato M carlavirus souche non europ enne Potato M carlavirus souche europ enne P
14. ganisme r glement non de quarantaine organisme nuisible qui n est pas un organisme de quarantaine dont la pr sence dans les v g taux destin s la plantation affecte l usage pr vu de ces v g taux avec une incidence conomique inacceptable et qui est donc r glement sur le territoire de la partie contractante importatrice OEPP Organisation europ enne et m diterran enne pour la protection des plantes Liste A1 organismes de quarantaine absents de l ensemble de la r gion OEPP liste A2 organismes de distribution restreinte l int rieur de la r gion OEPP VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 12 17 ANNEXE II Composition des Tampons 1 Tampon de rin age PBS Tween COMPOSITION NaCl KHP0O Na HPO 12 H20 KCI Tween 20 NaN facultatif Eau permut e Solution 1X 8g 0 2 g 2 9 g 0 2 g 0 5 ml ou 22 gouttes 0 2 g qsq 1 litre Ajuster le pH 7 4 0 3 par addition de Na HPO 12 H20 pour l augmenter et KH2PO pour le diminuer 2 Tampon de coating COMPOSITION NaCO NaHCO NaN facultatif Eau permut e Solution 1X 1 59 g 2 93 g 0 2 g qsq 1 litre Ajuster le pH 9 6 0 2 par addition de NaCO pour l augmenter ou de NaHCO pour le diminuer 3 Tampon d extraction COMPOSITION PBS Tween PVP Polyvinylpyrrolidone Dans le cas des analyses sur tubercules et germes ajouter Ovalbumine Veiller la compl te dissolution du PVP et de l oval
15. id hnne s fred taste penis ERE E 9 10 Modalit s de transmission au laboratoire de confirmation sssssesssssssseesesseseseeseesressee 9 11 D sinfection et destruction des d chets d analyse sise 10 2 ANNEXE Siuire naaar EEE E E E RSR E 10 Annexe I Listes des virus et phytoplasmes de Quarantaine r pertori s par l Union Europ enne et l OEPP liste des organismes europ ens dits de Qualit et liste des virus et phytoplasmes r pertori s par la FAO IPGRI 11 Annexe LE Composition des tampons ss nemnsntenrdinnnntseens 13 Annexes III Pr paration de solutions d alcool et d eau de Javel au degr souhait 14 Annexe V Pr paration de la solution d acide gibb rellique 0 03 MM n sssssssnssssessessee 15 Annexe VI Exigences relatives aux locaux de stockage des chantillons qui s ten cours ANR te ne a du r 15 Annexe VH Plan d plaques EX MDIeS ss srssereessibsiitnnstesnetsusnsctssnesttiidiens 16 VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 2 17 VEGETAL POMME DE TERRE Solanum tuberosum DETECTION DE VIRUS ET PHYTOPLASMES PAR LA TECHNIQUE SEROLOGIQUE ELISA Avertissements et pr cautions de s curit Les phytopathog nes ne pr sentant aucun caract re de pouvoir pathog ne pour l homme les pr cautions prendre lors de leur manipulation pourront se limiter au respect des consignes g n rales de protection dont l application doit permettre d viter la diss mination d agents phytopathog
16. ions du fournisseur Pr parer une quantit de substrat exc dentaire de l ordre de 5 10 ml afin d observer son volution temp rature ambiante pendant l incubation des plaques Incuber temp rature ambiante jusqu obtention de niveaux de D O satisfaisants pour les t moins 8 Validation et interpr tation des r sultats Pour valider chaque plaque se r f rer la Directive G n rale cf 0 Introduction et 3 5 4 Pour interpr ter les r sultats se r f rer aux pr conisations du fournisseur des r actifs s rologiques ou la Directive G n rale cf 0 Introduction et 3 5 4 Si le fournisseur n indique pas de seuil le seuil le plus fr quemment utilis est de deux fois la moyenne des D O brutes des t moins sains calcul e sur au moins 2 puits Si pour des raisons particuli res nature de l antiserum du virus ce seuil de positivit ne convient pas le laboratoire utilisateur peut s adresser au Laboratoire de r f rence qui lui donne titre indicatif les seuils VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 8 17 qu il a utilis s lui m me ou bien il pourra prendre la m thode de calcul du seuil qu il aura test Les chantillons dont la D O brute est inf rieure ce seuil sont d clar s n gatifs Les chantillons dont la D O brute est sup rieure ce seuil sont d clar s positifs Une attention particuli re sera port e aux chantillons pr sentant des D O proches du seuil de
17. iques Un conseil pour le choix du fournisseur de r actifs s rologiques cf Directive G n rale 0 Introduction peut tre apport notamment par le Laboratoire de r f rence pour les parasites de quarantaine 4 1 2 Conservation suivre les consignes des fournisseurs des r actifs 4 2 Tampons Composition et pr paration des tampons voir annexe II 4 2 1 Tampon de rin age PBS Tween 4 2 2 Tampon de coating tampon de fixation des anticorps 4 2 3 Tampon d extraction de broyage 4 2 4 Tampon de conjugu 4 2 5 Tampon de substrat Conservation conserver les solutions 1X tampons sans azide de sodium 1 mois 5 C 4 C et les solutions 1X tampons avec azide de sodium 3 mois 5 C 4 C Des solutions stock concentr es peuvent tre pr par es et sont conserv es au maximum 6 mois temp rature ambiante 4 3 Autres consommables 4 3 1 thanol 70 modifi ou non cf annexe III et 96 non d natur produits inflammables tenir loign s des sources de chaleur et des flammes nues 4 3 2 Eau courante 4 3 3 Eau permut e ou distill e 4 3 4 ventuellement d tergent p ex DDN 50 ou MIR et d sinfectant p ex eau de Javel 1 chlorom trique cf annexe II 4 3 5 Solution d acide gibb rellique 0 003 mM voir pr paration en annexe IV 4 3 6 Plaques de microtitration fond plat NUNC IMMUNO ou tout autre type de plaque assurant une qualit de r action
18. ment au service charg de la protection des v g taux dont elle d pend 10 D sinfection et destruction des d chets d analyse Mat riel jetable et d chets obtenus lors de la pr paration des chantillons autoclavage incin ration ou d sinfection la Javel 1 CT Mat riel r utilisable couteaux plucheurs tubes d sinfection la Javel 1 C1 et rin age l eau avant r utilisation Mat riel v g tal non contamin pour les parasites de quarantaine d chetterie ou autre possibilit de destruction Mat riel v g tal douteux ou contamin s pour les parasites de quarantaine autoclavage VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 9 17 11 Annexes Annexe I Listes des virus et phytoplasmes de la pomme de terre r pertori s par l Union Europ enne de quarantaine et par d autres organismes organisme r glement non de quarantaine OEPP parasite non r glement Annexe II Composition des tampons Annexe III Pr paration de solutions d alcool et d eau de Javel au degr souhait Annexes IV Pr paration de la solution d acide gibb rellique 0 003 mM Annexe V Exigences relatives aux locaux de stockage des chantillons en cours d analyse Annexe VI Plans de plaque exemples Annexe VII Transmission des chantillons au x laboratoire s de confirmation VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 10 17 l Union Europ enne de quarantaine et par d autres organismes organisme r glem
19. nt un support de culture l g rement humide par exemple de la vermiculite ou du terreau les enfoncer l g rement afin d viter un dess chement trop important Un exc s d eau peut tre pr judiciable la conservation des couronnes ou illetons Eventuellement traiter l aide d un fongicide pour viter certaines pourritures des couronnes Mettre en germination temp rature ambiante a Dans le cas des tests sur germes un obscurcissement temporaire ventuel favorise l allongement des germes et facilite ainsi le broyage Lorsque les germes ont atteint une longueur de 2 3 cm les clairer afin de favoriser la mise en vidence d une ventuelle contamination Veiller maintenir le support de culture humide Apr s 3 5 semaines de culture on pr l ve un germe sur chaque tubercule au moyen d un scalpel ou d un couteau propre et d sinfect Une prise d essai contient les germes issus de 1 5 tubercules L outil de pr l vement des germes lame de scalpel ou couteau sera d sinfect entre chaque chantillon pour laboratoire soit en le trempant dans l thanol 70 ou un d tergent de type DDN 50 puis dans l eau soit en le st rilisant trempage dans l thanol 70 suivi d un s chage ventuel la flamme soit en le trempant dans une solution de javel 1 CT puis dans l eau b Dans le cas des tests sur feuilles se reporter au 6 2 3 6 2 2 Tubercules sympt mes Pr lever les tissus au nive
20. otato P carlavirus Potato S carlavirus souche non europ enne Potato S carlavirus souche europ enne Potato T trichovirus Potato U nepovirus VHe 01 04 a LNPV SDQPV DGAL 11 17 Potato V potyvirus souche non X europ enne Potato V potyvirus souche europ enne X Potato X potexvirus souche non X europ enne Potato X potexvirus souche europ enne X Potato Y potyvirus Y Y et Y souche X non europ enne Potato Y potyvirus Y Y et Y souche X europ enne Potato Yellow Dwarf nucleorhabdovirus X Potato Yellowing alfamovirus X x lt Potato Yellow Mosaic begomovirus Potato Yellow Vein Disease X Saq O disease Solanum Apical Leaf Curling begomovirus Sowbane Mosaic sobemovirus Tobacco Mosaic tobamovirus Tobacco Necrosis Necovirus Tobacco Rattle Tobravirus X Tobacco Streak Ilarvirus Tomato Black Ring nepovirus D K K L K K x Tomato Mosaic tobamovirus Tomato Spotted Wilt tospovirus X X x Wild Potato Mosaic potyvirus La d tection par la technique ELISA est inappropri e pour ce virus lt Directive 2000 29 CE du 8 mai 2000 La partie A I des annexes I et II concerne les organismes nuisibles inconnus dans la communaut la partie A II des annexes I et II concerne les organismes nuisibles pr sents dans la communaut T Or
21. se Rassembler le mat riel v g tal dans un sac plastique bien tanche ajouter la quantit de tampon d extraction n cessaire et effectuer le broyage Conserver l ensemble au r frig rateur 5 C 4 C jusqu la fin de l analyse 6 3 2 Broyage avec la presse rouleaux Les chantillons sont broy s en ajoutant la quantit de tampon n cessaire Il faut s assurer du bon nettoyage de la presse rouleaux entre deux chantillons faire un premier rin age l eau courante afin d liminer tous les d bris puis on peut ajouter successivement par exemple d tergent eau courante eau permut e et tampon d extraction Recueillir le broyat dans un tube et conserver au r frig rateur 5 4 C 6 3 3 Broyage avec l extracteur fraise Se reporter au mode d emploi du fournisseur concernant l utilisation de l extracteur fraise Remarque il est possible de clarifier les extraits obtenus les laisser d canter de 2 h une nuit 5 C 4 C apr s broyage 7 Mode op ratoire Rappel afin d viter toutes contaminations il est imp ratif de traiter s par ment les chantillons et les t moins positifs ceci implique notamment des lieux de stockage et de manipulation s par s Les t moins positifs sont trait s de pr f rence en fin de s rie 7 1 Echantillons de r f rence Il est pr f rable que le mat riel v g tal utilis pour la r f rence infect e TM soit de m me nature et au m
22. ts au moins jusqu l ach vement de la m thode de confirmation en question au mieux si possible durant 1 mois partir de l obtention du premier r sultat n cessitant confirmation Conditions d envoi au laboratoire de confirmation Les chantillons seront identifi s et accompagn s d une fiche de renseignements Ils seront envelopp s dans un emballage tanche transmis par un moyen de transport rapide collissimo ou chronopost ou autre et dans des conditions adapt es une temp rature aussi basse que possible mais sans cong lation emballage isotherme de pr f rence avec syst me rafra chissant Mat riel envoyer chantillon conserv au frais et non broy Adresse du laboratoire de confirmation Pomme de Terre L N P V STATION QUARANTAINE POMME DE TERRE 3 LA MOTTE AU VICOMTE 35650 LE RHEU T 02 23 48 51 15 Fax 02 23 48 51 19 E Mail srpv Inpv sqpdt draf bretagne agriculture gouv fr VHe 01 04 a LNPV SDOPV DGAL 17 17
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