Extrait du guide des analyses spécialisées Cerba
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1. Ac anti cytoplasme des polynucl aires neutrophiles Les anticorps anti cytoplasme des polynucl aires ANCA anti neutrophil cytoplasmic antibodies sont des marqueurs pour le diagnostic des patients atteints de vascularites syst miques n crosantes tels la gra nulomatose de Wegener les polyang ites microsco piques le syndrome de Churg et Strauss et les glom rulon phrites n crosantes focales en croissants Ils reconnaissent des cibles antig niques pr sentes dans les granules des polynucl aires neutrophiles PNN principalement les granules primaires et dans les lyso somes des monocytes Deux aspects principaux de fluorescence sont d crits en IFI cytoplasmique cANCA et p rinucl aire PANCA Les cibles antig niques des ANCA sont loca lis es dans les granules des polynucl aires neutrophiles Outre leur int r t diagnostique ils sont galement utiles au suivi de certaines de ces affections au moins pour la granulomatose de Wegener o l volution de leur titre corr le avec l activit de la maladie De nombreux arguments exp rimentaux sugg rent leur r le pathog ne dans ces maladies o ils activeraient les polynucl aires neutrophiles et les monocytes dans les vaisseaux de petit calibre et les capillaires glom ru laires ce qui aboutirait aux l sions anatomiques avec infiltrat inflammatoire et n crose qui d finissent ces vascularites n crosantes En revanche dans les vascularites touchant l2. a maladie il est pr f rable d utiliser le titre de fluorescence plut t que PELISA Les rechutes sont fr quentes dans la maladie de Wegener 18 64 des patients plus que dans la micropolyan g ite 8 35 Il est conseill de titrer les ANCA tous les 3 mois la premi re ann e au cours du Wegener Au cours du traitement on doit voir une diminution de la fluorescence Une variation n est significative que si elle est sup rieure ou gale trois dilutions Une r ascen sion du taux de fluorescence aurait une valeur pr dic tive pour le diagnostic de rechute Tous les r sultats doivent bien s r tre interpr t s en tenant compte des donn es cliniques Association clinique Vascularites Les ANCA sont associ s des vascularites primitives tou chant les vaisseaux de petit calibre Ce sont des affections rares dexpression clinique tr s polymorphe Ce sont la granulomatose de Wegener la maladie de Churg et Strauss la micropolyang ite Les associations cCANCA anti PR3 d une part et pANCA anti MPO d autre part permettent le diagnostic de ces maladies avec une excellente sp cificit 98 6 et une sensibilit de 85 5 Cependant 10 20 des cas de cANCA ou de pANCA positifs en IFI et n gatifs en ELISA corres pondent d authentiques vascularites l inverse 5 des s rums peuvent tre n gatifs en IFI et positifs en ELISA invitant pratiquer cette recherche chaque fois que le tabl
3. eau clinique permet de suspecter un d faut de sensibilit de l IFI tableau 4 Maladies inflammatoires chroniques de l intestin Les xANCA sont d crits comme les marqueurs de la recto colite h morragique RCH ainsi que de pathologies autoimmunes h patiques cholangite scl rosante primitive h patite autoimmune de type 1 La RCH correspond une atteinte inflammatoire chronique de la muqueuse colique avec atteinte rectale quasi constante voluant par pouss es Elle survient chez l adulte jeune 20 30 ans Les princi paux sympt mes sont des douleurs classiquement locali Tableau 4 Fr quence des ANCA caract ris s en IFI cANCA pANCA pANCA atypiques ou xANCA Wegener 75 15 Micropolyang ite 35 60 Churg et Strauss 10 60 Glom rulon phrite n crosante focale sans d p t d Ig 20 70 P riart rite noueuse Rares Rares Glom rulon phrite Ac anti MBG 25 Purpura rhumato de IgA Maladies syst miques lupus PR Gougerot Sj gren 30 Maladies inflammatoires chroniques de l intestin rectocolite h morragique 70 cholangite scl rosante primitive 70 maladie de Crohn 10 h patites autoimmunes 30 M dicaments minocycline propylthiouracile Tuberculose aspergillose infection par VIH Mucoviscidose endocardites Noter que dans 10 30 des cas de maladie de Wegener et de micropolyang ites des a
4. ent entre les lobes nucl aires L antig ne est le plus souvent la PR3 e l aspect pANCA est particulier par la condensation de la fluorescence autour du noyau sans marquage cytoplasmique L antig ne est souvent la MPO Sur ces lames les anticorps anti nucl aires ANA peuvent avoir un aspect de pANCA L utilisation dans un second temps de cellules Hep 2 aidera leur caract risation D autres autoanticorps peuvent donner un aspect voisin de celui des pPANCA on les appelle pANCA aty piques xANCA ou bien encore NANA nuclear associated neutrophil antibodies Ces pANCA atypiques peuvent tre rencontr s dans les maladies inflammatoires de l intestin rectocolite h mor ragique les h patites autoimmunes les cancers et les infections Dans ces pathologies il n a pas t caract ris d antig ne sp cifique contre lequel ces xANCA r a gissent L utilisation d autres fixateurs que l thanol peut aider cette diff renciation Le formald hyde maintient les constituants dans les granules et emp che toute redistri bution art factuelle les pANCA et les cANCA obser v s sur lame fix e l thanol auront le m me aspect granuleux cytoplasmique sur lame fix e au formol Les ANA et les xANCA ne r agissent pas sur ces cellules fix es au formol La fixation des PNN au m thanol per met aussi de diff rencier les xANCA et les ANA mais ce fixateur est moins utilis que le f
5. es vais seaux de moyen ou de gros calibre comme dans la maladie de Horton ou la maladie de Takayasu on ne retrouve jamais d ANCA Autoantig nes et autoanticorps Les PNN patrouillent l tat quiescent dans le compar timent vasculaire Ils sont activ s par des messagers les ch mokines ou ch moattractants peptides N formyl m thionyl s interleukine 8 CSa qui diffusent d un foyer inflammatoire puis attir s dans le compartiment extra vasculaire par interaction avec les cellules endo th liales gr ce aux mol cules d adh rence Pour pou voir adapter leur morphologie et leur physiologie aux variations de leur micro environnement ils sont qui p s de granules et de v sicules diff rant par les mol cules qu elles contiennent On distingue les granules azurophiles ou primaires ou les granules sp cifiques ou secondaires ou neutro philes ou 8 les granules de type g latinase et les v si cules s cr toires Ces derni res d origine endocytaire contiennent des mol cules plasmatiques qui sont excr t es par fusion la membrane certains r cepteurs membranaires sont ainsi renouvel s impliqu s notam ment dans les ph nom nes d adh rence La disponibi lit imm diate de ces mol cules permet aux PNN d interagir avec les cellules endoth liales et la matrice intercellulaire sans lib ration du contenu potentielle ment toxique des granules tableau 2 Les granules secondai
6. manifestations inflammatoires Elle peut se lier aux cel lules endoth liales et entra ner leur apoptose r le dans la pathog nie de vascularites Elle intervient dans le processus de diff renciation de la lign e promy lo cytaire HL60 my loblastine Pinhibition de son expression induit une inhibition de la prolif ration et induit la diff renciation cet effet est reproduit par des anticorps monoclonaux anti PR3 explication possible de l hyperleucocytose au cours du Wegener On en retrouve dans la circulation et dans les tissus des patients atteints de Wegener Certains anticorps anti PR3 inhibent l action lastino lytique de la PR3 se liant donc au site actif Normalement elle est soumise une inhibition par les serpines inhibiteurs des prot ases s rine principale ment l 1 antitrypsine et l amp 2 macroglobuline Un d ficit en l antitrypsine est souvent associ aux vascularites Le g ne d ficitaire PiZ est exprim chez 20 des patients atteints de vascularites anti PR3 contre 4 7 dans la population g n rale L activit cli nique de la maladie de Wegener est corr l e avec le pou voir inhibiteur des cANCA vis vis de la liaison PR3 a 1 antitrypsine La conformation tridimensionnelle de la PR3 impos e par ses quatre ponts disulfures est importante pour sa reconnaissance par les anti PR3 les prot ines recombi nantes produites par des cellules de rat ou humaines conservent cet
7. nticorps anti membrane basale glom rulaire sont associ s s es dans la fosse iliaque gauche une diarrh e hydrique accompagn e de pus et de sang des rectorragies constantes Les manifestations extra intestinales sont des arthrites et surtout la cholangite scl rosante La maladie de Crohn est associ e la pr sence d anticorps anti Saccharomyces cerevisiae ASCA On a montr que la combinaison ANCA ASCA est plus discriminative que les tests pris isol ment pour le diagnostic de RCH et de Crohn En effet la combinaison xANCA ASCA est en faveur d une maladie de Crohn avec une valeur pr dictive positive de plus de 90 tandis que la combinaison xANCA ASCA est en faveur d une RCH IS Ac Saccharomyces cerevisiae H patites autoimmunes anti membrane basale glom rulaire Ac anti 1 Deguillaume Y Renaudineau Y Chaline L Saraux A Nousbaum JB Youinou P Les nouveaux ANCA leur mode d emploi Immunoanal Biol Sp 2006 21 301 307 M rens A Nizou JY Duvic C Nicand E Polyang ite microscopique et pANCA Rev Fr Lab 2007 37 389 59 63
8. ormol tableau 3 Tableau 3 Aspect des ANCA selon le fixateur des PNN Type d anticorps Aspect en fixation thanol Aspect en fixation formol Aspect en fixation m thanol Aspect sur cellules Hep2 cANCA cANCA cANCA cANCA N gatif pANCA pANCA cANCA N gatif N gatif XANCA pANCA N gatif pANCA N gatif ANA Nucl aire ou pANCA N gatif ANA Nucl aire Technique ELISA La recherche des sp cificit s anti MPO et ou anti PR3 est pratiqu e pour tous les ANCA positifs en IFI pour le diagnostic des vascularites Il n existe pas de tech nique permettant l identification des xANCA associ s aux maladies inflammatoires chroniques de l intestin pour lesquelles on doit se contenter de l aspect en IFI Les antig nes utilis s peuvent tre purifi s ou recombi nants la technique peut tre directe ou en sandwich par immunocapture utilisant un premier anticorps monoclonal Les techniques en capture semblent tre plus sensibles pour la d tection des anticorps anti PR3 D autres techniques sont disponibles Les immunoblots ou dot blots sont des techniques unitaires reposant sur le principe de PELISA Ils fournissent un r sultat quali tatif ou semi quantitatif utile pour un diagnostic d urgence En cytofluorim trie les prot ines cibles sont coupl es des particules et la r action Ag Ac est lue par un cytom tre de flux technologie Luminex Pour suivre l volution de l
9. ranules primaires elle se lie au LPS des bact ries Gram n gatif et a des effets cyto toxiques ainsi que neutralisants sur les endotoxines lib r es Des anticorps anti BPI ont t observ s au cours de vascularites et de maladies inflammatoires du tube digestif ainsi qu au cours de mucoviscidoses infec t es par Pseudomonas Ils produisent une fluorescence de type cANCA quand ils sont positifs en IFI dans 50 des cas ils sont n gatifs en IFI Lactoferrine lysozyme Les anticorps reconnaissant les cibles antig niques des granules secondaires sont rares Ils sont retrouv s au cours de vascularites de colites ulc reuses de cholan gites scl rosantes de polyarthrites rhumato des de lupus syst miques d arthrites inflammatoires et au cours de l infection par le VIH Les m canismes d action des anti corps anti lactoferrine ne sont pas bien tablis M thodes de d tection Les ANCA sont recherch s par technique d immuno fluorescence indirecte IFI sur des lames de PNN humains avec une premi re dilution au 1 20 Leur sp cificit est ensuite pr cis e par ELISA anti MPO anti PR3 Ce sont le plus souvent des IgG Technique IFI La fixation des PNN humains de groupe O par l tha nol est responsable de la distribution particuli re des autoantig nes reconnus par les ANCA e l aspect cANCA est caract ris par une fluorescence diffuse et granulaire du cytoplasme avec renforce m
10. rement aux anti PR3 il ne semble pas qu il y ait de corr lation entre leur titre et l activit clinique de la maladie L aspect pANCA est li une distribution art factuelle autour du noyau de certains antig nes dont la MPO lors de la fixation des pr parations de PNN par l tha nol Une fixation par le formol respecte leur distribu tion cytoplasmique lastase C est une s rine prot ase pr sentant 54 d homologie avec la PR3 Elle est stock e dans les granules azuro philes Des anticorps anti lastase ont t d crits au cours de certaines vascularites de lupus et dans des cas de glom rulon phrites induites par l hydralazine Cathepsine G C est une autre s rine prot ase de 29 kDa contenue dans les granules primaires Des anticorps anti cathepsine G ont t d crits au cours de maladies de Wegener de vascularites syst miques tels la polyang ite microscopique et le syndrome de Churg et Strauss Ils sont aussi retrouv s au cours d ent rites inflamma toires chroniques comme la rectocolite h morragique et la maladie de Crohn d h patites autoimmunes de cirrhose biliaire primitive de cholangite scl rosante et de cirrhose alcoolique Leur sp cificit diagnostique est donc limit e BPI bactericidal permeability increasing protein Prot ine cationique antimicrobienne de 57 kDa elle a t aussi appel e CAP 57 pour cationic antigenic protein pr sente dans les g
11. res peroxydase n gatifs forment un ensemble h t rog ne depuis les granules tr s riches en lactoferrine et d pourvus de g latinase jusqu ceux tr s riches en g latinase et d pourvus de lactoferrine r alisant au maximum les granules de type g latinase en passant par des interm diaires contenant les deux mol cules en proportions variables Lors de la diap d se les granules contenant la g latinase sont mobilis s en second apr s les v sicules au contact du collag ne de type IV principal constituant de la membrane basale et substrat de la g latinase Ainsi le PNN activ au sein d un foyer tissulaire inflammatoire a relargu l essentiel du contenu de ses v sicules et de ses granules secon daires tout en conservant intactes ses r serves d enzymes prot olytiques et bact ricides contenues dans ses granules primaires Au contact des micro organismes il est donc en mesure d exprimer sa sur face les r cepteurs pour la phagocytose et ses fonctions microbicides Agents de l immunit naturelle ce sont les premiers leucocytes rejoindre le site infectieux ils sont en mesure de phagocyter et de tuer les micro organismes gr ce leur quipement en mol cules antibiotiques enzymes prot olytiques d riv s actifs de l oxyg ne avant m me qu une r ponse immunitaire sp cifique soit mise place Ils y contribuent dans un deuxi me temps par la lib ration des chimiokines et des d fen
12. sines capables d attirer lymphocytes et cellules dendritiques Prot inase 3 La cible principale des cANCA est une s rine prot ase de 29 kDa elle clive l lastine Ph moglobine la fibro nectine la laminine la vitronectine le collag ne de type IV Dans les phagosomes la prot inase 3 PR3 d truit les bact ries en association avec la cathepsine G l lastase et les radicaux libres d oxyg ne la diff rence de l lastase de la my loperoxydase et de la cathepsine G elle est galement pr sente dans les gra nules secondaires et les v sicules Elle est la cible antig nique pr f rentielle des cANCA caract ristiques de la granulomatose de Wegener elle est surexprim e lors de certaines leuc mies my lo des aigu s ou chroniques La PR3 peut cliver PIL8 et le C1 inhibiteur et inhiber la NADPH oxydase ce qui concourt au maintien des Tableau 2 Cibles antig niques des ANCA Granules primaires Granules secondaires Granules g latinases V sicules s cr toires Azurocidine BPI Cathepsine G lastase Glucuronidase Lysosyme Lysosyme Lysosyme My loperoxydase Prot inase 3 Prot inase 3 Prot inase 3 Lactoferrine Glyc rophosphatase Collag nase Ac tyl transf rase Prot ines plasmatiques Mannosidase G latinase Histaminase Sialidase Vit B12 bp Les cibles antig niques des ANCA sont indiqu es en gras
13. te structure antig nique ce qui n est pas le cas dans les syst mes Baculovirus ou les bact ries My loperoxydase Environ 50 des pANCA retrouv s chez les patients atteints de vascularite syst mique ou de glom rulo n phrite extra capillaire pauci immune sont sp cifiques de la my loperoxydase MPO Elle a t d crite en 1941 sous le nom de verdoperoxydase elle est respon sable de la couleur verte du pus Elle est contenue dans les granules primaires c est un puissant oxydant elle permet la production d un oxydant chlor l acide hypochloreux en pr sence d halog nures selon la r action H202 CT H30 HOCI 2H 0 L acide hypochloreux est un puissant agent bact ricide il peut galement inactiver des inhibiteurs de prot ases et avoir ainsi un effet indirect dans la d gradation des tissus Pourtant le d ficit en MPO 1 pour 2 000 4 000 individus ne semble pas avoir de cons quences d l t res Les anticorps anti MPO sont dirig s contre des pitopes multiples et pour certains conformationnels et n inter f rent pas avec l activit enzymatique L expression de MPO recombinante a t obtenue dans diff rentes lign es cellulaires d origine my lo de Les anticorps anti MPO sont retrouv s dans 70 des glom rulon phrites extra capillaires pauci immunes 60 des micropolyang ites 60 des syndromes de Churg et Strauss et 10 des maladies de Wegener Contrai
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