Home

Coffret SPOT-Light HER2 CISH

1. Hautement inflammable R20 Dangereux en cas d inhalation S2 Tenir hors de port e des enfants S16 Tenir distance des sources d inflammation Interdiction de fumer S25 viter tout contact avec les yeux S29 Ne pas d verser dans les gouts 833 Prendre des mesures de pr caution contre les d charges statiques e Tous les r actifs num r s sont pr ts l emploi et poss dent une dilution optimale Une dilution suppl mentaire risque de fausser les r sultats du dosage e Les temps d incubation les r actifs et les temp ratures sont optimis s L utilisation de temps d incubation de r actifs ou de temp ratures autres risque de fausser les r sultats du dosage e L utilisation de fixateurs ou d paisseurs de tissu diff rents n est pas recommand e et risque de fausser les r sultats du test e Se reporter aux r glementations locales relatives l limination des composants potentiellement toxiques e Limiter la contamination microbienne pour viter toute coloration non sp cifique e Multiplier les pr cautions lors de la manipulation des r actifs Porter des gants une blouse et lunettes jetables lors de la manipulation de mati res potentiellement carcinog nes Stockage des r actifs e Le coffret SPOT Light HER2 CISH doit tre stock entre 2 et 8 C e Conserver le r actif J temp rature ambiante entre 15 et 30 C Remarque les performances du r actif B peuvent tre alt r es en
2. Permet de r aliser lt n gt tests europ enne Utiliser avant Diagnostic in vitro Se reporter aux documents d accompagnement LT Se reporter aux instructions gt E E EE pour IVDD 98 79 EC Invitrogen Ltd Inchinnan Business Park 3 Fountain Drive Paisley PA4 9RF Royaume Uni Copyright O Invitrogen Corporation 16 juillet 2008 PI84 0150 R v 0 0 Page 26 de 26 Annexe A Guide d interpr tation du test HER2 CISH Amplification du g ne HER2 Amplification Amplification lev e 10 points agr gats importants ou un m lange de points multiples et d agr gats importants du g ne HER2 pr sent dans le noyau de 50 96 des cellules canc reuses Se reporter aux figures A B et C Un agr gat important est un groupe de signaux de forme irr gu li re avec un diam tre 5 fois sup rieur celui d un point unique Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cel lules pith liales normales de la m me lame peut tre utilis comme r f rence Se reporter la figure A Amplification faible 5 points 10 points petits agr gats ou un m lange de points multiples et de petits agr gats du g ne HER2 pr sent dans le noyau de 50 96 des cellules canc reuses Se reporter aux figures D et E Un petit agr gat est un groupe de signaux de forme irr gu i re avec un diam tre 3 5 fois plus grand que celui d un point unique Un point unique provenant des cellul
3. 80 0 95 CI 28 4 99 5 Concordance n gative 35 36 97 2 95 CI 85 5 99 5 Concordance du pourcentage total 4 35 41 95 1 95 CI 83 5 99 4 Tableau 10 Cas discordants HercepTest 2 entre les techniques CISH et FISH HER CISH Pos FISH N g HER CISH N g FISH Pos Nombre CISH FISH IHC Nombre de CISH FISH de sujets sujets Site A 4 11 76 Lo o LLLA aeraoe 10 2810 7750 2 EE 700400 2450 0 50 7 L LL 85691 mao 500 248050750 2 LE qp o CE ET OT ON 2 7 vs ingos ias er sam 7 995 oreo san sol 7 Hombre de cas TT divis par le nombre total de cas acceptables utilisant les techniques FISH et CISH sur le site correspondant x 100 96 PI84 0150 R v 0 0 Page 17 de 26 D Cas de polysomie Deux sites d tude ont valu les cas de polysomie d apr s leurs pratiques cliniques institutionnelles respectives Sur le site A la polysomie du chromosome 17 a t d finie comme la pr sence de gt 3 signaux CEP17 dans au moins 10 des cellules tumorales alors que sur le site B le crit re tait la pr sence de gt 3 signaux CEP17 dans au moins 30 des cellules tumorales La fr quence des tumeurs pr sentant une polysomie du chromosome 17 tait de 18 68 sur le site A et de 7 91 sur le site B Le taux de d tection de la polysomie sur le m me groupe tumoral variait significativement entre les deux sites de test en raison de la diff rence dans la d finit
4. car il peut produire des variations significatives des r sultats ce qui peut n cessiter des contr les r guliers en interne en plus de ceux effectu s dans les proc dures suivantes Interpr tation valuation de l ad quation de la lame Les points signaux HER2 CISH doivent tre petits mais ais ment discernables l aide d un objectif de 20X 40X Les points poss deront une coloration brune sur la coloration de contraste PI84 0150 R v 0 0 Page 11 de 26 Si aucun point n appara t sur l chantillon renouveler le dosage Contacter le service d assistance technique en composant le 1 800 955 6288 Etats Unis uniquement pour d terminer les causes ventuelles du probl me Aspect du signal CISH consulter l annexe A Guide d interpr tation du test HER2 CISH Les points HER2 CISH apparaissent sous diff rentes formes e Point unique figure G Un point unique poss de un pourtour arrondi et lisse dans les cellules normales ou tumorales Un point unique repr sente une seule copie du g ne HER2 e Undoublet figure H Les points apparaissent comme des paires et ne constituent pas de vrais petits agr gats Si deux signaux sont situ s une distance inf rieure au diam tre d un signal ces signaux doivent tre comptabilis s comme un point unique Le doublet r sulte de la division des chromosomes chaque signal r sidant sur la paire de chromatides sceurs e Un petit agr gat figure E Un petit agr gat es
5. invitrogen Coffret SPOT Light HER2 CISH R f rence catalogue 84 0150 V 20 tests utilisant des lamelles de 24 mm x 30 mm CE Utilisation pr vue R serv l usage pour diagnostics in vitro Le coffret SPOT Light HER2 CISH est destin au dosage quantitatif de l amplification du g ne HER2 sur des coupes de tissus de cancer du sein inclus dans la paraffine et fix s au formol formalin fixed paraffin embedded FFPE par hybridation chromog nique in situ chromogenic in situ hybridization CISH et microscopie en champ clair Le test doit tre effectu dans un laboratoire d histopathologie Le coffret SPOT Light HER2 CISH est indiqu comme aide dans l valuation des patientes pour lesquelles un traitement base d Herceptin trastuzumab est envisag Les r sultats du test sont destin s tre utilis s en compl ment des informations clinicopathologiques utilis es dans le cadre de la prise en charge des patientes atteintes du cancer du sein Les r sultats du test doivent tre interpr t s en tenant compte des ant c dents cliniques de la patiente par un pathologiste agr R sum et description du test Le g ne humain HER2 ou c erbB 2 et le g ne quivalent du rat neu ont t identifi s comme des proto oncog nes homologues de l oncog ne v erbB qui leur est troitement apparent Le g ne HER2 est situ sur le chromosome 17 17q11 2 21 et code une prot ine membranaire de 185 kDa de type r c
6. Rincer rapidement les lames dans la jarre contenant le SSC temp rature ambiante entre 15 et 30 C puis immerger les lames pendant 5 min dans la jarre Coplin contenant le SSC dans le bain marie 70 C 1 C Laver les lames trois fois dans de l H Od pendant 2 min chaque fois 10 Immunod tection a b c d e f g h j k D Immerger les lames dans du H202 3 dans du m thanol absolu pendant 10 min Laver trois fois dans du PBS Tween 20 0 01 pendant 2 min chaque fois Ajouter 2 3 gouttes de CAS Block r actif F par lame ou en quantit suffisante de sorte recouvrir le tissu et laisser incuber pendant 10 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C Absorber le r actif F l aide de papier buvard Ne pas rincer Ajouter 2 3 gouttes d anticorps anti digoxig nine de souris r actif G par lame ou en quantit suffisante pour recouvrir le tissu et laisser incuber pendant 30 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C Laver trois fois dans du PBS Tween 20 0 01 pendant 2 min chaque fois Ajouter 2 3 gouttes d anticorps de ch vre anti souris conjugu polym re HRP r actif H par lame ou en quantit suffisante pour recouvrir le tissu et laisser incuber pendant 30 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C dans une chambre d humidit Laver trois fois dans du PBS Tween 20 0 01 96 pendant 2 min chaque fois Pendant le lavage pr parer la solution substrat chromog
7. Se reporter la proc dure a V rifier que le lavage stringent a t effectu 70 C Il est recommand d utiliser un thermom tre talonn pour v rifier la temp rature b V rifier que le temps d incubation du lavage stringent est appropri 5 min 4 V rifier les conditions de conservation Le coffret SPOT Light HER2 CISH doit tre stock entre 2 et 8 C Conserver le r actif J temp rature ambiante entre 15 et 30 C PI84 0150 R v 0 0 Page 23 de 26 Morphologie de tissu m diocre 1 Conditions de pr traitement par la chaleur inappropri es temps d incubation ou temp rature 2 Conditions de pr traitement enzymatique inappropri es temps ou temp rature 3 Conditions de d naturation inappropri es temps ou temp rature 4 Le retrait de la lamelle a provoqu des dommages physiques au niveau du tissu 5 S chage du tissu pendant la proc dure CISH 6 paisseur de tissu inappropri e 7 Temps de fixation inappropri 8 Fixateur inappropri 1 V rifier que les conditions de pr traitement ad quates ont t respect es 2 V rifier que les conditions de digestion enzymatique appropri es ont t respect es Remarque pour la plupart des tissus mammaires une digestion enzymatique de 5 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C est optimale Selon l paisseur du tissu et le temps de fixation augmenter ou diminuer le temps d incubation pour o
8. lange de points multiples et d agr gats importants m lange de points multiples et de petits agr gats ou petits agr gats du g ne HER2 pr sents dans chaque noyau dans une majorit gt 50 96 des cellules tumorales de la zone de tissu s lectionn e pour l num ration Consulter les figures A B C D et E de l annexe A Guide d interpr tation du test HER2 CISH Un agr gat important est un groupe de signaux de forme irr guli re avec un diam tre 5 fois sup rieur celui d un point unique Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame doit tre utilis comme r f rence Consulter la figure A de l annexe A Un petit agr gat est un groupe de signaux de forme irr guli re avec un diam tre de 3 5 fois celui d un point unique Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame doit tre utilis comme r f rence Consulter la figure E de l annexe A Pas d amplification 1 5 points du g ne HER2 pr sent dans chaque noyau dans une majorit gt 50 des cellules tumorales de la zone de tissu s lectionn e pour l num ration Consulter les figures F G et H de l annexe A Un point unique poss de un pourtour arrondi et lisse et est pr sent dans les cellules normales et tumorales PI84 0150 R v 0 0 Page 14 de 26 Valeurs attendues La pr valence du g ne HER2 amplifi dans
9. ne DAB et ajouter une goutte de chaque r actif I1 I2 et I3 dans 1 ml d H Od Ajouter 2 3 gouttes de substrat chromog ne DAB par lame ou en quantit suffisante pour recouvrir le tissu et laisser incuber pendant 30 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C dans une chambre d humidit Placer les lames sur la grille Laver sous l eau du robinet pendant 2 min 11 Coloration de contraste et montage Remarque r aliser une br ve contre coloration pendant 3 5 s et examiner le tissu l aide du microscope sans utiliser de lamelle R aliser une nouvelle coloration de contraste pendant 3 5 s pour obtenir une coloration nucl aire plus prononc e Le temps de coloration de contraste d pend des tissus utilis s Une coloration de contraste sombre est d conseill e car elle risque d obscurcir les signaux de coloration positifs a b c d e f R aliser une contre coloration en utilisant de h matoxyline r actif J 3 5 s Laver sous l eau du robinet pendant 2 min D shydrater dans des bains d thanol concentrations croissantes pendant 2 min dans chaque concentration 70 96 85 95 100 100 96 conserv es suite au jour 1 et utilis es en respectant le m me ordre Immerger deux fois dans du xyl ne pendant 2 min chaque fois Ce bain de xyl ne doit tre diff rent de celui utilis le jour 1 Il peut tre r utilis pour cette tape pendant 1 semaine ou pour 100 lames au maximum Placer
10. 1 ml de H Od M langer soigneusement e H 0 3 dans du m thanol absolu o Ajouter 1 volume de H O 30 9 volumes de m thanol o Recouvrir compl tement et conserver jusqu 1 semaine temp rature ambiante entre 15 et 30 C ou jusqu au traitement de la 100e lame e Xyle ne 2 grilles o Recouvrir compl tement et conserver jusqu 1 semaine temp rature ambiante entre 15 et 30 C ou jusqu au traitement de la 100e lame 9 Lavage stringent PI84 0150 R v 0 0 Page 8 de 26 Remarque l utilisation de temp ratures plus lev es que celles recommand es par la proc dure peut entrainer une diminution ou une perte totale du signal CISH Les lavages effectu s une temp rature trop basse peuvent g n rer des bruits de fond lev s Un thermom tre talonn doit tre utilis pour garantir que la temp rature appropri e du bain marie est atteinte et stabilis e a b c d e f Allumer le bain marie 70 C 1 C et l amener la temp rature voulue Pr parer deux jarres Coplin avec du tampon SSC r actif D une temp rature ambiante et l autre chauff e 70 C Retirer la colle caoutchouc ou le dispositif UnderCoverTM Slip Ne pas laisser s cher la coupe de tissu Pour retirer la lamelle sans d chirer le tissu humidifier les lames au pr alable dans le SSC temp rature ambiante pendant 2 3 min jusqu ce que les lamelles se d collent facilement Passer ensuite l tape suivante
11. cas d exposition des temp ratures lev es Conserver ce r actif entre 2 et 8 C imm diatement apr s utilisation Ne pas conserver ce r actif temp rature ambiante e Conserver le tampon PBS Tween 20 en cours d utilisation temp rature ambiante 15 30 C jusqu 1 semaine au maximum Ne pas utiliser le coffret apr s la date de p remption indiqu e sur l tiquette Si le produit est stock dans des conditions autres que celles indiqu es sur la notice ces conditions de stockage doivent tre v rifi es par l utilisateur Inspecter les lames de contr le car aucun signe apparent n indique l instabilit du produit Contacter le service d assistance technique si vous suspectez un probl me au niveau du coffret PI84 0150 R v 0 0 Page 5 de 26 Mode d emploi LT A Pr paration du sp cimen Coupes de tissu inclus dans la paraffine Les tissus fix s dans du formol tamponn neutre pendant 6 48 heures avant l incorporation dans la paraffine peuvent tre utilis s Les fixateurs autres que le formol tamponn neutre 10 n ont pas t optimis s pour ce protocole et ne doivent pas tre utilis s Les coupes de tissu 4 5 um d paisseur doivent tre fix s sur des lames de microscope HistoGripTM trait es ou Superfrost Plus Dans la mesure du possible utiliser des coupes de tissu poss dant l paisseur normalis e pour garantir une coloration uniforme des r actifs de coloration de contraste et de
12. ne HER2 a t d tect comme un point unique dans la coupe de tissu et dans la coupe du bloc de cellules avec le g ne HER2 normal Chaque chantillon amplifi et non amplifi a pr sent une contre coloration d intensit 3 et une morphologie de tissu correcte Efficacit de l hybridation L efficacit de l hybridation a t tablie en testant 2 chantillons de tissu 1 amplifi 1 non amplifi 10 coupes chacun et 4 chantillons de lign es cellulaires 2 amplifi s 2 non amplifi s Chaque chantillon a t analys afin de d terminer le nombre de cellules poss dant des signaux HER2 parmi le nombre total de cellules analys es 100 300 cellules L efficacit de l hybridation a t valu e 94 7 100 Pour le marquage CISH de 226 chantillons cliniques provenant de 3 laboratoires le taux d chec de chaque site tait de 8 4 19 1 3 3 et de 0 9 2 9 Sp cificit analytique Pour d terminer la sp cificit des tudes en m taphases ont t r alis es sur des lames pr par es de mani re cytog n tique une PCR a t effectu e l aide d une paire d amorces sp cifique au g ne HER2 dans la sonde ADN mod le HER2 et un s quen age de l ADN a t r alis sur les deux extr mit s des clones BAC utilis s dans la sonde ADN HER2 La sonde SPOT Light HER2 CISH a montr une liaison sp cifique pour le locus du g ne HER2 sur la bande du chromosome 17q11 2 21 La localisation chromosomi
13. sonde une temp rature inf rieure celle recommand e par le protocole risque de cr er un signal CISH faible ou d annuler tout signal La modification des temps d incubation peut g n rer un signal faible ou une coloration de fond a Ajouter 15 ul de sonde HER2 r actif C au milieu du couvre lame de 22 x 22 mm Selon la taille du tissu la quantit de sonde requise peut varier Utiliser les volumes de sonde suivants en fonction de la taille de la lamelle 18 mm x 18 mm 10 ul e 22 mm x 22 mm 15 ul e 24 mm x 30 mm 20 ul b Placer la lamelle la sonde face vers le bas sur la zone appropri e d chantillon de tissu se trouvant sur la lame Les dispositifs UnderCover M Slips CISH d Invitrogen peuvent tre utilis es la place des lamelles standard Lors de l utilisation de dispositifs UnderCoverTM Slips CISH tirer le papier vers l arri re et placer la face poss dant la lamelle expos e face o le papier vient d tre retir sur la zone appropri e de la lame afin de recouvrir l chantillon de tissu Appuyer sur les bords de bande pour sceller la lamelle afin d viter toute vaporation NE PAS APPUYER AU MILIEU DE LA LAMELLE c Lors de l utilisation d une lamelle standard celle ci doit tre scell e pour viter toute vaporation pendant l incubation Le scellement peut tre r alis l aide d une seringue de 5 ml et d une aiguille de 18G 2 po Remplir la seringue de colle caoutchouc et l appliquer en fine couc
14. sonde SPOT Light HER2 marqu e la digoxig nine dans un tampon d hybridation contenant du formamide pr t l emploi ATTENTION dangereux R actif D Tampon SSC 500 ml contenant du SSC saline sodium citrate pr t l emploi R actif E1 Poudre PBS 3 sachets chacun suffisant pour 1 1 de PBS PI84 0150 R v 0 0 Page 2 de 26 R actif E2 Tween 20 50 2 ml Tween 20 dans une solution 50 96 R actif F CAS Block 3 ml de tampon avec un stabilisateur et 0 1 d azide de sodium pr t l emploi ATTENTION dangereux R actif G Anticorps de souris anti digoxig nine 3 ml de tampon contenant de la BSA avec un stabilisateur et 0 1 d azide de sodium pr t l emploi ATTENTION dangereux R actif H Anticorps de ch vre anti souris polym re conjugu de la peroxydase 3 ml de tampon contenant un stabilisateur 0 005 de sulfate de gentamicine et 0 1 de Proclin 300 pr t l emploi R actif I1 Tampon substrat DAB 20x 1 ml de tampon concentr R actif I2 Solution DAB 20x 1 ml de concentr contenant 85 m v de m thanol ATTENTION inflammable et toxique R actif I3 Peroxyde d hydrog ne 20x 1 ml H20 0 6 R actif J H matoxyline de Mayer 100 ml pr t l emploi R actif K Solution de fixation Histomount 4 ml pr t l emploi ATTENTION hautement inflammable et dangereux Lame de contr le L Lames de cellules de contr le proc durales 2 lames chacune avec
15. tre visualis dans le contexte de la morphologie des tissus environnants Apr s le d paraffinage les chantillons sont soumis un pr traitement consistant en une phase de restauration par la chaleur suivie d une phase de digestion enzymatique Les sp cimens sont ensuite d shydrat s et s ch s l air avant l ajout de la sonde HER2 Apr s l ajout de la sonde et la pose de la lamelle protectrice sur l chantillon celui ci est d natur et hybrid pendant plus de 10 heures ou durant toute une nuit L chantillon est ensuite lav pour liminer la sonde non hybrid e et le signal est d tect de mani re chromog nique par l ajout s quentiel d un anticorps dirig contre la digoxig nine puis du conjugu HRP polym re conjugu de la peroxydase La coloration est produite par la liaison de HRP avec le chromog ne DAB en pr sence du substrat H 0 L chantillon est enfin contre color avec l h matoxyline de Mayer afin d identifier la morphologie du tissu et recouvert par une lamelle protectrice Un point brun fonc unique signale la pr sence en faible quantit du g ne HER2 des agr gats bruns signalent la pr sence du g ne en grand nombre de copies Les zones des cellules tumorales peuvent tre facilement localis es sous un objectif faible puissance d un microscope en champ clair et les copies du g ne HER2 peuvent tre quantifi es l aide d un objectif de 40X Le microscope en champ clair dot d un objectif de 40
16. une lamelle l aide de la solution de fixation Histomount M r actif K Conserver les lames temp rature ambiante entre 15 et 30 C pour effectuer une analyse ult rieure des r sultats Limites de la proc dure Le coffret SPOT Light amp HER2 CISH peut ne pas d tecter les 5 96 de cancers du sein positifs par immunohistochimie IHC mais n gatifs au test d amplification du g ne HER2 PI84 0150 R v 0 0 Page 9 de 26 e La technique CISH est une proc dure plusieurs tapes qui n cessite une formation sp cialis e l utilisation des r actifs appropri s la s lection des tissus la fixation la manipulation la pr paration des lames CISH et l interpr tation des r sultats du marquage e Le marquage des tissus d pend du traitement et de la manipulation de l chantillon de tissu avant l tape de marquage Une contre coloration excessive ou incompl te peut compromettre l interpr tation des r sultats e Toute d viation par rapport la proc dure de test recommand e peut invalider les r sultats escompt s d clar s Des m thodes de contr le appropri es doivent tre utilis es et document es Les utilisateurs s cartant de la proc dure de test recommand e assument alors la responsabilit de l interpr tation des r sultats de sp cimens e Le coffret SPOT Light amp HER2 CISH a t optimis uniquement pour identifier et quantifier le g ne HER2 neu dans les sp cimens de tissu de cancer du sein humain dans
17. 2 lign es cellulaires fix es au formol et incluses dans de la paraffine FFPE juxtapos es A HER2 non amplifi MCF 7 et B HER2 amplifi SK OV 3 Une lign e cellulaire non amplifi e avec des r sultats quantifiables est recommand e pour un contr le optimal du dosage R ACTIFS COMPOSANTS ET QUIPEMENTS N CESSAIRES MAIS NON FOURNIS Autres r actifs composants R f rence catalogue Invitrogen 1 Lames SuperFrost Plus OU Lames adh sives Histogrip 00 8050 2 Contr le de tissu positif coupe de tissu canc reux du sein FFPE canalaire tubulaire lobulaire ou de type mixte avec amplification du g ne HER2 confirm e au pr alable par CISH ou FISH 3 Contr le de tissu n gatif coupe de tissu canc reux du sein FFPE canalaire tubulaire lobulaire ou de type mixte avec non amplification du g ne HER2 confirm e au pr alable par CISH ou FISH 4 Eau d sionis e ou distill e H5Od 5 Xyl ne 6 thanol EtOH 70 96 85 95 et 100 7 Lamelles colle caoutchouc aiguille 18G po et seringue de 5 ml OU 8 Dispositifs UnderCover Slips 18 x 18 mm 00 8403 9 Dispositifs UnderCover Slips 22 x 22 mm 00 8404 10 30 peroxyde d hydrog ne H202 11 M thanol absolu PI84 0150 R v 0 0 Page 3 de 26 quipement UO a gv dec vas 9 10 11 Minuterie Pipette 20 ul 1000 ul Embouts de pipette Grille Plaque chauffante feuille d aluminium et b cher d 1 1 Platine chauffante pour lames Inc
18. 2639 2648 1999 Ross JS et al The Oncologist 8 307 325 2003 Slamon DJ Clark GM Wong SG et al Science 235 177 82 1987 Slamon DJ et al Science 244 707 12 1989 Pauletti G et al J Clin Oncol 18 21 3651 3664 2000 Herceptin trastuzumab package insert Genentech South San Francisco CA www fda gov 2004 Heikki Joensuu et al N Engl J Med 354 8 809 820 2006 Nicols DW et al Ann Clin Laboratory Sci 32 1 2002 Bhargava R et al Am J Clin Path 123 237 243 2005 Gong Y et al Mod Path 18 8 1015 21 2005 Zhao J Wu R Au A et al Mod Pathol 15 6 657 665 2002 Dandachi N Dietze O Hauser Kronberger C Anticancer Res 24 4 2401 6 2004 Wixom CR et al Appl Immunohistochem Mol Morphol 12 3 248 251 2004 Diaz LK et al J Histochem Cytochem 52 4 501 507 2004 van de Vijver M et al Chromogenic in situ hybridization CISH compared with FISH and IHC for detection of HER2 gene amplification An international validation ring study 26 Annual San Antonio Breast Cancer Symposium 2003 Amould L et al Br J Cancer 88 1587 91 2003 Gupta D et al Am J Clin Pathol 119 381 87 2003 Loring P et al Appl Immunohistochem Mol Morphol 13 2 194 200 2005 Rueschoff J et al HER2 status assessment by chromogenic in situ hybridization CISH demonstrates high sensitivity for predicting response to Herceptin 27 Annual San Antonio Breast Cancer Symposium 2004 Wolff AC et
19. CI 96 5 99 9 Les r sultats ont montr une concordance de 99 95 CI 96 5 99 9 indiquant un degr d accord lev entre le coffret SPOT Light HER2 CISH et le test PathVysion HER2 Le taux de concordance indiquait donc que le test du coffret SPOT Light HER2 CISH a fourni des r sultats quivalents au test PathVysion HER2 Un r capitulatif des deux cas discordants entre les tests de la sonde SPOT Light HER2 et PathVysion HER2 est indiqu ci dessous Les donn es CISH et FISH sont indiqu es sous forme de moyenne et d intervalle La colonne IHC indique le score HercepTest TM Tableau 4 Cas discordants entre les techniques FISH et CISH HER2 CISH Pos FISH N g HER2 CISH N g FISH Pos Nombre de CISH FISH IHC Nombre de CISH FISH IHC sujets sujets 2 0 98 94 Lo E A999 40700 1000 281 1 61 500 a 77 0 0 40 265 1006 00 1 nombre de cas discordants divis par le nombre total de cas acceptables utilisant les techniques FISH et CISH sur le site correspondant x 100 B Cas suppl mentaires IHC 2 60 cas IHC 2 suppl mentaires ont t fournis par le site d tude A et test s sur les sites d tude A et B Les r sultats de chaque site d tude ont montr que le test du coffret SPOT Light HER2 CISH a fourni des r sultats quivalents ceux obtenus avec le test PathVysion HER2 Les r sultats de la corr lation sont synth tis s dans les tableaux 5 et 6 Tabl
20. SH N g FISH Pos Nomb CISH FISH IHC Nombre de CISH FISH re de sujets sujets Site A 2 4 17 96 40501 4 07 1 00 10 00 2810677509 27 E LLL SE naoso 24805050 Site B 1 4 55 96 A 023 550 200 800 149 67 359 2 1 nombre de cas discordants divis par le nombre total de cas acceptables utilisant les techniques FISH et CISH sur le site correspondant x 100 PI84 0150 R v 0 0 Page 18 de 26 E Synth se des r sultats de la comparaison entre le coffret SPOT Light HER2 CISH et le coffret de la sonde ADN PathVysion HER2 Tableau 14 Synth se des r sultats obtenus avec le coffret SPOT Light HER2 CISH et le coffret de la sonde ADN PathVysion HER2 Cas A C Casd J I Cas t aeetis as quivoques as de polysomie cons cutifs Site A Site B Site A Site B Site A Site B Nombre 205 54 56 34 41 48 22 d chantillons de 94 4 96 75 0 96 77 8 42 9 96 80 0 85 7 100 0 concordance positive de 100 0 100 0 95 7 100 0 97 2 96 100 0 90 0 concordance n gative de 99 0 96 96 3 929 88 2 95 1 958 95 5 concordance totale Sensibilit analytique La sensibilit du coffret SPOT Light HER2 CISH a t test e partir de coupes de tissus canc reux du sein FFPE pr sentant un statut HER2 amplifi et non amplifi ainsi qu l aide des lign es cellulaires FFPE utilis es sur des lames de contr le Le g
21. X permet de localiser les cellules tumorales et de quantifier les copies du g ne HER2 Le DAB forme un pr cipit color permettant d archiver les r sultats et de les consulter ult rieurement Composants fournis Le coffret SPOT Light HER2 CISH contient l ensemble des r actifs requis pour effectuer la proc dure CISH sur des tissus inclus dans la paraffine et fix s au formol Les composants indiqu s ci dessous permettent d effectuer 20 tests et jusqu 2 s ries avec les deux lames de contr le en utilisant des chantillons de tissu mont s sous des lamelles de 24 mm x 30 mm La plupart des tests peuvent tre effectu s avec des lamelles protectrices plus petites Le coffret SPOT Light HER2 CISH est livr sur des blocs r frig rants Les blocs r frig rants doivent tre encore froids la r ception du coffret pour garantir que le mat riel n a pas t expos des temp ratures lev es Certains composants peuvent cependant rester d gel s sans que cela affecte les performances du coffret Veuillez consulter les recommandations de stockage des r actifs pour les ranger imm diatement apr s leur r ception R actif A Solution de pr traitement par la chaleur 1 1 contenant le tampon Tris EDTA pr t l emploi R actif B R actif de pr traitement enzymatique 5 ml contenant une solution de pepsine avec 0 05 d azide de sodium et de d tergent pr t l emploi ATTENTION dangereux R actif C Sonde HER2 0 4 ml de
22. al American Society of Clinical Oncology College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer Arch Pathol Lab Med 131 18 43 2007 Sheehan DC Hrapchak BB Theory and practice of histotechnology St Louis CV Mosby Company 1980 24 Kiernan JA Histological and histochemical methods theory and practice New York Pergamon Press 1981 Data on file PMA application amp USCAP 2008 Annual Meeting poster presentations numbers 138 139 amp 140 Cooper K et al J Clin Pathol 44 406 409 1991 MARQUES DE COMMERCE Clearmount M HistoGripTM HistomountTM et SPTTM sont des marques de commerce d Invitrogen Corporation SPOT Light et Zymed sont des marques d pos es d Invitrogen Corporation Herceptin est une marque d pos e de Genentech Inc HercepTestTM est une marque de commerce de Genentech Inc PathVysion est une marque d pos e d Abbott Molecular Inc PI84 0150 R v 0 0 Page 25 de 26 Invitrogen Corporation 542 Flynn Road Camarillo e CA 93012 1 800 955 6288 Pour tout probl me technique crire techsupport invitrogen com Pour obtenir des informations g n rales sur le coffret SPOT Light HER2 CISH crire her2cish invitrogen com URL www invitrogen com her2cish Explication des symboles utilis s Num ro de lot R f rence catalogue Limites de temp rature Fabricant Repr sentant agr pour l Union
23. ancer l ext rieur du noyau Pas d amplification o D finie comme 1 5 points uniques dans la majorit gt 50 des cellules tumorales dans la zone de tissu s lectionn e o lln est pas n cessaire de comptabiliser les points dans 30 cellules Facultatif utiliser la fiche de l annexe B Fiche de scores HER2 CISH pour la num ration des cellules Rapporter les r sultats sous forme de moyenne de la num ration cellulaire totale des 30 cellules pour obtenir un diagnostic pr cis de l absence d amplification PI84 0150 R v 0 0 Page 12 de 26 Amplification o D finie comme o 75 points dans la majorit gt 50 des cellules tumorales dans la zone de tissu s lectionn e ou o JD importants agr gats dans la majorit gt 50 des cellules tumorale dans la zone de tissu s lectionn e ou o Un m lange de points multiples et d agr gats importants dans la majorit gt 50 96 des cellules tumorales dans la zone de tissu s lectionn e ou o Un m lange de points multiples et de petits agr gats dans la majorit gt 50 des cellules tumorales dans la zone de tissu s lectionn e ou o De petits agr gats dans la majorit 50 des cellules tumorales dans la zone de tissu s lectionn e o Pour l ensemble des cas indiqu s ci dessus il n est pas n cessaire de compter les points dans 30 cellules Facultatif utiliser la fiche de l annexe B Fiche de scores HER2 CISH pour la num ration des cellule
24. aturation inappropri e b Temps de d naturation inappropri 3 Conditions de lavage stringent incorrectes a Temp rature de lavage stringent inappropri e sup rieure 80 C b Temps d incubation du lavage stringent inappropri 4 Temp rature de stockage ou de transport excessive 1 V rifier que les conditions de pr traitement ad quates ont t respect es Se reporter la proc dure a V rifier que les conditions de pr traitement par la chaleur ad quates ont t respect es 15 minutes 98 102 C b V rifier que les conditions de pr traitement enzymatique ad quates ont t respect es 5 min recommand es ou entre 2 et 20 min S assurer que l enzyme est temp rature ambiante 15 30 C avant d tre utilis e c Selon l paisseur du tissu 4 6 um et les m thodes de fixation le temps d incubation permettant d obtenir un pr traitement enzymatique optimal peut tre augment ou diminu 2 V rifier que les conditions de d naturation ad quates ont t respect es Se reporter la proc dure a V rifier que la temp rature de d naturation est de 95 C plage comprise entre 95 et 98 C et de 90 C plage comprise entre 85 et 90 C pour le thermocycleur PCR et le bloc chauffant b V rifier que le temps de d naturation est de 5 min pour le thermocycleur PCR 3 V rifier que les conditions de lavage stringent appropri es ont t respect es
25. btenir une digestion optimale 3 V rifier que les conditions de pr traitement ad quates ont t respect es Se reporter la proc dure 4 Ne pas appuyer sur la lamelle Pr humidifier les lames dans du tampon SSC temp rature ambiante entre 15 et 30 C pendant 2 3 min ou jusqu ce que la lamelle se d tache facilement 5 Sauf indication contraire ne pas laisser le tissu s cher pendant la proc dure CISH 6 V rifier que le tissu poss de une paisseur de 4 6 um 7 V rifier que le tissu est fix pendant 6 48 heures 8 V rifier que le tissu est fix dans du formol tamponn neutre 10 Coloration de fond 1 Temp rature de lavage stringent inappropri e lt 70 C 2 Incubation excessive avec le DAB 3 Utilisation de r actifs inappropri s comme tampon de lavage 1 V rifier que la temp rature de lavage stringent est appropri e 70 C 2 V rifier que le temps d incubation avec le DAB est de 30 min temp rature ambiante 15 30 C 3 Le tampon de lavage r actifs E1 E2 doit tre utilis lors des tapes d immunod tection Signaux apparents mais difficiles visualiser 1 Contre coloration l h matoxyline excessive 1 V rifier que le temps de la contre coloration du tissu est compris entre 3 et 5 secondes En cas de doute sur le temps de contre coloration optimal appliquer la contre coloration au tissu pendant 3 s puis laver penda
26. centage total 35 184 222 98 6 95 CI 96 196 99 7 Tableau 20 Reproductibilit CISH pour l ensemble des cas cons cutifs examin e par les sites C et A Site C Site r sultats CISH R sultats CISH Amplifi Non amplifi Total 19 cas ont t signal s avec des r sultats de test CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance du pourcentage total 32 171 207 98 1 95 CI 95 1 99 5 tudes de r p tabilit et de reproductibilit men es sur des coupes de tissus cons cutifs et plusieurs paisseurs de tissu Les tudes de r p tabilit et de reproductibilit ont t r alis es pour valuer la r p tabilit et la reproductibilit du coffret SPOT Light HER2 CISH lors du test de tissus canc reux du sein cons cutifs non amplifi s et amplifi s pr sentant des paisseurs variables Les chantillons valu s inclus dans les lames provenant de trois blocs de tissus canc reux du sein HER2 sans amplification normal HER2 avec une amplification limite et amplification HER2 lev e Dix chantillons par blocs de coupes cons cutives poss dant une paisseur de 4 um ont t trait s et test s selon les proc dures standard modalit s de contr le et des chantillons poss dant des paisseurs diff rentes comprises entre 2 et 8 um provenant de chaque bloc ont subi un traitement et des tests dupliqu s identiques conform ment aux proc dures standard Le
27. cepTest Score 0 Total 19 2i NA 00 Ca i8 5 N non amplifi 181 3 3 56 E N N total x 100 96 Nombre de cas FISH ou CISH acceptables avec le score IHC correspondant 962 n Nombre total de cas FISH ou CISH acceptables x 100 Tableau 2 Concordance entre CISH et IHC R sultats CISH R sultats IHC Positif 3 N gatif lt 3 Total Noname EE 20 cas ont t signal s avec des r sultats de test IHC ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 32 38 842 95 CI 68 8 94 0 Concordance n gative 164 168 97 6 95 CI 94 0 99 4 Concordance du pourcentage total Les r sultats ont montr une concordance de 95 1 95 CI 91 3 97 7 indiquant un degr d accord lev entre le coffret SPOT Light HER2 CISH et HerceptTestr 32 164 206 95 1 9 95 CI 91 3 97 7 PI84 0150 R v 0 0 Page 15 de 26 Tableau 3 Concordance entre CISH et FISH R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi Total amu 0 21 cas ont t signal s avec des r sultats de test FISH ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 34 36 94 4 95 CI 81 3 99 3 Concordance n gative 169 169 100 0 95 CI 97 8 100 Concordance du pourcentage total 34 169 205 99 95
28. comprenant un tissu de cancer du sein utilis pour montrer l amplification HER2 si utilis doit indiquer la pr sence d agr gats de g nes ou de gt 5 signaux ou points individuels par noyau dans la majorit gt 50 des cellules tumorales r v lant une r activit positive attendue Si le contr le positif ne montre pas la pr sence d agr gats ou de gt 5 signaux par noyau dans une majorit gt 50 de cellules tumorales les r sultats obtenus pour les chantillons de la patiente doivent tre consid r s comme erron s e Un contr le de tissu n gatif comprenant un tissu de cancer du sein utilis pour montrer l absence d amplification HER2 si utilis doit contenir lt 5 signaux par noyau dans la majorit gt 50 96 des cellules tumorales e En g n ral la pr sence de deux signaux ou points maximum dans les noyaux du tissu normal cellules pith liales ou stromales normales de la tumeur du contr le de tissu positif correspondant confirme l absence de r action crois e entre la sonde ainsi que les r actifs d immunod tection et les composants ou les tissus cellulaires Si un marquage non sp cifique intervient dans le noyau de la contrepartie de tissu normal du contr le de tissu positif les r sultats obtenus pour les chantillons de la patiente doivent tre consid r s comme erron s e Tout cart dans la manipulation des tissus et des proc dures techniques dans le laboratoire de l utilisateur doit tre valid
29. d tection CISH Laisser les lames s cher l air ou les s cher 37 C puis les passer au four pendant 2 4 heures 60 C Les tissus fix s et incorpor s de facon appropri e se conserveront de facon illimit e avant leur sectionnement et leur installation sur des lames s ils sont conserv s dans un endroit frais et sec entre 15 et PCT Les coupes de tissu de 2 3 um d paisseur risquent de donner des r sultats de copie de g ne faussement bas B Proc dure CISH standard pour les coupes de tissu FFPE Notes relatives la proc dure Tous les r actifs l exception du r actif C sonde HER2 doivent tre port s temp rature ambiante entre 15 et 30 C avant utilisation La sonde HER2 doit tre utilis e basse temp rature sans tre quilibr e temp rature ambiante Chaque incubation doit tre effectu e temp rature ambiante entre 15 et 30 C sauf indication contraire Au cours de la proc dure et sauf indication contraire veiller garder les coupes de tissu humide entre chacune des tapes Plusieurs lavages seront effectu s pendant la proc dure Renouveler la solution pour chaque lavage Les lames de contr le doivent tre trait es en m me temps que les chantillons du test de la patiente et subir un traitement identique chaque tape Sauf indication contraire toutes les tapes sont effectu es temp rature ambiante 15 30 C Cette proc dure s tend sur plus de huit h
30. des noyaux en interphase fix s au formol et inclus dans la paraffine Aucun autre type d chantillon ou de fixateur n a t valid e L interpr tation clinique de tous r sultats de test doit tre valu e dans le cadre des ant c dents m dicaux de la patiente et d autres tests de diagnostic PI84 0150 R v 0 0 Page 10 de 26 Contr le de la qualit Contr le positif et n gatif sur une m me lame Lame de contr le L Image 1 La lame de contr le L poss de une lign e cellulaire non amplifi e A MCF 7 et une lign e cellulaire amplifi e B SK OV 3 Remarque les lign es cellulaires ne sont pas mises l chelle et sont en r alit plus petites que sur le sch ma e Le signal CISH doit tre brun distinct et facile valuer e Les lames de contr le incluses lame L poss dent deux coupes de 4 um pr lev s sur des blocs de cellules FFPE pr par s partir de deux lign es de cellules diff rentes Ces lames doivent tre utilis es en tant que contr les de proc dure La lign e cellulaire A MCF 7 n est pas amplifi e et pr sentera lt 5 signaux ou points par noyau La lign e cellulaire B SK OV 3 est amplifi e et apparaitra sous forme d agr gats DAB de petite ou grande taille dans le noyau e Lalame de la lign e cellulaire de contr le doit tre trait e avec chaque s rie de lames de test de la patiente et subir le m me traitement que les coupes de tissu e Silalame de contr le lame L est n ga
31. e pr traitement par la chaleur r actif A dans un b cher plac sur une plaque chauffante jusqu l obtention d une bullition constante et d une temp rature gt 98 C Pour viter l vaporation du tampon recouvrir le b cher d un couvercle en verre ou d une feuille d aluminium c Placer les lames dans la solution en bullition couvrir le b cher commencer le compte rebours lorsque la temp rature atteint 98 C ou lorsque les bulles d bullition r apparaissent et porter bullition pendant 15 min V rifier que la temp rature reste comprise entre 98 C et 100 C d Mettre imm diatement les lames dans de l H2Od temp rature ambiante entre 15 et 30 C e Laver trois fois dans de l H2Od pendant 2 min chaque fois Digestion enzymatique Remarque pour la plupart des tissus mammaires une digestion enzymatique de 5 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C fournira des r sultats CISH optimum Le temps de digestion doit tre ajust en fonction des premiers r sultats obtenus l issue du temps de digestion de 5 min Un temps d incubation enzymatique diff rent peut tre requis selon la m thode de fixation et l paisseur du tissu D apr s une tude sp cifique le temps de digestion enzymatique peut varier de 2 20 min et fournir un signal CISH correct pour l valuation HER2 dans un ensemble d chantillons de tissus mammaires archiv s Une tude de concordance destin e promouvoir l utilisation de la techniq
32. e tissu 4 5 um fix s avec une solution tamponn e neutre de formol 10 le pr traitement enzymatique ne doit pas d passer 5 minutes Avec les tissus pour lesquels aucune donn e de fixation n est disponible un titrage enzymatique par exemple 2 min 5 min et 10 min doit tre effectu avec un d lai de digestion maximum ajust par rapport aux r sultats initiaux e R actif C Sonde marqu e HER2 contenant du formamide class comme dangereux R21 Dangereux au contact de la peau R22 Dangereux en cas d ingestion R61 Pr sente un risque pour le foetus S24 viter tout contact avec la peau 36 Porter des gants de protection appropri s S37 Porter des gants appropri s S39 Porter une protection oculaire faciale e R actif I2 Solution de DAB contenant du m thanol class comme inflammable et toxique Se reporter la fiche technique de s curit du composant pour plus d informations R10 Inflammable R23 24 25 Toxique en cas d inhalation d ingestion ou au contact de la peau S45 En cas d accident contacter imm diatement votre m decin si vous ressentez un malaise S36 Porter des gants de protection appropri s S37 Porter des gants appropri s e R actif K Solution de fixation Histomount contenant du tolu ne class comme hautement inflammable et dangereux en cas d inhalation Se reporter la fiche technique de s curit du composant pour plus d informations R11
33. eau 5 Concordance entre les techniques CISH et FISH sur le site d tude A avec les cas IHC 2 R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi Ampli pepe X0 Non ampli ma EE 6 cas ont t signal s comme incomplets ou incorrects Concordance positive 6 8 75 0 95 CI 34 9 96 8 Concordance n gative 46 46 100 0 95 CI 92 3 100 0 Concordance du pourcentage total 6 46 54 96 3 95 CI 87 3 99 6 Tableau 6 Concordance entre les techniques CISH et FISH sur le site d tude B avec les cas IHC 2 R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi ampin Non ampli uere e e n 4 cas ont t signal s comme incomplets ou incorrects Concordance positive 7 9 2TNS 95 CI 40 0 97 2 Concordance n gative 45 47 95 7 95 CI 85 5 99 5 Concordance du pourcentage total 7 45 56 92 9 95 CI 82 7 98 0 PI84 0150 R v 0 0 Page 16 de 26 Tableau 7 Cas IHC 2 discordants entre les techniques CISH et FISH HER2 CISH Pos FISH N g HER2 CISH N g FISH Pos Nombre IHC Nombre de de sujets Site A 2 3 70 94 A 277 100 5 00 2 48 0 50 5 00 Eoo dS 3676100 7 00 234050780 2 S178 20 00 20 00 20 00 1 25 0 50 2 00 9155 413 00 6 00 273000 60 9 nombre de cas discordants divis par le nombre total de cas acceptables utilisant les technique
34. ec la peau et les muqueuses En cas de contact avec la bouche ou les muqueuses rincer abondamment les zones concern es avec de l eau Les r actifs B F et G contiennent 0 1 d azide de sodium le r actif H contient 0 005 de sulfate de gentamicine et 0 1 de Proclin le r actif I2 contient 85 m v de m thanol et le r actif I3 contient 0 6 de peroxyde d hydrog ne Ces r actifs aux concentrations pr sentes dans le produit ne n cessitent pas d tre tiquet s comme produits dangereux Se reporter la fiche technique de s curit du composant pour plus d informations Le r actif B contient de la pepsine une enzyme susceptible de provoquer des r actions allergiques en cas de contact avec la peau Utiliser un bain marie un bloc chauffant et un four hybridation talonn s en temp rature pour des r sultats optimum Certains r actifs de ce coffret contiennent de l azide de sodium comme agent de conservation L azide de sodium peut r agir avec le plomb ou le cuivre des tuyauteries et former des azides m talliques explosifs notamment si une accumulation se produit Lors de l limination des r actifs contenant de l azide de sodium rincer abondamment avec de l eau pour viter tout risque chimique dans les tuyauteries Certains r actifs de ce coffret contiennent du Proclin de l azide de sodium ou du peroxyde d hydrog ne Ces r actifs sont class s comme dangereux car ils provoquent des irritations cutan es
35. epteur La prot ine HER2 poss de une activit tyrosine kinase et partage une relative homologie avec le r cepteur du facteur de croissance de l piderme connu sous les noms de EGFr HER lou c erbB 1 L amplification du g ne HER2 ou la surexpression de la prot ine HER2 a t identifi e dans 18 30 des cancers du sein humains L identification du statut d amplification du g ne HER2 est cruciale pour tablir le pronostic des patientes diagnostiqu es avec un cancer du sein invasif ainsi que pour s lectionner les patientes ligibles une th rapie au trastuzumab Herceptin F Hoffmann La Roche Ltd Basel Suisse et Genentech Inc South San Francisco CA Le trastuzumab est un anticorps monoclonal sp cifique la prot ine HER2 Le trastuzumab s av re tre un traitement efficace uniquement chez les patientes dont les tumeurs pr sentent une amplification du g ne HER2 et ou une surexpression de la prot ine HER2 Dans les cancers du sein pr coces une br ve cure de trastuzumab administr e en m me temps que du doc taxel ou du vinorelbine a donn de bons r sultats chez les femmes atteintes d un cancer du sein avec une amplification du g ne HER2 neu D autres tudes ont galement montr que le statut HER2 permettait d anticiper la sensibilit ou la r sistance certaines chimioth rapies Par cons quent des m thodes pr cises fiables et directes pour l valuation du statut du g ne HER2 et de la prot i
36. es tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame peut tre utilis comme r f rence Se reporter la figure E r 4 1 A Agr gats importants pass GE he vd c AN C Agr gats importants et points multiples E Petits agr gats i 4 ex B Points multiples gt 10 points E D gt 5 10 points 6 invitrogen Pas d amplification du g ne HER2 Pas d amplification Polysomie 3 5 points du g ne HER2 sont pr sents dans chaque noyau de gt 50 des cellules canc reuses Se reporter la figure F Un point unique poss de un pourtour arrondi et lisse dans les cellules normales ou tumorales Se reporter la figure F Diploidie 1 2 points du g ne HER2 pr sents dans chaque noyau de 5096 des cellules canc reuses Se reporter la figure G Un point unique poss de un pourtour arrondi et lisse dans les yf KE Ww cellules normales ou tumorales Se reporter la figure G x 3 EA wa 0 f G dm E 2 N Doublet 2 X Lo V3 Si deux signaux sont situ s une distance inf rieure au diam tre DL J m A M Z d un signal ces signaux doivent tre comptabilis s comme un 2 d H Doublet 1 point Image gracieusement fournie par le Dr Adrienne point unique Les doublets apparaissent sous forme de paires et Morey ne constituent pas de v ritables petits agr gat
37. et au niveau des muqueuses Ces substances sont fournies sous forme dilu e dans ce coffret r duisant ainsi de mani re significative mais pas absolue les risques d exposition viter tout contact avec la peau les yeux et les v tements Se reporter la fiche technique de s curit du composant pour plus d informations Le 3 3 diaminobenzidine tetrachloride DAB peut tre dangereux s il est ingurgit inhal ou absorb au niveau cutan Il peut galement provoquer des irritations au niveau des yeux de la peau des muqueuses et des voies respiratoires sup rieures Le DAB est consid r comme potentiellement carcinog ne Consulter les r glementations f d rales nationales et ou locales pour plus d informations sur les recommandations pour l limination viter toute vaporation du r actif I2 Le m thanol est volatile Prendre les mesures appropri es pour viter toute vaporation comme le scellement du conteneur et l abaissement du couvercle imm diatement apr s utilisation L vaporation du m thanol peut entra ner la formation d un pr cipit de DAB pouvant affecter les r sultats du marquage PI84 0150 R v 0 0 Page 4 de 26 e viter toute vaporation pendant l hybridation en garantissant que les lames sont correctement scell es et que le taux d humidit de la chambre d hybridation est appropri e Le pr traitement enzymatique peut varier selon la fixation et l paisseur du tissu Pour la plupart des coupes d
38. eures Un d coupage pratique est indiqu ci dessous sur deux jours Le premier jour d crit les tapes de d paraffinage jusqu la d naturation et l hybridation pendant la nuit et les tapes comprenant le lavage stringent jusqu la lecture au moyen d un microscope en champ clair ont lieu le deuxi me jour Les r actifs Invitrogen fournis avec le coffret sont indispensables pour la proc dure CISH L utilisation de r actifs de lots diff rents risque de cr er des bruits de fond lev s ou d entrainer une diminution ou la perte du signal CISH La substitution de l un des r actifs fournis dans le coffret peut invalider les r sultats du test Proc dure du jour 1 1 Pr paration du r actif Xyl ne 2 conteneurs de lames thanol absolu 3 conteneurs de lames o Recouvrir compl tement et conserver jusqu 1 semaine temp rature ambiante entre 15 et 30 C ou jusqu au traitement de la 100e lame Gradients de concentration d thanol EtOH PI84 0150 R v 0 0 Page 6 de 26 2 5 o Pr parer plusieurs bains avec de l thanol 70 85 95 et 100 o Recouvrir compl tement et conserver jusqu 1 semaine temp rature ambiante entre 15 et 30 C ou jusqu au traitement de la 100e lame tiqueter chaque r actif de lavage de fa on appropri e et consigner et conserver l ordre d utilisation pendant la proc dure D paraffinage Remarque pr parer les r actifs en quantit suffisante p
39. frais Reporter les r sultats dans la fiche de l annexe B Fiche de scores HER2 CISH 1 Compter les points dans 30 cellules tumorales de la zone de tissu s lectionn e Se reporter au point 4 ci dessous si des petits agr gats sont identifi s Additionner tous les points trouv s dans les 30 cellules et calculer la moyenne 3 Rapporter le r sultat comme une moyenne de la num ration des 60 cellules Si un m lange de points uniques et de petits agr gats suite l agr gation de plusieurs points uniques est observ ou si seuls des petits agr gats sont identifi s e Compter un petit agr gat comme 5 points e Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame peut tre utilis comme r f rence pour d terminer ce quoi correspond un petit agr gat 5 Rapporter le r sultat comme une moyenne de la num ration des 60 cellules pour obtenir un diagnostic de l amplification ou de l absence d amplification conform ment aux directives d Invitrogen e Enregistrement des r sultats Les r sultats peuvent tre report s dans la fiche de l annexe B Fiche de scores HER2 CISH Le rapport de statut HER2 doit tre enregistr conform ment aux directives d Invitrogen notamment pour les cas impr cis d amplification ou d absence d amplification PI84 0150 R v 0 0 Page 13 de 26 R capitulatif de l interpr tation Amplification 7 5 points agr gats importants m
40. he sur les bords de la lamelle en d passant l g rement sur la lame d Laisser s cher la colle caoutchouc 10 min environ pour viter tout glissement de la lamelle e La d naturation et l hybridation peuvent tre effectu es au moyen d un thermocycleur PCR en utilisant un bloc de lames ou un bloc chauffant dot d un affichage digital de la temp rature ainsi que d une chambre de simulation d humidit pour lames et un incubateur 37 C 1 Lors de l utilisation d un thermocycleur PCR avec un bloc de lames d naturer 95 C 1 C pendant 5 min puis laisser incuber toute la nuit entre 10 et 18 h 37 C 1 C 2 Lors de l utilisation d un bloc chauffant et d une chambre de simulation d humidit avec un incubateur 37 C d naturer 95 C 1 C pendant 5 min puis laisser incuber toute la nuit entre 10 et 18 h 37 C 1 C dans une chambre de simulation d humidit Proc dure du jour 2 8 Pr paration du r actif e PBS tampon phosphate salin o Verser 1 paquet de PBS en poudre r actif E1 dans 1 1 de H Od M langer e Tampon PBS Tween 20 tampon Tween 0 01 o Ajouter 10 gouttes de Tween 20 50 r actif E2 dans 1 1 de PBS extrait du m lange ci dessus M langer o Conserver temp rature ambiante entre 15 et 30 C jusqu 1 semaine e Solution substrat chromog ne DAB o Pr parer cette solution imm diatement avant utilisation o Ajouter 1 goutte de chaque r actif I1 I2 I3 dans
41. ion de la polysomie utilis e sur chaque site Les r sultats de chaque site d tude ont montr que le test du coffret SPOT Light HER2 CISH a fourni des r sultats quivalents ceux obtenus avec le test PathVysion HER2 Les r sultats sont synth tis s dans les tableaux 11 et 12 Tableau 11 Concordance des techniques CISH et FISH avec les cas de polysomie sur le site d tude A R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi Total Ampli a T 9 T 3 Non amplifi 3 cas ont t signal s avec des r sultats de test FISH ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 12 14 85 7 95 CI 57 2 98 2 Concordance n gative 34 34 100 0 95 CI 89 7 100 0 Concordance du pourcentage total 127 34 48 95 8 95 CI 85 8 79 99 5 Tableau 12 Concordance des techniques CISH et FISH avec les cas de polysomie sur le site d tude B Resultats CISH Total Noam 9 y 9 L SSS 0 cas ont t signal s avec des r sultats de test FISH ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 12 12 100 0 95 CI 73 5 100 0 Concordance n gative 9 10 90 0 95 CI 55 5 99 8 Concordance du pourcentage total 12 9 22 95 5 9 95 CI 77 2 99 9 Tableau 13 Cas de polysomie discordants entre les techniques CISH et FISH HER2 CISH Pos FISH N g HER2 CI
42. la population f minine g n rale atteinte du cancer du sein est de 18 30 95 5 Lors de la comparaison de l amplification du g ne HER2 la surexpression de la prot ine HER2 les tudes ont montr que jusqu 5 des patientes atteintes d un cancer du sein sont positives la surexpression de la prot ine au test par immunohistochimie IHC et n gatives pour l amplification du g ne HER2 Caract ristiques de performances sp cifiques Performances cliniques La s curit et l efficacit du coffret SPOT Light HER2 CISH ont t valu es dans une tude comparative de trois tests le coffret SPOT Light HER2 CISH PathVysion FISH et HercepTestTM L tude a port sur deux types de cas 226 cas cons cutifs et 60 cas suppl mentaires Les cas cons cutifs ont t s lectionn s partir de cancers du sein invasifs cons cutifs examin s dans le cadre de la prise en charge des patientes sur deux sites d tude A et B Les cas suppl mentaires correspondent aux cas ayant re u un score de 2 par immunohistochimie IHC l aide de l anticorps AB8 pendant la prise en charge des patientes sur le site A A Cas cons cutifs Le tableau suivant synth tise la r partition des r sultats CISH et FISH par rapport aux scores HercepTest Un test tait consid r acceptable si la lame marqu e obtenue permettait d effectuer une valuation Tableau 1 R sultats des techniques IHC FISH et CISH Expression dela prot ine Her
43. ne HER2 ont acquis une importance croissante PI84 0150 R v 0 0 Page 1 de 26 Principes de la proc dure La technique CISH utilise des sondes ADN marqu es la digoxig nine sp cifiques du locus du g ne HER2 sur le chromosome 17q11 2 21 pour l hybridation avec les acides nucl iques compl mentaires pr sents dans l chantillon de cancer du sein La sonde HER2 marqu e a t mise au point l aide de la technologie propri taire et brevet e Subtraction Probe Technology SPTTM qui permet de cr er des sondes sp cifiques en r duisant de mani re significative les s quences r p titives par exemple l ments Alu et LINE pr sentes dans les acides nucl iques humains Il a t d montr par m thode PCR que la sonde contient le g ne HER2 et par la m thode FISH sur m taphase sur des lymphocytes normaux qu elle se lie sp cifiquement au locus du g ne HER2 sur le chromosome 17q11 2 21 Par cons quent les sondes SPTTM d Invitrogen sont sp cifiques par nature et ne requi rent pas de bocage des s quences r p titives comme cela est n cessaire pour les sondes ADN cytog n tiques traditionnelles La technique CISH permet d valuer les aberrations g n tiques sous un microscope en champ clair par d tection chromog nique Les r sultats de la coloration CISH peuvent tre visualis s avec nettet l aide d un microscope en champ clair standard et d un objectif sec de 40X Le statut d amplification du g ne HER2 peut
44. nt 2 min l eau courante V rifier le tissu avec la contre coloration au microscope S il est trop clair appliquer la contre coloration au tissu pendant 3 5 s nouveau avant de poser la lamelle Zones sans signal 1 Formation de bulles d air sous la lamelle lors de l ajout de la sonde 2 Volume de sonde insuffisant par rapport la taille du tissu 1 V rifier l absence de bulles d air lors de l ajout de la sonde et de la lamelle 2 Ajouter environ 15 ul pour un tissu recouvert d une lamelle de 22 x 22 mm Davantage de sonde et une lamelle plus large peuvent tre n cessaires pour des tissus plus grands utiliser 20 ul pour un tissu recouvert par une lamelle de 24 x 30 mm REMARQUE si vous rencontrez un autre cas de figure ou si le probl me persiste malgr l action recommand e contacter le service d assistance technique en composant le 1 800 955 6288 Etats Unis uniquement ou envoyez un e mail techsupport invitrogen com PI84 0150 R v 0 0 Page 24 de 26 BIBLIOGRAPHIE 19590 ON ONE SU bae 26 27 28 29 King CR Kraus MH Aaronson SA Science 229 4717 974 976 1985 Schechter AL Hung MC Vaidyanathan L et al Science 229 976 978 1985 Semba K Kamata N Toyoshima K et al PNAS 82 19 6497 6501 1985 Ross JS Fletcher JA Am J Clin Pathol 112 S53 S67 1999 Shak S Semin Oncol 4 Suppl 12 71 77 1999 Cobleigh MA Vogel CL Tripathy D et al J Clin Oncol 17
45. ou agr gat de signaux amplifi s noyau dans gt 50 96 des cellules tumorales R sultat O Pas d amplification lt 5 L1 Amplification gt 5 Signature du technicien et date Signature du pathologiste et date invitrogen 2008 Invitrogen Corporation Tous droits r serv s Ces produits peuvent tre couverts par une ou plusieurs licences usage limit consulter le catalogue d Invitrogen ou au site www invitrogen com En utilisant ces produits vous acceptez les termes et les conditions de l ensemble des licences usage limit applicables Ne convient pas une utilisation des fins de diagnostic ou th rapeutiques chez l homme ou l animal sauf indication contraire O 079226 r1 0808 www nvitrogen com
46. our chaque conteneur de lames utiliser pour le nombre de lames de la s rie Chaque lavage n cessite un volume sp cifique de r actif Si l tape suivante est d cal e laisser s cher les lames l air apr s les avoir tremp es trois fois dans de l thanol absolu au lieu de les laver dans de l H2Od trois reprises a Plonger deux fois dans du xyl ne pendant 5 min chaque fois b Tremper trois fois dans de l thanol absolu pendant 3 min chaque fois c Laver trois fois dans de l H2Od pendant 2 min chaque fois Effectuer le d paraffinage si n cessaire pour obtenir des r sultats optimum et reproductibles Pr traitement par la chaleur Remarque les lames doivent tre port es bullition et chauff es une temp rature gt 98 C pendant 15 min dans la solution de pr traitement par la chaleur r actif A V rifier que la temp rature est comprise entre 98 C et 100 C pour viter de surchauffer les lames Il est recommand d utiliser la plaque chauffante lors de cette tape pour les protocoles utilisant un autocuiseur avec un indicateur de pression et de temp rature ou un four micro ondes dot d un indicateur des temp ratures veuillez contacter le service d assistance technique d Invitrogen l adresse suivante techsupport invitrogen com La solution de pr traitement par la chaleur r actif A peut tre utilis e deux fois avant d tre jet e a Placer les lames sur la grille b Chauffer la solution d
47. que a t d finie par la technique FISH en m taphase sur des lymphocytes normaux Le test par PCR a r v l la bande ADN voulue et le s quen age ADN a indiqu l emplacement chromosomique correct et la couverture du g ne HER2 Limites de la proc dure La proc dure SPOT Light HER2 CISH a t test e avec les valeurs extr mes de chacun des param tres suivants paisseur du tissu pr traitement d naturation hybridation lavage stringent immunod tection et contre coloration Aucune diff rence significative au niveau des r sultats CISH n a t observ e dans les conditions suivantes PI84 0150 R v 0 0 Page 19 de 26 Tableau 15 Limites de la proc dure Plages acceptables pour le param tre du test paisseur du tissu 4 6 um Pr traitement par la 99 100 C 10 20 min chaleur Digestion 4 14 min enzymatique D naturation Thermocycleur PCR 93 98 C 2 8 min Hybridation 30 39 C 10 18h Lavage stringent 60 78 C 2 8 min Immunod tection Conjugu polym re HRP 25v60 min Chromog ne DAB 15 60 min Coloration de 3 30s contraste Reproductibilit Trois lots de coffrets SPOT Light HER2 CISH ont t test s sur 3 chantillons de tissus canc reux du sein et sur 4 chantillons de lign es cellulaires avec diff rents niveaux de g ne HER2 Les performances du test des 3 lots test s ont t identiques Reproductibilit entre les s ries d
48. r une zone de tissu pr sentant des signaux CISH puissants pour l num ration du signal Effectuer l num ration du signal Si l chantillon pr sente une h t rog n it intratumorale du statut du g ne HER2 dans le carcinome envahissant s lectionner les zones repr sentant chaque statut du g ne HER2 pour l num ration du signal Un chantillon de tissu est h t rog ne si le statut du g ne HER2 cellules amplifi es et non amplifi es varie dans plusieurs zones du m me fragment d un cancer du sein primaire Les cellules de chaque zone d h t rog n it doivent tre valu es pour d terminer le statut HER2 amplifi ou non amplifi pr dominant dans plus de 50 de la coupe tumorale Effectuer l num ration du signal de la zone dans laquelle le statut HER2 pr domine pour cette tumeur Enum ration du signal Utiliser un objectif de 40X Un objectif plus grand peut tre utilis si n cessaire mais une immersion dans l huile est inutile Consulter l annexe A Guide d interpr tation du test HER2 CISH Un g ne HER2 individuel apparait sous forme d un petit point rond figure G Ne pas comptabiliser les noyaux chevauchants ou les zones dans lesquelles les noyaux ne sont pas visibles Comptabiliser uniquement le signal CISH se trouvant l int rieur d un noyau Exclure les signaux sporadiques occasionnels pouvant tre li s des restes d un d bordement d ADN HERQ2 suite au renouvellement des cellules de c
49. s Rapporter les r sultats sous forme de moyenne de la num ration cellulaire totale des 30 cellules pour obtenir un diagnostic pr cis de l absence d amplification des fins de num ration compter un petit agr gat comme 5 points et un agr gat important comme 10 points o Justification l affectation d un nombre de points sp cifique aux agr gats de petite et grande taille est arbitraire des fins de quantification Les cellules poss dent g n ralement deux copies de g ne HER2 Les cellules pour lesquelles l ADN a t r pliqu mais qui ne se sont pas encore t divis es poss dent 4 copies de g ne Un petit agr gat indique donc une amplification et poss de un nombre minimum de 5 copies du g ne Un agr gat important au moins quivalent au double de la taille d un petit agr gat poss dera un nombre minimum de 10 copies du g ne e Casimpr cis d amplification ou d absence d amplification Interpr ter avec soin les chantillons qui n appartiennent pas clairement l une des cat gories amplification pas d amplification Ces chantillons poss dent entre 4 et 6 points dans la majorit gt 50 des cellules tumorales dans le champ cible Lorsque le nombre moyen de points se situe entre 4 et 6 points apr s avoir effectu la num ration de 30 cellules tumorales 30 cellules suppl mentaires doivent tre compt es pour obtenir un total de 60 cellules Si le doute persiste refaire le test avec une lame d chantillon
50. s Se reporter la figure H e e Invitrogen www invitrogen com 2008 Invitrogen Corporation Tous droits r serv s Ces produits peuvent tre couverts par une ou plusieurs licences usage limit consulter le catalogue d Invitrogen ou au site www invitrogen com En utilisant ces produits vous acceptez les termes et les conditions de l ensemble des licences usage limit applicables Ne convient pas une utilisation des fins de diagnostic ou th rapeutiques chez l homme ou l animal sauf indication contraire O 079226 r1 0808 Annexe B Fiche de scores HER2 CISH Coffret SPOT Light HER2 CISH r f rence catalogue 84 0150 Num ro d identification du registre de la s rie de marquage Num ro de lot du coffret SPOT Light HER2 CISH 84 0150 Num ro d identification de l chantillon R sultats CISH indiquer le nombre de signaux HER2 pour chaque cellule valu e Tableau 1 R sultats CISH Cellule n Points ou agr gats HER2 Cellule n Points ou agr gats HER2 Cellule n Points ou agr gats HER2 1 1 21 2 2 22 3 3 23 4 4 24 5 5 25 6 6 26 7 7 27 8 8 28 9 9 29 10 20 30 Remarque pour les agr gats veuillez fournir l estimation la plus pr cise des points copies du g ne petit agr gat 5 points agr gat important 10 points Somme des points dans 30 cellules Moyenne des points dans 30 cellules Si la moyenne se situe entre 4 et 6 point
51. s compter les points dans 30 cellules suppl mentaires afin d obtenir un total de 60 cellules et indiquer les r sultats dans le tableau 2 Si la moyenne est 4 ou gt 6 il n est pas n cessaire de compter 30 cellules suppl mentaires L chantillon peut tre consign sous forme d amplification ou d absence d amplification Score CISH Instructions de consignation des scores HER2 CISH d Invitrogen Pas d amplification 1 5 signaux noyau dans les cellules tumorales Amplification gt 5 signaux noyau ou agr gat de signaux amplifi s noyau dans gt 50 96 des cellules tumorales R sultat Pas d amplification x 5 Amplification gt 5 Signature du technicien et date Signature du pathologiste et date invitrogen Tableau 2 r sultats CISH Indiquer le nombre de points pr sents dans le deuxi me ensemble de 30 cellules si n cessaire Cellule n Points ou agr gats HER2 Cellule n Points ou agr gats HER2 Cellule n Points ou agr gats HER2 1 1 21 2 2 22 3 3 23 4 4 24 5 5 25 6 6 26 7 7 27 8 8 28 9 9 29 10 20 30 Somme des points dans les cellules 31 60 Somme des points dans les cellules 1 30 Moyenne des points dans 60 cellules Score CISH Instructions de consignation des scores HER2 CISH d Invitrogen Pas d amplification 1 5 signaux noyau dans les cellules tumorales Amplification gt 5 signaux noyau
52. s FISH et CISH sur le site correspondant x 100 C Cas HercepTest 2 Tous les cas cons cutifs et suppl mentaires ont t test s l aide de la m thode HercepTest M Les cas ayant donn des scores HercepTestTM 2 ont t combin s et test s sur les deux sites d tude Les r sultats de chaque site d tude ont montr que le test du coffret SPOT Light HER2 CISH a fourni des r sultats quivalents ceux obtenus avec le test PathVysion HER2 Les r sultats de la corr lation sont synth tis s dans les tableaux 8 et 9 Tableau 8 Concordance entre les techniques CISH et FISH appliqu es aux cas HercepTest 2 sur le site d tude A R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi Total Ampli NER CERRO a Non ampli 2 cas ont t signal s avec des r sultats de test FISH ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 3 7 42 9 95 CI 9 9 81 6 Concordance n gative 27 27 100 0 95 CI 87 2 100 0 Concordance du pourcentage total 3427 34 88 2 95 CI 72 6 96 7 Tableau 9 Concordance entre les techniques CISH et FISH appliqu es aux cas HercepTest 2 sur le site d tude B R sultats CISH R sultats FISH Amplifi Non amplifi Total min a 4 LCS Non ampli 2 cas ont t signal s avec des r sultats de test FISH ou CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance positive 4 5
53. s r sultats du test sont indiqu s dans les tableaux 21 23 Tableau 21 Moyenne des points HER2 CISH par cellule dans des coupes cons cutives de 4 um cancer du sein avec un statut HER2 normal Num ro de fragment I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Moyenne de points HER2 1 8 20 19 20 1 6 17 1 7 1 6 1 7 2 0 CISH noyau Moyenne HER2 1 8 STD 0 16 CV 8 9 Tableau 22 Moyenne des points HER2 CISH par cellule dans des coupes cons cutives de 4 um cancer du sein avec amplification limite de la prot ine HER2 Num ro de fragment 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Moyenne de points HER2 54 5 5 53 58 52 6 2 5 7 54 55 58 CISH noyau PI84 0150 R v 0 0 Page 22 de 26 Moyenne HER2 5 6 STD 0 30 CV 5 4 Tableau 23 Moyenne des points HER2 CISH par cellule dans des coupes cons cutives de 4 um cancer du sein avec un statut HER2 amplifi Num ro de fragment 7 8 9 10 Moyenne de points HER2 BC BC BC BC BC BC BC BC BC BC CISH noyau D pannage Probl me Cause probable Action recommand e Signal faible ou absent 1 Non respect des instructions de pr traitement a Conditions de pr traitement par la chaleur inappropri es temps d incubation ou temp rature b Conditions de pr traitement enzymatique inappropri es temps ou temp rature c paisseur excessive de la coupe de tissu ne permettant pas d obtenir des r sultats optimum 2 Conditions de d naturation inappropri es a Temp rature de d n
54. t un groupe de signaux de forme irr guli re avec un diam tre de 3 5 fois celui d un point unique Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame peut tre utilis comme r f rence e Unagr gat important figure A Un agr gat important est un groupe de signaux de forme irr guli re avec un diam tre 5 fois sup rieur celui d un point unique Un point unique provenant des cellules tumorales ou des cellules pith liales normales de la m me lame devrait tre utilis comme r f rence Grossissement Signal CISH 10X Les points uniques sont peine visibles et facilement oubli s 20X Les points uniques sont petits mais ais ment discernables 40X Les points uniques sont facilement identifi s 60X ou 100X Non requis S lection des champs cible pour l num ration du signal HER2 CISH Au moyen d objectifs de 4X 20X balayer l chantillon marqu par la m thode CISH afin d identifier les zones les plus repr sentatives du point de vue histopathologique de carcinome envahissant viter les zones de n crose les signaux chevauchants li s au chevauchement des noyaux et les noyaux pr sentant une faible intensit de signal viter les carcinomes intracanalaires DCIS dans les carcinomes envahissants valuer l h t rog n it intratumorale possible du statut du g ne HER2 avant l num ration CISH Si l chantillon est homog ne choisi
55. tillon 6 NAM chantillon 7 Agr gat important Agr gat important Agr gat important points multiples points multiples AM AM AM chantillon 8 NAM Reproductibilit par site L tude de reproductibilit CISH men e site par site s appuyait sur 226 cas cons cutifs r p t s sur trois sites d tude Les pourcentages de concordance totale pour la reproductibilit CISH utilisant le crit re gt 5 comme seuil de positivit taient de 99 0 98 6 et 98 1 indiquant une forte reproductibilit du test avec le coffret SPOT Light HER2 CISH Tableau 18 Reproductibilit CISH pour l ensemble des cas cons cutifs examin e par les sites A et B Site A Site B r sultats CISH R sultats CISH Amplifi Non amplifi Total Amplifi le Jo a 0 0 Non amplifi 20 cas ont t signal s avec des r sultats de test CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance du pourcentage total 34 170 206 990 95 CI 96 5 99 9 PI84 0150 R v 0 0 Page 21 de 26 Tableau 19 Reproductibilit CISH pour l ensemble des cas cons cutifs examin e par les sites C et B Site C Site B r sultats CISH R sultats CISH Amplifi Non amplifi Total Amii e Q ws 4 cas ont t signal s avec des r sultats de test CISH manquants ou incorrects et ne figurent pas dans le tableau Concordance du pour
56. tive pour les lign es cellulaires A et B cela indique une erreur dans la proc dure CISH e La lign e cellulaire de contr le positif B qui permet de montrer l amplification HER2 doit tre d abord examin e pour garantir que tous les r actifs fonctionnent correctement La pr sence d agr gats de g nes ou de gt 5 signaux ou points individuels dans le noyau d une m me cellule indique une r activit positive attendue Si le contr le positif ne montre pas la pr sence d agr gats ou de gt 5 signaux par noyau dans une majorit gt 50 de cellules tumorales les r sultats obtenus pour les sp cimens de la patiente doivent tre consid r s comme erron s e La lign e cellulaire de contr le n gatif ou normal A qui permet de montrer l absence d amplification HER2 doit contenir lt 5 points dans le noyau de chaque cellule e Siun marquage non sp cifique intervient dans le noyau de la lign e de contr le normal A les r sultats obtenus pour les chantillons de la patiente doivent tre consid r s comme erron s e Un marquage non sp cifique se distingue g n ralement par sa coloration diffuse Une coloration brune sporadique peut parfois tre observ e l ext rieur du noyau dans les coupes de tissu excessivement fix s au formol Le cas ch ant les r sultats doivent tre interpr t s avec soin Le marquage non sp cifique ne doit pas tre confondu avec des signaux CISH positifs e Un contr le de tissu positif
57. ubateur 37 C Thermocycleur PCR avec bloc de lames OU Bloc chauffant avec thermom tre num rique et incubateur 37 C 1 C et chambre de simulation d humidit pour lames Bain marie capable de maintenir une temp rature comprise entre 70 et 80 C avec un thermom tre talonn Jarres Coplin et jarres de coloration Microscope en champ clair avec des objectifs de 20X et de 40X Pr cautions Destin au diagnostic in vitro R serv aux utilisateurs professionnels qualifi s Utiliser le coffret avant la date de p remption indiqu e sur l tiquette Si le produit est stock dans des conditions autres que celles indiqu es sur la notice ces conditions de stockage doivent tre v rifi es par l utilisateur Ne pas manger boire fumer ou utiliser de produits cosm tiques sur le lieu de manipulation des composants du coffret Les bonnes pratiques de laboratoire internationales doivent tre observ es Aucune m thode de test ne peut apporter une garantie absolue quant l absence de tout risque biologique Manipuler le mat riel selon le niveau de s curit 2 de la m me fa on que tout mat riel humain potentiellement infectieux tel que recommand par le Centers for Disease Control National Institutes for Health dans le manuel Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4 me dition avril 1999 Ne pas pipeter les r actifs avec la bouche et viter tout contact des sp cimens et des r actifs av
58. ue CISH par rapport la technique FISH a montr que pour les chantillons de tissus canc reux du sein cliniques utilis s et trait s au cours des 12 mois de l tude le temps de digestion enzymatique de 5 min fournissait des signaux CISH optimum pour la quantification du g ne HER2 U a quilibrer le r actif de pr traitement enzymatique r actif B temp rature ambiante entre 15 et 30 C b Ajouter suffisamment de r actif B pour recouvrir la coupe de tissu et incuber pendant 5 min temp rature ambiante entre 15 et 30 C c Laver trois fois dans de l H2Od pendant 2 min chaque fois D shydratation dans des concentrations croissantes d thanol a thanol 70 pendant 2 min b thanol 85 pendant 2 min c thanol 95 pendant 2 min d thanol absolu pendant 2 min e thanol absolu pendant 2 min PI84 0150 R v 0 0 Page 7 de 26 6 S cher les lames l air libre pendant gt 20 min ou jusqu leur s chage complet tiqueter les lames l aide d un crayon si n cessaire 7 D naturation et hybridation Remarque utiliser un thermocycleur PCR avec le bloc de lames ou un bloc chauffant affichage digital de la temp rature et une chambre de simulation d humidit pour lames avec un incubateur 37 C ou un appareil comparable V rifier que le taux d humidit des chambres est appropri L hybridation effectu e sur des p riodes plus courtes peut cr er un signal plus faible La d naturation de la
59. un jour l autre L tude a valu la reproductibilit entre les s ries CISH sur trois jours diff rents en utilisant des chantillons de cancer du sein avec trois types de statuts HER2 poss dant 3 sp cimens de chaque type La synth se des r sultats est indiqu e ci dessous Tableau 16 Reproductibilit entre les s ries d un jour l autre Copie du g ne Non amplifi Non amplifi polysomie Amplifi MoyneN 9 17 3 45 2022 carttpe 9 905 9 12 1 72 CV 9 3 4 8 tude observateur observateur Trois pathologistes ont t form s la lecture des lames pr par es et color es l aide du coffret SPOT Light HER2 CISH Pour valider la comp tence huit lames pr color es 6 non amplifi es et 2 amplifi es fournies par Invitrogen ont t donn es chaque pathologiste Pour les deux types de cas avec et sans amplification tous les chantillons 100 ont t interpr t s avec pr cision PI84 0150 R v 0 0 Page 20 de 26 Tableau 17 Reproductibilit entre les observateurs Signal CISH moyenne points cellule HER2 CISH et statut Num ro du g ne HER2 lame chantillon 1 2 points 1 5 points 1 2 NAM NAM NAM NAM d identification de la lame chantillon 2 Agr gat important Agr gat important AM points multiples points multiples AM AM chantillon 3 4 chantillon 4 NAM chantillon 5 NAM chan

Coffret SPOT-Light HER2 CISH

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents