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1. S SO i oh S D KE ah Figure 62 Cin tique d expression des g nes r gul s pendant la cicatrisation Cooper et al 2005 Les donn es obtenues avec des souris sauvages sont repr sent es en bleu celles des souris PU1 en rose Environ 450 g nes consid r s comme des g nes impliqu s dans la r paration tissulaire pr sentent une r gulation au cours de la cicatrisation identique chez les souris sauvages et mut es et donc ind pendante de la pr sence de cellules de l immunit inn e groupes a b c et d Au contraire 200 g nes voient leur expression 129 modul e par la pr sence de macrophages groupes e f et g Le groupe a contenant les g nes de r ponse pr coce est principalement constitu de facteurs de transcription Egri Fosb Fra1 Junb Klf9 Klf10 Myc Parmi les effecteurs groupes b et c sont largement repr sent s des g nes codant pour des prot ines de la matrice extracellulaire des prot ines de structure ou de signalisation La k ratine 6 connue pour tre induite au cours de la cicatrisation fait partie comme attendu des effecteurs d expression tardive Enfin les g nes du groupe d pourraient tre impliqu s dans l inhibition de contact qui intervient lors de la fermeture de la blessure comme les phrines et leurs r cepteurs le r cepteur NOTCH ou DSC3 3 2 2 Etudes de la differenciation epidermique in vitro Plusieurs quipes ont d crit le transcriptome de di
2. L tude de Bowcock et collaborateurs a galement mis en vidence de nombreux g nes surexprim s codant pour des prot ines du prot asome qui pourraient intervenir dans la pr sentation antig nique via le CMH Cette donn e est a rapprocher avec lassociation entre susceptibilit au psoriasis familial et certains haplotypes du complexe HLA Le transcrit pr sentant la plus forte induction 93 fois code pour la transcobalamine I une prot ine de liaison a la vitamine B12 sp cifique des cellules inflammatoires 5 g nes ont montr une surexpression la fois dans la peau l sionnelle et non l sionnelle par rapport aux individus contr le CD47 Vinterleukine 8 SPRR2C ECGF1 Endothelial Cell Growth Factor 1 et STAF50 Stimulated Trans Acting Factor 50kDa Une tude r cente employant des puces Affymetrix contre environ 14 500 g nes a permis d tablir le profil d expression g nique de k ratinocytes trait s l interleukine 1 et de mettre en vidence de nombreux points communs avec expression g nique dans le psoriasis soulignant le r le important de l IL 1 et de l inflammation dans les alt rations de la diff renciation k ratinocytaire observ es dans cette maladie Yano et al 2008 Malgr ces r sultats l infiltrat de nombreuses cellules immunitaires au niveau des l sions psoriasiques ainsi que l activation de nombreux g nes impliqu s dans l inflammation mais non sp cifiques de la maladie rendent
3. 246 Vs BIBLIOGRAPHIE scsi stands denses sise DO 12 I INTRODUCTION 13 14 1 Etude du transcriptome et de la r gulation g nique 1 1 Etudes statiques de transcriptomes 1 1 1 Banques d ESTs La production d EST est la technique d analyse syst matique du transcriptome la plus ancienne Adams et al 1991 Boguski et al 1994 Les ARNm sont convertis en ADNc clon s dans un vecteur puis s quenc s de fa on syst matique une de leurs extr mit s Chaque lecture de s quenceur g n ralement de quelques centaines de nucl otides est nomm e EST pour Expressed Sequence Tag Selon que le clonage a t fait de fa on orient e ou non et que le s quencage a t fait en utilisant des amorces situ es sur le vecteur les EST correspondent la partie 5 ou 3 de ARNm Les EST 3 correspondent habituellement la r gion 3 non traduite de l ARNm Cette partie du transcrit qui fait en moyenne 750 nucl otides de long chez l homme est en g n ral la moins conserv e au sein des familles multig niques et permet ainsi une identification univoque du g ne correspondant Les EST 5 couvrent plus fr quemment la r gion codante car la r gion 5 non traduite est courte en moyenne 300 pb De plus il arrive que les ADNc synth tis s avec une amorce oligo dT soient incomplets a leur extr mit 5 en raison de la faible efficacit de la reverse transcriptase et de la pr sence de structures secondair
4. etc jouant des r les cl s dans les cellules souches embryonnaires d finissant ainsi 44 une premi re carte du c ur du r seau de r gulation transcriptionnelle dans ces cellules Chen et al 2008 Le s quencage nouvelle g n ration facilite galement les tudes de populations comme la recherche de SNP Van Tassell et al 2008 ou de CNV en s quencant de nombreux individus ou m me les travaux de m tag nomique identification de nombreuses esp ces de microorganismes pr sentes dans un chantillon complexe par exemple eau d tang ou pr l vements de fluides biologiques Nakamura et al 2009 voire de m tatranscriptomique Gilbert et al 2008 1 3 Bioinformatique 1 3 1 Banques de donn es La premi re tape dans la gestion et l analyse des donn es est avant tout leur p rennisation qui doit garantir leur disponibilit pour le plus grand nombre Il existe pour cela de nombreuses bases de donn es publiques qui diff rent notamment par leur architecture la fa on dont l information est collect e stock e et redistribu e ce point ne sera pas trait ici mais aussi par leur approche selon qu il s agisse d une banque g n raliste ou sp cialis e Concernant les banques de s quences nucl otidiques trois grandes banques internationales existent GenBank au NCBI National Center for Biotechnology Information Bethesda MD USA la Nucleotide Sequence Database ou EMBL Bank de PEMBL Europe
5. i ft ot a i CAS er Frac THESE En vue de l obtention du Universite de Toulouse DOCTORAT DE L UNI VERSI TE DE TOULOUSE D livr par l Universit Toulouse III Paul Sabatier Discipline ou sp cialit Genes Cellules amp D veloppement Pr sent e et soutenue par Nicolas MATTIUZZO Le 23 octobre 2009 Titre ETUDE DU TRANSCRIPTOME KERATINOCYTAIRE AU COURS DU PROGRAMME DE DIFF RENCIATION DE L EPIDERME JURY Fr d ric CAUX Rapporteur Judith FISCHER Rapporteur J r me LAMARTINE Rapporteur Nathalie ONCA Examinateur Guy SERRE Examinateur R my POUPOT Pr sident Ecole doctorale Biologie Sant Biotechnologie Unit de recherche Unit Diff renciation Epidermique et Autoimmunit Rhumatoide UMR5165 CNRS Universit de Toulouse Directeur s de Th se Marina GUERRIN WEBER Rapporteurs Fr d ric CAUX Judith FISCHER J r me LAMARTINE REMERCIEMENTS Je tiens exprimer toute ma gratitude Guy Serre pour m avoir accueilli au sein de son laboratoire ou j ai pu trouver des conditions de travail exceptionnelles tout au long de ces ann es Un grand merci Judith Fischer dirigeant l quipe Maladies Dermatologiques au Centre National de G notypage Evry a Fr d ric Caux Professeur de dermatologie a l H pital Avicenne Bobigny et J r me Lamartine Professeur de g n tique humaine a l Universit Claude Bernard Lyon qui ont tous les trois accept d valuer
6. piderme de certaines des prot ines correspondant aux g nes identifi s dans nos deux tudes de transcriptome Toulza et al 2007 Mattiuzzo et al 2009 Certains des g nes d j pr sents dans la discussion du second article ne sont pas discut s ici Dans tous les cas le ratio R correspond au ratio KG KB en qRT PCR Prot ines de la matrice extracellulaire Bien que la plupart des prot ines de la matrice extracellulaire soient localis es au niveau de la membrane basale la matrice extracellulaire est galement impliqu e dans la stratification la diff renciation k ratinocytaire ainsi que la cicatrisation Le prot oglycan membranaire Syndecan 1 et la glycoprot ine s cr t e ECM1b sont des exemples de prot ines de la matrice surexprim es au cours de la diff renciation Sanderson et al 1992 Smits et al 2000 En plus du g ne EXT2 non r gul jouant 218 un role dans la synth se des prot oglycans nous avons galement identifi HYAL2 R 2 6 un g ne codant une enzyme capable d hydrolyser l acide hyaluronique L acide hyaluronique est un constituant majeur de la matrice extracellulaire mais est absent de la couche granuleuse Tammi et al 1988 De plus le g ne HAS1 hyaluronan synthase 1 est surexprim dans la couche basale de l piderme Radoja et al 2006 Ces donn es sugg rent un gradient oppos de synth se et de d gradation de l acide hyaluronique dans les couches de l piderme La pr
7. piderme reconstitu Mehul est d tect e dans les 3 et al 2004 mod les et leurs profils 131 d expression sont globalement proches Chacun des mod les a t compar des k ratinocytes primaires cultiv s en monocouche Tous les pidermes reconstitu s reproduisent l expression de plusieurs g nes associ s la diff renciation terminale comme la corn odesmosine la loricrine la caspase 14 ou la filaggrine m me si chacun montre quelques sp cificit s figure 63 Afin d identifier plus directement les g nes sp cifiquement exprim s au cours de la stratification des k ratinocytes primaires ont t mis en culture sur du derme irradi et maintenus submerg s ou ont t diff renci s l interface air liquide Koria and Andreadis 2006 Les ARNm sont extraits partir des cultures submerg es ou l interface air liquide apr s 3 ou 7 jours Leur transcriptome analys l aide de puces pang nomiques Affymetrix montre que la plupart des g nes surexprim s dans les cultures linterface air liquide interviennent dans le m tabolisme des carbohydrates la biosynth se des lipides ou la phosphorylation oxydative De fa on tonnante tr s peu de g nes tardifs de la diff renciation pidermique apparaissent exprim s de mani re diff rentielle entre des cultures submerg es et des cultures diff renci es l interface air liquide D autre part l analyse morphologique des cultures submerg es montre un
8. Hypoderme Glande sudoripare Figure 25 Repr sentation sch matique de la peau 54 2 1 2 L hypoderme et le derme Egalement nomm tissu adipeux sous cutan l hypoderme est constitu de lobules graisseux s par s par un septum fibreux riche en collag ne Comme l ensemble du tissu adipeux de l organisme dont il repr sente environ 50 sa principale fonction est le stockage de lipides sous la forme de triglyc rides Le tissu adipeux est galement consid r comme une glande endocrine en raison de son role dans la production de nombreuses hormones notamment leptine adiponectine et r sistine ou la conversion des hormones st roidiennes L paisseur de l hypoderme ainsi que sa position p riph rique lui conf rent des propri t s plus sp cifiques de protection thermique et m canique Le derme est un tissu conjonctif l che comprenant peu de cellules majoritairement des fibroblastes ou fibrocytes responsables de la synth se de fibres de collag ne 70 de la masse s che du derme de fibres lastiques 3 et de substance fondamentale ou matrice extrafibrillaire faible masse mais volume important d aux glycosaminoglycans riches notamment en acide hyaluronique et capables de retenir pr s de 1000 fois leur volume d eau Les diff rentes fibres conf rent au tissu une grande r sistance et lasticit Le derme a un r le important de soutien pour l piderme et ses annexes les nombreux vaisseaux
9. O 6B 1 WE 4 epiderma ET cluster iE AVOS1265 Ornithine aminotransferase 528 AI838612 a 2097 genes AVOSOZ47 Giycine N meth Pr 20 2 68606 _ Proca J BAE 07 AVAIS A041 2366 Procal j i Ja B i AVOSS326 AV0S9816 Fold change 30 20 10 1 10 20 30 EEE Figure 64 Signature transcriptionnelle des diff rentes couches de la peau murine April and Barsh 2006 Krtio p riplakine Gjb5 connexine 31 1 Pkc epsilon Ovo like 1 Ror alpha r p tine suprabasine cornif line Tgm1 Sprr 1b 2j Lce 1a1 1a2 1h 1m et 3c Csta Aloxe3 Fabp5 Ce travail a galement mis en vidence des g nes peu ou pas caract ris s dans l piderme impliqu s dans le m tabolisme lipidique Acsbg1 lipidosine Pla2 groupes IVB amp VI Pla2 activating protein Pld2 Galc diverses 134 voies de signalisation Ilib Il4 Ilirn antagoniste IL1R Chrnai r cepteur cholinergique la nicotine Stati amp 4 Calmoduline 1 Camkk1 le cycle cellulaire Stathmin like 3 la d fense antimicrobienne Camp Defa22 la r gulation de la prot olyse Spink2 Toutefois de nombreux marqueurs connus sont absents Flg Ivl Tgm3 Padi tandis que Lor est d tect e dans plusieurs fractions alors qu elle nest attendue que dans la fraction suprabasale peut tre cause d une contamination de la fraction basale lors de la dissociation par r curage manuel des cellules en
10. Q uw en UN 9 a O 6 a oO Q N 3 D D D D N 9 amp amp amp E BBBE BB y y u v LL 50kb lt i 4 p amp p Mouse 19qC1 b 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 mn tee teem paeme paeme teem t e pa paeem paeem l LIPA HKHRFLGLYYCLYLHTLHSEGSGGKLTAYDPETNHHHYSEIISYHGFPSEEYLYETEDGYILCLHRIPHGRK HHSDKGPKPYYFLOHGLLADSSHHYT LIPH HLETLSROHIYSHRHEHHLLILYAYHFORHYAHSYHHPTKAYDPERFHHISETTOHQGYPCEEYEVATEDGYILSYNRIPRGLY QPKKTGSRPYYLLOHGLYGGASHHIS LIPK HHQLLAAACHHLLLGSHYGYDKKGNMANPEANHNISOTISYHGYPYEEYDYTTKDGYILGIYRIPHGRG CPGRTAPKPAYYLOHGLIASASHHIC LIPF HHLLLTHASLISYLGTTHGLEFGKLHPGSPEYTHNISOHITYHGYPNEEYEYVYTEDGYILEYNRIPYGKK HSGKTGQRPYYFLOHGLLASATHHIS LIPN HHULLLTTTCLICGTLNAGGFLDLENEVNPEVUNNTSETIIYNGYPSEEYEVTTEDGYILLYNRIPYGRT HARSTGPRPYVY YHQHALFADRAYULE LIPJ NNISOTISYHGYPDEEYDI YTEDGYILGLYRIPYHRTDNNKALAQRYYYYLQHGLLTSASSHIS Consensus cecrccccccccceMeclleccccccccccceHeccecee epls MNiIS I I sywG4P EEY TEDGYIL nRIPyert n te rpYYyfQHeLla as His 111 120 130 140 150 160 170 180 199 200 210 220 ar l LIPA NLAWSSLGFILADAGFDYHNGNSRGNTHSRKHKTLSYSQDEFHAFSYDENAKYDLPASINE ILNKTGQEQVY YGHSAGTTIGF TAF SQIPELAKRIKHFFALGPYASYA LIPH NLPHNSLGFILADAGFOYAHNGNSRGNAHSRKHKTLSIDQDEFHAFSYDENARF DLPAYINFE ILQKTGQEKIY YGYSPGT TNGF TAF STNPELAQKIKNYFALAPLATYK LI
11. coupl a la technique des ORESTEs a permis dans un premier temps de produire 22 000 s quences et d identifier 3387 g nes exprim s dans la couche granuleuse parmi lesquels de nouveaux marqueurs de la diff renciation impliqu s dans diverses fonctions prot ine structurale m tabolisme et transport des lipides prot ase et inhibiteurs potentiellement impliqu s dans la desquamation etc Les profils dexpression g nique des k ratinocytes granuleux ont galement t compar s avec ceux des k ratinocytes basaux au moyen de puces ADN pang nomiques mettant en vidence 200 candidats Afin d identifier des facteurs de transcription suppl mentaires une recherche bioinformatique de sites de fixation conserv s volutivement a t r alis e sur les promoteurs de 52 marqueurs de la diff renciation Les r sultats issus de ces trois techniques ont t combin s et analys s afin de r duire 300 genes le nombre de candidats valider Pour 155 d entre eux leur profil d expression au sein de l piderme a pu tre analys par PCR quantitative permettant d identifier 49 nouveaux marqueurs de la diff renciation De plus sur 94 g nes quantifi s codant pour des facteurs de transcription 37 apparaissent positivement ou n gativement r gul s sugg rant un r le dans le contr le des tapes tardives du programme de diff renciation Ces r sultats ouvrent de nombreuses voies et constituent donc une avanc e importante pour l
12. 18 1 2 Etudes comparatives de transcriptomes 1 2 1 Puces ADN 1 2 1 1 Origines de la technique et principe Les premi res techniques de quantification de l expression g nique d rivent de celles d velopp es pour l ADN telles que le Southern blot Southern 1974 bas es sur l hybridation mol culaire entre des cibles d int r ts et des sondes compl mentaires marqu es radioactives ou fluorescentes Ainsi dans les ann es 70 fut d velopp e la technique du buvardage de Northern ou Northern blot Alwine et al 1977 consistant s parer des ARN totaux par lectrophor se les transf rer sur une membrane de nitrocellulose ou un filtre de nylon et employer des sondes ARN ou ADN radiomarqu es pour quantifier les transcrits d int r t Les techniques du RNA dot blot Kafatos et al 1979 ou slot blot sont des variantes simplifi es du Northern blot o les ARN sont d pos s directement sur les membranes sans lectrophor se pr alable ce qui les rend plus adapt es des comparaisons simultan es entre de multiples conditions mais ne permet pas d identifier des diff rences de longueur entre les messagers produits par ces cellules Ces m thodes comportent peu d tapes susceptibles d introduire des biais mais les risques d hybridations crois es non d tectables en absence de migration peuvent conduire une d tection non sp cifique 58 L id e de concevoir des puces ADN d coule de la volon
13. Indra A K Warot X Brocard J Messaddeq N Kato S Metzger D and Chambon P 2000 Skin abnormalities gencrated by temporally controlled RARalpha mutations in mouse epidermis Nature 407 633 636 Li M Chiba H Warot X Messaddeq N G rard C Chambon F and Metzger D 2001 RAR alpha ablation in skin keratinocytes results in alopecm and epidermal alterations Development 128 675 638 Livak K J and Schmittgen T D 2001 Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 Delta Delta C T Method Methods 25 402 HOR Lundstrom Serre Ga Haftek M and Egelrud T 19 Evidence for a role of comecdesmeosin a protein which may serve to modify desmosomes during cornification in stratum comeum cell cohesion and desquamution Arch Dermatol Res 286 269 375 Marshall D Hardman M J and Byrne C 2000 SPRRI gene induction and bamier formation occur as coordinated moving fronts in terminally differentiating epithelia s Invest Dermatol U4 967 975 Matsumoto Ma hou Ya Matsuo S Nakanishi H Hirose K Oura Ha Arase S Ishida Vamamoto A Bando Y Izumi K et al 2008 Targeted deletion of the munne comeadesmosin gene delmentes its essential role in skin and hair physiology Prac Nad Ace Set USA 105 6720 6724 Nair R F Stuart F Es Nistor I Hiremagalore Ra Chia N Va Jenisch S Weichenthal M Abecasis G R Lim H W Christophers E et
14. Translocates and acts on g Spindle formation and checkpoint control L Microtubule associated survivin Cvelin B ne a hi voy pN CIP AURKE CENPA i Li TER 1 4 T CDK4 7 4 4 gt Peptidase i Transcription regulator CI i i hFAM 7 at ITA aka UN TUBBL es T Kinase _ Transporter TPX2 Q AURKA s Phosphatase _ 2 Protein family Shugoshin Cyclin DI Figure 21 R seau de prot ines associ es la Survivine reconstitu gr ce l outil d annotation Ingenuity Pathway Altieri 2008 1 3 3 Identification in silico de s quences r gulatrices Lorsque la connaissance d un processus biologique est suffisante la bioinformatique peut devenir un outil de mod lisation et de pr diction permettant de r aliser d importantes conomies de temps en ciblant les recherches partir des donn es obtenues in silico Un des exemples les plus frappants est probablement la 48 recherche de s quences r gulatrices au sein des g nomes d organismes s quenc s Plusieurs approches bioinformatiques compl mentaires ont t employ es et nous allons d tailler ici la recherche de sites de fixation pour facteurs de transcription ou TFBS Transcription Factor Binding Site ainsi que la recherche de r gions conserv es au cours de l volution 1 3 3 1 Recherche de sites de fixation pour facteurs de transcription Ces derni res ann es la connaissance sur les facteurs de transcr
15. abhydrolase domain containing 11 talin 2 filaggrin solute carrier family 35 member B2 Homo sapiens isolate BRAS immunoglobulin light chain variable region mRNA regulated endocrine specific protein 18 uncharacterized protein KIAA0423 epidermal growth factor beta urogastrone methyl CpG binding domain protein 3 torsin family 1 member B testis expressed 13B Skin specific protein 32 xp32 LEP Homo sapiens mRNA AL117559 late cornified envelope 3C tubulin beta 24 keratin 2 epidermal ichthyosis bullosa of Siemens G protein signalling modulator 3 AGS3 like C elegans suprabasin loricrin solute carrier family 2 facilitated glucose transporter member 3 serine protease inhibitor Kazal type 5 cysteine rich C terminal 1 C1orf42 NICE 1 filaggrin alternative probe DEAD Asp Glu Ala Asp box polypeptide 41 chromodomain helicase DNA binding protein 2 homeobox D13 chromosome 12 open reading frame 10 MYG1 chromosome 10 open reading frame 65 fatty acid binding protein 5 psoriasis associated Brain specific angiogenesis inhibitor 1 associated protein 2 hydroxysteroid 17 beta dehydrogenase 7 pseudogene 2 chloride channel calcium activated family member 4 chromosome 20 open reading frame 181 translocase of inner mitochondrial membrane amp homolog A yeast TAF 13 RNA polymerase Il TATA box binding protein TBP associated factor 18kDa CKLF like MARVEL transmembrane domain containing 1 dermokine Homo sapi
16. de fa on ectopique dans la couche basale de souris transg niques Krt5 tTA TRE K f4 la mise en place de la fonction barri re in utero est acc l r e passant de E16 5 E17 5 E15 5 E16 5 Jaubert et al 2003 voir Annexe 1 pour les diff rents stades de la formation de l piderme au cours du d veloppement murin L expression des marqueurs principaux de la diff renciation K Lor Flg est galement plus pr coce Un second travail d identification des g nes r gul s directement ou non par Klf4 par comparaison des profils d expression entre piderme KIf4 et Klf4 sur puce ADN a permis d identifier non seulement Sprrib et Sprr2a comme cibles r prim es par Klf4 mais aussi les connexines 26 et 30 Djalilian et al 2006 figure 56 De plus la r gulation de la connexine 26 par Klf4 semble directe celui ci liant sa r gion promotrice et r primant son activit in vitro Les auteurs sugg rent que la r pression de Cx26 par Klf4 pourrait avoir un r le physiologique afin d viter un relargage trop important d ATP dans l espace extracellulaire via les connexons non appari s des k ratinocytes ce qui entrainerait l activation de r cepteurs 107 A Comparison of Kif and psoriatic skin expression profiles Gene symbol Gene name Psoriasis Kifa AGPE Acid phosphatase prostate 4 0 3 0 CTSHP C Cathepsin C ad 1 9 CLOAZ Chonde channel calcium activated 2 2 5 3 3 DSC Desmocallin 2 1 0 2 5 FPRG Eni
17. maladie autosomique dominante due a Arrhythmogenic 1 1 e nightventreuiar g une haploinsuffisance d autres cardiomyopathy J Woolly hair Woolly hair mutations sont responsables de keratoderma keratoderma cardiomyopathy _ cardiomyopathy fragilit s pidermiques pouvant aller Lethal igh et api all TS sant 1 id i e cardiomyopathy pi P pullosa jusqu une pidermolyse bulleuse Striate a palmoplantar ie Naxos x keratoderma ay disease acantholytique l tale a la naissance ou ae de k ratodermies g n ralis es ee era erma e d anomalies du follicule pileux et de 4 I Armyihmogen de cardiomyopathies OMIM 125647 cardiomyopathy EET Toutefois en raison d une certaine _ nypotrichosis redondance fonctionnelle ae Recessive monilethrix l importance de certaines prot ines de Hypotrichosis simplex la famille des plakines dans l tablissement de la fonction barri re Figure 44 Prot ines du corn o desmosome impliqu es dans des maladies humaines souris dont le g ne de l envoplakine Lai Cheong et al 2007 reste tr s difficile tablir Ainsi des Maatta et al 2001 de la p riplakine Aho et al 2004 ou de l piplakine Spazierer et al 2006 ont t inactiv s s par ment ne pr sentent aucun trouble de la fonction barri re De plus une inactivation simultan e de l involucrine pr curseur de l envelo
18. piderme beaucoup plus fin avec une deux assises cellulaires mais qui d veloppe une couche corn e Les auteurs proposent que le manque de nutriments en particulier de glycog ne dans le milieu de culture pourrait affecter la stratification Malgr le manque de couches suprabasales interm diaires un programme transcriptionnel conduisant la cornification des cellules est mis en place Une tude men e la m me ann e sur des k ratinocytes humains immortalis s HaCaT cultiv s en conditions prolif ratives J3 apr s mise en culture ou diff renciantes post confluence J10 combine une approche de transcriptomique utilisant des puces ADN contre 2500 g nes et une approche prot omique par lectrophor se 2D suivie de spectrom trie de masse Lemaitre et al 2004 Cette double approche a permis d identifier 15 prot ines diff rentiellement d tect es sur gel 4 surexprim es et 11 sousexprim es lors de la diff renciation et 171 g nes r gul s parmi 1370 d tect s 89 positivement et 82 n gativement L analyse des transcrits et prot ines diff rentiellement exprim s souligne l implication de plusieurs fonctions cellulaires au cours de la diff renciation telles que le contr le du cycle le m tabolisme des carbohydrates la pr sentation antig nique l adh rence cellulaire ou encore les voies de signalisations li es au cytokines ou le contr le de la transcription 132 Au del de ces processus l t
19. t r cemment identifi es chez des patients atteint d un syndrome associant ichtyose et pr maturit OMIM 608649 Klar et al 2009 De facon int ressante en accord avec les donn es de la litt rature sur le m tabolisme lipidique des adipocytes et des h patocytes les r cepteurs nucl aires facteurs de transcription des familles PPAR Peroxisome Proliferation Activation Receptor et LXR Liver X Receptor exprim s dans l piderme semblent capables de r guler plusieurs g nes impliqu s dans la synth se ou le transport des lipides requis pour la fonction barri re pour une revue r cente voir Schmuth et al 2008 Ainsi le traitement topique par des activateurs des PPAR ou LXR induisent l expression du transporteur ABCA12 Jiang et al 2008 de la cholest rol sulfotransf rase SULT2B1 Jiang et al 2005 mais aussi acc l re la s cr tion des k ratinosomes et des phospholipases A2 contenues par ceux ci Fluhr et al 2009 Toutefois en plus du r le crucial des diff rents lipides de la couche corn e et des prot ines impliqu es dans leur synth se et transport pour l tablissement d une barri re imperm able il a galement t mis en vidence ces derni res ann es un r le des jonctions serr es localis es au niveau de la couche granuleuse 299512 Jonctions serr es Egalement nomm es zonula occludens les jonctions serr es forment une ceinture d adh rence autour du p le apical des cellul
20. 2001 Early gene expression profile of human skin to injury using high density cDNA microarrays Wound Repair Regen 9 360 370 267 Colell A Ricci J E Tait S Milasta S Maurer U Bouchier Hayes L Fitzgerald P Guio Carrion A Waterhouse N J Li C W Mari B Barbry P Newmeyer D D Beere H M and Green D R 2007 GAPDH and autophagy preserve survival after apoptotic cytochrome c release in the absence of caspase activation Cell 129 983 997 Collin C Moll R Kubicka S Ouhayoun J P and Franke W W 1992 Characterization of human cytokeratin 2 an epidermal cytoskeletal protein synthesized late during differentiation Exp Cell Res 202 132 141 Cooper L Johnson C Burslem F and Martin P 2005 Wound healing and inflammation genes revealed by array analysis of macrophageless PU 1 null mice Genome Biol 6 R5 Cotsarelis G Sun T T and Lavker R M 1990 Label retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit implications for follicular stem cells hair cycle and skin carcinogenesis Cell 61 1329 1337 Crish J F Gopalakrishnan R Bone F Gilliam A C and Eckert R L 2006 The distal and proximal regulatory regions of the involucrin gene promoter have distinct functions and are required for in vivo involucrin expression J Invest Dermatol 126 305 314 Crish J F Howard J M Zaim T M Murthy S and Eckert R L 1993 Tissue specific and differentiation a
21. 2B member Kallikrein 11 Histidine ammonia lyase histidase Envoplakin Corneodesmosin PDZKI interacting protein Transglutaminase Serpin peptidase inhibitor clade B member 8 Sciellin Genome Biology 2007 8 R107 Toulza et al R107 7 149 D h D D D D n D 2 be 4 A u R107 8 Genome Biology 2007 Table 4 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al http genomebiology com 2007 8 6 R107 Genes with 100 or less UniGene ESTs known as mainly expressed in a specific tissue different from epidermis No of ORESTES Gene symbol No of UniGene ESTs Full name 99 SERPINA 12 11 Serpin peptidase inhibitor clade A member 12 BSND 12 Bartter syndrome infantile with sensorineural deafness OPN LW 16 Opsin long wave sensitive 5 GRIN2 16 G protein regulated inducer of neurite outgrowth 2 ILI RL2 24 Interleukin receptor like 2 13 LCTL 25 Lactase like PPEF2 31 Protein phosphatase EF hand calcium binding domain 2 2 SLC6A3 34 Solute carrier family 6 member 3 3 CDC42BPG 41 CDC42 binding protein kinase gamma 4 GPR7S 41 G protein coupled receptor 75 OTX 45 Orthodenticle homolog K5B 46 Keratin 5b l TBXIS 46 T box I5 3 TMPRSSS 53 Transmembrane protease serine 5 spinesin 3 LEAP 2 53 Liver expressed antimicrobial peptide 2 l BMP8B 56 Bone morphogenetic protein 8B PTGFR 59 Prostaglandin F receptor 2 TEC 59 Tec protein tyrosine kinase 3 SLCSA I 60 Solute
22. Ce mod le pr sente notamment l int r t d expliquer certaines observations comme la croissance de la taille des EPU au cours de la vie d une souris 66 Figure 32 Distribution de la fluorescence dans des unit s de prolif ration d piderme humain greff chez la souris nude et transfect par un lentivirus exprimant la GFP Ghazizadeh and Taichman 2005 Deux excellentes revues r centes Jones and Simons 2008 Blanpain and Fuchs 2009 r sument bien la complexit du mod le o plusieurs populations de cellules souches aux potentiels variables occupent des niches distinctes et jouent des r les probablement diff rents voire aucun r le suivant le contexte hom ostasie tissulaire cicatrisation 2 2 2 12 Couche corn e et desquamation De fa on coupl e avec le renouvellement des cellules dans la couche basale les corn ocytes les plus superficiels se d tachent r guli rement au cours du processus de la desquamation du latin desquamare cailler corcer enlever ce qui est autour Correspondant l tape ultime du programme de diff renciation la desquamation se traduit par l exfoliation d environ 1000 corn ocytes cm h dans des condition normales Roberts and Marks 1980 Les corn odesmosomes constituent les structures jonctionnelles liant entre eux les corn ocytes et sont donc l origine de la coh sion de la couche corn e Leur structure d rive de celle des desmosomes ma
23. Hughes T R 2004 The functional landscape of mouse gene expression J Biol 3 21 Zhang X J Huang W Yang S Sun L D Zhang F Y Zhu Q X Zhang F R Zhang C Du W H Pu X M Li H Xiao F L Wang Z X Cui Y Hao F Zheng J Yang X Q Cheng H He C D Liu X M Xu L M Zheng H F Zhang S M Zhang J Z Wang H Y Cheng Y L Ji B H Fang Q Y Li Y Z Zhou F S Han J W Quan C Chen B Liu J L Lin D Fan L Zhang A P Liu S X Yang C J Wang P G Zhou W M Lin G S Wu W D Fan X Gao M Yang B Q Lu W S Zhang Z Zhu K J Shen S K Li M Zhang X Y Cao T T Ren W Zhang X He J Tang X F Lu S Yang J Q Zhang L Wang D N Yuan F Yin X Y Huang H J Wang H F Lin X Y and Liu J J 2009 Psoriasis genome wide association study identifies susceptibility variants within LCE gene cluster at 1q21 Nat Genet 41 205 210 Zhao X S Shin D M Liu L H Shull G E and Muallem S 2001 Plasticity and adaptation of Ca2 signaling and Ca2 dependent exocytosis in SERCA2 mice Embo J 20 2680 2689 289 AUTEUR Nicolas MATTIUZZO TITRE tude du transcriptome k ratinocytaire au cours du programme de diff renciation de l piderme DIRECTEUR DE TH SE Marina GUERRIN WEBER LIEU ET DATE DE SOUTENANCE Toulouse le 23 octobre 2009 R SUM Au sein de l piderme la fonction de barri re est assur e par
24. K Hubiche T Nilsson S K and Egelrud T 2009 SPINK9 A Selective Skin Specific Kazal Type Serine Protease Inhibitor J Invest Dermatol Braun K M Niemann C Jensen U B Sundberg J P Silva Vargas V and Watt F M 2003 Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment visualisation of label retaining cells in wholemounts of mouse epidermis Development 130 5241 5255 Brown A C Kai K May M E Brown D C and Roopenian D C 2004 ExQuest a novel method for displaying quantitative gene expression from ESTs Genomics 83 528 539 Cabral A Sayin A de Winter S Fischer D F Pavel S and Backendorf C 2001 a SPRR4 a novel cornified envelope precursor UV dependent epidermal expression and selective incorporation into fragile envelopes J Cell Sci 114 3837 3843 Cabral A Voskamp P Cleton Jansen A M South A Nizetic D and Backendorf C 2001b Structural organization and regulation of the small proline rich family of cornified envelope precursors suggest a role in adaptive barrier function J Biol Chem 276 19231 19237 Calautti E Li J Saoncella S Brissette J L and Goetinck P F 2005 Phosphoinositide 3 kinase signaling to Akt promotes keratinocyte differentiation versus death J Biol Chem 280 32856 32865 Caloca M J Zugaza J L and Bustelo X R 2003 Exchange factors of the RasGRP family mediate Ras activation in the Golgi J Biol Chem 278 33465 33473
25. Kitko D J Madison K C and Downing D T 1989 Molecular models of the intercellular lipid lamellae in mammalian stratum corneum J Invest Dermatol 92 251 257 Sybert V P Dale B A and Holbrook K A 1985 Ichthyosis vulgaris identification of a defect in synthesis of filaggrin correlated with an absence of keratohyaline granules J Invest Dermatol 84 191 194 Syed S E Trinnaman B Martin S Major S Hutchinson J and Magee A I 2002 Molecular interactions between desmosomal cadherins Biochem J 362 317 327 Tago K Nakamura T Nishita M Hyodo J Nagai S Murata Y Adachi S Ohwada S Morishita Y Shibuya H and Akiyama T 2000 Inhibition of Wnt signaling by ICAT a novel beta catenin interacting protein Genes Dev 14 1741 1749 Tammi R Ripellino J A Margolis R U and Tammi M 1988 Localization of epidermal hyaluronic acid using the hyaluronate binding region of cartilage proteoglycan as a specific probe J Invest Dermatol 90 412 414 Tang V W 2006 Proteomic and bioinformatic analysis of epithelial tight junction reveals an unexpected cluster of synaptic molecules Biol Direct 1 37 Thrash B R Menges C W Pierce R H and McCance D J 2006 AKTI provides an essential survival signal required for differentiation and stratification of primary human keratinocytes J Biol Chem 281 12155 12162 Tiede S Kloepper J E Bodo E Tiwari S Kruse C and Paus R 2007 Hair fol
26. Nair et al 2009 transmembranaire ADAM33 Lesueur et al 2007 ou encore la prot ase Locus Region Associated gene Study population PSORS lp ND British PSORS4 lq Many within epidermal differentiation complex Italian and American 2p ND American and British 2q ND British 3 ND Swedish PSORSS 30 SLCT 248 Swedish 4q13 ND American and Swedish PSORS9 4q31 ND Chinese American Northern Europe PSORS3 4q34 IRF 2 Irish PSORS1 6p21 3 HLA C HERV K HCG27 CDSN PSORS1C3 Many POUSFT TCF19 CCHCRT LMP SEEKT SPR bq ND American and German 7 ND American Bq ND British 10q ND American and German 14q ND American and British 15p ND Swedish 1 q American German Icelandic PSORS2 17925 SLOGASRT NATO RAPTOR American and British 18p11 ND Finnish PSORS 19p13 JunE German and British 20p ND German British and American Table 4 Liste des loci putatifs de susceptibilit au psoriasis famillial et de quelques g nes candidats Jullien and Barker 2006 Afin d tudier plus facilement les m canismes impliqu s dans le psoriasis un grand nombre de mod les murins ont t d velopp s qu il s agisse de mod les spontan s de x no ou allogreffes de mod les transg niques ou inactiv s pour un gene Toutefois certaines observations sont limit es par la densit tr s lev e de follicules pileux dans l piderme murin sans compter que la plupart des mod les pr sentent d autres signes ph notypiques non observ s dans le ps
27. U Machleidt W Fritz H and Steffens G 1986 Molecular cloning and expression of cDNA for human antileukoprotease from cervix uterus Eur J Biochem 160 61 67 Helms C Saccone N L Cao L Daw J A Cao K Hsu T M Taillon Miller P Duan S Gordon D Pierce B Ott J Rice J Fernandez Vina M A Kwok P Y Menter A and Bowcock A M 2005 Localization of PSORSI to a haplotype block harboring HLA C and distinct from corneodesmosin and HCR Hum Genet 118 466 476 212 Henseler T and Christophers E 1985 Psoriasis of early and late onset characterization of two types of psoriasis vulgaris J Am Acad Dermatol 13 450 456 Herrero J Al Shahrour F Diaz Uriarte R Mateos A Vaquerizas J M Santoyo J and Dopazo J 2003 GEPAS A web based resource for microarray gene expression data analysis Nucleic Acids Res 31 3461 3467 Hofman V J Moreilhon C Brest P D Lassalle S Le Brigand K Sicard D Raymond J Lamarque D Hebuterne X A Mari B Barbry P J and Hofman P M 2007 Gene expression profiling in human gastric mucosa infected with Helicobacter pylori Mod Pathol 20 974 989 Hohl D Mehrel T Lichti U Turner M L Roop D R and Steinert P M 1991 Characterization of human loricrin Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins J Biol Chem 266 6626 6636 Horikoshi T Igarashi S Uchiwa H Brysk H and Brysk M M 1999
28. aliser syst matiquement partir des m mes ADNc les deux marquages possibles Leur cohybridation en parall le permet ainsi d obtenir deux lames miroir ou lames swapp es soit T1 Cy3 T4 Cy5 et T1 Cy5 T4 Cy3 pour le m me couple T1 T4 Si le dye swap permet en toute rigueur d quilibrer les marquages pour chaque 208 TEST chantillon il requiert une quantit d ARN Re deux fois plus importante de plus les T4 K ratinocytes granuleux chantillons tant non ind pendants deux A B D E F ran a deux l approche est moins performante Cy3 Cy5 Cy3 Cy5 Cy3 Cy5 Cy5 Cy3 que le dye switch d un point de vue statistique nombre de lames gal Au final notre tude a donc t r alis e a Cy5 Cy3 Cy5 Cy3 Cy5 Cy3 Cy3 Cys A B C D E pF Partir de six individus et neuf lames dont T1 K ratinocytes basaux trois couples de lames swapp es voir figure ci contre Pour cette raison les REFERENCE marquages ne sont pas tout a fait quilibr s quatre T1 Cy3 T4 Cy5 contre cing T1 Cy5 T4 Cy3 toutefois une comparaison entre les r sultats incluant ou excluant la lame non quilibr e montre qu il n y a pas de d s quilibre majeur li la prise en compte de cette lame Les analyses finales ont donc t r alis es partir de neuf lames Le plan exp rimental final tant donc un m lange de dye switch pour trois lames et de dye swap pour les six
29. and Beier D R 2007 A mouse mutation in the 12R lipoxygenase Alox12b disrupts formation of the epidermal permeability barrier J Invest Dermatol 127 1893 1897 Morasso M I Grinberg A Robinson G Sargent T D and Mahon K A 1999 Placental failure in mice lacking the homeobox gene DIx3 Proc Natl Acad Sci U S A 96 162 167 Morasso M I Markova N G and Sargent T D 1996 Regulation of epidermal differentiation by a Distal less homeodomain gene J Cell Biol 135 1879 1887 Moreilhon C Gras D Hologne C Bajolet O Cottrez F Magnone V Merten M Groux H Puchelle E and Barbry P 2005 Live Staphylococcus aureus and bacterial soluble factors induce different transcriptional responses in human airway cells Physiol Genomics 20 244 255 Morin R Bainbridge M Fejes A Hirst M Krzywinski M Pugh T McDonald H Varhol R Jones S and Marra M 2008a Profiling the HeLa S3 transcriptome using randomly primed cDNA and massively parallel short read sequencing Biotechniques 45 81 94 280 Morin R D O Connor M D Griffith M Kuchenbauer F Delaney A Prabhu A L Zhao Y McDonald H Zeng T Hirst M Eaves C J and Marra M A 2008b Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells Genome Res 18 610 621 Morris R J Liu Y Marles L Yang Z Trempus C Li S Lin J S Sawicki J A and Cotsareli
30. associ s au psoriasis dans une population finlandaise Kainu et al 2009 De fa on surprenante trois tudes r centes men es sur des populations diff rentes ont galement montr une association entre les g nes codant pour les LCE et le psoriasis Liu et al 2008 de Cid et al 2009 Zhang et al 2009 alors que ces g nes bien que situ s dans EDC se trouvent en dehors des bornes du locus PSORS4 tel qu il a t red fini Capon et al 2001 Peu d tudes de liaison avec les g nes des autres loci de susceptibilit ont t publi es et se heurtent souvent au probleme des contributions faibles et variables d une population l autre Les donn es sur les diff rents loci identifi s g nes candidats et populations d tude sont r sum es dans la Table 4 Jullien amp Barker 2006 En outre les volutions r centes des techniques de recherche d associations a l chelle du g nome ont permis d obtenir des r sultats plus pr cis qu avec des tudes classiques de liaison et d agrandir le nombre de g nes susceptibles de contribuer a la physiopathologie du psoriasis Elles ont notamment soulign le r le potentiel de plusieurs interleukines IL 4 IL 12B IL 13 IL 15 et IL 23A dont les g nes sont situ s en dehors des loci de susceptibilit d crits auparavant mais aussi le r cepteur IL23R situ dans le locus PSORS7 pour revue Duffin and Krueger 2009 la voie de 121 signalisation TNFalpha NF kB
31. dical y sont aussi diversement repr sent es Pour une grande partie de ces esp ces la base de donn es UniGene du NCBI rassemble les EST chevauchants ou correspondant un m me ARNm dans un cluster c est dire un groupe de s quences correspondant un g ne unique et indique l origine tissulaire de chaque EST lorsqu elle est connue Tous les EST annot s correspondent autant de donn es d expression origine cellulaire ou tissulaire de ARNm stade de diff renciation Plusieurs initiatives de d veloppement de programmes d analyse virtuelle du transcriptome partir de ces donn es ont vu le jour C est par exemple le cas de ExQuest Expressional Quantification of EST qui permet d identifier pour un g ne donn le nombre d EST provenant de chaque tissu ou organe et propose une normalisation de Ea T Frome ces profils par rapport au nombre total HE S56031 COSM Corneodesmosin de s quences Brown et al 2004 Il est pituitary gland 0 0 16736 placenta 197 E 56 2854142 prostate 0 0190888 salivary gland 0 0 r 20291 skin 255 54 211668 Spleen 0 OfS4070 stomach 0 0 97193 testis 0 D34 thymus 12 1181245 galement possible de visualiser pour un tissu donn la r partition des EST sur une r gion chromosomique correspondant un locus d int r t par S exemple sous la forme dun Type d chantillon diagramme La fonction EST Profile on par million ne a ana tillon figure 1 de la base
32. diff renciation k ratinocyte transcriptome bioanalyse facteurs de transcription expression g nique DISCIPLINE ADMINISTRATIVE Genes Cellules et D veloppement LABORATOIRE Unit Diff renciation Epidermique et Autoimmunit Rhumatoide UMR 5165 CNRS Universit de Toulouse Paul Sabatier CHU Purpan place du Docteur Baylac 31059 Toulouse
33. directement r gul e par la concentration calcique comme pour les transglutaminases les cadh rines les peptidyl arginine d siminases la glucosylc ramide synthase les PKCn et a via l activation des PLC les prot ines S100 Le r cepteur membranaire au calcium figure 50 produit du g ne CASR Calcium sensing receptor est requis in vitro pour la r ponse des k ratinocytes au calcium Tu et al 2001 Tu et al 2007 L inactivation de ce g ne chez la souris nentraine qu une alt ration mod r e de la diff renciation en particulier une alt ration morphologique des granules de k ratohyaline probablement li e a la sous expression de la Flg et Lor normalement induites par le calcium Komuves et al 2002 L absence de trouble majeur de la barri re permet de supposer l existence d un m canisme alternatif compensant la perte du CaSR Les ARN pr messagers du gene CASR subissent un pissage alternatif conduisant a la production de deux isoformes membranaire ou p rinucl aire Ainsi la fonction du CaSR pourrait galement passer par une interaction avec les pompes du RE qui r gulent la concentration intracellulaire en calcium Tu et al 2007 De nombreux travaux ont en effet d montr l importance de ces pompes dans la physiologie pidermique Les pompes ATP2A2 ATPase Ca2 transporting type 2A member 2 et ATP2C1 type 2C member 1 interviennent dans le maintien d une concentration calcique tr s basse dans l
34. euros rendant par exemple possible le s quencage complet du g nome d un humain avec une profondeur x12 soit en moyenne 12 lectures base pour 10000 en 2009 chose videmment impossible avec la technique de Sanger Les inconv nients de ces techniques sont n anmoins multiples En premier lieu elles sont peu appropri es a de petits projets la quantit de donn es g n r es pouvant tre en soi un obstacle pour l analyse ou m me le stockage de ces donn es voir chapitre suivant De plus la longueur des s quences environ 35 paires de bases pour deux des trois m thodes complique fortement l identification des s quences dans le g nome s il s agit de portions r p t es et constitue un v ritable d fi pour l assemblage s il s agit d un g nome jamais s quenc Pour cette raison chacune des techniques conna t r guli rement des am liorations visant la fois augmenter le d bit donc la quantit de s quences g n r es mais surtout leur longueur avec en moyenne une nouvelle g n ration d appareils tous les six mois Toutefois si le grand nombre de donn es susceptibles d tre g n r es en un seul run peut compliquer l analyse des r sultats c est cette m me caract ristique qui rend possible l exploitation d un grand nombre de techniques leur vrai potentiel c est dire l chelle de g nomes entiers et de fa on r ellement exhaustive Nous ne d taillerons ici que les exemp
35. expression g nique par microarray ne se bornent pas non plus aux ARN messagers codant pour des prot ines mais ont trouv galement leur place dans la course la recherche de petits ARN non codants tels que les microARN des petits ARN simple brin de 21 23 nt issus de la maturation de pr curseurs repli s en tiges boucles et jouant un r le de r presseur post 25 transcriptionnel Des puces sp cialement d di es a la d tection des microARN ont permis de dresser un profil de l expression de ces nouveaux marqueurs dans plusieurs types de cancers tels que le cancer du sein Blenkiron et al 2007 Yin et al 2008 du poumon Yanaihara et al 2006 ou de la prostate Mattie et al 2006 Fixation covalente des prot ines sur l ADN Facteur X Fragmentation de la chromatine i S paration en 4 deux lots Swe ADN g nomique total Rp pas de ChIP Immunopr cipitation Q a d agarose de la chromatine ChIP P aBiotine Biotinylation de l ADN Co hybridation sur microarray Figure 7 Principe du ChIP on chip contre un facteur X Toutefois la quantification de l expression g nique est loin d tre la seule application des puces ADN D autres utilisations ont galement b n fici des am liorations techniques les plus r centes Ainsi un grand nombre d approches chelle du g nome ont pu tre men es r cemment couplant ventuellement plusieurs techniques l empl
36. gions tr s conserv es et parfois distantes des r gions promotrices Marshall et al 1994 Gr ce notamment aux donn es issues du s quencage de g nomes entiers l analyse plus pouss e de certaines 50 de ces s quences appel es CNS ou CNE Conserved Non coding Sequences Elements a mis en vidence leur association pr f rentielle avec des g nes cruciaux pour le d veloppement Ces r gions conserv es sont notamment tr s fortement associ es avec des enhancers connus pour activer a longue distance la transcription de leurs g nes cibles Toutefois l hypoth se selon laquelle le fort degr de conservation de ces enhancers ou CNS serait corr l avec leur importance dans l expression de g nes essentiels semble mise mal par une tude r cente relancant le d bat sur le r le exact de ces s quences Ahituv et al 2007 1 3 3 3 Outils d analyse des r gions r gulatrices Les deux optiques possibles recherche de TFBS et de r gions conserv es sont des techniques hautement compl mentaires En effet si la recherche de r gions conserv es est souvent un bon choix pour cibler de petites r gions dans de larges r gions g nomiques elles ne livrent aucune autre information en soi Inversement les TFBS tant des s quences nucl otidiques relativement courtes et d g n r es la probabilit de les rencontrer dans une s quence al atoire est relativement lev e et seulement une proportion tr s fai
37. http genomebiology com 2007 8 6 R107 transcriptional or translational activity and are devoid of organelles Rather their intracellullar content consists of a homogeneous matrix composed mainly of covalently linked keratins The cornified envelope a highly specialized insolu ble structure encapsulates corneocytes in place of their plasma membrane see Kalinin et al 6 for a recent review The lipid enriched extracellular matrix which subserves the barrier is produced by a highly active lipid factory mainly operative in the granular layer and comprises secretory organelles named the epidermal lamellar bodies 7 In addi tion to the provision of lipids for the barrier lamellar bodies deliver a large number of proteins including lipid processing enzymes proteases and anti proteases that regulate desqua mation antimicrobial peptides and corneodesmosin an adhesive protein secondarily located in the external face of the desmosomes as they turn into corneodesmosomes 8 Therefore the components of the stratum corneum respon sible for most of the protective cutaneous functions are pro duced by GKs Transcriptome studies of selected cell types of the human epi dermis are expected to contribute to the elucidation of the mechanisms responsible for barrier function They will also shed further light on the causes of monogenic genoderma toses and the pathomechanisms of common complex skin disorders like psoriasis However presen
38. induced Fig 8D At later stages hair follicles disappeared as evidenced by the absence of K6 labeling Fig 9B D right panel These observations are reminiscent of the neonatal skin grafted model which is characterized by cyst formation and hair follicle degeneration Discussion In this study we performed conditional ablation of Cdsn in mouse skin using A 4 promoter driven Cre mediated oxP recombination Our results demonstrated that CDSN is necessary for epidermis integrity and barrier function in adult and neonatal mouse skin Cdsn is also excised in the IRS of the hair follicles At birth hair follicles from KO mice appeared normal However they degenerated in KO 295 o O O o O w 5 O Le 2706 Journal of Cell Science 122 15 TAM Fig 8 Phenotype of generalized temporally controlled Cdsn KO in adult mouse skin Shaved adult HOMO mice were injected with vehicle only control or with Tam TAM for 5 consecutive days and checked daily for phenotype onset by clinical observation and TEWL measurement A Macroscopic appearance of the mice The ventral skin of the control mouse has no phenotype whereas scales are visible on the ventral area of the TAM mouse B Representative skin sections from ventral areas of control and TAM mice were stained with hematoxylin and cosin H amp E showing acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis of the TAM mouse epidermis In the dermis of TAM mouse th
39. l enzyme responsable de la formation d ester de cholest rol plus hydrophobe la l citine cholest rol acyltransf rase LCAT et dans le transport de lipides sous forme de chylomicrons cholest rol et triglyc rides APOF est une apolipoprot ine mineure du plasma qui bloque le transfert des esters de cholest rol et des triglyc rides vers les lipoprot ines normalement m di par la Cholesteryl ester transfer protein CETP Paromov and Morton 2003 Le g ne codant la LCAT est majoritairement transcrit dans la couche basale de l piderme de singe Rh sus Smith et al 1990 tandis que l expression ou non du g ne CETP reste inconnue La fonction pr cise de chacune de ces prot ines dans la biologie de l piderme reste lucider Toutefois l existence d une machinerie probablement complexe r gulant la disponibilit la modification le transport et peut tre la clairance de plusieurs lipides s cr t s par les k ratinocytes granuleux particuli rement le cholest rol et ses d riv s pourrait tre un l ment important de la r gulation de la fonction barri re Maturation et d gradation Le cholest rol est partiellement sulfat dans les couches suprabasales de l piderme et le sulfate de cholest rol 2 6 des lipides intercorn ocytaires est ensuite converti en cholest rol par les arylsulfatases du stratum corneum Nous avons confirm l expression du g ne ARSD codant pour une arylsulfatase dans
40. nitale et g n ralement l tale est caract ris e par une hyperk ratose une compaction de la couche corn e des fissures cutan es profondes un ectropion et un eclabium L piderme des individus atteints d ichtyose arlequin pr sente des k ratinosomes anormaux d pourvus de contenu lamellaire Dale et al 1990 Des analyses en immunomicroscopie lectronique montrent que ABCA12 est exclusivement localis 4 la membrane des k ratinosomes Akiyama et al 2005 Des k ratinocytes de patients tablis en culture et diff renci s in vitro pr sentent un d faut de s cr tion des glucosylc ramides ce ph notype tant r versible par transfert du g ne ABCA12 sauvage dans ces cellules Des analyses en microscopie lectronique montrent une accumulation des k ratinosomes dans le cytosol pr s de la membrane 74 plasmique et des structures lamellaires perturb es Des substitutions d acides amin s dans la prot ine sont quant elles associ es l ichtyose lamellaire de type II OMIM 601277 pathologie h t rog ne transmise sur le mode autosomique r cessif Ces travaux sugg rent ainsi un r le direct pour ABCA12 dans la s cr tion des lipides transfert des lipides vers les k ratinosomes et ou extrusion rapprocher de la fonction du g ne ABCA3 dans la s cr tion du surfactant pulmonaire principalement de la dipalmitoylphosphatidylcholine via les corps lamellaires des pneumocytes de type II Shulenin et al 200
41. ont t compar es des souris sauvages Cooper et al 2005 Le facteur de transcription PU 1 est en effet impliqu dans la diff renciation de plusieurs lign es h matopoi tiques et les souris invalid es pour ce g ne sont d pourvues de macrophages et de neutrophiles fonctionnels La peau de souriceaux P2 2 jours est incis e au niveau dorsal et les animaux sont trait s avec un 128 antibiotique jusqu au sacrifice Une r pith lialisation compl te des l sions des souris sauvages comme des souris mut es est g n ralement observ e au bout de 24h Les pr l vements de peau sont effectu s 30 min 6h 12h et 24h apr s la blessure Les chantillons ont t analys s avec des puces Affymetrix ciblant environ 12 000 g nes en comparaison la peau non bless e provenant du m me animal 1001 g nes sont r gul s au cours de la cicatrisation avec un ratio sup rieur ou gal 2 par rapport la peau saine Ces g nes ont ensuite t regroup s selon leur cin tique d expression taux d ARNm en unit s arbitraires figure 62 a b sec m Activation ns Early effector 600 JA 300 A 500 Mf N 250 A 400 aw Le 200 a 300 150 1200 Late effector 300 Stop 1000 Pa 250 a A 800 F 200 Sa s 600 a 150 Le 400 If 100 e 400 Early inflammatory 300 Late inflammatory 700 Inflammation maintained 250 4 131 ra 200 fl 150 e al 100 m A 50 Y 5 5 amp e q P S s s
42. quence d ADN mais aussi en r alisant une validation par s quencage des amplicons obtenues au cours de la PCR quantitative En dehors de son utilisation pour la quantification de l expression g nique ou comme outil de validation la PCR quantitative en temps r el est galement couramment employ e pour la d tection et quantification de charges virales Lin et al 2004 le diagnostic de tumeurs Rambaldi et al 2005 le titrage de germes et contaminants agronomie sang 38 fluides tissus la discrimination all lique l analyse de SNP d amplifications ou de d l tions g niques la quantification du nombre de copies d un transg ne etc Fluorescence UA dRFU dT A 10900 1000 F7 300 Seuil Quantit i A t 15 a 3 Nombre de cycles Amplification exponentielle threghold Nombre de cycles Platea Amplification lin aire 6 10 12 14 16 18 20 22 V4 26 29 30 32 34 Ct Cycle threshold 22 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 76 80 82 64 86 88 90 92 94 Temperature Celsius c o e UO O O O Threshold Cycle S i 101 102 Starting Quantity 10 10 107 106 Delta Rn ts gt gt i i gt z m i 3 as gt j 2 H re S J ae e i mm ne ae i 5 ae
43. r ellement positifs Il est cependant possible que les signaux les plus faibles bien qu tant significativement sup rieurs au seuil fix correspondent des hybridations crois es et que les g nes cibl s ne soient donc pas exprim s Le cas des ratios contradictoires est plus complexe Il est videmment possible d voquer pour partie des erreurs de PCR quantitative Il convient toutefois de noter plusieurs l ments Premi rement pour la totalit des g nes quantifi s de fa on fiable en PCRq 157 g nes nouveaux dans l piderme plus 20 marqueurs connus les amplicons issus de la PCRq ont t syst matiquement valid s par s quencage afin de s assurer de la sp cificit de l amplification Pour tous l amplicon s quenc correspondait l amplicon pr dit par PCR in silico Deux autres param tres peuvent venir fausser les ratios de PCR quantitative dans des proportions variables le choix du g ne de m nage et l efficacit des amorces Les valeurs de PCRq devant tre normalis es par rapport aux concentrations des ADNc il convient de choisir un voire plusieurs g ne s de 215 m nage dont l expression est la plus stable possible Dans un premier temps l ARN ribosomique 18S et lARNm de la galectine 7 LGALS7 ont t utilis s comme g nes de normalisation Toutefois ils ont rapidement t abandonn s le 18S tant exprim trop fortement par rapport aux g nes quantifier d o
44. scales became more numerous and were shed After generalized induction of Cesa deletion the scales were first visible on the ventral side and snout and then extended to the back and the whole body consistent with the level of mechanical stress applied to these different body areas Within 5 days of the abnormal skin phenotype onset mice became prostrate lost weight and were euthanized A representative aspect of a ventral skin region with a TEWL value of 13 g m 7 per hour is presented in Fig 8 At the histological level acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis of the epidermis accompanied scaling Fig 8A B D left panel Topical applications of OHT were made with the aim of analyzing the phenotype for a longer period of time Fig 9 Skin phenotype progression is presented at early Fig 9 middle panels or late Fig 9 right panels stages in comparison with the control Fig 9 left panels The early stage showed a moderate barrier defect TEWL of 11 g m per hour associated with the development of acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis together with a strong expression of the hyperproliterative keratin K6 Fig 9 middle panel At the late 254 D O O g Q O w z O ae Corneodesmosomal defects in Cds mice 2705 KO Fig 7 Transplantation of Cdsn deficient skin onto nude mice Dorsal skin from WT or KO neonates was grafted onto the back of nude mice Four weeks after grafting is shown a
45. tacher compl tement en surface sous l effet des contraintes m caniques La cornification se traduit par la mise en place de nouvelles structures bien visibles en microscopie lectronique La membrane plasmique est remplac e par une coque prot ique rigide l enveloppe corn e et le cytoplasme est r duit une matrice fibreuse dense amorphe constitu e de k ratines r arrang es en macrofibrilles L espace intercorn ocytaire est rempli de lipides organis s en bicouches les lamellae lipidiques Les desmosomes prennent le nom de corn odesmosomes tandis que la plaque cytoplasmique est int gr e l enveloppe corn e et le c ur intercellulaire se densifie Au cours de la progression des corn ocytes vers la surface les corn odesmosomes sont progressivement d grad s les premiers dispara tre tant ceux situ s aux p les apicaux et basaux des corn ocytes la d gradation des corn odesmosomes lat raux permet la lib ration du corn ocyte correspondant la desquamation L paisseur de la couche corn e est extr mement variable selon le territoire anatomique et les contraintes m caniques subies passant de quelques dizaines de um pour les paupi res quelques millim tres pour les r gions palmoplantaires cet paississement de la couche corn e dans l piderme palmoplantaire s accompagne d une persistance prolong e de l ensemble des corn odesmosomes jusque dans les derni res assises corn ocytaires Une
46. whereas WAP2 is overexpressed in GKs and could thus play an antimicrobial role in uppermost epidermal layers Therefore our study contributes to enlarge the panel of proteases and protease inhibitors potentially involved in Genome Biology 2007 8 R107 160 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article RIO7 Toulza et a R107 19 Table 8 Monogenic diseases due to mutations of genes involved in lipid metabolism and displaying an epidermal phenotype Gene Function MiM reference Pathology ABCA 12 ABC lipid transporter 242500 Harlequin ichthyosis STS Steroid sulfatase 38100 X linked ichthyosis GBA Glucocerebrosidase 230800 Gaucher disease ALOXE3 ALOXBI 2 Arachidonate lipoxygenases 242100 Non bullous congenital ichthyosiform erythroderma CGI58 ABHDS Putative triglyceride lipase 62 Chanarin Dorman syndrome LIPH Phospholipase A 63 Hair growth defect barrier function regulation of desquamation and defense against microorganisms Genes involved in lipid metabolism Mutations of genes involved in various aspects of lipid metab olism are at the origin of several human genodermatoses Table 8 underlying the key interest in the identification of new lipid processing genes expressed in the skin We identi fied three new human genes LIPK LIPM and LIPN which encode proteins containing two characteristic domains the B hydrolase fold and the abhydrolase associated lipase region They
47. 22 ainsi que les sites li s par les facteurs de transcription r gulant leur activit g n ralement situ s dans le promoteur proximal ou ventuellement dans les premiers introns Les d veloppements de la bioinformatique ont rendu faciles les comparaisons entre les g nomes de diff rentes esp ces et de nombreux logiciels d alignements multiples DBA DNA Block Aligner PipMaker zPicture permettent d identifier les r gions conserv es les remaniements inversions duplications etc et donc de cibler des r gions plus susceptibles d tre importantes pour la r gulation g nique 37 to 32 31 to 26 2 to 4 28 to 32 Figure 22 Diff rents l ments du c ur d un SS EE promoteur eucaryote Smale and Kadonaga 2003 Chacun de ces BRE TATA Box Inc DPE l ments n est pr sent que TFIIB Initiator Downstream Core dans une partie des Recognition Promoter Element promoteurs et environ 50 Drosophila TCASTE des g nes sont associ s a G AAC GGG A aG GACA CACGCC TATAT AAR mimara PyPyANTPyPy al Ea des lots CpG Element C Toutefois l analyse de la conservation des s quences g nomiques ne se limite pas aux promoteurs proximaux et introns D s 1993 la comparaison de s quences g nomiques d organismes tr s loign s volutivement notamment entre les mammif res et le poisson Takifugu rubripes ou Fugu a permis de mettre en vidence l existence en dehors des r gions codantes de r
48. 8 R107 Toulza et a R107 13 155 D _ D a D n D gt Le n J R107 14 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al http genomebiology conv 2007 8 6 R107 Small intestine Placenta Lung Liver Muscle Kidney Pancreas Spleen Thymus Prostate Colon PBL FLG2 SERPA12 CLDN23 Heart Brain Eii i i GAPDH LIPN LIPM LIPK Figure 4 Testis Ovary Expression profile of newly identified genes PCR experiments were performed with a commercial panel of cDNAs from 16 human tissues PBL peripheral blood leukocytes and with cDNAs prepared from the T4 fraction enriched in GKs For each gene PCR primers were chosen to amplify a cDNA fragment encompassing at least two exons Note the highly specific expression pattern of FLG2 LIPK M N and to a lesser extent SERPINA 2 genes The apparent size variation of the CLDN23 fragment results from an artifactual gel distortion Expression of GAPDH assessed with the primers provided by the manufacturer was used as a control step of keratinocyte differentiation Although highly related the LIPJ protein might play a different role as previously sug gested by its lack of a signal peptide Clorf8l Six spliced ORESTES corresponded to a totally unknown gene without mRNA sequences in the databases We per formed RACE experiments and identified 16 exons and 15 introns with canonical splice sites and a consensus pol
49. A p gt ANAGENE CATAG NE T LOGENE gt 5 semaines Cuticule de la TP SSSR me x ss Le dite B CE _ Epiderme ER i a Couche REA Pannie Infundibulum Muscle rs arrecteur IA a Cortex de poil i AS ie ie ANS be e a an i i i i s bac e SOLE WE GEE Medulla GEI fone keratogene Bulbe pileux Figure 27 Unit pilo s bac e et cycle pilaire A Repr sentation sch matique des trois phases du cycle pilaire B Repr sentation sch matique de l unit pilo s bac e avec un follicule en phase anag ne E piderme GEE gaine pith liale externe GEI gaine pith liale interne C cortex M m dulla Ma matrice Pd papille dermique S glande s bac e TP tige pillaire D apr s Bernard 2002 Le follicule pileux ob it un cycle complexe de renouvellement o une p riode de croissance phase anag ne est suivie d une r gression phase catag ne puis d une p riode de latence phase t log ne avant que la croissance lors du cycle suivant ne provoque l expulsion du follicule pr c dant figure 27 Les follicules pileux sont constitu s de trois r gions de la surface vers l int rieur l infundibulum portion stable du follicule isthme et le bulbe pileux renouvel s chaque cycle Le bulbe est ancr autour de la papille dermique qui joue aussi un r le de nutrition et comprend la fois des m lanocytes re
50. A cryotransmission electron microscopy study of skin barrier formation J Invest Dermatol 120 555 560 Nukui T Ehama R Sakaguchi M Sonegawa H Katagiri C Hibino T and Huh N H 2008 SI00A8 A9 a key mediator for positive feedback growth stimulation of normal human keratinocytes J Cell Biochem 104 453 464 281 Okunade G W Miller M L Azhar M Andringa A Sanford L P Doetschman T Prasad V and Shull G E 2007 Loss of the Atp2cl secretory pathway Ca 2 ATPase SPCA I in mice causes Golgi stress apoptosis and midgestational death in homozygous embryos and squamous cell tumors in adult heterozygotes J Biol Chem 282 26517 26527 Palmer C N Irvine A D Terron Kwiatkowski A Zhao Y Liao H Lee S P Goudie D R Sandilands A Campbell L E Smith F J O Regan G M Watson R M Cecil J E Bale S J Compton J G DiGiovanna J J Fleckman P Lewis Jones S Arseculeratne G Sergeant A Munro C S El Houate B McElreavey K Halkjaer L B Bisgaard H Mukhopadhyay S and McLean W H 2006 Common loss of function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis Nat Genet 38 441 446 Palmer H G Anjos Afonso F Carmeliet G Takeda H and Watt F M 2008 The vitamin D receptor is a Wnt effector that controls hair follicle differentiation and specifies tumor type in adult epidermis PLoS ONE 3 e1483
51. A molecular defect in loricrin the major component of the cornified cell envelope underlies Vohwinkel s syndrome Nat Genet 13 70 77 Magert H J Standker L Kreutzmann P Zucht H D Reinecke M Sommerhoff C P Fritz H and Forssmann W G 1999 LEKTI a novel 15 domain type of human serine proteinase inhibitor J Biol Chem 274 21499 21502 Magnusdottir E Kalachikov S Mizukoshi K Savitsky D Ishida Yamamoto A Panteleyev A A and Calame K 2007 Epidermal terminal differentiation depends on B lymphocyte induced maturation protein 1 Proc Natl Acad Sci U S A 104 14988 14993 Mao Qiang M Feingold K R Jain M and Elias P M 1995 Extracellular processing of phospholipids is required for permeability barrier homeostasis J Lipid Res 36 1925 1935 Marshall H Studer M Popperl H Aparicio S Kuroiwa A Brenner S and Krumlauf R 1994 A conserved retinoic acid response element required for early expression of the homeobox gene Hoxb 1 Nature 370 567 571 Matsui T Hayashi Kisumi F Kinoshita Y Katahira S Morita K Miyachi Y Ono Y Imai T Tanigawa Y Komiya T and Tsukita S 2004 Identification of novel keratinocyte secreted peptides dermokine alpha beta and a new stratified epithelium secreted protein gene complex on human chromosome 19q13 1 Genomics 84 384 397 Matsuki M Yamashita F Ishida Yamamoto A Yamada K Kinoshita C Fushiki S Ueda E Mo
52. Bee 243 Dinucl otides encod s par chaque couleur 2 me base S quence mod le TA AC AA GA CG CA CC TC GC GI GG AG AT TG TT CT 1 re base Double interrogation Avec un encodage a deux bases chacune est d finie deux fois A SNP site indicated by 2 adjacent color changes AA w 6 6 T Reference in base space Reference in color space Read in color space A A CET A GGT G Read in base space SNP Single color change is typically a measurement error A EE OT E E TG Reference in base space Reference in color space Read in color space A A CGATCOCOCAC Read in base space Error 1 Base Deletion Book Se TAGG T G Reference in base space Reference in color space Read in color space Read in base space Reference in base space Reference in color space Read in color space A A CC AG EA EU I Read in base space insertion 244 Annexe 3 Vers l int gration des donn es d expression de la connaissance la mod lisation Un des int r ts des approches grande chelle est la possibilit th orique des combiner les r sultats de plusieurs tudes ou de les comparer En r alit de telles m ta analyses sont g n ralement compliqu es par l emploi de techniques diff rentes et par l absence d uniformisation dans l analyse et l annotation des r sultats Ainsi m me lorsqu il s agit de comparer des donn es de diverses puces ADN par exempl
53. Desmoglein 4 in hair follicle differentiation and epidermal adhesion evidence from inherited hypotrichosis and acquired pemphigus vulgaris Cell 113 249 260 Kloting N Berndt J Kralisch S Kovacs P Fasshauer M Schon M R Stumvoll M and Bluher M 2006 Vaspin gene expression in human adipose tissue association with obesity and type 2 diabetes Biochem Biophys Res Commun 339 430 436 Kobayashi M S Asai S Ishikawa K Nishida Y Nagata T and Takahashi Y 2008 Global profiling of influence of intra ischemic brain temperature on gene expression in rat brain Brain Res Rev 58 171 191 Koch P J de Viragh P A Scharer E Bundman D Longley M A Bickenbach J Kawachi Y Suga Y Zhou Z Huber M Hohl D Kartasova T Jarnik M Steven A C and Roop D R 2000 Lessons from loricrin deficient mice compensatory mechanisms maintaining skin barrier function in the absence of a major cornified envelope protein J Cell Biol 151 389 400 295 Komuves L Oda Y Tu C L Chang W H Ho Pao C L Mauro T and Bikle D D 2002 Epidermal expression of the full length extracellular calcium sensing receptor is required for normal keratinocyte differentiation J Cell Physiol 192 45 54 Koria P and Andreadis S T 2006 Epidermal morphogenesis the transcriptional program of human keratinocytes during stratification J Invest Dermatol 126 1834 1841 Koster M I and Roop D R 2007 Mechanism
54. ESTs were selected Table 7 The relative T4 T1 ratio could not be calculated for 20 of them due to very low expression levels Ten genes were equally expressed in the two layers and nine were overex pressed in the basal layer even if expressed at a low level in the granular layer Interestingly 33 were overexpressed in the granular layer with T4 T1 ratios ranging from 6 to 800 For several genes the T4 T1 expression ratio was thus much larger than that observed for the KLK7 gene used as a specific marker of the GKs in our cell purification experiments Table 1 Therefore these data emphasize the high degree of purity of the GKs we have purified from healthy human skin They also provide one with new highly specific markers for this cell type Identification of new genes FLG2 The epidermal differentiation complex EDC spans 1 62 megabases on 1q21 3 and contains approximately 50 genes specifically involved in the barrier function such as those encoding involucrin loricrin filaggrin small proline rich proteins SPRR1 4 or late cornified envelope proteins LCE1 5 Figure 3a We cloned many sequences corresponding to known genes of this locus Figure 3b but also a large number of sequences for a previously poorly characterized transcript encoding filaggrin 2 FLG2 also called ifapsoriasin IFPS GenBank AY827490 FLG2 dis plays features of the fused family genes encoding filaggrin trichohyalin or repetin with three
55. Genotoul biochips platform Toulouse We thank I El Gannab and M Guti rrez Martos for their contribution to qRT PCR and sequencing respectively References l Segre JA Bauer C Fuchs E KIf4 is a transcription factor required for establishing the barrier function of the skin Nat Genet 1999 22 356 60 2 de Guzman Strong C Wertz PW Wang C et al Lipid defect underlies selective skin barrier impairment of an epidermal specific deletion of Gata 3 J Cell Biol 2006 175 661 70 3 Yu Z Lin KK Bhandari A et al The Grainyhead like epithelial transactivator Get 1 Grhl3 regulates epidermal terminal differentiation and interacts functionally with LMO4 Dev Biol 2006 299 122 36 4 Magnusdottir E Kalachikov S Mizukoshi K et al Epidermal terminal differentiation depends on B lymphocyte induced maturation protein 1 Proc Natl Acad Sci U S A 2007 104 14988 93 5 Jansen BJ van Ruissen F de Jongh G et al Serial analysis of gene expression in differentiated cultures of human epidermal keratinocytes J Invest Dermatol 2001 116 12 22 6 van Ruissen F Jansen BJ de Jongh GJ et al Differential gene expression in premalignant human epidermis revealed by cluster analysis of serial analysis of gene expression SAGE libraries Faseb J 2002 16 246 8 180 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 van Ruissen F Jansen BJ de Jongh GJ et al A partial transcriptome of human epidermis Genomi
56. J Cell Biol 174 169 174 Scott I R Harding C R and Barrett J G 1982 Histidine rich protein of the keratohyalin granules Source of the free amino acids urocanic acid and pyrrolidone carboxylic acid in the stratum corneum Biochim Biophys Acta 719 110 117 Segre J A Bauer C and Fuchs E 1999 Klf4 is a transcription factor required for establishing the barrier function of the skin Nat Genet 22 356 360 Serre G Mils V Haftek M Vincent C Croute F Reano A Ouhayoun J P Bettinger S and Soleilhavoup J P 1991 Identification of late differentiation antigens of human cornified epithelia expressed in re organized desmosomes and bound to cross linked envelope J Invest Dermatol 97 1061 1072 Serup J and Blichmann C 1987 Epidermal hydration of psoriasis plaques and the relation to scaling Measurement of electrical conductance and transepidermal water loss Acta Derm Venereol 67 357 359 Sevilla L M Nachat R Groot K R Klement J F Uitto J Djian P Maatta A and Watt F M 2007 Mice deficient in involucrin envoplakin and periplakin have a defective epidermal barrier J Cell Biol 179 1599 1612 Sevilla L M Nachat R Groot K R and Watt F M 2008 Kazrin regulates keratinocyte cytoskeletal networks intercellular junctions and differentiation J Cell Sci 121 3561 3509 Shields J M Christy R J and Yang V W 1996 Identification and characterization of a gene encoding a gu
57. JP Simon M Serre G Homo oligomerization of human corneodesmosin is mediated by its N terminal glycine loop domain j Invest Dermatol 2004 Genome Biology 2007 8 R107 164 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et a R107 23 122 747 754 51 Grundmann U Romisch J Siebold B Bohn H Amann E Cloning and expression of a cDNA encoding human placental protein 11 a putative serine protease with diagnostic significance as a tumor marker DNA Cell Biol 1990 9 243 250 52 Hagiwara K Kikuchi T Endo Y Huqun Usui K Takahashi M Shibata N Kusakabe T Xin H Hoshi S et al Mouse SWAMI and SWAM 2 are antibacterial proteins composed of a single whey acidic protein motif J Immunol 2003 170 1973 1979 53 Cousin X Hotelier T Giles K Lievin P Toutant JP Chatonnet A The alpha beta fold family of proteins database and the cholinesterase gene server ESTHER Nucleic Acids Res 1997 25 143 146 54 Du H Witte DP Grabowski GA Tissue and cellular specific expression of murine lysosomal acid lipase mRNA and protein Lipid Res 1996 37 937 949 55 Anderson RA Sando GN Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase cholesteryl ester hydrolase Similarities to gastric and lingual lipases Biol Chem 1991 266 22479 22484 56 Bodmer MW Angal S Yarranton GT Harris TJ Lyons A King DJ Pieroni G Riviere C Verger R Lowe PA Molecular cloning of
58. Kelley J M Gocayne J D Dubnick M Polymeropoulos M H Xiao H Merril C R Wu A Olde B Moreno R F and et al 1991 Complementary DNA sequencing expressed sequence tags and human genome project Science 252 1651 1656 Adams M J Reichel M B King I A Marsden M D Greenwood M D Thirlwell H Arnemann J Buxton R S and Ali R R 1998 Characterization of the regulatory regions in the human desmoglein genes encoding the pemphigus foliaceous and pemphigus vulgaris antigens Biochem J 329 Pt 1 165 174 Ahituv N Zhu Y Visel A Holt A Afzal V Pennacchio L A and Rubin E M 2007 Deletion of ultraconserved elements yields viable mice PLoS Biol 5 e234 Aho S Li K Ryoo Y McGee C Ishida Yamamoto A Uitto J and Klement JF 2004 Periplakin gene targeting reveals a constituent of the cornified cell envelope dispensable for normal mouse development Mol Cell Biol 24 6410 6418 Akavia U D Veinblat O and Benayahu D 2008 Comparing the transcriptional profile of mesenchymal cells to cardiac and skeletal muscle cells J Cell Physiol 216 663 672 Akiyama M Sugiyama Nakagiri Y Sakai K McMillan J R Goto M Arita K Tsuji Abe Y Tabata N Matsuoka K Sasaki R Sawamura D and Shimizu H 2005 Mutations in lipid transporter ABCA12 in harlequin ichthyosis and functional recovery by corrective gene transfer J Clin Invest 115 1777 1784 Al Amoudi A Die
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60. PREPS 7652 Z05210 principaux clusters 41576 LPS gt zabit _ Ciorttz e TATS RAIZ regroupant lui seul 19 175693 KLE D ur ne m d 14259 IHES arqueurs a isti 7 be tiges _250_s_BC04 0865 ee e nS 135936 SL CSUR diff renciation fl ches i f it COC148 n i f 15148 KTERE rouges Toutefois la encore 14766 i Bre Tk leb 147 SLCsSB2 tt h t 166147 ECS cette approche perme 1072247 kKIAA0 2S me d ter tion d 13484 BATAPZ augmenter la proportion de fier REBRI P 7 HET eoi vrais positifs 44 mais 165355 ECC 15 157966 CESC 12 eee augmente consid rablement le 103a FLE att pre piin nombre de faux n gatifs Lidse EO SSA L h fi h e o te approche finalement choisie TEET BEz Srrar MA _i0ize4_1571_5_W A_001264 est celle du tri des g nes en 211 fonction du FDR taux de fausse d couverte qui a pour avantage d tre plus stringent que le test de Student sans carter de l analyse un nombre trop important de g nes Toutefois le probl me ne se situe pas dans la m thode d analyse des donn es mais dans les mesures elles m mes et aucune des approches n a permis de discriminer avec efficacit les vrais des faux positifs Si les donn es issues de PCR quantitative sont consid r es comme des r f rences les ratios de puces non confirm s peuvent trouver plusieurs explications propres a la technique et au mat riel biologique employe La fi
61. R sum Au cours de la diff renciation pidermique les k ratinocytes quittent le compartiment basal et cessent de prolif rer Les cellules progressant dans les couches suprabasales subissent des remaniements biochimiques complexes et finement r gul s conduisant a la cornification puis la desquamation Ce processus de mort cellulaire programm e aboutit la formation des corn ocytes qui assurent la fonction de barri re protectrice Les k ratinocytes granuleux derni res cellules vivantes produisent la quasi totalit des prot ines et lipides requis pour la fonction barri re pour cette raison une meilleure compr hension des processus mis en jeu passe par l tude grande chelle de leur transcriptome Dans cet objectif des k ratinocytes granuleux ont t purifi s a partir d piderme humain par incubations successives en pr sence de trypsine Le niveau d enrichissement en k ratinocyte granuleux a t contr l par RT PCR quantitative en temps r el qRT PCR Plus de 22 500 EST ont t produits par la m thode des ORESTES puis s quenc s Parmi eux 16 406 EST correspondent 3 387 g nes diff rents dont 14 r trog nes et 5 g nes non codants Le niveau de normalisation de la m thode s av re satisfaisant 4 6 EST par g ne bien que certains transcrits abondants soient plus repr sent s Environ 330 g nes exprim s sont repr sent s par moins de 100 EST dans la banque de donn es UniGene et sont donc su
62. Role of endogenous cathepsin D like and chymotrypsin like proteolysis in human epidermal desquamation Br J Dermatol 141 453 459 Horsley V O Carroll D Tooze R Ohinata Y Saitou M Obukhanych T Nussenzweig M Tarakhovsky A and Fuchs E 2006 Blimp defines a progenitor population that governs cellular input to the sebaceous gland Cell 126 597 609 Huang J Sheng H H Shen T Hu Y J Xiao H S Zhang Q Zhang Q H and Han Z G 2006 Correlation between genomic DNA copy number alterations and transcriptional expression in hepatitis B virus associated hepatocellular carcinoma FEBS Lett 580 3571 3581 Hughes T R Mao M Jones A R Burchard J Marton M J Shannon K W Lefkowitz S M Ziman M Schelter J M Meyer M R Kobayashi S Davis C Dai H He Y D Stephaniants S B Cavet G Walker W L West A Coffey E Shoemaker D D Stoughton R Blanchard A P Friend S H and Linsley P S 2001 Expression profiling using microarrays fabricated by an ink jet oligonucleotide synthesizer Nat Biotechnol 19 342 347 Hwang J Mehrani T Millar S E and Morasso M I 2008 DIx3 is a crucial regulator of hair follicle differentiation and cycling Development 135 3149 3159 Hwang S M Ahn S K Menon G K Choi E H and Lee S H 2001 Basis of occlusive therapy in psoriasis correcting defects in permeability barrier and calcium gradient Int J Dermatol 40 223 231 Iga
63. Steinert et al 1991 stabilise par des ponts disulfures Deux g nodermatoses autosomiques dominantes ont t associ es a des mutations de la loricrine une forme mutilante du syndrome de Vohwinkel Maestrini et al 1996 OMIM 604117 et P rythrok ratodermie progressive sym trique PSEK OMIM 602036 Ishida Yamamoto et al 1997 Ces pathologies sont caract ris es par une k ratodermie palmoplantaire assortie d un pseudo ainhum constriction circonf rentielle des phalanges pouvant aboutir leur amputation Des souris invalid es pour le g ne de la loricrine pr sentent un retard dans la formation de la barri re pidermique la fin de la vie embryonnaire une rythrodermie cong nitale et une couche corn e fragilis e Koch et al 2000 N anmoins ce ph notype dispara t au bout de 4 5 jours La surexpression d autres prot ines de l enveloppe corn e telles que SPRR2D SPRR2H et la r p tine pourrait t moigner de la mise en place d un m canisme de compensation Produites par la m me quipe des souris transg niques exprimant une forme mut e de la loricrine proche de celle associ e au variant mutilant du syndrome de Vohwinkel et la PSEK pr sentent un ph notype proche de celui des patients avec une ichtyose un d faut de barri re et des constrictions au niveau de la queue Stern et al 2006 La s v rit du ph notype est directement corr l e au taux d expression du transg ne N anmoins la loricr
64. T and Foa R 2005 Quantitative PCR of bone marrow BCL2 IgH cells at diagnosis predicts treatment response and long term outcome in follicular non Hodgkin lymphoma Blood 105 3428 3433 Rassner U Feingold K R Crumrine D A and Elias P M 1999 Coordinate assembly of lipids and enzyme proteins into epidermal lamellar bodies Tissue Cell 31 489 498 Ratnam A V Bikle D D and Cho J K 1999 1 25 dihydroxyvitamin D3 enhances the calcium response of keratinocytes J Cell Physiol 178 188 196 Reiner A Yekutieli D and Benjamini Y 2003 Identifying differentially expressed genes using false discovery rate controlling procedures Bioinformatics 19 368 375 Rice R H and Green H 1977 The cornified envelope of terminally differentiated human epidermal keratinocytes consists of cross linked protein Cell 11 417 422 Roberts D and Marks R 1980 The determination of regional and age variations in the rate of desquamation a comparison of four techniques J Invest Dermatol 74 13 16 Rochat A Kobayashi K and Barrandon Y 1994 Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis Cell 76 1063 1073 Roepman P Wessels L F Kettelarij N Kemmeren P Miles A J Lijnzaad P Tilanus M G Koole R Hordijk G J van der Vliet P C Reinders M J Slootweg P J and Holstege F C 2005 An expression profile for diagnosis of lymph node metastases from primary head and neck squamous cell carci
65. This process used together with the ORESTEs technique allowed the production of more than 22000 sequences corresponding to 3387 genes expressed in the granular layer including new differentiation markers involved in various functions structural protein lipid metabolism and transport protease and inhibitors etc Gene expression profile of granular keratinocytes was also compared with basal keratinocytes one using pangenomic microarrays highlighting 200 candidates To identify some additional TF coding genes a study of conserved TF binding site was performed by bioinformatics on the promoters of 52 differentiation markers The results produced by these three techniques were combined and analyzed to select 300 candidates to be validated by real time PCR Among them 155 could be reliably quantified including 49 new differentiation associated genes Moreover 37 of 94 TF coding genes appeared to be up or downregulated in granular keratinocytes suggesting a function in the regulation of the differentiation These advances made in the field of normal keratinocyte differentiation should improve the knowledge of the complex regulatory networks driving the formation of the epidermal barrier and may also contribute to the deciphering of complex diseases such as atopic dermatitis psoriasis and ichthyoses which are characterized by deregulated differentiation programs Table des mati res LINTRODUC HON seins danseuse donnees doseotensosetaes
66. Y Tagami M Morita R Maeda N Kawai J Hayashizaki Y Nagai Y Hori T lida T and Nakaya T 2009 Direct metagenomic detection of viral pathogens in nasal and fecal specimens using an unbiased high throughput sequencing approach PLoS ONE 4 e4219 Nakayama Y Nara N Kawakita Y Takeshima Y Arakawa M Katoh M Morita S Iwatsuki K Tanaka K Okamoto S Kitamura T Seki N Matsuda R Matsuo M Saito K and Hara T 2004 Cloning of cDNA encoding a regeneration associated muscle protease whose expression is attenuated in cell lines derived from Duchenne muscular dystrophy patients Am J Pathol 164 1773 1782 Neiva K G Zhang Z Miyazawa M Warner K A Karl E and Nor J E 2009 Cross talk initiated by endothelial cells enhances migration and inhibits anoikis of squamous cell carcinoma cells through STAT3 AKt ERK signaling Neoplasia 11 583 593 Nemes Z Marekov L N Fesus L and Steinert P M 1999 A novel function for transglutaminase 1 attachment of long chain omega hydroxyceramides to involucrin by ester bond formation Proc Natl Acad Sci U S A 96 8402 8407 Ng D C Shafaee S Lee D and Bikle D D 2000 Requirement of an AP 1 site in the calcium response region of the involucrin promoter J Biol Chem 275 24080 24088 Norlen L 2001 Skin barrier formation the membrane folding model J Invest Dermatol 117 823 829 Norlen L Al Amoudi A and Dubochet J 2003
67. a une p riodontopathie OMIM 245000 Peu d tudes sont disponibles quant au r le de cette prot ase dans l piderme en g n ral et dans la desquamation en particulier Sa fonction dans les lymphocytes T est toutefois bien document e Elle y active les granzymes A et B par prot olyse des proformes Le granzyme B s cr t par les k ratinocytes intervient dans la d fense antimicrobienne Berthou et al 1997 On peut sp culer sur un r le de CTSC dans l activation du granzyme B ou celle d autres prot ases jouant un r le dans la diff renciation pidermique Meade et al 2006 L inhibition de la cathepsine D diminue d un tiers le d tachement des corn ocytes pH acide dans un mod le de desquamation de couche corn e plantaire in vitro Horikoshi et al 1999 Cette prot ase acide aspartique est d tect e en immunomicroscopie lectronique dans l espace intercorn ocytaire o elle colocalise avec les corn odesmosomes Igarashi et al 2004 Ces arguments sont en faveur de l implication de la CTSD dans la desquamation En plus des cathepsines C et D les cathepsines V et L semblent impliqu es respectivement dans la d gradation des corn odesmosomes et la maturation des transglutaminases Zeeuwen et al 2007 L activit prot olytique responsable de la desquamation est r gul e par la pr sence d un grand nombre d inhibiteurs de prot ases On peut citer SLPI Secretory Leukocyte Protease Inhibitor et SKALP
68. across exons except for 8 intronless genes Primer sequences were designed using the Primer3 software and BLAST analysis ensured the lack of any similarity to other human sequences Reverse transcription was performed by standard procedures using 1 ug of total RNA and a mixture of oligo dT and random hexamers Primer pairs were systematically tested by classical PCR T 60 C 38 cycles on total epidermis cDNA to verify amplification of a single product of expected size Quantification assays were performed using the Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG with ROX Invitrogen and the 7300 Real Time PCR System with corresponding software Applied Biosystems Expression levels were calibrated using transcript levels of the beta 2 microglubulin B2M housekeeping gene The 2 4c method calculated the relative level of gene expression between BK and GK fractions Dissociation curves were verified and amplicons were systematically sequenced to attest the specificity of quantifications Promoter analyses Human promoter sequences and vertebrate orthologues were retrieved for 52 previously described differentiation associated genes selected from the literature and analyzed with Genomatix Suite tools Genomatix Software GmbH see Supporting 173 information When a given transcription factor binding site was found in a minimum of three different promoters corresponding TF or family was selected for RT PCR analyses Results Large scale id
69. al 2006 Sequence and haplotype analysis supports HLA C as the psoriasis susceptibility gene Arr Hum Genet T8 827 851 Nickoloff B J Bonish B K Marble D J Schriedel K A DiPietro L A Gordon K B and Lingen M W 2006 Lessons leamed from psonatic plaques conceming mechanisms of tissue repair remodeling and inilammai n A dinvesig Dermatol Sven Prec 11 16 29 Orr Sa Giuressi E Carcassi C Casula M and Contu L 2005 Mapping of the major psoriasis susceptiility locus PSORS1 in a 70 Kb interval around the comeodesmosin gene CDSN Arr J Hum Genet 76 164 171 Proksch E Feingold K Ra Man M Q and Elias F M 1991 Barner function regulates epidermal DNA synthesis Clin invest 87 1668 1674 Serre Ge Mils Ya Haftek Ma Vincent C Croute F Reano As Oubayoun J Pa Bettinger S and Soleilhavoup J P 1991 kbemification of late differentiation antigens of human comifed epithelia expressed in re organized desmosomes and bound to cross linked envelope J invest Dermatal 97 1061 1072 Simon M Mont zin ML Guerrin M Duricux J J and Serre CG 1997 Characterization and purification of human comeodesmosin an epidermal basic glycopravtem associated with comeorvie specific modified desmosomes d Biol Chem 272 31770 31776 Simon M Jonca N Guerrin M Haftek M Bernard D Caubet C Egelrud T Schmidt R and Serre G 2001 Refined characterization
70. and GKs were reverse transcribed differentially labelled with Cy3 or Cy5 and cohybridized on pangenomic microarrays consisting of 25 248 different 50mers targeting 22 458 genes platform GPL1946 in Gene Expression Omnibus GEO database Experiments were performed at the Biochip platform of the G nopole G notoul in Toulouse France http biopuce insa toulouse fr sommaire php and arrays were used according to the manufacturer s instructions for non amplified RNA see Supporting information Microarrays data are MIAME compliant and raw data are available from the GEO database under accession number GSE13263 Data were normalized using the LOWESS method with Bioplot software http biopuce insa toulouse fr ExperimentExplorer doc SAM software was used for false discovery rate FDR analysis 172 Immunohistochemistry Normal human skin samples were fixed 24h in formalin dehydrated 24h in 70 ethanol and embedded in paraffin Sections 4 um were processed for immunohistochemical analysis ImmPRESS anti rabbit lg peroxidase kit Vector Laboratories was used with the polyclonal rabbit antibodies against MAPT Abcam or SH3KBP1 Sigma Aldrich prepared at the manufacturers recommended dilutions Images were taken using a Nikon eclipse 22 80i microscope equipped with a Nikon DXM 1200C digital camera and NIS image analysis software Quantitative real time PCR All primer pairs Additional Table 2 generated 100 250 bp amplicons spanning
71. au del de ce qui tait suppos pr c demment expliquant probablement une partie des variations ph notypiques normales entre individus Carter 2007 La combinaison de puces pour l expression g nique et de CGH arrays a galement r v l un lien indirect entre des variations de nombre de copies et l expression de certains g nes dans des carcinomes h patocellulaires dus au virus de l h patite B Huang et al 2006 rejoignant des r sultats faisant le lien entre amplification ou perte d h t rozygotie et alt rations des profils d expression g nique dans le m me type de cancer Xu et al 2001 Enfin la technologie des puces ADN ou des versions d riv es sur support microfluidique commence tre employ e pour capturer des s quences g nomiques et les s quencer par des techniques de nouvelle g n ration Garber 2008 1 2 1 5 Normalisation et tests statistiques En raison du grand nombre de types de puces et d applications nous ne d crivons ici que l analyse de donn es d expression issues d hybridations comparatives c est a dire du type deux couleurs o une condition est marqu e en rouge Cyanine5 ou Cy5 et l autre en vert Cy3 les deux tant simultan ment cohybrid es sur le m me support Les donn es issues de puces ADN sont des donn es dites bruit es c est a dire qu une part non n gligeable de chaque mesure est soumise l influence de param tres exp rimentaux qui peuv
72. autre caract ristique de cet piderme est l existence d une couche claire stratum lucidum situ e juste avant la couche corn e et constitu e de cellules transitionnelles en cours de cornification alors que ces m mes cellules apparaissent dispers es l interface couche granuleuse couche corn e dans les autres r gions anatomiques 61 2 2 2 Aspects fonctionnels 2 2 2 1 Hom ostasie de l piderme L piderme est soumis a de nombreuses forces tirement cisaillement abrasion et m me en absence de traumatisme n cessitant une cicatrisation un renouvellement permanent du tissu est indispensable pour que la fonction protectrice soit maintenue Afin que l hom ostasie du tissu soit conserv e il faut que l auto renouvellement des k ratinocytes dans la couche basale contrebalance exactement le d tachement des corn ocytes en surface A l heure actuelle le ou les m canismes couplant prolif ration et desquamation restent obscurs m me si la description de ces deux processus a consid rablement progress ces derni res ann es 2 2 2 LL Couche basale et auto renouvellement La couche basale est le lieu o les k ratinocytes assurent l auto renouvellement de l piderme les k ratinocytes suprabasaux tant des cellules post mitotiques engag es dans un processus de diff renciation terminale irr versible Les k ratinocytes basaux se distinguent des k ratinocytes suprabasaux par l expression d un
73. bain de trypsine La premi re tude partielle du transcriptome de l piderme humain entier obtenu par clivage enzymatique a utilis la m thode SAGE peu adapt e a la caract risation de nouveaux g nes par manque de sp cificit van Ruissen et al 2002b Au total 15 131 tiquettes SAGE dont 7645 uniques ont t collect es et compar es aux bases de donn es Parmi les 20 tiquettes les plus repr sent es 6 n ont pu tre identifi es et 10 correspondent des prot ines ribosomiques La galectine 7 une lectine pidermique exprim e dans toutes les couches et le g ne hypoth tique KIAA0375 identifi depuis comme codant pour RUSC2 RUN and SH3 domain containing 2 ou Iporine un partenaire de Rabi exprim de fa on ubiquiste font partie des g nes les plus fortement d tect s Cartharius et al 2005 Enfin le fait que seulement 2 tiquettes correspondent des g nes de la diff renciation pidermique KRT10 et KDAP Keratinocyte Differentiation Associated Protein souligne les limites de la m thode SAGE dans l tude de transcriptomes peu caract ris s De r cents travaux ont compar le profil d expression de diff rentes populations cellulaires pidermiques Radoja et al 2006 L piderme est s par du derme apr s incubation d une nuit 4 C avec la dispase puis les cellules pidermiques sont dissoci es par traitement la trypsine 37 C Les k ratinocytes basaux sont ensuite isol s l aid
74. but not to homeostasis of the epidermis Nat Med 11 1351 1354 Jackson B Till C M Hardman M J Avilion A A MacLeod M C Ashcroft G S and Byrne C 2005 Late cornified envelope family in differentiating epithelia response to calcium and ultraviolet irradiation J Invest Dermatol 124 1062 1070 Jang S I Karaman Jurukovska N Morasso M I Steinert P M and Markova N G 2000 Complex interactions between epidermal POU domain and activator protein 1 transcription factors regulate the expression of the profilaggrin gene in normal human epidermal keratinocytes J Biol Chem 275 15295 15304 Jang S I and Steinert P M 2002 Loricrin expression in cultured human keratinocytes is controlled by a complex interplay between transcription factors of the Spl CREB API and AP2 families J Biol Chem 277 42268 42279 Jansen B J van Ruissen F de Jongh G Zeeuwen P L and Schalkwijk J 2001 Serial analysis of gene expression in differentiated cultures of human epidermal keratinocytes J Invest Dermatol 116 12 22 Jaubert J Cheng J and Segre J A 2003 Ectopic expression of kruppel like factor 4 KIf4 accelerates formation of the epidermal permeability barrier Development 130 2767 2774 Jensen J M Folster Holst R Baranowsky A Schunck M Winoto Morbach S Neumann C Schutze S and Proksch E 2004 Impaired sphingomyelinase activity and epidermal differentiation in atopic dermatitis J Invest De
75. carrier family 5 member 20 CASZI 6l Castor homolog zinc finger 2 KCNJ 12 62 Potassium inwardly rectifying channel subfamily J 12 PII 64 26 serine protease 14 SERPINB7 64 Serpin peptidase inhibitor clade B member 7 127 DUOX2 64 Dual oxidase 2 3 GDPD2 68 Glycerophosphodiester phosphodiesterase containing 2 3 PDEI IA 75 Phosphodiesterase A 2 CLDN23 76 Claudin 23 PLCL4 78 Phospholipase C like 4 EYA4 8 Eyes absent homolog 4 LIPH 85 Lipase member H l RBP3 88 Retinol binding protein 3 Main specificity Adipocytes Kidney and inner ear Eye Brain Neurons Kidney Retina Neuron Heart and skeletal muscle Retina Neurons Tongue Embryo Spinal chord Liver Embryo Uterus Hematopoietic cells Intestine and kidney Mesenchyme Heart Placenta Mesangial cells Thyroid Osteoblasts Testis Placenta Neurons Heart and cochlea Intestine Retina epidermis had not been previously assessed evoking the pos sibility that they might play a specific role in this tissue Real time PCR expression profiling of selected genes Genes involved in the establishment of the skin barrier are expected to be specifically overexpressed by granular keratinocytes To compare the expression levels of candidate genes between the basal layer and GKs quantitative real time PCR experiments were performed with the T4 and T1 cell fractions Based on predicted domains and homologies 73 genes represented by less than 100
76. cibles connus Cette approche est forc ment limit e puisque bas e sur la comparaison de types cellulaires parfois tr s distincts mais a permis de montrer que certains des nouveaux FT surexprim s au cours de la diff renciation k ratinocytaire et donc r gulateurs probables de ce programme g n tique sont galement exprim s au cours d autres programmes comme la diff renciation des cardiomyocytes GATA4 ZFPM2 ANKRD1 et HOPX ou lh matopoi se NFE2 de m me que GATA3 d ja d crit Si l on se base sur le nombre de g nes codant pour des prot ines contenant un domaine de liaison l ADN le nombre estim de facteurs de transcription chez l tre humain est d environ 2600 Babu et al 2004 Ce chiffre exclue les nombreuses prot ines adaptatrices susceptibles d influer grandement sur l action de ces facteurs sans se lier directement l ADN Alors que cette immense diversit de facteurs sugg re une faible redondance il existe d j plus de 3 millions de combinaisons de deux facteurs de transcription et pr s de 3 milliards de combinaisons de trois 229 facteurs il semble quun m me facteur de transcription non ubiquiste soit fr quemment r utilis dans des contextes et types cellulaires parfois tr s diff rents Il serait par exemple int ressant de savoir si la diff renciation des k ratinocytes et des cardiomyocytes deux types cellulaires soumis a des contraintes m caniques importantes partagent
77. coh sion pidermique in utero mais qu elle est par contre indispensable tout au long de la vie pour maintenir l int grit des desmosomes et donc la coh sion intercellulaire dans l piderme Le renforcement des propri t s adh sives que cette prot ine conf re aux corn odesmosomes semble galement n cessaire au maintien de l architecture des follicules pileux 248 D 2 O YW ri O 2 a w i O 2 Research Article 2699 Corneodesmosin gene ablation induces lethal skin barrier disruption and hair follicle degeneration related to desmosome dysfunction Emilie A Leclerc Anne Huchenq Nicolas R Mattiuzzo Daniel Metzger Pierre Chambon Norbert B Ghyselinck Guy Serre Nathalie Jonca and Marina Guerrin UMRA 5165 Diff renciation Epidermique et Autoimmunit Rhumatoide UDEAR CNRS Universit Toulouse Ill IFR150 INSERM CHU PURPAN Place du Dr Baylac TSA 40031 F 31059 Toulouse Cedex 9 France IGBMC Institut de G n tique et de Biologie Mol culaire et Cellulaire Inserm U596 CNRS UMR 7104 Universit Louis Pasteur Coll ge de France Iilkirch F 67400 France Author for correspondence e mail Guy Serre udear cnrs fr These authors contributed equally to this work Accepted 1 May 2009 doumai of Call Science 122 2699 2709 Published by The Company of Biologists 2009 doi 10 1242fes 050302 summary Corneodesmosin CDSN is specific to desm
78. cytoskeleton 2 Soares_testis_NHT Homo sapiens cDNA clone 1292851 mannosidase alpha class 16 member 1 CDC42 binding protein kinase beta DMPK like FLJ25076 similar to CG4502 PA TBC1 domain family member 9B with GRAM domain mitochondrial ribosomal protein L28 hypothetical protein FLJ14100 Home sapiens cDNA clone IMAGE 4798730 ATPase H transporting lysosomal VO subunit a1 chromosome 20 open reading frame 77 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1 collagen type XVII alpha 1 heparan sulfate 6 O sulfotransferase 3 keratin epidermolysis bullosa simplex Dowling Meara KobnerWeber Cockayne 0 35 196 supplementary Material amp Methods promoter analyses A set of 52 genes upregulated during keratinocyte differentiation was selected from the literature A2MLT ABCA12 ASAHS ASPRVT Saspase CASP74 CASR CDSN CLDN6 CRNN CSTA CTSC CTSL2 DLX3 DMKN beta gamma isoforms DSG1 EVPL FABPS FLG FLG2 GRHL3 GSDM1 HRNR IVL KDAP KLF4 KLK5 KLK7 KPRP KRT1 KRT10 KRT2 LASSS LCE1C LIPK LIPM LIPN LOR POU2F3 RPTN SBSN SCEL SERPINBS SLPI SPINKS SPRR2G SPRR4 TGMT TGM3 TGMS THHL1 TJPT TLR9 Promoter sequences of these genes for human and at least two other vertebrate species mouse rat dog cow horse occasionally armadillo or opossum depending on sequence availability and conservation level were retrieved 2300 bp upstream to 500 bp downstream from the transcription start site using
79. d p t et la consultation de ce type de s quences en marge des s quences de type Sanger Trace Archive A titre d illustration lors de la cr ation de cette section l EMBL Bank a re u en trois mois un volume de s quences correspondant 1 8 me des donn es g n r es en 28 ann es d activit Ainsi l architecture de ces banques a d tre adapt e pour permettre le stockage des donn es de s quencage haut d bit Concernant les donn es d expression issues de puces ADN trois banques coexistent le Gene Expression Omnibus GEO du NCBI ttp www ncbi nim nih gov geo ArrayExpress de l EMBL EBI http www ebi ac uk microarray as ae et le Center for Information Biology gene EXpression database CIBEX de la DDBJ http cibex nig ac jp toutes trois imposant le respect du standard MIAME Minimum Information About Microarray Experiment cr par la MGED Society une organisation fond e en 1999 et regroupant des biologistes bioinformaticiens et bioanalystes dans le but de faciliter le partage l interpr tation et la reproduction de donn es issues de m thodes haut d bit Le standard MIAME impose notamment de sp cifier le maximum d informations sur la totalit du protocole l chantillon nom date organisme tissus cellules stade d veloppemental statut physiologique g notype l extraction nom date ARN totaux purifi s m thode volume concentration le marquage nom date fluorochrome m thod
80. decarboxylase antizyme gene family 40 This would thus constitute a further exam ple of a partial loss of gene function during hominoid evolu tion The systematic comparison of the human and chimpanzee genomes has revealed nine other human specific frameshift mutations pseudogenization leading to the mRNA decay or carboxy terminal protein truncation 41 Gene losses that occurred after human chimpanzee divergence could play a role in adaptive evolution as shown for caspase 12 inactivation during hominization 42 In this framework it is intriguing that a member of the hair keratin gene complex KRTHAP1 and a serine protease inhibitor gene SERPINA13 are also among the few genes specifically inactivated in human by a mutation 43 44 In addition we sequenced ORESTES for CTAGES5 and CNOT6L functional retrogenes which are specific for primate and hominoid lineages respectively Moreover the CTAGE5 retrogene is included in a larger human specific insertion data not shown It is indeed known that new genes have emerged after a burst of retroposition in primates 45 Not surprisingly this suggests that modifications of genes expressed in the skin participate in obvious differences between human and chimpanzee Real time PCR experiments Real time PCR experiments were used to measure the relative expression ratio of selected genes in the T4 mainly GKs and T1 basal layer fractions In initial experiments using the SCCE KLK7
81. en plus de lexpression des prot ines desmosomales un ou plusieurs modules de r gulation transcriptionnelle comme sugg r par nos r sultats ANKRD1 et HOPX sont ainsi r gul s par des membres des familles GATA et ZFPM dans les cardiomyocytes Seule une analyse grande chelle et sur de multiples tissus des sites r ellement fix s par chaque facteur de transcription est susceptible d aboutir une description suffisante pour pouvoir v ritablement comparer entre eux plusieurs programmes de diff renciation et valuer leur degr de recyclage Si un tel projet est actuellement en cours chez certains organismes mod les C elegans et D melanogaster dans le cadre du projet modENCODE http www modencode org la t che sera extr mement longue et co teuse dans le cas d un g nome aussi complexe que celui des mammif res puisqu elle n cessiterait de d velopper et ou de valider des anticorps dirig s contre chaque facteur de transcription puis de r aliser du ChIP on chip ou du ChIP seq pour chaque tissu stade d veloppemental etc 230 Conclusion D une fa on g n rale les techniques discut es pr c demment n ont pas les m mes sensibilit s et sp cificit s Ceci explique que leur emploi sur un m me type cellulaire loin d tre redondant conduit plut t a des r sultats compl mentaires Ainsi si l on compare la contribution de chacune des techniques dans l identification des 49 nouveaux marqueurs de l
82. encompasses exons 3 14 b Sequence alignment of the eighth exon of the C orf8 gene from mammals The sequences were retrieved from the multiz 7way table of the UCSC Genome Browser 73 and from a BLAST search of the cat genome The consensus splicing signals are boxed The black arrow indicates the single nucleotide insertion in the human gene The alignment was created with Multalin software 71 Asterisks indicate the positions conserved in all the sequences The colors correspond to various levels of consensus with red for high consensus and grey for low consensus responsible for Netherton syndrome OMIM 256500 char acterized by ichthyosiform erythroderma bamboo hair and atopic dermatitis In this framework we identified three pro tease inhibitors potentially involved in desquamation In addition to the serine protease inhibitor SERPINA12 dis cussed above we identified two other members of the serpin superfamily SERPINB7 and SERPINB12 whose expression in the epidermis is reported here for the first time Moreover our real time PCR experiments clearly show that these two protease inhibitors as well as SERPINA12 are overex pressed in the uppermost epidermal layers SERPINB7 also known as Megsin is deposited in the extracellular matrix by kidney mesangial cells 48 but its targets have not been identified to date SERPINB12 is expressed in many tissues and displays inhibitor activity against trypsin like serine pro
83. es de puces dites pang nomiques c est dire contenant au minimum une sonde pour chacun des g nes connus ou suppos s EST ARNm pr dictions bioinformatiques d une esp ce Toutefois le terme pang nomique peut sembler abusif sur la plupart des puces de ce type le nombre de sonde par g ne est g n ralement limit 1 4 sondes maximum Ainsi ces puces ne livreront pas d information sur d ventuels nouveaux g nes pour lesquels il n y aurait pas de sonde ou encore sur la complexit de certaines unit s de transcription poss dant plusieurs sites d initiation de la transcription variants d pissage exons terminaux alternatifs etc Le d veloppement des ADN puces a tres haute densit par synth se in situ permet de pallier Sondes partiellement en partie l inconv nient des chevauchantes mens variants avec jusqu plusieurs dizaines de sondes par exon 5 5 millions de sondes au total pour le GeneChip Exon Array Sondes non chevauchantes d Affymetrix permettant ainsi Res nee de Ga une cartographie tr s fine des zones transcrites du g nome Pour un nombre limit d esp ces de mammif res humain souris rat l identification de nouvelles r gions transcrites est possible en employant des tiling arrays figure 5 couvrant tout le g nome et permettant de s affranchir de l annotation du g nome et donc d identifier de nouveaux g nes transcrits antisens etc Les tiling arra
84. est rapidement devenu un moyen ais de consulter les r sultats de fa on cibl e famille de g nes r gion g nomique s quence particuli re et a t mis disposition de la communaut http genome ucsc edu cgi bin hgTracks org human amp hgt custom Text http udear cnrs free fr orestes txt Par la suite 22 000 clones suppl mentaires ont t produits et s quenc s grande chelle gr ce un financement en r ponse a un appel d offre du G noscope d Evry Le volume des donn es imposant une analyse informatique une collaboration avec le Centre de Biolnformatique de Bordeaux CBiB a permis de r aliser assemblage des s quences contigs ainsi qu une premi re annotation et une conversion des s quences en coordonn es g nomiques pour l int gration au Genome Browser 205 Afin de r duire le nombre de clones correspondant a des ARN ribosomiques deux cycles successifs de purification des ARN totaux sur billes magn tiques coupl es a des amorces oligo dT ont t effectu s La proportion finale de s quences correspondant a des ARNr est de 8 contre 7 8 pour les donn es produites par le consortium br silien a l origine de la m thode Camargo et al 2001 Les ARN d origine mitochondriale repr sentaient quant eux pr s de 10 du total Au total les 24200 s quences produites ont permis d identifier apr s limination des s quences contaminantes ADN g nomique ARN ribosomique vecteur 3387
85. et l autre 1h apr s la blessure Cole et al 2001 Le transcriptome de ces chantillons de peau est compar a celui de peau non bless e du m me individu a l aide de filtres de nylon contenant des sondes pour 4400 g nes Au bout de 30 min 124 g nes sont surexprim s au niveau de la blessure et aucun n est sous exprim Il s agit notamment d activateurs de transcription BCL3 TCF3 RFXAP MLL et de genes impliqu s dans la signalisation et l inflammation SOCS 1 codant pour une prot ine capable d inhiber les voies de signalisation de plusieurs cytokines MS 1 codant pour une prot ine s cr t e pro inflammatoire Apr s 1h 46 g nes sont surexprim s et 264 sont sous exprim s L ensemble de ces r sultats sugg re que la premi re phase de r ponse a une blessure est caract ris e uniquement par lactivation transcriptionnelle de certains g nes alors qu apr s 1h une importante proportion de ces g nes est r prim e On peut toutefois reprocher cette tude la trop petite proportion de g nes tudi s 4000 probablement assez peu repr sentatifs du transcriptome ainsi que les pr l vements utilis s compos s de nombreux types cellulaires qui pourraient se trouver en proportions variables dans les diff rents pr l vements Dans le but de d finir les g nes impliqu s dans la cicatrisation ind pendamment de l inflammation induite par la blessure des souris dont le g ne PU 1 spi1 a t inactiv
86. files The following additional data are available with the online version of this paper Additional data file 1 is a screen copy of the ORESTES custom track of the human UCSC Genome Browser that shows the genomic localization of the newly described Ciorf81 gene with the corresponding ORESTES chr1 199 164 695 199 202 419 hgi8 March 2006 Addi tional data file 2 is a table of genes with 100 or less UniGene ESTs expressed in various tissues but for which epidermal expression had never been assessed Additional data file 3 is a colored text file containing the alignment of human and rhe sus genomic sequences showing the location of the insertion point and tandem site duplication for the hominoid specific CNOT6L processed retrogene Additional data file 4 is the alignment of protein sequences of the ten mouse lipases including Lipde1 5 The alignment was generated with Multa lin software 71 the amino acids of the catalytic triad are boxed Additional data file 5 is a table providing gene nomen clature and IDs for five new mouse lipase genes Acknowledgements Our special thanks go to M T Ribouchon for excellent technical assistance We are grateful to H Brun and C Offer from the Service Commun de S quen age IFR30 for sequencing the clones EL593304 to EL595248 We thank D Bobermien for her contribution to the production of minilibraries and M Fraisse for histochemistry This work was supported in part by grants from the Centre Natio
87. for localized autosomal recessive hypotrichosis LAH OMIM 607903 Klue et al 2003 LAH ts allele with the lanceolate hair lah mouse Which fails to grow any normal hair and completely lacks vibrissae Finally the inactivation of genes encoding other desmosomal cadherins also leads to hair follicle abnormalities Mice deficient for Dsg3 or Dse3 normally detected in the outer root sheath of the hair follicle suffer from acantholysis between the two cell layers surrounding the telogen hair club leading to telogen hair loss Koch et al 1998 Chen et al 2008 Absence of Dscl in the IRS of hair follicles from Dse mice induces localized hair loss associated with formation of utricali and dermal cysts denoting hair follicle degeneration Chidgey et al 2001 Altogether these data emphasize the importance of desmosomes and corncodesmosomes in hair follicle integrity In our different models the hyperproliferative and inflammatory environment could aggravate the hair follicle phenotype A mouse model with specific inactivation of Cdsn in the IRS would be useful for an in depth study of the consequences of Casn deletion on hair follicle integrity Materials and Methods Mice tamoxifen treatment and skin grafting Animals were handled according to the instituonal guidelines and policies The Casa mutant mouse line was established at the MCVICS Mouse Clinical Institute Institu Clinique de la Souris Mkirch France hitp www mnetu st
88. frame 47 Hypothetical protein LOC283 143 Hypothetical LOC388727 Flj44317 Flj3 1 184 Hypothetical protein LOC125893 Zinc finger protein 311 Image 5 300 1 99 Zinc finger protein 600 Minichromosome maintenance deficient domain containing Hypothetical protein FLJI 3646 Chromosome 14 open reading frame 121 Family with sequence similarity 83 member F Abhydrolase domain containing 9 Hypothetical protein LOC 134466 Chromosome X open reading frame 33 Genome Biology 2007 8 R107 152 hetp genomebiology com 2007 8 6 R 107 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et a R107 1 1 Table 6 Continued Unknown genes with 100 or less UniGene ESTs 2 FU25006 52 Hypothetical protein FLJ25006 2 DKFZp434N062 53 Hypothetical protein dkfzp434n062 9 LASS3 53 LAGI longevity assurance homolog 3 CI 4orf2 54 Chromosome 4 open reading frame 21 CI 7orf 7 56 Chromosome 17 open reading frame 67 FAM62C 58 Family with sequence similarity 62 member C 2 CI 4orf29 60 Chromosome 14 open reading frame 29 FU21736 6l Esterase 3 3 LOC3491 14 6l Hypothetical protein LOC3491 14 MGC26885 62 Hypothetical protein MGC26885 SMA3 62 Sma3 8 FAM46B 62 Family with sequence similarity 46 member B ELMODI 62 ELMO CED 12 domain containing 3 DENND2C 63 DENN MADD domain containing 2C ANKRD35 64 Ankyrin repeat domain 35 5 LOC401 553 66 Hypothetical gene supported by BC019073 LOC390927 67 Similar to zinc finger pro
89. furthermore contain the consensus pattern of the active domain 53 suggesting that they are bona fide lipase genes Figure 5b Additional data file 4 The LIPK LIPM and LIPN genes are strongly specific for the epidermis Figure 4 and real time RT PCR experiments revealed a highly specific expression in GKs with T4 T1 ratios gt 100 Phylogenetic studies showed that the LIPJ LIPK LIPM and LIPN proteins are very close to well characterized members of the family LIPA and LIPF both also encoded in the 10q23 31 locus LIPA is a ubiquitous lysosomal cholesterol ester hydrolase EC 3 1 1 13 54 55 while LIPF is a secreted triglyceride lipase EC 3 1 1 3 56 Interestingly both LIPA and LIPF have a low pH optimum in agreement with the acidic pH of the extracellular space in the stratum corneum 57 58 The extracellular hydrolysis of triglycerides in free fatty acids and glycerol is essential to stratum corneum hydration 59 Furthermore long chain free fatty acids represent 16 of extracellular lipids cholesterol esters 15 and free choles terol 32 60 Triglyceride lipase enzymatic activity has been detected in the intercellular space of the human stratum corneum 61 and little is known regarding the metabolism and extracellular modifications of cholesterol esters The LIPK LIPM and LIPN proteins are most probably secreted and could thus participate in the establishment of the barrier function by catalyzing the maturation o
90. g nes Compar aux 25000 g nes du g nome humain ce chiffre peut sembler important surtout pour un tissu majoritairement compos de cellules sp cialis es et engag es dans un processus de mort cellulaire programm e Il reste dans le m me ordre de grandeur gt 10000 que plusieurs autres tudes men es l aide de puces pang nomiques sur divers tissus ou cellules pour exemple Akavia et al 2008 Kobayashi et al 2008 Toutefois il est galement possible que la technique des puces ADN conduise une sur valuation du nombre de g nes exprim s L tude d April amp Barsh a galement permis de distinguer des g nes sp cifiques de la couche basale 2097 ou des couches suprabasales 883 sur les 16715 g nes d tect s au total Comme pour notre tude la majorit des g nes ne 231 semblent donc pas r gul s Les diff rentes approches que nous avons employ es ont permis d identifier au total 82 nouveaux g nes associ s la diff renciation Toulza et al 2007 Mattiuzzo et al 2009 Si l on se base sur la premi re analyse des puces pang nomiques 624 g nes avec R gt 1 5 et p lt 0 05 et que l on extrapole aux 1450 ORESTEs non d tect s sur puces on atteint un chiffre de 695 g nes environ assez proche des 883 g nes de l tude d April amp Barsh Toutefois en tenant compte des r sultats de PCR quantitative 27 g nes confirm s sur 64 choisis partir de puces cette estimation ch te 293
91. g nes sont respectivement mut s dans l ichtyose lamellaire de type III Lefevre et al 2006 et le syndrome de Sjogren Larsson De Laurenzi et al 1996 Toutes ces donn es sugg rent que le produit final de cette voie m tabolique probablement la 20 COOH TXA3 est requis pour la fonction barri re de l piderme L ichthyin une prot ine a plusieurs domaines transmembranaires cod e par le g ne NIPAL4 pourrait tre le r cepteur du 20 COOH TXA3 ce g ne tant notamment mut dans un sous type d ichtyose cong nitale autosomique r cessive ARCII OMIM 612281 Lefevre et al 2004 Les prot ines responsables de la transduction du signal de l ichthyin potentiellement des prot ines G restent encore a identifier 2 2 3 2 Facteurs de transcription 2 2 3 2 L Facteurs ubiquistes Pendant de nombreuses ann es les tudes men es sur la r gulation de l expression des g nes de la diff renciation pidermique n ont pas conduit l identification de facteurs sp cifiques et ont conduit imaginer un mod le g n ral o l expression diff rentielle de facteurs ubiquistes suffirait expliquer toute la r gulation de la diff renciation pidermique De nombreuses tudes dont quelques r sultats sont cit s titre d exemple dans la table 2 ont mis en vidence l implication de plusieurs familles telles que AP 1 AP 2 Sp1 Sp3 CREB 1 etc ainsi que d autres facteurs d expression plus restreinte tels que les facteu
92. genes encoding desmosomal proteins Dse Dse a and Dse b expression analyzed in dorsal skin biopsies from KO neonates Values are shown relative to RNA level in the WT after normalization with Dsg3 transcripts to take the epidermal area of each sample into account Values are mean s c m C lmmunohistochemical labeling of dorsal skin sections from WT and KO neonates using antibodies specific to keratin 10 K10 involucrin Ivl filagerin Fil loricrin Lor and desmoglein Dsg l shows a similar expression level and localization of the differentiation markers in WT and KO pups D dermis E epidermis dotted line dermoepidermal junction Scale bar 20 um Fig 7D Concomitantly immunohistochemistry revealed high expression levels of keratin K6 and increased expression of several epidermal differentiation markers such as involucrin filaggrin loricrin and K10 Fig 7C E left panel and data not shown From 8 weeks after grafting despite its hyperproliferative state the epidermis started to disappear in some central areas replaced by a scab directly covering the dermis Fig 7B By 9 weeks post grafting this phenomenon had amplified ending with the total absence of the grafted epidermis In parallel hair follicles became scarce and then totally disappeared Concomitantly the epidermis of the nude mice located at the edge of the initial graft became thicker producing keratinocytes that seemed to migrate to the grafted zone I
93. human epidermis Other studies were carried out using macroarrays or microarrays with different in vitro models proliferating or differentiating keratinocytes and reconstructed epidermis and total skin Interpretation of these results is often made difficult by the presence of diverse cell types or differentiation states in the sample or by the use of in vitro models which do not fully recapitulate the complexity of the cellular environment Analyses of purified samples from ex vivo material are thus expected to provide more relevant and functional results Radoja and colleagues used microarrays that targeted 10 000 genes to compare the transcriptomes of total epidermis and of two cell fractions purified by integrin beta 4 expression levels i e basal vs suprabasal cells These authors reported a large number of regulated genes but GKs were largely absent from the suprabasal fraction due to the purification process By cDNA sequencing our laboratory has previously identified 3 387 genes expressed in GKs purified from normal human skin by a trypsine based approach However the EST database alone gave no information about gene expression levels nor allowed a comparison with basal keratinocytes to identify genes potentially required for barrier function For this reason we combined EST database and results from microarrays experiments and in silico promoter analyses to select a large number of candidate genes in order to study their r
94. in B show hyperkeratosis and parakeratosis left and dermal cyst formation right E Higher magnifications of skin sections after immunostaining with K6 corresponding to areas boxed in C show hyperproliferative region left and edge of the KO graft right SC stratum corneum E epidermis Scale bars 100 um B C 50 um D E stage corresponding to a TEWL value of 33 g m per hour ulcerations appeared and were associated with the shedding of large scales histological analysis revealed almost complete disappearance of the epidermis replaced by a scab Fig 9 right panel At the early stages moderate inflammation was observed which we further characterized by immunohistochemistry for CD3 and F4 80 supplementary material Fig 1 It mainly consisted of CD3 T cells infiltrating the epidermis supplementary material Fig SIA and macrophages and Langerhans cells in the dermis at proximity of the epidermis supplementary material Fig 1B The increasing barrier defect led to a typical inflammatory response with ulceration dilation of capillaries and subcorneal abscesses with neutrophils see Fig 9B right panel Localized temporally controlled Cdsn excision in adult mouse skin also induced a notable morphological modification of the hair follicles At early stages they appeared to be distended and associated with hypertrophic sebaceous glands Fig 9B middle panel This was also the case when generalized Cdsn excision was
95. in the human genome this gene resides between the Lipl2 and Lipl3 genes Intriguingly we could not precisely identify a single orthologue of LIPJ Instead we found upstream of the Lipf gene a cluster of five predicted genes encoding secreted alpha beta hydrolases as well as at least three pseudogenes containing premature stop codons Figure 5a A syntenic cluster albeit of smaller size resides in the rat genome These five hypothetical functional mouse lipases form by them selves a separate group in the phylogenic tree Figure 5c Additional data file 4 Their genomic localization suggests that they could have arisen from a large expansion by tandem duplications well after the separation of the rodents from the primate ancestors or from a lipase gene lost in the human genome These five new genes have thus been renamed Lipdc1 5 for lipase domain containing1 5 in accordance with the Mouse Gene Nomenclature Committee MGNC Addi tional data file 5 The human LIPK LIPM and LIPN genes appear to be exclu sively expressed in the epidermis as shown by PCR on a panel of 16 cDNAs Figure 4 Their expression was highly specific for GKs with real time PCR T4 T1 ratios of 100 150 Table 7 LIPJ expression was also detected in the epidermis by PCR but was too weak to allow real time PCR experiments to be performed These results strongly suggest that the LIPK LIPM and LIPN genes play a highly specific role in the last Genome Biology 2007
96. ines la loricrine L granules d aspect arrondi et la profilaggrine F granules irr guliers et plus gros produites en grandes quantit s par ces cellules Les k ratinocytes granuleux constituent les derni res cellules vivantes de l piderme avant la cornification qui s accompagne de la destruction du noyau et de la disparition de toute activit transcriptionnelle Le nombre de k ratinosomes ou la densit du r seau tubulaire branch selon le mod le consid r augmente fortement au p le apical de la derni re assise et la s cr tion de leur contenu lipidique dans l espace extracellulaire l interface couche granuleuse couche corn e permet la formation de lamellae lipidiques cruciaux pour l imperm abilit de la couche corn e et donc la fonction barri re de l piderme 2 2 1 4 La couche corn e stratum corneum La couche corn e est form e d un empilement de 15 20 assises de k ratinocytes morts d aspect tr s aplati qui constituent le stade ultime de la diff rentiation k ratinocytaire prenant le nom de corn ocytes Le noyau et les organites principaux tant d grad s au cours de la cornification les corn ocytes ne 60 pr sentent pas d activit transcriptionnelle ou traductionnelle voire m tabolique Les corn ocytes sont particuli rement coh sifs dans les assises profondes de la couche corn e stratum compactum puis de moins en moins jointifs stratum disjunctum avant de se d
97. isb eu l autre europ en ELIXIR European Life Sciences Infrastructure for Biological Information lanc par P EMBL EBI http www elixir europe org visent collecter structurer et p renniser les donn es biologiques de toute nature et fournir des outils pour comparer et int grer ces donn es afin de mieux comprendre des processus complexes qui ne sont que tr s partiellement d crits par des tudes isol es Annexe Etude du r le de la corn odesmosine in vivo mod les murin Dans le cadre de l tude du r le de la corn odesmosine par inactivation du gene cdsn chez la souris j ai r alis des comparaisons des niveaux d expression de plusieurs g nes entre des peaux de souris sauvages ou KO par PCR quantitative Ce travail a fait l objet de la publication qui suit parue dans the Journal of Cell Science en 2009 246 JOURNAL OF CELL SCIENCE 122 2699 2709 2009 Corneodesmosin gene ablation induces lethal skin barrier disruption and hair follicle degeneration related to desmosome dysfunction Emilie Leclerc Anne Hucheng Nicolas R Mattiuzzo Daniel Metzger Pierre Chambon Norbert B Ghyselinck Guy Serre Nathalie Jonca and Marina Guerrin 247 R sum Afin d analyser le r le de la CDSN in vivo notre quipe a d velopp un mod le d inactivation somatique bas sur le syst me CreLox et ciblant le g ne Cdsn chez la souris soit tr s pr cocement pendant le d veloppement soit sp cif
98. k ratinocytes Pillai et al 1990 La perturbation de la barri re pidermique chez la souris par application topique d ac tone ou par d laminage au ruban adh sif entraine une disparition locale du gradient calcique pidermique lequel r apparait 6h plus tard parall lement a la restauration de la fonction de barri re et a la s cr tion de k ratinosomes Menon et al 1992 Quel que soit la m thode employ e pour la perturber une barri re fonctionnelle est syst matiquement requise pour le r tablissement d un gradient calcique certaines donn es sugg rant m me que le processus serait passif retour d un gradient 5h apr s d laminage au ruban adh sif et pose d une membrane de Goretex 4 C temp rature a laquelle la barri re ne se r tablit que tr s lentement Elias et al 2002a Si le gradient calcique est d pendant de la fonction barri re l inverse est aussi vrai si l on consid re que l expression de plusieurs marqueurs de la diff renciation est Calcium Regulation Caz of Differentiation PIP DG IP Differentiation Figure 50 Signalisation calcique m di e par le r cepteur membranaire au calcium extracellulaire Bikle et al 2005 96 d pendante de la concentration calcique comme d montr sur l piderme murin apr s divers traitements alt rant celle ci Elias et al 2002b De plus l activit de nombreuses prot ines impliqu es dans la diff renciation pidermique est
99. l absence de follicules pileux dans l piderme palmoplantaire n emp che pas le renouvellement du tissu ainsi que la pr sence de LRC dans la couche basale de l piderme interfolliculaire murin Braun et al 2003 A Figure 30 activit B galactosidase dans la peau de souris ShhCre R26R Levy et al 2005 Seuls les follicules pilo s bac s sont marqu s cellules bleues Les couches suprabasales sont marqu es en brun avec un anticorps anti k ratine 1 A fort grossissement B faible grossissement Ces m thodes fonctionnelles ont permis l identification d un petit nombre de marqueurs mol culaires Citons pour l homme une surexpression des k ratines 15 et 19 et de l int grine 61 importante pour le maintien l tat indiff renci Lyle et al 1998 de l int grine a6 associ e l absence du r cepteur de la transferrine CD71 Li et al 1998 ou encore de la forme longue du facteur de transcription p63 impliqu e dans le maintien des cellules souches Pellegrini et al 2001 pour revue Tiede et al 2007 De r centes tudes bas es sur le tri de cellules d piderme murin selon le marqueur CD34 sp cifique du bulge Trempus et al 2007 ou d piderme humain avec exclusion du marquage Hoechst 33342 Larderet et al 2006 et coupl es a l emploi de puces ADN ont permis d identifier de nouveaux g nes dont expression 64 est augment e ou diminu e dans les cell
100. les MMP CD8 et CD83 La principale limite de cette tude probablement li e a l tude directe de maladies complexes impliquant de nombreux types cellulaires est le tr s grand nombre de g nes identifi s comme d r gul s dans les tumeurs 582 g nes surexprim s dans les tumeurs et non r gul s dans le psoriasis 2520 g nes au total sont diff rentiellement r gul s dans les 2 pathologies Parmi les autres tudes grande chelle men es sur les carcinomes pidermoides on peut citer par exemple les travaux de Roepman et al qui ont cherch am liorer le diagnostic clinique en recherchant des marqueurs sp cifiques exprim s par les tumeurs primaires et susceptibles d indiquer la pr sence de m tastases non d tect es Roepman et al 2005 Des chantillons provenant de 82 patients atteints de tumeurs de la sph re ORL parmi lesquels 45 pr sentaient des m tastases ganglionnaires les autres n ayant pas d velopp de m tastases 3 ans apr s le traitement chirurgical ont t utilis s L analyse par puces pang nomiques a oligonucl otides Qiagen 21 329 g nes humains montre que 1986 g nes pr sentent une surexpression dans au moins 30 des 82 chantillons tumoraux Une classification des profils dexpression des tumeurs ayant form des m tastases ou non a permis la mise en vidence de 102 g nes pr dictifs de leur potentiel invasif Il est int ressant de noter que 2 3 d entre eux sont sous exprim s dans les tumeur
101. lie in the junction between living and cornified layers This emphasizes the importance of corneodesmosomes as cornification takes place However the timing of the barrier defect differs between the two models E18 5 for Spink5 mice but only after birth for our somatic Cds mouse model It is tempting to suggest that in the Spink5 model the biochemical defect absence of protease inhibitor induces a dysfunction of the corneodesmosomes in utero as soon as cornification occurs By contrast the absence of CDSN leads to a mechanical deficiency and thus the barrier impairment only takes place in the environment experienced after birth Grafting experiments demonstrated that the barrier defect extended postnatally Skin from Cdsn deficient grafts first developed acanthosis and hyperkeratosis Increased expression of various 256 D O z Q O ep Q O O differentiation markers involucrin K10 and induced expression of K6 confirmed the altered differentiation and the hyperproliferative state of the grafted epidermis Hyperproliferation and acanthosis are thought to be compensatory responses to impaired epidermal barrier Proksch et al 1991 In the case of our Cdsn deficient graft these compensatory mechanisms appeared to be ineffective and were followed by a complete disappearance of the epidermis This demonstrates that CDSN is necessary for maintaining the integrity and barrier function of the postnatal ep
102. logen se imparfaite et des malformations des os du cr ne mais aucune anomalie au niveau de l piderme Cette observation sugg re une redondance bien qu aucun autre facteur DLX n ait t d crit dans l piderme ou A plus probablement une compensation par d autres facteurs exprim s dans les a LU k ratinocytes diff renci s de l piderme a J A ee ps w interfolliculaire em ees SEE ie ie kes 2 y brut aP 7 e oa Ve TE gt ee i 12000 KLF We a d 3 4 KLF4 est le premier facteur de transcription a avoir t identifi comme sp cifiquement requis pour les tapes tardives de la diff rentiation et jouant un role essentiel dans la mise en place de la fonction barri re Initialement identifi au niveau du colon Shields et al 1996 d o son appellation de gut enriched Kr ppel like factor GKLF il est galement fortement d tect dans les noyaux des k ratinocytes suprabasaux de l piderme figure 55A Son inactivation par KO chez des souris conduit une mort rapide Figure 55 Inactivation de KIf4 dans l piderme murin Segre et al 1999 A Immunod tection de KIf4 dans l piderme de souris sauvages B Coupes d piderme et pr parations d enveloppes corn es de souris sauvages ou klf4 C D fauts dans la formation des lamellae lipidiques 106 dans les heures suivant la naissance la fonction barri re de l piderme tant fortement a
103. low magnification the cells at the junction between the granular and cornified layers have no obvious abnormality G G1 G2 granular Keratinocytes C1 to C9 corneocytes with C1 being adjacent to the granular layer and C9 being nearest the skin surface C H The ultrastructure of desmosomes and comeodesmosomes from WT C E and KO F H epidermis analyzed at higher magnification Regular desmosomes in the stratum granulosum C F transitional desmosomes at the stratum granulosum to stratum corneum interface DG and corneodesmosomes white arrows in the stratum corneum E H show the same classical morphology in WT and KO epidermis LJ Detachment between granular keratinocyte and corneocyte is frequently observed in KO epidermis Split desmosomes tsolated 1 or adjacent J can be seen The mid dense intercellular plugs of the detached transitional desmosomes remain associated with the granular keratinocyte black arrowhead whereas an interruption in the electron dense line corresponding to the cornified envelope is clearly visible at the surface of the corneocyte at the site where the desmosome was attached white arrowhead Scale bars 2 tum A B 0 2 um C D desmosomal proteins as long as the integrity of the epidermis is preserved Long term phenotype of mouse skin lacking CDSN after grafting onto nude mice The drastic barrier defect that occurs in KO mice does not allow the long term consequences of Cdsn excision to be anal
104. number of upregulated genes 589 exceeded the 2 fold threshold red lines when compared to downregulated genes 88 b SAM plotsheet With a 2 fold ratio threshold and a delta value of 1 462 567 genes were considered to be significantly up or downregulated red and green dots respectively Only genes 203 upregulated and 3 downregulated with a local FDR lower than 0 05 were retained for further analysis mean GK BK ratio observed score log10 average intensity expected score 193 Table 1 Differentially expressed genes listed according to Significance Analysis of Microarrays SAM Known markers of suprabasal and basal layers of epidermis are written in red and green respectively Gene Name PCDH12 APOLS CDSN SPDYA BC039551 LCEZE BMP 1 FGFR10P2 AK090694 LO 34 7509 AK095117 KRTDAP SCEL CALMLS SLCSI AG ARL 11 TMEM45A HSUTI275 KLK7 IQUE SPRR2IC BAGE LOC259783 protocadherin 12 apolipoprotein L 5 cornmeodesmosin speedy homolog A Drosophila Homo sapiens clone IMAGE 5762932 mRNA late cornified envelope 2B bone morphogenetic protein 1 FisFR1 oncogene partner 2 Homo sapiens cCONA FLJ33375 similar to ribosomal protein L7 like 1 Homo sapiens cDNA FLJ37798 keratinocyte differentiation associated protein sciellin calmodulin like 5 solute carrier family 39 zinc transporter member 6 ADP ribosylation factor like 11 transmembrane protein 454
105. of CDSN in mouse skin leads to a drastic barrier defect To measure the effects of the mutation on skin permeability we performed a Toluidine blue penetration assay on E18 5 embryos Fig 3A When the assessment was carried out immediately after caesarian delivery before any skin phenotype onset complete dye exclusion was observed in KO pups as in their control littermates reflecting an intact barrier at that stage Fig 3A left panels However when mice were given to a surrogate mother for hour large areas showed toluidine blue penetration particularly in the ventral part of the embryos Fig 3A right panels Thus as soon as a skin phenotype became macroscopically visible in KO animals the dye extensively penetrated the skin This drastic perturbation of the barrier could be perfectly superimposed with the zones of detachment of the stratum corneum in KO animals see Fig 2C Similarly transepidermal water loss TEWL measured on whole pups was similar at first in WT HET and KO pups immediately after caesarian delivery but dramatically increased by a factor greater than ten in KO mice after phenotype onset Fig 3B To maintain conditions of minimal mechanical stress KO neonates were isolated at 37 C for 4 hours immediately after caesarian section Under these Corneodesmosomal defects in Cas mice 2701 A Natural birth HET E18 5 th Fig 2 Mice lacking CDSN show a drastic skin tear leading to p
106. of skin rupture such as the ventral region a complete absence of the stratum comeum was observed Fig 4A In some areas the skin abrasion was more pronounced and also concerned part of the living layers data not shown On the dorsal skin the 251 D 2 O gn pe O w O 5 2702 Journal of Cell Science 122 15 A E18 5 E18 5 1h E18 5 1h EEEN EE Fig 3 Mice lacking CDSN exhibit a drastic barrier defect and decreased mechanical resistance of the skin A Barrier dlependent dye exclusion assay Toluidine blue performed on WT HET and KO neonates Pups obtained by caesarian delivery E18 5 were placed with surrogate mother for hour until the skin phenotype appears E18 5 1h B TEWL assay performed on whole WT HET or KO neonates immediately alter caesarian delivery E18 5 and after phenotype onset E18 5 1h C Mechanical resistance assay of the stratum corneum from neonates Tape stripping was performed on the dorsal skin of WT HET or KO neonates before phenotype onset and the proteins present on the tape were quantified by colorimetric assay Values are mean SEM stratum comeum was still present and looked similar to that of the WT However even if the macroscopic aspect was normal some blisters were observed between the stratum granulosum and stratum corneum data not shown Although we could not discriminate between blisters induced by natural mechanical stress or during sample pr
107. otides non marqu s permettent l amplification locale Cluster d une mol cule d ADN jusqu 1000 copies par cluster et 80 100 millions de clusters par support L tape de s quen age consiste employer des amorces compl mentaires d un des adaptateurs et ajouter simultan ment quatre terminateurs r versibles marqu s des fluorochromes diff rents Ainsi apr s lavage la base ajout e est identifi e en fonction de sa longueur d onde d mission puis le blocage est revers et un nouveau cycle permet de d terminer la base suivante etc La r action bien qu automatis e s av re toutefois lente 2 jours pour d terminer des s quences de 35 pb soit jusqu 3 5 Gigabases s quenc es les versions les plus r centes permettant de g n rer jusqu 120 millions de s quences d une longueur de 75 pb voire 2 x 75 pb gr ce a la technique de Paired End diTag initialement d velopp e pour l immunopr cipitation de chromatine ChIP PET cette technique consiste ne garder que les extr mit s des fragments d ADN les rabouter par ligation et les s quencer ensemble afin d avoir les bornes des fragments pour un temps de r action pouvant atteindre 8 jours pour 15 Gigabases 239 1 PREPARE GENOMIC DNA SAMPLE 2 ATTACH DNA TO SURFACE BRIDGE AMPLIFICATION randomly to Add unlabeled nudeotides and enzyme to Bind single stranded fragments and li
108. ou psoriasique et il a r cemment t montr qu elles favorisent la production de nombreuses cytokines proinflammatoires dont le TNFa et sont induites en retour la boucle favorisant le maintien de l inflammation et une augmentation de la prolif ration k ratinocytaire Nukui et al 2008 Enfin malgr l effet pro apoptotique du TNFa dans certains contextes aucune diff rence significative dans l expression de g nes pro ou anti apoptotiques n est relev e IL est important de noter que plusieurs des marqueurs de la diff renciation LOR FLG KRT2 ne sont pas d tect s par cette tude dans les k ratinocytes diff renci s in vitro non trait s sugg rant un probl me de diff renciation tr s incompl te en accord avec la morphologie des cultures obtenues plut t qu un probl me d exhaustivit 3 1 3 Transcriptome et carcinogen se La m me quipe a galement cherch mettre en vidence par la technique du SAGE des g nes sp cifiquement surexprim s dans des l sions pidermiques pr canc reuses k ratose actinique par rapport la peau non l sionnelle du m me individu van Ruissen et al 2002a Parmi les 12000 g nes identifi s un ensemble de genes sp cifiques de l piderme pr canc reux donc de potentiels marqueurs mol culaires de la canc rogen se a t mis en vidence dont POLQ codant pour l ADN polym rase 6 S100A7 S100A8 et S100A9 CSTA cystatine A SFN stratifine ou encore TRAF5 co
109. pr sentant un pouvoir invasif Haider et al 2006 Des puces Affymetrix U95 contenant des sondes pour environ 12000 g nes ont t utilis es pour comparer chaque chantillon pathologique 8 carcinomes et 8 l sions psoriasiques de la peau saine provenant du m me individu Dans un premier temps 1048 g nes ont t identifi s comme tant surexprim s et 870 sous exprim s dans les carcinomes par rapport la peau saine Pour faire la part des g nes d r gul s dans le cadre de l hyperprolif ration b nigne et celle des g nes r ellement impliqu s dans la canc rogen se cette liste a t confront e celle des g nes surexprim s dans les l sions psoriasiques par rapport la peau non l sionnelle Parmi les g nes sp cifiquement surexprim s dans les 126 carcinomes et pas dans le psoriasis plusieurs membres de la famille des m talloprot ases MMP1 10 13 sont pr sents ainsi que des g nes impliqu s dans la prolif ration mais aussi la KLK7 SCCE la cathepsine L2 le facteur de transcription STAT3 des r cepteurs de la voie de signalisation WNT Au contraire les facteurs JUNB JUND et FOS ainsi que les marqueurs membranaires CD8 lymphocytes T et CD83 cellules dendritiques sont moins fortement exprim s dans les SCC que dans la peau normale ou le psoriasis respectivement Pour une partie de ces g nes les r sultats ont t confirm s par PCR quantitative en temps r el et en immunohistochimie pour
110. primer used for the reverse transcription or a single alternative arbitrary chosen primer The hybridization step of the first PCR cycle was set at 37 C while the 35 remaining cycles were performed in standard conditions with a hybridization temperature com plying with the length of the primer typically 55 C After gel electrophoresis products with predominant bands reflecting the amplification of highly abundant sequences were not fur ther processed Smear like reaction products were gel puri fied with a 500 bp cut off Mini libraries were then produced by T A cloning of the purified PCR fragments TOPO TA cloning kit Invitrogen Plasmid purification and sequencing Sequencing was performed by standard procedures ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing kit Applera Nor walk CI USA after either plasmid purification Wizard min iprep kit Promega or rolling circle amplification of the plasmids Sequence analysis An automated protocol for the sequence analysis was used to verify sequence quality Sequences were then analyzed using a stepwise approach Starting with RepeatMasker 67 Genome Biology 2007 8 R107 162 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 ORESTES were clustered with the PHRAP algorithm 68 Consensus sequences or singletons were annotated using BLAST searches against human databases best hit among successively RefSeq Uniprot and EST_Human databases 69 Sequences were also aligned on the huma
111. promoter analyses Figure 52 Example of promoter analysis for DMAN G y orthologs using Genomatix tools Table S2 Sequences of primers used for qRT PCR essays 190 Supplementary Results and Material amp Methods Microarrays Pangenomic oligonucleotide microarrays were used for global transcriptional profiling Differentially labeled cDNAs prepared from GKs and BKs from six individuals were cohybridized onto microarrays Data processing revealed that 11 520 spots corresponding to 10 824 different genes were significantly detected For statistical analysis of differentially expressed genes local False Discovery Rate FDR using the Significance Analysis of Microarrays SAM method was considered rather than p values With a delta value of 1 462 and a two fold ratio threshold 567 genes appeared to be up or downregulated in the GK fraction Figure S1 By further imposing a local FDR below 0 05 this number was restricted to 206 genes Table S1 with 203 upregulated and 3 downregulated Among the 203 upregulated genes 23 were known players of epidermal differentiation while the others were not previously Known to be expressed in the human epidermis Bioanalyzer experiments as well as cDNA labeling microarray hybridizations and scanning were performed at the Biochips platform of the Genopole Toulouse Midi Pyrenees Genotoul in Toulouse France http biopuce insa toulouse fr sommaire php All microarrays data are MIAME comp
112. psoriasis Cell 83 957 968 Carter N P 2007 Methods and strategies for analyzing copy number variation using DNA microarrays Nat Genet 39 S16 21 Cartharius K Frech K Grote K Klocke B Haltmeier M Klingenhoff A Frisch M Bayerlein M and Werner T 2005 MatInspector and beyond promoter analysis based on transcription factor binding sites Bioinformatics 21 2933 2942 Cassidy A J van Steensel M A Steijlen P M van Geel M van der Velden J Morley S M Terrinoni A Melino G Candi E and McLean W H 2005 A homozygous missense mutation in TGM5 abolishes epidermal transglutaminase 5 activity and causes acral peeling skin syndrome Am J Hum Genet 77 909 917 Caubet C Jonca N Brattsand M Guerrin M Bernard D Schmidt R Egelrud T Simon M and Serre G 2004 Degradation of corneodesmosome proteins by two serine proteases of the kallikrein family SCTE KLK5 hK5 and SCCE KLK7 hK7 J Invest Dermatol 122 1235 1244 266 Caux F Selma Z B Laroche L Prud homme J F and Fischer J 2004 CGI 58 ABHDS5 gene is mutated in Dorfman Chanarin syndrome Am J Med Genet A 129A 214 Chalabi N Satih S Delort L Bignon Y J and Bernard Gallon D J 2007 Expression profiling by whole genome microarray hybridization reveals differential gene expression in breast cancer cell lines after lycopene exposure Biochim Biophys Acta 1769 124 130 Chalmel F Rolland A D Niederhaus
113. purification rRNA sequences still represent approximately 8 of the dataset b Histogram showing the number of ORESTES at each level of redundancy The vast majority of genes are represented by less than five ORESTES illustrating the normalization capability of that method However a small number of genes are represented by a large number of ORESTES up to 402 retrotransposition of the cutaneous T cell lymphoma associated antigen 5 CTAGE5 and CCR4 NOT transcrip tion complex subunit 6 like CNOT6L These genes can be considered as intact that is they show no disablements such as premature stop codons or frameshift mutations when com pared to the ORF of their parental genes Of note the CNOTOL retrogene is specific for hominoids Additional data file 3 while the CTAGES retrogene is specific for primates data not shown Moreover six unspliced ORESTES correspond to a part of intron 8 of the PPP2R5A gene and include the small nucleo lar RNA snoRNA U98b sequence The snoRNAs are non protein coding RNAs that guide the 2 O ribose methylation C D box snoRNAs or the pseudouridylation H ACA box snoRNAs of ribosomal RNAs and are generally processed from introns of RNA polymerase II transcripts 24 Interest ingly the U98b snoRNA is a primate specific retroposon of the ACA16 snoRNA hosted by the PNAS 123 gene 25 We thus suggest that the ORESTES from the PPP2R5A gene cor respond to a precursor form of the U98b sno
114. s en biologie sont la distance euclidienne distance physique dans un espace n dimensions n tant le nombre d chantillons ou de g nes et les coordonn es tant les mesures d expression elles m mes ou la distance de corr lation de Pearson tandis que les r gles d agglom ration courantes sont le lien moyen average linkage distance moyenne entre les points des deux groupes le 34 lien complet complete linkage distance entre les points les plus loign s ou le lien simple single linkage distance entre les points les plus proches Un des premiers logiciels d velopp sp cifiquement pour les donn es biologies est le programme Cluster Eisen et al 1998 encore couramment employ ainsi que Youtils Treeview pour construire la repr sentation visuelle en dendrogramme ou Eisengramme figure 15 D autres outils plus r cents mais moins utilis s sont bas s sur des alternatives a la classification hi rarchique tels que la m thode des K means la Self Organizing Map SOM et le Self Organizing Tree Algorithm SOTA particuli rement robuste Figure 15 Exemple d Eisengramme partir de donn es d expression de tumeurs sensibles ou non au tamoxif ne Vendrell et al 2008 35 1 2 2 PCR quantitative en temps r el 1 2 2 1 Origine et principe Les techniques de PCR utilisent des amorces sp cifiques d un messager particulier pour d tecter son expression parmi l e
115. seule ann e 2005 les articles citant des donn es de puces ADN repr sentent plus de 5300 publications Citons tout de m me plusieurs exemples dans l identification de g nes r gul s au cours de certains processus comme la gam togen se Chalmel et al 2007 ou sous l effet d une blessure d un nerf p riph rique permettant d identifier des cibles potentielles pour de nouveaux traitements antidouleurs Xiao et al 2002 Les puces ont galement t employ e comme moyen de caract risation de la fonction des genes en recherchant une co expression dans plusieurs tissus Zhang et al 2004 Toutefois un tr s grand nombre d tudes ont t men es dans l optique d une comparaison de profils d expression entre plusieurs types de pr l vement et la recherche de signature notamment dans certains cancers cf paragraphe 1 2 1 5 Ainsi Ash A Alizadeh et ses collaborateurs sont parvenu montrer que chez des patients souffrant de lymphomes B diffus grandes cellules DLBCL maladie dont le pronostic est tr s variable 40 des patients r pondent bien au traitement et ont une survie plus lev e les tumeurs pr sentent galement une h t rog n it mol culaire Les profils dexpression g nique diff rents refl tent notamment une variabilit dans le potentiel prolif ratif ou l tat de diff renciation et sont corr l es avec le taux de 24 survie des patients Alizadeh et al 2000 Un travail comparable a
116. sup rieurs a 4 CDSN KDAP LCE2B SCEL CALML5 LCE5A LOR FLG SBSN LCE3C KRT2 FABP5 SPINK5 LCE4A NICE 1 DMKN SPRR1B KLK7 et KLK5 Toutefois de nombreux autres marqueurs sont non d tect s par les sondes correspondantes A2ML1 GJB5 IVL KLF4 KRT10 TGM1 3 amp 5 non diff rentiellement d tect s KRT1 RORA ou n ont pas de sonde correspondante ex FLG2 IFPS A l exception de KLF4 ces marqueurs sont parfaitement quantifiables en PCR quantitative avec des ratios parfois bien plus importants ex LOR affiche un ratio de 7 3 sur puces et de 3735 en PCRq Mattiuzzo et al 2009 De plus le test en PCR quantitative de 103 des 624 g nes potentiellement surexprim s n a permis de confirmer les r sultats que pour une faible proportion des candidats 17 sur 54 g nes quantifiables soit 31 le reste se r partissant entre g nes non r gul s 26 sur 54 48 voire sous exprim s 11 sur 54 20 Dans le m me temps une approche purement bioinformatique voir plus loin a conduit au choix de 88 g nes codant pour des facteurs de transcription Cette 210 approche a permis de quantifier 43 de ces g nes par PCRa avec 9 surexprim s 21 et 8 sous exprim s 19 soit des proportions assez proches de celles obtenues avec les 103 g nes pr c dents Ce r sultat est surprenant les candidats s lectionn s partir de donn es de puces tant suppos s surexprim s dans leur grande majorit alors que l appro
117. t r alis sur des personnes atteintes de cancers du sein van t Veer et al 2002 et ce travail a abouti en 2006 a partir d une liste de 70 g nes la conception de MammapPrint le premier microarray sp cialement d di au pronostic qui soit approuv par la FDA US Food and Drug Administration figure 6 Malgr tout la fiabilit de certaines tudes et la difficult pour comparer des tudes similaires mais aux proc dures non standardis es rendent certains r sultats difficiles mettre en perspectives voir la revue Pusztai et al 2006 pour une discussion sur les m thodes de classification dans le cas des cancers du sein De plus la d termination de sous cat gories s est av r e plus d licate voire impossible avec d autres pathologies Len i CLSCTE ae ten i Do o6 Correlation lo average good prognosis profile Metastases f white Tumours Reporter genes Figure 6 Signatures de tumeurs du sein sur Mammaprint et prognostic Glas et al 2006 Profils dexpression pour 70 marqueurs prognostiques Les ARNm extraits de tumeurs de 78 patients sont analys s et classifi s sur Mammaprint Eisengramme gauche Les tumeurs sont class es selon leur degr de corr lation avec le profil moyen du groupe ayant un bon prognostic milieu Les patients d veloppant des m tastases moins de cinq ans apr s le diagnostic sont indiqu s en blanc droite Les analyses d
118. teases 49 To understand the roles of these protease inhibitors in desquamation it is of key interest to determine their molecular targets Proteases expressed in the skin and potentially involved in desquamation are interesting candi dates Our ORESTES data set includes the serine protease kallikrein 7 SCCE which plays a key function in desquama tion by cleaving two corneodesmosome components desmo collin 1 and corneodesmosin 50 Surprisingly we did not detect kallikrein 5 SCTE which cleaves another cor neodesmosome component desmoglein 1 However we detected for the first time the transcription of the P11 gene in the epidermis This gene encodes a secreted serine protease previously shown to be expressed in the human placenta and various neoplasms of the breast ovary testis and stomach 51 Its specific targets remain unknown In epidermis P11 is upregulated in the granular layer with a T4 T1 ratio of 35 Table 7 We suggest that P11 could act in the course of desq uamation either by cleaving corneodesmosome components or by activating other proteases Protease inhibitors might also play a documented role in pro tecting the body from infection In addition to the liver expressed antimicrobial peptide LEAP 2 we detected the expression of the WAP1 and WAP2 genes which encode ser ine protease inhibitors with antimicrobial activity in mouse tongue and kidney 52 WAP1 appears to be expressed in all epidermal layers
119. the UCSC Genome Browser These sequences were analyzed with GEMS launcher tools from Genomatix Suite Genomatix Software GmbH Munich Germany as follows For each gene conserved transcription factor binding sites TFBS and modules i e combinations of TFBS conserved in space and orientation were searched using the Dialign DialignTF and Frameworker tools respectively When a given TFBS or module was found in a minimum of three different promoters corresponding TFs were selected for qRT PCR analyses 1 Kent WJ Sugnet CW Furey TS et al The human genome browser at UCSC Genome Res 2002 12 996 1006 2 Cartharius K Frech K Grote K et al Matinspector and beyond promoter analysis based on transcription factor binding sites Bioinformatics 2005 21 2933 42 197 Figure S2 Example of promoter analysis for DMKN B y orthologs using Genomatix tools a The UCSC Genome Browser shows a high level of conservation between the human promoter and those of other species particularly for three conserved regions CR red lines b Using the Frameworker tool conserved combinations of transcription factor binding sites colored thumbs were identified within two of the most conserved regions c Corresponding transcription factor families from Genomatix Matrix Library for CR2 and CR3 include known players of epidermal differentiation including ETS factors VSETSF AP1 and AP1 related proteins VSAP1F VSAP1R as well as othe
120. transporter member 6 keratin associated protein 10 10 dual specificity phosphatase 22 transmembrane 4 L six family member 19 NORG family member 4 Homo sapiens clone IMAGE 5541055 mRNA U2 small nuclear RNA FERM domain containing 7 SH3 domain kinase binding protein 1 pescadillo homolog 1 containing BRCT domain zebrafish von Willebrand factor A domain containing 3A neurogenic differentiation 4 Homo sapiens CONA FLJ13350 lysophospholipase Il early B cell factor 2 attractin Homo sapiens cDNA FLJ25839 carnitine acetyltransferase emopamil binding protein sterol isomerase secretoglobin family 1C member 1 hypothetical protein LOC201617 zinc finger protein 230 Homo sapiens cDNA FLJ37075 HOP homeobox extracellular matrix protein 1 acy Coenzyme A binding domain containing 6 cornifelin testis specific serine kinase 1B keratin associated protein 19 5 N acetyliransferase 6 DC STAMP domain containing 2 hippocampus abundant transcript like 1 Rho GTPase activating protein 23 cystatin F leukocystatin olfactory receptor family 6 subfamily S member 1 HLA complex group 4 pseudogene 6 cystatin SA solute carrier family 25 mitochondrial carrier oxoglutarate carrier member 11 transmembrane protein 150 Homo sapiens CONA FLJ32931 carbonic anhydrase IV keratin associated protein 19 3 chromosome 3 open reading frame 1 zine finger protein 335 biglycan caspase 6 glutathione S transferase omega 1 W
121. un i s M 1 1 1 l i f DE 3 z t 2 j z z 3 3 a E p amp i T _ 0246810 14 1820 24 2830 34 3840 44 4850 Figure 17 Quantification relative ou absolue par la d termination du Cycle threshold Ct A Courbe d amplification et d termination du Ct B Courbe de dissociation C Gamme talon et quantification absolue du mat riel de d part D apr s http pathmicro med sc edu et http pathol2 iwate med ac jp 39 1 2 3 SAGE amp Sequencage nouvelle g n ration Les m thodes d analyse du g nome et du transcriptome bas es sur lhybridation ont des limites la fois en termes de sensibilit et de sp cificit R cemment le d veloppement de m thodes de s quencage dites de nouvelle g n ration ou a haut d bit deep sequencing autorise une conception radicalement diff rente de l exploration de l expression g nique Nous nous concentrerons sur les approches qu elles permettent de r aliser la description des techniques elles m mes pouvant tre trouv e en annexe Plusieurs techniques de s quencage tr s haut d bit ont vu le jour ces derni res ann es et visent apporter des solutions plusieurs probl mes pos s par la technique de Sanger Elles permettent notamment de s affranchir de l tape pr alable QU Se Enzymes x ce Polymerase 494 on beads ne ann
122. were frozen as dry pellets The procedure was repeated twice lead ing to three successive fractions of dissociated cells named T1 T2 and T3 The residual fragments T4 fraction were drained on a gauze compress frozen and ground to a powder under liquid nitrogen Total RNA was extracted from the various cell batches using the RNeasy extraction kit Qiagen Hilden Ger many Purification of poly A RNA was always performed from the T4 fraction of individual patients using oligo dT 25 tagged magnetic beads according to the manufacturer s instructions Dynal Oslo Norway Two rounds of hybridiza tion to the beads were performed The mRNAs were treated with DNAse I Invitrogen and the absence of genomic DNA was confirmed by PCR using primers for the corneodesmosin gene GenBank AFo3130 Morphological analysis of epidermis samples After each trypsin incubation an aliquot of epidermal frag ments was fixed in Bouin s solution embedded in paraffin and sections 10 um were stained with hematoxylin eosin Production and analysis of ORESTES ORESTES production was essentially performed as described 66 Purified mRNA 20 ng was heated 10 minutes at 65 C reverse transcribed at 37 C for 1 h with 200 U of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase Promega Mad ison WI USA and 10 pmol of an arbitrary selected primer 18 25 nt in a final volume of 20 ul The reaction products 1 ul were amplified by PCR using either the
123. y ksp r lp si ka fG K Flp t f k tk C il ils f1 6 kNSNmMSR dVY sH paGtS qNnLHusO1 ns 1 A4DWGs H 331 340 350 360 370 380 390 400 410 420 424 mn tm mm mm t 4ap mn mn mn mn LIPA FHYHOSYPPTYHYKDHLYPTAYHSGGHDHLADYYOYHILLTOTTHLYFHESTPBHEHLOFTHGLDAPHRLYHKITHLHRKYQ LIPH EKCHQPTPYRYRYRDNTYPTANNT DHLSNPEDYKHLLSEYTNLIYHKNIP H DFIMGLOAPHRNYNETTHLNQQEETNLSQGRCEAYL LIPK MHFHOLTPPLYNITKMNEYPTALYNGGODIVADPKDVENLLPOTANLIYYKLIPHYRHYDF YLGEDAPQETYQDLITLNEEYLON LIPF HMHYDOSQPPYYRYTANNYPIAYMNGGKOLLADPQDYGLLLPKLPNLIYHKETPARYRHLDF THANDAPQEY YNDIYSHISEDKK LIPH KHYNOSHPPIYOLTANKYPTALMAGGHDYL YTPQDVARILPOTKSLHYFKLLPQMBHF DF YHGLDAPQRNYSETTALNKAYS LIPJ YHYNOTTSPLYNMTNMNYATALUNGKSOLL ADPEDYNILHSETTNHIYYKTISWYRHIDSLFGLOYYDOYYHETIDITOONL Consensus hy 0 tpp n t H YpTAiH D Ladp DY 11 tnliz k ipgwph Df u6 Dap r ell lnm seseses c on Lipa LIPF Lipf Re 100 LIPK Lipk a LIPN 100 x h a aT Nn D 2 n io LIPH 10 Figure 5 see legend on previous page Genome Biology 2007 8 R107 159 R107 18 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Epidermis Prostate Small intestine b Human Chimp Rhesus Dog CAGGGCCATGGTCGTCAAGAAC TG TIGGCACAACCGCCCCATCTICAGCTTCATCATCAAAACTCTCCAAGAAGTGGSC AACACGAACCACTTGACAGCCT TOG Cat CAGGGCCATGGTCATCAAGAACTGTTGGCACAACCGCCCCATCTTCAGCTTCCTCATCAGGATTCTCCAAGAACGAGAC CACAAAAATCGCTTA
124. 0 42 51 Kafatos F C Jones C W and Efstratiadis A 1979 Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure Nucleic Acids Res 7 1541 1552 274 Kainu K Kivinen K Zucchelli M Suomela S Kere J Inerot A Baker B S Powles A V Fry L Samuelsson L and Saarialho Kere U 2009 Association of psoriasis to PGLYRP and SPRR genes at PSORS4 locus on 1q shows heterogeneity between Finnish Swedish and Irish families Exp Dermatol 18 109 115 Kamata Y Taniguchi A Yamamoto M Nomura J Ishihara K Takahara H Hibino T and Takeda A 2009 Neutral cysteine protease bleomycin hydrolase is essential for the breakdown of deiminated filaggrin into amino acids J Biol Chem Kaminski W E Piehler A and Wenzel J J 2006 ABC A subfamily transporters structure function and disease Biochim Biophys Acta 1762 510 524 Kazerounian S and Aho S 2003 Characterization of periphilin a widespread highly insoluble nuclear protein and potential constituent of the keratinocyte cornified envelope J Biol Chem 278 36707 36717 Keating D J Dubach D Zanin M P Yu Y Martin K Zhao Y F Chen C Porta S Arbones M L Mittaz L and Pritchard M A 2008 DSCRI RCANI regulates vesicle exocytosis and fusion pore kinetics implications for Down syndrome and Alzheimer s disease Hum Mol Genet 17 1020 1030 Kelsell D P Norgett E E Unsw
125. 006 AP 2alpha a regulator of EGF receptor signaling and proliferation in skin epidermis J Cell Biol 172 409 421 Wang X Pasolli H A Wiliams T and Fuchs E 2008 AP 2 factors act in concert with Notch to orchestrate terminal differentiation in skin epidermis J Cell Biol 183 37 48 Wang Z Gerstein M and Snyder M 2009 RNA Seq a revolutionary tool for transcriptomics Nat Rev Genet 10 57 63 287 Welter J F Crish J F Agarwal C and Eckert R L 1995 Fos related antigen Fra 1 junB and junD activate human involucrin promoter transcription by binding to proximal and distal API sites to mediate phorbol ester effects on promoter activity J Biol Chem 270 12614 12622 Wiedow O Schroder J M Gregory H Young J A and Christophers E 1990 Elafin an elastase specific inhibitor of human skin Purification characterization and complete amino acid sequence J Biol Chem 265 14791 14795 Wilanowski T Caddy J Ting S B Hislop N R Cerruti L Auden A Zhao L L Asquith S Ellis S Sinclair R Cunningham J M and Jane S M 2008 Perturbed desmosomal cadherin expression in grainy head like 1 null mice Embo J 27 886 897 Wrone Smith T and Nickoloff B J 1996 Dermal injection of immunocytes induces psoriasis J Clin Invest 98 1878 1887 Wu Z Hansmann B Meyer Hoffert U Glaser R and Schroder J M 2009 Molecular identification and expression analysis of filaggrin 2 a memb
126. 06 A ENN gene homolog to 2900002G24Rik 0 00187 1 59 gt a 0060NO1RIk bart Adhesion molecules 1110058A15Rik 11 65 Mm289441 claudin 1 Cidn1 0 00087 2 31 Spm 1155 Mm 7339 claudin 4 Cidns 0 00058 2 20 H 1110014K05Rik 1205 Mm 37817 claudin 23 Cidn23 0 00024 3 01 925M fy Spri2 41 34 Mm 4807 occludin Ocin 0 00228 2 22 7 Spmis H5 Mm 350037 plakophilin 3 Pkp3 0 00242 1 67 A e Mm266875 periplakin Ppl 0 00009 1 80 4e Mm 293683 envoplakin Evpi 0 04208 1 30 ae Sprria 4am Mm 909 desmocoltin 1 Dsc1 0 03673 1 54 b Sprr2h 1154 Mm247477 comeodesmosin C sn 001393 1 49 Sprrat 1345 Protein lipid modifying enzymes Sprr d 17 0 Mm 4 1964 transglutaminase 1 K polypeptide Tgm 0 00195 1 81 92 0M Spr2a 1495 Mm 20851 peptidy arginine deiminase type lll Padi3 0 00489 2 28 zz A030004J04Fik 13 80 O luml Protease and serine protease inhibitor Lor 1 38 Mm 20024 similar to human kallikrein 5 preproprotein 1110030019Bik 0 00125 1 96 Mm 83909 serine or cysteine proteinase inhibitor clade D Serpinds 0 01608 1 74 member 8 Transcription factors M grainyhead like epithelial transactivator 1 Gett Gris 0 00112 2 00 91 5M Mm 325445 Skin 1a Pou2t3 Skn 1a 0 00198 1 71 iL Enzymes and transporters involved in lipid metabolism 8 Mm 41989 arachidonate lipoxygenase 3 Aloxe3 002175 1 50 Mm 340329 arachidonate 12 lipoxygenase 12A type Alox12b 000310 2 17 Mm 5031 glucosidase bet
127. 08 bas sur R et GEPAS http gepas bioinfo cipf es Herrero et al 2003 aux fonctionnalit s tr s completes Cette tape de normalisation est faite syst matiquement pour chacune des puces normalisation intra lames ou centrage Plus rarement une tape de 31 normalisation inter lames centrage r duction est parfois rajout e afin d quilibrer la dispersion des ratios d une puce lorsque certaines s av rent plus sensibles que d autres figure 12 0R Figure 12 Boxplot et normalisation inter esau Re lames A Le boxplot mat rialise la dispersion de tous les ratios d une m me lame en les Median repr sentant sous la forme d une boite materialisant les quartiles Q1 25 des donn es s So do 35 20 0 lg do ip ase Situ es a gauche de cette limite Q3 75 et la _ HR 26880 m diane ou Q2 50 La largeur de la boite 2 IQR interquartile range repr sente donc la if dispersion de 50 des donn es et la largeur des IN moustaches environ 99 B Boxplot pour les DRE donn es brutes de trois lames Les valeurs extr mes sont repr sent es sous la forme de _ cercles C La normalisation intra lames correspond un centrage de la loi Normale ou courbe de Gauss m diane des log ratios 0 La lame 1 semble plus sensible les ratios des g nes potentiellement r gul s M 40 sont plus importants D La normalisation inter lames permet
128. 1 SERPINE1 Une implication de la prot ine P11 dans la desquamation ou dans un autre processus reste donc ind termin e Une seconde prot ase s rine s cr t e PAMR1 impliqu e dans la r g n ration musculaire Nakayama et al 2004 s est av r e sous exprim e au cours de la diff renciation R 0 3 Mattiuzzo et al 2009 sugg rant un r le dans un processus autre que la desquamation Trois nouveaux inhibiteurs de prot ases a s rine SERPINA12 R 50 SERPINB7 R 10 et SERPINB12 R 15 ont t identifi s a partir des ORESTEs mais leur fonction dans la r gulation de la desquamation est toujours inconnue La serpine A12 est d crite comme une adipokine impliqu e dans l ob sit et le diab te de type 2 Kloting et al 2006 la serpine B7 est fortement exprim e au niveau du glom rule par les cellules m sangiales et aurait pour cible potentielle la plasmine Inagi et al 2003 enfin la fonction de la serpine B12 n a jamais t explor e Le g ne CST7 codant pour la cystatine F leucocystatine un inhibiteur potentiel de la cathepsine C Hamilton et al 2008 est galement exprim mais ne semble pas r gul au cours de la diff renciation R 0 8 Mattiuzzo et al 2009 La d couverte de ces nouvelles prot ines structurales enzymes et r gulateurs tend a prouver que les acteurs impliqu s dans la r gulation de la coh sion intercellulaire et intercorn ocytaire pourtant essentielle a la fonction du ti
129. 11 819 Chidgey M Brakebusch C Gustafsson E Cruchley A Hail C Kirk S Merritt A North A Tselepis C Hewitt J Byrne C Fassler R and Garrod D 2001 Mice lacking desmocollin 1 show epidermal fragility accompanied by barrier defects and abnormal differentiation J Cell Biol 155 821 832 Chimienti F Hogg R C Plantard L Lehmann C Brakch N Fischer J Huber M Bertrand D and Hohl D 2003 Identification of SLURP I as an epidermal neuromodulator explains the clinical phenotype of Mal de Meleda Hum Mol Genet 12 3017 3024 Choi M J and Maibach H I 2005 Role of ceramides in barrier function of healthy and diseased skin Am J Clin Dermatol 6 215 223 Chou J Lin Y C Kim J You L Xu Z He B and Jablons D M 2008 Nasopharyngeal carcinoma review of the molecular mechanisms of tumorigenesis Head Neck 30 946 963 Clayton E Doupe D P Klein A M Winton D J Simons B D and Jones P H 2007 A single type of progenitor cell maintains normal epidermis Nature 446 185 189 Cohen C D Klingenhoff A Boucherot A Nitsche A Henger A Brunner B Schmid H Merkle M Saleem M A Koller K P Werner T Grone H J Nelson P J and Kretzler M 2006 Comparative promoter analysis allows de novo identification of specialized cell junction associated proteins Proc Natl Acad Sci U S A 103 5682 5687 Cole J Tsou R Wallace K Gibran N and Isik F
130. 18 aa transcrits correspondants sont LCE1E LEP5 118 aa 22 Or LCE1D LEP4 er g n ralement constitu s de 2 exons et LCE1C LEP3 118 aa codent pour des prot ines de 100 LCE1B LEP2 SPRL2A 118 aa a LCE1A LEP1 do acides amin s en moyenne Contrairement aux prot ines SPRR les 17 prot ines LCE ne comprennent pas de r p titions en tandem identifiables Elles s en distinguent aussi par leur contenu lev en serine glycine et cyst ine Leur nombre pose la question de la redondance de leur fonction La comparaison de leur s quence en acides amin s et leur localisation g nomique a permis d tablir une classification en 3 familles LCE1 LCE2 LCE3 et 2 genes isol s LCE4A et LCE5A Jackson et al 2005 L expression de ces g nes chez l homme a t tudi e par PCR quantitative en temps r el dans diff rents pith liums pluristratifi s Les familles 1 et 2 sont les LCE que l piderme exprime majoritairement en particulier LCE1C et dans une moindre mesure LCE2A et LCE2B Les g nes de la famille LCE3 sont exprim s dans les pith liums stratifi s non cornifi s tels que l oesophage et la langue Les g nes LCE4A et LCE5A sont tr s faiblement exprim s dans les tissus et conditions test s dans tude D autre part seule l expression des g nes de la famille LCE2 est inductible par le calcium Enfin les g nes LCE1 sont surexprim s lors de exposition des k ratinocytes aux UVB 90 Les transglutaminas
131. 1977 il est peu probable que ce processus joue un role direct dans la fonction barri re Transport Bien que n tant pas ou tr s peu surexprim s deux g nes identifi s par notre tude SCP2 R 1 8 et SCPx R 1 2 sont susceptibles de jouer un r le important dans le transfert intracellulaire de lipides et plus particuli rement de cholest rol SCP2 and SCPx sont issues de l usage de deux promoteurs alternatifs de la m me unit de transcription SCP2 code pour un transporteur facilitant le transfert intermembranaire de st rols augmentant notamment la s cr tion du cholest rol dans les s cr tions biliaires Gallegos et al 2001 Il est tentant de sp culer sur le r le de SCP2 dans le transfert du cholesterol vers les k ratinosomes m me s il semble que 224 le transporteur est galement capable de lier les c ramides Atshaves et al 2007 Le role de SCPx qui code pour une thiolase de la matrice des peroxisomes semble plus difficile d finir Plusieurs g nes semblent galement impliqu s dans le transport extracellulaire de lipides au sein de l piderme La surexpression du g ne APOF dans les k ratinocytes granuleux R 41 est particuli rement int ressante d autant que APOD et APOE ont galement t d crits comme surexprim s dans les couches suprabasales Radoja et al 2006 APOD et APOE sont des apolipoprot ines respectivement impliqu es dans les changes de cholest rol via l activation de
132. 2001 Gene structure intracellular localization and functional roles of sterol carrier protein 2 Prog Lipid Res 40 498 563 Galliano M F Toulza E Gallinaro H Jonca N Ishida Yamamoto A Serre G and Guerrin M 2006 A novel protease inhibitor of the alpha2 macroglobulin family expressed in the human epidermis J Biol Chem 281 5780 5789 Gan S Q McBride O W Idler W W Markova N and Steinert P M 1990 Organization structure and polymorphisms of the human profilaggrin gene Biochemistry 29 9432 9440 Garber K 2008 Fixing the front end Nat Biotechnol 26 1101 1104 Gariboldi S Palazzo M Zanobbio L Selleri S Sommariva M Sfondrini L Cavicchini S Balsari A and Rumio C 2008 Low molecular weight hyaluronic 270 acid increases the self defense of skin epithelium by induction of beta defensin 2 via TLR2 and TLR4 J Immunol 181 2103 2110 Garrod D R Berika M Y Bardsley W F Holmes D and Tabernero L 2005 Hyper adhesion in desmosomes its regulation in wound healing and possible relationship to cadherin crystal structure J Cell Sci 118 5743 5754 Gazel A Ramphal P Rosdy M De Wever B Tornier C Hosein N Lee B Tomic Canic M and Blumenberg M 2003 Transcriptional profiling of epidermal keratinocytes comparison of genes expressed in skin cultured keratinocytes and reconstituted epidermis using large DNA microarrays J Invest Dermatol 121 1459 146
133. 21 432 Descargues Pa Deraison C Bonnart Ca Kreft Ma Kishibe M Ishida Yamamoto A Elias Pa Barrandon Zambruno G Sonnenberg A et al 2005 Spinks deficient mice mimic Netherton syndrome through degradation of desmoglein by epidermal protease hyperactivity Nat Gener 37 36 65 Garrod D and Chidgey M 200K Desmosome structure composition and function Biochim Biophys Acta 1778 572 387 Guerrin M Simon M Montezin Ma Haftek M Vincent C and Serre G 1998 Expression cloning of human comeodesmosin proves its identity with the product of the gene and allows improved characterization of its processing during keratinocyte differentiation Biel Chem 273 2140 22647 Haftek ML Simon M Kanitakis J Mar chal Claudy A Serre G and Schmitt D 1997 Expression of comeodesmosin m the granular layer and stratum comeum of normal and discased epidermis Br J Dermarel 137 864 873 Hardman M Ja Sisi P Banbury D N and Byrne C 1998 Patterned acquisition of skin barrier function during development Development 125 1341 1332 Helms Ca Saccone M La Cao La Daw J An Cao Ka Hsu T Ma Taillon Miller Pa Duan S Gordon D Pierce B et al 2005 Localization of PSORST toa haplotype block harboring HLA C and distinct from comeadesmosin and HER Aum Genrer 118 466 476 Indra A K Warot X Brocard J Bornert J M Xiao J H Chambon P and Meten D 1999 Tempor
134. 3 Etudes de la diff renciation pidermique in vivo Une tude men e en 2006 sur des souris sauvages ou mut es pour le r cepteur la m lanocortine Mcir un marqueur des m lanocytes a permis d identifier de nombreux g nes potentiellement impliqu s dans la diff renciation k ratinocytaire au moyen de puces ADN pang nomiques de souris April and Barsh 2006 Les auteurs ont analys le transcriptome des fibroblastes du derme des cellules de la couche basale o sont log s les m lanocytes ou de l piderme suprabasal de souris sauvages ou mut es Ces 3 populations cellulaires ont t compar es 2 2 permettant de d gager une signature transcriptionnelle sp cifique de chacune des fractions cellulaires ind pendante du g notype des souris figure 64 Au total sur 17267 transcrits d tect s toutes fractions confondues 552 2097 et 883 transcrits se sont av r s sp cifiques du derme de la couche basale et des couches suprabasales de l piderme respectivement Parmi ces 883 transcrits sp cifiques des k ratinocytes diff renci s on peut noter de nombreux marqueurs d j d crits dans la litt rature 133 S 4 epidermis epidermis skin SSS ENS KOEN SENS ENS LILLLLLLLLLELLLLLS dUUUUUUUUuUUULUUUUU MFP F FF Fr S SELELSLELELLLERT H RR F E I E NM OOR360 GE __AVOTE128 ESR SE AVDSTTOS E 7 99E 03 Basal BCE Pag SE karmai AMOTOTAT EST O
135. 4 Le sulfate de cholest rol Le cholest rol s cr t par les k ratinosomes provient de la synth se de novo dans les couches vivantes de l piderme Une petite proportion est transform e dans les couches suprabasales en sulfate de cholest rol par la cholest rol sulfotransf rase SULT2B1 Ce sulfate de cholest rol stimule la diff renciation k ratinocytaire par activation des PKC Protein Kinase C et par r gulation transcriptionnelle de Pinvolucrine et de la transglutaminase 1 via l induction de complexes AP 1 contenant Fra1 Fra2 et JunD Hanley et al 2001 Le sulfate de cholest rol est galement un inhibiteur de serine prot ases et retarde la desquamation chez la souris Sato et al 1998 Dans la couche corn e le sulfate de cholest rol est progressivement converti en cholest rol par la st ro de sulfatase STS aussi connue sous le symbole ARSC1 figure 37 Une d ficience de cette enzyme est responsable d une ichtyose r cessive Stratum Basale Stratum Granulosum stratum Corneum SO Choi STase Cholesterol Sulfate ___SSase 7 Chol PKC Droas 50 activity ana inhibitor Differentiation TT Cohesion Desquamation Chol SO content 2 1 Yo SG Lower SC Outer SC Figure 37 Cycle du sulfate de cholest rol dans l piderme normal Elias et al 2004 75 li e l X OMIM 308100 par accumulation de son substrat le sulfate de cholest rol dans la couche c
136. 4 Babu M M Luscombe N M Aravind L Gerstein M and Teichmann S A 2004 Structure and evolution of transcriptional regulatory networks Curr Opin Struct Biol 14 283 291 Balaji S Babu M M Iyer L M Luscombe N M and Aravind L 2006 Comprehensive analysis of combinatorial regulation using the transcriptional regulatory network of yeast J Mol Biol 360 213 227 Barrandon Y and Green H 1987 Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication Proc Natl Acad Sci U S A 84 2302 2306 Bazzi H Getz A Mahoney M G Ishida Yamamoto A Langbein L Wahl J K 3rd and Christiano A M 2006 Desmoglein 4 is expressed in highly differentiated keratinocytes and trichocytes in human epidermis and hair follicle Differentiation 74 129 140 Bazzi H Martinez Muir A Kljuic A and Christiano A M 2005 Desmoglein 4 mutations underlie localized autosomal recessive hypotrichosis in humans mice and rats J Investig Dermatol Symp Proc 10 222 224 Ben Selma Z Yilmaz S Schischmanoff P O Blom A Ozogul C Laroche L and Caux F 2007 A novel S115G mutation of CGI 58 in a Turkish patient with Dorfman Chanarin syndrome J Invest Dermatol 127 2273 2276 Bernard B A 2002 Hair biology an update Int J Cosmet Sci 24 13 16 Bernard F X Pedretti N Rosdy M and Deguercy A 2002 Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono layer cultures reconstitu
137. 4 25 13 6 120 54 these 1 453 approximately 6 corresponded to empty plas mids or uninformative sequences 377 1 7 were of bacterial origin and 2 303 10 matched the human mitochondrial genome Despite two rounds of polyA RNA purification 1 859 sequences 8 2 arose from ribosomal RNA In addi tion 187 sequences corresponded to unspliced intergenic DNA and may reflect spurious transcriptional activity The remaining 16 591 sequences 73 matched known or pre dicted transcribed regions of which 62 aligned with the human genome in several blocks and thus corresponded to spliced transcripts After clustering we observed the tran scription of 3 387 genes by GKs Additionally 23 sequences matched overlapping exons belonging to two genes tran scribed in opposite orientations and thus could not be attrib uted to a single gene The normalization ability of the ORESTES method was exam ined by classifying genes according to the number of match ing sequences in the dataset Figure 2b Half of the genes were represented by a unique sequence and 76 3 by three or less sequences thus showing an acceptable level of normali zation with a mean of 4 6 ORESTES per gene However the ORESTES method only partially compensates for transcript abundance as several genes were represented by a large ORESTES number In these cases we examined the number of sequences in the corresponding UniGene clusters a rough measure of gene expression
138. 4 Patel et al 2006 notamment des g nes connus pour leur fonction cruciale dans A B Promoter Activity Promoter Activity E Promoter Activity E Promoter Activity with KLF4 with KLF4 29 17 100 10 30 8 I 60 I 6 E 40 4 20 A E 2 0 0 i i bh OA i nd h sh fh A ON Keo g av ob 2 SO oP ae SN Sd SP PES IOS PS FP CP PE ar ar C3 SF iS ee eo Ta y LE q Ry es s ES eo org 3 am oS Figure 57 R gulation de l activit du promoteur proximal de plusieurs g nes d expression tardive par Kif4 Patel et al 2006 A G nes sous exprim s dans l piderme des souris klf4 Le test de transactivation in vitro indique une activation directe du promoteur proximal de 12 g nes sur 19 B G nes surexprim s dans l piderme des souris klf4 Pour les g nes clca1 et clca2 la r pression par Klf4 semble directe 108 l piderme tels que Cdsn Klk7 Serpina12 et Spinks ainsi que Alox12b et Far2 tous deux impliqu s dans le m tabolisme des lipides la transcription de la plupart de ces cibles semblant tre directement activ e par la fixation de Klf4 sur leur promoteur proximal figure 57 contrairement aux travaux pr c dents qui attribuaient un role de r presseur a KIf4 Au final KLF4 semble donc r guler plusieurs g nes impliqu s dans divers aspects de la diff renciation k ratinocytaire signalisation m tabolisme lipidique enveloppe corn e desquamation De plus son role d activ
139. 4 181 McGrath J A 2008 Filaggrin and the great epidermal barrier grief Australas J Dermatol 49 67 73 quiz 73 64 McLean W H Eady R A Dopping Hepenstal P J McMillan J R Leigh I M Navsaria H A Higgins C Harper J I Paige D G Morley S M and et al 1994a Mutations in the rod 1A domain of keratins 1 and 10 in bullous congenital ichthyosiform erythroderma BCIE J Invest Dermatol 102 24 30 279 McLean W H Morley S M Lane E B Eady R A Griffiths W A Paige D G Harper JL Higgins C and Leigh I M 1994b Ichthyosis bullosa of Siemens a disease involving keratin 2e J Invest Dermatol 103 277 281 Meade J L de Wynter E A Brett P Sharif S M Woods C G Markham A F and Cook G P 2006 A family with Papillon Lefevre syndrome reveals a requirement for cathepsin C in granzyme B activation and NK cell cytolytic activity Blood 107 3665 3668 Medini D Serruto D Parkhill J Relman D A Donati C Moxon R Falkow S and Rappuoli R 2008 Microbiology in the post genomic era Nat Rev Microbiol 6 419 430 Mehic D Bakiri L Ghannadan M Wagner E F and Tschachler E 2005 Fos and jun proteins are specifically expressed during differentiation of human keratinocytes J Invest Dermatol 124 212 220 Mehrel T Hohl D Rothnagel J A Longley M A Bundman D Cheng C Lichti U Bisher M E Steven A C Steinert P M and et al 1990 Identification
140. 5 Tu C L Chang W and Bikle D D 2001 The extracellular calcium sensing receptor is required for calcium induced differentiation in human keratinocytes J Biol Chem 276 41079 41085 Tu C L Chang W and Bikle D D 2007 The role of the calcium sensing receptor in regulating intracellular calcium handling in human epidermal keratinocytes J Invest Dermatol 127 1074 1083 Tuerk C and Gold L 1990 Systematic evolution of ligands by exponential enrichment RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase Science 249 505 510 Tumbar T Guasch G Greco V Blanpain C Lowry W E Rendl M and Fuchs E 2004 Defining the epithelial stem cell niche in skin Science 303 359 363 Tummala R Romano R A Fuchs E and Sinha S 2003 Molecular cloning and characterization of AP 2 epsilon a fifth member of the AP 2 family Gene 321 93 102 Turksen K and Troy T C 2002 Permeability barrier dysfunction in transgenic mice overexpressing claudin 6 Development 129 1775 1784 van t Veer L J Dai H van de Vijver M J He Y D Hart A A Mao M Peterse H L van der Kooy K Marton M J Witteveen A T Schreiber G J Kerkhoven R M Roberts C Linsley P S Bernards R and Friend S H 2002 Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer Nature 415 530 536 van Ruissen F Jansen B J de Jongh G J van Vlijmen Willems I M and Schalkwijk J 2002a Differential gene ex
141. 7 304 Genomatix 1 7 ISL1 ISL LIM homeobox 1 79 Genomatix 0 7 KLF10 Kruppel like factor 10 TIEG1 324 ORESTES 1 7 KLF13 Kruppel like factor 13 BTEB3 253 ORESTES 1 LDB1 LIM domain binding 1 204 ORESTES 0 8 LLGL1 lethal giant larvae homolog 1 DLG4 HUGL 333 Microarrays 0 9 PLA2G15 phospholipase A2 group XV lysosomal phospholipase A2 389 Microarrays 1 MAFK v maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog K 256 Literature 0 6 MAGED1 melanoma antigen family D 1 NRAGE 1293 ORESTES 1 MAX MYC associated factor X splicing variants 1 3 amp 5 434 ORESTES Genomatix 1 7 MBD2 methyl CpG binding domain protein 2 284 ORESTES 1 8 MBTPS1 membrane bound transcription factor peptidase site 1 804 ORESTES 0 9 MED4 mediator complex subunit 4 VDRIP 496 Microarrays 1 9 NCOA6 nuclear receptor coactivator 6 362 Literature 1 6 NIPBL Nipped B homolog Drosophila 360 ORESTES 1 3 NR1D1 nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 196 ORESTES Genomatix 1 2 NR4A1 nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 677 ORESTES 1 9 NRBP1 nuclear receptor binding protein 1 931 ORESTES 1 6 ODZ1 odz odd Oz ten m homolog 1 Drosophila 37 Microarrays 0 6 OTUD7B OTU domain containing protein 7B deubiquitinating cysteine protease ZA20D1 159 ORESTES 0 54 OXER1 oxoeicosanoid OXE receptor 1 12 Microarrays 1 6 PAPOLG poly A polymerase gamma 202 Microarrays 1 8 PHF7 PHD finger protein 7 684 Genomatix 1 1 184 POU6F1 PRDM15 SCLY SCP2 SCP2 SEZ6L2 SKIV2L
142. 8 Ghazizadeh S and Taichman L B 2005 Organization of stem cells and their progeny in human epidermis J Invest Dermatol 124 367 372 Gibbs S Fijneman R Wiegant J van Kessel A G van De Putte P and Backendorf C 1993 Molecular characterization and evolution of the SPRR family of keratinocyte differentiation markers encoding small proline rich proteins Genomics 16 630 637 Gibson D F Ratnam A V and Bikle D D 1996 Evidence for separate control mechanisms at the message protein and enzyme activation levels for transglutaminase during calcium induced differentiation of normal and transformed human keratinocytes J Invest Dermatol 106 154 161 Gilbert J A Field D Huang Y Edwards R Li W Gilna P and Joint I 2008 Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities PLoS ONE 3 e3042 Glas A M Floore A Delahaye L J Witteveen A T Pover R C Bakx N Lahti Domenici J S Bruinsma T J Warmoes M O Bernards R Wessels L F and Van t Veer L J 2006 Converting a breast cancer microarray signature into a high throughput diagnostic test BMC Genomics 7 278 Groot K R Sevilla L M Nishi K DiColandrea T and Watt F M 2004 Kazrin a novel periplakin interacting protein associated with desmosomes and the keratinocyte plasma membrane J Cell Biol 166 653 659 Gudjonsson J E Johnston A Dyson M Valdimarsso
143. A La ligne bleue correspond la d finition de M o ratio 1 pour une normalisation selon l intensit moyenne dans chaque canal B La d finition d une courbe de r gression par la m thode Lowess ne d pend que de la largeur des fen tres pour la r gression lin aire locale et de leur degr de chevauchement C Courbe de r gression d finie pour les donn es de A D Donn es apr s normalisation D apr s http bioinfo unice fr 30 Le design des puces pang nomiques autorise des m thodes de normalisation s appuyant sur le grand nombre de g nes donc moins risqu es Il est notamment possible de se baser sur l intensit globale de fluorescence de chaque condition donc sur l ensemble des d p ts pour calibrer les marquages entre eux sur l intensit de fluorescence des seuls d p ts consid r s comme positifs dans les deux cas on suppose que les deux cellules ont une activit transcriptionnelle quivalente quantitativement ou encore sur la supposition que la majorit des g nes sont exprim s au m me niveau entre les deux conditions Deux m thodes sont bas es sur cette derni re possibilit la m thode de la majorit stable qui recherche le plus grand sous ensemble de g nes ayant un ratio similaire et se sert de leurs valeurs pour d finir un facteur de correction unique ou la m thode Lowess initialement d velopp e par W S Cleveland et de loin la plus utilis e La m thode Lowess LOcally WEig
144. A TncRNA 44 ORESTES is a 481 nucleotide nt non protein coding RNA involved in trophoblastic major histocompatibility complex suppression by inhibiting class II transactivator CIITA tran scription 28 H19 is a non protein coding maternally imprinted mRNA two spliced ORESTES 29 that is highly transcribed in extraembryonic and fetal tissues as well as in adult skeletal muscle It has been shown that H79 is involved in the genomic imprinting of the insulin like growth factor 2 IGF2 gene 30 Moreover IGF2 is expressed throughout the epidermis 31 and its overexpression increases the thick ness of the epidermis and the proportion of dividing cells in the basal layer 32 We suggest that H19 could participate in the regulation of JGF2 transcription by maintaining the genomic imprinting of its promoter in adult epidermis In addition to numerous protein coding genes we thus detected several non protein coding RNAs whose expression in the Genome Biology 2007 8 R107 148 http genomebiology com 2007 8 6 R107 Table 3 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Genes with less than 100 UniGene ESTs encoding known GK expressed proteins No of ORESTES v N N 100 140 Gene symbol LCE IF LCE2C Cl orf46 LCE2A LCESA LCE IA PGLYRP3 LCEIC FLG LEP7 RPTN LCE2B hKPRP LOR KRT2A Cl orf42 TGMS DSC KRTIB CASPI4 CNFN CALMLS ALOXE3 ALOX12B SPRR2E IVL EPPK POU2F3 ICHTHYIN
145. A U reton A E ue ened ewe 54 21 2 LHA PODERME ETLE DERM E cernir E EA 55 2 1 3 LA JONCTION DERMO EPIDERMIQUE nn rss ssssnsses 55 2 1 4 E PWS RIVE Sd ae a de nc T 56 2 1 5 LES ANNEXES EPIDERMIQUES ccccsseccnssccssccseccnseccnseccsecoenees 56 2 2 LA DIFFERENCIATION KERATINOCYTAIRE cccccccscccccceees 58 2221 ASPECTS MORPHOLOGIQUES nn nn i 58 2 2 1 1 La couche basale stratum Dasale 8 ein ne 59 221 2 La couche pineuse stratum spinosum 59 22 12 La couche granuleuse Stratum granulosum 60 2 2 1 4 La couche corn e Stratum COPNECUM cceccccssecccssescesseccesseseescsceeesscens 60 22 gt ASPECTS FONCFONNELS in need RS 62 5 50 1 Homeostasie d l pid rme ssssn inner 62 2 2 2 1 1 Couche basale et auto renouvellement 62 29 212 Couche corn e et desquamation ccccccesssseneesesseseeeecececeeeeceeaaeeaesssses 67 2222 Fonction barri re de l piderme ss 72 DDD 7 TPE mea DU aea shite nin ticwseaee es ae 73 2 29 9 PA Lipides intercorn ocytaires ss 73 D99919 JONCUONS SELICES Larsson ocean os 77 22229 IRESESLONICE INMCCOMIGUC LR MA 81 2 2 2 2 2 1 Matrice NDICUSC SL ttc heres eee 81 D DD DO Enveloppe CONN E ne ei 84 D 9 9 9 9 3 COPMEOCESINOSOINE Sereia int emilie 92 223 REGULATION DES ETAPES TARDIVES DE LA DIFFERENCIATION 95 Do VOIES d SIG AIS ATOME SN CA un ec Nes 95 2 2 3 1 1 VO COICIQUE insi
146. AAGTTGA TICCCAGGAAGACATTCACC GCTTAAATCCGGAGCCACTT TCCCTTCCTCTACTGCTGGA TCCATTCCCAAAAGCTCTGT CTTCTCATCCCGGTCACTGT ACACGTCCTCCACGTAGTCC CACAGCCATTTGTGATTTGC ACCGCAAAATACGCTCTCAA GCCCCTGAAGAAAGTCTGC TCAGGTCCTCCTCAGCAAAG 201 TFAP2E TFCP2L1 TLE1 TMEM45A TRIM29 TSPYLS UBP1 VIVAT ZBTB B ZEB ZFHX3 ZFPM1 ZFPM2 ZHX2 ZNF143 ZNF230 ZNF239 ZNF239 alternative primer pair ZNF335 ZNF396 ZNF 6 ACGTCTGTGAGACGGAGTTC CAGCACATCCACCGAGTCTA CCTACCATTCCTCCAAACCTG TGCATGGGATCTGATGGAT ACTACACCTCCCGGGTCTG CCCAATCCCTTGCAGTTCTA AGCAGTGCAAGCGAGAATG TGACCTGCACATCATTGTCC ATTCACCAGGAACGACAAGC TCCTGTCTGTCTCGCAAAAA AGCAGCAAGGGATGTTTGAC GTGAAGAAGGAGCCAGCAGA GCTTCTATTTTGCCCACAGC GGGAGGAGGATGCGATCT CACAATGGTAACGCAGGATG CCTGCGGTTGCTACATAACC TCCTCCTGGCTAGTTTTGGA AGCCCATTCAGGTCTTCACA CCGAGCTGAGATGGAGAGTC AGCATCATGGGAGCTTCAGT GCCAGAAGCCAACTTCATGT CTGAGCCATCAAGTCTGCAA ACTGCTGCTCAGAGTCCACA GGTTGAGGGTGTTGATCTGG TCCAACTTCTGAGGAGCAGAG ACGTAGAATGGCCGGTAGTG ATCAGTTGGATTGGCTCACC TGTGGATGCCATCACTACTTTC CAGCTCCAGCACATAGTAGCC CAGTTCTGGCCTTTGAGGTG GCCTTGAGTGCTCGATAAGG CAAGTTCGGCTTAGGAGACG TCTTTGGGCTTCTCGTCTGT ACAGGCTGGAAATCTGATGG CGTTGATCAGCACAGCAGTT CCCATTTCTGATGAGGCAGT ATGGAGCACAAAGGAAGGTG CACACTGTCCCTGTTTICTGG CCCATCTGAGAAACAAGAACAA CAAAGCTGCACTGGCTACAC TCCAAGAAGGGTTTICCTIGTC ATCCTCGAGCTGGATCACC 202 HI DISCUSSION 203 204 Technique des ORESTEs La technique des ORESTES repose sur l utilisation d amorces non sp c
147. ACGGCCTTCA Elephant Mouse TAGGACCATGGT TGCTAAGAAC TGCTGGCACAAC TGCCCCATCTTCAGCCTCATCC TCAGGAT TCTCCAGGAACTSGOS CAGATCTC TGGTCATCAAGAAC TGCTGGCACAATCGCCC TG TCTICAGCTTC T TCATIAAGACCCTTCAGAACCCAACC TGTACCAATTACCTCACAGCCCTEG http genomebiology com 2007 8 6 R107 Placenta Pancreas 4 TAGGTCCGTTGTCATCAATAACTGTTGGCACAACCGCCCCCTC TTCAGCTCCATCATCAGGTTCCTCCAGGACCCAGACCTGCAAGAATCACTTAACGGCCCTTG l AGGTCCCTGGTCATCAATAACTGTTGGCACAACCGCCCCCTCTTCAGCTCOCATCATCAGGTTCCTCCAGGACCCAGAC TGCAAGAATCACTTAACGGCCCTTG TAGGTCCCTGGTCATCAATAAC TG TTGGCACAACCGCCCCCICTICAGCTCCATCATCAGATTCCTCCAGGACCCAGAC TGCAAGAATCACTTAACGGCCCTTG TACACGAATCACTTAACAGCCCTTG Rat CAGATCCCTGGTC G TCAAGAAATGCTGGCACAACCGCCC TG TT TICAGCTTCT TCATTAAGACTCTCCAAAGCCGAGSC TGCACCAAT TACTTCACAGCCCTSG Armadillo CAGGGCCATGGTCACCAAGAAC TGTTGGCACAACCGC TCCATATGCAGCCTCATCATIAACATTCTCCATGAATIGGAC CATGCAAGTCACTICACAGCICTCA CAGGGCCATGGTC GTCOGCASCTGCTGGCACACCCGCCC GS TSTICCGCE TCACCSTCOGCGTCCTCCAGGACCCGGAC CTCGAGAACCACATGACGGCTICTTG CAGGTCTATGACCATAAGGAACTTCTGGCA TATT CGCCCCATIGTIAGCCTCATCITCCACATCCTCTATGGGCATGAA GATGGGAGT TCT GTITACCGCCTTSGGC x ON Rkkek se OF te Figure 6 ee tek ee Clorf8 mRNA expression and conservation of the eighth exon among mammals a Expression pattern of the C orf8 gene PCR was performed with a commercial panel of cDNAs from 16 human tissues PBL peripheral blood leukocytes and with cDNA prepared from epidermis The amplified fragment 120 nt
148. Annu Rev Biochem 1977 46 331 358 Brzozowski AM Derewenda U Derewenda ZS Dodson GG Lawson DM Turkenburg JP Bjorkling F Huge Jensen B Patkar SA Thim L A model for interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase inhibitor complex Nature 1991 351 491 494 Smith TP Grosse WM Freking BA Roberts AJ Stone RT Casas E Wray JE White J Cho J Fahrenkrug SC et da Sequence evaluation of four pooled tissue normalized bovine cDNA libraries and construction of a gene index for cattle Genome Res 2001 11 626 630 Hida K Wada J Eguchi J Zhang H Baba M Seida A Hashimoto Okada T Yasuhara A Nakatsuka A et al Visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor a unique insulin sensitizing adipocytokine in obesity Proc Natl Acad Sci USA 2005 102 10610 10615 Singh G Lykke Andersen New insights into the formation of active nonsense mediated decay complexes Trends Biochem Sci 2003 28 464 466 Matsufuji S Matsufuji T Miyazaki Y Murakami Y Atkins JF Gesteland RF Hayashi S Autoregulatory frameshifting in decoding mam malian ornithine decarboxylase antizyme Cell 1995 80 51 60 Hahn Y Lee B Identification of nine human specific frameshift mutations by comparative analysis of the human and the chimpanzee genome sequences Bioinformatics 2005 21 Suppl i 1 86 194 Wang X Grus WE Zhang J Gene losses during human origins PLoS Biol 2006 4 e52 Winter H Langbein L Krawczak M C
149. B 11 561 Ribosomal protein L3 2 970 Nucleolin 2 394 Ribosomal protein L28 5 864 Ribosomal protein 7a 5 623 Ribosomal protein SA 4 385 Poly A binding protein cytoplasmic 2 292 Ribosomal protein 18 134 Keratin 275 Dermokine 5 Late envelope protein 7 xp32 5 Filaggrin 12 Keratin 2A 36 Small proline rich protein 2E 19 Caspase 4 91 Corneodesmosin 7 Human keratinocyte proline rich protein 263 Plakophilin 49 Suprabasin 6l Desmoglein 526 Tetraspanin 5 64 Dual oxidase 2 476 Transmembrane protein 14C 11 Serpin peptidase inhibitor clade A member 12 142 Solute carrier family 22 member 5 10 Filaggrin 2 ifapsoriasin 309 Chromosome 7 open reading frame 24 gene is the host gene for 10 C D box snoRNAs 26 Other snoRNA host genes included in our ORESTES dataset are RPS11 RPS12 RPLio and EIF4A1 In certain cases ORESTES contain the snoRNA sequence U39B in RPS11 mgU6 77 in ElF4A1 U70 in RPL10 and probably corre spond to alternative splicing forms of the host gene mRNA with intron retention We furthermore obtained sequences for long non protein coding transcripts Metastasis associated lung adenocarci noma transcript 1 MALAT 1 22 ORESTES is a conserved long non protein coding RNA gt 8 000 nucleotides nt of unknown function that is highly expressed in numerous healthy organs and overexpressed in metastatic non small cell lung carcinomas 27 Close to MALAT 1 on 11q13 1 trophoblast derived noncoding RN
150. CCACAAGCACGGAGACCT CGTGCGCACAAGTCCTG GGAACCCCCACTTITTACGTT CCGCCTCTCACTTCAGAAAC AGTCCCATCTGGACAGCAAC GAGTCTTCTTCCAAGAGCTGGT CAGCAACTGGTCAATTTTTCA ACCTCTACCCTGGGCTTCC TGCCTCAGCCTTACTGTGAGT CATCTGTAGCCACCCAGGAT AGCACAAGTGCCACTACGC ACCAAGGCACAGACTGGTTC CCCACACAGGTGAGAAACCT AGTCAGAAAAGGTGCGAGGA CAGGACTGCACGAAGGTTTACA AGAAGCATCGAGACTTGGACA AACTACCTCCGACTCTGTGTGATAC GGGACGTCACAGTGGAAGAT GTGACAATGACCAGCCTCCT GTGCTTTGGGCTCTCCTTC GACAGAGGAGTGGTCGTGGT AAGGCATTAAAGGTCAAGAAGGA GACATCCCCTCCTTGGAGAT GGCAACAGCACCTTICTICG CATGACCCTGCTAGTGAGGA AAGGTGACCTCCAAGTGTGG GAACGAAAACGTAGGGACCA GAACGAAAACGTAGGGACCA CCTTCAAATGTGAGAAATGTGAG TACCAGAGCCCCACAGGA ATGAATGAACAGCCACGTCA ACTAGCACCATGCCCATCAC AGAAGCGTGAGCTGGTGAAT AGCTTTCTGCCTCACCAAAA TCCATGTTCAGTTTCTTGCACT TGGAGTGCTGCTCTITTAACTTC TGGATTCTTCAGGATTTGCC CTTTGACCCTGAAGCTTTGC CTTGGTCTGTGGGACTGTCA CAGGGCAGATCACCCTAAGA TGTTICCTGGAGTGCTGAGTG CTCACCCTGAACGGGATTTA TTTTTTGAGAGGTTAATGAAAAAACA CCCCGATAGTCACTCCATGT GGGAAGAGGGAAGATTACGC TITGCAGTCGAAGTCCTTGTG ACTGTGTCCCCAGGAGTGAG AGGTCCAGGTTIGTGGTCTTG ACTTGATGCCCCTTGGAAAT GTCTGAGTCCGAGTCCTCCA AGCACTGATCTTCAGCAGCA TCTGTGACGGATCTGCACTC ATTTTCATCCTGCGGTTCTG TGGCACGTGATCCTATTTGA CAGGAAGGTACTGGCACTGG TGGAACCACTCAATGGAACA CCAGACCGCATTTCTAGACC TGACAGCCACACCCTCATAC TGGGCACACTATCAGTCGTT CCAGGGTTCCAGCTTCAC TICCCACTTICTICCAACAGG CCGTCTTGCCGAAGTCTATC TGGGTATTGACTGGAGGAGG ATCAGAACGGGCAAACCTC AACTTCTTCTCGCCCGTGT ACGGGAGTTCATCCCTTCTT ATGTGTAAGGCGAGGTGGTC TGAA
151. CTTGCAGAGGTTCGTG CCCCCTGAGTCACCATTGC CTTCTCCAGGTGGGTTTTGA TGGGCTCTICTTICTTGCTGT GATAGTTCTGGCCTTCCTCATTT AGAGCAGGGTGAGGAAGACA GAGTAGCCGCAGCCAGAACG CCACCGGTTAAAGTCGTTGT GTAGCCGCGGTICTTGAGT TTITTCTGAACCTCTGCAATGAAT GGATGGACCCAAGGTGTTC TGGACTGCAGGGTTAAGGTC AGGTCAGCTTGTIGGGTTTCA TGCTGGTGTGTGTGGTTITT AAGGTGTGGCATTTCTGCAT CTGTGCACCTTCATGTGGTC TIGAAGGCTTCTTTICGCTTC GCACTGGCAACAGCAGATAA TICCTGCTTCCTGATGTCCT TCTATGTAGCTGGGGCTCAAA 200 MED4 MVD NCOA6 NCOR2 NDORT NFE2 NFE2L1 NIPBL NMI NR1D1 NR2C7 NR4AT NABPT ODZ1 OTUD B OTX7 OXERT PAPOLG PELP1 PHF2 PHF PKNOX7 PLA2G15 PLEKHA2 POU6F1 PRDM15 RASGRP1 RCANT RFXS RORA RREB1 SCEL SCLY SCP2 SCP2 SERPINBS SERPFINBE SEZ6L2 SH3KBP1 SIMI SKIV2L SLC3046 SLC35B2 SLC39A6 SLC8A1 SLTM SOXT2 SPINKS SSRP1 SUV39H1 TCFLS TCFLS TCIRG1 TEF TTCCACTAATGGCGTGAATG TGGCGGCAGTCACTIGTA GGCCTCTGAAAGTGTGGAAA CAAGCTGACCGAGAGCAACT GGGCCAGACTGGAAACTTCT GAGCTGCAGGGTCTGAATG CTICCCTGCACAGTTTCCA GCACTTCAGGGTCATTGAGAA TCACGTTTGTGGAGATTGGA CACCTTTGAGGTGCTGATGG GAGTCTGCCTCCAGACTGCT GCTTCTTCAAGCGCACAGT GAGATTCAGGGCAATGGAGA TCGGGATTGGTGACGTTTAT ATGGCAGAAGGAGTGGAATG CCAAGACTCGCTACCCTGAC ATCATCTTTGGCATGGCTTC AAGAGATCCCATTCCCCATC GTGAGCAGTCAGCATTGGAA TGCCAGAGTCAAGAAGGAGAG GCTATGCCTTCGAGAACCTG CATCCCTACCCAACAGAGGA CTGGCTTCAGGAGACAACAA CGTGAAGCAAGGGAATGTG CCATCTGCCGGTTCGAG ACGTTCAGCTCACACACGAC AGCCCAGTCTTGGTCAGAAA ACTTCAGCAACCCCTTCTCC GGCTIGCTGAAGAGGACGA ACACCAGCATCAGGCTTCTT C
152. Camargo A A Samaia H P Dias Neto E Simao D F Migotto I A Briones M R Costa F F Nagai M A Verjovski Almeida S Zago M A Andrade L E Carrer 265 H El Dorry H F Espreafico E M Habr Gama A Giannella Neto D Goldman G H Gruber A Hackel C Kimura E T Maciel R M Marie S K Martins E A Nobrega M P Paco Larson M L Pardini M I Pereira G G Pesquero J B Rodrigues V Rogatto S R da Silva I D Sogayar M C Sonati M F Tajara E H Valentini S R Alberto F L Amaral M E Aneas I Arnaldi L A de Assis A M Bengtson M H Bergamo N A Bombonato V de Camargo M E Canevari R A Carraro D M Cerutti J M Correa M L Correa R F Costa M C Curcio C Hokama P O Ferreira A J Furuzawa G K Gushiken T Ho P L Kimura E Krieger J E Leite L C Majumder P Marins M Marques E R Melo A S Melo M B Mestriner C A Miracca E C Miranda D C Nascimento A L Nobrega F G Ojopi E P Pandolfi J R Pessoa L G Prevedel A C Rahal P Rainho C A Reis E M Ribeiro M L da Ros N de Sa R G Sales M M Sant anna S C dos Santos M L da Silva A M da Silva N P Silva W A Jr da Silveira R A Sousa J F Stecconi D Tsukumo F Valente V Soares F Moreira E S Nunes D N Correa R G Zalcberg H Carvalho A F Reis L F Brentani R R Simpson A J and de Souza S J 2001 Th
153. De plus m me lorsque des mutations sont identifi es la corr lation entre g notype et ph notype reste parfois difficile tablir avec parfois une h t rog n it ph notypique au sein d une m me famille voire d un m me individu C est notamment le cas des ichtyoses cong nitales autosomiques r cessives ARCI un groupe la fois g n tiquement et ph notypiquement h t rog ne constitu des ichtyoses lamellaires de PARCI li e l ichthyin et de l rythrodermie ichtyosiforme cong nitale s che Fischer 2009 Le manque de pr cision dans la d finition des signes cliniques ainsi que les difficult s pour tablir la nature causative des mutations identifi es dans les g nes TGM1 ABCA12 CYP4F22 NIPAL4 ALOXE3 et ALOX12B sans oublier que dans 22 des cas aucune mutation n est identifi e compliquent galement l tude de ces maladies 2 3 2 Le psoriasis Cette dermatose inflammatoire qui touche environ 2 de la population caucasienne est caract ris e par l apparition de plaques ryth mato squameuses de forme de taille et de localisation tr s variables Au niveau des l sions l piderme est hyperplasique Cette hyperprolif ration k ratinocytaire est associ e une disparition de la couche granuleuse une hyperk ratose et une parak ratose Les papilles dermiques sont plus allong es et des micro abc s polynucl aires sont souvent pr sents L infiltration de l piderme et du derme r
154. F Roskin KM Baertsch R Rosenbloom K Clawson H Green ED et dl Aligning multiple genomic sequences with the threaded blockset aligner Genome Res 2004 4 708 715 x h D a x n D n a Genome Biology 2007 8 R107 165 166 A large scale multi technique approach identifies 49 new players of human epidermal differentiation 2009 soumis Nicolas R Mattiuzzo Eve Toulza Nathalie Jonca Guy Serre and Marina Guerrin 167 R sum La formation de la couche corn e l ment indispensable la barri re pidermique requiert la mise en oeuvre d un programme de diff renciation extr mement complexe et finement r gul culminant au niveau de la couche granuleuse derni re assise de cellules vivantes L tude du transcriptome du k ratinocyte granuleux constitue donc une cible prioritaire pour une meilleure connaissance de ce tissu Pourtant la plupart des tudes publi es n ont pas t men es in vivo de plus seule une poign e de facteurs de transcription requis pour la fonction barri re a t identifi e Au moyen d une m thode de dissociation des cellules partir d piderme humain nous avons tudi la r gulation de l expression g nique au cours de la diff renciation in vivo Plusieurs approches grande chelle ont t combin es pour identifier des candidats puces ADN pang nomiques banque d EST de k ratinocytes granuleux analyses bioinformatiques des p
155. FP fix 5 on attend ainsi environ 28 faux et 541 vrais positifs sur les 569 g nes accept s plus simple pour d terminer le seuil ad quat consiste classer les m g nes potentiellement r gul s par p value croissante p lt lt pi lt lt Pm et d terminer le rang i au del duquel la p value d passe la valeur q x i m o q est la proportion maximale souhait e de faux positifs figure 14 Si le calcul de la p value ou du FDR est adapt la recherche de g nes diff rentiellement exprim s la classification non supervis e des donn es est une approche alternative fr quemment utilis e en canc rologie pour identifier des signatures sp cifiques de certaines tumeurs cf partie pr c dente La classification non supervis e consiste d terminer des classes groupes de g nes co exprim s dans les diff rents chantillons analys s de sorte que les diff rences soient minimales au sein d une classe et maximales entre les classes La plus couramment utilis e est la classification hi rarchique qui consiste g n rer une suite de classes emboit es et repr sent es sous la forme d un dendrogramme repr sentation en arbre Elle requiert de calculer une distance entre les g nes et chantillons afin de regrouper les plus similaires dans une classe et de choisir une r gle d agglom ration distance inter groupes pour hi rarchiser ces classes Les distances de similarit les plus utilis
156. G Guo Z Lyle S Ginter EK et al Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH Science 2006 314 982 985 64 Liu Z Yang X Tan F Cullion K Thiele Cj Molecular cloning and characterization of human Castor a novel human gene upregulated during cell differentiation Biochem Biophys Res Commun 2006 344 834 844 65 Olson MV When less is more gene loss as an engine of evo lutionary change Am J Hum Genet 1999 64 1 8 23 66 Leerkes MR Caballero OL Mackay A Torloni H O Hare MJ Simpson AJ de Souza SJ In silico comparison of the transcriptomeder ived from purified normal breast cells and breast tumor cell lines reveals candidate upregulated genes in breast tumor cells Genomics 2002 79 257 265 67 RepeatMasker Open 3 0 http www repeatmasker org 68 PHRAP Software http www phrap org 69 Altschul SF Madden TL Schaffer AA Zhang J Zhang Z Miller W Lip man DJ Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 1997 25 3389 3402 70 Rozen S Skaletsky H Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers Methods Mol Biol 2000 132 365 386 71 Corpet F Multiple sequence alignment with hierarchical clustering Nudeic Acids Res 1988 16 10881 10890 72 TreeTop Phylogenetic Tree Prediction http www genebee msu su services phtree_reduced html 73 Blanchette M Kent VYJ Riemer C Elnitski L Smit A
157. GGAAACCTGAGCAGA AGTTCAGACAACCAGATTCTTGC CTTGGGAGCAAAGCCTCTC AGCTGCTTGAATGCTTCGTT TGCAGGTTCTGACCACAGAG ACTGAGGTGGTCGTCTTGCT AGAGCTTCTGGCACTGGAAA ATGGCCAAACTCTTCAGCAG TT GCCACCACCATAGTTGAA TCCATGAGCCCGAACTTTTA TATTGGTCAGGCAAGGGAAG AGACAGGCATGTCGTTGCAG GTI GGTACCCCTGTTGTTGG CTCTCTGTICCCCCAGGAC GTATCTGGCTGCTIGGAGGA GCTAAAAGCCCGTCAGCTC GCTACTGCCTCCGGICTIC ACTGACATCCAGGGCGATAC CAGTGTCCCGAAGGAGAAAG TGAATCTTCTTCGGCATGGT AAGGCCGCTGAGTATAGCTG TCACCGACACTGGGTCCT ACGGAGTCCCCAGACCTC TTAGATGGGCGTCCTTCATC GATGGTTTCCATGCACACTG TGGGTTGGTCATGCTCACTA TTCAGCGAGTGGAATTTGGT GCATCTGGGTCACAGACAAAT TCACATTCAGACCTCCACCA ACGAGGGACTGATTTTCTGGT 199 FART FBXO38 FGFRTOP2 FLG FLG2 FLVCRT FOXC1 FOXJ3 FOXK2 FOXL1 FOXPT GATA4 GJES GMIP GRLFI HDACE HIVEP3 HLTF HOPX HOXAG HSPC159 HYAL2 ING4 INSMT lQGAP3 IRF 2 IRF ISL1 ITPKC IVL KLF10 KLF13 KLF14 KLF4 KLKS KLK KRT23 LDE1 LLGLT LOCS 226 LOR LRBA MAFK MAGED1 MAML1 MAP3KFIPT MAPT MAX MAX MAZ ME01 MBD2 MBD3 MBTPS1 TGAGCCTCTGCGTCTAGGAT TGACCAATTGTGGAATCACAG TGGGAATCCAGCAAGAAAAC TGAACAAGGTTCACATTTATTGC TCCAGTTCTGAAGAACCCAGAT ATTGGCTCAAGGAAAGCTCA AAGAAGGAAGGCGAGAGGAG CAGGTTCAGTTTGCCGATCT TGGGTCTATCCTCCAGAACG TTCCACGACTGGGTTCTACC GGCAGATCTCCTATGCAAGC GTGTCCCAGACGTTCTCAGTC CAGGAGAGCCCTGAGGAGTA ACCACAGTACCCTGGAGCAG CTGTCGTGACTCCAGAGAAGC CACCGAATCCAACAAATCCT CACAGCAAAAAGTGCCAAGA CATGGCCCAAAAGAAAAGAG TCAACAAGGTCGACAAGCAC CCCATCGATCCCAATAACC ATTCCAGACCAGCCATTCAG A
158. GGACTGTGTGGGTACTCTGCT TGCCCCAGATGGCAAA TCCGACTAACAGCTGCCTTAATA CTCCAATCAAACCTCGGAAA CTAATAGTAACACAGAGGATTCAGCAGT ATGTGGAGGAGATGGACTGG CAGCCATGGAGTCTTCCACT ACCACCCATAACAAGACCACA CCTCATTTGAAACCGTCCAG CTGAGCGTGAAGAGCTTGG CACAGAGGGGAACAGATTTCA GAATTCACCCCCACTGAAAA AAGATGAATCCAGGTGATGTGA GCCCCAAACAGGAACACATA CGGAGCCAGATTTGTACAGG GACCGGATTAACGAGTGCAT TCCCCATTTTACCAGTGTGC AGGAAGCTGTCACGAAGGAG CATGGAGCTTCTGTCTGCTG AGAGGATGCTTTCCTCGTCA TCACCTTCCCCATTGAGTTC ACTGCTGCTGGCTGGTCT GTGAGAGCGTTCCAGAACTTG TCACACAACCTTCACCCTCA GCCAATGTGACTGCTTTCATT GTAGTGAACGGGGAAATTGAAG GCGATCCTGCAGCTATGTC TTT GGGGCAAGTTTATACGG GAGCTGAGTGAGGAGCTGGT TCTGCTGCCTGGTCOCTTGAG ACGGAAAATTGGAAGCTGTG ATGGGATCAAACCTGACAGC GATGGGTTCGTCCTCAAGAA AGCCAAAATCAGAGCTGGAA TGTCCGTGAAAGAGCAGATG GGAGAGTGGTCAGGGAAACA CAGACGGTGAACCCCTACAC GACACGGAGCAGATGCTGT AAATGCAAGATCTGGGAGGA TIGCAGTGTGTGGGTTCATT TGACCGCAGAGTCTTTTCCT CAAGCTCAACGACCTCATCA GGCATGGAGTTCAAGCTGAT CCTGAGTGCACAGCCATAGA CCTTCAGCAAAAGGAAGACG Reverse primer GTIGCCTGTTICATCTIGGTIAGG GCCAAAAAGAGAGCGGTACA GICCTGGCTCATGATCICGT AGCTGTTITGGCCTTCATTGT GGAATTTCAAATCGCTCCAA GCCTTCAAAATGCCAGTGA ACTTTGGGTGCAGAAATTGG CAGTCATGGCCTCTICTICTG CATAAAGGCATTTGGCAAGG AGGCTCAGGGATGCTTITTCT GTGGCCCTICAGCTTIGTAAA ACTGGTCCTCTCCAGGGTTT GGAGTGACATGGCTGTAGCA CTGGTGTCCATCACCTGACA CTTCCAGGACCTCCTCTCCT CGGTCCCGCTGTAGAATTT GGGCTCGAACCAATAACTCA AGCAAGCAAGCAGAATTTGG TTTCCATTCTCCACCCTCTG TAGCTGCTGGGCTCATCTTT CTGGCTTTTGTGACGGAAAT TGTCT
159. MIQUE IN VITRO 130 3 2 3 ETUDES DE LA DIFFERENCIATION EPIDERMIQUE IN VIVO 133 II RESULTATS EXPERIMENTAUX sssescsssossecccssossesesssoosee 139 Large scale identification of human genes implicated in epidermal D irier NCH ON esseeri a AE aA Ra 141 A large scale multi technique approach identifies 49 new players of human epidermal differentiation cccccccscsscsscsscsscsscsscsscssccccsccscces 167 11 HI DISCUSSION werscsiiescincsiiccucncisesececsteceuiedaveecteseteecsesesdacseseuews 207 Technique des ORES DES vasssacsvasscenaccawcwscsesscaeacaccewscers instants 205 Puces A ADN orror renee eines ar ceunssaauacssswsueconsausenesseusessensaails 208 POR Qua nui ati 6 senior asc coattawevssacucecesesestecwisegecsencewssecscuonceeses 215 Nouveaux acteurs de la diff renciation ccccecsscsccsscsscsscssccccscceees 218 Facteurs de rANSCFIDHON icnssscceroadcesdsdueseusmncsccseeessassuseedacsensesseawees 228 Annexe 1 Stratification pidermique cccccscsscssccsccsscsscsscccccsscesecs 235 Annexe 2 le s quen age nouvelle g n ration ssssssssssssesesesseesee 235 Annexe 2 le s quen age nouvelle g n ration ssssssssssssesseseseeesee 237 Annexe 3 Vers l int gration des donn es d expression de la connaissance la mod lisation cccccccccccccccccccccccccccsccccscccccccccccoeccs 245 Annexe4 R le de la corn odesmosine in vivo mod les murin
160. O repeat domain 69 MAP domain containing 1 solute carrier family 39 zinc transporter member 10 gap junction protein beta 3 31kDa low density lipoprotein receptor class A domain containing 2 pleckstrin homology domain containing family A phosphoinositide binding specific member 2 family with sequence similarity 125 member A leukocyte immunoglobulin like receptor subfamily B with TM and ITIM domains member 4 acyl CoA synthetase long chain family member 4 RAB B member RAS oncogene family potassium voltage gated channel subfamily H eag related member 6 major histocompatibility complex class Il DOQ beta 1 UbiA prenyltransferase domain containing 1 ribokinase spermatogenesis associated 21 inositol 1 4 5 trisphosphate 3 kinase C 195 PPFIA3 HIST1H4B C13orf33 TIMEM160 LRP6 DOCK2 PRDM15 MVD MGC39900 C15orf21 AKO96857 TMEM163 CDKL3 MYO15B LOC401152 BHLHB8 CYLC2 AAT76719 MAN1B1 CDC42BPB LOC134111 TBC1DSB MRPL28 FLJ14100 BCO36424 ATPEVOA 1 C20orf77 EEF1E1 COL17A1 HS6ST3 KRT5 hypothetical gene CG012 chromosome 17 open reading frame 37 anaphase promoting complex subunit 2 odz odd Oz ten m homolog 1 Drosaphila hect homologous to the E6 AP UBE3A carboxyl terminus domain and RCC1 CHC1 like domain 1 origin recognition complex subunit 6 like yeast NLR family member X1 protein O linked mannose beta 2 N acetylglucosaminyliransferase transmembrane protein 1066 GEM
161. OHT 0 02 mg in 50 pl ethanol on the shaved flank for five consecutive days For skin grafting the dorsal skin harvested from KO s 12 or WT pups was grafted onto the back interscapular region of T to amp week old Ri NMRI nude mice Janvier France using the skin flap technique Barrandon et al 1988 We removed the flap 2 weeks after grafting to bring the grafi into an aerial environment and siared analysis 2 weeks later Primary antibodies Rabbit polyclonal antibodies against K10 K flagerin involucrin lonenn all from Covance Research Products Dsgl Santa Cruz Biotechnology mouse mAb MAB1501 against actin Chemicon Intemational rat mAb against CD3 clone CD3 12 Serotec and mi mAb against F480 clone BMS Serotec were diluted following the manufacturers recommendations Mouse mAb F28 27 raised against human CDSN crossreaching wilh mouse CDSN was used as previously desenbed Serre et al 1991 Epidermal protein extraction and western blot analysis Frozen tissues were homogenized in extraction buffer 40 mM Tris HCI 10 mM EDTA 3 M urea 0 25 mM PMSF pH 7 4 with 0 1 v v protease inhibitor cocktail Sigma by the FastPrep system MP Biomedicals Equal quantities of protein were separated by 12 3 SDS PAGE and transferred to nitrocellulose membrane The blots were probed with pimary antibodies and HRP conjugated secondary antibodies Invitrogen Detection was performed with ECL reagent Amersham Pharmacia Bi
162. PK NLPHNSLAFLLADSGYDYHLGNSRGNTHSRKHLKLSPKSPEYHAFSLDENAKYDLPAT INE TLIEKTGQKRLY YGHSAGTTIAFIAFSTNPELAKKIKIFFALAPYYTYK LIPF NLPHHSLAFILADAGYDYHLGHSRGNTHARRHLYYSPDSVEFHAFSFDEHAKYDLPATIDFIYKKTGQKQLHF YGHSAGTTIGF TAF STNPSLAKRIKTF YALAPYATYK LIPN HYANGSLGFLLADAGYDYHHGHSRGNTHSRRHKTLSETDEKFHAFSFDEHAKYDLPGYIDFIYNKTGQEKLYFIGHSEGTTIGFVAFSTHPELAQRIKHNFALGPTISFK LIPJ NLPHNSLGFILADAGYDYHHGNSRGNTHSRKHLYLETSSKEFHAFSFDEHAKYDLPASIDFTYKQTROQEEIFF YGHSAGTTIGFITFSTISKIAERIKIFFALAPYFSTK Consensus N1pinSL gF iLADAGZDYNSGNSRGNEMSRKHKtLs eFWAFSZDEMAKADLPa T Fiv kT ge 46 GhSRGTTiGF aFSt pelA riKnfFALaPy s k 221 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 mm t t lt mm mm mn t mm l LIPA FCTSPHAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPOSAFLKHLGTHYCTHYILKELCGNLCFLLEGFNERNLHHSRVOYYTTHSPAGTSYONHLHHSQAYKFQOKFQOAFDHGSSAKNY LIPH HAKSPGTKFLLLPDHHIKGLFGKKEFLYOTRFLROLYTYLCGQYILDOICSNTIHLLLGGFNTHNHNHSRASYYARATLAGTSYONILHHSQAYNSGELRAFDNGSETKNL LIPK YTOSPHKKLTTLSRRYYKYLEFGDKHFHPATLFDQFIATKYCHRKLFRRICSNELFTLSGFDPQOHLHHSRLOYYLSHNHPAGTSYONHLHHRQAYHSGQLQAFDHGKHSDONH LIPF Y TKSLINKLRFYPQSLFKFIFGDKIF YPHNFFDQFLATEYCSREHLHLLESNALFIICGFOSKNHFAHTSRLOYYLSHNPAGTSYONHFENTORYKSGKFOAYDHGSPYONR LIPH YPTGIFTRFFLLPHSITKAVEGTEKGFFLEDKKTKIASTKICHHKILHLICSEFHSLHAGSNKENHNQSRHDV YHSHAPTSSSVHNILHIKOL YHSDEFRAYOUGRKDADNH LIPJ YLKSPLIRHTYKHKSIYHAFSGHKDFLPKTSFKKFIGSKLCPLOIFDKICLNILFHHFGYDPKNLHHSRLOYYFSHNPAGTSYQHHLHHSQLLHSTHLKAYOHGSPOLHL Consensus
163. Paromov V M and Morton R E 2003 Lipid transfer inhibitor protein defines the participation of high density lipoprotein subfractions in lipid transfer reactions mediated by cholesterol ester transfer protein CETP J Biol Chem 278 40859 40866 Patel S X1 Z F Seo E Y McGaughey D and Segre J A 2006 KIf4 and corticosteroids activate an overlapping set of transcriptional targets to accelerate in utero epidermal barrier acquisition Proc Natl Acad Sci U S A 103 18668 18673 Pease A C Solas D Sullivan E J Cronin M T Holmes C P and Fodor S P 1994 Light generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis Proc Natl Acad Sci U S A 91 5022 5026 Pellegrini G Dellambra E Golisano O Martinelli E Fantozzi I Bondanza S Ponzin D McKeon F and De Luca M 2001 p63 identifies keratinocyte stem cells Proc Natl Acad Sci U S A 98 3156 3161 Pillai S Bikle D D Mancianti M L Cline P and Hincenbergs M 1990 Calcium regulation of growth and differentiation of normal human keratinocytes modulation of differentiation competence by stages of growth and extracellular calcium J Cell Physiol 143 294 302 Pillai S Bikle D D Su M J Ratnam A and Abe J 1995 1 25 Dihydroxyvitamin D3 upregulates the phosphatidylinositol signaling pathway in human keratinocytes by increasing phospholipase C levels J Clin Invest 96 602 609 Potten C S 1974 The epidermal proliferative unit
164. Polycomb group ring finger CI 7orf6 100 Chromosome 17 open reading frame 61 KIAA 1853 100 Kiaal 853 C22orf23 100 Chromosome 22 open reading frame 23 Genome Biology 2007 8 R107 153 R107 12 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Table 7 Comparison of gene expression in the T4 and TI cell fractions by real time PCR No of ORESTES Gene symbol Full name 56 FLG2 Filaggrin 2 ifapsoriasin 9 GSDM Gasdermin 13 ASAH3 N acylsphingosine amidohydrolase 3 2 ILIF7 Interleukin family member 7 13 ELMOD ELMO CED 12 domain containing 0 LIPL4 LIPN Lipase like ab hydrolase domain containing 4 LIPL3 LIPM Lipase like ab hydrolase domain containing 3 3 C20orf95 Chromosome 20 open reading frame 95 WFDCI 2 WAP four disulfide core domain 12 WAP2 LIPL2 LIPK Lipase like ab hydrolase domain containing 2 12 SMPD3 Sphingomyelin phosphodiesterase 3 10 LOC440449 Similar to WDNMI homolog LOC645638 99 SERPINAI 2 Serpin peptidase inhibitor clade A member 12 PII 26 serine protease 5 PSORSI C2 Psoriasis susceptibility candidate 2 l C3orf52 Chromosome 3 open reading frame 52 2 CLDN23 Claudin 23 PNPLAI Patatin like phospholipase domain containing 10 THEMS Thioesterase superfamily member 5 3 ABHD9 Abhydrolase domain containing 9 2 TMEMI 6H Transmembrane protein 16H 6 SERPINBI 2 Serpin peptidase inhibitor clade B member 12 l PLEKHN I Pleckstrin homology domain containing
165. Q Hachem J P Crumrine D Mauro T M Elias P M and Feingold K R 2009 Topical peroxisome proliferator activated receptor activators accelerate postnatal stratum corneum acidification J Invest Dermatol 129 365 374 Fodor S P Rava R P Huang X C Pease A C Holmes C P and Adams C L 1993 Multiplexed biochemical assays with biological chips Nature 364 555 556 Forslind B 1986 Particle probe analysis in the study of skin physiology Scan Electron Microsc 1007 1014 Franco B Meroni G Parenti G Levilliers J Bernard L Gebbia M Cox L Maroteaux P Sheffield L Rappold G A and et al 1995 A cluster of sulfatase genes on Xp22 3 mutations in chondrodysplasia punctata CDPX and implications for warfarin embryopathy Cell 81 15 25 Frisch S M and Francis H 1994 Disruption of epithelial cell matrix interactions induces apoptosis J Cell Biol 124 619 626 Fuchs E and Weber K 1994 Intermediate filaments structure dynamics function and disease Annu Rev Biochem 63 345 382 Furuse M Hata M Furuse K Yoshida Y Haratake A Sugitani Y Noda T Kubo A and Tsukita S 2002 Claudin based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier a lesson from claudin 1 deficient mice J Cell Biol 156 1099 1111 Gallegos A M Atshaves B P Storey S M Starodub O Petrescu A D Huang H McIntosh A L Martin G G Chao H Kier A B and Schroeder F
166. QROQOOCPRORADQOOVKOFCOPPP 4X DOKCE ROQA SKSKOR MSYQOQOCKOPCOPPPVCPT QOCOOK PPVTPSPPCg K PPKSK I MEYQOQOOCKOPCOPPRPVCPT GOCOGE PPVTPSPPCOPEK PPKEKS ARRIC MEYOO OCKGPCOPP2vc 4 QOCDOR BL VIPSPPCOPKCPPESK type SRR MSYQOQOCKOPCOQOPPPVCPT COCOON PPVTPSPPCOPKCPPKSK SERRE HSYQIQQCK PCOPPIVCPT QOCQQRCPrVTPSPrcorucrrusx RR2E ME YOQQOCKOBCOBESyce QOCOOKCPPVIPSPPCOPKCPPKSK MSYQOQRICKOPCOPEPVCPT PPOQORCPEY OP r PECORE PPESEK Figure 46 Organisation des prot ines SPRR Cabral et al 2001b Les membres de la famille des SPRR se r partissent en quatre familles initialement d finies en fonction de leur homologie de s quence SPRR1 deux membres SPRR1A et SPRRiB SPRR2 six membres chez l homme SPRR2A 2G SPRR2C tant un pseudog ne SPRR3 un seul membre Gibbs et al 1993 et SPRR4 un seul membre Cabral et al 2001a Ces petites prot ines 6 a 25 kDa compos es de courtes r p titions sont class es en 2 types selon l homologie de leurs domaines terminaux et le nombre d acides amin s de leurs r p titions figure 46 Les SPRR de type I comprennent des r p titions de 8 aa 6 pour SPRR1 16 pour SPRR3 et 4 pour SPRR4 et les SPRR de type II comprennent 3 r p titions de 9 aa SPRR2A G Cabral et al 2001b Cette tude a galement montr que les SPRR2G et SPRR4 sont pr f rentiellement exprim s dans le k ratinocyte granuleux alors que les autres membres sont aussi d tect s dans d autres pi
167. RESTES Genomatix ORESTES Microarrays ORESTES microarrays Microarrays ORESTES ORESTES Genomatix ORESTES microarrays Genomatix ORESTES microarrays ORESTES Genomatix pt ORESTES microarrays Genomatix GK BK ratio 4 9 41 41 2 1 2 7 5 2 3 2 5 6 2 1 6 9 9 1 2 4 2 7 2 8 2 2 22 7 24 43 2 1 23 1 15 6 2 6 59 9 3 4 41 3 745 10 4 3 1 2 1 6 1 5 4 3 6 4 8 76 9 2 3 TA 4 3 7 5 8 1 5 5 4 5 64 46 8 4 16 2 26 4 66 9 183 Table 2 Genes expressed equally in the basal and granular layers GK BK expression ratios determined by qRT PCR Gene symbol Full name alias previous name Le UniGene en ol Se BK AATF apoptosis antagonizing transcription factor 605 ORESTES 1 ACBD6 acyl Coenzyme A binding domain containing 6 200 Microarrays 1 ACSL4 acyl CoA synthetase long chain family member 4 FACL4 MRX63 MRX68 392 Microarrays 0 9 AQR aquarius homolog mouse 288 ORESTES 1 5 ARID2 AT rich interactive domain 2 ARID RFX like 206 ORESTES Genomatix 1 1 ARID5B AT rich interactive domain 5B MRF 1 like 285 ORESTES Genomatix 0 6 ARSD arylsulfatase D 323 Microarrays 1 4 ATF5 activating transcription factor 5 479 Genomatix 0 5 ATF6B activating transcription factor 6 beta 217 ORESTES 1 1 AVEN apoptosis caspase activation inhibitor 77 ORESTES 1 3 BCL6 B cell CLL lymphoma 6 zinc finger protein 51 398 Genomatix 0 9 BPTF bromodomain PHD finger transcription factor FALZ 455 ORESTES 1 3 BRF1 BRF1 homol
168. RNA and that snoRNA retroposons can indeed be expressed when located in an intron of a new host gene in the sense orientation Therefore our ORESTES dataset included transcripts from retrogenes originating either from spliced pre mRNAs or from an intron encoded snoRNA gene Non protein coding genes We obtained two long spliced ORESTES highly similar to the BCo70486 mRNA form of the GAS5 gene a non protein cod ing gene that belongs to the growth arrest specific family but is disrupted in its ORF by a premature stop codon The GAS5 Genome Biology 2007 8 R107 147 D h D Q D n D ey n u R107 6 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Table 2 http genomebiology com 2007 8 6 R107 Representative sample of genes with the highest number of ORESTES No of ORESTES Gene symbol Ubiquitously expressed genes with a high number of UniGene ESTs 142 RPS8 115 EEFIAI 77 HLA B 71 RPL3 62 NCL 55 RPL28 55 RPL7A 5I RPSA 50 PABPCI 34 RPSI 8 Known epidermis specific genes 402 KRTI 217 DMKN 140 LEP7 100 FLG 71 KRT2A 62 SPRR2E 6l CASPI 4 59 CDSN 56 hKPRP 54 PKP 32 SBSN 30 DSGI Genes with unknown function 193 TSPANS 127 DUOX2 99 TMEMI 4C 99 SERPINAI 2 66 SLC22A5 56 FLG2 4 C7orf24 No of UniGene ESTs Full name alias 3 382 Ribosomal protein S8 29 374 Eukaryotic translation elongation factor alpha 4 536 Major histocompatibility complex class l
169. SBSN KLK8 TGM3 ABCA 1 2 PADI DSGI GJB3 CALML3 SASpase KLK7 SCCE A2MLI CST6 SULT2B KLKI I HAL EVPL CDSN PDZKI IP TGMI SERPINB8 SCEL No of UniGene ESTs D D T0 0 RO I NNa unnn www N wo 0 0 0 OO D D D UM OO A www A A A RW wen NN Ww 0 ONN OO ww 0 O0 OO UT AUAU O0 OO OU D DO D OU Full name alias Late cornified envelope IF Late cornified envelope 2C Chromosome open reading frame 46 xp 33 Late cornified envelope 2A Late cornified envelope 5A Late cornified envelope IA Peptidoglycan recognition protein 3 Late cornified envelope IC Filaggrin Late envelope protein 7 Repetin Late cornified envelope 2B Human keratinocyte proline rich protein Loricrin Keratin 2A Chromosome open reading frame 42 NICE 1 Transglutaminase 5 Desmocollin Keratin IB Caspase 4 Cornifelin Calmodulin like 5 Arachidonate lipoxygenase 3 Arachidonate 12 lipoxygenase 12R type Small proline rich protein 2E Involucrin Epiplakin POU domain class 2 transcription factor 3 oct I 1 Ichthyin Suprabasin Kallikrein 8 neuropsin ovasin Transglutaminase 3 ATP binding cassette sub family A ABC 1 member 12 Peptidylarginine deiminase type Desmoglein Gap junction protein beta 3 connexin 31 Calmodulin like 3 Skin aspartic protease Kallikrein 7 Stratum corneum chymotrypticenzyme Alpha 2 macroglobulin like Cystatin E M Sulfotransferase family cytosolic
170. SLC30A6 SLC35B2 SLTM SSRP1 TCFL5 TCFL5 TFAP2E TFCP2L1 TLE1 TRIM29 TSPYL5 UBP1 VWA1 ZBTB7B ZEB2 ZFHX3 ZFPM1 ZHX2 ZNF143 ZNF230 ZNF335 ZNF396 based on preliminary microarrays analysis FDR gt 0 05 Names of genes encoding transcription POU class 6 homeobox 1 BRN5 PR domain containing 15 ZNF298 selenocysteine lyase sterol carrier protein 2 SCP2 isoform sterol carrier protein 2 SCPx isoform seizure related 6 homolog mouse like 2 superkiller viralicidic activity 2 like solute carrier family 30 zinc transporter member 6 solute carrier family 35 member B2 3 phosphoadenosine 5 phosphosulfate transporter SAFB like transcription modulator structure specific recognition protein 1 transcription factor like 5 basic helix loop helix medial last exon transcription factor like 5 basic helix loop helix distal last exon activating enhancer binding protein 2 epsilon transcription factor CP2 like protein 1 transducin like enhancer of split 1 E sp1 homolog Drosophila tripartite motif containing 29 ATDC testis specific Y encoded like protein 5 upstream binding protein 1 LBP 1a von Willebrand factor A domain containing 1 WARP zinc finger and BTB domain containing 7B c Krox zinc finger E box binding homeobox 2 ZFHX1B zinc finger homeobox 3 ATBF1 zinc finger protein multitype 1 FOG1 zinc fingers and homeoboxes protein 2 zinc finger protein 143 STAF zinc finger protein 230 zin
171. Sayama et al 2006 Toutefois le r le de TAB1 dans la signalisation de TAK1 est peut tre accessoire Shim et al 2005 Le g ne codant la prot ine CARD14 Caspase Recruitment Domain family member 14 est galement surexprim au cours de la diff renciation k ratinocytaire avec un facteur x8 Toulza et al 2007 Cette prot ine est capable en r ponse a divers stimuli dont l activation des PKC de former un complexe multiprot ique avec BCL10 TRAF6 TAKi et TAB1 ou TAB2 Ce complexe active ensuite l IkappaB kinase et donc la signalisation de NF kB Bertin et al 2001 Facteurs de transcription Le travail initial de sequencage des ORESTEs a permis d identifier un nombre important de facteurs de transcription pour la plupart jamais d crits dans l piderme Le but de cette premi re tude tant de dresser un inventaire des g nes exprim s dans les k ratinocytes granuleux un nombre limit de g nes a t test par PCR quantitative pour valuer le profil d expression des g nes identifi s La priorit a t donn e aux g nes les moins d crits dans les banques de s quences donc les plus susceptibles d tre sp cifiques de la diff renciation pidermique et surtout aux 228 genes les plus facilement reliable la fonction barri re lipases et autres g nes du m tabolisme des lipides prot ines structurales prot ases et inhibiteurs de prot ases etc Un seul facteur de transcription CASZ1 figure p
172. Serre G Nothen M M and Pras E 2003 Hypotrichosis simplex of the scalp is associated with nonsense mutations in CDSN encoding corneodesmosin Nat Genet 34 151 153 Levy V Lindon C Harfe B D and Morgan B A 2005 Distinct stem cell populations regenerate the follicle and interfollicular epidermis Dev Cell 9 855 861 Li A Simmons P J and Kaur P 1998 Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype Proc Natl Acad Sci U S A 95 3902 3907 Li Q Lu Q Estepa G and Verma I M 2005 Identification of 14 3 3sigma mutation causing cutaneous abnormality in repeated epilation mutant mouse Proc Natl Acad Sci U S A 102 15977 15982 271 Lin J C Wang W Y Chen K Y Wei Y H Liang W M Jan J S and Jiang R S 2004 Quantification of plasma Epstein Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma N Engl J Med 350 2461 2470 List K Szabo R Wertz P W Segre J Haudenschild C C Kim S Y and Bugge T H 2003 Loss of proteolytically processed filaggrin caused by epidermal deletion of Matriptase MT SP1 J Cell Biol 163 901 910 Litjens S H de Pereda J M and Sonnenberg A 2006 Current insights into the formation and breakdown of hemidesmosomes Trends Cell Biol 16 376 383 Liu Y Helms C Liao W Zaba L C Duan S Gardner J Wise C Miner A Malloy M J Pullinger C R Kane J P Saccone S Wort
173. Skin derived AntiLeukoProteinase galement d sign lafine deux prot ines de petite taille dont les spectres d inhibition sont compl mentaires Heinzel et al 1986 Wiedow et al 1990 SLPI pr sente une meilleure inhibition vis a vis des prot ases de la famille de la chymotrypsine telles que SCCE SKALP est au contraire plus efficace comme inhibiteur de prot ases de la famille de la trypsine telles que SCTE Alors que ces deux inhibiteurs sont tr s faiblement d tect s dans l piderme sain ils sont fortement surexprim s dans les couches diff renci es de l piderme psoriasique et lors de la cicatrisation Schalkwijk et al 1990 Ashcroft et al 2000 Un autre inhibiteur de prot ases la cystatine M E produit du g ne Cst6 inhibe l activit de plusieurs 70 prot ases aux cibles et localisations vari es notamment les cathepsines V et L Zeeuwen et al 2007 Des mutations nulles de Cst6 sont responsables chez la souris du ph notype ichq caract ris par des anomalies de la cornification et de la desquamation et une mortalit n onatale Zeeuwen et al 2002 Enfin LEKTI LymphoEpithelial Kazal Type related Inhibitor produit du g ne SPINKS Serine Protease INhibitor Kazal type 5 Magert et al 1999 joue un role crucial dans la r gulation de la desquamation Ainsi des mutations du g ne codant cet anti trypsine sont responsables du syndrome de Netherton Chavanas et al 2000 g nodermatose caract ris e pa
174. TCCCACACAGGGGAAAG CCCAAGGATGGATATCAGGA TGGGGCACAAGTTTTATGGT TTAGGCATTGGAGGAGCTGT TCAAAGGGACACCCACTAGG CTACCCAAGGATGTGGAGGA ATGCGGATGAGGTACACACC CCTCTACGTGGAGCTGCTG GAAGGACCAGCAGAAACGAG GATCCATGGGCGAGGTC CCCTCAAGCAGGGAATAGAAC AGACAACACCACCCCATGTT TGGTACCTGGCTACCTCCTG GCTCTAGGAGGCCTGTATTICA CACCATTGGCCTGAAAGATT GTGGATCACAGCACTATCCTGA ATAGCCCCTTTICCGGTATG AGGGAAGTGTGAGGAGAGCA AGGAGAATGCCAATGACAGC ATTCGCAAGAACAGCTICGT CATCCAGGAAAGACATGGAGA CGCATTTGCTGTGATGAGTT CCGCTACCAGGAGGTCAAC GAGTCTGCCAGCTCTTCCAG CCAGGAGGT TCCAACAAAAA TGAAGTCCTTGCTGATGACG ATCAAGTCGCAGTCCTGCTT ACCGCCTGGCTTCTATAGGT CCGGTGCTGCACATATACTTT GGAGCTCATAAGGTGGTGGA GGGCACTGTACAGGATTTCACT GTCCAGGAGCCACTGTAGGA CCTGTCAGAAGCACTGTCCTC GAAGCGGAATTCTCCATGC CATTCATCACTTGCCAGCAC CGGACAACTTCCTTCACCAT AATGCTGGGTGGAACAGAAG GCTGGCTGTGTAGGAGAAGC TGAGCAAGGACAAAGACGTG GAGCTAGAGGACGAGGCAGA GGAGGAAGTTGGGGCTAGAG TGACACGGATGTTGTTTGCT AAAAGCCAGCCCCTAAAGAG AATGGCTTCCTGTGTGCTG ATCCATGGAAGCCTCTGTTG TT TGGGGGTCTCTGAACAAC CCTGGAAGAACTTGCGGTAG GCTGTGCATGTCTICTGGACT CCCACAAACTCCATCAGGTT TCCTCTTCTGGCTTCTGCTT GAACAGTCACCCTGCTCCAT GCTGCGTGCAATTCATACTTT CGGGCTTCCAGATCCTTAG GGTCTGCCACGTTATCTGCT GCTGTGGGTGGACTCATTCT GCAAGTAGAATGGCAGCAAA GCAATCATTGGGGTGTTCTC TGATTGTGCAGTCAGCCTTC ACAGCTCCTCCAATGCCTAA CAAGCCTTGGGATCAATCAT TCTGAATTTGTCCAGGCTTTG ACTCAGGGTCCGTGGTAGTG GGGGAAGATTCTCCTCTTGG AATGGAAGCCAGTTGGTCTG CGGGCCCACTCATATACAAC CCATTTGTTCATTGGCATCTG ACTCTTTCCTGCAGCACACC TICTCCTCATTTGTTGA
175. V NANO 1 AAN9 Eds guns sautajoid sap uonoe Jed saqiyul 159 AUUOILIO E ap UOISSAIX9 SoANBISJI OAd Sa n 99 Sa eds 1ds 2002 jeje buer SUEC A1AIOUNRISY NP UONPIAUMIIJIP ap apes np UONDUO ua SINAPE QUAIAIP anua uoNHedwos Unp 9 gun L dV ULIOQUO eA najowoid np ayeurxoid uogas ey suep anbrajoidyynu axajdwios wm p uoneoydur SINODI JUOS JEWIXOIU qy as UN Ja RISIP dV AUS un AULION OAUL ap AUS NP 31921109 uorssaidxa g anessasau 153 C JV 4v9 d aus a uns ds pue guni qunl 4yo d 00 d 1 814 sunajory say quenqour anbiayoudnynu sxa duu09 ooed 2618 un amsip uoa sun Jed jo jeunxoid InajOWOId un Jed mzy 1853 SULIDNIOAUI ap 32u33 37 Lds 8002 Ie 1a YsUD L 814 gunr quo p d SUUANjOAU Oq UIEUIOp g SaUAJOId sap Ja dV SMAOE Sap SMAIL So Jo XNE Sa SUEP JOUE suy aun p 2uop puadap suusseyoid ap asayuAs eq maomwuoid 2 Ins un 2 ap ayuepuadap ganse JULSIUOTOJUL NO juepnwns ua juassi8e 90 19 LEIUNS HO NOd auwwop g sautajoid sap wed anne dq d aNs UN ms SO4 d UNs 9 SINUIPOINIOU JAL UONJLIAUI BIA S91 90U1E19Y 000 1818 buer sa mod ayoyioads amey aun a1ajuos my auuSSseloid e ap majououid np ajeunxoid uolsal eg gunr so4 9 unf 2 L dy euu56elyoi HE 9190 NOd Sulewop e saulajoig S99U8 9 9 SaJleJUaLULUOT senbduui uonduosuey ap sunajoe4 saug anbiuwapida uoneisuaiayip ej ap sauigzosd anod juepos saug emes de prot i 10n de l express lon dan
176. a acid Gba 0 04756 1 30 Mm 4628 sphingomyelin phosphodiesterase 1 acid Smpdi 0 00001 2 03 SLOM Mm23298 sphingomyelin phosphodiesterase 3 neutral Smpd3 0 00049 3 14 Mm 287187 sphingomyelin phosphodiesterase acid like 38 Smpdi3b 0 00196 2 54 Mm249342 7 dehydrocholesterol reductase Dher7 0 00446 1 66 Mm 5092 phospholipase A2 group IB pancreas receptor Pia2g1br 0 03762 1 50 Mm 331989 phospholipase A2 group IIF Pia2g2t 0 00301 2 21 Mm 100476 phospholipase A2 group lil Pia2g3 0 00257 2 14 Mm 87136 Phospholipase A2 group IVB cytosolic Pla2g4b 0 00097 222 S100a9 a Mm 180189 diacylglycerol O acyitransterase 2 Dgat2 0 00021 1 78 90 5M einnap fie Mm 282096 elongation of very long chain fatty acids like 1 Elovi1 0 00012 1 65 Mm 281887 RP ou 000102 213 Ke oo containing 1 S100a14 1153 Mm 246881 glycerophosphodiester phosphodiesterase domain Gapd3 lt 0 00001 2 88 ll containing 3 Figure 58 Inactivation du g ne Grhl3 Yu et al 2006 A Coupe histologique d piderme de souris sauvage ou grhl3 B Observation des d fauts structurels des k ratinosomes en microscopie lectronique C G nes diff rentiellement exprim s dans l piderme entre souris sauvage et grhl3 D G nes r gul s appartenant au Complexe de Diff renciation Epidermique 110 dans l piderme des souris Grhl3 Les auteurs ont caract ris le site consensus li par Grhl3 A TAAACCGGTTT AT A T A et pu montrer qu un
177. a human gastric lipase and expression of the enzyme in yeast Biochim Biophys Acta 1987 909 237 244 57 Ohman H Vahiquist A In vivo studies concerning a pH gradient in human stratum corneum and upper epidermis Acta Derm Venereol 1994 74 375 379 58 Hanson KM Behne MJ Barry NP Mauro TM Gratton E Clegg RM Two photon fluorescence lifetime imaging of the skin stra tum corneum pH gradient Biophys J 2002 83 1682 1690 59 Fluhr JW Mao Qiang M Brown BE Wertz PW Crumrine D Sund berg JP Feingold KR Elias PM Glycerol regulates stratum cor neum hydration in sebaceous gland deficient asebia mice Invest Dermatol 2003 120 728 737 60 Norlen L Nicander Lundh Rozell B Ollmar S Forslind B Inter and intra individual differences in human stratum corneum lipid content related to physical parameters of skin barrier function in vivo Invest Dermatol 1999 112 72 77 61 Menon GK Grayson S Elias PM Cytochemical and biochemical localization of lipase and sphingomyelinase activity in mam malian epidermis Invest Dermatol 1986 86 59 1 597 62 Lefevre C Jobard F Caux F Bouadjar B Karaduman A Heilig R Lakh dar H Wollenberg A Verret JL Weissenbach J et al Mutations in CGI 58 the gene encoding a new protein of the esterase lipase thioesterase subfamily in Chanarin Dorfman syndrome Am J Hum Genet 2001 69 1002 1012 63 Kazantseva A Goltsov A Zinchenko R Grigorenko AP Abrukova AV Moliaka YK Kirillov A
178. a compr hension des m canismes complexes mis en jeu dans ce r seau de r gulation g nique tant dans le cadre physiologique que pour certaines pathologies caract ris es par une alt ration de la diff renciation comme dans le cas du psoriasis ou des ichthyoses ABSTRACT The barrier function of the epidermis is provided by its outermost part the cornified layer formed by corneocytes strongly interconnected dead cells surrounded by a lipid rich extracellular environment A complex programmed cell death named cornification turns the last living cells granular keratinocytes into dead corneocytes devoid of transcriptional and translational activity Since all the constituents of corneocytes as well as the enzymes regulating their release leading to the desquamation are produced by granular keratinocytes they do not only represent the last step of epidermal differentiation but also its climax Very few large scale studies have been performed on human epidermis and until now only four transcription factors required for the barrier function were described The present work combines several large scale techniques in order to identify new genes especially transcription factor TF coding genes potentially involved in the last step of epidermal differentiation Based on a purification process using iterative trypsinizations of chilled epidermis fragments we recovered cell fractions enriched in keratinocytes from various differentiation states
179. a diff renciation pr sent s dans le second article 9 proviennent des ORESTEs 19 des puces pang nomiques 6 de l analyse bioinformatique et 1 de l analyse bibliographique tandis que seulement 8 sont issus la fois des ORESTEs et des puces et 6 des ORESTEs et de l analyse bioinformatique La redondance entre les diff rentes bases apparait donc faible 28 6 ce qui est galement confirm par la confrontation des donn es d ORESTEs et de puces sur les 3387 et 10824 g nes identifi s respectivement seuls 1930 sont en commun en plus des 150 ORESTEs sans sonde correspondante sur les puces soit une redondance de 60 ou 18 selon la technique consid r e Combiner plusieurs techniques compl mentaires permet galement de faire une estimation du nombre de g nes exprim s dans l piderme Toutes couches confondues les diff rentes techniques ont permis d identifier environ 12300 g nes potentiellement exprim s dont 3466 avec certitude ORESTES et ou PCRq s quen age des amplicons De nombreuses tudes grande chelle ne rendent disponible que le nombre de g nes consid r s comme diff rentiellement exprim s et non le total des g nes d tect s Seule l tude r alis e au moyen de puces pang nomiques sur de l piderme murin April and Barsh 2006 cite le chiffre de 16715 g nes d tect s On peut donc estimer que le nombre de g nes exprim s dans l piderme humain ou murin se situe aux alentours de 14500
180. abilit des donn es de puces a pu tre diminu e par la variabilit inter chantillons li e a la fois aux diff rences inter individuelles et aux fluctuations des niveaux d enrichissement des fractions T1 et T4 en k ratinocytes basaux et granuleux respectivement Toutefois cette variabilit concerne essentiellement des g nes qui ont une p value tr s lev e au test t de Student or plusieurs ratios de g nes avec une p value largement inf rieure au seuil de 0 05 ou m me 0 01 n ont pu tre valid s par la PCRq L explication la plus plausible reste donc celle de quantifications biais es de fa on reproductible par des hybridations crois es La sp cificit in silico de certaines des sondes concern es semblant correcte il est probable que le probl me vienne en partie d une stringence trop faible lors de l hybridation A ce jour seuls quelques articles pr sentent des donn es issues des puces du RNG Moreilhon et al 2005 Chalabi et al 2007 Lyons et al 2007 ce qui est faible compar aux 3500 puces et 100 projets concern s selon les seuls chiffres de 2006 Le Brigand et al 2006 Plusieurs publications ne concernent des versions fa on ne contenant que 1700 sondes Hofman et al 2007 Puissegur et al 2007 de plus les r sultats ne sont parfois pas pr sent s Colell et al 2007 Une seule tude pr sente des r sultats valid s par une autre m thode PCR quantitative Doghman et al 2007 Ceci ren
181. aires Ca2 d pendantes assurant la jonction intercellulaire des desmosomes se divisent en deux familles les desmocollines DSC1 DSC2 et DSC3 et les desmogl ines DSG1 DSG2 DSG3 et DSG4 organis es en locus sur le chromosome 18 figure 47 Le niveau d expression de ces prot ines est li au stade de diff renciation k ratinocytaire figure 48 L expression de DSG2 et DSC2 est restreinte la couche basale DSG3 et DSC3 92 Couche corn e Couche X Dsct Dsg PG IPKP3 Dsa4 dia DP granuleuse Couche pineuse Couche basale nie P El Figure 48 Profil d expression des composants des desmosomes de l piderme Kottke et al 2006 M Desmosome sont pr sentes dans tout l piderme avec un fort gradient vers la couche basale alors que DSC1 et DSG1 sont au contraire fortement exprim es dans les couches suprabasales La desmogl ine 4 plus r cemment identifi e Kljuic et al 2003 est exprim e dans la couche granuleuse de l piderme interfolliculaire et dans le follicule pileux matrice cellules EEA intercenutaire corticales et gaine pith liale interne Bazzi et al 2006 Elle est la seule desmogl ine pr sente dans la cuticule de la tige pilaire Le mode d interaction entre les cadh rines desmosomales homophile ou h t rophile reste encore incertain Une tude de l association entre les domaines extracellulaires de DSC2 et DSG2 par la technique du Biac
182. ally controlled site specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis comparison of the recombinase activity of the tamoxifen inducible Cre ER T and Cre ER T2 recombinases Nucleic Acts Res 27 4524 4527 Jonca N Guerrin VL Hadjiolova Ka Caubet C Gallinaro H Simon M and Serre G 2002 Comeadesmosin a component of epidermal comeocyte desmosames displays homophilic adhesive properties J Biel Chem 277 3024 3029 Kiljulc A Bazzi H Sundberg J Fs Martinez Mir A O Shaughnessy Ro Mahoney M Gn Levy M Montagutelli X Ahmad W Aita V ML et al 2003 Desmoglein 4 in hair follicle differentiation and epidermal adhesion evidence from inherited hypetnchosis and acquired pemphigus vulgaris Cel 113 249 260 Koch P da Mahoney M G Cotsarelis Gu Rothenberger Ka Lavker R M and Stanley J R 1998 Desmoelein 3 anchors telowen hair m the follicle Cel Sef 111 2529 2537 Kottke M Da Delva E and Kowalczyk A P 2006 The desmosome cell science lessons from human diseases Cell Sei 119 797 806 Lal Cheong J En Arita K and McGrath J A 2007 Genetic diseases of junctions J favest Dermatol 127 2713 2725 Levy Nissenbaum E Betz R Ca Frydman Ma Simon XL Lahat H Bakhan T Goldman B Bygum A Pierick M Hillmer A ML et al 2003 Hypotnchosis simplex of the scalp is assocmted with nonsense mutations in CDSN encoding comecddesmosin Nat Genet 34 151 153 Li M
183. amides partir de sphingomy line SMPD3 est notamment connu pour tre pr sent dans les k ratinosomes Rassner et al 1999 et son expression est diminu e dans le cas de la dermatite atopique Jensen et al 2004 Au final nos donn es sugg rent que la synth se des c ramides au niveau de la couche granuleuse implique plusieurs des voies m taboliques connues mais aussi que certaines des enzymes impliqu es telle ACSL4 ne sont pas n cessairement r gul es au cours de la diff renciation Enfin il est int ressant de noter que ASAH3 un gene fortement surexprim R 300 Toulza et al 2007 codant pour la c ramidase alkaline haCER1 qui d grade certaines esp ces de c ramides a longue cha ne a r cemment t impliqu directement dans la diff renciation pidermique probablement en raison de l activation de voies de signalisation li es la sphingosine et la sphingosine 1 phosphate Sun et al 2008 De facon surprenante nous avons galement identifi deux g nes SLC22A5 66 ORESTEs et BBOX1 R 5 2 respectivement impliqu s dans le transport et la synth se de carnitine La carnitine est un compos impliqu dans le transport des acides gras jusqu la matrice mitochondriale en vue d une d gradation via la b ta oxydation La production d nergie dans les k ratinocytes reste peu d crite et si des travaux anciens indiquent que la b ta oxydation se produit bien au sein de l piderme Anastasia and Conley
184. an Molecular Biology Laboratory Cambridge UK et la DDBJ DNA Database of Japan Mishima Japan toutes trois interconnect es depuis 1986 grace aux efforts de l INSDC International Nucleotide Sequence Database Collaboration http www insdc org Ce comit est charg d unifier les formats de stockage des donn es de ces trois grandes banques afin de faciliter par la suite leur annotation ainsi toute s quence soumise a une de ces trois banques sera convertie dans un format commun et int gr e aux deux autres banques lors d une mise a jour Pour les donn es de s quencage a haut d bit le volume de stockage requis repr sente un r el d fi pour leur partage et leur exploitation En effet un seul run de s quen age haut d bit peut g n rer une quantit tr s importante de donn es de 100 m gabases a 3 gigabases suivant la technique Le volume des donn es brutes pose de s rieux probl mes de stockage ce qui explique qu elles aient t parfois supprim es apr s leur traitement d o des difficult s pour recontr ler la qualit des 45 s quences M me en ne consid rant que les s quences post traitement leur tr s grand nombre pose probl me pour la gestion et l interrogation des banques de donn es les h bergeant Ainsi les trois banques internationales devant l immense afflux de courtes s quences issues des techniques haut d bit ont cr une section SRA Short Read Archive d di e au
185. ant pas avec l activit de la polym rase D autres m thodes Taqman Lightcycler Molecular Beacons Scorpion primers sont bas es sur un syst me de sondes couplant g n ralement un fluorochrome et un quencheur qui absorbe la fluorescence du fluorochrome les deux tant physiquement s par s lors de l amplification ce qui entra ne l apparition d un signal figure 16 Ces m thodes sont th oriquement plus sp cifiques que la PCR en Sybr green puisque faisant intervenir une sonde s quence sp cifique pour la d tection en plus des deux amorces mais la synth se d amorces marqu es est co teuse Elles sont donc plus adapt es la quantification de quelques g nes dans un grand nombre d chantillons Au contraire la PCR quantitative en Sybr Green est plus adapt e la quantification d un grand nombre de g nes diff rents dans un faible nombre d chantillons La PCR quantitative en Sybr green permet soit une quantification absolue soit relative La quantification absolue n cessite la r alisation d une courbe talon pour chaque g ne d int r t alors que la quantification relative consiste simplement comparer directement les chantillons entre eux Dans ce dernier cas la PCR quantitative n cessite de choisir un ou plusieurs g nes de r f rence afin de r aliser une normalisation n cessaire pour compenser par exemple les diff rences de concentration des solutions d ADNc compar es Le choix du ou d
186. ante La table ci dessous donne le pourcentage d erreur suivant la valeur de E et du AACt donn par la 7 AAC E 1 pi Ey formule 100 x i 7 E an Efficacit 95 90 19 3 5 8 11 14 18 19 119 owes 2 8 179 2 1 ee 7 o o EE A 16 E A 2 CS 5 Erreur Rgatcul lt 10 10 25 216 Ainsi dans le cas d une efficacit faible 70 et d un cart de Ct lev 10 cycles le ratio calcul selon la formule simplifi e est de 1024 alors qu en prennant en compte l efficacit il n est que de 201 soit une erreur de 408 Au contraire pour une efficacit correcte 95 et un cart de Ct similaire erreur reste inf rieure 30 formule simplifi e R 1024 f exacte R 795 Des exp riences de dilutions limites ont montr que l efficacit moyenne de nos amorces pour les g nes B2M KRT14 et KLK7 est de 96 Pour des raisons pratiques l efficacit des amorces des autres g nes n a pas t valu e m me si le parall lisme des courbes d amplifications permet de supposer qu elles ont une efficacit similaire 90 95 G n ralement les amorces ayant une efficacit plus faible correspondent galement a des amorces peu sp cifiques ou dont les courbes d amplification ne sont pas dans la gamme de cycle voulue 17 30 cycles donc cart s de l analyse Au vu de l efficacit moyenne de nos amorces l erreur li e a l efficacit reste relativement faible pour les g nes que nous a
187. anules kDa environ phosphoryl form ed d un domaine amino terminal de p 203 aa dune sous unit tronqu e de 173 aa suivie de 10 12 sous unit s homologues de Traduction 324 aa et enfin d un domaine a ta ie ttt ARN im b carboxy terminal de 157 aa PORScripTion Presland et al 1992 Lors de la a gene i cornification la profilaggrine est Figure 42 M tabolisme de la profilaggrine Simon M chin et al 2001 d phosphoryl e puis cliv e en unit s de filaggrine figure 42 Gan et al 1990 La ou les prot ases impliqu es dans le clivage entre les monom res n ont ce jour pas t formellement identifi es bien que la matriptase List et al 2003 Alef et al 2009 et la caspase 14 Denecker et al 2007 puissent tre impliqu es dans une partie du processus Les monom res de filaggrine lib r s agr gent les filaments interm diaires en macrofibrilles qui formeront la matrice fibreuse dense intracorn ocytaire Steinert et al 1981 Finalement la filaggrine est 83 d simin e dans la couche corn e par des peptidyl arginine d siminases PADI qui catalysent la conversion des r sidus arginyl en r sidus citrullyl Nachat et al 2005 la prot ine perd son affinit pour les filaments interm diaires de k ratines et est d grad e en acides amin s libres qui participent a la formation du facteur naturel d hydratation Scott et al 1982 possiblement sous l action de d
188. armi les g nes surexprim s identifi dans notre premi re tude du transcriptome k ratinocytaire Toulza et al 2007 Sa fonction reste a ce jour totalement inconnue de m me que sa sp cificit de s quence vis vis de l ADN D une fa on g n rale la recherche d un r le pour les facteurs de transcription identifi s se heurte plusieurs obstacles La majorit des facteurs identifi s sont tr s peu caract ris s m me dans d autres types cellulaires De plus lorsqu une fonction est connue dans un autre tissu rien n indique que les g nes cibles de ce facteur seront les m mes dans l piderme m me si la sp cificit de s quence reste la m me certains cofacteurs essentiels peuvent tre absents et la chromatine peut tre condens e et rendre inaccessible certains sites de fixation d crits ou inversement rendre accessibles de nouveaux sites Pour les facteurs les moins d crits dans la litt rature la m thode g n ralement privil gi e pour analyser leur fonction est la perte ou le gain de fonction sur cellules ou animaux et surtout l identification des g nes cibles g n ralement par immunopr cipitation de chromatine suivie de l identification des s quences par microarray ChIP on chip ou par s quencage ChIP seq Pour les facteurs mieux d crits dans d autres syst mes une strat gie susceptible de livrer quelques indices sur la fonction est la recherche de I expression de cofacteurs ou de genes
189. as detected in skin extracts from WT and HET animals The smaller amount of protein in HET mice is consistent with results of RT PCR analysis which indicate inactivation of one Cdsn allele lower molecular mass peptide of 45 kDa was also detected in both WT and HET pup extracts which corresponds to a first step of the CDSN proteolytic cleavage in the course of stratum comeum maturation Simon et al 1997 Inactivation of CDSN in mouse skin results in early postnatal death KO pups suffered from severe skin detachment Fig 2A and died within hour of birth or were immediately eliminated by their mother To delineate the causes of neonatal lethality we systematically performed caesarian deliveries at E18 5 Under these conditions KO embryos were indistinguishable from their littermates when handled carefully Fig 2B However during grooming by surrogate mothers we observed the rapid appearance of skin detachment that was similar to that observed after natural birth Skin rupture started in the ventral area paws and snout and extended to the flanks Fig 2C The peeled skin was red shiny and became somewhat sticky to the touch On the dorsal part of the pups the skin retained a normal macroscopic aspect until death which occurred within 2 hours A standard procedure for analysis of the phenotype was thus established atter caesarian delivery all neonates were given to a surrogate mother and euthanized after hour Inactivation
190. ase domain containing 11 WBSCR21 ankyrin repeat domain 1 cardiac muscle apolipoprotein F lipid transfer inhibitor protein LTIP ADP ribosylation factor like protein 11 ARLTS1 activating transcription factor 6 ATPase H transporting lysosomal VO subunit a1 butyrobetaine gamma 2 oxoglutarate dioxygenase gamma butyrobetaine hydroxylase 1 basic helix loop helix domain containing class B 2 calicin chloride channel calcium activated family member 4 cysteine rich with EGF like domains 1 AVSD2 catenin beta interacting protein 1 ICAT DNA segment on chromosome 4 unique 234 expressed sequence NEEP21 EH domain containing 4 PAST4 F box protein 38 MoKA FGFR1 oncogene partner 2 forkhead box C1 forkhead box L1 GATA binding protein 4 GEM interacting protein HOP homeobox hematopoietic stem cell precursor galectin related protein GRP hyaluronoglucosaminidase 2 insulinoma associated 1 IA 1 inositol 1 4 5 trisphosphate 3 kinase C Kruppel like factor 14 BTEB5 keratin 23 histone deacetylase inducible small trans membrane and glycosylated protein SMAGP LPS responsive vesicle trafficking beach and anchor containing CDC4L mitogen activated protein kinase kinase kinase 7 interacting protein 1 TAB1 microtubule associated protein tau MYC associated factor X splicing variant 4 methyl CpG binding domain protein 1 mevalonate diphospho decarboxylase nuclear factor erythroid derived 2 45kDa N
191. ases acides LIPA et LIPH toutes deux cod es par des g nes du m me locus 10q23 31 sugg re un r le dans la maturation des triglyc rides et ou des esters de cholest rol tous deux importants pour la fonction du stratum corneum La fonction des phospholipases identifi es PNPLA1 PLA2G4E PLA2G4F Toulza et al 2007 et PLA2G15 Mattiuzzo et al 2009 reste inconnue mais le fait que seul PNPLA1 soit surexprim R 20 sugg re que ces trois autres phospholipases ne jouent peut tre pas de r le direct dans la fonction barri re Signalisation cellulaire M me si plusieurs prot ines impliqu es dans diverses voies de signalisation sont connues pour leur fonction dans la r gulation de la prolif ration et de la diff renciation dans l piderme les acteurs mol culaires des voies impliqu es dans ces cascades complexes et souvent imbriqu es restent peu d crites dans les k ratinocytes diff renci s M me si leur fonction exacte est pour le moment inconnue l identification de nouveaux g nes impliqu s dans de nombreuses voies reste primordiale pour esp rer comprendre l int gration des nombreux signaux intervenant dans la r gulation fine du programme de diff renciation Ainsi plusieurs g nes impliqu s dans les voies de signalisation des cat nines de Ras et de Src sont surexprim s dans les k ratinocytes diff renci s CTNNBIP1 R 9 1 emp che l interaction entre la cat nine 1 et les facteurs de transcription de la
192. associated zinc finger protein purine binding transcription factor 746 Genomatix 0 36 MBD3 methyl CpG binding domain protein 3 550 Microarrays 0 15 NCOR2 nuclear receptor corepressor 2 SMRT 544 ORESTES 0 38 NDOR1 NADPH dependent diflavin oxidoreductase 1 107 ORESTES microarrays 0 42 NFE2L1 nuclear factor erythroid derived 2 like 1 1022 ORESTES Genomatix 0 14 PELP1 proline glutamic acid and leucine rich protein 1 492 ORESTES 0 3 PKNOX1 PBX knotted 1 homeobox 1 316 ORESTES Genomatix 0 35 RREB1 ras responsive element binding protein 1 207 ORESTES Genomatix 0 29 SOX12 SRY sex determining region Y box 12 171 Microarrays 0 29 SUV39H1 suppressor of variegation 3 9 homolog 1 histone H3 K9 methyltransferase 1 241 Microarrays 0 4 TCIRG1 T cell immune regulator 1 ATPase H transporting lysosomal VO subunit A3 268 Microarrays 0 49 TEF thyrotrophic embryonic factor 348 ORESTES Genomatix 0 17 ZFPM2 zinc finger protein multitype 2 FOG2 modulator of GATA4 55 Literature 0 33 ZNF76 zinc finger protein 76 232 Genomatix 0 24 based on preliminary microarrays analysis FDR gt 0 05 Names of genes encoding transcription factors are written in bold 186 Table 4 Previously described markers of suprabasal layers GK BK expression ratios determined by qRT PCR Gene symbol A2ML1 CDSN CNFN CSTA DLX3 DMKN DSG1 FLG FLG2 GJB5 IVL KLF4 KLK5 KLK7 LOR RORA SCEL SERPINB5 SERPINB8 SPINK5S Full name alias previous name alp
193. ast cell type in the skin to display transcription activity before cornification and we describe the expression of 3 387 genes a proportion of which are expressed in GKs in a highly specific manner We presume that many of them are impor tant for the establishment of the barrier function and as such deserve detailed functional studies Moreover we provide the scientific community with a list of gene candidates for genodermatoses of unknown origin In particular the under standing of complex diseases associated with defects in bar rier function such as psoriasis or atopic dermatitis might benefit from identification of new epidermis expressed genes located in associated loci Among the genes described some fit with and even improve our present knowledge of the bar rier function in particular concerning the fine tuning of pro tein degradation and lipid metabolism The precise function of the corresponding proteins will be assessed using mouse models and immunochemistry methods starting from healthy and pathological human skin However many of the genes described herein often specifically expressed in GKs at high levels encode putative proteins whose functions are totally obscure but that might well participate in the establishment of the skin barrier Incidentally we characterized a new gene Ciorf81 which is specifically inactivated or truncated in humans Whether this gene loss participated in the establish ment of the human speci
194. ateur ou de r presseur transcriptionnel suivant les cibles sugg re que son action est probablement modul e par d autres facteurs de transcription comme cela a t d montr pour GRHL3 et LMO4 par exemple D292 22D GRHL3 Grainyhead like 3 aussi nomm Get 1 est membre d une famille de trois g nes orthologues de grainyhead identifi chez D melanogaster Initialement d crit chez les mammif res comme un g ne essentiel pour la fermeture du tube neural pendant l embryogen se Ting et al 2003 Grhl3 joue aussi un r le essentiel dans la mise en place de la fonction barri re de l piderme Le g ne est majoritairement exprim au cours du d veloppement murin dans l ectoderme de surface d s E10 5 puis persiste dans l piderme en formation dans les follicules pileux et vibrisses cortex ainsi que plusieurs autres pith lia de recouvrement tels que l pith lium buccal ou nasal Kudryavtseva et al 2003 partir de E15 5 ainsi que chez le nouveau n et l adulte l expression est limit e aux couches suprabasales de l piderme interfolliculaire Des souris dont le g ne Ghrl3 a t constitutivement inactiv meurent en p riode p rinatale avec un ph notype caract ristique spina bifida et curly tail d aux anomalies du tube neural et ne pr sentent pas de barri re fonctionnelle Ting et al 2005 L piderme montre une hyperacanthose une hyperk ratose ainsi qu une parak ratose figure 58A A
195. ati re de r gulation g nique Pour pousser plus loin la caract risation des r seaux de r gulation impliqu s dans le programme de diff renciation k ratinocytaire il semble donc n cessaire de compl ter cette premi re description par une approche exp rimentale par exemple en identifiant les cibles directes des FT par ChIP on chip ou ChIP Seq Aucune A technique grande chelle n tant exhaustive ou exempte de faux positifs de A nombreux allers retours entre approches grande chelle et approches cibl es 213 restent n cessaires pour dresser un portrait aussi complet que possible De plus les approches par ChIP sont galement susceptibles d apporter des informations sur les liens complexes entre les facteurs de transcription les r seaux d une grande complexit impliquant g n ralement que des FT se r gulent les uns les autres Ainsi des travaux men s sur S cerevisiae le mod le eucaryote le mieux d crit au niveau transcriptionnel montrent que les g nes codant pour des FT sont r gul s de mani re plus fine que d autres g nes au niveau transcriptionnel Balaji et al 2006 Ils pr sentent notamment un degr de cor gulation plus important et un nombre de FT par g ne r gul sup rieur ce qui n est pas surprenant au vu de leur r le crucial de chefs d orchestre de la diff renciation 214 PCR quantitative Plusieurs g nes mis en vidence par la technique des puces 4 ADN n on
196. autres Les lames swapp es ont t fusionn es deux deux afin d tre analys es comme trois lames virtuelles ind pendantes L analyse finale repose donc sur six mesures ind pendantes correspondant aux six chantillons Le choix des puces pang nomiques employ es s est port sur des lames oligonucl otides produites pour le programme Resogen Soutenu par un consortium franco britannique RNG R seau National des G nopoles MRC Medical Research Council le programme a t lanc pour permettre le d veloppement et la commercialisation prix co tant de puces pang nomiques humain et souris afin que la communaut scientifique puisse disposer d un outil d analyse a grande chelle a un prix bien plus abordable que les offres commerciales disponibles auparavant Les lames humaines produites en France par trois plateformes Nice Sophia Antipolis Evry et Strasbourg comprennent 25 248 oligonucl otides 50m res diff rents pour un total de 26 496 d pots lame ciblant 22 458 g nes connus pr dits ou ESTs du g nome humain Le Brigand et al 2006 Le Brigand and Barbry 2007 Les quantit s d ARN de qualit optimale se sont av r es suffisantes pour ne pas avoir recours a une tape suppl mentaire d amplification in vitro alternative int ressante lorsque les ARN sont limitants mais susceptible d introduire des biais 209 suppl mentaires Les lames ont t hybrid es manuellement en chambre d inc
197. ays The treated areas were checked daily for phenotype onset by clinical observation and TEWL measurement A Macroscopic appearance of untreated left flank control or OHT treated right flank from representative animals Right flank of mice euthanized when the phenotype was moderate early or more severe late are presented The scaling becomes more marked and ulceration of the skin appears as the phenotype progresses B Representative skin sections from control early or late flanks stained with hematoxylin and cosin H amp E At early stage middle panel note the development of acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis as well as the altered morphology of the hair follicles which are distended from the infudibulum to the skin surface arrows and associated with hypertrophic sebaceous glands arrowheads At the late stage right panel hair follicles are no longer visible and a scab replaces the epidermis asterisk D dermis E epidermis C D Skin sections from control early or late flanks processed for immunohistochemical staining with F28 27 mAb CDSN C or with an antibody specific to K6 D Absence of labeling in early and late flanks confirms the efficient Cdsn excision in HOMO mouse skin treated with OHT and the strong K6 expression confirms the hyperproliferative state of the HOMO mice epidermis Scale bars 50 um acanthosis hyperkeratosis and parakcratosis at carly stages there was no formation of prom
198. ble lt 5 des sites pr dits sont r ellement fix s par leur facteur la chromatine n tant pas n cessairement accessible dans le mod le tudi ou le facteur de transcription m tant pas n cessairement pr sent et actif Or les facteurs de transcription n agissent pas de fa on isol e mais en synergie ou en comp tition avec d autres cofacteurs activateurs ou inhibiteurs d o l int r t de resserrer l analyse des TFBS d un promoteur en recherchant non pas tous les sites potentiels plusieurs centaines mais uniquement des combinaisons de sites de fixation pr sents dans plusieurs s quences ex promoteurs de g nes co r gul s de g nes orthologues ou paralogues etc En effet la probabilit que plusieurs s quences aient plusieurs sites en commun avec plus ou moins le m me agencement est beaucoup plus faible que pour un site isol De nombreux outils tels que ceux propos s par le Comparative Genomics Center du Lawrence Livermore National Lab http www dcode org ou ceux payants propos s par la suite logicielle Genomatix permettent ainsi de cibler des r gions conserv es et ou de rechercher des combinaisons de TFBS entre plusieurs s quences homologues figure 23 qu il s agisse de mod les connus cofacteurs av r s d crits dans un type cellulaire donn ou non La pr sence de tels mod les dans les promoteurs de g nes ayant des patrons d expression comparables permet 5I ECR Brow
199. ble d un grand nombre de g nes mais ne permet pas de distinguer lesquels sont sp cifiques de la couche granuleuse ou exprim s dans tout l piderme Pour cette raison plusieurs autres techniques compl mentaires grande chelle ont t employ es pour rechercher sp cifiquement des g nes d expression 136 tardive plus susceptibles d tre impliqu s dans la fonction barri re de l piderme exploration de la banque d ESTs puces ADN pang nomiques et analyses bioinformatiques de promoteurs pour l identification de candidats PCR quantitative en temps r el et s quen age pour l identification des g nes r gul s Mattiuzzo et al 2009 Enfin la technique de PCR quantitative en temps r el utilis e pour ces deux tudes d expression g nique a galement t employ e pour tablir le profil d expression de plusieurs marqueurs de diff renciation dans un mod le de souris inactiv es pour le g ne de la corn odesmosine Leclerc et al 2009 Cette tude tant distincte des approches grandes chelles l article correspondant est donn en Annexes 137 138 II RESULTATS EXPERIMENTAUX 139 140 GENOME BIOLOGY 8 R107 2007 Large scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function Eve Toulza Nicolas R Mattiuzzo Marie Florence Galliano Nathalie Jonca Carole Dossat Daniel Jacob Antoine de Daruvar Patrick Wincker Guy Serre and Marina Guerrin 141
200. c commerciaux pr par s partir de placenta de thymus et de testicule bien que la prot ine soit en dessous du seuil de d tection dans des extraits prot iques commerciaux de placenta et de testicule D autre part parmi les 70 EST pr sents dans les banques de donn es 5 proviennent de placenta 7 de testicule et les autres ont t clon s en grande majorit partir de tissus exprimant un programme de diff renciation proche de celui de l piderme comme la langue l oesophage l hypopharynx ou des carcinomes pidermoides 207 Puces a ADN Pour poursuivre le travail de description du transcriptome des k ratinocytes granuleux et de sa r gulation une approche par puces a ADN a t choisie principalement pour deux raisons Premi rement aucune m thode grande chelle nest r ellement exhaustive et la m thode des ORESTEs bien que capable d identifier des g nes tr s faiblement transcrits n a certainement pas couvert la totalit du transcriptome de la couche granuleuse de l piderme De plus cette approche n est ni quantitative ni comparative et ne discrimine donc pas les g nes sp cifiques du k ratinocyte granuleux de ceux exprim s plus pr cocement voire dans toutes les couches Il a donc t d cid d employer des puces ADN dites pang nomiques afin de pousser plus loin la description du transcriptome des k ratinocytes granuleux et d identifier de nouveaux g nes sp cifiquement exprim s da
201. c finger protein 335 NIF 1 zinc finger protein 396 ZSCAN14 factors are written in bold 83 170 470 1173 1173 380 286 286 496 490 696 121 121 130 546 772 134 298 631 105 411 176 40 151 204 76 187 27 Genomatix ORESTES microarrays Microarrays ORESTES ORESTES Microarrays Microarrays Microarrays Microarrays ORESTES ORESTES ORESTES ORESTES Literature Genomatix Microarrays ORESTES Microarrays ORESTES Genomatix Microarrays ORESTES Genomatix Microarrays ORESTES Genomatix Genomatix ORESTES Genomatix Microarrays ORESTES microarrays ORESTES 0 5 0 6 0 7 1 8 1 2 1 1 1 9 1 2 0 55 1 5 0 8 1 5 0 6 1 3 0 8 1 2 1 3 1 6 0 6 1 1 0 7 0 9 1 3 1 2 1 3 1 2 1 1 185 Table 3 Genes downregulated in the granular layer GK BK expression ratios determined by qRT PCR Gene symbol Full name alias previous name oe shai re or T Bn BCL11A B cell CLL lymphoma 11A EVI9 203 ORESTES Genomatix 0 32 DKFZP586H2123 regeneration associated muscle protease RAMP 245 ORESTES 0 3 ETV5 ets variant gene 5 ets related molecule 359 ORESTES 0 29 FOXK2 forkhead box protein K2 ILF1 508 Genomatix 0 37 GRLF1 glucocorticoid receptor DNA binding factor 1 490 ORESTES 0 47 HIVEP3 human immunodeficiency virus type enhancer binding protein 3 41 ORESTES 0 27 IQGAP3 IQ motif containing GTPase activating protein 3 77 ORESTES 0 18 MAML1 Mastermind like protein 1 325 ORESTES 0 36 MAZ MYC
202. ccurred similarly in both WT and KO mice Typical transitional junctions were found with classical dense fibrils of keratin filaments attached ventral skin eit ea al pl i Zu be i on i wy Hier A k y 4 y El KOE an Fig 4 Histological analysis of cornified epithelia in Casn KO mice A Representative sections stained with hematoxylin and eosin HAE trom dorsal skin of WT and KO neonates or from ventral skin of KO neonates The staining shows complete detachment of the SC from the ventral epidermis of the KO mouse D dermis LL living layers of epidermis SC cornified layer B lmmunohistochemical staining with F28 27 mAb CDSN of sections from dorsal skin of WT and KO neonates or from ventral skin of KO neonates confirmed the absence of CDSN in the stratum granulosum of the epidermis arrows and the IRS of the hair follicles arrowheads of KO pups C Immunohistochemical staining with F28 27 mAb CDSN of sections from longue and esophagus of WT and KO neonates showing that Cds excision is not efficient in internal epithelia Scale bars 20 um to the electron dense intracellular desmosomal plaque in the granular keratinocyte densification of the intercellular portion and an electron dense line at the other side of the junction corresponding to the cornified envelope of the upper transitional keratinocyte Fig 5D G The number of these transitional desmosomes at the interface between the stratum gran
203. ce le sodium est probablement impliqu lui aussi dans la diff renciation k ratinocytaire Mauro et al 2002 SLC8A1 R 16 2 codant pour un changeur membranaire sodium calcium son action pourrait tre double Enfin RCAN1 R 5 5 inhibe la voie de la calcineurine Rothermel et al 2000 et r gule l exocytose dans les cellules chromaffines murines Keating et al 2008 sugg rant une implication de RCAN1 dans la s cr tion des k ratinosomes Le g ne GSDMA dont le ratio de surexpression est tr s lev R 800 Toulza et al 2007 code pour la gasdermine 1 une prot ine ayant un role antitumoral Saeki et al 2000 et impliqu e dans la signalisation du TGFB Saeki2007 mais dont la fonction au cours de la diff renciation pidermique reste inconnue Un anticorps dirig contre plusieurs gasdermines conduit 4 un marquage restreint a la couche granuleuse de l piderme humain la gaine pith liale interne et la tige pilaire des follicules pileux et aux s bocytes maturs Lunny et al 2005 Si la GSDM3 joue un r le dans la diff renciation de ces annexes pidermiques GSDM1 semble tre la principale gasdermine exprim e dans les couches diff renci es de l pith lium de loesophage murin dont les cellules pr sentent une diff renciation tr s proche de celle de l piderme Saeki et al 2009 Les k ratinocytes peuvent subir deux types de mort cellulaire programm e la cornification point culminant de la dif
204. certain nombre de marqueurs sp cifiques des prot ines impliqu es dans la prolif ration cellulaire ex cycline D1 PCNA mais aussi des constituants de la lame basale ex la laminine 5 ligand des int grines s cr t e dans la lamina lucida des h midesmosomes int grines a6 4 le collag ne de type XVII alphai COL17A1 aussi nomm BP180 ou Bullous Pemphigoid Antigen 2 BPAG2 du cytosquelette avec le couple de k ratines K5 K14 La compr hension des m canismes assurant l auto renouvellement de l piderme reste sujet d bat et fait de ce tissu un mod le d tude de premier choix pour les cellules souches Les m thodes d identification des cellules souches tant essentiellement fonctionnelles elles s av rent difficilement compatibles avec l tude in vivo chez l homme Pour cette raison l tude du renouvellement pidermique et des cellules souches s est surtout effectu e sur des mod les murins Les cellules souches pidermiques y ont t initialement identifi es et tudi es gr ce leur tr s faible taux de division cellulaire compar aux cellules prog nitrices Ainsi les cellules souches sont capables de retenir un marquage la thymidine triti e ou au BrdU Bickenbach 1981 ou de conserver plus longtemps jusqu huit mois que des cellules fortement prolif ratives une histone H2B GFP exprim e transitoirement Tumbar et al 2004 figure 29 L identification de ces label 62 re
205. chaque bille est isol e dans un puit d une plaque de tr s haute densit les PicoTiter plates employ es sont form es d un tr s grand nombre de fibres optique formant un large support dans lequel sont creus s plusieurs centaines de milliers de puits de 44um de large puis des microbilles portant deux enzymes une ATP sulfurylase et une lucif rase sont ajout es En effet le pyros quencage est bas non pas sur l arr t de la synth se d un brin d ADN par des nucl otides terminateurs comme pour la technique de Sanger mais par la d tection en temps r el de l incorporation des nucl otides Durant un cycle chaque dNTP possible dATP dTTP dGTP ou dCTP est ajout e non pas simultan ment mais s quentiellement s il correspond a la base compl mentaire du brin s quenc l ADN polym rase pr sente dans le puit allonge le brin n osynth tis en incorporant la base ce qui entra ne la lib ration d un pyrophosphate inorganique PPi L ATP 237 sulfurylase emploie alors ce PPi pour produire de l ATP qui est employ par la lucif rase pour transformer la lucif rine en oxylucif rine une apyrase d grade les nucl otides en surplus Cette r action s accompagne d une mission de lumi re qui est proportionnelle la quantit de PPi lib r donc au nombre de bases incorpor es simultan ment si deux bases successives sont identiques deux fois plus de lumi re sera mise etc La lum
206. che bioinformatique n est que pr dictive Certaines contradictions peuvent provenir de biais dans la quantification par PCRq ce point est discut dans la section suivante Toutefois le degr de validation des donn es de PCRq avec notamment 19 marqueurs de la diff renciation confirm s par cette approche sur 20 test s va plut t dans le sens de faux positifs dus la technique de puces plut t que d une quantification erron e par PCRq Plusieurs d marches ont t test es pour tenter de s affranchir de ces faux positifs Ainsi le seuil de p value a t abaiss de 0 05 0 01 am liorant la proportion de vrais positifs dans une faible mesure passant de 31 de g nes confirm s 47 mais augmentant consid rablement le nombre de faux n gatifs parmis les 624 g nes consid r s comme surexprim s p lt 0 05 seuls 238 g nes ont une p value inf rieure 0 01 Pour tenter d am liorer la discrimination entre vrais et faux positifs une approche alternative par clustering hi rarchique a t employ e le but tant ici d identifier des g nes qui auraient un profil proche de celui des marqueurs connus de la diff renciation L analyse par clustering hi rarchique ou par Self Organizing Tree Algorithm a permis de montrer qu un grand nombre de marqueurs connus taient regroup s dans les m mes branches du graphe voir ci aa contre le d tail d un des deux CO4 3173_666_ 5 _ BC 043175 15319 gt 31109
207. corn odesmosine Lundstrom and Egelrud 1990 Serre et al 1991 Lundstrom et al 1994 Guerrin et al 1998 Simon et al 2001 Cette d gradation implique plusieurs prot ases pr sentes dans l espace intercorn ocytaire leur action tant finement r gul e des inhibiteurs de prot ases La cin tique de la desquamation donc galement l paisseur de la couche corn e et ventuellement la fonction barri re elle m me d pend de la balance entre les prot ases et les inhibiteurs tous s cr t s par les k ratinocytes granuleux sous forme active ou non Une tude en immunofluorescence et en immunomicroscopie lectronique montre que plusieurs mol cules s cr t es telles que la kallikr ine 7 KLK7 ou SCCE Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme la corn odesmosine CDSN la cathepsine 68 D CTSD ou les glucosylc ramides sont transport es s par ment depuis l appareil de Golgi vers le p le apical des k ratinocytes granuleux par le syst me s cr toire sp cifique les k ratinosomes Ishida Yamamoto et al 2004 Toutes les cargaisons test es dans cette tude semblent achemin es ind pendamment sous la forme d agr gats vers la membrane plasmique Dans le cas de KLK7 dont CDSN constitue un substrat au cours de la desquamation cette s paration pourrait avoir un role fonctionnel en emp chant une prot olyse pr matur e de la CDSN Toutefois certaines enzymes transport es par les k ratinosomes comme les catheps
208. couche granuleuse sont impliqu es conjointement dans cette double barri re sans que les liens fonctionnels entre ces deux structures soient clairement tablis 22 921 1 Lipides intercorn ocytaires Les lipides extracellulaires organis s en feuillets lamellaires ou lamellae Swartzendruber et al 1989 jouent un r le primordial dans l imperm abilit de la couche corn e En PU aie as A Madison 2003 microscopie lectronique les lipides pr sentent une organisation alternant bandes denses aux lectrons et bandes claires qui correspondent respectivement aux groupements polaires et aux chaines carbon es apolaires L espace intercorn ocytaire contient une quantit variable de triglyc rides d esters de cholest rol et de squal nes provenant des glandes s bac es Cependant les lipides de la couche corn e sont principalement synth tis s par les k ratinocytes Une analyse en chromatographie en couche mince montre que la 73 couche corn e contient selon les sites anatomiques 20 30 de sphingolipides majoritairement des c ramides 15 20 de cholest rol 15 20 d acides gras libres 2 6 de sulfate de cholest rol et 3 5 de phospholipides Lampe et al 1983 Au niveau palmoplantaire la couche corn e est plus riche en cholest rol 33 et en sphingolipides 35 au d triment des lipides sp cifiques des glandes s bac es lesquelles sont absentes de ce territoire Les k ratinosomes occupent
209. cs 2002 79 671 8 Bernard FX Pedretti N Rosdy M et al Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono layer cultures reconstituted epidermis and normal human skin transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis Exp Dermatol 2002 11 59 74 Gazel A Ramphal P Rosdy M et al Transcriptional profiling of epidermal keratinocytes comparison of genes expressed in skin cultured keratinocytes and reconstituted epidermis using large DNA microarrays J Invest Dermatol 2003 121 1459 68 Mehul B Asselineau D Bernard D et al Gene expression profiles of three different models of reconstructed human epidermis and classical cultures of keratinocytes using cDNA arrays Arch Dermatol Res 2004 296 145 56 Lemaitre G Lamartine J Pitaval A et al Expression profiling of genes and proteins in HaCaT keratinocytes proliferating versus differentiated state J Cell Biochem 2004 93 1048 62 Radoja N Gazel A Banno T et al Transcriptional profiling of epidermal differentiation Phvsiol Genomics 2006 27 65 78 Toulza E Mattiuzzo NR Galliano MF et al Large scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function Genome Biol 2007 8 R107 Le Brigand K Russell R Moreilhon C et al An open access long oligonucleotide microarray resource for analysis of the human and mouse transcriptomes Nucleic Acids Res 2006 34 e87 Tusher VG Tibshirani R Chu G Significance analysis
210. ctivation du g ne Gata3 de Guzman Strong et al 2006 A Coupe histologique d piderme de souris sauvages ou mutantes nouveaux n s B D faut structurels des k ratinosomes C Greffe d piderme sur souris nude EE sphingomyelin phosphodiesterase 1 acid lysosomal D G nes d expression pidermique diff rentiellement exprim s chez les souris mutantes vert sous expression R lt O 5 rouge surexpression R gt 2 112 fortement exprim d s les premi res couches suprabasales de l piderme interfolliculaire mais aussi au niveau des follicules pileux Des souris homozygotes Gata3 pr sentent un trouble majeur de la barri re et meurent de d shydratation quelques heures apr s la naissance de Guzman Strong et al 2006 L analyse histologique montre un d faut de diff renciation notamment des lamellae lipidiques moins nombreux et d sorganis s dans l espace intercorn ocytaire Ces manifestations s accompagnent d une hyperprolif ration compensatoire lorsque la peau des nouveaux n s est greff e sur des souris nude figure 59 La comparaison par puce ADN des profils d expression g nique entre peau de souris inactiv es pour gata3 ou sauvages met en vidence une sous expression de nombreux marqueurs connus de la diff renciation mais galement de plusieurs g nes impliqu s dans le m tabolisme lipidique Il appara t en particulier que le g ne agpat5 codant pour une enzyme cl de la synth se
211. cture du g ne FLG2 IFPS Wu et al 2009 221 fortement homologues de l hornerine 50 77 d identit tandis que les r p titions de type B sont plut t apparent es a la filaggrine 28 a 39 d identit Wu et al 2009 Enfin l expression et la localisation subcellulaire de l ifapsoriasine rappelle fortement de celle de la filaggrine puisqu elle est d tect e au niveau de la couche granuleuse dans les granules de k ratohyaline et de la couche corn e dans la matrice fibreuse La r sistance m canique est un aspect important de la fonction barri re Nous avons identif une nouvelle k ratine acide pidermique K23 fortement surexprim e dans les k ratinocytes granuleux R 745 Initialement d crite dans une lign e de cellules canc reuses trait es au butyrate de sodium Zhang et al 2001 l expression de KRT23 est principalement d tectable dans le placenta d apr s les donn es de la banque UniGene EST ProfileViewer Hs 9029 Des mutations des g nes KRT1 KRT2 et KRT10 tant responsables de diverses genodermatoses incluant des pidermolyses bulleuse et des k ratodermies ces donn es sugg rent une implication du g ne KRT23 dans des g nodermatoses d tiologie inconnue m me si une description plus pouss e de l expression de K23 dans l piderme reste n cessaire par exemple par immunohistochimie En plus de l ifapsoriasine et de la k ratine 23 un autre g ne codant une prot ine structurale po
212. d galiser la dispersion des ratios r duction de la loi Normale slide 1 slide 2 slide 3 slide 1 slide 2 slide 3 slide 1 slide 2 slide 3 Une fois la normalisation effectu e la moyenne des ratios d expression est calcul e pour chaque sonde partir des donn es normalis es des diff rentes puces puis un seuil est choisi afin de d finir les g nes diff rentiellement exprim s A cette tape un test statistique est requis afin d valuer si les conclusions tir es a partir des ratios moyens sont significatives ou susceptibles d tre dues au hasard Le risque lors d un test statistique est double celui de d clarer un g ne comme tant diff rentiellement d tect alors qu il ne l est pas risque de type 1 ou risque de faux positif et celui de d clarer un g ne comme non r gul alors qu une diff rence de d tection est constat e risque de type 2 ou faux n gatif figure 13 Ces deux risques 32 H Pas de diff rence de d tection Sont li s au choix de deux param tres a H Diff rence de d tection et B Le seuil a 1 confiance du test correspondant au seuil d erreur de type 1 faux positifs tol r pour un test est g n ralement fix 0 05 ou 0 01 Le seuil P 1 puissance du test Ho rejet e correspond au seuil d erreur de type 2 H accept e mais ce risque n est g n ralement pas _ valu les faux n gatifs n tant
213. d globalement difficile l valuation de la qualit de ces puces pang nomiques Au vu de ces r sultats emploi de puces pang nomiques s est av r certes d cevant en tant que m thode pr sent e initialement comme semi quantitative mais malgr tout int ressante dans une approche de criblage en association avec d autres m thodes 27 des 49 nouveaux marqueurs de diff renciation identifi s au cours de cette tude apparaissent surexprim s d apr s les donn es de puces dont 19 identifi s uniquement d apr s cette m thode Il n est d ailleurs pas rare depuis quelques ann es de voir la technique des puces ADN pr sent e comme m thode de criblage pour rechercher des candidats plut t que comme m thode de quantification de 212 l expression g nique comme par exemple pour l analyse du triple KO involucrine envoplakine p riplakine Sevilla et al 2007 Analyse in silico des promoteurs de g nes coexprim s L approche bioinformatique par recherche de TFBS a permis de s lectionner un grand nombre de candidats non identifi s par les autres m thodes mais n a pas rendu possible la reconstitution m me partielle des r seaux de r gulation mis en jeu Les raisons potentielles sont multiples Premi rement la d couverte d un site de fixation pour un facteur de transcription dans une s quence r gulatrice ou suppos es telle ne constitue pas une preuve de implication du facteur en question mais seule
214. d steroidogenic factor 1 dosage triggers adrenocortical cell proliferation and cancer Mol Endocrinol 21 2968 2987 Dooley T P Haldeman Cahill R Joiner J and Wilborn T W 2000 Expression profiling of human sulfotransferase and sulfatase gene superfamilies in epithelial tissues and cultured cells Biochem Biophys Res Commun 277 236 245 Dowler S Currie R A Campbell D G Deak M Kular G Downes C P and Alessi D R 2000 Identification of pleckstrin homology domain containing proteins with novel phosphoinositide binding specificities Biochem J 351 19 31 Dudoit S Gentleman R C and Quackenbush J 2003 Open source software for the analysis of microarray data Biotechniques Suppl 45 51 Duffin K C and Krueger G G 2009 Genetic variations in cytokines and cytokine receptors associated with psoriasis found by genome wide association J Invest Dermatol 129 827 833 Eckert R L Crish J F Efimova T Dashti S R Deucher A Bone F Adhikary G Huang G Gopalakrishnan R and Balasubramanian S 2004 Regulation of involucrin gene expression J Invest Dermatol 123 13 22 Eckert R L and Green H 1986 Structure and evolution of the human involucrin gene Cell 46 583 589 Eisen M B Spellman P T Brown P O and Botstein D 1998 Cluster analysis and display of genome wide expression patterns Proc Natl Acad Sci U S A 95 14863 14868 Ekholm E and Egelrud T 2000 Expression of stratum co
215. d synthesis or transport APOF MVD and BBOX7 were upregulated in GKs Finally several structural proteins were previously undescribed in the epidermis a new epidermal acidic keratin KRT23 the microtubule associated protein Tau MAPT and calicin CC N a basic actin binding protein of the sperm head cytoskeleton Remarkably KRT23 displayed the highest R value 745 among the newly identified differentiation associated genes Furthermore transmembrane proteins CRELD1 TMEM45A LOC57228 and hyaluronoglucosaminidase HYAL2 were also specifically expressed in GKs As the expression ratios for these new differentiation associated genes exhibited a large variation 2 1 lt R lt 45 we wondered whether choosing R 2 as the lower limit was judicious To address this question GK BK ratios of 20 previously identified differentiation specific genes were measured by qRT PCR Table 4 With the exception of KLF4 R 1 7 all these genes were differentially detected with ratios ranging from 3 8 GJB5 to 5 800 FLG2 FPS This comparison reinforced our identification of 49 novel differentiation associated genes and furthermore suggested that only a few false negatives 1 lt R lt 2 may have been overlooked Furthermore two of the 49 new genes upregulated with differentiation were tested by immunohistochemistry IHC Fig 2 The microtubule associated protein Tau MAPT which presents a modest qRI PCR ratio R 6 1 displays a suprabasal gradient mod
216. dant pour un r cepteur au TNFa Certains g nes tant galement surexprim s dans le psoriasis les auteurs proposent que la progression vers le cancer passe par une activation non r versible des g nes impliqu s dans la prolif ration la o celle ci est r versible dans le psoriasis La technique utilis e pose cependant un probl me de sensibilit puisque de nombreux g nes repr sent s par une seule tiquette SAGE n ont pas pu tre inclus dans une analyse statistique quantitative De nombreuses autres tudes se sont cibl es sur l expression g nique des carcinomes pidermoides Les carcinomes pidermoides ou carcinomes malpighiens sont des tumeurs malignes qui reproduisent de fa on plus ou moins labor e la structure d un pith lium pluristratifi cornifi La diff renciation au sein de la tumeur se fait g n ralement de la p riph rie vers le centre pouvant aboutir la 125 formation de perles corn es On parle de carcinome spinocellulaire pour les carcinomes pidermoides d origine pidermique Les carcinomes pidermoides d velopp s aux d pens d un pith lium non malpighien prennent le nom de carcinomes pidermoides m taplasiques Les plus fr quents si gent au niveau des bronches de la sph re ORL de l oesophage HNSCC head and neck squamous cell carcinoma ou du col ut rin Les carcinomes pidermoides ayant fait l objet de nombreux s quen ages syst matiques partir de biopsi
217. de courtes s quences livre peu d information sur la complexit du transcriptome jonctions exon exon pissages alternatifs etc Or le d bit du s quen age nouvelle g n ration ne justifie plus les restrictions qu imposait la m thode de Sanger comme le fait de se limiter une portion des ADNc qu il s agisse de tags ou d ESTs Ainsi l tude de la complexit du transcriptome est plus directement accessible notamment gr ce la technique r cente du RNA Seq figure 20 En partant d une population d ARN totaux ou purifi s poly A par exemple une librairie de fragment d ADNc est produite soit par n bulisation ou hydrolyse des ARN soit par sonication ou traitement la DNasel Technologie Caract ristiques Principe R solution D bit D pendance vis a vis du s quen age du g nome Bruit de fond Applications Cartographie des r gions transcrites et mesure de l expression g nique simultan ment Gamme dynamique expression g nique Distinction entre isoformes Distinction entre alleles Limitations pratiques Quantit d ARN requis Co t pour des genomes importants Tiling microarray Hybridation De quelques bases a 100pb Haut Oui Eleve G n ralement lt 100x Limit e Limit e Importante Elev Sequencage EST ADNc S quen age de Sanger Une base Bas Non Bas Limit e pour l expression g nique Peu app
218. de donn es Intense relative UniGene permet elle aussi de visualiser ape ES la provenance des s quences d un g ne Figure 1 Extrait du profil des EST du g ne CDSN dans la banque UniGene selon le tissu l tat le stade de d veloppement 16 1 1 2 Technique des ORESTEs La production d ORESTES Open Reading Frame EST repose sur la construction de minibanques d EST par RT PCR faible stringence l aide d amorces choisies de fa on arbitraire figure 2 Il peut s agir de n importe quelle amorce d une vingtaine de nucl otides pourvu que sa s quence n aie d homologie parfaite avec aucun des transcrits potentiels du tissu tudi s quence choisie au hasard s quence g nomique non codante interg nique intronique ou brin non transcrit ou s quence correspondant une esp ce diff rente Initialement d nomm s RAP EST RNA arbitrarily primed EST Dias Neto et al 1997 ces ORESTES correspondent des s quences distribu es au hasard sur les ARNm et donc susceptibles de correspondre aux r gions codantes d o leur nom Transcription inverse eT Faible stringence 37 C la ney Amorce arbitraire ARN poly A RT PAINA AAAA i WY 5 PCR i m i P j i AA EE am ie ler cycle faible stringence Amorce ADNe lag Hybridation IPC i gt Ana SO St 5 39 cycles classiques ee Ha aor gut Hybndation 55 C g Figure 2 Principe de la techni
219. de geek je fais ce que je peux n Enfin merci ma th se pour avoir r pondu la lancinante question Peut on faire un th se et avoir une vraie vie sociale La r ponse est quelque part au dessus on dirait LISTE DES ABBREVIATIONS aa acides amin s ADN Acide D soxyriboNucl ique ADNc ADN compl mentaire ARN Acide RiboNucl ique ARNm ARN messager ATP Adenosine TriPhosphate gb kb pb gigabases kilobases paires de bases CGH Comparative Genomic Hybridization ChIP Chromatin ImmunoPrecipitation CNV Copy Number Variation Cre Lox syst me recombinase Cre sites LoxP Ct Cycle threshold dNTP d soxyribonucl otides triphosphates EDC Epidermal Differentiation Complex EGF Epidermal Growth Factor EPU Epidermal Proliferative Unit EST Expressed Sequence Tag FACS Fluorescent Activated Cell Sorting FDR False Discovery Rate FT Facteur de transcription GFP Green Fluorescent Protein GO Gene Ontology HN SCC Head and Neck Squamous Cell Carcinoma kDa kiloDalton LOH Loss Of Heterozygosity LOWESS LOcally WEighted Scatterplot Smoothing LRC Label Retaining Cells MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MIAME Minimal Information About Microarray Experiment ORESTE Open Reading Frame EST PCR Polymerase Chain Reaction PKC Protein Kinase C qRT PCR quantitative Real Time PCR RT Reverse Transcription SAGE Serial Analysis of Gene Expression SNP Singl
220. de la polarit cellulaire Contrairement aux pith liums monocouches ou leur fonction cruciale a t caract ris e depuis de nombreuses ann es les jonctions serr es sont longtemps pass es inapercues au sein de l piderme principalement parce que leur localisation est restreinte quelques assises et leur observation peu ais e Furuse et al 2002 figure 38B Les jonctions serr es ne sont assembl es et fonctionnelles qu partir RSR jonction serr e JAM occludine claudine i tr actine membrane Figure 38 Structure des jonctions serr es A Repr sentation sch matique http www ulysse u bordeaux fr atelier ikramer biocell_diffusion B Coupe d piderme murin observ e en microscopie lectronique Furuse et al 2002 Les jonctions serr es sont visibles dans la couche granuleuse SG au p le apical des k ratinocytes TJ jonction serr e DS desmosome 78 Figure 39 Diffusion paracellulaire d un marqueur Furuse et al 2002 Dans un piderme de souris sauvage la diffusion du marqueur est arr t e au niveau de la couche granuleuse par la pr sence des jonctions serr es marquage occludine Dans l piderme de souris inactiv es pour la claudine 1 le marqueur diffuse jusqu a la couche corn e NHS LC biotin composite occludin des assises centrales de la couche granuleuse m me si certaines prot ines sont exprim es plus pr coceme
221. de ne Red 95 22372 Vole de la bide DF sire te isi En esi ee eae 99 D2 27 3 Voie del GCide arachidomiqQue is tiennent 101 5 9 9 5 Facteurs de tTANSCIDUON EM a RL lee ates 102 2 2 3 2 1 Faclo S UDIT LES nee dre resnen te nnie CU tnere radio 102 2 2 9 9 D Facteurs d expression tissulaire restreinte ssssssseeeeeeecceceeeeenees 105 209 9 Di DEX roren sedan teuteubnsedes nid temed sues NE ved east 105 10 2 25D 22 EPI e nero tucunaas ouceegenseeekccne sonsaeuhcabeneee ed scueca tae 106 D 949270 CRIEI RS dd COR ras 109 2 2 3 2 2 4 CS Rd ed du ete 112 59 909 PRIVEE CBR testis 2 Re a de tel 113 2 3 PATHOLOGIES ASSOCIEES AU PROGRAMME DE DIFFERENCIATION EPIDERMITQUE ccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccees 116 DT LEO GENODER MATOS RS ae arr i ut 116 29 0 LEPSORIASIS ES tee ion Racer tn une tien nee enr eines 119 3 ETUDES A GRANDE ECHELLE DU TRANSCRIPTOME 3 1 ETUDES DU TRANSCRIPTOME LORS DE PATHOLOGIES EPIDERMIOUES sev saeasvessiacusecvanvcweebasnewescanbeevens suiawweeseeeccuceceusewesceasceve sues 123 3 1 1 TRANSCRIPTOME ET PSORIASIS cms ed EE 123 3 1 2 TRANSCRIPTOME ET INFLAMMATION ccesscoeccescesccescceseees 124 3 1 3 TRANSCRIPTOME ET CARCINOGENESE uu eee ecceceeeece scene 125 3 2 ETUDES DU TRANSCRIPTOME DANS UN CONTEXTE PHYSIOLOGIOUE soseo E EAE ES 128 32 L TRANSCRIPTOME ET CICATRISATION ccsccsscceccesccescsceescees 128 2 22 ETUDES DE LA DIFFERENCIATION EPIDER
222. des glyc rolipides est une cible directe de Gata3 avec quatre sites de fixation pr dits dans le promoteur proximal et confirm s par immunopr cipitation de chromatine Il est int ressant de noter que le niveau d expression de K f4 n est pas alt r dans l piderme Gata3 et vice versa sugg rant que ces deux facteurs r gulent deux ensembles ind pendants du programme de diff renciation D 0 4 DDR PRDM1 BLIMP 1 Le facteur de transcription BLIMP 1 B Lymphocyte Induced Maturation Protein 1 produit du g ne PRDM1 PR domain containing 1 et initialement d crit comme n cessaire et suffisant pour la diff renciation des cellules B en plasmocytes est galement exprim dans d autres tissus au cours du d veloppement comme chez l adulte Il est notamment exprim dans l piderme murin au niveau des prog niteurs des glandes s bac es puis les s bocytes matures de la papille dermique et de la GEI des follicules pileux en d veloppement puis dans la GEI le cortex et la medulla des poils matures et dans les couches les plus diff renci es de l piderme interfolliculaire Horsley et al 2006 Ainsi il repr sente a ce jour le facteur le plus tardivement exprim au cours de la diff renciation son expression qui d bute entre E15 5 et E17 formation du stratum granulosum est restreinte aux derni res cellules vivantes de la couche granuleuse y compris chez l adulte figure 60 Bien qu il ne soit pas stric
223. des probl mes de dilution tandis que LGALS7 initialement d crit comme exprim dans toutes les couches s est av r l g rement surexprim au cours de la diff renciation Sept autres g nes de m nage ont t test s par PCRa sur l ensemble des fractions T1 T4 et les r sultats obtenus ont t analys s avec l outil geNorm Vandesompele et al 2002 afin de d terminer quel g ne poss de l expression la plus stable Il ressort que le g ne B2M codant la B2 microglobuline du CMH de classe I est le g ne de r f rence le plus adapt Les biais de normalisation ne sont r ellement g nants que pour les ratios tr s proches de 1 or la plupart des nouveaux marqueurs de la diff renciation que nous avons identifi s ont des ratios sup rieurs a 4 voire bien plus pour certains g nes comme KRT23 R 745 Ces ventuels biais sont donc n gligeables et ne remettent pas en cause la surexpression des g nes identifi s L efficacit des amorces est galement importante pour toute quantification relative la formule employ e 244 n tant qu une version simplifi e de la formule exacte 1 44ct o E est l efficacit de la PCRq La formule simplifi e n cessite que l efficacit des amorces du g ne test et du g ne de r f rence soient toutes deux proches de 1 100 Dans le cas contraire plus l efficacit E est faible et l cart de Ct lev plus le ratio calcul est surestim parfois de fa on tr s import
224. dmi lui m me ainsi qu une phosphatase r gulant la voie des MAPK Dusp16 Au final il appara t que la grande majorit des g nes identifi s ce jour sont des effecteurs de la diff renciation k ratinocytaire qu il s agisse de prot ines structurales d enzymes ou d inhibiteurs Au contraire les voies de signalisation et le pool de facteurs de transcription ne sont que tr s partiellement d crits en particulier pour les tapes les plus tardives pourtant cruciales pour la mise en place et le maintien de la fonction barri re Ils constituent pourtant des l ments essentiels pour comprendre comment un programme aussi complexe peut tre ex cut correctement donc galement pour comprendre certaines pathologies li es des alt rations de ce programme 115 2 3 Pathologies associ es au programme de diff renciation epidermique 2 3 1 Les g nodermatoses De nombreuses maladies monog niques sont caus es par des mutations des genes exprim s au cours de la diff renciation pidermique Une grande partie des g nodermatoses sont caract ris es par un trouble de la cornification associ une perturbation de la diff renciation k ratinocytaire et conduisent a des pathologies ichtyosiformes g n ralis es s cheresse cutan e importante et formation de larges squames ou localis es k ratodermies palmoplantaires Voici un tableau r capitulatif des principales g nodermatoses li es des mutations de g nes
225. dmis pour l organisation de la couche basale des EPU d crit la pr sence d une minorit de cellules souches isol es se divisant tr s rarement entour e de cellules d amplification transitoire TA cells Les cellules TA issues de la division asym trique d une cellule souche se divisent un nombre limit de fois lt de 15 cycles avant de s engager irr m diablement dans la diff renciation en gagnant la couche pineuse figure 31A L observation des EPU dans l piderme humain n a pu tre r alis e qu assez r cemment au moyen de greffes de biopsies de pr puce sur des souris nude suivies de transfection par des lentivirus contenant le gene de la GFP Ghazizadeh and Taichman 2005 figure 32 Apr s 28 semaines les cellules exprimant la GFP sont organis es en colonnes typiques La largeur de ces colonnes semble variable suivant la localisation anatomique creux ou sommet des papilles dermiques 65 ee 8 O 1 blessure i 8 1 Vi EPC i SC SC TAT TA2 TA3 temps Figure 31 Renouvellement de l piderme A Mod le d organisation des cellules pidermiques en unit s EPU propos par Potten B Les cellules la base des EPU se r partissent en cellules souches SC se divisant rarement en cellules d amplification transitoire TA1 3 et en cellules post mitotiques PM passant alors dans le compartiment suprabasal C Dans le mod le propos par Clayton et collaborateu
226. e haut d bit ainsi que le volume et la diversit de nature des informations g n r es par ces techniques rendent cette int gration impossible pour des quipes ou des laboratoires isol s Pour faciliter cette tape d int gration un premier pas a t franchi vers un formatage universel des donn es gr ce aux standards d finis par la MGED Society non seulement pour les donn es de puces ADN standard MIAME mais plus largement pour toutes les donn es d expression g nique avec MAGE MicroArray and Gene Expression de s quen age avec MINSEQE Minimal INformation about a high throughput SEQuencing Experiment de prot omique 245 g nomique etc l ensemble des standards tant regroup sous le projet MIBBI Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations http www mibbi org L emploi aujourd hui tr s marginal de LIMS Laboratory Information Management System sorte de cahier de manipulation num rique permettant un suivi parfait de toutes les tapes depuis la collecte des chantillons jusqu aux m thodes d analyse employ es facilitera plus long terme l limination des donn es peu fiables d pos es dans les banques et la comparaison entre tudes A ce jour plusieurs projets publics de grande ampleur l un francais SIDR Standard based Infrastructure with Distributed Resources lanc par l INIST l Institut de l Information Scientifique et Technique du CNRS http www sidr
227. e ARIH OMIM 610765 ST14 Matriptase Syndrome de Papillon Lef vre OMIM 245000 Syndrome de Netherton OMIM 256500 B b collodion k ratodermie palmoplantaire signes cliniques proches de l IL ou NCIE trouble massif et g n ralis de la desquamation ryth me B b collodion ryth me ectropion eclabium K ratose hyperprolif rative Hyperk ratose fragilit cutan e bulles intra pidermiques et vacuolisation des couches suprabasales Cardiomyopathie k ratodermie palmoplantaire cheveux laineux Atteinte acrale ryth me indolore d tachement de l piderme au niveau de la couche corn e Hyperk ratose diffuse hypotrichose g n ralis e et diffuse prurit Syndrome similaire OMIM 602400 avec galement une atrophodermie folliculaire et une hypohidrose d des mutations du m me g ne Alef et al 2009 Hyperk ratose palmoplantaire p riodontite conduisant la perte de la dentition Erythrodermie ichtyosiforme cheveux bambous atopie dans 34 des cas 117 D ficit de la fonction barri re Maladie de Gaucher GBA gluco TEWL augment ichtyose OMIM 230800 c r brosidase mort l ge de 18 mois due a des troubles neurologiques Erythrodermie ichtyosiforme Syndrome de ee CGI 58 ABHD5 h patospl nom galie Chanarin Dorfman OMIM 275630 accumulation de gouttelettes lipidiques nbx tissus Syndrome de Sjo
228. e afin de la comparer la s quence tudi e et de d terminer le degr de ressemblance et la probabilit d observer un tel motif Plusieurs bases de donn es regroupent un grand nombre de matrices citons les bases de donn es publiques ooTFD object oriented Transcription Factors Database 457 matrices http www ifti org ootfd et TransFac 398 matrices http www gene regulation com pub databases html ou encore la base MatBase d velopp e par Genomatix http www genomatix de products index html tr s compl te 974 matrices mais payante 49 1 3 3 2 Recherche de r gions conserv es La recherche de TFBS tant limit e aux facteurs de transcription dont on conna t la sp cificit de liaison ADN une partie des s quences susceptibles de jouer un r le dans la r gulation g nique peuvent chapper cette approche La recherche de r gions conserv es au cours de l volution part du postulat que parmi les s quences du g nome codantes ou non les portions contenant une information importante auront tendance accumuler moins de mutations que les portions contenant peu d information parce que ces mutations auront plus de chances d tre d l t res Parmi les s quences non codantes mais porteuses d une information cruciale figurent notamment les l ments du c ur des promoteurs core elements tels que la bo te TATA la s quence initiatrice Inr correspond au point 1 de transcription etc figure
229. e l obstacle que repr sente la diversit des techniques puces oligonucl otides courts longs ADNc hybridation simple ou double et des annotations employ es par les fabricants nom de g ne symbole officiel ou alias r f rence de la sonde propre au fabricant rend la comparaison complexe et augmente le risque d erreur d o l int r t d employer une ontologie pr cise Bien que se situant un degr sup rieur int gration des donn es c est dire l assimilation et l assemblage de nombreuses informations de omique de nature souvent diff rente transcriptomique prot omique m tabolomique en un portrait coh rent des v nements r els se heurte galement au m me probl me de la diversit de nature et d annotation des donn es L int gration repr sente pourtant un des d fis les plus cruciaux pour la bioinformatique et plus largement la biologie cellulaire et mol culaire le but ultime tant de parvenir une description aussi compl te que possible des v nements ayant lieu a tous les niveaux mol cules cellules tissus organes organismes entiers et m me populations ceci afin de pouvoir mod liser les syst mes biologiques dans leur ensemble en tenant compte de leur exceptionnelle complexit Si les outils sont th oriquement disponibles ou port e de d veloppement l absence quasi compl te de nomenclature commune l ensemble des techniques de g nomique fonctionnell
230. e multig nique et multifactorielle de grandes disparit s tant constat es selon les diff rentes populations consid r es De nombreuses tudes de liaison ont d fini une 120 vingtaine de loci de susceptibilit pour le psoriasis familial dont les plus document s sont nomm s PSORS PSORS1 6p21 3 PSORS2 17q25 PSORS3 4q PSORS4 1q21 PSORS5 3q21 PSORS6 19p13 PSORS7 1p PSORS8 16q PSORS9 4q31 q34 PSORS10 18p11 23 et PSORS11 5q31 1 q33 1 PSORS1 contribuerait jusqu 65 dans la forme familiale du psoriasis Gudjonsson et al 2006 et contient les g nes codant pour le HLA C et la CDSN Si des travaux g n tiques ont initialement sugg r une liaison entre certains alleles du gene CDSN et la susceptibilit cette maladie Capon et al 2003 Capon et al 2004 la contribution de ce g ne a t cart e par deux tudes plus r centes dans des populations diff rentes faisant du g ne HLA Cw6 all le Cw o602 le candidat le plus probable au sein du locus PSORS1 Helms et al 2005 Nair et al 2006 La possible contribution du locus PSORS4 est plus vidente situ en 1q21 il correspond une partie de EDC le complexe de diff renciation pidermique comportant un grand nombre de g nes sp cifiques du k ratinocyte granuleux Dans une r cente tude plusieurs g nes faisant partie du locus de susceptibilit au psoriasis PSORS4 et notamment les g nes de la famille SPRR sont ainsi apparus
231. e quantit les puces employ es plan exact de la puce le protocole d hybridation chantillons quantit tampon temp rature dur e le plan exp rimental comparaison de deux types cellulaires profiling 1 3 2 Outils d annotation de l information la connaissance Les techniques haut d bit g n rent un tel flux de donn es _ d expression que leur d p t dans des DATA banques de donn es n est pas de loin DATA ab ace tw Data Data tata ASN DATA Ainsi HATA sae DA D Data la seule tape posant probl me Ainsi TA o DATA DATAM Data Data Data Vata Vata DATA PAZA lannotation c est a dire le retour au 46 versant biologique de ces approches s av re g n ralement complexe que ce soit a l chelle d un m me projet ou lorsqu on tente de comparer les donn es g n r es par plusieurs quipes ou groupes A l chelle d un projet l tape cruciale est le passage d une information issue de donn es analys es une connaissance biologique soit par exemple le passage de donn es normalis es de puces ADN liste de g nes diff rentiellement exprim s une description des fonctions connues ou suppos es de ces g nes Suivant le volume de donn es g n r es l analyse manuelle bien que pr sentant un niveau de fiabilit lev peut s av rer une solution trop co teuse en temps voire impossible en plus d avoir le d faut de consid rer les g nes
232. e souris transg niques K5 XDIx3 pr sentent un trouble l tal de la fonction barri re Morasso et al 1996 avec un piderme atrophique et parak ratosique une diminution du nombre de granules de k ratohyaline dans la couche granuleuse et une expression de plusieurs marqueurs tardifs de la diff renciation dans la couche basale notamment Flg dont les auteurs montrent qu il est une cible directe de Dlx3 Toutefois en raison de son r le crucial dans le d veloppement du placenta au cours de l embryogen se Morasso et al 1999 l exploration directe du r le de Dlx3 par inactivation chez la souris a longtemps t impossible r aliser R cemment la Figure 54 Expression de DIx3 dans l piderme murin Morasso et al 1996 105 g n ration de souris invalid es sp cifiquement au niveau de l piderme pour Dlx3 a amen a reconsid rer l importance de ce facteur dans tablissement de la fonction barri re Hwang et al 2008 En effet ces souris ne pr sentent aucun ph notype cutan mais pr sentent une alop cie totale d montrant le r le de Dlx3 dans la formation et le cycle des follicules pileux L absence de ph notype cutan est en accord avec le syndrome tricho dento osseux OMIM 190320 observ chez l homme qui est caus par des mutations dominantes situ es dans lexon 3 du g ne Dix3 d l tions entra nant un d calage du cadre de lecture et se caract rise par des cheveux cassants une am
233. e Nucleotide Polymorphism TA Transit Amplifying cells FT Facteur de Transcription TFBS Transcription Factor Binding Site TNF Tumor Necrosis Factor VS versus RESUME Au sein de l piderme la fonction de barri re est assur e par la partie la plus superficielle la couche corn e constitu e de corn ocytes des cellules mortes tr s coh sives entour es d une matrice lipidique Un processus complexe de mort cellulaire programm e la cornification aboutit a la transformation des derni res cellules vivantes les k ratinocytes granuleux en corn ocytes d pourvus d activit transcriptionnelle et traductionnelle Les k ratinocytes granuleux constituent donc la fois le stade ultime de la diff renciation pidermique mais aussi celui o sont produits les diff rents acteurs de la cornification et de la desquamation donc de la fonction barri re Tr s peu d tudes mol culaires syst matiques ont t consacr es l piderme humain et seulement quatre facteurs de transcription sp cifiques requis pour la fonction barri re ont t identifi s Le travail pr sent ici combine plusieurs techniques grande chelle afin d identifier de nouveaux g nes impliqu s dans les tapes tardives de ce programme Un proc d de purification de cellules a partir d piderme humain normal a t d velopp afin d obtenir des fractions enrichies en k ratinocytes de diff rents stades de diff renciation Ce proc d
234. e contribution of 700 000 ORF sequence tags to the definition of the human transcriptome Proc Natl Acad Sci U SA 98 12103 12108 Candi E Schmidt R and Melino G 2005 The cornified envelope a model of cell death in the skin Nat Rev Mol Cell Biol 6 328 340 Capon F Allen M H Ameen M Burden A D Tillman D Barker J N and Trembath R C 2004 A synonymous SNP of the corneodesmosin gene leads to increased mRNA stability and demonstrates association with psoriasis across diverse ethnic groups Hum Mol Genet 13 2361 2368 Capon F Semprini S Chimenti S Fabrizi G Zambruno G Murgia S Carcassi C Fazio M Mingarelli R Dallapiccola B and Novelli G 2001 Fine mapping of the PSORS4 psoriasis susceptibility region on chromosome 1q21 J Invest Dermatol 116 728 730 Capon F Toal I K Evans J C Allen M H Patel S Tillman D Burden D Barker J N and Trembath R C 2003 Haplotype analysis of distantly related populations implicates corneodesmosin in psoriasis susceptibility J Med Genet 40 447 452 Carroll J M Albers K M Garlick J A Harrington R and Taichman L B 1993 Tissue and stratum specific expression of the human involucrin promoter in transgenic mice Proc Natl Acad Sci U S A 90 10270 10274 Carroll J M Romero M R and Watt F M 1995 Suprabasal integrin expression in the epidermis of transgenic mice results in developmental defects and a phenotype resembling
235. e cytosol n cessaire la signalisation calcique Des mutations dominantes de ces deux g nes sont responsables respectivement de la maladie de Darier White OMIM 124200 et de sa variante de l acrok ratose verruciforme OMIM 101900 et de la maladie de Hailey Hailey OMIM 169600 La maladie de Darier White transmise sur le mode autosomique dominant est li e des mutations non sens ou faux sens du g ne ATP2A2 Elle se caract rise par la pr sence de bulles une ichtyose et une dystrophie ungu ale L analyse histologique montre un d tachement des k ratinocytes au niveau de la couche pineuse accompagn d une acantholyse En microscopie lectronique une perte de coh sion au niveau des desmosomes et une d sorganisation du r seau de filaments interm diaires qui s agr gent a la p riph rie du noyau sont mises en vidence Ces observations sugg rent que la maladie r sulte d un d faut de formation des complexes desmosomes filaments interm diaires de k ratines L acrok ratose 97 verruciforme d aspect clinique diff rent l sions hyperk ratosiques et verruciformes sur la face dorsale des extr mit s est caus e par une mutation faux sens P602L du g ne ATP2A2 ce qui fait de cette maladie un variant all lique de la maladie de Darier Tandis que les mutations non sens entrainant la d gradation de ARNm mut par le NMD plaident en faveur d un m canisme d haploinsuffisance les diff rences p
236. e de billes magn tiques coupl es des anticorps dirig s contre l int grine 64 sp cifiquement exprim e par ces cellules Des puces Affymetrix HU95 10 000 g nes ont t utilis es pour comparer les cellules 64 aux cellules B4 et l piderme entier partir de 3 donneurs sains Comme attendu les genes plus fortement exprim s dans la population de k ratinocytes basaux 64 codent pour des prot ines de l h midesmosome du cycle cellulaire et de la r plication de ADN Les g nes plus fortement exprim s dans la population de cellules B4 135 correspondent aux marqueurs de la diff renciation pidermique et en particulier aux genes situ s dans EDC LOR IVL FLG SPRRs Les 2 populations cellulaires expriment aussi de fa on diff rentielle les g nes codant pour des prot ines impliqu es dans l adh sion la matrice extracellulaire le m tabolisme et la signalisation D autre part 49 g nes surexprim s dans les cellules B4 sont sp cifiques des m lanocytes En fait cette derni re population est tr s h t rog ne puisque compos e de k ratinocytes suprabasaux ainsi que des autres types cellulaires pidermiques m lanocytes cellules de Langerhans et cellules de Merkel Une autre limitation dans cette tude vient du fait que les k ratinocytes granuleux sont plus r sistants la trypsine que les autres k ratinocytes et demeurent accroch s la couche corn e de ce fait ils sont majoritairement abs
237. e du 454 pour sa strat gie d amplification par PCR en mulsion mais l tape de s quencage est radicalement diff rente puisque effectu e en absence de polym rase Apr s la fragmentation de l ADN et l ajout d adaptateurs diff rents aux extr mit s les fragments sont captur s par des billes et amplifi s par PCR en mulsion Puis les extr mit s 3 des fragments sont modifi es afin de permettre la fixation covalente avec le support de verre sur lequel les billes sont d pos es plusieurs dizaines de millions de billes par lame de verre Une fois immobilis s sur le support les fragments sont hybrid s avec une amorce universelle de longueur n compl mentaire d un des adaptateurs Puis au lieu d employer une ADN polym rase comme pr c demment d crit la technique SOLiD fait appel un m lange d oligonucl otides marqu s et utilise une ligase pour d terminer la s quence du brin d ADN Il est crucial de d crire la conception des oligonucl otides pour bien appr hender la technique SOLID Chaque oligo de formule 3 XX NNN YYY 5 poss de un des 16 dinucl otides sp cifiques sur les bases 1 et 2 XX est d g n r sur les bases 3 5 NNN ainsi que sur les bases 6 8 YYY coupl es un des quatre fluorochromes employ s pour marquer les oligos Seules les bases XX donnent une information sur la s quence d ADN mais seulement apr s plusieurs tapes puisqu il y a seulement 4 fluorochromes pour 16 dinucl otides Da
238. e hair follicles display an altered morphology their upper part from the infudibulum to the skin surface is distended arrows and they are associated with hypertrophic sebaceous glands arrowheads D dermis E epidermis C Immunohistochemical staining with F28 27 mAb CDSN of ventral skin sections from control and TAM mice shows an effective loss of CDSN expression in the stratum granulosum of the epidermis and the IRS of the hair follicles in TAM mouse D Higher magnification corresponding to the areas boxed in B shows in detail hyperproliferation hyperkeratosis and abnormally distended hair follicles left panel hypertrophic sebaceous glands right panel Scale bars 100 um B C 20 um D grafted skin as well as in the adult KO models revealing that CDSN is also required for hair follicle integrity Cdsn inactivation is useful to examine the function of CDSN within the corncodesmosome As previously shown Matsumoto et al 2008 the major consequence observed here was an epidermal tear at sites of trauma and friction Our detailed analysis of the neonatal phenotype showed that although the greatly reduced mechanical resistance of the stratum comeum is an intrinsic feature caused by Cdsn deficiency epidermal tear leading to lethal barrier defect occurred only under mechanical stress encountered after birth At the histological level blisters were found as soon as cornification occurred that is at the stratum granulosum
239. e l HSS est d un gain de fonction de la forme tronqu e et non a une haploinsuffisance Enfin le g ne CDSN est localis dans le locus PSORS1 en 6p21 3 locus majeur de susceptibilit au Psoriasis familial OMIM 177900 maladie inflammatoire chronique dont la physiopathologie est encore mal comprise mais plusieurs travaux Helms et al 2005 Nair et al 2006 sugg rent fortement que CDSN n est pas le g ne responsable de la liaison entre PSORS1 et la maladie 223 R gulation des tapes tardives de la diff renciation 2 2 3 1 Voies de signalisation Si plusieurs voies de signalisation ont t identifi es comme intervenant dans la r gulation de la prolif ration ou l initiation de la diff renciation peu de voies ont t caract ris es en ce qui concerne les tapes tardives Seules les voies de signalisation du calcium de la vitamine D et des d riv s de l acide arachidonique partiellement d crites ce jour sont connues pour leur implication directe dans la fonction barri re 2 2 3 LL Voie calcique L piderme pr sente un gradient de calcium de la profondeur vers la surface des couches vivantes puis sa concentration diminue dans la couche corn e comme 95 d montr par une analyse ionique de ce tissu aux rayons X Forslind 1986 In vitro l augmentation de la concentration de calcium dans le milieu de culture est une m thode tr s classique pour induire la stratification et la diff renciation des
240. ee HGNC these new hypothetical lipase genes LIPL1 LIPL2 LIPL3 and LIPL4 have been renamed LIPJ LIPK LIPM and LIPN respectively Rapid amplification of cDNA ends RACE cloning experi ments of the human LIPK mRNA localized the cap site 165 nt upstream of the conceptual ATG initiation codon For the LIPM and LIPN mRNAs the entire coding sequences have been cloned using primers deduced from alignments with the mouse cDNAs GenBank EF426482 GenBank EF426484 and GenBank EF426483 The conceptual translation of LIPJ LIPK LIPM and LIPN ORFs led to proteins of 366 399 423 and 398 amino acids respectively As is the case for LIPA and LIPF these proteins contain an abhydrolase associated lipase region PFAM PF04083 with an alpha beta hydrolase fold domain PFAM PF00561 More precisely they display the characteristic Ser Asp His catalytic triad Figure 5b also present in various hydrolases such as serine proteases 35 36 Surprisingly LIPJ NM_001010939 appeared as the only member in this family to lack a cleavable signal peptide Figure 5b and might thus play a distinct role in human physiology The clustering of six lipase genes on the human 10q23 31 locus led us to examine in detail the syntenic mouse locus 19qC1 where the orthologous genes except for LIPN and LIPJ had already been identified or predicted Sequence analysis showed that the AK154333 cDNA clearly corre sponds to the LIPN orthologue 89 homology As
241. eeding protocol described previously Resulting animals were wild type mice K 4CreER Cdsn or K14CreER Cdsn heterozygous pre mutant mice KI4CreERT 80 Cdsn 3 and homozygous pre mutant mice KI4CreERT 8 Can denoted hereafter HOMO In the absence of treatment HOMO mice did not develop any skin or hair phenotype for at least 6 months denoting no leakiness of uninduced CreER Generalized or localized temporally controlled Cdsn excision was achieved in the skin of adult HOMO mice by intraperitoneal injection of tamoxifen Tam or topical application of OHT respectively In both cases immunodetection of CDSN revealed a loss of Cdsn expression in epidermal keratinocytes and in the IRS of hair follicles Fig 8C Fig 9C HOMO mice injected with Tam or locally treated with OHT developed a skin phenotype with variable kinetics according to the individuals but once the phenotype had initiated it progressed within 5 days to a critical situation Wild type mice treated in the same conditions never developed any phenotype denoting the absence of toxicity of Tam or OHT in our experimental conditions We attributed the variation in the kinetic of the HOMO mice phenotype onset to the genetic background heterogeneity of the mice For this reason we used TEWL values to evaluate the onset and progress of the phenotype Typically TEWL values reached 4 5 g m per hour when the first scales became visible and rose to 33 g m7 per hour as the
242. egulation during in vivo GK differentiation by quantitative real time PCR qRT PCR Materials and Methods Ethics statement 171 Human skin samples were obtained from healthy donors undergoing previously scheduled abdominal plastic surgery Professor J P Chavoin Service de Chirurgie Plastique Reconstructrice et Esth tique Centre Hospitalier Universitaire Rangueil Toulouse Before anonymous skin samples were provided to our lab informed written consent was obtained from donors as recommended by local ethics committee CHU Toulouse France and in accordance with Helsinki principles Skin samples and RNA extraction Skin samples obtained from six healthy subjects were processed as previously described Briefly after dermis separation epidermal fragments were incubated in trypsin EDTA three times at 4 C for 15 min Successively dissociated cells were named T1 mainly basal keratinocytes or BKs T2 and T3 while residual fragments constituted the T4 fraction predominantly composed of GKs and cornified layer Total RNA from BKs T1 and GKs T4 were isolated and concentrated using RNeasy columns Qiagen RNA quality purity and concentration were checked on agarose gels and on the RNA 6000 Nano LabChip with 2100 Bioanalyzer Agilent Samples used for analyses showed ODogeq289 gt 1 65 a 285 185 ratio gt 1 6 and no visible degradation of rRNA or genomic DNA contamination Microarrays experiments Total RNA isolated from BKs
243. eliably quantified by qRT PCR and confirmed by sequencing see Table S2 for the sequences of primers Indeed the use of primers located in different exons associated with sequencing constitutes a definite evidence of their expression in normal epidermis Among these genes 49 were overexpressed in the GK fraction 2 1 lt A ratio lt 45 Table 1 and 86 showed no differential expression Table 2 whereas 22 were more highly expressed in the BK fraction 0 14 lt R lt 0 49 Table 3 Among the 49 upregulated genes 9 were selected from the ORESTEs database 19 as a result of microarray experiments 6 using Genomatix tools and one from literature Only 8 genes were retained from both microarrays and ORESTES database and 6 from both ORESTEs and Genomatix tools This low redundancy highlights the complementarity of the sources and thus the relevance of a multi technique approach As we focused on these functions upregulated genes comprise several transcriptional regulators 20 genes and signal proteins 8 genes Other functional categories are represented by small gene numbers Four genes SH3KBP1 LRBA EHD4 and D4S234E are probably involved in vesicle trafficking and cell polarity Four transporters potentially important for GK differentiation were also identified a calcium sodium exchanger 175 SLC8A1 a calcium activated chloride channel CLCA4 a zinc transporter SLC39A6 and a proton pump subunit ATP6V0A7 Three genes involved in lipi
244. elon isoformes localisation membranaire et cytoplasmique Ms add Sp cifiques de l piderme murin Ainsi il appara t qu une double barri re a la fois lipidique et prot ique est requise pour garantir l imperm abilit de l piderme Toutefois il ne s agit que d un aspect de la fonction barri re la r sistance de l piderme aux fortes contraintes m caniques auxquelles il est soumis tant galement un pr requis pour qu il assure sa fonction 80 2 2 2 2 2 Resistance m canique La r sistance de la couche corn e fait intervenir trois l ments en continuit physique la matrice fibreuse composant l int rieur des corn ocytes l enveloppe corn e qui forme une sorte de coque autour de cette matrice et remplace la membrane plasmique et enfin les corn odesmosomes liant entre eux les corn ocytes et assurant leur coh sion 2 2 2 2 2 1 Matrice fibreuse La compaction des filaments interm diaires de k ratines dans les corn ocytes par la filaggrine est vraisemblablement responsable de l aplatissement de ces cellules Le cytoplasme est remplac par une matrice fibreuse essentiellement form e de k ratines agr g es Les filaments interm diaires FI de k ratines sont une composante essentielle du cytosquelette pidermique permettant la coh sion de ce tissu gr ce notamment leur connexion intercellulaire par l interm diaire des desmosomes et la lame basale par l interm diaire des h m
245. ens cCONA FLJ37969 nucleoporin 205kDa cell division cycle 14 homolog B S cerevisiae A kinase PRKA anchor protein 11 T cell immune regulator 1 ATPase H transporting lysosomal VO subunit A3 Homo sapiens cCONA FLJ11900 family with sequence similarity 26 member E SRY sex determining region Y box 12 Kallikrein related peptidase 5 hypothetical protein LOC27105 Kallikrein related peptidase 7 IQ motif and ubiquitin domain containing small proline rich protein 2C B melanoma antigen hypothetical protein LOC255783 GK vs BK Fold Change 27 58 26 03 19 71 16 98 16 41 16 37 15 2 14 75 14 02 13 94 12 32 12 06 11 38 10 62 10 39 10 24 10 23 10 1 10 01 9 95 194 MPP6 CSTA LOC201181 AKO24255 CASQ1 SLCSOAEG KRTAP10 10 DUSP22 IM4SF19 NDORG4 LOC201617 ZNF230 AK094394 HOPX ECM1 ACBD6 CNEN TSSKiB KRTAP19 5 ae tals loo PJ MAP 7D1 SLC39A10 GJE LDLRAD2 PLEKHA2 FAM125 LILRB4 ACSL4 RAB B KONHS HLA DOB1 UBIAD1 RBKS SPATA21 ITPKC immunoglobulin lambda locus membrane protein palmitoylated 6 MAGUK p55 subfamily member 6 eystatin A stefin A zine finger protein 385 C Galectin related protein glutamine rich 2 NADPH dependent diflavin oxidoreductase 1 splicing factor arginine serine rich 8 suppressor of white apricot homolog Drosophila Homo sapiens cDNA FLJ14193 calsequestrin 1 fast twitch skeletal muscle solute carrier family 30 zinc
246. ent donc la fausser Les donn es brutes ne sont donc pas directement analysables et comparables et n cessitent de s affranchir de deux types d erreurs de mesure 27 meee Pro annl eS FB rm Marquage des d p ts non conformes LY Mesure du Mesure du bruit de fond signal du local d p t Figure 8 Analyse d un scan de microarray avec le logiciel Genepix Les logiciels d analyse d images de puces d finissent une trame partir d un plan de la puce fichier gal puis cette trame est ajust e de fa on semi automatique sur le scan r el Les d p ts ou hybridations non conformes poussi re raflure sont marqu s pour tre ignor s Le logiciel quantifie le signal dans l aire de chaque d p t moyenne ou m diane de l intensit des pixels mais aussi autour des d p ts pour d terminer le bruit de fond Les erreurs syst matiques sont dues des biais se produisant sur l ensemble des donn es avec une amplitude g n ralement similaire d une exp rience une autre et qui surtout est mesurable partir des donn es Elles correspondent notamment des diff rences dans les quantit s de mat riel au d part dans l efficacit des diff rentes tapes d extraction des ARN de la transcription inverse du marquage diff rence d incorporation des diff rentes cyanines mais aussi de leur rendement quantique de l hybridation du scan Ces biais peuvent tre corrig s en calibrant
247. ent of an ichthyosiform phenotype in Alox12b deficient mouse skin transplants J Invest Dermatol 129 1429 1436 De Laurenzi V Rogers G R Hamrock D J Marekov L N Steinert P M Compton J G Markova N and Rizzo W B 1996 Sjogren Larsson syndrome is caused by mutations in the fatty aldehyde dehydrogenase gene Nat Genet 12 52 57 Denecker G Hoste E Gilbert B Hochepied T Ovaere P Lippens S Van den Broecke C Van Damme P D Herde K Hachem J P Borgonie G Presland R B Schoonjans L Libert C Vandekerckhove J Gevaert K Vandenabeele P and Declercq W 2007 Caspase 14 protects against epidermal UVB photodamage and water loss Nat Cell Biol 9 666 674 Deraison C Bonnart C Lopez F Besson C Robinson R Jayakumar A Wagberg F Brattsand M Hachem J P Leonardsson G and Hovnanian A 2007 LEKTI 268 fragments specifically inhibit KLK5 KLK7 and KLK14 and control desquamation through a pH dependent interaction Mol Biol Cell 18 3607 3619 Derry J M Gormally E Means G D Zhao W Meindl A Kelley R I Boyd Y and Herman G E 1999 Mutations in a delta 8 delta 7 sterol isomerase in the tattered mouse and X linked dominant chondrodysplasia punctata Nat Genet 22 286 290 Descargues P Deraison C Bonnart C Kreft M Kishibe M Ishida Yamamoto A Elias P Barrandon Y Zambruno G Sonnenberg A and Hovnanian A 2005 Spink5 deficient
248. entification of differentiation specific genes To optimize the discovery of new proteins involved in the differentiation data compiled from several sources and techniques were used to select a large number of gene candidates for subsequent qRT PCR analyses Fig 1 First pangenomic oligonucleotide microarrays were used for global transcriptional profiling Complementary DNAs prepared from GKs and BKs isolated from six individuals were cohybridized onto microarrays see Material and Methods and Supporting information Statistical analysis using a local False Discovery Rate FDR threshold of 0 05 and a two fold ratio threshold revealed 203 upregulated genes and 3 downregulated Fig S1 amp Table 51 Among the upregulated genes 23 were known players of epidermal differentiation while 180 were not previously known to be expressed in the human epidermis Therefore the microarray analysis provided us with the first series of gene candidates The second source for potential differentiation associated genes was our EST dataset obtained from the GK fraction which matched 3 387 different genes A third strategy to select additional candidates was to identify transcription factor binding sites within promoter sequences of 52 genes expressed in differentiated keratinocytes focusing on conserved non coding sequences within the 2 8 kb proximal region Recurrent binding sites were identified and several modules i e evolutionarily conserved combinat
249. ents de la fraction cellulaire B4 ce qui limite l identification des g nes les plus tardivement exprim s Ceux ci ne sont identifi s que par d duction puisque d tect s dans l piderme entier et absents des fractions B4 et B4 ratio piderme K pineux gt 1 7 Cette approche est donc moins susceptible d identifier de nouveaux g nes d expression tardive qu une comparaison directe des k ratinocytes granuleux avec une r f rence L tat des connaissances concernant le transcriptome des diff rentes couches de l piderme apparait donc tr s fragmentaire en particulier in vivo Pour cette raison notre quipe s est attach e a d crire le transcriptome des k ratinocytes granuleux partir d piderme humain normal dans le but d identifier des g nes sp cifiquement exprim s dans ces cellules et impliqu s dans la r gulation du programme de diff renciation dans la cornification ou dans la desquamation Les r sultats exp rimentaux qui suivent d crivent notamment une proc dure de purification par incubations it ratives en bain de trypsine permettant un enrichissement progressif en k ratinocytes granuleux Cette technique a permis dans un premier temps d identifier pr s de 3400 g nes sp cifiquement exprim s dans les k ratinocytes granuleux par s quencage d une banque d ESTs produits par la technique des ORESTES Toulza et al 2007 Cette m thode autorise la d tection de l expression m me tr s fai
250. environ 10 du volume cytoplasmique des k ratinocytes granuleux Ce compartiment repr sente vraisemblablement un syst me de stockage des lipides destin e extracellulaire avant leur s cr tion Les k ratinosomes transportent aussi en plus de la CDSN et des prot ines r gulant la desquamation une partie des enzymes charg es de la transformation des lipides telles que la st roide sulfatase la beta glucoc r brosidase la sphingomy linase et les phospholipases A2 s cr t es A ce jour on peut supposer que toutes les prot ines extracellulaires dot es d un peptide signal transitent par les k ratinosomes Les transporteurs de la famille ABC ATP Binding Cassette constituent une superfamille de prot ines plusieurs domaines transmembranaires volutivement tr s conserv es formant un canal qui permet le transport ATP d pendant de biomol cules travers les membranes Les membres de la sous famille ABCA participent au transfert de lipides travers les membranes d un compartiment l autre de la cellule Kaminski et al 2006 et participent probablement l accumulation des lipides dans les corps lamellaires Ainsi des mutations inactivant lexpression du transporteur ABCA12 mutations non sens et d l tions ont t identifi es chez patients atteints d ichtyose arlequin Lefevre et al 2003 Kelsell et al 2005 L ichtyose arlequin OMIM 242500 g nodermatose transmise sur le mode autosomique r cessif cong
251. eparation our results suggest an extreme fragility of the intercellular links No acanthosis or hyperkeratosis was observed in either dorsal or ventral KO epidermis Immunohistochemical labeling of skin sections with F28 27 mAb confirmed the complete absence of CDSN in the stratum granulosum and IRS of hair follicles in KO mice Fig 4B Transcriptional activity of the human KRT14 promoter in transgenic mice is largely restricted to external epithelia with a reduced expression in more internal stratified tissues Wang et al 1997 In accordance with these findings CDSN was still detected in the tongue the hard palate and the esophagus of KO newborns Fig 4C and data not shown Corneodesmosomes deficient for CDSN display normal morphology but impaired functionality Transmission electron microscopy performed on dorsal skin of WT and KO neonates revealed a similar organization of the granular layer The thickness of stratum corneum from KO mice was also unchanged with 10 to 13 layers Fig SA B Some blisters already detected by optical microscopy were present between the stratum granulosum and stratum corneum Fig 5J and data not shown The ultrastructure of desmosomes and corneodesmosomes was analyzed at higher magnification In granular keratinocytes from both WT and KO animals the same characteristic symmetrical tri lamellar structure of regular desmosomes was observed Fig 5C F Morphological changes accompanying cornification o
252. er Wiederkehr C Chung S S Demougin P Gattiker A Moore J Patard J J Wolgemuth D J Jegou B and Primig M 2007 The conserved transcriptome in human and rodent male gametogenesis Proc Natl Acad Sci U S A 104 8346 8351 Chan T A Hermeking H Lengauer C Kinzler K W and Vogelstein B 1999 14 3 3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage Nature 401 616 620 Chapman S J and Walsh A 1990 Desmosomes corneosomes and desquamation An ultrastructural study of adult pig epidermis Arch Dermatol Res 282 304 310 Chavanas S Bodemer C Rochat A Hamel Teillac D Ali M Irvine A D Bonafe J L Wilkinson J Taieb A Barrandon Y Harper J I de Prost Y and Hovnanian A 2000 Mutations in SPINK5 encoding a serine protease inhibitor cause Netherton syndrome Nat Genet 25 141 142 Chen X Xu H Yuan P Fang F Huss M Vega V B Wong E Orlov Y L Zhang W Jiang J Loh Y H Yeo H C Yeo Z X Narang V Govindarajan K R Leong B Shahab A Ruan Y Bourque G Sung W K Clarke N D Wei C L and Ng H H 2008 Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells Cell 133 1106 1117 Cheng J Syder A J Yu Q C Letai A Paller A S and Fuchs E 1992 The genetic basis of epidermolytic hyperkeratosis a disorder of differentiation specific epidermal keratin genes Cell 70 8
253. er of the S100 fused type protein family PLoS One 4 e5227 Xiao H S Huang Q H Zhang F X Bao L Lu Y J Guo C Yang L Huang W J Fu G Xu S H Cheng X P Yan Q Zhu Z D Zhang X Chen Z Han Z G and Zhang X 2002 Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain Proc Natl Acad Sci U S A 99 8360 8365 Xie Z Komuves L Yu Q C Elalieh H Ng D C Leary C Chang S Crumrine D Yoshizawa T Kato S and Bikle D D 2002 Lack of the vitamin D receptor is associated with reduced epidermal differentiation and hair follicle growth J Invest Dermatol 118 11 16 Xu X R Huang J Xu Z G Qian B Z Zhu Z D Yan Q Cai T Zhang X Xiao H S Qu J Liu F Huang Q H Cheng Z H Li N G Du J J Hu W Shen K T Lu G Fu G Zhong M Xu S H Gu W Y Huang W Zhao X T Hu G X Gu J R Chen Z and Han Z G 2001 Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver Proc Natl Acad Sci US A 98 15089 15094 Yamaguchi T and Osumi T 2009 Chanarin Dorfman syndrome deficiency in CGI 58 a lipid droplet bound coactivator of lipase Biochim Biophys Acta 1791 519 523 Yan Q Liu J P and Li D W 2006 Apoptosis in lens development and pathology Differentiati
254. erately reinforced in the granular layer at the protein level Fig 2a SH3 domain kinase binding protein 1 SH3KBP1 which was strongly overexpressed at MRNA level R 64 appears to be restricted to the granular layer Fig 2b These two validations by IHC on normal human skin strengthen our gene expression profiling by qRT PCR and suggest that genes displaying the highest qRT PCR ratios are more likely to have a GK restricted expression while others may be expressed earlier i e in all suprabasal layers or progressively upregulated through differentiation 176 Discussion An integrated approach to identify novel human differentiation associated genes Basal B and suprabasal S keratinocyte fractions separated by integrin beta 4 expression levels were analysed in a previous transcriptome study of human epidermis However aS most GKs remain attached to the stratum corneum after extensive trypsin treatment GKs were largely absent from the S fraction Accordingly the authors noted that several gene transcripts were overexpressed in the S fraction relative to the B fraction but were underrepresented when compared to total epidermis Therefore our study complements these previous findings and directly identifies new GK expressed genes We discuss the potential roles of these new differentiation players based on function Potential roles of TF in the epidermis Our approach allowed identification of differentiation associated genes tha
255. es pith liales figure 38A et assurent l tanch it de certains pith liums en emp chant la diffusion de mol cules par la voie paracellulaire certaines sont particuli rement tanches notamment celles de l endoth lium vasculaire formant la barri re h mato enc phalique Plusieurs familles de prot ines quatre segments transmembranaires sont caract ristiques de ces jonctions telles que les claudines plus de 24 membres l occludine et la 17 tricelluline localis e uniquement aux points de contact entre trois cellules Du c t cytosolique plusieurs prot ines adaptatrices assurent la liaison au cytosquelette d actine les prot ines domaine PDZ interactions prot ine prot ine ZO Zonula Occludens 1 ZO 2 et ZO 3 MUPP1 multi PDZ Domain Protein 1 la cinguline etc Enfin de nombreuses prot ines impliqu es dans diverses voies de signalisation prot ines G PKC sont galement li es aux jonctions serr es Une tude alliant prot omique et bioinformatique souligne ainsi la pr sence av r e ou potentielle de plus de 900 prot ines diff rentes Tang 2006 Les jonctions serr es jouent la fois un role structurel fonctionnel et signalisateur divisant la membrane plasmique en plusieurs domaines apical vs baso lat ral de composition prot ique et lipidique variable et recrutant localement de nombreuses prot ines de signalisation ayant notamment une fonction pr pond rante dans le maintien
256. es and thus fits the less is more hypothesis 65 remains a fascinating question Our study of the human GK transcriptome thus opens new avenues for future research in many fields including the normal function ing of the epidermis the origin of genodermatoses and even the emergence of the human species Materials and methods Skin samples and RNA extraction Normal human skin was obtained from patients undergoing abdominal plastic surgery kindly provided by Professor JP Chavoin Service de Chirurgie Plastique et des Bril s Cen tre Hospitalier Universitaire Rangueil Toulouse France after informed consent and in accordance with Helsinki prin ciples Subcutaneous fat was promptly removed and strips of skin were incubated epidermis side up for 1h at 4 C in phos phate buffered saline PBS containing 0 5 mg ml thermo lysin T7902 Sigma St Louis MO USA The epidermis was dissected free of dermis tissue with forceps and rinsed in cold PBS Epidermal fragments were either immediately frozen for total RNA extraction or incubated in 1x trypsin EDTA solu tion 25300 054 Invitrogen Carlsbad CA USA at 4 C hetp genomebiology com 2007 8 6 R107 under gentle agitation for 15 minutes The remaining epider mal fragments were rinsed in cold PBS and incubated in another trypsin EDTA solution while fetal calf serum 10270098 Invitrogen was added to the suspended cells 10 final concentration After centrifugation the cells
257. es directement O I us e 2 2 HCH lt t NHACH2 5 responsables de la r ticulation pr coce des prot ines NH lt i d assemblage et de la consolidation avec les prot ines Glutamine Lysine de structure plus tardives jouent videmment un r le Transglutaminase Ca a crucial dans la cornification Ces enzymes produites sous forme de zymog nes sont matur es par des CH C NH CH NH prot ases encore peu caract ris es et deviennent probablement actives sous l effet de l augmentation du calcium intracellulaire Ces enzymes catalysent la formation d une liaison covalente entre le groupement gamma carboxamide de la cha ne lat rale d un r sidu glutamine et le groupement epsilon amino de la cha ne lat rale d un r sidu lysine EC 2 3 2 13 Bien que les diff rentes isoformes de transglutamisases pr sentes dans l piderme TGM1 3 et 5 aient la m me activit catalytique leur redondance n est qu apparente La TGM1 est une isoforme li e a la face cytosolique de la membrane plasmique par un acide gras et interviendrait conjointement avec la TGM5 sur l assemblage pr coce de l enveloppe corn e en liant entre elles les plakines essentiellement envoplakine et p riplakine et l involucrine selon le mod le propos par Peter Steinert figure 45 La TGM1 est galement responsable de la liaison sur la face externe de l enveloppe corn e des c ramides tr s longues cha nes d acides gras l
258. es ils sont fortement repr sent s dans les banques de donn es De ce fait la majorit des EST correspondant a des g nes de la diff renciation pidermique proviennent de carcinomes pidermoides Ceux ci expriment de nombreux marqueurs de la diff renciation pidermique Haider et al 2006 m me si a ce jour aucun n a t identifi comme constituant un facteur pronostique De plus tr s peu de donn es sont disponibles sur les facteurs de transcription et autres r gulateurs impliqu s dans la diff renciation observable dans ces carcinomes malgr l int r t de comparer ce programme avec la diff renciation k ratinocytaire normale A ce jour les rares donn es disponibles sugg rent l implication de g nes par ailleurs connus pour leur r le dans d autres types de cancer tels que p53 Bcl2 la TERT ou plusieurs cyclines Plusieurs travaux d montrent galement l activation constitutive de STAT3 dans la plupart des HNSCC Sriuranpong et al 2003 Neiva et al 2009 NF B AP1 c Myc et la B cat nine semblent galement impliqu s notamment dans les carcinomes du nasopharynx pour revue Allen et al 2007 Chou et al 2008 Dans le but de mieux comprendre les g nes impliqu s dans l invasivit des cellules tumorales des carcinomes spinocellulaires ont t compar s des l sions psoriasiques ces deux pathologies tant notamment caract ris es par une hyperprolif ration k ratinocytaire mais seul le carcinome
259. es most probably reinforcing the cell cell adhesion mediated by the desmosomal cadherins already present in the structure In the course of stratum comeum maturation CDSN is progressively degraded its degradation being a prerequisite for desquamation Simon et al 2001 Cloning of its cDNA has revealed that CDSN is located on chromosome 6 in the major psoriasis susceptibility locus PSORS 1 Guerrin et al 1998 Some CDSN single nucleotide polymorphisms SNPs have been associated with psoriasis in many genetic studies reviewed by Capon et al 2002 and a recent study revealed that only two genes from PSORSI HLAC and CDSN yield protein alleles that are unique to risk haplotypes Nair et al 2006 However according to the latter study and others the exact identity of the PSORSI gene remains controversial Veal et al 2002 Capon et al 2003 Helms et al 2005 Orr et al 2005 Nair et al 2006 Intriguingly the only monogenic disease identified so far to be associated with mutations in CDSN revealed a hair phenotype and did not affect the epidermis Levy Nissenbaum et al 2003 hypotrichosis simplex of the scalp HSS OMIM 146520 is a rare autosomal dominant disease characterized by progressive loss of scalp hair resulting in almost complete baldness by the third decade 249 Q O D O ep O 5 2700 Journal of Cell Science 122 15 To date three different nonsense mutations have bee
260. es w hydroxyc ramides cf paragraphe 2 2 2 2 1 1 Nemes et al 1999 Chez l homme des mutations du g ne TGM1 sont responsables d une g nodermatose r cessive grave l ichtyose lamellaire de type 1 MIM 242300 Le ph notype de b b collodion a la naissance parfois associ un ectropion et ou eclabium conduit g n ralement une mort n onatale L piderme est hyperk ratosique le profil de c ramides alt r et l augmentation des pertes hydriques transcutan es t moigne d un trouble de la barri re Comme attendu des souris invalid es pour ce g ne pr sentent un trouble majeur de la barri re pidermique et meurent quelques heures apres la naissance Matsuki et al 1998 Les granules de k ratohyaline s accumulent dans le cytoplasme des k ratinocytes granuleux et on observe en microscopie lectronique un d faut de formation de l enveloppe corn e et une anomalie ultrastructurale des lipides intercorn ocytaires Kuramoto et al 2002 Ces arguments convergent vers un r le indispensable de TGM1 dans l attachement des 91 prot ines servant d chafaudage pour la mise en place de l enveloppe corn e et la fonction barri re Les TGM3 et 5 sont quant a elles cytosoliques et interviendraient dans la consolidation de cette premi re structure via l int gration de la LOR des SPRR et des LCE L inactivation de la TGM3 chez la souris provoque une l talit embryonnaire tr s pr coce Leonard M Milst
261. es au sein de ARNm Les EST 5 peuvent ainsi se r v ler utiles pour la mise en vidence d pissages alternatifs ou pour l alignement de s quences codantes conserv es entre esp ces diff rentes La production d EST permet l identification des s quences codantes l chelle d un g nome et ainsi la d couverte de nouveaux g nes Elle est aujourd hui plus particuli rement utilis e pour la constitution de banques sp cifiques tissus stade embryonnaire La principale limite de cette technique r side dans son manque de sensibilit pour la d tection des ARNm de faible abondance qui constituent 85 95 des transcrits Bishop et al 1974 Afin d viter le s quen age r p titif des transcrits les plus fr quents plusieurs m thodes de normalisation ont t mises au point C est le cas par exemple des banques soustraites ou de la technique des ORESTES d crite ci apr s Au printemps 2009 la division dbEST de GenBank contient plus de 60 millions de s quences d EST dont plus de 8 millions sont d origine humaine esp ce la plus largement repr sent e dans cette banque de donn es 15 http www ncbi nlm nih gov dbEST dbEST_summary html Viennent ensuite la souris avec environ 5 millions de s quences puis le riz 2 millions le cochon Arabidopsis thaliana le boeuf et le poisson z bre avec 1 5 millions de s quences environ chacun De nombreuses autres esp ces d int r t scientifique agronomique ou m
262. es autres que les k ratinocytes De fa on tonnante plusieurs g nes mitochondriaux sont sous exprim s dans l piderme normal par rapport l piderme reconstitu ce qui pourrait refl ter une activit m tabolique moins intense in vivo L tude de Mehul et collaborateurs est bas e sur l utilisation de puces d di es obtenues par d p t de produits PCR sur membrane de nylon Les 504 g nes tudi s ont t choisis pour leur r le connu ou suppos dans la biologie cutan e Trois Over expressed genes in organotypic models versus NHK ct plakoglobin desmocollin 3 versus NHK plakophilin 1 JNK2 integrin beta4 calmodulin rel protein Nb1 cathepsin d mod les d piderme reconstitu a partir de k ratinocytes primaires diff renci s l interface air liquide diff rant par psoriasin le support utilis matrice neurosin de derme irradi m lange keratin 1 desmoglein 1 loricrin de collag ne bovin et de Fos related ag2 filaggrin FA omega caspase 14 Episkin fibroblastes humains ou hydroxylase corneodesmosin ei CLSP NAIK membrane recouverte de collag ne I et IV keratin 2e integrin alpha4 pgd2 efabp DED versus NHK Episkin ont t analys s La grande majorit des g nes 86 Figure 63 G nes diff rentiellement exprim s selon les mod les d
263. es et de leurs performances sans cesse am lior es La n cessit de changer de support pour atteindre une plus grande chelle d analyse a conduit l mergence de deux technologies radicalement diff rentes dans le milieu des ann es 90 les microarrays fabriqu s par d pot de sondes sur lame de verre et les microarrays r alis s par synth se in situ figure 4 Synth se in situ de puces tr s haute densit ex Affymetrix D p ts sur filtres de nylon D p ts sur lames de verre macroarrays microarrays e C Detail Detail Detail gt Taille 12cm x 8cm Taille 7 2cm x 2 4cm Taille 1 28cm x 1 28cm e quelques centaines milliers de e plusieurs dizaines de milliers e Plusieurs millions de sondes sondes sondes e marquage fluorescent e marquage radioactif e marquage fluorescent syst me biotine e 1 condition exp rimentale par syst me aminoallyl dUTP avidine phyco rythrine membrane NHS cyanines e 1 condition exp rimentale e 2 conditions exp rimentales par puce par lame g n ralement parfois 1 Figure 4 Diff rentes sortes de puces ADN 21 Les premiers microarrays r alis s sur des lames de verre comportaient 48 sondes diff rentes contre des g nes exprim s par Arabidopsis thaliana et furent employ s en cohybridant des ADNc marqu s avec deux fluorochromes distincts Schena et al 1995 La fonctionnalisation de la surface des lames tape n cessaire pour la fixation
264. es fonctions prot ine structurale m tabolisme et transport des lipides prot ase et inhibiteurs etc Les profils d expression g nique des k ratinocytes granuleux ont galement t compar s avec ceux des k ratinocytes basaux au moyen de puces a ADN pang nomiques mettant en vidence 200 candidats Afin d identifier des facteurs de transcription suppl mentaires une recherche bioinformatique de sites de fixation conserv s volutivement a t r alis e sur les promoteurs de 52 marqueurs de la diff renciation Les r sultats issus de ces trois techniques ont t combin s et analys s afin de r duire a 300 genes le nombre de candidats valider Pour 155 d entre eux leur profil d expression au sein de l piderme a pu tre analys par PCR quantitative permettant d identifier 49 nouveaux marqueurs de la diff renciation De plus sur 94 g nes quantifi s codant pour des facteurs de transcription 37 apparaissent positivement ou n gativement r gul s sugg rant un r le dans le contr le des tapes tardives du programme de diff renciation Ces r sultats ouvrent de nombreuses voies et constituent donc une avanc e importante pour la compr hension des m canismes complexes mis en jeu dans ce r seau de r gulation g nique tant dans le cadre physiologique que pour certaines pathologies caract ris es par une alt ration de la diff renciation comme dans le cas du psoriasis ou des ichthyoses MOTS CL S piderme
265. es g nes de r f rence est critique en effet peu des g nes usuellement consid r s comme des g nes de m nage ont une expression v ritablement inchang e entre les conditions compar es ce qui n cessite avant toute tude de d terminer avec soin quels sont les genes les plus stables Ainsi de profonds biais peuvent tre introduits dans la quantification lors de la normalisation si les g nes de r f rences sont inad quats 1 2 2 2 Normalisation Le principe de la PCR quantitative consiste quantifier l ADN amplifi a chaque cycle d o le terme PCR quantitative en temps r el en se basant sur le fait que la quantit d ADN en fin de r action n est plus corr l e avec la quantit de 37 d part mais l est durant la phase d amplification exponentielle qui pr c de la phase de plateau figure 17 La m thode de d termination du Ct consiste a d finir arbitrairement un seuil de fluorescence g n ralement bas mais bien sup rieur au bruit de fond de sorte que ce seuil soit d pass lorsque l amplification est encore exponentielle Le Ct ou Cycle threshold correspond alors au nombre de cycles requis pour d passer ce seuil Or les Ct sont directement corr l s la quantit d ADN au d part les chantillons les plus concentr s au d part tant ceux dont la fluorescence sera d tect e en premier Il est donc possible en comparant les Ct de calculer des ratios d expression La m thode la
266. espectivement par des lymphocytes T CD8 et CD4 aboutit la production de nombreuses cytokines proinflammatoires telles que l IL1 l ILS l interf ron y et le TNFa figure 61 L origine de cette pathologie k ratinocytaire ou immunitaire n a pas t d finitivement tranch e Concernant les k ratinocytes des mesures du TEWL pertes en eau trans pidermiques montrent que la fonction barri re est d fectueuse au niveau des l sions psoriasiques Serup and Blichmann 1987 L absence de couche granuleuse est li e une forte diminution de l expression de la profilaggrine et de la loricrine en plus de la diminution d autres marqueurs transglutaminase 3 caspase 14 DNase1iL2 A l inverse d autres marqueurs de la diff renciation tels que l involucrine la cystatine A SLPI SKALP la transglutaminase 1 ou encore de nombreuses prot ines a activit antimicrobienne faiblement exprim es dans l piderme normal hBD2 hBD3 LL 37 S100A7 sont surexprim s ou exprim s plus pr cocement dans cette pathologie pour revue Iizuka et al 2004 Tschachler 119 2007 D autres l ments sont plut t en faveur d une origine immunologique de la maladie L am lioration spectaculaire des l sions psoriasiques apr s traitement par la cyclosporine une mol cule immunosuppressive sp cifique des lymphocytes T sugg re qu ils ont un r le important dans la maladie De plus l injection de lymphocytes de patients da
267. ession ratio 800 800 300 200 160 150 130 120 110 100 70 50 50 35 30 30 25 20 20 20 16 15 12 12 12 10 10 10 10 10 8 6 6 l l l l l l l l l l 0 46 0 4 0 38 0 36 0 35 0 3 0 28 Not determined FL 21 736 HES2 ZNF696 LYG2 MGC34829 KIAA0963 ALKBH ADAMTSL2 c orfl 05 AW367250 KCNJI 2 LOC338667 TMPRSSS CLEC2A FLJ21 736 cl4orf29 cl4orf72 KRBAI FLJ37464 LOCI 34466 Genome Biology 2007 8 R107 154 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 a chri 1490800889 ORESTES I 1432586888 ORESTES IEG D HE Gii H Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 150000000 Refseg Genes THHL1 HRNR g LCESA FLO BH CRNN p IFPS Ciorf42 PTNI LCESB LCE30 L Figure 3 LCESC LCE2C LCE2A LCESE LCE2D LCE28 CESA LCE4A LCE1F LELF1 LCE1E LCE10 LCE1C LCE1B SMCPH SPRR4 SPRR2E IYL SPRRS SPRR2E SPRR1A SPRR2F SPRRIB SPRR2G SPRR2D SPRR2A PGCLYRP4 HB oR POLYRPS Mi LCE1A PGLYRP3 PGLYRP4 X cr Q a LOR Genes of the EDC present in the ORESTES dataset a Screen copy of a UCSC Genome Browser window chr 1 150 300 000 I1 5 1 590 000 hg17 May 2004 showing the RefSeq genes from the EDC and the ORESTE custom track b Number of ORESTES for each gene of the locus The genes for which at least one ORESTE was sequenced are in red bold characters Nomenclature Committ
268. eux prot ases la bl omycine hydrolase et la calpaine I Kamata et al 2009 L implication de la profilaggrine dans la physiopathologie de lichtyose vulgaire a t longtemps soup onn e en particulier en raison de l absence de granules de k ratohyaline dans cette pathologie Sybert et al 1985 mais ce n est que r cemment que des mutations du g ne ont t identifi es dans 15 familles de patients Smith et al 2006 La longueur de la s quence codante presque 12kb ainsi que la pr sence de r p titions ont sans doute t responsable du retard pris dans le s quen age de ce g ne chez les malades Il n existe d ailleurs aucun ARNm complet dans les banques de donn es Les deux principales mutations entrainant une perte de fonction R501X ou 2282del4 sont retrouv es chez 9 de la population europ enne et constituent en outre un facteur de risque majeur l tat h t rozygote pour la dermatite atopique mutations semidominantes Palmer et al 2006 pour une revue r cente voir McGrath 2008 Enfin il faut noter que des mol cules de k ratines suprabasales Ki K2 et K10 ainsi que de filaggrine Simon et al 1996 sont li es a l enveloppe corn e sous l action des transglutaminases enzymes qui catalysent la formation de liaisons covalentes comme le montre la digestion prot olytique d enveloppes corn es purifi es partir d piderme humain et le s quen age des peptides obtenus Steinert and Ma
269. exons and a large pre dicted protein sequence 2 391 amino acids containing two Genome Biology 2007 8 R107 150 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Table 5 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Genes with 100 or less UniGene ESTs corresponding to uncharacterized paralogues of known genes No of ORESTES Gene symbol No of UniGene ESTs 13 ASAH3 4 l LIPL2 LIPK 4 11 CLEC2A 7 2 IGFL3 12 3 LYG2 14 l PNPLA I I5 9 GSDMI 16 l GRID2IP 17 2 ILIF7 17 2 FCRL 17 3 AADACL2 20 l LIPL3 LIPM 20 l LAMB4 26 10 THEMS 26 l FLJ90165 27 3 FLJ45651 28 l LPIN3 31 l SLC25A34 36 l GPRI I5 37 LRPSL 4 l HSPC 105 45 l QPCTL 52 3 PLA2G4F 56 l KIAA0605 58 l CTGLFI 60 2 UGT3A2 65 l GALNTI 7 74 l BAIAP2L2 76 l FLJ43692 80 VILL 86 l LOC203427 87 l ILI 7RE 100 calcium binding EF hand domains and a large domain made of repeated segments of about 25 amino acids The amino acid composition of FLG2 is very similar to that of filaggrin with a high content of serine 22 glycine 20 histidine 10 and glutamine 10 The expression of this gene is likely restricted to the epidermis as shown by PCR on a panel of cDNAs from 16 healthy human tissues and organs Figure 4 Real time PCR also showed a strong overexpression of the FLG2 gene in GKs with a T4 T1 ratio of 800 Table 7 These results thus suggest that this gene is a new functional member of the EDC complex in agreement with its similarity to the filag
270. expression is to the best of our knowledge described here for the first time Additional data file 2 Sev eral genes from these five classes were selected to quantify their expression in the course of epidermal differentiation by real time PCR see below Expressed retrogenes and pseudogenes Pseudogenes generally correspond to retrocopies with many disruptions in their open reading frame ORF However it is now recognized that a large number of retrocopies are tran scribed and can encode functional proteins 22 Among the top 50 transcribed retrocopies reported by these authors 11 were detected in GKs by the ORESTES method Among these calmodulin like 3 CALML3 was previously shown to be spe cific for keratinocyte terminal differentiation 23 We identi fied two other expressed retrogenes corresponding to the Genome Biology 2007 8 R107 146 http genomebiology com 2007 8 6 R107 12345 6 7 8 9 101112 13 14 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CANE Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 E mRNA fl Genomic LI Mitochondrial _ Ribosomal BA Uninformative M Bacterial Number of ORESTES per gene Figure 2 Toulza et a R107 5 Analysis of the ORESTES dataset from GKs a Pie graph of the 22 585 sequences obtained from the T4 fraction enriched in GKs The treatment of the mRNA samples with DNAse resulted in minimal contamination with genomic sequences Despite two rounds of polyA mRNA
271. exprim s au niveau des couches suprabasales de l piderme Les g nes et la plupart de ces pathologies tant cit s dans les chapitres pr c dents le m canisme mol culaire quand il est connu n est pas indiqu L gende A transmission autosomique X transmission li e au chromosome X R r cessive D SD dominante semidominante Manifestations Pathologie Transmission G ne affect cliniques anatomopathologiques B b collodion grandes squames brunes et adh rentes prurit TGM1 ectropion eclabium Hyperk ratose massive ABCA12 perte de Ichtyose lamellaire de type I OMIM 242300 Ichtyose lamellaire de type II OMIM 601277 Cf IL type I fonction partielle eclabium OMIM 242500 fonction totale Hyperk ratose compaction de la couche corn e Ichtyose lamellaire de FLJ39501 type III Cf IL type I CYP4F22 OMIM 604777 G n ralement l tale fissures cutan es profondes ectropion Ichtyose arlequin ie ABCA12 perte de 116 Ichtyose cong nitale autosomique r cessive li e l ichthyin NIPAL4 Ichthyin ARCII OMIM 612281 Erythrodermie ichtyosiforme cong nitale s che ALOXE3 ALOX12B NCIE OMIM 242100 Erythrodermie ichtyosiforme S KRT1 KRT10 cong nitale bulleuse BCIE OMIM 113800 Maladie de Naxos JUP plakoglobine OMIM 601214 Acral peeling skin syndrome OMIM 609796 Ichtyose autosomique recessive avec hypotrichos
272. f renciation mais galement apoptose 221 notamment dans le cas d une exposition important aux ultraviolets Le r sultat de ces deux morts est radicalement diff rent l apoptose entra nant la d gradation du corps cellulaire tandis que la cornification permet la formation de la couche corn e indispensable la fonction barri re Il n est pas donc surprenant que les k ratinocytes expriment de nombreux r gulateurs positifs ou n gatifs de la des mort s cellulaire s Si le g ne antiapoptotique AVEN est d tect dans toutes les couches R 1 3 le suppresseur de tumeurs ARL11 ADP ribosylation factor like 11 or ARLTS1 qui agit sur plusieurs voies de signalisation pro apoptotiques Yendamuri et al 2008 est surexprim R 9 Mattiuzzo et al 2009 La fonction de PLEKHA2 R 8 1 reste obscure le g ne code une prot ine domaine PH Pleckstrin Homology recrut la membrane plasmique par le PI 3 4 P2 au cours de la signalisation de la PI3 kinase Dowler et al 2000 Ma et al 2008 La voie de la PI3K joue un r le important dans la protection des k ratinocytes contre l ano kis probablement via l activation de la kinase AKT1 Calautti et al 2005 Thrash et al 2006 Cependant le r le potentiel de PLEKHA2 dans la voie PI3K AKT1 reste a d terminer Le g ne MAP3K71P1 R 2 1 code pour la prot ine TAB1 qui interagit avec la kinase TAK1 MAP3K7 requise pour l hom ostasie pidermique et la survie k ratinocytaire
273. f extracellular lipids The weakly expressed non secreted LIPJ protein might play a distinct role The LIPK LIPM and LIPN but not LIPJ gene orthologues could be identified in several vertebrate species including mouse and rat Surprisingly a cluster of tandem duplicated genes encoding new lipases resides in the mouse and rat genomes which could eventually increase the lipase reper toire of these species The new LIPK LIPM and LIPN lipide hydrolase genes may play an essential function in lipid metabolism of the most dif ferentiated epidermal layers and are thus interesting gene candidates for genodermatoses of unknown origin Accord ingly mutations in the CGI58 ABHD5 gene which encodes a putative triacylglycerol lipase are responsible for the Chanarin Dorman syndrome a neutral lipid storage disease with ichthyosis 62 Mutations in the LIPH gene are respon sible for a hair growth defect 63 Both CGI58 ABHD5 and LIPH proteins resemble the lipases encoded by genes from the 10q23 31 locus as they include an 8 hydrolase fold but they lack the abhydrolase associated lipase region In addition to the lipases from the 10q23 31 locus nine addi tional genes predicted to be involved in lipid metabolism were overexpressed in GKs Table 8 Their homology with known genes suggests that they might act on fatty acid PNPLA1 THEM5 ADHD9 FAMS83F or ceramide LASS3 ASAH3 SMPD3 metabolism Compared to other tissues lipid metab
274. famille TCF emp chant la transcription des g nes cibles Tago et al 2000 RASGRP1 R 31 8 code pour une GEF GDP GTP exchange factor qui active sp cifiquement Ras au niveau de l appareil de Golgi et r gule la voie ERK MAP 226 kinases Caloca et al 2003 En aval de Ras deux autres g nes GMIP et IQGAP3 sont galement r gul s GMIP code pour un r presseur de la voie CDC42 Rac Rho Hatzoglou et al 2007 et est l g rement surexprim dans les k ratinocytes granuleux R 2 1 tandis que IQGAP3 qui code pour un effecteur en aval de CDC42 et Rac1 est essentiellement exprim dans la couche basale R 0 18 Enfin en aval de Src GRLF1 qui code pour la RhoGAP GTPase activating protein p190 est sous exprim dans les k ratinocytes granuleux R 0 47 Ces g nes sont susceptibles d tre impliqu s dans la r gulation de l adh rence et de la migration mais aussi dans la survie cellulaire Ras et Src ayant potentiellement une fonction de protection contre l anoikis apoptose d clench e par la perte de contact avec la lame basale Frisch and Francis 1994 Plusieurs r gulateurs de la concentration intracellulaire de calcium ont galement t identifi s ITPKC R 3 4 est responsable de la transformation de l inositol 1 4 5 trisphosphate IP3 en inositol 1 3 4 5 tetrakisphosphate IP tous deux impliqu s dans l hom ostasie calcique Le canal sodique ENaC tant requis pour une fonction barri re effica
275. family N member FAM83F Family with sequence similarity 83 member F 3 AADACL2 Arylacetamide deacetylase like 2 10 LOC342897 Similar to F box only protein 2 9 LASS3 LAGI longevity assurance homolog 3 20 CASZ Castor homolog zinc finger 8 FAM46B Family with sequence similarity 46 member B 14 SERPINB7 Serpin peptidase inhibitor clade B member 7 l CARDI 4 Caspase recruitment domain family member 14 l GGT6 Gamma glutamyltransferase 6 homolog l CXorf33 Chromosome X open reading frame 33 10 WFDCS WAP four disulfide core domain 5 WAPI 5 KIAAOS 14 Kiaa0514 5 AMIGO3 Adhesion molecule with Ig like domain 3 3 PLA2G4E Phospholipase A2 group IVE l HSPCI05 NAD P dependent steroid dehydrogenase like 3 PLA2G4F Phospholipase A2 group IVF 127 DUOX2 Dual oxidase 2 APXL2 Apical protein 2 3 RAB38 RAB38 member RAS oncogene family AFMID Arylformamidase 2 ANKRDS Ankyrin repeat domain 5 3 MCMDCI Minichromosome maintenance deficient domain containing l Cl4orf21 Chromosome 14 open reading frame 21 3 LEAP 2 Liver expressed antimicrobial peptide 2 LRPSL Low density lipoprotein receptor related protein 5 like 4 FNDC6 Fibronectin type Ill domain containing 6 2 KIAAI 287 Kiaal 287 http genomebiology com 2007 8 6 R107 No of UniGene ESTs 10 16 4 17 62 9 20 28 3 4 98 76 15 26 51 78 6 12 49 20 21 53 6l 62 64 86 27 52 Il 16 18 28 45 56 64 74 79 87 86 43 54 53 4 79 91 T4 TI expr
276. ff rents mod les d piderme reconstruit in vitro et de k ratinocytes cultiv s en monocouche Bernard et al 2002 Gazel et al 2003 Lemaitre et al 2004 Mehul et al 2004 Ces tudes s appuient toutes sur la technologie des puces ou filtres ADN pour la comparaison du transcriptome dans les diff rents mod les tudi s L tude de Bernard et collaborateurs a compar des chantillons d piderme humain normal d tachement froid partir de peau de sein d piderme reconstitu produit par le laboratoire SkinEthic k ratinocytes pluristratifi s l interface air liquide et de k ratinocytes primaires en culture monocouche Les ARN radiomarqu s ont t hybrid s sur filtres de nylon contenants 475 sondes correspondant a 5 groupes de g nes matrice extracellulaire diff renciation adh sion signalisation cytokines facteurs de croissance apoptose et radicaux libres structure et enfin m tabolisme 25 30 des g nes du filtre sont d tect s Les ARNm de la k ratine K6b et des int grines alpha 3 alpha 6 et beta 1 sont d tect s dans les k ratinocytes in vitro piderme reconstitu et culture monocouche mais de mani re surprenante pas dans l piderme normal ce qui suggere une faible sensibilit de la m thode utilis e Au contraire des marqueurs de la diff renciation pidermique tels que Ki et K10 la filaggrine la loricrine et la corn odesmosine sont d tect s dans l piderme normal et
277. folliculaire ainsi que dans les follicules pileux particuli rement la gaine pith liale interne Des souris invalid es pour Grhli ne pr sentent aucun trouble de la barri re mais une alop cie ainsi qu une k ratodermie palmoplantaire associ e une expression r duite de la desmogl ine 1 les g nes Dsgia Dsg1f et Dsg1y tant apparemment des cibles directes de Grhl1 Wilanowski et al 2008 Grhl2 semble r guler directement l expression de la E cadh rine dans l piderme Cunningham and Jane donn es non publi es De fa on surprenante certains de leurs g nes cibles sont conserv s chez d autres esp ces parfois tr s loign es des mammif res Ainsi un membre de la famille Grainyhead identifi chez Caenorhabditis elegans Grh 1 r gule lui aussi plusieurs g nes de la famille des cadh rines de m me que GRH chez D melanogaster De plus chez la drosophile GRH r gule aussi l expression de deux enzymes dont la Dopa d carboxylase impliqu es dans la formation de liens covalents entre les constituants de la cuticule qui assure les fonctions de barri re et d exosquelette de l insecte Bien que les enzymes impliqu es dans ce ph nom ne n aient aucune homologie avec les 111 transglutaminases expirm es dans l piderme de mammif res et r gul es par Grhl3 dans les deux syst mes la formation d une couche protectrice passe par la cr ation de structures r sistantes et hydrophobes Le role des facteur
278. fournissent l oxyg ne et les nutriments requis pour la survie des cellules pith liales 2 1 3 La jonction dermo pidermique A l interface entre deux tissus la jonction dermo pidermique ou lame basale est une structure complexe synth tis e la fois par les k ratinocytes de la couche basale de l piderme et par les fibroblastes du derme superficiel Cette structure r gule les changes entre derme et piderme et constitue un support pour l ancrage des cellules de la couche basale de l piderme assur par les h midesmosomes En microscopie lectronique elle apparait sous la forme de trois couches de densit diff rente figure 26 la lamina lucida ou lamina rara situ e imm diatement sous la membrane plasmique des cellules pidermiques et dans laquelle on peut distinguer les filaments d ancrage des h midesmosomes la lamina densa plus profonde et la sub lamina densa correspondant la partie la plus superficielle du derme dans laquelle sont situ es les fibrilles d ancrage assurant la liaison m canique entre le derme et la lame basale et principalement constitu s de collag ne VII 55 Inner plaque Figure 26 Jonction dermo pidermique et h midesmosomes Gauche Microscopie lectronique HD plaque cytoplasmique des plaque h midesmosomes IF filaments interm diaires de k ratines LL lamina lucida LD lamina densa AF filaments d ancrage AFb fibrilles d ancrage Lam
279. g nes environ Toutefois le nombre r el de g nes sp cifiques du k ratinocyte granuleux reste difficile valuer les hybridations crois es biaisant le nombre de g nes exprim s tandis qu au contraire certains transcrits sont probablement en dessous du seuil de d tection des puces ADN De plus le nombre de faux n gatifs g nes d clar s non r gul s alors qu ils sont diff rentiellement exprim s est quasi impossible valuer Par ailleurs l tude d April amp Barsh met en vidence un plus grand nombre de g nes exprim s dans la couche basale que dans les couches suprabasales ce qui est logique pour des cellules de type et d tat prolif ratif vari s et qui confirme le biais de notre m thode d enrichissement puisque nous avons plus de difficult identifier des g nes surexprim s dans la couche basale cf discussion sur les puces pang nomiques Au final le choix d une approche multi technique peut sembler paradoxal dans le sens o chacune pr sente des difficult s techniques non n gligeables et n cessite de prendre un maximum de pr cautions tant au moment de la r alisation qu celui de l interpr tation des r sultats Cependant la plupart des techniques actuelles a l exception peut tre du s quencage nouvelle g n ration ne permettant pas r ellement de d crire un syst me de fa on exhaustive cette strat gie poss de l avantage ind niable d tre un des meilleurs moyen de dresser u
280. gene as a GK specific marker the T4 T1 ratios 54 189 Table 1 indicated that the T4 fraction was indeed highly enriched in GKs However subsequent experiments led to even higher ratios for example 800 for FLG2 and GSDM Our approach thus led to the discovery of new exqui sitely specific gene markers for GKs that constitute valuable tools for detailed studies of epidermis architecture by histo chemistry and in situ hybridization methods Moreover such highly specific expression strongly suggests that the corre sponding genes play key roles in barrier function The real Figure 5 see following page http genomebiology com 2007 8 6 R107 time PCR studies also revealed equal expression of several genes in the T4 and T1 fractions suggesting that they are transcribed during all steps of keratinocyte differentiation In addition to providing one with a highly purified GK fraction our human skin fractionation method thus constitutes a new tool for the characterization of genes involved in the succes sive steps of terminal differentiation in the epidermis GK specific candidate genes To further characterize genes poorly represented in data bases the 330 genes with the lowest EST number in the Uni Gene database lt 100 ESTs were analyzed in more detail Among these the known specific genes involved in keratinocyte terminal differentiation account for only 15 of the panel whereas 42 139 encode hypothetical proteins This sh
281. genes diff rents avec une moyenne de 4 6 s quences par g ne soit une redondance assez faible montrant bien le pouvoir normalisateur intrins que de cette m thode Cette redondance est encore plus faible 3 s quences par g ne pour les 2200 premi res s quences produites a petite chelle En effet les clones taient syst matiquement cribl s par PCR et lectrophor se afin que les clonages g n rant un grand nombre de fragments de m me taille potentiellement redondants soient cart s De plus le s quencage progressif des minibanques permettait de ne pas analyser en totalit les plus redondantes Toutefois la faible redondance indique probablement que cette description du transcriptome n est pas exhaustive sugg rant un nombre total de g nes exprim s plus important cf conclusion de la discussion Malgr la normalisation intrins que de la technique des ORESTEs et l limination avant le clonage des produits d amplification pr f rentielle par l excision des ventuelles bandes visibles apr s migration sur gel quelques rares g nes sont repr sent s plus fortement 9 d entre eux d passant les 100 s quences C est le cas notamment de trois g nes connus pour tre fortement exprim s par le k ratinocyte granuleux la k ratine 1 la filaggrine et la prot ine d enveloppe LEP7 de deux g nes codant pour des prot ines ubiquistes la prot ine ribosomique RPS8 et le facteur d longation EEF1A1 mais auss
282. gete adapters to both ends of the the inside surface of the flow cell channels initiate solid phase bridge amplification fragments 4 FRAGMENTS BECOME DOUBLE 5 DENATURE THE DOUBLE STRANDED 6 COMPLETE AMPLIACATION STRANDED MOLECULES Several million dense dusters of double stranded DMA are generated in each channel The enzyme incorporates nudeotides to buid double stranded bridges on the soid 240 7 DETERMINE FIRST BASE 6 IMAGE FIRST BASE 9 DETERMINE SECOND BASE f a A w First chemistry cycle toinitiate the first After laser excitation capture the image of Second chemistry cycle to initiate the sequencing gde addall four labeled reversible emitted fluorescence from each duster on the next sequencing cyde add al four labeled term nators primers and DMA pohmersss flow cell Record the identity of the first base reversible terminators and enryme to the enzyme to the flow cell foreach duster flow cell 10 MAGE SECOND CHEMISTRY CYCLE 11 SEQUENCE READS OVER MULTPLE 12 ALIGN DATA CHEMISTRY CYCLES After loser excitation collect the image data Repeat cycles of sequencdng to determine Align data compare to a reference and m before Record the identity of the second the sequence of bases in a given fragment identify sequence differences base for each duster a single base at time 241 La troisi me approche nomm e SOLID Applied Biosystems peut tre rapproch
283. ggests that the rare autosomal dominant human disease HSS is not caused by Cdsn haploinsufficiency Moreover recent work demonstrated that truncated CDSN which accumulates abnormally as high order 257 D Le a E 0 O Ly O w a 2708 Journal of Cell Science 122 15 assemblies in the dermis of patients organizes into proto fibrillar structures in vitro and is toxic to keratinocytes C cile Caubet Luc Bousset and G S et al unpublished Common features between CDSN mutant aggregates and amyloid deposits support HSS as a new potential amyloid disease and allow a better understanding of the HSS pathophysiology Analysis of skin sections from newborn Cdsn KO mice showed a similar morphology and number of hair follicle to those in skin from WT littermates The KO neonates also displayed normal whiskers The only difference was that in KO pup skin no hair follicles expressed CDSN in the IRS Therefore CDSN seems to be dispensable for hair follicle morphogenesis as was the case for barrier establishment in the absence of external stress The progressive degeneration of hair follicles and the formation of cysts observed from 4 weeks after grafting together with the altered morphology and disappearance of hair follicles in adult mouse skin induced for Cden excision suggest that CDSN ts necessary for normal hair follicle integrity Mutation of another gene encoding a structural protein of the IRS DSG4 is responsible
284. gram 34 respectively The cor responding human genes LIPL2 and LIPL3 were clustered in a 665 kB interval on chromosome 10q23 31 with genes encod ing two experimentally characterized lipases LIPA lyso somal acid lipase MIM 27 8000 and LIPF gastric lipase MIM 601980 and two hypothetical lipase like proteins LIPL1 and LIPL4 Figure 5a Therefore our study contrib uted to the elucidation of a specialized human genomic locus that includes six lipase genes and four other genes ANKRD22 STAMBPL1 ACT2 and FAS of apparently unre lated function Figure 5a In accordance with the Hugo Gene Genome Biology 2007 8 R107 151 D h D _ D a D l a D gt be n 1 R107 10 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Table 6 Unknown genes with 100 or less UniGene ESTs No of ORESTES Gene symbol FLJ43861 LOC389791 LOC285435 LOC387846 LOC401062 IMAGE 5260914 LOC338667 PSORS C2 DKFZp7 7981 540 Cl4orf72 FLJ37989 56 FLG2 10 WFDCS LOC402110 PLEKHN LOC441240 FLJ38159 Clorfl77 HMCN2 MGC23985 OFCCI LOC44 1860 AMIGO3 LOC441257 LOC285484 C20orf9 I LOC202460 FLJ25664 FLJ4 1623 0 LOC342897 LOC339237 3 LOCI26248 LOC389142 C20orf95 FKBP9L FNDC8 FLJ4631 C3orf47 LOC283143 LOC388727 FLJ44317 FLJ31 184 LOCI25893 ZNF311 BCO41 923 ZNF600 MCMDCI FLJI 3646 Cl4orfl2 FAM83F ABHD9 LOCI 34466 CXorf33 nn fF NY WU WU N D WU wer Ke D n
285. gren an Ichtyose troubles moteurs et Larsson ALDH3A2 retard mental d g n rescence OMIM 270200 wo r tinienne Hyperk ratose opacification OMIM 308100 asymptomatique de la corn e Peau s che Ichtyose vulgaire Hyperk ratose mod r e d ficit OMIM 146700 de la fonction barri re K ratodermie palmoplantaire stri e Re Hyperk ratose palmoplantaire e type OMIM 148700 K ratodermie De Hyperk ratose palmoplantaire almoplantaire stri e j x a cheveux laineux e type OMIM 125647 Ichtyose bulleuse de Hyperk ratose et rosion Siemens AD KRT2A superficielle de l piderme avec OMIM 146800 acantholyse Syndrome de Ichtyose k ratodermie Vohwinkel AD GJB2 Cx26 palmoplantaire pseudoainhum OMIM 124500 surdit Variant du syndrome j LOR Ichtyose k ratodermie de Vohwinkel AD palmoplantaire pseudoainhum OMIM 604117 Maladie de Darier A D D faut de coh sion ATP2A2 OMIM 124200 k ratinocytaire acantholyse Maladie de Hailey Ph notype proche de celui de la Hailey AD ATP2C1 maladie de Darier atteinte des OMIM 169600 ongles Table 3 principales g nodermatoses li es a des mutations de g nes exprim s au niveau des couches suprabasales de l piderme cardiomyopathie 118 Il est important de noter qu ce jour la nature causative de certaines mutations n est pas parfaitement tablie et que les m canismes mol culaires impliqu s sont parfois peu d crits
286. grin gene whose function in the epidermal barrier is well established Full name N acylsphingosine amidohydrolase 3 Lipase like ab hydrolase domain containing 2 C type lectin domain family 2 member A Insulin growth factor like family member 3 Lysozyme like Patatin like phospholipase domain containing Gasdermin Glutamate receptor ionotropic delta 2 interacting protein Interleukin family member 7 Fc receptor like 6 Arylacetamide deacetylase like 2 Lipase like ab hydrolase domain containing 3 Laminin beta 4 Thioesterase superfamily member 5 Gamma glutamyltransferase 6 homolog Phospholipase A2 group IVE Lipin 3 Solute carrier family 25 member 34 G protein coupled receptor 15 Low density lipoprotein receptor related protein 5 like NAD P dependent steroid dehydrogenase like Glutaminyl peptide cyclotransferase like Phospholipase A2 group IVF ADAMTS like 2 Centaurin gamma like family member UDP glycosyltransferase 3 family polypeptide A2 Polypeptide N acetylgalactosaminyltransferase 17 BAI associated protein 2 like 2 ARHGEFS5 like Villin like Similar to solute carrier family 25 member 16 Interleukin 7 receptor E Lipase like genes Toulza et al R107 9 Two ORESTES were identified as the human orthologues of the murine lipases Lipl2 NM_172837 and Lipl3 BCo031933 previously identified by large scale mouse cDNA sequencing by the Riken Institute 33 and the Mam malian Gene Collection pro
287. h notypiques li es certaines mutations faux sens not P602L sugg rent en plus un ventuel gain de fonction des prot ines mut es La maladie de Hailey Hailey est une affection voisine de la maladie de Darier White mais o les ongles ne sont pas atteints Elle est transmise galement de fa on autosomique dominante les nombreuses mutations mises en vidence entrainent g n ralement une perte de fonction du transporteur sugg rant l aussi un m canisme d haploinsuffisance Le m canisme physiopathologique de ces trois affections n a pas t clairement tabli Des mod les animaux de souris dont un all le des g nes ATP2A2 Ji et al 2000 ou ATP2C1 Okunade et al 2007 a t inactiv seuls les h t rozygotes sont viables ne reproduisent pas le ph notype pidermique humain Les tudes ont mis en vidence une perturbation de l exocytose Ca2 d pendante Zhao et al 2001 ou une d sorganisation du syst me de Golgi et une accumulation de gouttelettes lipidiques Okunade et al 2007 mais pas d alt ration des jonctions intercellulaires Les souris h t rozygotes des deux mod les pr sentent de plus une pr disposition aux carcinomes pidermoides Les mutations des g nes ATP2A2 ou ATP2C1 conduisent donc des ph notypes tr s similaires mais extr mement diff rents entre l homme troubles de la diff renciation et le mod le murin carcinomes sans qu il soit possible d expliquer les diff rences entre le
288. ha 2 macroglobulin like 1 corneodesmosin cornifelin cystatin A stefin A distal less homeobox 3 dermokine ZD52F 10 desmoglein 1 filaggrin filaggrin family member 2 Ifapsoriasin FPS gap junction protein beta 5 connexin 31 1 Cx31 1 involucrin Kruppel like factor 4 Gut enriched kruppel like factor kallikrein related peptidase 5 Stratum corneum tryptic enzyme SCTE kallikrein related peptidase 7 Stratum corneum chymotryptic enzyme SCCE loricrin RAR related orphan receptor A sciellin serpin peptidase inhibitor clade B ovalbumin member 5 maspin serpin peptidase inhibitor clade B ovalbumin member 8 serine peptidase inhibitor Kazal type 5 no of UniGene ESTs 70 134 29 179 93 446 89 114 61 49 73 218 53 91 17 62 134 213 105 138 GK BK ratio qRT PCR 43 3 225 775 16 3 7 390 4 5 2 155 5 795 3 8 204 1 7 ns 23 80 3 735 7 2 34 6 9 4 9 44 ns not significant ratio lt 2 Names of genes encoding transcription factors are written in bold 187 FIGURE 1 FIGURE 2 Pangenomic oligonucleotide i microarrays 4 Analysis of TFBS on regulated genes Genomatix cs Pal aL Fg Filtering krtqwn or putative function EST n mber YhiGene Identification of potentially regulated genes Role in barrier function 188 Figure Legends Fig 1 Design of the large scale multi technique approach Data from severa
289. hat are involved in desquamation of stratum corneum J Invest Dermatol 111 189 193 Sayama K Hanakawa Y Nagai H Shirakata Y Dai X Hirakawa S Tokumaru S Tohyama M Yang L Sato S Shizuo A and Hashimoto K 2006 Transforming growth factor beta activated kinase is essential for differentiation and the prevention of apoptosis in epidermis J Biol Chem 281 22013 22020 283 Schalkwijk J Chang A Janssen P De Jongh G J and Mier P D 1990 Skin derived antileucoproteases SKALPs characterization of two new elastase inhibitors from psoriatic epidermis Br J Dermatol 122 631 641 Schena M Shalon D Davis R W and Brown P O 1995 Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray Science 270 467 470 Schluter H Moll I Wolburg H and Franke W W 2007 The different structures containing tight junction proteins in epidermal and other stratified epithelial cells including squamous cell metaplasia Eur J Cell Biol 86 645 655 Schmuth M Jiang Y J Dubrac S Elias P M and Feingold K R 2008 Thematic review series skin lipids Peroxisome proliferator activated receptors and liver X receptors in epidermal biology J Lipid Res 49 499 509 Schweizer J Bowden P E Coulombe P A Langbein L Lane E B Magin T M Maltais L Omary M B Parry D A Rogers M A and Wright M W 2006 New consensus nomenclature for mammalian keratins
290. hington J Bruce I Kwok P Y Menter A Krueger J Barton A Saccone N L and Bowcock A M 2008 A genome wide association study of psoriasis and psoriatic arthritis identifies new disease loci PLoS Genet 4 e1000041 Livak K J and Schmittgen T D 2001 Analysis of relative gene expression data using real tme quantitative PCR and the 2 Delta Delta C T Method Methods 25 402 408 Lowes M A Bowcock A M and Krueger J G 2007 Pathogenesis and therapy of psoriasis Nature 445 866 873 Lu J Goldstein K M Chen P Huang S Gelbert L M and Nagpal S 2005 Transcriptional profiling of keratinocytes reveals a vitamin D regulated epidermal differentiation network J Invest Dermatol 124 778 785 Lu S Saydak M Gentile V Stein J P and Davies P J 1995 Isolation and characterization of the human tissue transglutaminase gene promoter J Biol Chem 270 9748 9756 Lundstrom A and Egelrud T 1990 Evidence that cell shedding from plantar stratum corneum in vitro involves endogenous proteolysis of the desmosomal protein desmoglein I J Invest Dermatol 94 216 220 Lundstrom A Serre G Haftek M and Egelrud T 1994 Evidence for a role of corneodesmosin a protein which may serve to modify desmosomes during cornification in stratum corneum cell cohesion and desquamation Arch Dermatol Res 286 369 375 Lunny D P Weed E Nolan P M Marquardt A Augustin M and Porter R M 2005 Mutatio
291. hted Scatterplot Smoothing ou m thode de lissage des valeurs par pond ration locale appliqu e aux donn es de puces a ADN Yang et al 2002 permet d quilibrer les marquages mais aussi de gommer certains art facts notamment Veffet banane ou non lin arit des ratios en fonction de l intensit un effet particuli rement visible sur les MA plots figure 10 et qui est responsable d important biais avec les autres m thodes de normalisation lin aire La m thode consiste a effectuer une r gression lin aire locale pour aboutir en d finitive 4 une courbe de r gression robuste figure 11 pour chaque fen tre d intensit la r gression lin aire locale d finit une correction adapt e aux donn es dans cette gamme d intensit puis la fen tre est d cal e vers les intensit s plus lev es et ainsi de suite Cette m thode permet de normaliser de fa on adapt e l o un facteur de correction unique s accommode mal de la nature non lin aire des donn es De nombreux outils de normalisation pour les donn es de puces deux couleurs sont disponibles citons simplement l outil Bioconductor et le langage de programmation R Dudoit et al 2003 extr mement employ s car libres d usage et comportant de nombreux modules pour l analyse d image la normalisation la classification des donn es Citons galement les portails M IA Micro rray Integrated Applications http maia genouest org Le Bechec et al 20
292. i re est d tect e en temps r el par un capteur CCD directement coupl aux fibres optiques composant le support ainsi chaque ajout d un dNTP le capteur CCD produit une image qui t moigne de la lumi re mise dans chaque puit Ces donn es brutes permettent apr s normalisation des images de reconstruire un pyrogramme correspondant l encha nement des bases dans la s quence pour chacun des puits de la machine Ainsi la version la plus r cente de la plateforme 454 le Q20 permet de g n rer plus d un million de s quences de 400 bases de long par run FE ALT Signal image Mu at ak ee ARE eu a as ih E z hte ne po r n F PERTE APS Annet peiteer i a 7 ATP Light oxy luciferin 238 La seconde approche a avoir t d velopp e est la technologie Solexa Illumina L tape d amplification est ici r alis e en phase solide bridge amplification l ADN est fragment coupl a des adaptateurs diff rents chaque extr mit puis d pos sous forme simple brin sur la Cluster Station un support sp cialement d velopp pour permettre l amplification et le s quen age des brins Chaque mol cule se fixe al atoirement sur le support or celui ci est recouvert d oligonucl otides compl mentaires des adaptateurs port s par les fragments Ainsi plusieurs cycles de d naturation renaturation extension en pr sence d ADN polym rase et de nucl
293. i de g nes peu caract ris s tels que l ifapsoriasine filaggrine 2 l inhibiteur de prot ases s rine SERPINA12 ou la t traspanine 5 Parmi les g nes d couverts et jamais caract ris s auparavant dans l piderme deux ont fait l objet d une tude plus pouss e Ainsi le g ne DMKN codant pour la dermokine repr sent par 217 ORESTES a t identifi chez la souris en tant que membre d un locus de trois g nes KDAP DMKN et SBSN codant pour des prot ines s cr t es dans les couches suprabasales de l piderme le SSC Stratified epithelium 206 Secreted protein gene Complex Matsui et al 2004 Le g ne DMKN poss de trois promoteurs distincts deux exons terminaux diff rents et les messagers subissent un pissage alternatif complexe Toulza et al 2006 Parmi les quatre classes de transcrits identifi es DMKN a p y et 5 les isoformes B et y sont sp cifiques du k ratinocyte granuleux alors que l isoforme a est exprim e dans toutes les couches de l piderme et dans le placenta tandis que l isoforme est ubiquiste Un autre g ne A2ML1 a fait l objet d une caract risation au sein de notre quipe Identifi partir de six s quences d ORESTE le g ne code un inhibiteur de prot ase de la famille des a2 macroglobulines dont l expression dans l piderme est restreinte la couche granuleuse Galliano et al 2006 Des transcrits ont t d tect s par PCR sur des ADN
294. iation Endocr Rev 14 3 19 Bishop J O Morton J G Rosbash M and Richardson M 1974 Three abundance classes in HeLa cell messenger RNA Nature 250 199 204 Blanpain C and Fuchs E 2009 Epidermal homeostasis a balancing act of stem cells in the skin Nat Rev Mol Cell Biol 10 207 217 Blanpain C Lowry W E Geoghegan A Polak L and Fuchs E 2004 Self renewal multipotency and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche Cell 118 635 648 Blenkiron C Goldstein L D Thorne N P Spiteri I Chin S F Dunning M J Barbosa Morais N L Teschendorff A E Green A R Ellis I O Tavare S Caldas C and Miska E A 2007 MicroRNA expression profiling of human breast cancer identifies new markers of tumor subtype Genome Biol 8 R214 Boguski M S Tolstoshev C M and Bassett D E Jr 1994 Gene discovery in dbEST Science 265 1993 1994 Borradori L and Sonnenberg A 1999 Structure and function of hemidesmosomes more than simple adhesion complexes J Invest Dermatol 112 411 418 Bowcock A M Shannon W Du F Duncan J Cao K Aftergut K Catier J Fernandez Vina M A and Menter A 2001 Insights into psoriasis and other inflammatory diseases from large scale gene expression studies Hum Mol Genet 10 1793 1805 Brandner J M 2008 Tight junctions and tight junction proteins in mammalian epidermis Eur J Pharm Biopharm Brattsand M Stefansson
295. iderme assurant la distribution de contraintes locales l ensemble du tissu et garantissant sa coh sion avec le muscle cardiaque l piderme est un des tissus ayant la plus forte densit en desmosomes Dans les assises sup rieures de la couche pineuse des organites s cr toires plurimembranaires nomm s corps lamellaires ou k ratinosomes peuvent tre rep r s en microscopie lectronique au niveau du p le apical des k ratinocytes D rivant de l appareil de Golgi les k ratinosomes pr sentent un aspect de v sicules membranaires arrondies d une taille de 0 2 0 3 um au contenu riche en bicouches lipidiques formant des saccules aplatis Toutefois cet aspect de v sicules isol es et plurimembranaires pourrait tre du a des art facts de pr paration en effet sur des cryocoupes d piderme vitrifi observ es en microscopie cryo lectronique les corps lamellaires n apparaissent plus comme des v sicules discr tes mais comme un r seau tubulaire branch et non lamellaire Norlen 2001 Norlen et al 2003 2 2 1 3 La couche granuleuse stratum granulosum La couche granuleuse comprend 2 5 assises de cellules et celles ci ayant une morphologie aplatie la couche granuleuse est bien moins paisse que la couche pineuse Les k ratinocytes granuleux tirent leur nom de la pr sence au sein de leur cytoplasme de nombreux grains de k ratohyaline correspondant des agr gats insolubles de deux prot
296. idermis In our inducible models the epidermal phenotype was very similar to that of our Cdsn KO skin graft model although it progressed faster within days This might be due to the different location of the zone of interest the interscapular area in the case of the grafts and the flank in the inducible model which is subjected to higher mechanical stress Finally in our inducible Cdsn KO models barrier restoration remained unsuccessful compromising the vital prognosis of the mice when the whole skin area was affected Thus CDSN seems to have a vital role in adult epidermis too Acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis are histological features more generally encountered in inflammatory epidermis such as during wound healing or in psoriatic lesions Although wound healing is transitory and rapidly leads to orthokeratotic epidermis and barrier repair psoriatic epidermis maintains acanthosis hyperkeratosis and parakeratosis with barrier defect The situation has been described as a chronically persistent epidermal healing state Nickoloff et al 2006 Our model of induction of Cdsn KO in adult mouse showed a persistent barrier defect similar to that observed in psoriasis However although we observed Corneodesmosomal defects in Cds mice 2707 Fig 9 Phenotype of localized temporally controlled Cds KO in adult mouse skin Adult HOMO mice were shaved on both flanks and OHT was applied on the right flank for 5 consecutive d
297. idesmosomes Une nouvelle nomenclature a t propos e par plusieurs scientifiques faisant r f rence dans ce domaine Schweizer et al 2006 Les g nes codant pour les sa i r a di 2 Li k fi t i SS oe L Be LE E i US OURS EN a z mm le 1 pm Lorde bt 7 COOH eer Cat che cee eh upar nr eh oleae i Feu ae ee a CRUE Lee CNT Figure 41 Assemblage des filaments interm diaires de k ratines http www humans be bio cell cytosquelette html 81 k ratines classiques sont d sign s KRT1 24 et les prot ines correspondantes K1 24 Elles sont class es en deux groupes I acide K9 a K23 ou II basique Ki a K8 Les k ratines acides sont cod es par des g nes situ s dans un m me locus en 17q12 alors que les g nes codant pour les k ratines basiques sont situ s en 12q13 Lessin et al 1988 Toutes les k ratines partagent une m me organisation structurale avec une partie centrale constitu e d h lices a reli es par des domaines de liaison entour e de deux domaines globulaires terminaux Les k ratines s assemblent en h t rodim res constitu s d une k ratine basique et d une k ratine acide puis en t tram res qui forment l unit de base des protofilaments de 3 nm figure 41 Huit protofilaments forment finalement le filament interm diaire de 10 nm de diam tre Fuchs and Weber 1994 D s la premi re assise de la couche pineuse les k ratinocytes expri
298. iellement des c ramides qui sont soit n osynth tis s partir d acyl CoA longues cha nes et de s rine soit issus de la d gradation d autres sphingolipides De fa on int ressante deux g nes impliqu s en amont de la n osynth se des c ramides ACBD6 R 1 qui code pour une prot ine liant les acyl CoA longues cha nes et ACSL4 R 0 9 qui est responsable de la production de ces acyl CoA longues cha nes sont d tect s indiff remment des couches de l piderme Mattiuzzo et al 2009 Toutefois LASS3 une des enzymes impliqu es dans la synth se des c ramides partir de ces acylCoA et de s rine est surexprim e avec un facteur 10 au cours de la diff renciation Toulza et al 2007 Deux tudes post rieures ont confirm ce r sultat indiquant que LASS3 est bien la c ramide synthase principale des k ratinocytes diff renci s Mizutani et al 2006 Mizutani et al 2008 Les c ramides peuvent galement tre produits par d gradation de la 225 sphingomy line Radoja et ses collaborateurs ont d crit la surexpression tr s faible dans les k ratinocytes granuleux de SMPD1 ratio piderme total k ratinocytes pineux 1 8 qui code pour une sphingomy linase tandis que nous avons identifi SMPD3 comme tant tr s fortement surexprim au cours de la diff renciation avec un ratio KG KB de 70 Toulza et al 2007 sugg rant une implication de SMPD3 plut t que de SMPD1 dans la production de c r
299. ifiques arbitrairement choisies afin d amplifier une sous population d ARN ind pendamment de leur abondance relative La strat gie employ e vise produire un ensemble de minibanques afin d aboutir une couverture maximale du transcriptome Au cours de l tude plus de 150 minibanques ont t produites au total correspondant 22 585 clones chaque amorce produisant entre 100 et 200 clones Dans un premier temps 2200 clones ont t produits afin d optimiser la proc dure Les premiers clonages produisant 10 de vecteurs vides une strat gie de criblage LacZ X gal a t employ e afin de r duire le nombre de clones vides moins de 5 Une premi re s rie d ADNc clon s dans des vecteurs pCRII TOPO par clonage A T a t s quenc e par le service commun de l IFR30 puis les 2200 s quences ont t annot es manuellement Une des strat gies employ es a t de cartographier les s quences en les impl mentant sur le Genome Browser un outil extr mement utile pour visualiser l organisation du g nome et la structure des g nes d velopp par l Universit de Santa Cruz Californie UCSC L int gration des s quences dans ce navigateur permet ainsi d identifier ais ment les g nes correspondants s ils sont d j d crits les ventuels variants d pissage tissu sp cifiques les s quences g n r es dans d autres tissus etc L ajout de cette piste personnalis e custom track dans ce navigateur
300. impr cise r alis es sur membrane de nylon les macroarrays constituaient simplement un changement d chelle dans la technique du dot blot inverse La robotisation de l tape de d p t permit d augmenter la densit et donc le nombre de sondes pr sentes sur le support passant de 96 plusieurs centaines Dans un premier temps les sondes employ es avec ce type de support taient des ADN compl mentaires clon s dans des vecteurs puis l emploi de produits de PCR a permis une plus grande plasticit dans la conception 20 fa on des puces ADN Toutefois les supports en nylon pr sentant une tr s forte autofluorescence les acides nucl iques analyser doivent tre marqu s radioactivement ce qui repr sente une contrainte pratique vidente mais aussi technique En effet l autoradiographie n autorise pas une r solution aussi importante donc une densit de d p ts qu un scanner en fluorescence de plus la fluorescence permet l hybridation simultan e de deux populations d acides nucl iques marqu es avec des fluorochromes diff rents hybridation comparative tandis que les macroarrays imposent d hybrider un seul chantillon par puce hybridation simple ce qui impose des contraintes suppl mentaires pour la normalisation et la comparaison des r sultats de puces cf paragraphe 1 2 1 5 Cette technologie a t rapidement supplant e par les microarrays en raison des contraintes moindr
301. in Ultrathin 90 nm sections cut on a Reichert Ultracut ultramicrotome were stamed with uranyle acetate and lead citrate and examined with an electron microscope Hitachi HUI2A The floxed mouse mutant line was established at the Mouse Clinical Institute Institut Clinique de la Souris MCI ICS in the Targeted Mutagenesis and Transgenesis Department with funds from the GIS Institut des Maladies Rares The authors would like to thank H Gallinaro for participating in the targeting strategy and M Ribouchon for excellent technical assistance We thank staff of INSERM IFR 150 and more particularly M Calise 5 Appolinaire A Tridon F Aregui G Marsal from the animal facilities F Capilla and T Al Saati from the technical platform of histopathologic exp rimentale C Offer and H Brun from the plateau de s quen age We also thank I Fourguaux from the CME AB for technical assistance with ultrastructural analysis This study was supported by grants from the CNRS Toulouse III University the Soci t de Recherche Dermatologique SRD and the Association Alopecia Areata AAA 258 5 E 0 T O ie a Corneodesmosomal defects in Cas mice 2709 References Allen Ma Ishida Yamamoto A MeGrath J Davison S Iizuka H Simon Ma Guerrin M Hayday Vaughan R Serre G et al 2001 Comecdesmosin expression in psoriasis vulgaris differs from normal skin and other
302. ina Outer Col fibres de collag ne du derme superficiel HER Borradori and Sonnenberg 1999 Droite Repr sentation sch matique Litjens et al ee 2006 densa 2 1 4 L epiderme Les k ratinocytes cellules majoritaires de l piderme 95 composent un pith lium pluristratifi pavimenteux et cornifi En effet ces cellules en progressant des couches profondes vers la surface se diff rencient progressivement avant de subir un processus de mort cellulaire programm e la cornification Les autres types cellulaires dont les proportions varient l g rement selon les territoires anatomiques comprennent les m lanocytes 3 dont le r le est essentiel dans la protection contre les rayonnements ultraviolets les cellules de Langerhans 2 cellules pr sentatrices d antig nes assurant la fonction de sentinelles du syst me immunitaire les cellules de Merkel lt 1 g n ralement proches de terminaisons nerveuses et jouant un r le neurosensoriel 2 1 5 Les annexes pidermiques Les annexes pidermiques sont form es au cours du d veloppement par invagination des cellules de lectoderme et sont donc situ es dans le derme et Phypoderme elles comprennent les follicules pileux et les ongles tous deux caract ris s par la pr sence de cellules cornifi es ainsi que les glandes s bac es les glandes sudoripares eccrines et les glandes apocrines faussement qualifi es de sudoripares 56
303. ine J C Kemp D J and Stark G R 1977 Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl paper and hybridization with DNA probes Proc Natl Acad Sci U S A 74 5350 5354 Anastasia J V and Conley J P 1977 The role of fatty acid oxidation in the epidermis J Invest Dermatol 69 430 434 April C S and Barsh G S 2006 Skin layer specific transcriptional profiles in normal and recessive yellow Mclre Mclre mice Pigment Cell Res 19 194 205 Arredondo J Chernyavsky A I Webber R J and Grando S A 2005 Biological effects of SLURP 1 on human keratinocytes J Invest Dermatol 125 1236 1241 263 Arredondo J Nguyen V T Chernyavsky A I Bercovich D Orr Urtreger A Kummer W Lips K Vetter D E and Grando S A 2002 Central role of alpha7 nicotinic receptor in differentiation of the stratified squamous epithelium J Cell Biol 159 325 336 Ashcroft G S Lei K Jin W Longenecker G Kulkarni A B Greenwell Wild T Hale Donze H McGrady G Song X Y and Wahl S M 2000 Secretory leukocyte protease inhibitor mediates non redundant functions necessary for normal wound healing Nat Med 6 1147 1153 Atshaves B P Jefferson J R McIntosh A L Gallegos A McCann B M Landrock K K Kier A B and Schroeder F 2007 Effect of sterol carrier protein 2 expression on sphingolipid distribution in plasma membrane lipid rafts caveolae Lipids 42 871 88
304. ine mut e n interagit pas avec la prot ine sauvage et n est pas incorpor e l enveloppe corn e mais accumul e dans les noyaux parak ratosiques La forme mut e n agirait pas comme dominant n gatif mais par un gain de fonction cons cutif l apparition d un signal de localisation nucl aire fonctionnel Une autre tude montre que les mutations caract ristiques de 88 ces pathologies insertion d un nucl otide en position 662 709 ou 730 entrainent aussi chez l homme un d calage du cadre de lecture et l apparition d un signal de localisation nucl aire Ishida Yamamoto 2003 Il est propos que la forme de loricrine mut e interf re indirectement dans la cornification en emp chant la lyse nucl aire et ou en perturbant les fonctions nucl aires requises lors de la diff renciation Cette m me tude propose de regrouper la forme variante mutilante du syndrome de Vohwinkel et l rythrok ratodermie progressive sym trique sous le terme de k ratodermie impliquant la loricrine LK Loricrin Keratoderma Le m canisme par lequel se forment les constrictions conduisant a des mutilations reste encore totalement incompris REPEATS an F N TERMINUS consensus SCQUENCE SERR MNSQOO KOPCTPPPOFOO00VMOFCOPPE FER FRERE TVTPAPAOQ KTKOK type ARLE MSSQ00 KOPC PPPOTOGOOVEOFCOPPE a UTPAPAOGQ TRORS PRE MSS 0Q KOTTTPPPOLOQOQVKOFSOPPP 16X 57VTPGPAQQ xTKOK SERRA MSSQOQ
305. inent and elongated rete ridges only a weak inflammatory cell infiltrate and the phenotype evolved towards ulceration and disappearance of the epidermis In psoriasis the barrier defect is thought to be associated with intrinsic immunological defects The lack of any distinctive feature at the immunological level in our inducible KO model might contribute to the differences in the intensity of the inflammatory response Finally unlike our Cdsn deficient mouse models psoriasis is characterized by a significant increase in CDSN expression which is observed in multiple living layers and stratum corneum from lesional psoriatic epidermis Haftek et al 1997 Allen et al 2001 However the psoriasis associated SNPs of CDSN could affect the function of the corresponding proteins thus participating in the development of hyperproliferation as a compensatory mechanism to the barrier impairment Assessment of the functional consequence of the amino acid substitution in alleles unique to risk haplotypes is needed to further investigate the putative involvement of CDSN in psoriasis pathophysiology Spatially controlled somatic Cdsn inactivation in mouse epidermis using K 4 promoter driven Cre mediated deletion also allowed inactivation of Cdsn in the developing hair follicle Mice heterozygous for the excised Cds allele were indistinguishable from their wild type littermates In particular they did not develop any hair phenotype up to 8 months This su
306. ines ou certaines enzymes du m tabolisme des lipides ont dans d autres tissus une localisation lysosomiale Madison et al 1998 Le m canisme exact de biogen se des k ratinosomes reste en fait partiellement incompris Inactive proSCTE LES F iz APCE LEE ETES atin ae OO ee a BST Te a inactive 4 Ai proSCCE PNR Inactive cathepsins ooh Active cathepsins ee cystatin genet m a i a s ia F ses CET ihe Hin Ta Figure 34 Mod le de r gulation de la desquamation Caubet et al 2004 Parmi la dizaine de prot ases s cr t es identifi es dans la couche corn e deux prot ases s rine la KLK5 SCTE Ekholm and Egelrud 2000 et la KLK7 SCCE Hansson et al 1994 semblent jouer un r le majeur In vitro dans des conditions de pH acide proches de celles de la couche corn e les composants du corn odesmosome sont des substrats pour la SCTE La SCCE est quant elle capable de cliver 69 efficacement la CDSN et la desmocolline 1 DSC1 Caubet et al 2004 S appuyant sur ces donn es et celles de la litt rature une repr sentation sch matique des acteurs principaux intervenant dans la r gulation de la desquamation a t propos e figure 34 Les cathepsines sont des prot ases lysosomiales Chez l homme une mutation de la cathepsine C CTSC est responsable du syndrome de Papillon Lef vre une k ratodermie palmoplantaire associ e
307. inflammatory skin disorders Lah fnvest 81 969 976 Altschul 5 F Madden T L Schaffer A A hang da Ahane Miller W and Lipman D J 1997 Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 25 3389 3402 Barrandon Y LE V and Green H 1983 New techniques for the grafting of cultured human epidermal cells onto athymic animals frvest Dermatol 91 315 318 Capon F Munra M Barker J and Trembath R 2002 Searching for the major histocompatibility complex psoriasis susceptibility geme J Javest Dermarel 118 745 731 Capon F Toal L K Evans J C Allen M H Patel 5 Tillman D Burden D Barker J N and Trembath R C 2003 Haplotype analysis of distantly related populations implicutes comeodemocin in psoriasis susceptibility J Aed Gener 40 447 452 Caubet C Janca N Lopez F Est ve J Po Simon M and Serre G 2004 Homo oligomerization of human comeodesmesin is mediated by ns N terminal glycine loop domain fivest Dermatol 122 747 754 Chen J Den and Koch P J 2005 Loss ofdesmocollin 3 in mice leads to epidermal blistering Cell Sed 121 2844 2849 Chidgey M Brakebusch Ca Gustafsson E Cruchley A Hail Ca Kirk S Merritt A North Tselepis C Hewitt J et al 2001 Mice lacking desmocollin show cpidermal fragility accompanied by barier defects and abnormal differentiation Cel Biol 155 8
308. informatique Bordeaux Universit V Segalen Bordeaux 2 rue L o Saignat 33076 Bordeaux Cedex France Correspondence Marina Guerrin Email mweber udear cnrs ir Published 1 1 June 2007 Received March 2007 Genome Biology 2007 8 R107 doi 10 1 86 gb 2007 8 6 r 107 ja fee The electronic version of this article is the complete one and can be found online at http genomebiology com 2007 8 6 R1 07 2007 Toulza et al licensee BioMed Central Ltd This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License http creativecommons org licenses by 2 0 which permits unrestricted use distribution and reproduction in any medium provided the original work is properly cited Abstract Background During epidermal differentiation keratinocytes progressing through the suprabasal layers undergo complex and tightly regulated biochemical modifications leading to cornification and desquamation The last living cells the granular keratinocytes GKs produce almost all of the proteins and lipids required for the protective barrier function before their programmed cell death gives rise to corneocytes We present here the first analysis of the transcriptome of human GKs purified from healthy epidermis by an original approach Results Using the ORESTES method 22 585 expressed sequence tags ESTs were produced that matched 3 387 genes Despite normalization provided by this method mean 4 6 ORESTES
309. interacting protein CREB regulated transcription coactivator 1 spenmidine spenmine N1 acetyltransferase 1 LYR motif containing 4 hypothetical gene LOC96610 hypothetical protein FLJ31958 intestine specific homeobox T cell receptor delta locus hypothetical protein LOC283483 forkhead box L1 formin hamology 2 domain containing 1 serpin peptidase Inhibitor clade B ovalbumin member 5 tripartite motif containing 46 arylalkylamine N acetyltransferase B cell CLL lymphoma 2 6 pyruvoyltetrahydropterin synthase family with sequence similarity 26 member F proteasome prosome macropain subunit beta type 8 large multifunctional peptidase 7 desmoglein 1 spectrin beta non erythrocytic 2 zinc finger protein 5858 small proline rich protein 2B hypothetical protein FLJ33590 protein tyrosine phosphatase receptor type f polypeptide PTPRF interacting protein alpha 3 histone cluster 1 H4b chromosome 13 open reading frame 33 transmembrane protein 160 low density lipoprotein receptor related protein 6 dedicator of cytokinesis 2 PR domain containing 15 mevalonate diphospho decarboxylase hypothetical protein MGC39900 chromosome 15 open reading frame 21 trefoil factor 2 Spasmolytic protein 1 hypothetical LOC646999 transmembrane protein 163 cyclin dependent kinase like 3 Myosin AVB pseudogene HCV F transactivated protein 1 basic helix loop helix domain containing class B 8 cylicin basic protein of sperm head
310. ion existent et le choix d pend la fois du type de puces employ et de la nature des donn es Le but de la normalisation est de s affranchir au maximum des biais inh rents la technique des puces afin de rendre les donn es comparables entre elles Malgr tout les donn es issues de puces sont dites bruit es et si la normalisation permet de r duire le bruit syst matique par exemple une diff rence de concentration entre deux populations d ADNc diff rentiellement marqu es et co hybrid es elle ne permet pas de prendre en compte la variabilit dans les mesures pour un g ne ou une sonde donn s Seules la r p tition de l exp rience a partir d chantillons biologiques totalement ind pendants et une analyse statistique permettent d valuer la solidit des r sultats Le nombre de r p titions n cessaires pour avoir des mesures fiables d pend essentiellement de la finesse d analyse souhait e ex seuil de ratio pour d clarer un g ne comme surexprim fix 1 5 ou 2 et la variabilit entre chaque mesure variabilit biologique exp rimentale Les diff rences entre puces ADN r sident principalement dans leur type de support et leur mode d emploi hybridation simple ou co hybridation de deux chantillons mais aussi dans leur champ d application et donc leur design choix des sondes pr sentes sur le support 1 2 1 2 Types de support L origine des premi res puces ADN est
311. ions hereafter named T1 T3 and finally to isolate cells attached to the stratum corneum T4 fraction Genome Biology 2007 8 R107 144 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Table Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Expression ratios for KRT 4 and KLK7 as measured by real time PCR from four independent samples Expression ratio KRTI 4 TI TA4 75 SCCE KLK7 T4 T1 164 Morphological analyses revealed that after three treatments residual epidermal fragments were mostly composed of cor neocytes and GKs Figure 1 Quantitative real time PCR was performed to quantify the enrichment in GKs To first select a reference gene for normalization the relative expression of eight housekeeping genes GAPDH SOD1 ACTB B2M HPRT1 HMBS TBP and UBC in each cell fraction T1 T4 was analyzed using GeNorm 10 In agreement with previous data 11 beta 2 microglobulin B2M appeared to be stably expressed during epidermis differentiation and was thus chosen for normalization In addition we used the lectin Galectin 7 LSGAL7 which was previously shown by in situ hybridization to be equally expressed in all epidermal layers 12 BPAG2 bullous pemphigoid antigen 2 or KRT14 and KLK7 kallikrein 7 also called stratum corneum chymotryptic enzyme SCCE were selected as specific for the basal layer or the GKs respectively 13 14 For four cell fractionations from different individuals the mean T1 T4 expression
312. ions of binding sites could be found within the majority of promoters examined see Fig S2 for an example Thus 88 TFs belonging to gene families underscored by the comparative promoter analysis were selected for qRT PCR experiments together with potential cofactors identified from the literature Data filtering of all three sources 35 76 genes was performed using the UniGene database so that all genes represented by less than 200 ESTs were selected for subsequent 174 qRT PCR analyses Indeed the number of ESTs for a given gene represents how many times it was sequenced from all human libraries Thus a small number suggests that the gene has a tissue specific expression pattern indicative of a differentiation program Among the remaining genes our filtering focused on the regulation of the terminal differentiation program potential transcription factors cofactors proteins linked to signal transduction We also selected a few genes involved in lipid metabolism and programmed cell death potentially important for the permeability barrier and cornification Regardless of their function all genes strongly represented in UniGene gt 1500 ESTs were discarded Gene expression profiling by qRT PCR In total 298 candidates were tested by qRT PCR analysis to quantify expression during keratinocyte differentiation Among these 216 72 5 were detected by classical PCR confirming their expression in the epidermis Furthermore 157 were r
313. iption FT et leur fonctionnement a grandement volu en particulier sur la fa on dont ils interagissent avec ADN G n ralement le contact FT ADN se fait par l interm diaire de liaisons faibles lectrostatiques forces de van der Waals avec les bases nucl otidiques de l ADN g n ralement depuis le grand sillon Si quelques FT peuvent se fixer sur un grand nombre de r gions de facon assez peu sp cifique la plupart reconnaissent sp cifiquement plusieurs bases nucl otidiques et donc des sites plus ou moins d finis Cependant les bases reconnues n tant pas n cessairement directement adjacentes de nombreux FT reconnaissent pr f rentiellement un site de fixation pr cis mais aussi des sites plus ou moins d g n r s avec des affinit s variables selon les bases qui diff rent Pour cette raison il n est pas judicieux de rechercher directement au sein d une s quence la pr sence d un site consensus en sachant que des sites alternatifs sont susceptibles de ne pas tre pris en compte par l analyse La plupart des outils bioinformatiques de recherche de TFBS emploient non pas des s quences consensus mais des matrices de liaison tablies partir de sites de fixation d termin s exp rimentalement principalement par la technique de SELEX ou Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment Tuerk and Gold 1990 Cui et al 1995 Pour chaque position la fr quence observ e de A T G ou C est alors calcul
314. iptionnel ces donn es appellent dans un premier temps une validation au niveau prot ique par immunohistochimie ou immunofluorescence voire par microscopie lectronique pour une localisation subcellulaire Selon la fonction putative de ces g nes plusieurs approches sont ensuite envisageables pour la caract risation fonctionnelle de ces prot ines Des exp riences de gain ou de perte de fonction soit dans des mod les in vitro k ratinocytes en condition diff renciantes ou piderme reconstitu siRNA ou transfections soit in vivo pr f rables pour tudier la fonction barri re souris transg niques knock out sont possibles pour les g nes d int r t Dans le cas de facteurs de transcription les exp riences de gain ou de perte de fonction ne permettent pas de distinguer les cibles directes des cibles indirectes lorsque l on identifie des g nes diff rentiellement exprim s Or l identification des cibles directes si possible in vivo est d un int r t lev pour comprendre leur fonction qui peut tre diff rente d un tissu un autre Pour cette raison les exp riences d immunopr cipitation de chromatine suivie de puces ADN ou de s quen age pour identifier les s quences g nomiques fix es sont de plus en plus employ es syst matiquement et constitue une approche de choix pour une partie des facteurs peu d crits que nous avons identifi Nous avons choisi de discuter le r le potentiel dans l
315. iptome project the ORESTE methodol ogy was selected because it produces sequences that are dis tributed predominantly within the central part of the corresponding transcripts and is biased towards less abun dant mRNAs 9 When using arbitrarily chosen primers for reverse transcription and PCR the amplification of a given transcript is proportional to its length and to the probability for the primer to anneal at low stringency 37 C This con ceptual normalization was secondarily strengthened by removing cDNA libraries with highly abundant amplification products After the elimination of irrelevant sequences we produced 16 591 ORESTES representing 3 387 genes The distribution of the ORESTE number per gene Figure 2 and the low number of ESTs in the corresponding UniGene entries fully confirmed that the transcript normalization obtained with this method is at least comparable to that of Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 hybridization subtraction techniques for an example see 37 Overrepresented genes Nevertheless a few genes were represented by more than 100 sequences obtained from different mini libraries These include ubiquitous highly expressed genes like RPS8 and EEF1A1 and genes already known to be highly transcribed in GKs those encoding keratin 1 late envelope protein 7 or pro filaggrin Other members of this class DMKN formerly ZD52F10 SERPINA12 and FLG2 were not previously known to be o
316. iquement dans l piderme chez l adulte Les souris h t rozygotes pour la mutation ne pr sentent aucun ph notype apparent Au contraire les souris homozygotes Cdsn souffrent d une extr me fragilit pidermique et meurent quelques heures apr s la naissance Des tests fonctionnels montrent un trouble majeur de la perm abilit pidermique et une perte de la r sistance m canique de la couche corn e Les analyses histologiques et ultrastructurales montrent que la coh sion pidermique est rompue l interface couche granuleuse couche corn e Pour valuer plus long terme l volution de l piderme des souris Cdsn des greffes de peau sur souris Nude ont t r alis es Au niveau des greffons l piderme pr sente d abord une hyperprolif ration compensatoire et une hyperk ratose parak ratosique associ es un trouble persistant de la barri re avant que le greffon ne finisse par d g n rer De plus les follicules pileux o la Cdsn est galement exprim e dans la gaine pith liale interne subissent une d g n rescence progressive qui aboutit leur disparition apr s huit semaines Chez la souris adulte l inactivation au niveau de l piderme par traitement topique du g ne Cdsn conduit des anomalies histologiques similaires et un d faut finalement l tal de la barri re pidermique L ensemble de ces r sultats montre que la Cdsn n est pas n cessaire pour le maintien de la
317. ires humains normaux NHEK Lu et al 2005 Parmi les 82 g nes surexprim s figurent plusieurs membres des PADI 1 2 et 3 des kallikr ines 5 6 7 8 10 13 et des serpines B1 6 et 9 mais aussi l involucrine la cystatine M E et les facteurs de transcription c Fos et KLF4 SPRR1 et TGM1 font partie des 16 g nes r prim s Ces r sultats confirment le caract re pl iotropique de la vitamine D3 mais ne permettent pas d identifier les cibles directes du VDR L action du 1 25 OH sD dans la diff renciation k ratinocytaire passe par de nombreuses voies de signalisation communes avec le calcium figure 51 Bikle and Pillai 1993 Premi rement l expression du CaSR est augment e par le 1 25 OH sD entra nant une plus grande sensibilit du k ratinocyte la concentration en calcium 99 extracellulaire Ratnam et al 1999 De plus plusieurs membres de la famille des phospholipases C galement cruciale pour la signalisation calcique dans les k ratinocytes sont induites par le 1 25 OH 2D Pillai et al 1995 aussi bien que par le calcium Enfin le calcium et le 1 25 OH 2D agissent en synergie notamment pour activer la transcription de l involucrine et des TGM Su et al 1994 Dans le promoteur du g ne de l involucrine des l ments de r ponse au calcium CaRE et VDRE ont t retrouv s tr s proches physiquement Des mutations dans le CaRE bloquent la fois l action du calcium et du 1 25 OH sD alors qu une mu
318. is est modifi e par la cornification Au cours de leur progression dans cette ultime couche les corn ocytes voient ces attaches progressivement d grad es comme en attestent les donn es de microscopie lectronique la partie extracellulaire des corn odesmosomes apparait moins dense et progressivement d grad e tandis que les lamellae lipidiques entourent progressivement la partie centrale Fartasch et al 1993 figure 33 67 Figure 33 D gradation progressive des corn odesmosomes au cours de la desquamation Fartasch et al 1993 Le c ur intercorn ocytaire dense aux lectrons est progressivement d grad et envahi par les lamellae lipidiques La densit du cceur diminue fortement puis seules de rares zones denses isol es persistent au milieu des lamellae Ce ph nom ne de d gradation se produit dans un premier temps au niveau des corn odesmosomes basaux apicaux dans la partie inf rieure de la couche corn e et est l origine des diff rences morphologiques entre stratum compactum et stratum disjunctum Puis un clivage plus tardif a lieu au niveau des corn odesmosomes lat raux Skerrow et al 1989 Chapman and Walsh 1990 ce qui entraine alors la lib ration du corn ocyte La prot olyse des corn odesmosomes passe par la d gradation de leur prot ines transmembranaires et extracellulaires cadh rines desmosomales de la famille des desmocollines et desmogl ines cf partie 2 2 2 2 2 3 ainsi que la
319. kov L N 1997 Direct evidence that involucrin is a major early isopeptide cross linked component of the keratinocyte cornified cell envelope J Biol Chem 272 2021 2030 Stern R Asari A A and Sugahara K N 2006 Hyaluronan fragments an information rich system Eur J Cell Biol 85 699 715 Steven A C Bisher M E Roop D R and Steinert P M 1990 Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes J Struct Biol 104 150 162 285 Strimmer K 2008 A unified approach to false discovery rate estimation BMC Bioinformatics 9 303 Su M J Bikle D D Mancianti M L and Pillai S 1994 1 25 Dihydroxyvitamin D3 potentiates the keratinocyte response to calcium J Biol Chem 269 14723 14729 Sultan M Schulz M H Richard H Magen A Klingenhoff A Scherf M Seifert M Borodina T Soldatov A Parkhomchuk D Schmidt D O Keeffe S Haas S Vingron M Lehrach H and Yaspo M L 2008 A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome Science 321 956 960 Sun W Xu R Hu W Jin J Crellin H A Bielawski J Szulc Z M Thiers B H Obeid L M and Mao C 2008 Upregulation of the human alkaline ceramidase 1 and acid ceramidase mediates calcium induced differentiation of epidermal keratinocytes J Invest Dermatol 128 389 397 Swartzendruber D C Wertz P W
320. l Tight junction proteins in the skin Skin Pharmacol Physiol 2006 19 71 77 Furuse M Hata M Furuse K Yoshida Y Haratake A Sugitani Y Noda T Kubo A Tsukita S Claudin based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier a lesson from claudin l deficient mice Cell Biol 2002 156 1099 1 111 Vinckenbosch N Dupanloup l Kaessmann H Evolutionary fate of retroposed gene copies in the human genome Proc Natl Acad Sci USA 2006 103 3220 3225 Rogers MS Kobayashi T Pittelkow MR Strehler EE Human cal modulin like protein is an epithelial specific protein regu lated during keratinocyte differentiation Exp Cell Res 2001 267 216 224 The snoRNABase http www snorna biotoul fr Weber MJ Mammalian small nucleolar RNAs are mobile genetic elements PLoS Genet 2006 2 e205 Smith CM Steitz JA Classification of gas5 as a multi small nucleolar RNA snoRNA host gene and a member of the 5 terminal oligopyrimidine gene family reveals common fea tures of snoRNA host genes Mol Cell Biol 1998 18 6897 6909 Ji P Diederichs S Wang WV Boing S Metzger R Schneider PM Tidow N Brandt B Buerger H Bulk E et al MALAT 1I a novel noncod ing RNA and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early stage non small cell lung cancer Oncogene 2003 22 8031 8041 Geirsson A Paliwal I Lynch RJ Bothwell AL Hammond GL Class II transactivator promoter activity is suppressed through reg ulation by a tro
321. l ensemble de l piderme R 1 4 ARSD r side dans le m me locus Xp22 32 que deux autres g nes apparent s ARSE et STS ARSC1 impliqu s respectivement dans la chondrodysplasie ponctu e dominante li e l X de type 1 CDPX1 OMIM 302950 et l ichtyose li e l X OMIM 308100 En raison de sa proximit avec ARSE il n est pas exclu que ARSD soit galement impliqu dans la CDPX1 Franco et al 1995 ARSD tant exprim dans la plupart des territoires anatomiques alors que ARSE n y est pas d tectable par RT PCR Dooley et al 2000 une d ficience en ARSE explique 225 difficilement les signes d ichtyose des personnes atteintes de CDPX1 faisant de ARSD un meilleur g ne candidat en cas de d faut pidermique Il est int ressant de noter que ARSF pr sent sur le m me locus est galement surexprim dans les couches suprabasales y compris dans les k ratinocytes granuleux ratio piderme k r pineux 2 4 Radoja et al 2006 Un certain nombre de g nes codant pour des lipases ont galement t identifi e notamment partir des ORESTEs Toulza et al 2007 Les lipases s cr t es LIPK LIPM et LIPN toutes trois fortement surexprim es dans les k ratinocytes granuleux R gt 100 ainsi que la lipase LIPJ probablement non s cr t e restent peu charact ris es M me si le substrat et la fonction de ces lipases restent non d crits dans la litt rature leur homologie de s quence avec les lip
322. l sources were compiled and filtered to specifically target genes most relevant for barrier function Expression levels during differentiation were determined by qRT PCR Fig 2 Validation of new differentiation associated genes by immunohistochemistry on normal human skin sections MAPT protein a is mainly detected in suprabasal layers and the staining is moderately reinforced in the granular layer SH3KBP1 protein b is restricted to the granular layer Negative controls c d consisted in incubations in the absence of the primary antibody on corresponding serial sections Bar 50 um Supporting information Supplementary Results and Material amp Methods microarrays Fig S1 Microarray results from six independent samples Table S1 Differentially expressed genes listed according to Significance Analysis of Microarrays SAM Supplementary Material amp Methods in silico promoter analyses Fig S2 Example of promoter analysis for DMKN B8 y orthologs using Genomatix tools Table S2 Sequences of primers used for qRT PCR essays 189 SUPPORTING INFORMATION Supplementary Results and Material amp Methods microarrays Figure 1 Microarray results from six independent samples Table 1 Differentially expressed genes listed according to Significance Analysis of Microarrays SAM Known markers of basal or differentiated layers are written in green or red bold respectively supplementary Material amp Methods in silico
323. l steps of GK differentiation Conclusions These new leads contribute to a better understanding of gene networks involved in barrier function and may help decipher some differentiation disorders observed in many skin diseases including ichthyosis Introduction The epidermis is a highly specialized pluristratified epithelium composed primarily of keratinocytes widely dedicated to the barrier function Genes Known to be involved in barrier formation are mainly expressed in the last living cells granular keratinocytes GKs produce more than 30 different epidermal specific proteins including well known structural components that aggregate into characteristic cytosolic granules GKs give rise to corneocytes that accumulate in the cornified layer ensuring the barrier function After cornification transcription and translation are no longer detectable and organelles disappear 170 Thus components of the stratum corneum responsible for most of the protective functions of the epidermis are produced by GKs Transcription factors TFs regulating cornification remain largely unknown Biochemical techniques have thus far made possible to identify only four TFs involved in late differentiation and barrier formation KLF4 GATA3 GRHL3 and PRDM1 Blimp 1 Few large scale studies were previously performed using diverse models pioneering work on skin differentiation initiated transcriptome studies of in vitro differentiated keratinocytes and total
324. la partie la plus superficielle la couche corn e constitu e de corn ocytes des cellules mortes tr s coh sives entour es d une matrice lipidique Un processus complexe de mort cellulaire programm e la cornification aboutit la transformation des derni res cellules vivantes les k ratinocytes granuleux en corn ocytes d pourvus d activit transcriptionnelle et traductionnelle Les k ratinocytes granuleux constituent donc la fois le stade ultime de la diff renciation pidermique mais aussi celui o sont produits les diff rents acteurs de la cornification et de la desquamation donc de la fonction barri re Tr s peu d tudes mol culaires syst matiques ont t consacr es l piderme humain et seulement quatre facteurs de transcription sp cifiques requis pour la fonction barri re ont t identifi s Le travail pr sent ici combine plusieurs techniques grande chelle afin d identifier de nouveaux g nes impliqu s dans les tapes tardives de ce programme Un proc d de purification de cellules a partir d piderme humain normal a t d velopp afin d obtenir des fractions enrichies en k ratinocytes de diff rents stades de diff renciation Ce proc d coupl a la technique des ORESTEs a permis dans un premier temps de produire 22 000 s quences et d identifier 3387 g nes exprim s dans la couche granuleuse parmi lesquels de nouveaux marqueurs de la diff renciation impliqu s dans divers
325. lack boxes represent exons oxP and Frt sites are depicted as black and open triangles respectively Primers for PCR genotyping P1 P3 are indicated with arrows B PCR analysis of tail DNA from offspring of Casu mice crossed with K14 Cre Cdsn HET mice Specific primers were used to detect the K 4 Cre transgene primers Cre Primers P2 and P3 were used to detect wild type 265 bp or floxed 366 bp Cdsn alleles A 550 bp band was detected only in heterozyeous pups which corresponds to the amplification of partial hybridization between 265 bp and 366 bp amplicons as verified by sequencing C Primers PT and P3 allow the amplification of a 560 bp fragment when the exon 2 of Cash 1s excised The experimental conditions used for this PCR do not allow amplification of the non excised 3 7 kb fragment still containing the second exon D Quantitative RT PCR analysis of Cds expression on dorsal skin samples from WT HET and KO neonates Values represent relative RNA level from the WT afler normalization with Dsgi transcript level Values are mean seim E Equal amounts of protein extracts from WT HET and KO neonate dorsal skin were separated by SDS PAGE and subjected to western blot analysis using the anti CDSN F28 27 mAb or an anti actin mAb In protem extracts from WT und HET animals F28 27 reacts with two major polypeptides of about 34 kDa and 45 kDa which correspond to the full length black triangle and a proteolytically
326. les concernant plus sp cifiquement l expression g nique deep sequencing et RNA Seq pour voir l impact du s quencage nouvelle g n ration sur les approches d j existantes ou sur le d veloppement de nouvelles approches GIS ditags or PETs Figure 19 Principales techniques d tude du transcriptome bas es sur la g n ration d tiquettes ne Harbers and Carninci 2005 ew ee A aa Pour un m me messager les tiquettes Pie E ss ou tags peuvent tre simples SAGE j is 3 A CAGE TEC RED ou appari es GIS m Anchoring enzyme sites 5 CAGE SAGE AG SAGE 3 SAGE TEC RED 5 ralated related ditags 5 SAGE 41 Le deep sequencing consiste employer le s quencage tr s haut d bit pour tirer le maximum du potentiel de techniques anciennes notamment celles visant ne sequencer que de courtes portions d ADNc tiquettes ou tags ces segments tant g n ralement concat n s afin de r duire le nombre de r actions de s quencage de type Sanger initialement employ Parmi toutes ces techniques figure 19 citons notamment le SAGE Serial Analysis of Gene Expression le CAGE Cap Analysis of Gene Expression permettant d identifier l extr mit 5 des transcrits ou encore le GIS Gene Identification Signature une strat gie visant rabouter les extr mit s 5 et 3 des ADNc afin d identifier sans ambigu t les transcrits ce qui est difficile lors
327. les donn es comparer ce qui correspond aux tapes de traitement des donn es brutes soustraction du bruit de fond et surtout tape de normalisation Les erreurs stochastiques qui se produisent au niveau d une partie seulement des cibles tudier et de fa on non reproductible variabilit inter individus d gradation partielle de certains ARN anomalie locale dans l hybridation ou dans le d p t des sondes ne peuvent tre prises en compte partir des donn es d une seule puce Ces erreurs stochastiques n cessitent donc de r p ter l exp rience un nombre variable de fois selon leur amplitude et selon la finesse d analyse souhait e Le coefficient de variation d une m me mesure tant difficilement pr visible a priori 28 il peut tre utile de faire quand cela est possible une analyse pr liminaire sur quelques chantillons pour estimer le nombre de r p titions n cessaires a l tude Quel que soit le type de puce la premi re tape dans le traitement des donn es est la soustraction du bruit de fond afin d liminer le signal li une fixation non sp cifique sur le support La plupart des logiciels d analyse d image gratuits ex ScanAlyze Dapple ou payants GenepixPro pour les scanners Axon QuantArray ImaGene permettent de d finir de fa on semi automatique la zone correspondant au d p t ainsi qu une zone autour de chaque d p t servant comme valeur locale du brui
328. les donn es de transcriptome global particuli rement difficile d crypter dans le cas du psoriasis celles ci n ayant livr que peu d information sur les m canismes impliqu s 3 1 2 Transcriptome et inflammation Le TNFa tant un des principaux m diateurs de linflammation dans l piderme avec l IL 1 le traitement de k ratinocytes en culture par cette cytokine est susceptible d induire une diff renciation aberrante qui ressemble a celle observ e dans un contexte d inflammation cutan e La technique du SAGE a permis d identifier environ 10 000 g nes exprim s par les k ratinocytes diff renci s in vitro parmi lesquels 90 subissent une r gulation surexpression pour 47 d entre eux sousexpression pour les 43 autres en r ponse au traitement par le TNFa Jansen et al 2001 Les auteurs rel vent notamment un niveau d expression relativement stable pour les g nes impliqu s dans la formation de plusieurs structures essentielles de l piderme KRTs SPRRs IVL TGMs m me si certains g nes suprabasaux tendent 124 tre l g rement r prim s tandis que K14 est surexprim Parmi les g nes fortement exprim s figurent galement des g nes codant pour des prot ines s cr t es activit antimicrobienne avec notamment une surexpression de S100A8 et S100A9 codants pour les calgranulines A et B De fa on int ressante ces deux prot ines sont surexprim es dans l piderme hyperprolif ratif
329. level This revealed two situa tions first the gene is strongly expressed in many cell types including GKs a high number of both ORESTES and Uni Gene entries and second the gene is particularly expressed in GKs a high number of ORESTES but low number of Uni Gene entries The first category mainly includes housekeep ing genes from the translation machinery for example RPS8 EEF1A1 RPL3 RPL7A RPL28 Table 2 The second category contains genes previously described as implicated in epider mis barrier function for example KRT1 DMKN LEP7 FLG KRT2A SPRR2E CASP14 CDSN hKRP SBSN and inter estingly new candidates for this function TSPAN5 DUOX2 TMEM14C SERPINA12 SLC22A5 FLG2 C7orf24 Dermokine DMKN represented by 217 ORESTES was shown to be selectively transcribed in mouse GKs by high throughput in situ hybridization 15 and signal sequence trap 16 screens The present ORESTES dataset allowed us to describe 13 novel human DMKN splicing isoforms with dis tinct subcellular locations and expression patterns 17 Genome Biology 2007 8 R107 145 Toulza et al R107 3 h D a D Nn 2 n y R107 4 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Figure Histological analysis of epidermis samples a Hematoxylin eosin stained sections of entire epidermis after thermolysin incubation and removal of the dermis b c d Epidermis fragments remaini
330. liant and available from the Gene Expression Omnibus GEO database under accession number GSE13263 Six independent samples and nine arrays were used in this study four BK samples were labeled with Cy3 and hybridized with the corresponding Cy5 labelled GK sample reverse labeling was performed for three arrays called swap arrays in order to assess potential biases due to the dye and the two remaining BK and GK samples were labeled with Cy5 and Cy3 respectively Non commercial pangenomic oligonucleotide microarrays platform GPL1946 in GEO database produced by the RNG MRC for the Resogen Program consisted of 25 248 different 50mers targeting 22 458 genes and used according to the manufacturer s instructions for non amplified RNA Briefly 10 20ug of total RNA were reverse transcribed with Superscript Il 18064 022 Invitrogen in the presence of oligo dT primers 18418 012 Invitrogen and aminoallyl dUTP A0410 Sigma Aldrich Single stranded cDNA were purified using the cleanup module of the Labelstar Array Kit 28904 Qiagen and coupled with monofunctional 191 NHS ester Cy3 or CyS dye RPN5661 Amersham GE Healthcare After purification Cys and Cy5 labelled cDNAs were pooled and vacuum concentrated Following dilution into 50yl of hybridization buffer 2x SSC 0 1 SDS and 0 1 salmon sperm DNA 15632 011 Invitrogen cDNA were deposited onto microarrays under coverslips and slides were placed in a hybridization chamber for 16 h
331. licable Importante Elev RNA Seq S quen age tr s haut d bit Une base Haut Variable selon l application Bas gt 8000x Faible Moyen Table 1 Comparaison entre tiling microarray banques d ADNc EST et RNA Seq 43 des ADNc ces fragments tant li s des adaptateurs permettant ventuellement une amplification avant le deep sequencing La possibilit de limiter au maximum les tapes entre l extraction des ARN et leur s quen age constitue une grande avanc e par rapport aux techniques ant rieures permettant d aller aussi loin dans l tude du transcriptome tiling microarrays ou s quencage d ADNc Table 1 Une r cente analyse du transcriptome de tissus murins cerveau foie et muscles squelettiques a t r alis e par RNA Seq Mortazavi et al 2008 Cette approche par deep sequencing a permis de mesurer l abondance relative de chacun des messagers en fonction du nombre de s quences mais galement de r viser l annotation du g nome 90 des s quences align es avec le g nome se sont av r es localis es au niveau d exons connus les autres s quences d finissant de nouveaux sites d initiation de la transcription des exons codants alternatifs ou des variants de la r gion 3 non codante ainsi que de nouveaux pr curseurs de microARN Deux tudes men es chez l homme ont permis de dresser un catalogue de 31 997 Morin et al 2008a et 94 241 Sultan et al 2008 jo
332. licle stem cells walking the maze Eur J Cell Biol 86 355 376 Ting S B Caddy J Hislop N Wilanowski T Auden A Zhao L L Ellis S Kaur P Uchida Y Holleran W M Elias P M Cunningham J M and Jane S M 2005 A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice Science 308 411 413 Ting S B Wilanowski T Auden A Hall M Voss A K Thomas T Parekh V Cunningham J M and Jane S M 2003 Inositol and folate resistant neural tube defects in mice lacking the epithelial specific factor Grhl 3 Nat Med 9 1513 1519 Toulza E Galliano M F Jonca N Gallinaro H Mechin M C Ishida Yamamoto A Serre G and Guerrin M 2006 The human dermokine gene description of novel isoforms with different tissue specific expression and subcellular location J Invest Dermatol 126 503 506 Toulza E Mattiuzzo N R Galliano M F Jonca N Dossat C Jacob D de Daruvar A Wincker P Serre G and Guerrin M 2007 Large scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function Genome Biol 8 R107 Trempus C S Dang H Humble M M Wei S J Gerdes M J Morris R J Bortner C D Cotsarelis G and Tennant R W 2007 Comprehensive microarray transcriptome 286 profiling of CD34 enriched mouse keratinocyte stem cells J Invest Dermatol 127 2904 2907 Tschachler E 2007 Psoriasis the epidermal component Clin Dermatol 25 589 59
333. logies pidermiques 3 1 1 Transcriptome et psoriasis Une des premi res tudes grande chelle consacr e au psoriasis a t men e au moyen de puces Affymetrix U95A 12 000 g nes humains afin d analyser des chantillons de peau de 15 patients peau l sionnelle et non l sionnelle pour 11 d entre eux et 6 individus t moins Bowcock et al 2001 7129 transcrits ont t d tect s et un clustering hi rarchique a permis de mettre en vidence 177 g nes sp cifiquement r gul s dans la peau l sionnelle dont seulement 16 r prim s Parmi les g nes surexprim s plusieurs sont connus pour leur r le dans la diff renciation pidermique dont certains situ s sur l EDC IVL SPRRs plusieurs prot ines de la famille S100A On trouve galement les g nes TGM1 et 3 SKALP ALOX12B les SERPINB3 et B4 le marqueur membranaire CD24 les facteurs de transcription STAT1 et 3 et les k ratines sp cifiques des k ratinocytes hyperprolif ratifs K6a K16 et K17 Ces r sultats semblent bien corr l s avec ceux obtenus ult rieurement par Haider et collaborateurs sur des l sions psoriasiques et des carcinomes spinocellulaires Haider et al 2006 ceux ci ayant identifi s dans les deux 123 pathologies des g nes impliqu s dans la prot olyse et sa r gulation ADAM23 KLK6 10 13 SERPINB3 B4 et B8 l inflammation interleukines S100A CD24 et dans la diff renciation k ratinocytaire SPRR DSG3 TGM1 IVL ALOX12B
334. lt r e Segre et al 1999 Le tissu pr sente des anomalies morphologiques strictement limit es aux couches granuleuses et corn es avec notamment un nombre fortement r duit de granules de k ratohyaline des k ratinocytes granuleux moins aplatis que ceux des souris sauvages et une parak ratose figure 55B Les enveloppes corn es pr par es partir de peau de souris KO pr sentent galement un aspect irr gulier frip et rugueux alors qu elles sont normalement polygonales rigides et lisses Les auteurs proposent que les anomalies structurales sugg r es par laspect de ces enveloppes corn es soient l origine des alt rations observ es au niveau des lamellae lipidiques lamellae d sorganis es voire discontinues ondul es et d paisseur variable les k ratinosomes ayant une apparence et un contenu qui semblent normaux figure 55C La recherche des cibles potentielles de KIf4 par hybridation soustractive entre les ARNm de ces souris et ceux de souris sauvages a permis de mettre en vidence une surexpression en absence de Klf4 de trois prot ines int gr es a l enveloppe corn e SPRR2A PAI2 Plasminogen Activator Inhibitor 2 aussi nomm SERPINB2 SERine Protease INhibitor B2 et la r p tine SPRR2A ayant un site de fixation pour Klf4 dans son promoteur les auteurs sugg rent que K1f4 l image de certains autres membres des KIf pourrait avoir une action de r presseur transcriptionnel Lorsque Klf4 est exprim
335. man KRT 4 promoter is active during mouse epidermal fetal development as early as embryonic day E 9 5 and is strongly activated by E14 5 onwards Vassar et al 1989 Similarly to many other markers of epidermis differentiation Cdsn mRNA was first detected at E16 5 and becomes prominent at E18 5 H G unpublished results Therefore the chosen strategy would induce the deletion of the second exon of Cdsn before the gene is expressed in the developing epidermis and in hair follicles We first generated mice bearing floxed Cdsn alleles Cdsn which were bred to homozygosity These animals appeared normal EV fly A ET EZ Wild type X Pare allele E1 ox E2 Neo eres fs Targeting A P2 Z D construct Ei loxP E2 exp Fr Floxed i a TT E allele E1 i sisi Deleted P1 M allele B ke C Primers WT HETK ag ea TES ta Primers Cre if Cdsn flwt fl fl fi wet fil E SS WT HETKO D E BO 62 a Cdsne ea a 60 gt k 47 40 de 47 0 i Acin sas aa WT HET KO Fig 1 Gene targeting of Cesn A Schematic drawing of the Casna wild type locus the targeting construct containing the neomycin selector gene the floxed allele and the deleted allele obtained after Cre mediated excision The floxed part of Casn 3 kb encompasses the second exon so only the first exon Which encodes 28 amino acids mostly corresponding to the signal peptide is preserved after Cre mediated recombination B
336. ment le couple de k ratines K1 et K10 qui remplace le r seau pr existant K5 K14 sp cifique des k ratinocytes basaux K2 anciennement KRT2A ou KRT2e est d tect e dans les couches suprabasales de l piderme partir de la troisi me ou quatri me assise cellulaire Des disparit s sont noter dans l expression des k ratines selon les territoires anatomiques ainsi K2 est moins pr sente au niveau des seins aisselles et verge Collin et al 1992 tandis que Ko une k ratine tr s homologue K10 est exprim e de fa on sp cifique dans les couches suprabasales de l piderme palmoplantaire Langbein et al 1993 De nombreuses g nodermatoses sont caus es par des mutations des k ratines pidermiques qui ont pour la plupart un effet dominant n gatif Les ph notypes sont plus ou moins s v res selon la couche pidermique au niveau de laquelle sont exprim es les k ratines touch es et selon la position de la mutation sur la prot ine Cheng et al 1992 Par exemple une anomalie au niveau des r gions globulaires de K5 ou K14 entra ne un grave d faut de coh sion entre les k ratinocytes basaux conduisant la rupture de ces cellules et la formation de bulles profondes pidermolyse bulleuse simple EBS de type Dowling Meara OMIM 131760 Des mutations dans les m me r gions globulaires des k ratines suprabasales K1 ou K10 sont responsables d une hyperk ratose pidermolytique avec rupture au niveau des k
337. ment une pr diction un moyen d augmenter la probabilit d identifier un candidat potentiel pouvant expliquer la r gulation du g ne tudi Inversement l absence de mod les combinaisons de TFBS nouveaux ou connus dans les promoteurs de g nes coexprim s n implique pas n cessairement une absence de cor gulation Les g nes cor gul s peuvent tre notamment sous la d pendance d une r gion r gulant un locus ou LCR Locus Controling Region pouvant agir sur de grandes tendues ex le locus des f globines ou simplement de r gions r gulatrices distantes enhancers ou silencers De plus certaines combinaisons de TFBS peuvent tre jug es non significatives par le logiciel si l agencement des sites varie trop L outil FrameWorker de Genomatix par exemple ne consid re que les mod les o l espacement et surtout l ordre et l orientation des sites restent relativement conserv s alors qu un agencement diff rent peut aboutir une m me r gulation Il est enfin possible que les g nes coexprim s ne soient pas r ellement cor gul s mais soumis des combinaisons diff rentes de facteurs de transcription pr sents dans le m me type cellulaire Au final la pr diction de sites de fixation peut donc se heurter la faible sp cificit de certains facteurs de transcription la complexit de leurs interactions et la difficult d laborer des logiciels tenant compte de l ensemble des cas d crits en m
338. mice mimic Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity Nat Genet 37 56 65 Dias Neto E Correa R G Verjovski Almeida S Briones M R Nagai M A da Silva W Jr Zago M A Bordin S Costa F F Goldman G H Carvalho A F Matsukuma A Baia G S Simpson D H Brunstein A de Oliveira P S Bucher P Jongeneel C V O Hare M J Soares F Brentani R R Reis L F de Souza S J and Simpson A J 2000 Shotgun sequencing of the human transcriptome with ORF expressed sequence tags Proc Natl Acad Sci U S A 97 3491 3496 Dias Neto E Harrop R Correa Oliveira R Wilson R A Pena S D and Simpson A J 1997 Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed RT PCR an alternative to normalized libraries for the generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA Gene 186 135 142 Djalilian A R McGaughey D Patel S Seo E Y Yang C Cheng J Tomic M Sinha S Ishida Yamamoto A and Segre J A 2006 Connexin 26 regulates epidermal barrier and wound remodeling and promotes psoriasiform response J Clin Invest 116 1243 1253 Djian P Easley K and Green H 2000 Targeted ablation of the murine involucrin gene J Cell Biol 151 381 388 Doghman M Karpova T Rodrigues G A Arhatte M De Moura J Cavalli L R Virolle V Barbry P Zambetti G P Figueiredo B C Heckert L L and Lalli E 2007 Increase
339. mon travail de these en tant que rapporteurs et fait le d placement jusqu a Toulouse Merci galement a R my Poupot Professeur de biochimie a l Universit Paul Sabatier d avoir accept de pr sider le jury de cette th se MERCI mais m me en majuscules le mot ne suffit probablement pas Marina Weber pour tout Encadrer un pseudo g nie des alpages n a pas du tre facile tous les jours merci de ne t tre pas trop veng e dans les Pyr n es espagnoles m me si J estime que nous sommes quittes vu certains des endroits ou tu m as fait passer Plus s rieusement bravo pour ton encadrement qui a t impeccable quelles que soient les circonstances En tout cas c est quand tu veux pour une petite rando dans les Appalaches ou un m choui sur les rives du Potomac J adresse un norme merci l ensemble du laboratoire pas seulement pour le soutien professionnel ou personnel dont j ai pu b n ficier mais aussi pour l ambiance unique les nombreux sujets de d bats autour des grandes tabl es de la caf t et les 5 6 kilos que j ai pris pendant ces ann es la gourmandise est contagieuse et j ai t bien entour Bon pour Eve je n ai m me pas vraiment besoin de le faire tu sais toute l admiration et l amiti que J ai pour toi m me si une certaine question d optique et de Pyr n es reste encore source de discorde mais j aurai le dernier mot Merci pour ton amiti combie
340. mples were determined using NSA Livak and Schmitigen 2001 with desmoglein 3 gene Ospi expression for normalization Control wells without template cDNA emitted no significant fluorescence Specificily was assessed by sequencing the qRT PCR amplicons Skin barrier function assays TEWL was measured using an EP Evaporimeter Servo Med AB Stockholm Sweden The dye exclusion assay was performed as previously desenbed Hardman et al 1998 Marshall et al 2000 The mice were then photographed using a Sony DSC W 50 camera For quantification of stratum corneum removal by tape stripping a quarter of a D Squame disk 22 mm diameter Monaderm was placed on the flank of neonates and siripped off and the process was repeated once on the same area Tape disc fragments were incubated with shaking in 250 pl extraction buffer 40 mM Tris HCI 10 mM EDTA 8 M urea 50 mM dithiothreitol pH 7 4 for hour at 70 C then centnfuged for 5 minutes at 12 000 tp and the protem content was measured in the supematant using a colorimetric protein assay Bio Rad Transmission electron microscopy Specimens were fixed for at least 4 hours in 2 glutaraldehyde in Sorensen s buffer pH 7 4 washed with Sorensen s buffer cut into pieces of 1 mm postfixed for hour at room temperature in 1 osmium 250 mM saccharose in Sorensen s buffer pH 7 4 dehydrated through graded ethanol solutions transferred into propylene oxide and embedded in araldite res
341. myc and STAT interactor nuclear receptor subfamily 2 group C member 1 orthodenticle homeobox 1 PHD finger protein 2 pleckstrin homology domain containing family A phosphoinositide binding specific member 2 RAS guanyl releasing protein 1 calcium and DAG regulated regulator of calcineurin 1 DSCR1 regulatory factor X subunit 5 SH3 domain kinase binding protein 1 single minded homolog 1 Drosophila solute carrier family 39 zinc transporter member 6 solute carrier family 8 sodium calcium exchanger member 1 transmembrane protein 45A Zinc finger protein 239 homologous to mouse MOK 2 encoding transcription factors are written in bold no of UniGene ESTs 150 162 14 20 452 1352 134 556 189 95 262 321 997 186 265 290 115 17 129 160 482 190 424 105 205 320 168 306 421 475 434 551 358 112 176 303 45 178 257 134 595 485 397 18 392 179 257 79 Technique s of identification ORESTES microarrays Microarrays Microarrays Microarrays Literature ORESTES microarrays Genomatix pt ORESTES Microarrays Microarrays Microarrays ORESTES ORESTES ORESTES Microarrays Microarrays ORESTES Genomatix Microarrays Microarrays Microarrays ORESTES microarrays ORESTES microarrays Microarrays Genomatix Microarrays Genomatix ORESTES Microarrays ORESTES Genomatix pt Microarrays Microarrays ORESTES Genomatix ORESTES Microarrays ORESTES Genomatix O
342. n D Toulza et al No of UniGene ESTs O O N NOD W W woo ek A A A A A Bwwwwwwwwwny nr nrnynnryrnrynrynrrrrereomaou4u44z2reoem zmseenteOrItOItOZ7 TAZ w NO N O OO ww ww OO LOU U ON SP ww 0 0 O0 DOM DO NO A WYN http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Full name Flj43861 Hypothetical gene supported by AK094537 Hypothetical LOC285435 Hypothetical LOC387846 Hypothetical gene supported by AK092973 Image 52609 14 Hypothetical protein LOC338667 Psoriasis susceptibility candidate 2 Hypothetical protein dkfzp779b 1540 Chromosome 14 open reading frame 72 F1j37989 Filaggrin 2 ifapsoriasin WAP four disulfide core domain 5 Hypothetical LOC4021 10 Pleckstrin homology domain containing family N member Hypothetical protein LOC441 240 Hypothetical protein FLJ38159 Chromosome open reading frame 177 Hemicentin 2 Similar to AVLV 472 Orofacial cleft candidate Novel KRAB box containing C2H2 type zinc finger protein Adhesion molecule with Ig like domain 3 Hypothetical protein LOC441 257 Hypothetical protein LOC285484 Chromosome 20 open reading frame 91 Hypothetical protein LOC202460 F1j25664 Flj41623 Similar to F box only protein 2 Similar to Envoplakin Hypothetical protein LOC126248 Hypothetical LOC389142 Chromosome 20 open reading frame 95 FK506 binding protein 9 like Fibronectin type Ill domain containing 8 FLJ46311 protein Chromosome 3 open reading
343. n H and Elder J T 2007 Mouse models of psoriasis J Invest Dermatol 127 1292 1308 Gudjonsson J E Karason A Runarsdottir E H Antonsdottir A A Hauksson V B Jonsson H H Gulcher J Stefansson K and Valdimarsson H 2006 Distinct clinical differences between HLA Cw 0602 positive and negative psoriasis patients an analysis of 1019 HLA C and HLA B typed patients J Invest Dermatol 126 740 745 Guenther M G Levine S S Boyer L A Jaenisch R and Young R A 2007 A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells Cell 130 77 88 Guerrin M Simon M Montezin M Haftek M Vincent C and Serre G 1998 Expression cloning of human corneodesmosin proves its identity with the product of the S gene and allows improved characterization of its processing during keratinocyte differentiation J Biol Chem 273 22640 22647 Gunderson K L Steemers F J Lee G Mendoza L G and Chee M S 2005 A genome wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology Nat Genet 37 549 554 Guttormsen J Koster M I Stevens J R Roop D R Williams T and Winger Q A 2008 Disruption of epidermal specific gene expression and delayed skin development in AP 2 gamma mutant mice Dev Biol 317 187 195 271 Haas U Podda M Behne M Gurrieri S Alonso A Furstenberger G Pfeilschifter J Lambeau G Gelb M H and Kaszkin M 2005 Characterization a
344. n a specific cell death process that transforms keratinocytes into anucleated flattened comeocytes considerable modifications of the desmosomes occur accounting for their designation as corncodesmosomes Serre et al 1991 Comeodesmosin CDSN is a protein specific to desmosomes that will undergo transformation into corneodesmosomes which in humans comprises desmosomes of the epidermis the three layers of the inner root sheath IRS of the hair follicles and the hard palate epithelium Indeed the protein is not expressed in noncomified squamous epithelia Serre et al 1991 After its secretion by granular keratinocytes via the lamellar granules CDSN is incorporated into the desmoglea of the desmosomes shortly before laver then both the epidermis and the hair follicles degenerated In adults Cds deletion resulted in similar histological abnormalities and in a lethal barrier defect We demonstrate that Cdsn is not essential for skin barrier formation in utero but is vital throughout life to preserve this barrier by maintaining desmosome integrity The strong adhesive function that the protein confers on corneodesmosomes also seems necessary for maintaining the architecture of the hair follicle Supplementary material available online at http jes biologists org cai content full 122 13 2699 DC 1 Key words Desmosome Epidermis Hypotrichosis simplex of the scalp Knockout mice Psoriasis their transformation into corneodesmosom
345. n pr cieuse au moins autant que le vin de ton mari Et je maintiens le labo sans toi c est plus tout fait pareil mais bon je m en fiche j ai r cup r ton bureau Merci galement a Emilie la seule personne a tre parvenue a me faire venir a Ikea un samedi a huit heures du matin et a avoir vraiment ador mes sabl s a la lavande Lequel des deux est le plus grand exploit Au passage pardon a tous pour les nombreux plats tonnants tranges suspects immangeables que j ai port intervalles trop r guliers Merci pour ton entrain et navr de t avoir remerci e en tentant de te faire passer pour une personne violente et sanguinaire la rigueur mon temps sur Toulouse tant Comt j ai quelques raisons de te craindre d sormais Profite Cyril c est mon dernier private calembour Merci aussi Mitou ta bonne humeur en toutes circonstances et tes doigts de f e en toutes exp riences en ont impressionn es plus d un et je ne fais pas exception Comme pour Eve le labo sans toi a fait un peu bizarre Merci vraiment pour tout Hors quipe une pens e sp ciale Mireille et Cyril pour les trop rares conversations non professionnelles que nous avons pu avoir qu il s agisse de litt rature trang r e de philosophie ou de calembours Evidemment je remercie toute ma famille pour m avoir soutenu Merci a Lucie qui est m me parvenue un temps a se souvenir de mon sujet Me
346. n genome May 2004 assembly using BLAT 18 and inserted as a cus tom track into the UCSC Genome Browser Analysis of gene expression For quantitative real time RT PCR experiments all primer pairs available upon request were chosen to generate ampli cons of 100 250 bp encompassing different exons thus avoiding the amplification of potential contaminating genomic DNA The primer sequences were designed using Primer3 software 70 and BLAST analysis 69 ensured the absence of similarity to any other human sequence Reverse transcription was performed by standard procedures start ing from 100 ng of total RNA of each cell batch and using a mixture of oligo dT and random hexamers Amplification assays were performed with the ABI prism 7000 Sequence Detection System and analyzed with the corresponding soft ware Applied Biosystems Foster City CA USA using the qPCR ROX amp GO Green mix MP Biomedicals Irvine CA USA Fluorescence was quantified as Ct threshold cycle values Samples were analyzed in triplicate with differences between the three Ct values lower than 0 3 Expression levels were calibrated using galectin 7 LGALS7 or beta 2 micro glubulin B2M mRNA as internal controls The differences between the mean Ct values of the various amplicons and the reference genes are denoted ACt The difference between ACt obtained with the indicated cell samples are labeled AACt 244Ct gave the relative level of gene expression bet
347. n identit puisque seuls 4 fluorochromes sont employ s pour 16 dinucl otides une seule lecture ne peut identifier le dinucl otide en question et d autre part de distinguer les erreurs de lectures reconnues dans une seule des deux phases des polymorphismes sur un nucl otide d tect s dans les deux phases 1 Prime and Ligate Fai POR PRIMEA ROUND 1 TD ur verse aps immer ni ar Pt Adapter TA Template Sequence 2 Image Excite Fluorescence 3 Cap Unextended Strands Fe PO b 3 4 Cleave off Fluor Cleavage Agent a s a A HOw E ES TA 5 Repeat steps 1 4 to Extend Sequence Ligation cycle 1 2 3 a 5 6 T m cycles 6 Primer Reset Universal seg primer m f rene 1 Met off extended Sequence 2 Primernesat 7 Repeat steps 1 5 with new primer PRIMER ROUND 2 8 Repeat Reset with n 2 n 3 n 4 primers Read Position 0 1 2 3 4 5 8 7 8 9 1n ELEDE 1617 14 18 20 21 22 23 24 26 26 77 2829 20 31 32 33 24 35 1 RAA seg primer im y alai seg primer n 1 ST 4 Universa sea primer In s80 primer in 2 a Uni pr ener seg Bilis in 3 i fl 5 Universal seq primer ne primer ind aay Primer Round a ndicaias positions of interogation F base Sn Unversal seg Sakalir rs in A a t 7 a JA CA ce TC AA TA CC 3 T GT GC AG IT AT GG EE ENS 1 4 i i j e SERS TETTE i ie i Ligation Cycle BRR
348. n inventaire aussi complet que possible de l tat du transcriptome d un type cellulaire 232 IV ANNEXES 233 234 Annexe 1 Stratification pidermique E8s COR ES LOL E14 5 E15 5 E16 5 E18 5 En Surface ectoderm O Spinous layer Basal layer Granular layer ae Periderm esas Cornified cell envelope C Intermediate layer Repr sentation sch matique des tapes de la Stratification pidermique au cours du d veloppement murin Koster and Roop 2007 225 236 Annexe 2 le s quencage nouvelle g n ration La technologie 454 commercialis e par 454 Life Sciences Roche Applied Science couple une m thode de PCR en mulsion et un pyros quencage Dans un premier temps des fragments de 300 a 800 paires de bases sont g n r s a partir d ADN g nomique ou autre puis des adaptateurs diff rents sont ajout s chaque extr mit des fragments Un des adaptateurs tant biotinyl les fragments sont immobilis s en dilution limite sur des billes portant de la streptavidine de sorte ne pas avoir plus d un fragment par bille Puis les billes sont plac es dans une mulsion o chaque bille est isol e dans une gouttelette qui va tenir lieu de micror acteur pour la PCR Cette tape d amplification in vitro tr s performante permet de g n rer jusqu 107 fragments par bille partir d un seul fragment d ADN initial Pour l tape de pyros quencage
349. n reported in four families from Israel Denmark and Mexico Lai Cheong etal 2007 These mutations lead to the production of a truncated form of CDSN that has been detected as deposits beneath the epidermis basement membrane and deeper in the dermis at the periphery of the hair follicles Levy Nissenbaum et al 2003 Although the pathophysiological mechanism of this disorder is not understood CDSN obviously has an important role in hair physiology A striking feature of CDSN is its very high serine and glycine content 27 5 and 16 respectively particularly at the N terminus of the protein residues 60 171 It has been suggested that similar serine and glycine rich domains described at both termini of keratins form structural motifs the so called glycine loops that mediate intermolecular adhesion by acting like Velero Steinert et al 1991 Furthermore it has been demonstrated in vivo and in vitro that CDSN displays homophilic adhesive properties Jonea et al 2002 Caubet et al 2004 Moreover recombinant CDSN forms highly stable homo oligomers that dissociate only partially in 8 M urea possibly reflecting cis and or trans interactions in vivo The N terminal glycine loop domain was shown to be necessary and sufficient and thus responsible tor both the oligomerization of CDSN and its homophilic adhesive properties in vitro Caubet et al 2004 In vivo CDSN could thus mediate cell cell adhesion by reinforcing the re
350. nal variations J Lipid Res 24 120 130 Laneve P Gioia U Ragno R Altieri F Di Franco C Santini T Arceci M Bozzoni I and Caffarelli E 2008 The tumor marker human placental protein 11 is an endoribonuclease J Biol Chem 283 34712 34719 Langbein L Heid H W Moll I and Franke W W 1993 Molecular characterization of the body site specific human epidermal cytokeratin 9 cDNA cloning amino acid sequence and tissue specificity of gene expression Differentiation 55 57 71 LaPres J J and Hudson L G 1996 Identification of a functional determinant of differentiation dependent expression in the involucrin gene J Biol Chem 271 23154 23160 Larderet G Fortunel N O Vaigot P Cegalerba M Maltere P Zobiri O Gidrol X Waksman G and Martin M T 2006 Human side population keratinocytes exhibit long term proliferative potential and a specific gene expression profile and can form a pluristratified epidermis Stem Cells 24 965 974 Le Bechec A Zindy P Sierocinski T Petritis D Bihouee A Le Meur N Leger J and Theret N 2008 M IA a modular open source application for microarray workflow and integrative datamining In Silico Biol 8 63 69 Le Brigand K and Barbry P 2007 Mediante a web based microarray data manager Bioinformatics 23 1304 1306 Le Brigand K Russell R Moreilhon C Rouillard J M Jost B Amiot F Magnone V Bole Feysot C Rostagno P Vi
351. nal de la Recherche Scientifique the Tou louse III Paul Sabatier University the Soci t Fran aise de Dermatologie and from the Soci t de Recherche Dermatologique Sequencing was funded by the Consortium National de Recherche en G nomique References Watt FM Celso CL Silva Vargas V Epidermal stem cells an update Curr Opin Genet Dev 2006 16 518 524 2 Park GT Lim SE Jang SI Morasso MI Suprabasin a novel epider mal differentiation marker and potential cornified envelope precursor Biol Chem 2002 277 45195 45202 3 Oomizu S Sahuc F Asahina K Inamatsu M Matsuzaki T Sasaki M Obara M Yoshizato K Kdap a novel gene associated with the stratification of the epithelium Gene 2000 256 1 9 27 4 Makino T Takaishi M Morohashi M Huh NH Hornerin a novel profilaggrin like protein and differentiation specific marker isolated from mouse skin Biol Chem 2001 276 47445 47452 5 Lee WH Jang S Lee JS Lee Y Seo EY You KH Lee SC Nam KI Kim JM Kee SH et al Molecular cloning and expression of human keratinocyte proline rich protein hKPRP an epidermal marker isolated from calcium induced differentiating keratinocytes Invest Dermatol 2005 125 995 1000 6 Kalinin AE Kajava AV Steinert PM Epithelial barrier function assembly and structural features of the cornified cell envelope Bioessays 2002 24 789 800 7 Elias PM Cullander C Mauro T Rassner U Komuves L Brown BE Menon GK The secre
352. nce databases Among the 3 375 genes from our set 330 10 corresponded to UniGene clusters containing less than 100 mRNA EST sequences and were thus good candidates for epidermis late expressed genes These were subdivided into five classes The first one contains all the genes 50 already known to be specifically expressed in the suprabasal layers Table 3 This confirms that late expressed genes are poorly represented in EST databases The second class consisted of 31 genes with known or inferred functions that were previously known as mainly expressed in a specific tissue different from epidermis Table 4 We sug gest that some of them might play a specific role in epidermal differentiation This could be the case for SERPINA12 DUOX2 and to a lesser extent CASZ1 which are represented by a large ORESTES number We also suspect that CLDN23 might play an important role in GKs since claudin based tight junctions in the granular layer contribute to barrier function of the epidermis 20 Accordingly claudin 1 defi cient mice display a lethal defect in skin permeability 21 The third class gathered 32 uncharacterized paralogues of known genes Table 5 The fourth class was composed of 105 genes that remain hypothetical and about which nothing is known regarding their normal function or disease relevance Table 6 The fifth class contained genes that are expressed most probably at low levels in numerous tissues but whose epidermal
353. nctata Nat Genet 1999 22 286 90 Wang JW Howson J Haller E et al Identification of a novel lipopolysaccharide inducible gene with key features of both A kinase anchor proteins and chsl beige proteins J Jmmunol 2001 166 4586 95 181 25 26 27 28 Havrylov Ichioka F Powell K et al Adaptor protein Ruk CINSS is associated with a subset of COPI coated membranes of the Golgi complex Traffic 2008 9 798 812 Sharma M Naslavsky N Caplan S A role for EHD4 in the regulation of early endosomal transport Traffic 2008 9 995 1018 Steiner P Sarria JC Glauser L et al Modulation of receptor cycling by neuron enriched endosomal protein of 21 kD J Cell Biol 2002 157 1197 209 Dixit R Ross JL Goldman YE et al Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau Science 2008 319 1086 9 182 Table 1 Genes upregulated in the granular layer GK BK expression ratios determined by qRT PCR Gene symbol ABHD11 ANKRD1 APOF ARL11 ATF6 ATP6VOA1 BBOX1 BHLHB2 CCIN CLCA4 CRELD1 CTNNBIP1 D4S234E EHD4 FBX038 FGFR1OP2 FOXC1 FOXL1 GATA4 GMIP HOPX HSPC159 HYAL2 INSM1 ITPKC KLF14 KRT23 LOC57228 LRBA MAP3K71P1 MAPT MAX MBD1 MVD NFE2 NMI NR2C1 OTX1 PHF2 PLEKHA2 RASGRP1 RCAN1 RFX5 SH3KBP1 SIM1 SLC39A6 SLC8A1 TMEM45A ZNF239 based on preliminary microarrays analysis FDR gt 0 05 pt putative target gene Names of genes Full name alias previous name abhydrol
354. nctions exon exon dont 379 et 4096 jamais d crites respectivement mettant notamment en valeur la pr valence du saut d exon sur les autres formes d pissage alternatifs Une autre tude ciblant exclusivement les microARN exprim s dans des cellules souches embryonnaires humaines non diff renci es ou diff renci es en corps embryo des amas cellulaire constitu des trois feuillets embryonnaires a identifi 334 microARN connus et 104 jamais d crits dont 171 connus et 23 nouveaux diff rentiellement exprim s entre les deux stades de diff renciation Morin et al 2008b Plusieurs autres tudes employant le RNA Seq ont t men es chez Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Arabidopsis thaliana ainsi que la souris et l homme pour revue voir Wang et al 2009 Il est important de noter que les applications du s quencage nouvelle g n ration ne se limitent pas l tude du transcriptome mais concernent galement la recherche de sites fix s par des facteurs de transcription le ChIP Seq ImmunoPr cipitation de Chromatine suivie du s quen age haut d bit des fragments de chromatine rempla ant alors le ChIP on chip les puces ADN tant moins sensibles et plus contraignantes ou l tude de l tat de la chromatine Le ChIP Seq a ainsi r cemment permis de caract riser l chelle du g nome les sites de fixation de 13 facteurs de transcription tels que Nanog Oct4 STAT3 Smad1 Sox2
355. nd differentiation dependent regulation of secreted phospholipases A in human keratinocytes and in healthy and psoriatic human skin J Invest Dermatol 124 204 211 Hachem J P Man M Q Crumrine D Uchida Y Brown B E Rogiers V Roseeuw D Feingold K R and Elias P M 2005 Sustained serine proteases activity by prolonged increase in pH leads to degradation of lipid processing enzymes and profound alterations of barrier function and stratum corneum integrity J Invest Dermatol 125 510 520 Hachem J P Wagberg F Schmuth M Crumrine D Lissens W Jayakumar A Houben E Mauro T M Leonardsson G Brattsand M Egelrud T Roseeuw D Clayman G L Feingold K R Williams M L and Elias P M 2006 Serine protease activity and residual LEKTI expression determine phenotype in Netherton syndrome J Invest Dermatol 126 1609 1621 Hadj Rabia S Baala L Vabres P Hamel Teillac D Jacquemin E Fabre M Lyonnet S De Prost Y Munnich A Hadchouel M and Smahi A 2004 Claudin 1 gene mutations in neonatal sclerosing cholangitis associated with ichthyosis a tight junction disease Gastroenterology 127 1386 1390 Haider A S Peters S B Kaporis H Cardinale I Fei J Ott J Blumenberg M Bowcock A M Krueger J G and Carucci J A 2006 Genomic analysis defines a cancer specific gene expression signature for human squamous cell carcinoma and distinguishes malignant hyperprolifera
356. nelle K ratinocyte granuleux K ratinocyte pineux Figure 28 Coupe de peau humaine color e l h matoxyline osine et repr sentation sch matique de l ultrastructure de piderme d apr s un sch ma original de Christian Vincent 58 UONCIOUBOYIG renouvellement de l piderme se d roule sur une p riode de 26 a 28 jours correspondant pour moiti la dur e de l ex cution du programme de diff renciation couches vivantes et pour moiti a la progression dans les couches mortes jusqu a la desquamation Diff rents stades dans l volution du k ratinocyte prolif ration tapes pr coces et tardives de la diff renciation cornification sont morphologiquement distinguables en microscopie optique et lectronique et permettent de d finir les diff rentes couches de l piderme figure 28 2 2 1 1 La couche basale stratum basale Seule assise de l piderme contenant des k ratinocytes prolif ratifs la couche basale de l piderme est constitu e de cellules cubiques de petite taille dont le noyau tr s basophile occupe une large place Elles sont ancr es la lame basale par les h midesmosomes et reli es via les desmosomes Les k ratinocytes basaux ne forment pas en r alit une population homog ne au niveau fonctionnel puisqu il est possible de distinguer des cellules souches au fort potentiel prolif ratif mais se divisant tr s rarement des cellules prog nitrices majoritai
357. nes et l involucrine d autres prot ines de structure sont int gr es l enveloppe corn e notamment la loricrine les SPRR Small PRoline Rich proteins et les LCE Late Cornified Envelope Le g ne LOR codant pour la loricrine est lui aussi situ au sein de EDC La loricrine est sp cifiquement d tect e dans la couche granuleuse de l piderme et la p riph rie des corn ocytes Mehrel et al 1990 La comparaison de sa s quence et de la composition des enveloppes corn es sugg re qu elle constitue au moins 70 de leur masse prot ique Hohl et al 1991 Steinert and Marekov 1997 La loricrine est exprim e tardivement dans les k ratinocytes granuleux au sein de L granules plus petits et de forme plus r guli re que les F granules de filaggrine Steven et al 1990 Tr s riche en glycine 47 chez l homme et plus de 55 chez la souris 87 a L la prot ine bien qu insoluble est a a ci os suppos e extr mement flexible Se 9 Be es ca gt Be A Selon le mod le de Peter Steinert 7 eh f Fa Gee ec Sa p Steinert et al 1991 les acides Ses Le amin s aromatiques ou aliphatiques dispers s parmi des r gions riches en glycine et serine oc a ee ei pourraient interagir entre eux et 9 0 268 Be permettre la formation de F Les boucles glycine figure 45 tm d Ts l ensemble tant ventuellement Figure 45 Mod le des boucles glycine pour la loricrine
358. ng after the first second and third trypsin incubation respectively Fragments shown in d are mainly composed of GKs attached to the cornified layer and constitute the T4 fraction Inset higher magnification showing the characteristic cytological aspect of a GK with cytoplasmic keratohyalin granules The ORESTES dataset was aligned with the human genome using BLAT 18 The BLAT results were used to write a cus tom track that allows the visualization of the position of a par ticular ORESTE relative to other annotations such as RefSeq genes vertebrate orthologues single nucleotide polymor phisms microarray expression data and so on and is freely available online 19 A screen copy of a UCSC Genome hetp genomebiology com 2007 8 6 R 107 Browser window showing the ORESTES obtained for the C1orf81 gene is presented as an example Additional data file 1 Indeed this gene was characterized and a cDNA DQ983818 was cloned for the first time in this study see below Our dataset includes the 16 591 ESTs matching known or predicted transcribed regions These sequences have also been deposited in public databases Gen Bank EL593304 EL595248 GenBank CU442764 CU457374 Poorly represented genes in expressed sequence databases As few sequencing projects from human epidermis have been performed so far relative to other organs genes expressed during the late steps of epidermis differentiation are poorly represented in seque
359. ng differentiation in normal human epidermis a quantitative ultrastructural study J Cell Sci 92 Pt 4 667 677 Smale S T and Kadonaga J T 2003 The RNA polymerase II core promoter Annu Rev Biochem 72 449 479 Smith F J Irvine A D Terron Kwiatkowski A Sandilands A Campbell L E Zhao Y Liao H Evans A T Goudie D R Lewis Jones S Arseculeratne G Munro C S Sergeant A O Regan G Bale S J Compton J G DiGiovanna J J Presland R B Fleckman P and McLean W H 2006 Loss of function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris Nat Genet 38 337 342 Smith K M Lawn R M and Wilcox J N 1990 Cellular localization of apolipoprotein D and lecithin cholesterol acyltransferase mRNA in rhesus monkey tissues by in situ hybridization J Lipid Res 31 995 1004 Smits P Poumay Y Karperien M Tylzanowski P Wauters J Huylebroeck D Ponec M and Merregaert J 2000 Differentiation dependent alternative splicing and expression of the extracellular matrix protein gene in human keratinocytes J Invest Dermatol 114 718 724 Southern E M 1974 An improved method for transferring nucleotides from electrophoresis strips to thin layers of 1on exchange cellulose Anal Biochem 62 317 318 Spazierer D Fuchs P Reipert S Fischer I Schmuth M Lassmann H and Wiche G 2006 Epiplakin is dispensable for skin barrier function and for integrity of keratin net
360. nomas Nat Genet 37 182 186 Rothermel B Vega R B Yang J Wu H Bassel Duby R and Williams R S 2000 A protein encoded within the Down syndrome critical region is enriched in striated muscles and inhibits calcineurin signaling J Biol Chem 275 8719 8725 Saeki N Kuwahara Y Sasaki H Satoh H and Shiroishi T 2000 Gasdermin Gsdm localizing to mouse Chromosome 11 is predominantly expressed in upper gastrointestinal tract but significantly suppressed in human gastric cancer cells Mamm Genome 11 718 724 Saeki N Usui T Aoyagi K Kim D H Sato M Mabuchi T Yanagihara K Ogawa K Sakamoto H Yoshida T and Sasaki H 2009 Distinctive expression and function of four GSDM family genes GSDMA D in normal and malignant upper gastrointestinal epithelium Genes Chromosomes Cancer 48 261 271 Sakabe N J de Souza J E Galante P A de Oliveira P S Passetti F Brentani H Osorio E C Zaiats A C Leerkes M R Kitajima J P Brentani R R Strausberg R L Simpson A J and de Souza S J 2003 ORESTES are enriched in rare exon usage variants affecting the encoded proteins C R Biol 326 979 985 Sanderson R D Hinkes M T and Bernfield M 1992 Syndecan 1 a cell surface proteoglycan changes in size and abundance when keratinocytes stratify J Invest Dermatol 99 390 396 Sato J Denda M Nakanishi J Nomura J and Koyama J 1998 Cholesterol sulfate inhibits proteases t
361. ns cette couche La strat gie choisie a t de comparer uniquement deux des quatre fractions r cup r es au moyen du proc d d enrichissement d crit auparavant Toulza et al 2007 Les fractions cellulaires T1 correspondant aux cellules de la couche basale et T4 constitu e de la couche granuleuse et corn e ont t choisies pour tre compar es sur puces Ainsi la fraction T4 sert d chantillon test tandis que la fraction T1 du m me individu sert d chantillon de r f rence afin de discriminer les g nes pr sents dans toutes les couches de ceux surexprim s au cours de la diff renciation voire sp cifiques de la couche granuleuse Pour les besoins de l tude six chantillons ind pendants ont t utilis s soit six couples T1 T4 Le marquage en fluorescence des ADNc m me indirect apr s la r action de transcription inverse est susceptible d introduire des biais selon le fluorochrome employ cyanines Cy3 ou Cy5 il est donc n cessaire autant que possible d quilibrer les marquages c est dire d avoir un nombre quivalent de marquages Cy3 vs Cy5 et Cy5 vs Cy3 Le plan exp rimental choisi est le dye switch qui consiste inverser le sens du marquage pour chaque nouvel individu soit pour notre tude trois lames T1 Cy3 T4 Cy5 et trois T1 Cy5 T4 Cy3 Toutefois pour trois des six couples T1 T4 des lames swap ont t r alis es Le dye swap consiste r
362. ns in gasdermin 3 cause aberrant differentiation of the hair follicle and sebaceous gland J Invest Dermatol 124 615 621 Lyle S Christofidou Solomidou M Liu Y Elder D E Albelda S and Cotsarelis G 1998 The C8 144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells J Cell Sci 111 Pt 21 3179 3188 Lyons P A Koukoulaki M Hatton A Doggett K Woffendin H B Chaudhry A N and Smith K G 2007 Microarray analysis of human leucocyte subsets the advantages of positive selection and rapid purification BMC Genomics 8 64 Ma K Cheung S M Marshall A J and Duronio V 2008 PI 3 4 5 P3 and PI 3 4 P2 levels correlate with PKB akt phosphorylation at Thr308 and Ser473 respectively PI 3 4 P2 levels determine PKB activity Cell Signal 20 684 694 Maatta A DiColandrea T Groot K and Watt F M 2001 Gene targeting of envoplakin a cytoskeletal linker protein and precursor of the epidermal cornified envelope Mol Cell Biol 21 7047 7053 Madison K C Sando G N Howard E J True C A Gilbert D Swartzendruber D C and Wertz P W 1998 Lamellar granule biogenesis a role for ceramide glucosyltransferase lysosomal enzyme transport and the Golgi J Investig Dermatol Symp Proc 3 80 86 278 Maestrini E Monaco A P McGrath J A Ishida Yamamoto A Camisa C Hovnanian A Weeks D E Lathrop M Uitto J and Christiano A M 1996
363. ns le derme de souris nude porteuses de greffes d piderme humain normal induit l apparition de l sions de type psoriasiques Wrone Smith and Nickoloff 1996 Que l alt ration de la barri re au niveau des l sions soit l origine de la pathologie ou une cons quence de l inflammation les anomalies de la diff renciation jouent probablement un r le important dans le maintien de la maladie et sa chronicit comme en attestent la disparition de l inflammation et le r tablissement d une diff renciation normale lorsque les plaques psoriasiques sont recouvertes d une protection inerte Hwang et al 2001 Adjacent skin normal appearance Normal straturi Fa cantum ae Epiderrrais Ta Pandlary dermis Reticular dernmns Langerhars cell immature Cone DE a inflarmmatory CAC Tir CC Mature DRC Abnormal straturn OC LAMP or COB COMmeum 5 Aamacyioid DE Skin homingT cell i Aetna Epidermis Elongated nebe peer olor hyperplasia Organized bhamnphoid im ibrabe Figure 61 Comparaison entre peau normale et psoriasique Lowes et al 2007 Selon la classification propos e en 1985 on distingue le psoriasis de type I dit familial d apparition pr coce habituellement avant l ge de 40 ans et qui constitue 30 des cas et le psoriasis de type II sporadique et d apparition plus tardive Henseler and Christophers 1985 Le psoriasis de type I est une maladi
364. ns un premier temps apr s l ajout de l amorce universelle de longueur n le m lange d oligos fluorescents 8 mers est hybrid et celui dont les deux premi res bases XX sont compl mentaires du brin d ADN imm diatement la suite de l amorce universelle se trouve accroch sa suite par une ligase les bases 1 2 de la s quence sont donc interrog es Un scanner d tecte alors les niveaux de fluorescence pour chacun des quatre fluorochromes sur l ensemble du support Puis un clivage chimique lib re le fluorochrome ainsi que les bases 6 8 laissant un phosphate libre en 5 les tapes pr c dentes oligos ligation scan phosphatase clivage sont ensuite r p t es pendant 5 7 cycles permettant d interroger les bases 6 7 11 12 16 17 etc de la s quence d ADN Puis l ensemble est r initialis en d shybridant l amorce universelle de longueur n ainsi que les extensions et une nouvelle amorce universelle de longueur n 1 est hybrid e permettant alors d interroger les bases 1 5 6 10 11 15 16 etc L op ration est ensuite r p t e avec une amorce de longueur n 2 puis n 3 et n 4 la succession de cinq cycles complets d hybridation et d extension par ligation permettant de g n rer un lot de donn es qui se chevauchent et couvrent environ 35 242 bases continues Ainsi chaque base de la s quence est interrog e par deux oligonucl otides diff rents ce qui permet d une part de connaitre so
365. nsemble des ADNc d une population cellulaire Les m thodes classiques n autorisent pas les comparaisons de niveau d expression car apr s quelques dizaines de cycles de PCR la quantit d ADN amplifi n est plus proportionnelle a la quantit de d part En effet un fl chissement de la cin tique d amplification appara t lorsque l un des r actifs amorces dNTP devient limitant ou que la polym rase n est plus suffisamment active Ainsi le d p t sur gel d agarose de produits de PCR obtenus partir de deux chantillons peut faire appara tre des bandes d intensit s tr s voisines malgr un niveau d expression du gene d int r t tr s diff rent Sondes Taqman sondes molecular beacons sur j PTA Figure 16 Chimies employ es pour la quantification en temps r el par PCR 36 Au contraire la PCR quantitative autorise une mesure de la quantit d ADN amplifi chaque cycle et non la fin de l exp rience Le principe de base reste toujours inchang amorces sp cifiques de la cible Taq polym rase dNTP etc mais le mat riel et la m thode de d tection connaissent des variantes le but tant de quantifier une fluorescence dont l intensit est directement corr l e amplification de la cible Ainsi la m thode de PCR quantitative en Sybr Green marqueur consiste suivre l apparition en temps r el d ADN double brin gr ce un marqueur n interf r
366. nt Leur fonction dans la barri re pidermique a t mise en vidence dans des souris inactiv es pour la claudine 1 celles ci pr sentant un trouble important de la barri re pidermique et mourrant en quelques heures apr s la naissance Furuse et al 2002 Chez ces souris la couche corn e appara t paissie et compacte en microscopie optique mais de fa on surprenante poss de une apparence normale en microscopie lectronique Par contre les jonctions serr es ne sont pas fonctionnelles et ne bloquent pas la diffusion paracellulaire d un marqueur figure 39 De m me des souris surexprimant la claudine 6 murine sous d pendance du promoteur humain de l involucrine JVL Cldn6 ont une d sorganisation des jonctions serr es avec perte de la fonction barri re Turksen and Troy 2002 Chez l homme des mutations du g ne codant la claudine 1 ont t identifi es chez des patients souffrant du syndrome NISCH Neonatal Ichthyosis Sclerosing CHolangitis syndrome galement associ a une alop cie OMIM 607626 Hadj Rabia et al 2004 touchant le foie l piderme et ses annexes sites majeurs d expression de la claudine 1 L importance des autres prot ines des jonctions serr es pour la fonction barri re reste encore d terminer l absence de changement dans l organisation k ratinocytaire ou dans la structure des jonctions serr es dans l piderme de souris d ficientes en claudine 1 sugg rant notamment une possible
367. nte la normalisation proprement parler d pend fortement du design des puces les diff rentes strat gies n tant pas applicables tous les types de puce Sur la plupart des puces le design autorise l emploi d talons internes et ou externes Les talons internes sont des g nes de r f rence dont l expression est sens e ne pas varier d une condition une autre L emploi de cette m thode se heurte deux cueils la difficult de trouver a priori de bons g nes de m nage et la n cessit d en trouver un nombre suffisant afin d viter les art facts de normalisation En effet les ratios sur puces tant g n ralement assez faibles par rapport d autres m thodes quantitatives la moindre variation d expression des g nes de r f rence fausse l ensemble de la normalisation d o la n cessit d identifier au minimum une dizaine de g nes d expression stable Les talons externes sont des ARN exog nes rajout s en quantit pr cise dans chaque chantillon et servant les calibrer entre eux linconv nient majeur de cette m thode tant qu elle est tributaire des impr cisions de dosage de ces ARN loin d tre n gligeables Courbe de R gression lin aire r gression locale iE i 2 O _ 6 7 8 A Figure 11 Normalisation des donn es par la m thode Lowess A Exemple de donn es de puces avec un fort biais des log ratios M selon l intensit
368. ntent une tr s forte activit des s rines prot ases et une d sorganisation massive des lamellae lipidiques qui serait directement li e a la d gradation par ces prot ases d r gul es de la G glucoc r brosidase une enzyme maturant les lipides inter corn ocytaires voir paragraphe 2 2 2 2 1 1 De facon int ressante en plus de l expression de LEKTI un autre inhibiteur de prot ase de la m me famille produit du g ne SPINKg Brattsand et al 2009 a r cemment t identifi dans l piderme palmoplantaire et pourrait expliquer en partie les diff rences observ es au niveau de ces territoires o la couche corn e est plus paisse et les corn ocytes persistent plus longtemps figure 36 Palmo plantaire Non palmo plantaire S lt u 3 j PP a gt 7 Hea LU e e Ao M e gt gt LEKTI SPINK9 KLK5 Figure 36 Immunod tection de LEKTI SPINK5 SPINK9g et KLK5 sur des coupes d piderme palmo plantaire et non palmo plantaire Brattsand et al 2009 2 2 2 2 Fonction barri re de l piderme La couche granuleuse participe largement la formation de la barri re pidermique en tant que derni re couche ayant une activit transcriptionnelle et traductionnelle responsable de la production de la quasi totalit des acteurs de la cornification prot ines structurales comme enzymes mais aussi de la desquamation La couche corn e bien que compos e de cellules mortes a
369. nterestingly these keratinocytes strongly expressed the hyperproliferative keratin K6 Fig 7C E right panel They also highly expressed CDSN confirming that they originated from nude epidermis data not shown Hence Cdsn deficiency resulted in chronic ulceration of the grafted skin To study potential barrier detects at the level of the graft TEWL measurements were performed Values measured from 4 to 9 weeks post gratting ranged from 1 5 to 5 g m per hour for the WT grafts versus 11 5 to 22 5 g m per hour for the KO grafts suggesting a strong permeability detect Histological and immunohistological data suggested that the KO graft first behaved like a healing epidermis However whereas wound healing leads to barrier restoration and a return of keratinocytes to a normal differentiation program the KO graft was unable to produce an efficient barrier However the epidermis of nude mice at the border of the scab showed acanthosis and pertectly mimicked a healing epidermis CDSN is also required in adult mice for epidermis integrity and barrier function To investigate the consequences of CDSN loss in adult mice we developed an additional model using a A 4 promoter driven CreER recombinase the activity of which is efficiently induced by 4 hydroxy tamoxifen OHT but not natural estrogen receptor ligands Li et al 2000 Mice homozygous for the floxed Cdsn allele and transgenic for K 4CreER were generated following the same br
370. ntriguing are genes in sequenced genomes that remain hypothetical and or poorly represented in expressed sequence databases and whose functions in health and dis ease remain unknown Some of these are most probably implicated in organ specific functions Their characterization is essential to complete the annotation of sequenced genomes and is expected to contribute to advances in physiology and pathology In order to achieve such goals transcriptome stud ies on tissues rather than cultured cells and eventually on a single cell type at a precise differentiation step are more likely to provide new information The epidermis is a highly specialized tissue mainly dedicated to the establishment of a barrier that restricts both water loss from the body and ingress of pathogens The barrier function of the epidermis is known to involve the expression of numer ous tissue specific genes most of which are specifically expressed in the late steps of keratinocyte differentiation In order to establish and constantly maintain this barrier kerat inocytes undergo a complex highly organized and tightly controlled differentiation program leading to cornification and finally to desquamation During this process cells migrate from the basal proliferative layer to the surface where they form the cornified layer stratum corneum According to the current model of skin epithelial mainte nance basal keratinocytes encompass a heterogeneous cell population
371. null mutation on epidermal differentiation we examined the expression of differentiation markers and desmosomal proteins by western blot quantitative real time PCR and immunohistochemistry Fig 6 No significant differences in the amount of early keratin K10 involucrin desmoglein 1 and late loricrin filaggrin differentiation markers were observed in skin from WT HET or KO neonates by western blot analysis Fig 6A Expression level analysis by qRT PCR of Dse Dsg a and Dsg1b coding for desmosomal proteins present in the suprabasal layers of epidermis did not reveal any differences between the dorsal skin of WT and KO neonates Fig 6B Immunohistochemical analyses Fig 6C were consistent with the western blot and qRT PCR data Again no differences in the distribution or the expression level of differentiation markers were observed between WT and KO neonate dorsal skin As expected we observed a dramatic reduction in the expression level of all the differentiation markers in the ventral area of KO animals data not shown which is consistent with the sudden loss of the most suprabasal keratinocytes once the stratum corneum had been shed see Fig 4A In conclusion the absence of CDSN does not affect the expression of differentiation markers and Corneodesmosomal defects in Cdsn mice 2703 Fig 5 Ultrastructural abnormalities in KO neonate epidermis Dorsal skin of WT and KO mice was processed for transmission EM A B At
372. of a major keratinocyte cell envelope protein loricrin Cell 61 1103 1112 Mehul B Asselineau D Bernard D Leclaire J Regnier M Schmidt R and Bernerd F 2004 Gene expression profiles of three different models of reconstructed human epidermis and classical cultures of keratinocytes using cDNA arrays Arch Dermatol Res 296 145 156 Menon G K Elias P M Lee S H and Feingold K R 1992 Localization of calcium in murine epidermis following disruption and repair of the permeability barrier Cell Tissue Res 270 503 512 Merritt A J Berika M Y Zhai W Kirk S E Ji B Hardman M J and Garrod D R 2002 Suprabasal desmoglein 3 expression in the epidermis of transgenic mice results in hyperproliferation and abnormal differentiation Mol Cell Biol 22 5846 5858 Mizutani Y Kihara A Chiba H Tojo H and Igarashi Y 2008 2 Hydroxy ceramide synthesis by ceramide synthase family enzymatic basis for the preference of FA chain length J Lipid Res 49 2356 2364 Mizutani Y Kihara A and Igarashi Y 2006 LASS3 longevity assurance homologue 3 is a mainly testis specific dihydro ceramide synthase with relatively broad substrate specificity Biochem J 398 531 538 Mockler T C Chan S Sundaresan A Chen H Jacobsen S E and Ecker J R 2005 Applications of DNA tiling arrays for whole genome analysis Genomics 85 1 15 Moran J L Qiu H Turbe Doan A Yun Y Boeglin W E Brash A R
373. of comeodesmosin praieolysis during terminal differentiation of human epidennis and its relationship to desquamation Biol Chem 276 20792 20299 Steinert A Ma Mack J Wa Korge B FP Gan 5 Haynes R and Steven A C 1991 Glycine loops in proteins their occurrence m certain intermediate filament chains lonerins and smele stranded RNA binding proteins fat Biel Macromol 13 130 139 Vassar R Rosenberg M Ross Tyner A and Fuchs E 1959 Tissuc specifie and differentiaton specific expression ofa human K14 keratin gene in transgenic mice Prec Natl Acad Scr USA 86 1563 1567 Veal C D Capon FE Allen M HL Heath E Ka Evans J Ca Jones A Patel S Burden D Tillman D Barker J N et al 2002 Family based analysis using a dense single nucleotide polymomphism based map defines genetic varaton al PSORSI the major psornasis suscepubility locus Am J Hum Genet Tl 334 364 Wane X Zinkel Polonsky K and Fuchs E 1997 Transgenic studies with a keratin promoter driven growth homone tramgene prospects for gene therapy Prec Natl Acad Sa OSA 94 219 226 Vang Ta Liang Du Koch PL Hohl D Kheradmand F and Overbeek P A 2004 Epidermal detachment desmosomal dissociation and destabilization of comeodesmosin in Spink mice Genes Dev 18 2354 2358 259 260 V BIBLIOGRAPHIE 261 262 2003 The International HapMap Project Nature 426 789 796 Adams M D
374. of microarrays applied to the ionizing radiation response Proc Natl Acad Sci US A 2001 98 5116 21 Rozen S Skaletsky H Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers Methods Mol Biol 2000 132 365 86 Altschul SF Madden TL Schaffer AA et al Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 1997 25 3389 402 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 Delta Delta C T Method Methods 2001 25 402 8 Svensson EC Tufts RL Polk CE et al Molecular cloning of FOG 2 a modulator of transcription factor GATA 4 in cardiomyocytes Proc Natl Acad Sci US A 1999 96 956 61 Vasiliev O Rhodes SJ Beebe DC Identitication and expression of Hop an atypical homeobox gene expressed late in lens fiber cell terminal differentiation Mol Vis 2007 13 114 24 Keating DJ Dubach D Zanin MP et al DSCRI RCANI regulates vesicle exocytosis and fusion pore kinetics implications for Down syndrome and Alzheimer s disease Hum Mol Genet 2008 17 1020 30 Zhang JS Wang L Huang H et al Keratin 23 K23 a novel acidic keratin 1s highly induced by histone deacetylase inhibitors during differentiation of pancreatic cancer cells Genes Chromosomes Cancer 2001 30 123 35 Derry JM Gormally E Means GD et al Mutations in a delta 8 delta 7 sterol isomerase in the tattered mouse and X linked dominant chondrodysplasia pu
375. of the de novo cholesterol synthesis pathway diphosphomevalonate decarboxylase MVD R 4 8 and emopamil binding protein a sterol isomerase EBP R 1 5 EBP is associated with X linked chondrodysplasia punctata 2 CDPX2 OMIM 302960 a human disease that includes striated hyperkeratosis and hair defects Surprisingly to our best knowledge the expression of this gene has never been reported in the epidermis We were particularly intrigued by the overexpression of APOF R 41 observed in GKs APOF encodes a minor plasma apolipoprotein which blocks cholesteryl ester and triglyceride transfer to lipoproteins The biological significance of APOF overexpression in GKs remains presently unclear but this unexpected finding underlines the role of lipid transfer during cornification Cell polarity vesicle trafficking and lamellar bodies Lamellar bodies are secreted from the apical pole of GKs highlighting the importance of cell polarity and vesicle trafficking in these cells Here we show that several genes involved in these processes are overexpressed in GKs LRBA R 3 1 and SH3KBP7 R 64 for polarized vesicle trafficking EHD4 R 2 7 and D4S234E R 2 4 for membrane recycling endocytosis Interestingly MAPT a gene encoding the microtubule associated protein Tau expressed primarily in neurons and oligodendrocytes is overexpressed in GKs R 6 1 By affecting microtubule stability and motor protein activity Tau may regulate vesicle
376. og subunit of RNA polymerase III TIFIIIB 322 Microarrays 1 BTBD11 BTB POZ domain containing 11 95 Microarrays 0 6 CBFA2T2 core binding factor runt domain alpha subunit 2 translocated to 2 439 ORESTES Genomatix 0 6 CEBPZ CCAAT enhancer binding protein zeta 349 ORESTES Genomatix 1 2 CHD2 chromodomain helicase DNA binding protein 2 923 ORESTES microarrays 1 5 CNOT2 CCR4 NOT transcription complex subunit 2 632 ORESTES 1 6 CST7 cystatin F leukocystatin 63 Microarrays 0 8 DDIT3 DNA damage inducible transcript 3 312 Genomatix 0 6 DDX41 DEAD Asp Glu Ala Asp box polypeptide 41 1416 Microarrays 1 6 EBP emopamil binding protein sterol isomerase CDPX2 561 Microarrays 1 5 EGR1 early growth response 1 451 ORESTES Genomatix 0 9 EXT2 exostosin 2 N acetylglucosaminyl proteoglycan 4 beta glucuronosyltransferase 538 Microarrays 0 8 FAM179B family with sequence similarity 179 member B 140 Microarrays 0 7 FAR1 fatty acyl CoA reductase 1 MLSTD2 363 Microarrays 0 9 FLVCR1 feline leukemia virus subgroup C cellular receptor 1 heme transporter 73 Microarrays 0 8 FOXJ3 forkhead box J3 314 ORESTES Genomatix 0 7 FOXP1 forkhead box P1 458 ORESTES Genomatix 0 7 HDAC8 histone deacetylase 8 223 Microarrays 1 4 HLTF helicase like transcription factor 348 Genomatix 1 HOXA9 homeobox A9 62 Genomatix 0 6 ING4 inhibitor of growth family member 4 280 ORESTES Genomatix 1 6 IRF2 interferon regulatory factor 2 317 Genomatix 1 IRF7 interferon regulatory factor
377. oi de puces Citons notamment des travaux de g nomique fonctionnelle comme la recherche des cibles directes de facteurs de transcription l aide d immunopr cipitations de chromatine ChIP suivie d une analyse sur puce ChIP on chip figure 7 technique notamment employ e pour d terminer les cibles du facteur de transcription p63 dans les k ratinocytes Vigano et al 2006 Le ChIP on chip a galement permis de montrer que dans des cellules souches embryonnaires humaines un tr s grand nombre de g nes codant pour des prot ines y compris ceux suppos s inactifs font l objet d une initiation de la transcription l longation tant r gul e par certaines modifications des histones Guenther et al 2007 Citons aussi des tudes de g n tique telles la recherche de 26 mutations ponctuelles SNP mais aussi de pertes d h t rozygotie LOH ou de variation du nombre de copies d un g ne CNV micro d l tions ou amplifications au moyen d une hybridation g nomique compar e sur puces CGH arrays Ainsi pr s de la moiti des SNP recens s par le projet international HapMap 2003 lont t au moyen de puces ADN une approche qui s est av r e aussi fiable que les m thodes traditionnelles par s quen age Gunderson et al 2005 Les CGH arrays ont quant eux permis de d couvrir que les variations du nombre de copies concernent pr s de 12 du g nome humain et plusieurs milliers de g nes bien
378. olipases exprim e dans la couche granuleuse de l piderme L acide arachidonique est progressivement transform en divers produits de la voie de la 12 R lipoxyg nase figure 52 Plusieurs enzymes cl s de cette voie sont exprim es dans l piderme et requises pour la fonction barri re voir aussi Table 3 dans le paragraphe 2 3 1 les genes ALOX12B et ALOXE3 responsables de la transformation de l acide arachidonique en hepoxylin A3 HXA3 sont fr quemment mut s dans des cas d rythrodermie ichtyosiforme cong nitale s che Jobard et al 2002 le lien de cause effet tant notamment confirm par un mod le de souris mutantes pour Alox12b Moran et al 2007 ou d l t es pour ce m me g ne de Juanes et al 2009 De plus la transformation du TXA3 en 20 COOH TXA3 est catalys e par plusieurs enzymes Acide arachidonique membranaire phospholipides Phospholipase Acide arachidonique Lipoxyg nase l ALOX12B 12 R HPETE Epoxide isom rase ALOXE3 R HXA3 Epoxide hydrolase ii R TXA3 Cytochrome P450 FLJ39501 20 OH R TXA3 Alcool gras d shydrog nase 20 CHO R TXA3 Ald hyde gras d shydrog nase ALDH3A2 20 COOH R TXA3 A v R cepteur ichthyin Figure 52 Voie de l acide arachidonique D apr s le mod le propos dans Lefevre et al 2006 101 notamment une prot ine apparent e a la famille des cytochromes P450 FLJ39501 CYP4F22 et une ald hyde d shydrog nase ALDH3A2 dont les
379. olism in the epidermis presents many distinct characteristics as it mainly occurs in the extracellular space Extracellular lipids play key roles in the barrier function par ticularly in hydrophobicity of the skin surface Our study thus unraveled new actors in this particularly important process and might shed new light on the etiology of genodermatoses Genes of miscellaneous function In addition to genes involved in protein degradation and lipid metabolism we characterized new genes that might be of key importance in skin function CASZ1 is a transcription factor induced during embryogenesis in the course of mesenchyme differentiation 64 As its gene targets are presently unknown its relatively high expression level in the human skin 20 ORESTES calls for detailed functional studies in this tissue Finally eight genes encoding hypothetical pro teins without known domains such as C200rf95 CXorf33 or Genome Biology 2007 8 R107 161 h D a x D n D w n g R107 20 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al LOC440449 also displayed GK specific expression Their roles in epidermal differentiation remain completely elusive Conclusion We have described an original and efficient method for puri fying GKs from healthy human epidermis It is now of key interest to adapt this technique to biopsy fragments from patients suffering from various genodermatoses The GK is the l
380. ommunaut GO citons AmiGO sur le site de GO DAVID Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery http david abcc ncifcrf gov Ease Expression Analysis Systematic Explorer http david abcc ncifcrf gov ease ease jsp GoMiner http discover nci nih gov gominer Toutefois l exploitation de ce type d outil se heurte deux cueils la fiabilit des termes GO parfois erron s ou contradictoires car attribu s automatiquement en fonction du degr d homologie avec une prot ine connue et non 47 v rifi s manuellement l exhaustivit et la pr cision de la description qui est loin d tre satisfaisante pour certains produits de g nes exprim s dans un tr s petit nombre de tissus et ou peu d crits Certains outils tels que Ease ou M IA offrent toutefois la possibilit de pallier en partie ce d faut en combinant les informations qui peuvent tre trouv es dans diff rentes bases de donn es afin d obtenir l annotation la plus compl te possible D autres outils tels que Ingenuity Pathway figure 21 permettent une annotation automatique th oriquement plus s re car v rifi e manuellement avant d tre rendue disponible toutefois leur co t ainsi que leur non exhaustivit en raison de l ampleur de la validation humaine des donn es rendent ces outils souvent incomplets Direct Binding cts on 4 inhibits g Chromosomal passenger complex indirect m4 Inhibits
381. on 74 195 211 Yanaihara N Caplen N Bowman E Seike M Kumamoto K Y1 M Stephens R M Okamoto A Yokota J Tanaka T Calin G A Liu C G Croce C M and Harris C C 2006 Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis Cancer Cell 9 189 198 Yang T Liang D Koch P J Hohl D Kheradmand F and Overbeek P A 2004 Epidermal detachment desmosomal dissociation and destabilization of corneodesmosin in Spink5 mice Genes Dev 18 2354 2358 Yang Y H Dudoit S Luu P Lin D M Peng V Ngai J and Speed T P 2002 Normalization for cDNA microarray data a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation Nucleic Acids Res 30 e15 Yano S Banno T Walsh R and Blumenberg M 2008 Transcriptional responses of human epidermal keratinocytes to cytokine interleukin 1 J Cell Physiol 214 1 13 Yazaki J Gregory B D and Ecker J R 2007 Mapping the genome landscape using tiling array technology Curr Opin Plant Biol 10 534 542 288 Yendamuri S Trapasso F and Calin G A 2008 ARLTSI a novel tumor suppressor gene Cancer Lett 264 11 20 Yin J Q Zhao R C and Morris K V 2008 Profiling microRNA expression with microarrays Trends Biotechnol 26 70 76 Yu Z Lin K K Bhandari A Spencer J A Xu X Wang N Lu Z Gill G N Roop D R Wertz P and Andersen B 2006 The Grainyhead like epithelial
382. one r sultats non publi s ce qui pourrait expliquer qu il n existe chez l homme aucune pathologie associ e des mutations de ce g ne La TGM5 a quant elle t r cemment associ e un syndrome de peau d ciduale acrale noninflammatory acral peeling skin syndrome OMIM 609796 Cassidy et al 2005 Kharfi et al 2009 Cette pathologie est caract ris e par un d tachement indolore de lambeaux de couche corn e successif a la formation de bulles a la transition couche granuleuse couche corn e En plus de importance majeure des constituants de l enveloppe corn e ceux du corn odesmosome assurant la forte coh sion entre les corn ocytes sont galement requis pour la fonction barri re 2 2 2 2 2 3 Corn odesmosomes Le corn odesmosome en tant que structure d rivant directement des desmosomes des couches vivantes de l piderme est compos des m mes prot ines savoir pour la partie extracellulaire assurant la liaison entre les corn ocytes des cadh rines desmosomales Desmocolline 1 Desmogl ine 1 et 4 auxquelles s ajoute la corn odesmosine prot ine s cr t e par le k ratinocyte granuleux et retrouv e au niveau du c ur desmosomal avant la cornification e gt gt Figure 47 Organisation g nomique des cadh rines desmosomales chez Phomme sur le locus 18q12 1 Kljuic et al 2003 4l Telomere kb Les cadh rines desmosomales prot ines transmembran
383. oneone 10 1 ETUDE DU TRANSCRIPTOME ET DE LA REGULATION 1 1 1 1 1 1 12 1 2 12 1 12 1 1 1 2 1 2 1 2 1 3 1 2 1 4 1231 5 1 2 2 L22 karz 2 1 2 2 3 1 2 3 1 3 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 3 1 1 3 3 2 1 3 3 3 ETUDES STATIQUES DE TRANSCRIPTOMES soso 15 BANQUES DESTO Sa anita eee data cd 15 TECHNIQUE DES ORES FEES urren ais a EO TOTAR 17 ETUDES COMPARATIVES DE TRANSCRIPTOMES 19 OCR SR DNS cn a 19 Origines de la technique et principe ss 19 Types GO SUP POLE ARR M neleieeneestouacouses 20 Types de conception des puces d expression g nique 22 ADDICATIONS SU de esses a aa ee 24 Normalisation et tests statistiques 27 PCR QUEANTIPALIVE EN TEMPS RER init 36 Ongine EU DEM IDe sean en int niet 36 NOMANSAUIONM EE MR ne Sn ne E 37 PRN CE LEO DS E Te 38 SAGE amp SEQUENCAGE NOUVELLE GENERATION eee eeceeeeees 40 BIOINFORMATIOUR sense essences secec ose iiseeoeanence 45 BANQUES DEDONNEES en nanas venpisatelecesmantangseeanens 45 OUTILS D ANNOTATION nn a nn ainsi 46 IDENTIFICATION IN SILICO DE SEQUENCES REGULATRICES 48 Recherche de sites de fixation pour facteurs de transcription 49 Recherche de r gions conserv es 50 Outils d analyse des r gions r gulatrices 51 2 LA DIFFERENCIATION EPIDERMIQUE 54 2 1 PRESENTATION GENERA LE sis siicsccsciwascccscacsssctesctwessdssescseseavsts 54 2 1 1 APE
384. ooper DN Jave Suarez LF Rog ers MA Praetzel S Heidt PJ Schweizer Human type I hair kera tin pseudogene phihHaA has functional orthologs in the chimpanzee and gorilla evidence for recent inactivation of the human gene after the Pan Homo divergence Hum Genet 2001 108 37 42 Hahn Y Lee B Human specific nonsense mutations identified by genome sequence comparisons Hum Genet 2006 119 169 178 Marques AC Dupanloup Vinckenbosch N Reymond A Kaessmann H Emergence of young human genes after a burst of retroposition in primates PLoS Biol 2005 3 e357 Zeeuwen PL Epidermal differentiation the role of proteases and their inhibitors Eur J Cell Biol 2004 83 761 773 Zeeuwen PL van Vlijmen Willems IM Hendriks W Merkx GF Schalkwijk J A null mutation in the cystatin M E gene of ichq mice causes juvenile lethality and defects in epidermal cornification Hum Mol Genet 2002 1 1 2867 2875 Miyata T Inagi R Nangaku M Imasawa T Sato M Izuhara Y Suzuki D Yoshino A Onogi H Kimura M et al Overexpression of the serpin megsin induces progressive mesangial cell prolifera tion and expansion Clin Invest 2002 109 585 593 Askew YS Pak SC Luke CJ Askew DJ Cataltepe S Mills DR Kato H Lehoczky J Dewar K Birren B et al SERPINB I2 is a novel mem ber of the human ov serpin family that is widely expressed and inhibits trypsin like serine proteinases Biol Chem 2001 276 49320 49330 Caubet C Jonca N Lopez F Esteve
385. ore r sonnance plasmonique de D Desmoplakine en surface montre qu en pr sence BB Plakophiline Filaments Dsc _ interm diaires de Ca2 DSC2 et DSG2 PR Plakoglobine Fl interagissent pr f rentiellement Figure 49 Desmosome de l piderme en microscopie lectronique et repr sentation sch matique correspondante Kottke et al est capable de former des 2006 en h t rodim res et seule DSC2 proposent que desmocollines et 93 desmogl ines pourraient s associer de facon h t rophile entre 2 cellules adjacentes et formeraient des dim res lat raux figure 49 De plus si la fonction de ces prot ines transmembranaires met en jeu des interactions entre cellules adjacentes donc en trans certaines donn es tendent montrer que dans de nombreux tissus dont l piderme leur association est renforc e par des interactions en cis d finissant ainsi un tat d hyper adh rence des desmosomes qui deviennent calcium ind pendants Garrod et al 2005 Al Amoudi et al 2007 Le passage de l tat renforc l tat normal semble d pendant de l action de la PKCa sur les prot ines de la plaque desmosomale et pourrait jouer un r le dans la r gulation de l adh rence notamment au cours de la cicatrisation Des souris inactiv es pour Dsc1 pr sentent un d faut de barri re associ une acantholyse Chidgey et al 2001 Toutefois la morphologie des desmosomes dans les couches sup
386. oriasis humain pour un r sum des principaux mod les voir l excellente revue publi e r cemment Gudjonsson et al 2007 122 3 Etudes a grande echelle du transcriptome epidermique Le nombre d EST produits a partir d piderme humain et ou de k ratinocytes en culture est environ 300 fois plus faible que le nombre de ceux obtenus partir d organes tels que le cerveau environ 1 600 contre 510 500 avant les premiers travaux grande chelle de notre quipe pour un total de 8 2 millions d EST humains ce qui montre le retard pris dans l tude de ce tissu Gr ce a la miniaturisation des outils et au changement d chelle op r par les techniques les plus r centes l annotation du g nome et la compr hension de m canismes cellulaires complexes s appuient de plus en plus sur des donn es obtenues partir de pr l vements humains plut t que de cellules en culture et partir de populations homog nes de cellules plut t que d organes entiers Malgr cela seul un petit nombre d tudes se sont int ress es l tude du transcriptome de l piderme De nombreuses tudes ont t men es dans un contexte pathologique et les tudes men es dans un contexte physiologique ont principalement eu pour but d valuer l int r t des quivalents cutan s donc in vitro Seuls quelques rares travaux ont t men s partir d piderme murin ou humain ex vivo 3 1 Etudes du transcriptome lors de patho
387. orn e de l piderme retardant la desquamation Les malades pr sentent une activit r duite des serine prot ases et un retard dans la prot olyse des corn odesmosomes Elias et al 2004 Les c ramides Les c ramides sont des sphingolipides form s d un groupement sphingosine li un acide gras par une liaison amide Dans la couche corn e 9 esp ces de c ramides sont pr sentes et diff rent entre elles par leur groupement sphingosine et par la longueur de leur cha ne carbon e Parmi eux se distinguent 2 esp ces d o hydroxyc ramides tr s longue cha ne 30 32 C qui traversent les deux h mi couches de la membrane plasmique et sont li es aux prot ines de l enveloppe corn e au moment de sa formation en particulier l involucrine sous l action de la transglutaminase 1 Nemes et al 1999 Cette couche de c ramides fix s de fa on covalente autour de l enveloppe corn e pourrait servir de matrice pour l orientation des lamellae lipidiques Swartzendruber et al 1989 Il existe 2 voies principales de synth se des c ramides par synth se de novo par la condensation de serine et de palmitoyl CoA par la serinepalmitoyltransf rase et la c ramide synthase Choi and Maibach 2005 et par d gradation du glucosylc ramide par la beta glucoc r brosidase GBA Hachem et al 2005 Hachem et al 2006 ou de la sphingomy line par la sphingomy linase SMPD Les acides gras libres Ils proviennent qua
388. orth H Teh M T Cullup T Mein C A Dopping Hepenstal P J Dale B A Tadini G Fleckman P Stephens K G Sybert V P Mallory S B North B V Witt D R Sprecher E Taylor A E Ilchyshyn A Kennedy C T Goodyear H Moss C Paige D Harper J I Young B D Leigh I M Eady R A and O Toole E A 2005 Mutations in ABCA12 underlie the severe congenital skin disease harlequin ichthyosis Am J Hum Genet 76 794 803 Kharfi M El Fekih N Ammar D Jaafoura H Schwonbeck S van Steensel M A Fazaa B Kamoun M R and Fischer J 2009 A Missense Mutation in TGM5 Causes Acral Peeling Skin Syndrome in a Tunisian Family J Invest Dermatol Kimonis V DiGiovanna J J Yang J M Doyle S Z Bale S J and Compton J G 1994 A mutation in the V1 end domain of keratin 1 in non epidermolytic palmar plantar keratoderma J Invest Dermatol 103 764 769 Klar J Schweiger M Zimmerman R Zechner R Li H Torma H Vahlquist A Bouadjar B Dahl N and Fischer J 2009 Mutations in the fatty acid transport protein 4 gene cause the ichthyosis prematurity syndrome Am J Hum Genet 85 248 253 Kljuic A Bazzi H Sundberg J P Martinez Mir A O Shaughnessy R Mahoney M G Levy M Montagutelli X Ahmad W Aita V M Gordon D Uitto J Whiting D Ott J Fischer S Gilliam T C Jahoda C A Morris R J Panteleyev A A Nguyen V T and Christiano A M 2003
389. osomes of epithelia undergoing cornification mainly the epidermis and the inner root sheath of the hair follicles CDSN nonsense mutations are associated with hypotrichosis simplex of the scalp a rare disease that leads to complete baldness in young adults CDSN displays adhesive properties mostly attributable to its N terminal glycine rich domain and is sequentially proteolyzed as corneocytes migrate towards the skin surface A 4 promoter driven Cre mediated deletion of Casa in mice resulted in neonatal death as a result of epidermal tearing upon minor mechanical stress Ultrastructural analyses revealed a desmosomal break at the interface between the living and cornified layers After grafting onto nude mice knockout skin showed a chronic defect in the epidermal permeability barrier The epidermis was first hyperproliferative with a thick cornified Introduction Lessons from human diseases and engineered mouse models have established the importance of desmosomes in tissues subjected to high mechanical stress Indeed these intercellular junctions provide strong cohesion between adjacent cells Mutations in genes encoding desmosomal components are invariably responsible for skin diseases often associated with heart defects for reviews see Kottke et al 2006 Garrod and Chidgey 2008 In the epidermis desmosomes undergo profound morphological and biochemical changes throughout keratinocyte differentiation In particular during comificatio
390. ostnatal death A Macroscopic appearance of WT HET and KO pups born at full term KO pups die within hour of birth and show considerable skin detachment particularly in the ventral area paws and snout whereas HET newborns show no visible difference from WT B Macroscopic appearance of WT HET and KO mice delivered by caesarian section at E18 5 Immediately after birth KO neonates are indistineuishable from the WT and HET littermates C When neonates were left in surrogate mother s care for hour the skin phenotype of KO pups appears and death occurs rapidly Higher magnifications of paw and snout of WT and KO neonates are shown on the right conditions only one out of nine KO pups died The remaining pups did not develop any noteworthy skin detachment and five of them maintained a TEWL value that was roughly similar to that of the WT and HET newborns between 0 and 4 m7 per hour These experiments demonstrate that the skin phenotype is closely linked to mechanical stress from the environment To assess the mechanical resistance of the skin the amount of protein detached from the skin by tape stripping was measured Three times more protein was extracted from KO skin than from WT or HET skin Fig 3C Hence even macroscopically intact KO skin is extremely fragile and tears under mechanical stress Histological analysis of KO mouse skin reveals a detachment of the stratum corneum from the living layers of epidermis In zones
391. ot ine HYAL2 est g n ralement localis e au niveau des lysosomes et ou de la membrane plasmique selon le type cellulaire et poss de un pH optimal acide pour revue Lepperdinger et al 2001 sugg rant que l enzyme pourrait tre s cr t e par les k ratinosomes souvent compar s a des lysosomes s cr toires et d grader l acide hyaluronique pr sent dans la matrice de la couche granuleuse Bien que le r le de l acide hyaluronique dans l piderme reste peu d fini sa capacit retenir l eau m dier des interactions intercellulaires ou encore lier des prot ines extracellulaires tels que les facteurs de croissance sugg re un r le dans la formation d un environnement favorable pour la diff renciation k ratinocytaire http www glycoforum gr jp science hyaluronan HAo4 HAo4E html De plus les produits de faible poids mol culaire issus de la d gradation de l acide hyaluronique poss dent une large gamme d effets notamment l induction de l expression de hBD2 2 defensine un peptide antimicrobien naturellement pr sent dans la couche granuleuse Ali et al 2001 Gariboldi et al 2008 Ces donn es sugg rent que de nouveaux composants ou modificateurs de la matrice extracellulaire restent d couvrir dans les couches suprabasales de l piderme De part leurs multiples fonctions notamment dans la s questration et ou la pr sentation de nombreux facteurs diffusibles leur identification est primordiale po
392. otech Histological and immunohistological analysis Tissue samples were fixed for 24 hours in Bouin s fixative dehydrated for 24 hours in 70 ethanol and embedded in paraffin Sections 4 pm were stained with hematoxylin and eosin or processed for immunohistochemical analysis Rabbit polyclonal antibodies were detected with the appropriate ImmPRESS anti rabbit Ig peroxidase kit whereas the Vector MOM peroxidase kit was used to detect CDSN Vector Laboratories Images were taken using a Nikon eclipse 80i microscope equipped with a Nikon DAM 12000 digital camera and NIS image analysis software Quantitative real time PCR experiments Skin samples were frozen immediately after dissection and total RNAs were isolated according to RNeasy mini columns protocol Qiagen Reverse transcription was performed using a combination of oliga dT and random hexamers Primer sequences supplementary matenal Table 51 were designed using Primers software to generale amplicons of 100 250 bp encompassing different exons BLAST analysis Altschul et al 1997 ensured the absence of similarity to any other mouse sequence Amplification assays were performed with the 7300 Real Time PCR System Applied Riosystems using the Sybr gPCR SuperMix with ROX Invitrogen Fluorescence was quantified as threshold cycle values Samples were analyzed in triplicate with differences between the three values lower than 0 3 Relative levels of gene expression between sa
393. ours at 50 C After four washes slides were digitized with an Axon GenePix 4000A scanner Image analysis was performed with the Axon GenePix Pro 3 0 software Raw data were imported into Bioplot software developed at the Genotoul biochips platform http biopuce insa toulouse fr ExperimentExplorer doc Data from the three pairs of swap arrays were merged and considered as three simple arrays for further analyses Only spots with signal intensities greater than the average signal for all buffer spots I e spots without oligonucleotides plus 2 SD and detected by more than half of the arrays i e with at least four values were analyzed Local background subtracted median intensities were log transformed and normalized by the LOWESS method and Students t tests were carried out on differentially expressed genes SAM software was used on normalized data for false discovery rate FDR analysis References 1 Le Brigand K Russell R Moreilhon C et al An open access long oligonucleotide microarray resource for analysis of the human and mouse transcriptomes Nucleic Acids Res 2006 34 e8f 2 Tusher VG Tibshirani R Chu G Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response Proc Nat Acad Sci U S A 2001 98 5116 21 192 Figure S1 Microarray results from six independent samples a MA plot Mean GK BK ratios and average intensities are represented for each of the 11 552 detected spots A higher
394. ows that genes expressed specifically in the uppermost layers of the epidermis are poorly represented in the sequence databases and suggests that some genes encoding hypotheti cal proteins may play a functional role in the late steps of epi dermal differentiation We specially focused on genes potentially involved in desquamation regulation as well as lipid metabolism and transport considering their importance for barrier function establishment Thus 73 candidate genes were chosen for a quantitative study of their expression in the course of epidermal differentiation by real time RT PCR The T4 T1 ratio for 20 of them could not be calculated by quanti tative RT PCR using the SYBR Green method due to a very low expression level This underlines the sensitivity of the ORESTES method in detecting rare transcripts Among the 52 remaining genes real time RT PCR experiments revealed that 33 are upregulated during late epidermis differentiation and hypotheses on the function of some of them are presented below Moreover the expression pattern of 6 of these genes is mostly restricted to epidermis as shown by PCR on a panel of 16 human cDNAs prepared from various organs Figure 4 Among the 330 genes poorly represented in EST databases that we identified a significant proportion of granular kerat inocyte specific genes are thus suspected to be present Expression of proteases and protease inhibitors in the human epidermis The balance between p
395. pas a risque de 1 esp ce faux positif B risque de 2 esp ce faux n gatif 1 a confiance du test sont li s plus le seuil a choisi est faible 1 B puissance du test consid r s par la suite Les seuils a et B plus le risque de rejeter une valeur tort Figure 13 Test statistique et risques est lev Le test statistique le plus employ est le test t de Student lorsque la p value calcul e probabilit d observer une diff rence d expression au moins gale si en r alit il n y a pas de diff rence est inf rieure au seuil a fix 0 05 ou 0 01 l expression diff rentielle est consid r e comme significative d apr s le test Toutefois ce type de test doit tre r p t pour chaque ratio ce qui m me en ne consid rant que les ratios de g nes surexprim s ou sous exprim s repr sente un grand nombre de tests En fixant par exemple un seuil a 0 05 pour le cas d une analyse o 1000 g nes seraient test s 50 faux positifs 1000 X 0 05 seraient consid r s comme vrais positifs alors que le nombre r el de vrais positifs en plus de ces 50 peut tre beaucoup plus faible ce qui explique qu en raison des tests multiples la proportion de faux positifs parmi les g nes d clar s positifs peut tre tr s lev e Une des parades consiste corriger le test une des premi res corrections invent e est la correction de Bonferroni qui consiste diviser le seuil a par le nombre de te
396. per gene some highly transcribed genes including that encoding dermokine were overrepresented About 330 expressed genes displayed less than 100 ESTs in UniGene clusters and are most likely to be specific for GKs and potentially involved in barrier function This hypothesis was tested by comparing the relative expression of 73 genes in the basal and granular layers of epidermis by quantitative RT PCR Among these 33 were identified as new highly specific markers of GKs including those encoding a protease protease inhibitors and proteins involved in lipid metabolism and transport We identified filaggrin 2 also called ifapsoriasin a poorly characterized member of the epidermal differentiation complex as well as three new lipase genes clustered with paralogous genes on chromosome 1 0q23 3 A new gene of unknown function Clorf8l is specifically disrupted in the human genome by a frameshift mutation D D D a D Wi z ri Conclusion These data increase the present knowledge of genes responsible for the formation of the skin barrier and suggest new candidates for genodermatoses of unknown origin Genome Biology 2007 8 R107 143 R107 2 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Background High throughput genomic projects focusing on the identifica tion of cell and tissue specific transcriptomes are expected to uncover fundamental insights into biological processes Par ticularly i
397. pes corn es sont morphologiquement identiques celles de souris sauvages Cette tude n a pas montr de m canisme de compensation par surexpression d autres prot ines de l enveloppe corn e n anmoins seules la loricrine et SPRR1 ont t analys es cet gard L expression de l involucrine a t tudi e depuis de nombreuses ann es comme mod le de r gulation g nique lors de la diff renciation k ratinocytaire pour une revue voir Eckert et al 2004 Deux s quences promotrices ont t identifi es un promoteur distal 2500 et un promoteur proximal Welter et al 1995 Crish et al 2006 Le promoteur distal est capable de lier les facteurs de transcription AP1 et Sp1 le promoteur proximal lie C EBP et AP1 L activation de ce g ne est sous la d pendance de la voie des MAPK Mitogen Activated Protein Kinases et des PKC Le promoteur humain de l involucrine est galement tr s utilis pour diriger l expression d un transg ne dans les k ratinocytes suprabasaux de mod les in vitro ou in vivo y compris chez la souris Carroll et al 1993 Crish et al 1993 De telles constructions ont notamment t employ es pour r aliser des expressions ectopiques ou surexpressions de plusieurs int grines Carroll et al 1995 du g ne nude foxni Prowse et al 1999 de la claudine 6 Turksen and Troy 2002 de la desmogl ine 3 Merritt et al 2002 et de la connexine 26 Djalilian et al 2006 Apr s les plaki
398. phoblast noncoding RNA Transplantation 2003 76 387 394 Zhang Y Tycko B Monoallelic expression of the human H19 gene Nat Genet 1992 1 40 44 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 hetp genomebiology com 2007 8 6 R107 Thorvaldsen JL Duran KL Bartolomei MS Deletion of the H19 dif ferentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2 Genes Dev 1998 12 3693 3702 Blakytny R Jude EB Martin Gibson J Boulton AJ Ferguson MW Lack of insulin like growth factor IGFI in the basal keratinoc yte layer of diabetic skin and diabetic foot ulcers Pathol 2000 1 90 589 594 Bennett WR Crew TE Slack JM Ward A Structural proliferative units and organ growth effects of insulin like growth factor 2 on the growth of colon and skin Development 2003 130 1079 1088 Katayama S Tomaru Y Kasukawa T Waki K Nakanishi M Nakamura M Nishida H Yap CC Suzuki M Kawai J et al Antisense tran scription in the mammalian transcriptome Science 2005 309 1564 1566 Strausberg RL Feingold EA Grouse LH Derge JG Klausner RD Col lins FS Wagner L Shenmen CM Schuler GD Altschul SF et al Gen eration and initial analysis of more than 15 000 full length human and mouse cDNA sequences Proc Nat Acad Sci USA 2002 99 16899 1 6903 Kraut J Serine proteases structure and mechanism of catalysis
399. plus couramment employ e Livak and Schmittgen 2001 est le calcul du 2 At les formules exactes et approch es sont d taill es dans la partie Discussion consacr e la PCR quantitative apr s avoir calcul le Ct du g ne d int r t la valeur du Ct du g ne de r f rence est soustraite ACT afin de rendre les chantillons comparables puis les Ct ainsi normalis s sont compar s par simple soustraction AAC Si l on suppose une efficacit de 100 c est dire un doublement de la quantit d ADN amplifi chaque cycle en phase exponentielle le rapport des niveaux d expression ou ratio correspond 2 AACt le signe tant uniquement d au fait que les g nes les plus exprim s ont les Ct les plus faibles 1 2 2 3 Applications En raison de son faible d bit la PCR quantitative est rarement utilis e comme outil de criblage grande chelle contrairement aux puces ADN Toutefois sa sensibilit ainsi que sa gamme dynamique pr s de 104 lev es en font un outil de pr dilection pour quantifier de petites variations d expression De plus la reproductibilit et la sp cificit lev es de cette m thode en font un outil privil gi pour confirmer des donn es obtenues par d autres techniques Enfin contrairement aux puces ADN la sp cificit de la PCR quantitative est ais ment v rifiable d une part en contr lant les courbes de dissociation qui t moignent de l amplification d une seule s
400. ppe corn e de lenvoplakine et de la p riplakine ne provoque qu un retard dans la mise en place de la fonction barri re au cours de l embryogen se accompagn d une simple anomalie de la desquamation conduisant une hyperk ratose Sevilla et al 2007 En compl ment de ces prot ines de la famille des plakines l involucrine participe galement au premier chafaudage l origine de l enveloppe corn e Le gene IVL situ au sein de l EDC code chez l homme pour une prot ine de 585 acides amin s compos e de courtes r p titions en tandem 39 r p titions de 10 acides amin s Eckert and Green 1986 Exprim e pr cocement d s la couche pineuse l involucrine est incorpor e l enveloppe corn e comme le montrent des marquages en immunomicroscopie lectronique d enveloppes corn es et le s quen age de peptides obtenus apr s prot olyse de ces enveloppes Steinert and Marekov 1997 Sa localisation sous membranaire lui permet d tre attach e de fa on covalente aux 86 hydroxyc ramides qui vont progressivement remplacer la membrane plasmique Nemes et al 1999 De mani re surprenante des souris invalid es pour le g ne de l involucrine ne d veloppent aucun ph notype particulier l piderme et les follicules pileux tant histologiquement normaux Djian et al 2000 Elles ne pr sentent pas non plus de diff rences avec des souris sauvages au cours de la cicatrisation Enfin les envelop
401. ppropriate expression of the human involucrin gene in transgenic mice an abnormal epidermal phenotype Differentiation 53 191 200 Cui Y Wang Q Stormo G D and Calvo J M 1995 A consensus sequence for binding of Lrp to DNA J Bacteriol 177 4872 4880 Dale B A Holbrook K A Fleckman P Kimball J R Brumbaugh S and Sybert V P 1990 Heterogeneity in harlequin ichthyosis an inborn error of epidermal keratinization variable morphology and structural protein expression and a defect in lamellar granules J Invest Dermatol 94 6 18 de Cid R Riveira Munoz E Zeeuwen P L Robarge J Liao W Dannhauser E N Giardina E Stuart P E Nair R Helms C Escaramis G Ballana E Mart n Ezquerra G den Heijer M Kamsteeg M Joosten I Eichler E E Lazaro C Pujol R M Armengol L Abecasis G Elder J T Novelli G Armour J A Kwok P Y Bowcock A Schalkwijk J and Estivill X 2009 Deletion of the late cornified envelope LCE3B and LCE3C genes as a susceptibility factor for psoriasis Nat Genet 41 211 215 de Guzman Strong C Wertz P W Wang C Yang F Meltzer P S Andl T Millar S E Ho I C Pai S Y and Segre J A 2006 Lipid defect underlies selective skin barrier impairment of an epidermal specific deletion of Gata 3 J Cell Biol 175 661 670 de Juanes S Epp N Latzko S Neumann M Furstenberger G Hausser I Stark H J and Krieg P 2009 Developm
402. prend cinq membres AP 2a AP 2B AP 2y AP 26 et AP2e seule isoforme sp cifique de l piderme Tummala et al 2003 Des sites de fixation pour ces facteurs fonctionnant en h t ro ou homodim res ont t mis en vidence aussi bien pour des g nes exprim s dans la couche basale que dans les couches suprabasales notamment les promoteurs des g nes KRT14 et KRT1 et in vitro selon le facteur AP 2 la construction et le type cellulaire ces facteurs sont d crits comme activateurs ou comme r presseurs Les ablations conditionnelles d AP 2a Wang et al 2006 ou AP 2y Guttormsen et al 2008 ont essentiellement soulign la redondance entre les facteurs AP 2 seule une l g re perturbation dans la signalisation de EGF et un retard dans l tablissement de la fonction barri re ont t mis en vidence respectivement par ces deux mod les L inactivation simultan e de ces deux g nes a livr plus d information sur leur r le dans l piderme r v lant la fonction des facteurs AP 2 et de la voie Notch dans la transition entre prolif ration et diff renciation via la r gulation des facteurs CCAAT enhancer binding protein Wang et al 2008 Ce mod le impliquant divers facteurs ubiquistes a t progressivement compl t par la d couverte de facteurs plus sp cifiques qui pourraient agir en synergie avec les facteurs ubiquistes 103 844N 8002 IE 38 unejjeg lk d pl asedsey 000z IE 8 BEEN eds je ids ewyerdor
403. pression in premalignant human epidermis revealed by cluster analysis of serial analysis of gene expression SAGE libraries Faseb J 16 246 248 van Ruissen F Jansen B J de Jongh G J Zeeuwen P L and Schalkwijk J 2002b A partial transcriptome of human epidermis Genomics 79 671 678 Van Tassell C P Smith T P Matukumalli L K Taylor J F Schnabel R D Lawley C T Haudenschild C D Moore S S Warren W C and Sonstegard T S 2008 SNP discovery and allele frequency estimation by deep sequencing of reduced representation libraries Nat Methods 5 247 252 Vandesompele J De Preter K Pattyn F Poppe B Van Roy N De Paepe A and Speleman F 2002 Accurate normalization of real time quantitative RT PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes Genome Biol 3 RESEARCH0034 Vendrell J A Robertson K E Ravel P Bray S E Bajard A Purdie C A Nguyen C Hadad S M Bieche I Chabaud S Bachelot T Thompson A M and Cohen P A 2008 A candidate molecular signature associated with tamoxifen failure in primary breast cancer Breast Cancer Res 10 R88 Vigano M A Lamartine J Testoni B Merico D Alotto D Castagnoli C Robert A Candi E Melino G Gidrol X and Mantovani R 2006 New p63 targets in keratinocytes identified by a genome wide approach Embo J 25 5105 5116 Wang X Bolotin D Chu D H Polak L Williams T and Fuchs E 2
404. processed lorm of CDSN open triangle respectively indicating that the genetic manipulation did not affect the function of the floxed gene Generation of Cdsn defictent mice was obtained by crossing Cdsn mice with K 4 Cre transgenic mice Li et al 2001 The resulting animals bearing the A 4 Cre and heterozygous for the floxed Cdsn allele were selected and mated again with Cdsn mice Four different genotypes were thus obtained Fig 1B K 4 Cre Cdsu and K14 Cre Cdsn both denoted hereafter as wild type WT K 4 Cre Cdsn denoted hereafter 250 D oO a se O an Q O O T z on 2 as heterozygous mice HET and K 4 Cre Cdsn denoted as knockout KO mice The genotyping of 232 newborns from 12 intercrosses revealed that WT HET and KO pups were produced in the expected mendelian ratios indicating no embryonic lethality for the KO mice Excision of the floxed Cdsn allele in the skin of newborn pups was controlled by PCR analysis Fig 1C As expected in skin of KO neonates Cas mRNA level measured by quantitative real time PCR was very low confirming efficient ablation of Cdsn Fig 1D In HET pup skin Cds expression was roughly 50 of the WT level demonstrating the absence of dose compensation Western blot analysis Fig 1E using the F28 27 anti CDSN monoclonal antibody mAb confirmed the absence of CDSN in the skin of KO animals whereas the full length 54 kDa protein w
405. que des ORESTEs Apr s extraction des ARNm de l chantillon une transcription inverse est r alis e une temp rature de 37 C permettant l hybridation imparfaite de amorce choisie une sous population des ces ARNm La premi re tape de la PCR qui suit se fera de m me faible stringence 37 C figure 1 Cette RT PCR constitue le principe de la normalisation conceptuelle de la m thode l hybridation de l amorce arbitraire ne d pend pas de l abondance relative des diff rents ARNm comme c est le cas avec des amorces oligo dT et favorise ainsi l amplification des transcrits rares Les produits d amplification sont ensuite d pos s sur gel et les bandes visibles correspondant l amplification pr f rentielle d une mol cule donn e sont limin es 17 constituant une tape suppl mentaire de normalisation Avec l utilisation d amorces diff rentes la construction de nombreuses minibanques d une centaine de clones rend possible l tablissement d un catalogue des g nes exprim s et l identification de g nes sp cifiques du type cellulaire consid r Le premier avantage de la technique des ORESTES est son principe de normalisation l amorce s hybridera lors de la premi re tape de transcription inverse faible stringence diminution de la temp rature de la r action 37 C avec la m me probabilit sur un ARNm abondant ou sur un ARNm rare L amplification d un tran
406. que les s quences g n r es sont trop courtes comme avec le SAGE Toutes ces techniques bas es sur la g n ration d tiquettes pr sentent l avantage de diminuer fortement le volume de s quences produire mais aussi de donner une information la fois qualitative quels g nes sont exprim s et quantitative le nombre de tags pour un g ne donn tant th oriquement proportionnel l abondance de son messager Les techniques de s quencage nouvelle g n ration permettent de se passer de l tape de concat nation puisque g n rant naturellement un tr s grand nombre de courtes s quences Elles permettent galement d atteindre une profondeur de lecture suffisante pour identifier les transcrits rares au milieu de transcrits plus abondants pr servant ainsi l aspect quantitatif de ces m thodes mRNA _ an or TTITTITIT RMA fragments cDNA C EST library with adaptors ATCACAGTGGGACTCCATAAATTTTTCT CGAAGGACCAGCAGAAACGAGAG IM GGACAGAGTCCCCAGCGGGCTGAAGGGG ATGAAACATTAAAGTCAAACAATATGAA Short sequence reads Coding SEQUENCE Oo E gt E E F _ _ _ _ _Bna9 p E nt Exonic reads AAAAAAAAA o l i i uaa c eS i i e AAAAAA unction reads SS gt i SS SS SS OS _ poly A end reads C gt Ss Mapped sequence reads Figure 20 Technique du RNA Seq Wang et al 2009 42 Toutefois en plus des difficult s d identification l usage
407. r TF families previously uncharacterized in the epidermis a che La UCSC Genes DMR a CHIEN TO Pos OMEN Pus Cmkn PLAN MRNAS ii anon L rma i 1 lo 40697500 40697600 49606500 UCSC Gene Predictions Based on Refseq UniProt Genbank and Comparative Genomics RefSeq Genes Hon Human RefSeq Genres Human mRHAS from GenBank Vertebrate Multiz Alignment amp PhastCona Conservation 26 Species Opossum rr nmen mum mummini TT NE AE DT TL Tr X_tcropicalis Stickleback SNPs 126 Human Mouse Rat Dog Horse amp mn nt a US nor ARR LE Les 7 rt 100 bp i ne Simp ie ae po La Fo lymorpn isms i build i265 CR2 Mlvsrkap vsetsF vsapir M vsecrr CR3 Mlvszepr vsparF vsevin vszFHx vsaPiF M vsar li vstepr 198 Table 52 Sequences of primers used for qRT PCR essays Gene symbol A2ML1 AATF ABAD11 ACBD6 ACSL4 ANKRD1 APOF AQR ARID2 ARID5B ARL11 ARSD ATFS ATF6 ATF6B ATP6VOAT AVEN B2M BBOX1 BCL11A BCL6 BHLHB2 BPTF BRF1 BTBD11 CBFA2T2 CCIN CDSN CEBPZ CHD2 CLCA4 CLCA4 alternative primer pair CNEN CNOT2 CRELD1 CST CSTA CTNNBIPT D45234E DDIT3 DDX41 DKFZP586H2123 DLX3 DMKN DSG1 EBP EGR1 EHD4 ETVS EXT2 FAM179B Forward primer CCCTGGTGAAGAAGGTTGAA AGATAGGAAAGCCAGCAAAGG GCTCTICGGCAGCAAAACTA CCATCAAATCGAAAAATGTGG GGTTGACACTTTTGGCACAAC AGAACTGTGCTGGGAAGACG
408. r the role of this new gene in mammalian physiology and evaluate the consequences of its possible inactivation in human Discussion We have described here the first large scale study of the tran scriptome of human epidermal cells As we are interested in genes that participate in the barrier function of the skin we focused on GKs They correspond to the ultimate step in the course of keratinocyte differentiation and are the last epider mal cells to display gene expression activity before undergoing a particular programmed cell death leading to cornification Because these cells represent less than 10 of the epidermis population a preliminary step was to design an efficient purification method starting from healthy human skin fragments After unsuccessful attempts using size filtra tion Ficoll gradients and fluorescence activated cell sorting we used successive short term enzyme incubations to pro gressively detach cells from the deep layers and purify the cells that remain attached to the cornified layer These incu bations were performed at 4 C to stop cellular metabolic activity and preserve the mRNA pool from degradation This point is highly relevant as many growth factors cell cycle reg ulators and transcription factors are encoded by short lived mRNA Quantitative PCR experiments were used to assess the relative expression levels of several genes in the succes sive cell fractions ORESTE technique In the present transcr
409. r une ichtyose rythrodermique une anomalie sp cifique des cheveux cheveux bambous et une atopie s v re avec un taux d IgE lev OMIM 256500 L inactivation de ce g ne par mutagen se insertionnelle reproduit le ph notype de la maladie chez la souris Yang et al 2004 figure 35 Les animaux pr sentent une fragilit desmosomale associ e une prot olyse pr matur e de la CDSN Deux autres tudes mettent en vidence d une part l hyperactivit des prot ases SCCE et SCTE et la prot olyse anormale de la desmoplakine et de la desmogl ine 1 Descargues et al 2005 et d autre part le r le du pH lequel varie dans la couche corn e passant d un pH neutre en profondeur acide en surface dans la dissociation entre LEKTI et ses cibles Deraison et al 2007 Ces r sultats font appara tre LEKTI comme un des r gulateurs cl du processus de desquamation LEKTI semble avoir galement de facon indirecte un role dans la formation des lamellae lipidiques chez les patients Figure 35 Trouble majeur de la desquamation chez des souris inactiv es pour Spink5 Descargues et al 2005 Les nouveaux n s pr sentent de larges d collements pidermiques a notamment aux zones de frottements b correspondant un clivage entre la couche granuleuse GR et la couche corn e SC c d 71 souffrant du syndrome de Netherton les ph notypes les plus s v res associ s a une quasi absence de LEKTI pr se
410. rA and primer gm oe T i E er gt v gDNA PNE SPGQ gt S44 PCR SA r AAAY El gt re Fm be Lo LILIA LA LAS Sample preparation Pyrosequencing Es ett Fe FAPI SSI TE SOLID ry Taga Ligase Beads Fr POSTS POSER Adaptors jj H a gDNA i OSa i CREER M J pi Le a d gt C 2 x 2 t p D prs rs SAYL roe Po oe re oor AAA AAA CE an De PR ET EEE ET AJ o oe t fe of Rs oe e Fe GO R PE PR i LATE fl ay pe wie S lr gt gt AAAA STe Eso fs ap LS Sample preparation Sequencing by ligation Polymerase lt gt Adaptors gDNA O IVY M E S g AL N ANINI g pe o Oo PL y S B a 2 D LAAJA IINIVIN Fae Sample preparation Sequencing by synthesis Figure 18 Nouvelles techniques de s quencage tr s haut d bit Medini et al 2008 40 de clonage et d amplification in vivo dans des bact ries susceptible de g n rer des mutations Les trois principales approches d velopp es et commercialis es par des compagnies concurrentes sont bas es sur des chimies distinctes technologies 454 du Solexa et du SOLID figure 18 Leurs principaux avantages sont la rapidit et surtout la grande quantit de s quences g n r es 400 600 megabases en 10 heures pour le 454 jusqu a 18 gigabases en 10 jours pour le Solexa et 1 a 3 gigabases en 8 jours pour le SOLID ainsi que le faible co t quelques milliers d
411. rabasales est normale comme montr en microscopie lectronique ce qui sugg re que la perte de Dsci seule desmocolline exprim e dans ces cellules est partiellement compens e par la formation de liaisons homophiles entre desmogl ines Les auteurs n ont pu mettre en vidence la surexpression d autres cadh rines desmosomales toutefois la Dsg4 n avait pas encore t identifi e au moment de cette tude Chez l homme des mutations de la DSG1 sont associ es une k ratodermie palmoplantaire de type I peu s v re OMIM 148700 Des mutations dans le g ne DSG4 ont t identifi es chez des patients pr sentant une hypotrichose transmise sur le mode r cessif OMIM 607903 et sont responsables de ph notypes similaires chez le rat et la souris Bazzi et al 2005 L absence de ph notype pidermique sugg re une compensation de la perte de Dsg4 peut tre li e la pr sence de Dsg1 dans les m mes couches Lors de la transition entre couche granuleuse et couche corn e les desmosomes changent de morphologie la plaque est incorpor e l enveloppe corn e jusqu devenir invisible en microscopie lectronique et le c ur extracellulaire se densifie La production au laboratoire d anticorps monoclonaux de souris immunis es avec des extraits de couche corn e a conduit l identification de la corn odesmosine CDSN Serre et al 1991 Guerrin et al 1998 D tect e dans la couche granuleuse o elle est s cr t e
412. rasbg r The targeting vector wis constricted as follows A 3 kb fragment encompassing most of the coding region exon 2 and corresponding to the floxed region was amplified by PCR from 2952 SvPas genomic DNA and subcloned in an MCI proprietary vector resulting instep plasmid The 5 4 7 kb and the 3 3 5 kb homologous arms were subcloned successively into the step plasmid to generate the final targeting vector All the coding regions were sequenced The MCI vector has a flipped neomycin resistance cassette The linearized construct was electroporated in 129S2 SvPas mouse embryonie stem ES cells After selection targeted clones were identified by PCR using external primers and further confirmed by Souther blot with both Neo and extemal probes One positive ES clone was injected into CS7BL 6 blastocysts and derived male chimeras gave germline transmission Chimene offspring were mated to FL Per flipper mice that express the Flp recombinase to excise the neomycin selection marker that was flanked by Fri sites A 4 Cre and AJ4 CreER were descnbed Indra et al 199 Li et al 2001 All experiments were performed on isolated mice Tamoxifen Tam and 4 hydroxy amoxifen OHT Sigma were prepared as previously described Indra et al 1999 For A 4 CreER transgene activation 8 to 10 week old transgenic mice were either intraperitoneally injected with Tam 0 1 mg in 100 wl sunflower oilj or subjected to topical application of
413. rashi S Takizawa T Takizawa T Yasuda Y Uchiwa H Hayashi S Brysk H Robinson J M Yamamoto K Brysk M M and Horikoshi T 2004 Cathepsin D but not cathepsin E degrades desmosomes during epidermal desquamation Br J Dermatol 151 355 361 Iizuka H Takahashi H Honma M and Ishida Yamamoto A 2004 Unique keratinization process in psoriasis late differentiation markers are abolished because of the premature cell death J Dermatol 31 271 276 Inagi R Nangaku M Miyata T and Kurokawa K 2003 Mesangial cell predominant functional gene megsin Clin Exp Nephrol 7 87 92 Ishida Yamamoto A 2003 Loricrin keratoderma a novel disease entity characterized by nuclear accumulation of mutant loricrin J Dermatol Sci 31 3 8 Ishida Yamamoto A McGrath J A Lam H lizuka H Friedman R A and Christiano A M 1997 The molecular pathology of progressive symmetric erythrokeratoderma a frameshift mutation in the loricrin gene and perturbations in the cornified cell envelope Am J Hum Genet 61 581 589 213 Ishida Yamamoto A Simon M Kishibe M Miyauchi Y Takahashi H Yoshida S O Brien T J Serre G and lizuka H 2004 Epidermal lamellar granules transport different cargoes as distinct aggregates J Invest Dermatol 122 1137 1144 Ito M Liu Y Yang Z Nguyen J Liang F Morris R J and Cotsarelis G 2005 Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair
414. ratinocytes pineux dermatose moins s v re Cheng et al 1992 ou encore de k ratodermies palmoplantaires Kimonis et al 1994 ou d ichtyose hystrix de Curth Macklin Sprecher et al 2001 tandis que des mutations dans le domaine h lico dal conduisent une rythrodermie ichtyosiforme cong nitale bulleuse McLean et al 82 1994a Des mutations de KRT2 sont responsables de l ichtyose bulleuse de Siemens McLean et al 1994b transmise sur le mode dominant et caract ris e par une hyperk ratose et la formation spontan e de bulles superficielles OMIM 146800 Enfin des mutations dans le g ne KRT9 sont responsables de k ratodermies palmoplantaires pidermolytiques OMIM 144200 Acides amin s libres Facteur naturel d hydratation Ea presen ae omente dans les granules de Prot olyse k ratohyaline granules F caract ristiques du k ratinocyte d a 5 TT e o p 8 Sous unit s de filaggrine d imin e granuleux appartient la famille ee 40 kDa des IFAP Intermediate Filament DRRRETEN Associated Protein Son g ne est a Sous unit s de filaggrine basique localis chez l homme dans le 37 kDa 7 _ SS associ es aux filaments de k ratines complexe de diff renciation pidermique en 1q21 Elle est Coupure des tides de liaison i d abord produite sous la forme b phosphorylation d un pr curseur insoluble de 400 or Profilaggrine 400 kDa P 4 agr g e sous forme de gr
415. ratio of KRT14 was 13 whereas the mean T4 T1 expression ratio of SCCE was approximately 130 Table 1 The KRT14 ratio might be indicative of a slight contamination of the T4 frac tion with basal keratinocytes Nevertheless the large SCCE ratio indicates that very few if any GKs were present in the T1 fraction From this we concluded that the T4 fraction was highly enriched in GKs and thus suitable for a large scale study of their transcriptome An ORESTES dataset from human granular keratinocytes PolyA RNA was extracted from the T4 fraction from individ ual 3 Table 1 and used to generate cDNA mini libraries using the ORESTES method 9 This sample was chosen as it presents the highest T1 T4 expression ratio for the KRT14 gene suggesting a low contamination of the T4 fraction by basal keratinocytes This method uses arbitrarily chosen primers for reverse transcription and PCR amplification The successful amplification of a mRNA thus depends primarily on partial sequence homology with the primer rather than on its abundance This and the elimination of cDNA prepara tions that display prominent bands on gels indicative of the selective amplification of particular mRNAs results in a nor malization process and allows the detection of rare tran scripts We constructed 150 cDNA libraries with different primers the analysis of 100 200 clones from each leading to the production of 22 585 sequences Figure 2a Among Sample no 3
416. rci surtout ma m re pour pas mal de choses comme m avoir support dans tous les sens du terme pendant toutes ces ann es ou avoir trouv le moyen de satisfaire ma curiosit quand j tais gamin Merci a tous d tre venus le jour J Je d die cette th se mon grand p re je suis s r qu il aurait ador tre la Pour leur soutien et leur amiti qui remontent a bien avant la th se pour certains merci a Mag Ludo Denis Thierry Laeti Kar ne El Rami Momo Miriam et tous les autres Marie H l ne Juju et Mathias vous tes hors cat gories votre pr sence a t mon oxyg ne alors merci ne suffirait pas tant pis Et puis y a d j trop de merci de toute fa on Et parce qu avec une vie sociale plut t fam lique il n y a pas que des personnes qui m ont tenu compagnie merci p le mele a ceux qui tombent en dehors aux habitants d Hyrule aux seize colosses aux ombres d Ico la Princesse qui n est jamais dans le ch teau et au pinceau des Dieux aux groupes islandais mondialement connus tels que Sigur Ros ou Mum JJG aux pandas roux r els ou virtuels au nombre 404 au BSoD et au RRoD la poussi re qui rentre dans mon appareil photo chaque changement d objectif aux Pyr n es que l on peut apercevoir ou pas depuis Toulouse et au seul vrai pic du Midi celui d Ossau videmment oui je sais quelques uns attendaient encore plus de r f rences
417. reconstitu et pas dans les cultures monocouche Les auteurs ont de ce fait choisi l piderme reconstitu pour analyser les effets de l acide r tinoique sur l expression g nique M me si ce travail a le m rite de tenter d analyser grande chelle la diff rence d expression g nique entre l piderme in vivo et les mod les in vitro le faible nombre de g nes test s et le manque de sensibilit de la m thode en diminuent la port e 130 L tude de Gazel et collaborateurs utilise des puces Affymetrix capables de d tecter 12000 g nes pour comparer le m me type d chantillons piderme humain normal diss qu piderme reconstitu SkinEthic et k ratinocytes primaires pr lev s 24h apr s confluence Au total 3240 g nes pr sentent une diff rence d expression avec un ratio sup rieur ou gal 2 entre au moins deux des chantillons Ce travail montre l aussi mais cette fois ci r ellement grande chelle que les mod les d piderme reconstruit expriment un programme g nique plus proche de l piderme normal que les k ratinocytes en culture monocouche On peut noter que l piderme reconstitu bien qu ayant une expression g nique plus proche de celle de l piderme ex vivo exprime plus faiblement certains g nes codant pour des prot ines de signalisation s cr t es et leurs r cepteurs Les auteurs proposent que cette diff rence soit largement due l absence des types cellulair
418. redondance mais non compensation avec les autres claudines pr sentes dans l piderme Le profil d expression de plusieurs d entre elles a t d termin en immunofluorescence indirecte les claudines 1 et 7 JAM1 et MUPP1 sont d tect es sur des coupes de peau 79 humaine dans toutes les couches vivantes de l piderme alors que ZO1 et la claudine 4 sont majoritairement exprim s dans la couche granuleuse et l occludine et la cinguline sont pr sentes exclusivement dans les derni res cellules vivantes pour revue Brandner 2008 figure 40 L expression de la tricelluline n a pas t caract ris e sur coupe de peau toutefois son expression est d tectable dans des cultures de k ratinocytes d s le d but de la stratification cellules post confluentes sugg rant que la prot ine pourrait tre pr sente dans toutes les couches suprabasales de l piderme l intersection de trois cellules Schluter et al 2007 Ocel a gt 7 N Cingulin Cldn 5 ms add Par6 Clan 4 0 1 Cldn 3 JAM A Ms add MUPP 1 Cldn 7 Cidn 18 ms add ms add Par 3 Cldn 6 i Cldn 11 PKC Cldn 1 1 rh Cidn 12 Tricelluline a Jonctions serr es Flux paracellulaire int rieur gt ext rieur d un marqueur de 600 Da renee gt Flux ext rieur gt int rieur Figure 40 Expression pidermique des prot ines des jonctions serr es d apr s Brandner 2008 Localisation variable s
419. regulin 2 0 114 ERO hhe EROT lihke 2 6 2 5 EVAT Epithetial V hke antigen 1 4 0 1 8 GIE CX 6 Gap jonction protein gt 10 3 4 GIFE CA HI Gap junction protein fi E a2 3 4 GK Glycerol kinase 5 9 3 9 HK Hexohinase 2 2 6 3 4 HIF Ta Ayvoowia inducible factor To 23 1 9 e Z ATM YT Interferen induced transmembrane 1 22 1 8 Figure 56 A Genes surexprunes dans ILIRIN Interleukin 1 receptor antagonist 2 4 2 4 l piderme de souris Klf4 ou dans l piderme MAD MAX dimenzation protein 3 2 Zu oe 2 x ss SL CEA 14 Solute canner family 6 sons 14 10 d d humain psorias que compare a un piderme SPARTE Small proline rich protain 1B 4 6 gt 10 normal B Immunofluorescence contre la SPARAZA Small proline rich protein ZA 3 3 5 0 connexine 26 sur coupe d piderme de souris Levels of gene upregulalion in psonatic and Kig skin Kia expression sauvage ou mut e Dj alilian et al 2006 levels were determined by microarray hybndizabtion and psonalic expression profiling data are published results from Boweeck laboratory 2 purinergiques et la perturbation de la r gulation du calcium intracellulaire hypoth se corrobor e par un modele murin surexprimant Cx26 sous d pendance du promoteur humain de l involucrine Une autre tude comparant sur puces ADN et par PCR quantitative les profils dexpression g nique d piderme de souris sauvages ou Klf4 a permis galement d identifier plusieurs cibles potentielles de Klf
420. rekov 1995 99 00 9D Enveloppe corn e L enveloppe corn e est une structure prot ique rempla ant la membrane plasmique et formant une coque qui emprisonne la matrice fibreuse Cette structure est insoluble en pr sence de d tergents et ou d agents r ducteurs dans la mesure ou les prot ines qui la constituent sont li es entre elles par des liaisons covalentes autres que des ponts disulfure Rice and Green 1977 L assemblage de l enveloppe corn e qui remplace la membrane plasmique se d roule de facon s quentielle par incorporation successive de pr curseurs de deux sortes des prot ines de la plaque desmosomale mais aussi des prot ines qui viennent se positionner sous la membrane plasmique au fur et mesure de leur synth se dans le cytoplasme figure 84 43 Les prot ines de la plaque desmosomale notamment la p riplakine et l envoplakine servent d chafaudage avec l involucrine avant que les autres pr curseurs ne soient incorpor s Ces pr curseurs sont li s entre eux par une famille d enzymes calcium d pendantes les transglutaminases dont les isoformes Tgm1 3 et 5 sont exprim es dans l piderme Initiation Renforcement Formation de l enveloppe corn e Desquamation Sni E couche pineuse couche granuleuse couche granuleuse sup rieure couche corn e Milieu extracellulaire i F i Granule L ait hu Cytoplasme fo Phospholipides G12 Activit
421. res se divisant activement pour garantir l hom ostasie et potentiellement des cellules post mitotiques sur le point de passer dans le compartiment suprabasal Les m lanocytes pr sents galement dans la couche basale produisent de la m lanine eum lanine et ph om lanine sous forme de granules les m lanosomes Le transfert aux k ratinocytes voisins se fait par cytophagocytose de l extr mit des dendrites contenant les m lanosomes Singh et al 2008 aboutissant la formation d une protection autour du noyau des k ratinocytes 2 2 1 2 La couche pineuse stratum spinosum Premi re couche suprabasale de l piderme la couche pineuse est constitu e de cing a dix assises cellulaires Les caract ristiques cellulaires majeures sont le changement de morphologie passant de cubique a poly drique l augmentation importante du volume cytoplasmique ainsi que le tr s grand nombre de desmosomes conf rant en microscopie optique un aspect pineux a ces cellules apr s r traction des membranes lors de la pr paration histologique Au sein du cytoplasme les desmosomes sont reli s par un tr s important r seau de filaments interm diaires de k ratines formant une cage p rinucl aire particuli rement visible en microscopie lectronique Les desmosomes et filaments interm diaires sont reli s via la plaque desmosomale form e de prot ines adaptatrices et jouent un role crucial dans la 59 r sistance de l p
422. reviations used GK granular keratinocyte BK basal keratinocyte EST expressed sequence tag ORESTE open reading frame EST qRT PCR quantitative real time PCR IHC immunohistochemistry TF transcription factor 169 Summary Background At the latest stage of terminal differentiation granular keratinocytes GKs undergo cornification a programmed cell death required for a functional skin barrier A complex gene regulatory network orchestrates the underlying biochemical modifications but very few transcription factors specific for this program have been identified Objectives We describe a large scale multi technique approach performed on cells purified from normal human epidermis and focusing primarily on identifying key regulators Methods We combined data from microarrays analysis on cell fractions enriched in GKs or basal keratinocytes from an EST library from GKs and from in silico promoter analysis for 52 differentiation associated genes Results Among 3576 potential GK expressed genes 298 candidates were selected and half could be profiled for the first time in the epidermis by real time PCR Results highlight various GK functions including lipid metabolism and secretion cell signaling and transcriptional regulation In total 49 new genes upregulated with differentiation were identified and 37 transcription factors out of 94 detected were found to be positively or negatively regulated suggesting a function during the fina
423. ris nude est capable de reformer des follicules pileux Blanpain et al 2004 cf ci contre Toutefois cette pluripotence ne semble pas tre requise dans un contexte physiologique les cellules souches impliqu es dans l hom ostasie de l piderme interfolliculaire et celles requises pour la g n ration des follicules pileux tant distinctes Levy et al 2005 les cellules du bulge n tant mobilis es hors du follicule pileux qu au cours de la cicatrisation Ito et al 2005 Au moyen de souris exprimant au cours de l embryogen se la B galactosidase dans les cellules de la placode donnant naissance au follicule pileux gr ce l excision d une 63 cassette de terminaison de transcription au moyen d une recombinase sous d pendance du promoteur du g ne shh Levy et collaborateurs ont ainsi pu montrer que la descendance de ces cellules se retrouvait dans la majorit du follicule pileux mais jamais dans l piderme interfolliculaire en absence de traumatisme figure 30 Ce r sultat confirme des donn es pr c dentes montrant que des cellules du bulge suivies gr ce leur expression de la G galactosidase ne contribuent que tr s rarement et marginalement au renouvellement de l piderme inter folliculaire Morris et al 2004 L id e que le renouvellement de l piderme se fait partir de cellules souches pr sentes dans la couche basale de l piderme interfolliculaire est en accord avec le fait que
424. rishima Y Tabata K Yasuno H Hashida M lizuka H Ikawa M Okabe M Kondoh G Kinoshita T Takeda J and Yamanishi K 1998 Defective stratum corneum and early neonatal death in mice lacking the gene for transglutaminase 1 keratinocyte transglutaminase Proc Natl Acad Sci U S A 95 1044 1049 Matsumoto M Zhou Y Matsuo S Nakanishi H Hirose K Oura H Arase S Ishida Yamamoto A Bando Y Izumi K Kiyonari H Oshima N Nakayama R Matsushima A Hirota F Mouri Y Kuroda N Sano S and Chaplin D D 2008 Targeted deletion of the murine corneodesmosin gene delineates its essential role in skin and hair physiology Proc Natl Acad Sci U S A 105 6720 6724 Mattie M D Benz C C Bowers J Sensinger K Wong L Scott G K Fedele V Ginzinger D Getts R and Haqq C 2006 Optimized high throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies Mol Cancer 5 24 Mauro T Guitard M Behne M Oda Y Crumrine D Komuves L Rassner U Elias P M and Hummler E 2002 The ENaC channel is required for normal epidermal differentiation J Invest Dermatol 118 589 594 Maytin E V Lin J C Krishnamurthy R Batchvarova N Ron D Mitchell P J and Habener J F 1999 Keratin 10 gene expression during differentiation of mouse epidermis requires transcription factors C EBP and AP 2 Dev Biol 216 16
425. rmatol 122 1423 1431 Ji Y Lalli M J Babu G J Xu Y Kirkpatrick D L Liu L H Chiamvimonvat N Walsh R A Shull G E and Periasamy M 2000 Disruption of a single copy of the SERCA2 gene results in altered Ca2 homeostasis and cardiomyocyte function J Biol Chem 275 38073 38080 Jiang Y J Kim P Elias P M and Feingold K R 2005 LXR and PPAR activators stimulate cholesterol sulfotransferase type 2 isoform 1b in human keratinocytes J Lipid Res 46 2657 2666 Jiang Y J Lu B Kim P Paragh G Schmitz G Elias P M and Feingold K R 2008 PPAR and LXR activators regulate ABCA12 expression in human keratinocytes J Invest Dermatol 128 104 109 Jobard F Lefevre C Karaduman A Blanchet Bardon C Emre S Weissenbach J Ozguc M Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2002 Lipoxygenase 3 ALOXE3 and 12 R lipoxygenase ALOX12B are mutated in non bullous congenital ichthyosiform erythroderma NCIE linked to chromosome 17p13 1 Hum Mol Genet 11 107 113 Jonca N Guerrin M Hadjiolova K Caubet C Gallinaro H Simon M and Serre G 2002 Corneodesmosin a component of epidermal corneocyte desmosomes displays homophilic adhesive properties J Biol Chem 277 5024 5029 Jones P and Simons B D 2008 Epidermal homeostasis do committed progenitors work while stem cells sleep Nat Rev Mol Cell Biol 9 82 88 Jullien D and Barker J N 2006 Genetics of psoriasis JEADV 2
426. rneum chymotryptic enzyme in relation to other markers of epidermal differentiation in a skin explant model Exp Dermatol 9 65 70 269 Elias P Ahn S Brown B Crumrine D and Feingold K R 2002a Origin of the epidermal calcium gradient regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms J Invest Dermatol 119 1269 1274 Elias P M Ahn S K Denda M Brown B E Crumrine D Kimutai L K Komuves L Lee S H and Feingold K R 2002b Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation specific markers J Invest Dermatol 119 1128 1136 Elias P M Crumrine D Rassner U Hachem J P Menon G K Man W Choy M H Leypoldt L Feingold K R and Williams M L 2004 Basis for abnormal desquamation and permeability barrier dysfunction in RXLI J Invest Dermatol 122 314 319 Fartasch M Bassukas I D and Diepgen T L 1993 Structural relationship between epidermal lipid lamellae lamellar bodies and desmosomes in human epidermis an ultrastructural study Br J Dermatol 128 1 9 Fischer J 2009 Autosomal recessive congenital ichthyosis J Invest Dermatol 129 1319 1321 Fischer J Bouadjar B Heilig R Huber M Lefevre C Jobard F Macari F Bakija Konsuo A Ait Belkacem F Weissenbach J Lathrop M Hohl D and Prud homme J F 2001 Mutations in the gene encoding SLURP 1 in Mal de Meleda Hum Mol Genet 10 875 880 Fluhr J W Man M
427. rolle V Defamie V Dessen P Wiliams G Lyons P Rios G Mari B Gulari E Kastner P Gidrol X Freeman T C and 276 Barbry P 2006 An open access long oligonucleotide microarray resource for analysis of the human and mouse transcriptomes Nucleic Acids Res 34 e87 Leclerc E A Hucheng A Mattiuzzo N R Metzger D Chambon P Ghyselinck N B Serre G Jonca N and Guerrin M 2009 Corneodesmosin gene ablation induces lethal skin barrier disruption and hair follicle degeneration related to desmosome dysfunction J Cell Sci Lecuyer C Dacheux J L Hermand E Mazeman E Rousseaux J and Rousseaux Prevost R 2000 Actin binding properties and colocalization with actin during spermiogenesis of mammalian sperm calicin Biol Reprod 63 1801 1810 Lefevre C Audebert S Jobard F Bouadjar B Lakhdar H Boughdene Stambouli O Blanchet Bardon C Heilig R Foglio M Weissenbach J Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2003 Mutations in the transporter ABCA12 are associated with lamellar ichthyosis type 2 Hum Mol Genet 12 2369 2378 Lefevre C Bouadjar B Ferrand V Tadini G Megarbane A Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2006 Mutations in a new cytochrome P450 gene in lamellar ichthyosis type 3 Hum Mol Genet 15 767 776 Lefevre C Bouadjar B Karaduman A Jobard F Saker S Ozguc M Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2004 M
428. romoteurs de 52 g nes exprim s au cours de la diff renciation et leur niveau d expression a t quantifi dans les couches basales et granuleuses par PCR quantitative Parmi 3576 candidats potentiels exprim s par les k ratinocytes granuleux 298 ont t s lectionn s et test s en mettant particuli rement l accent sur l identification de nouveaux facteurs de transcription cruciaux pour la compr hension du programme de diff renciation L expression de 157 g nes dont 94 codant pour des facteurs de transcription a pu tre mise en vidence pour la premi re fois dans l piderme Au total 49 g nes sont surexprim s au cours de la diff renciation et 20 sous exprim s avec notamment plus d un tiers des facteurs de transcription r gul 20 positivement et 17 n gativement Parmi les g nes les plus notables figurent FOXL1 susceptible de r guler n gativement l expression des h paran sulfate prot oglycans GATA4 dont le paralogue GATA3 joue un r le majeur dans la fonction barri re et HOPX exprim au cours de la diff renciation terminale des cellules du cristallin L tude a galement permis de mettre en vidence l expression d autres g nes codant pour des prot ines structurales telle la nouvelle k ratine acide K23 ou encore des prot ines potentiellement impliqu s dans diverses fonctions telles que la signalisation le m tabolisme lipidique la polarit cellulaire et le trafic v siculaire etc L identifica
429. roteases and protease inhibitors is essential to desquamation 46 The inactivation of the pro tease inhibitor cystatin M E gene in mice causes lethality and defects in epidermal cornification 47 Mutations in the SPINK5 gene encoding another protease inhibitor are Analysis of new human lipase genes a Schematic representation of the lipase gene cluster on chromosome 0q23 31 Six lipase genes including the newly described LIPL LIPJ LIPL2 LIPK LIPL3 LIPM and LIPL4 LIPN form a cluster also containing four unrelated genes b Alignment of the protein sequences of the six human lipases from the chromosome 10q23 31 cluster The amino acids of the catalytic triad are boxed The alignment was generated with Multalin software 71 c Hierarchical clustering of human and mouse abhydro lipase gene family members The human LIPA LIPF LIPK LIPM and LIPN but not LIP proteins have clear mouse orthologues lower case gene names The six hypothetical mouse genes found in place of the LIP gene Lipdc 5 form a separate branch of the phylogenetic tree This tree was generated with the Tree Top software 72 Bootstrap values are indicated in red Genome Biology 2007 8 R107 158 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al R107 17 a N g EN e amp a 6 2 N 50 kb v lt L gt gt _ r Human 10q23 31 au
430. rs les cellules souches pidermiques n interviennent pas dans un contexte physiologique seules des cellules prog nitrices EPC au potentiel prolif ratif non limit donneraient naissance z ro une ou deux cellules post mitotiques basales PM B dans des proportions fixes 8 64 8 La vitesse du renouvellement de l piderme ne d pendrait alors que du taux de division des cellules prog nitrices et de la vitesse du transfert vers le compartiment suprabasal PM SB D Dans ce mod le les diff rences de potentiel clonog nique observ es in vitro s expliqueraient par la probabilit non nulle d un arr t pr coce de la prolif ration cas du bas les cellules prog nitrices ne se renouvelant pas dans 8 des divisions Toutefois une tude r cente sugg re que le mod le en EPU avec cellules souches et TA n explique pas la dynamique r elle du renouvellement de l piderme et propose un nouveau paradigme dans lequel les cellules souches ne joueraient pas de r le dans des conditions physiologiques Des cellules prog nitrices au potentiel prolif ratif non limit contrairement au mod le des cellules TA seraient responsables elles seules de l hom ostasie se divisant essentiellement sur un mode asym trique pour donner une cellule post mitotique et une prog nitrice 84 des divisions mais aussi plus marginalement deux prog nitrices 8 ou deux cellules post mitotiques 8 Clayton et al 2007 figure 31B C
431. rs POU Oct et ETS dans la r gulation de nombreux g nes sp cifiques de la diff renciation La famille AP 1 compos e des facteurs Fos c Fos FosB Fra 1 et Fra 2 Jun c Jun JunB et JunD et des cofacteurs Maf et ATF est impliqu e dans la r gulation d un grand nombre de g nes de la diff renciation FLG Jang et al 2000 INV LaPres and Hudson 1996 LOR Jang and Steinert 2002 DSG1 Adams et al 1998 TGM1 Lu et al 1995 KRT10 Maytin et al 1999 Son site consensus est cependant pr sent dans 32 6 des promoteurs de vert br s ce qui met en vidence son caract re hautement ubiquiste Les diff rents membres de cette famille sont exprim s des niveaux variables selon les couches de l piderme figure 53 L tude de la fonction des facteurs AP 1 dans l piderme par inactivation chez la souris est limit e par la redondance partielle entre les diff rents membres de la famille 102 linactivation de c Jun par KO au niveau de l piderme murin a mis en vidence son r le dans la r ponse l EGF mais sans ph notype spontan Zenz et al 2003 Fos B Fra 1 Fra 2 c Jun Jun B Jun D g AO A AO A A j0 z AO A A AO 141 A E AO A A AO 14 0 2 AO A A AO A AS w AO AO A AO A A skin equivalents d8 A A normal epidermis O S signal strength neg weak strong neg weak strong Figure 53 Expression des prot ines AP 1 dans l piderme Mehic et al 2005 La famille AP 2 com
432. s l origine de m tastases On retrouve en particulier des g nes intervenant au niveau de l adh rence cellulaire plakines desmogl ine 3 la diff renciation pidermique transglutaminase 3 involucrine loricrine dermokine SLPI SKALP SPINK5 ALOX12B ABCA12 et la mort cellulaire De nombreux g nes codant pour des prot ines de la matrice extracellulaire et de son remodelage m talloprot ases et inhibiteurs sont pr sents certains tant surexprim s et d autres sous exprim s L analyse de ces 102 g nes pr dictifs du potentiel m tastatique dans 22 nouveaux chantillons a montr une bonne corr lation pour 19 chantillons sans aucun faux 127 n gatif La mise en place de ces nouvelles m thodes d analyse des tumeurs primaires devrait permettre de mieux adapter les traitements aux patients 3 2 Etudes du transcriptome dans un contexte physiologique 3 2 1 Transcriptome et cicatrisation Dans le but d tudier les modifications pr coces de l expression g nique en r ponse a une blessure Cole et collaborateurs ont mis au point un protocole original pour l tude de la cicatrisation in vivo chez l homme Dans le cadre d une mammoplastie 4 blessures adjacentes sont r alis es par biopsie punch de 8mm dans une r gion destin e a l ex r se Le chirurgien commence par l autre sein et organise l op ration de telle sorte que la moiti de la r gion bless e soit excis e au bout de 30 min
433. s G 2004 Capturing and profiling adult hair follicle stem cells Nat Biotechnol 22 411 417 Mortazavi A Williams B A McCue K Schaeffer L and Wold B 2008 Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA Seq Nat Methods 5 621 628 Nachat R Mechin M C Takahara H Chavanas S Charveron M Serre G and Simon M 2005 Peptidylarginine deiminase isoforms 1 3 are expressed in the epidermis and involved in the deimination of K1 and filaggrin J Invest Dermatol 124 384 393 Nair R P Duffin K C Helms C Ding J Stuart P E Goldgar D Gudjonsson J E Li Y Tejasvi T Feng B J Ruether A Schreiber S Weichenthal M Gladman D Rahman P Schrodi S J Prahalad S Guthery S L Fischer J Liao W Kwok P Y Menter A Lathrop G M Wise C A Begovich A B Voorhees J J Elder J T Krueger G G Bowcock A M and Abecasis G R 2009 Genome wide scan reveals association of psoriasis with IL 23 and NF kappaB pathways Nat Genet 41 199 204 Nair R P Stuart P E Nistor I Hiremagalore R Chia N V Jenisch S Weichenthal M Abecasis G R Lim H W Christophers E Voorhees J J and Elder J T 2006 Sequence and haplotype analysis supports HLA C as the psoriasis susceptibility 1 gene Am J Hum Genet 78 827 851 Nakamura S Yang C S Sakon N Ueda M Tougan T Yamashita A Goto N Takahashi K Yasunaga T Ikuta K Mizutani T Okamoto
434. s Grainyhead dans la r gulation des jonctions cellulaires et l tablissement d une fonction barri re para t donc conserv dans le r gne animal bien que les cibles directes diff rent 2 239 9 A GATA3 GATA3 appartient a la famille des GATA binding factors qui comprend 6 membres chez l homme et est impliqu e notamment dans l h matopoi se GATA3 est GATA37 prostaglandin endoperoxide synthase 1 1 acylglycerol 3 phosphate O acyltransferase 5 sphingosine 1 phosphate phosphatase 1 aldehyde dehydrogenase family 1 subfamily A7 fest N acylsphingosine amidohydrolase 3 fall BB alcoho dehydrogenase 1 Si sulfotransferase family cytosolic 2B member 1 arachidonate lipoxygenase 3 Elongation of very long chain fatty acids like 1 Elongation of very long chain fatty acids like 4 Lipase like ab hydrolase domain containing 3 EH arachidonate 12 lipoxygenase 12R type Tn Lipase member H arachidonate 12 lipoxygenase jii Sphingomyelin phosphodiesterase 3 BEE lipase hormone sensitive BB Elongation of very long chain fatty acids like 3 BB Elongation of very long chain fatty acids like 6 BEBE epidermal 12 S lipoxygenase a Lipase like ab hydrolase domain containing 2 NE hornerin MMM icin a BE keratin 1 a involucrin BR ice 28 LCE 2C LCE 1B BM cE BR cE 34 ME cc sa keratin 13 keratin 16 BR cepetin M tabolisme lipidique Diff renciation epidermique Figure 59 Ina
435. s a representative stage for the WT graft whereas 4 6 8 and 9 weeks after grafting are shown for the KO graft A Macroscopic appearance of the transplanted skin Grafts from KO mice develop few hairs which become rarer and finally disappear The skin is red forms a scab and looks like a chronic healing area Sections of WT or KO skin grafted onto nude mice were stained with hematoxylin and eosin H amp E B or processed for immunohistochemistry with an antibody specific to K6 C Morphology of the grafted skin from WT mice is similar to that of adult mice skin From 4 to 8 weeks the KO grafted epidermis becomes acanthotic and develops prominent papillomatosis The increasing K6 expression in epidermal keratinocytes confirms its hyperproliferative state The KO grafted epidermis also develops prominent hyperkeratosis and parakeratosis In the KO grafted skin hair follicles become cystic then progressively disappear They are totally absent by 9 weeks after grafting Inflammatory infiltrate in the dermis from KO skin is obvious by 4 weeks after grafting and diminishes in the course of the following weeks Nine weeks after grafting only a scab persists at the place of the KO grafted skin K6 is only detected at the border of the graft where the epidermis of the nude mice is thicker denoting its hyperproliferative state In B and C the graft border is indicated with a vertical arrow D Histological higher magnifications corresponding to the areas boxed
436. s la r gulat iqu s l imp Table 2 FT V Adoue 2008 ese th dermique ion pi t rencia 2 ff i fondamentales de la d 104 2 2 3 2 2 Facteurs d expression tissulaire restreinte A ce jour seul un petit nombre de facteurs de transcription non ubiquistes ont t identifi s pour leur r le dans les tapes tardives de la diff renciation et ou la mise en place de la fonction barri re de l piderme Il s agit des facteurs DLX3 Distal less homeobox 3 KLF4 Kr ppel like factor 4 GRHL3 Grainyhead like 3 GATA3 GATA binding protein 3 et BLIMP1 PRDM1 PR domain containing 1 with ZNF domain 20 92 21 DLX3 Le facteur DLX3 appartient a la famille des facteurs de transcription a hom odomaine apparent s au g ne distal less dil identifi chez D melanogaster Cette famille comporte six membres chez les mammif res r partis en tandem sur trois loci distincts DLX1 et DLX2 en 2q31 1 DLX3 et DLX4 en 17q21 33 DLX5 et DLX6 en 7q21 3 Le role du facteur de transcription DLX3 dans la morphogen se et la physiologie de l piderme et de ses annexes a t mis en vidence gr ce plusieurs mod les murins Dans l piderme murin l expression de Dlx3 est restreinte aux couches diff renci es de l piderme essentiellement la couche granuleuse ainsi que dans le follicule pileux figure 54 De fait des souris exprimant ce facteur de fa on ectopique dans la couche basal
437. s m canismes mis en jeu Enfin la prot ine s cr t e SLURP 1 est galement impliqu e dans la signalisation calcique Arredondo et al 2005 Chez l homme des mutations dans le g ne SLURP1 sont ainsi associ es au Mal de Meleda OMIM 248300 une maladie transmise sur le mode autosomique r cessif et caract ris e par une k ratodermie palmoplantaire inflammatoire d bordant sur la face dorsale des mains et des pieds fr quemment associ e d autres signes cliniques tels qu une brachydactylie et des anomalies des ongles Fischer et al 2001 Le Mal de Meleda constitue le premier exemple de k ratodermie palmoplantaire due des mutations dans un g ne codant une prot ine s cr t e SLURP 1 a une action r gulatrice aussi bien sur l hom ostasie pidermique que sur l inflammation qui passe par la potentialisation du signal calcique induit par le r cepteur nicotinique l ac tylcholine ACh a7 nAChR Si 98 plusieurs types de r cepteurs nicotiniques nAChR et muscariniques mAChR sont pr sents dans l piderme le r cepteur a7 nAChR est essentiellement exprim dans le haut de la couche pineuse et la couche granuleuse or l ac tylcholine produite par les k ratinocytes s accumule particuli rement dans la couche granuleuse pour revue Kurzen and Schallreuter 2004 L activation du r cepteur a7 nAChR favorise l entr e de calcium dans les cellules favorisant la diff renciation k ratinocytaire in
438. s notre seconde tude Mattiuzzo et al 2009 le gene codant la diphosphomevalonate decarboxylase MVD R 4 8 et celui codant l emopamil binding protein une st rol isom rase EBP R 1 5 De nombreuses mutations du g ne EBP sont associ es a la chondrodysplasie ponctu e dominante li e l X de type 2 CDPX2 OMIM 302960 une maladie humaine caract ris e notamment par une hyperk ratose stri e et des d fauts capilaires Derry et al 1999 MVD code pour l enzyme ultime de la voie du m valonate en amont d EBP dans la synth se des st rols et contrairement a EBP est surexprim dans les k ratinocytes granuleux Bien que jamais d crit dans l piderme MVD semble tre un bon candidat pour des g nodermatoses li es a un d faut de synth se du cholest rol IL est int ressant de noter que Radoja et ses collaborateurs ont d crit la surexpression dans les k ratinocytes granuleux de plusieurs autres g nes li s a la synth se des st rols tels que SC4MOL DHCR7 et OSBPLS tandis que d autres g nes IDI1 et HMGCR sont surexprim s dans la fraction suprabasale mais pas sp cialement dans les k ratinocytes granuleux Au final ces donn es montrent que les g nes impliqu s dans le m tabolisme du cholest rol ne sont pas n cessairement tous surexprim s ou peuvent l tre diff rents stades de la diff renciation En plus du cholest rol les lipides s cr t s sont compos es de 20 30 de sphingolipides essent
439. s regulating epithelial stratification Annu Rev Cell Dev Biol 23 93 113 Kottke M D Delva E and Kowalczyk A P 2006 The desmosome cell science lessons from human diseases J Cell Sci 119 797 806 Kouzu Y Uzawa K Koike H Saito K Nakashima D Higo M Endo Y Kasamatsu A Shiba M Bukawa H Yokoe H and Tanzawa H 2006 Overexpression of stathmin in oral squamous cell carcinoma correlation with tumour progression and poor prognosis Br J Cancer 94 717 723 Kudryavtseva E I Sugihara T M Wang N Lasso R J Gudnason J F Lipkin S M and Andersen B 2003 Identification and characterization of Grainyhead like epithelial transactivator GET 1 a novel mammalian Grainyhead like factor Dev Dyn 226 604 617 Kuramoto N Takizawa T Takizawa T Matsuki M Morioka H Robinson J M and Yamanishi K 2002 Development of ichthyosiform skin compensates for defective permeability barrier function in mice lacking transglutaminase 1 J Clin Invest 109 243 250 Kurzen H and Schallreuter K U 2004 Novel aspects in cutaneous biology of acetylcholine synthesis and acetylcholine receptors Exp Dermatol 13 Suppl 4 27 30 Lai Cheong J E Arita K and McGrath J A 2007 Genetic diseases of junctions J Invest Dermatol 127 2713 2725 Lampe M A Burlingame A L Whitney J Williams M L Brown B E Roitman E and Elias P M 1983 Human stratum corneum lipids characterization and regio
440. sceptibles d tre sp cifiques des k ratinocytes granuleux Parmi eux 73 codant pour des prot ines potentiellement impliqu es dans la fonction barri re ont t test s par RT PCR quantitative qRT PCR la moiti correspond de nouveaux marqueurs tardifs de la diff renciation parmi lesquels des prot ases des inhibiteurs de prot ases et des prot ines impliqu es dans le m tabolisme et le transport des lipides Deux membres du Complexe de Diff renciation Epidermique EDC l Ifapsoriasine et une nouvelle LCE ainsi qu un r trog ne de la Prosaposine sont d crits pour la premi re fois Au final l emploi coupl d une base de donn es de s quencage et de la qRT PCR s av re efficace pour identifier les g nes exprim s tardivement qui pourraient permettre une meilleure compr hension de la physiologie et des pathologies pidermiques 142 Research Large scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function Eve Toulza Nicolas R Mattiuzzo Marie Florence Galliano Nathalie Jonca Carole Dossat Daniel Jacob Antoine de Daruvar Patrick Wincker Guy Serre and Marina Guerrin Addresses UMR 5165 Epidermis Differentiation and Rheumatoid Autoimmunity CNRS Toulouse III University IFR 30 INSERM CNRS Toulouse III University CHU all es Jules Guesde 31073 Toulouse France Genoscope and CNRS UMR 8030 rue Gaston Cr mieux 91057 Evry France Centre de Bio
441. scopie lectronique les k ratinocytes granuleux apparaissent moins aplatis que dans un piderme normal et le nombre ainsi que le volume des grains de k ratohyaline est augment mais aucune anomalie dans la s cr tion des k ratinosomes et la formation des lamellae lipidiques n est visible La recherche des cibles Blimp 1 a permis d identifier 250 g nes diff rentiellement r gul s pour la plupart surexprim s dans l piderme des souris KO sugg rant que Blimp 1 agit plut t comme un r presseur transcriptionnel Parmi ces cibles il est int ressant de noter que plusieurs g nes codant notamment pour le transporteur d osmolytes SLC6A12 l aquaporine AQP9 ou encore le facteur de transcription NFATS cible directe confirm e par ChIP sont normalement impliqu s dans la r gulation de l osmolarit cellulaire Les auteurs sugg rent que le retard dans l tablissement de la barri re l hyperk ratose des infundibula et surtout accumulation de k ratinocytes granuleux et de corn ocytes d un volume anormalement lev s soient li s a l absence de r pression de ces g nes de l quilibre osmotique Cette r pression favoriserait dans un piderme normal la perte tr s importante de volume cellulaire constat e entre les couches pineuses et corn es Parmi les autres cibles directement inhib es par Blimp 1 les auteurs ont identifi plusieurs g nes codant pour des facteurs de transcription notamment Fosli Fra1 et Pr
442. scrit donn d pendra donc principalement de sa s quence et non de son abondance La production de minibanques d EST avec des amorces diff rentes ainsi que la purification sur gel a posteriori ajoutent encore a cette normalisation conceptuelle De fait une normalisation du nombre de s quences par rapport a labondance relative des messagers a t d montr e Dias Neto et al 2000 Cette technique permet en outre la production de s quences distribu es statistiquement selon une courbe de Gauss centr e au milieu de la s quence de ARNm donc correspondant en majorit a sa partie codante Elle est ainsi compl mentaire des techniques classiques de s quencage en 5 et en 3 pour l obtention de segments contigus contigs d EST et pour la mise en vidence d pissages alternatifs affectant le cadre de lecture et par cons quent la prot ine produite Sakabe et al 2003 L amplification des s quences se faisant au hasard parmi toutes les mol cules d ARN disponibles une attention toute particuli re doit tre port e a la purification des ARNm poly ad nyl s qui ne constituent en fait que 1 a 5 des ARN cellulaires Une tude par la technique des ORESTEs du transcriptome d ARNm poly ad nyl s purifi s partir de pr l vements de tumeurs mammaires humaines a montr que parmi 10 000 s quences environ 10 correspondent toutefois des contaminations ribosomiques mitochondriales et bact riennes Dias Neto et al 2000
443. ser on Human thg18 http ecrbrowser dcode orq 29 275 bps gene or position chrN from to ECR ECR Layer Coordinate g i Parameters Graph length similarity height system We ichr1 ae AEG change smooth 100 70 55 relative GENOME ALIGNMENT Align your sequence to a genome RefSeq Genes lt lt lt lt lt CEB OT X2 sa E 100 fr2 50 100 xenTro2 50 HIOTX2 100 galGal3 50 100 monDom4 50 Ai 100 mm9 50 100 canFam2 50 Per rare Set Ye eee way 100 rheMac2 50 BC041486 GNF Expression Atlas 2 gnf1h02829 x _at gnf1h00384 at Banfih02828 at SNPs 873035 li LLARI Pilot ot td Hot blu dl RL Irs 11851878 Irs 12436123 15113774 Flip move Left Right zoomin 1 54 3x 10x zoom out 1 5x 3x 10 Figure 23 Outils du portail dcode org Recherche de r gions conserv es sur le locus du g ne OTX2 et identification de TFBS dans le promoteur proximal x 32 d identifier plus facilement de des candidats valider exp rimentalement figure 24 Ces techniques in silico pr sentent malgr tout plusieurs limites qui sont abord es dans la partie Discussion 10 D catenins Cadherin 3 5 FAT j bee i EL 1 E 5 i Ig Superfamily Te al Nephrin NEPH1 3 i 5 See Bon 10 LJ l a N fe 10 Pin ps a 20 a Figure 24 Analyse de promoteur et recherche de mod les de r gulation Cohen et al 2006 L analyse par comparaison in
444. si exclusivement du catabolisme des glyc rophospholipides constituants principaux de la membrane plasmique des cellules par des phospholipases A2 Ces enzymes hydrolysent les liaisons ester des glyc rophospholipides lib rant un lysophospholipide et un acide gras Ainsi les glyc rophospholipides disparaissent progressivement et ne sont plus d tect s qu l tat de traces au niveau de la couche corn e L application topique d inhibiteurs des phospholipases A2 entra ne chez la souris une perturbation de la fonction barri re restaur e par l application d acides gras libres Mao Qiang et al 1995 Plusieurs phospholipases A2 s cr t es ont t identifi es dans l piderme mais seules sPLA2 IB IIF et X sont sp cifiques des k ratinocytes granuleux Leur fonction pr cise n a pas encore t clairement tablie Haas et al 2005 La prot ine ABHD5 CGI 58 de 76 la famille des alpha b ta hydrolases pourrait galement tre impliqu e dans la production d acides gras en servant de coactivateur des triglyc ride lipases pour revue Yamaguchi and Osumi 2009 Des mutations dans ce g ne sont associ es au syndrome de Chanarin Dorfman OMIM 275630 caract ris notamment par accumulation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme de nombreux tissus Lefevre et al 2001 Caux et al 2004 Ben Selma et al 2007 Enfin des mutations dans le g ne FATP4 codant pour un transporteur d acides gras ont
445. sistance of the desmosomes It has also been proposed that CDSN contributes to the structural modifications that characterize the transformation of desmosomes into corneodesmosomes Guerrin et al 1998 or prevents premature desquamation by protecting desmosomal proteins from proteolysis Lundstr m etal 1994 Inactivation of mouse Cesa by mutational insertion was very recently reported to induce neonatal death Matsumoto et al 2008 and defective corncodesmosome formation was proposed to be responsible for stratum comeum detachment We developed two epidermal selective Cdsn d ficient mouse models Somatic Cdsn inactivation in mouse epidermis was achieved using human keratin 14 K 4 promoter driven Cre mediated deletion Li et al 2001 Temporally controlled Casi deletion in epidermal keratinocytes was achieved using a tamoxifen inducible Cre recombinase under the control of the same promoter Li et al 2000 Our results confirmed the vital role of CDSN in newborns We also show that CDSN function is essential in adult skin and that the functional defect lies in an impaired resistance of corncodesmosomes to mechanical stress This supports the idea that CDSN mainly acts as an adhesive protein Results Generation of Cdsn deficient mice To investigate the role of CDSN in the barrier function and physiology of the hair follicle we developed Cdsn deficient mice by using A 4 promoter driven Cre mediated oxP recombination Fig LA The hu
446. site de liaison est pr sent dans le promoteur proximal du g ne Tgm1 Une tude ult rieure avec une nouvelle lign e de souris invalid es pour Grhl3 a confirm le ph notype cutan et par comparaison d piderme de souris sauvages ou KO sur puce Affymetrix permis d identifier de nombreuses cibles directes ou indirectes de Grhl3 et en particulier un grand nombre de g nes du locus de diff renciation pidermique Yu et al 2006 figure 58C D La recherche de sites de fixation pour Grhl3 dans les promoteurs de ces genes sous ou sur exprim s a d sign une dizaine de cibles directes parmi lesquelles Tgm1 mais aussi Sult2b1 ou le g ne de la r p tine Enfin les auteurs ont montr une interaction physique in vitro et fonctionnelle in vivo entre Grhl3 et Lmo4 un facteur de transcription lui aussi exprim dans l piderme a E14 5 puis restreint la couche basale de l piderme partir de E17 5 L inactivation de ce g ne n entraine pas elle seule de ph notype pidermique mais provoque un trouble majeur de la diff renciation dans des souris d j d ficientes pour Grhl3 avec une quasi absence de couche corn e E18 5 Il est int ressant de noter que les deux autres facteurs de la famille Grhli et Grhl2 sont galement exprim s dans l piderme murin au cours du d veloppement d s E10 5 et E8 5 respectivement L expression de Grhl1 persiste chez l adulte dans les couches suprabasales de l piderme inter
447. sponsables de la pigmentation du poil ou du cheveu et des cellules prog nitrices impliqu es dans le renouvellement des parties 57 sup rieures Les portions sup rieures du follicule pileux se d composent en gaine pith liale externe qui est en continuit directe avec l piderme interfolliculaire et gaine pith liale interne compos e de plusieurs feuillets dont les cellules subissent une cornification asynchrone selon les couches Ce processus est comparable celui qui a lieu au niveau des k ratinocytes granuleux de l piderme interfolliculaire bien que les programmes de diff renciation diff rent par l expression de marqueurs sp cifiques du follicule Enfin les cellules de la tige pilaire cuticule cortex et medulla jouent un r le dans les propri t s m caniques du poil et sont cornifi es au niveau de la cuticule o elles donnent naissance au poil proprement dit Un ph nom ne de cornification comparable a galement lieu au niveau de la matrice des ongles o les k ratinocytes se diff rencient pour former la plaque de l ongle partie morte 2 2 La diff renciation k ratinocytaire 224 Aspects morphologiques L piderme est un tissu en perp tuel renouvellement la desquamation des corn ocytes au niveau de la surface de l piderme est compens e par la prolif ration des k ratinocytes de la couche basale ce qui assure l hom ostasie de l piderme Le Corn ocyte Cellule transition
448. ssu ne sont que partiellement d crits a ce jour 220 Prot ines structurales Parmi les prot ines structurales nouvellement d crites figurent l ifapsoriasine IFPS Situ sur le locus de l EDC 1q21 3 entre les g nes FLG et CRNN cornuline le g ne IFPS a t renomm e FLG2 en raison de la composition en acides amin s de la prot ine pr dite proche de celle de la filaggrine Comme les autres membres de la famille fused laquelle il appartient compos e des g nes FLG TCHH RPTN HRNR et CRNN le g ne FLG2 est compos de trois exons comportant un cadre ouvert de lecture de grande taille gt 7kb qui code pour une prot ine pr dite de 2391 acides amin s contre 4061 pour la filaggrine riche en s rine 22 glycine 20 histidine 10 et glutamine 10 La prot ine pr dite comporte plusieurs domaines caract ristiques des prot ines fused un domaine N terminal S100 suivi d un domaine EF hand de liaison au calcium puis un large domaine constitu de deux s ries de r p titions de 75 77 acides amin s 9 r p titions de type A et 14 de type B figure 64 Si la prot ine pr dite comporte dans son ensemble une faible homologie avec les autres prot ines fused les r p tions de type A sont toutefois aA eg Sg SPP HOES EE SHPHESS se Se ee Spacer 1 Spacer 2 CECL EEC Sa A Ei at Sh D M j aj fn ie 7 a a H i C9 T a En 1 j W o EG 7 7 oS Figure 64 Stru
449. ssure la majorit des aspects de la fonction barri re de l piderme gr ce aux remaniements importants de 72 la cornification et aux nouvelles propri t s m caniques et physico chimiques qui en mergent Bien qu tant un processus de mort cellulaire programm e la cornification se distingue de l apoptose par la persistance des cellules mortes ph nom ne galement constat au cours d une autre mort cellulaire programm e la d nucl ation des cellules pith liales du cristallin cf revue Yan et al 2006 qui la aussi permet l mergence de nouvelles propri t s ici optiques que les cellules vivantes ne peuvent assurer Ainsi la cornification ne se r sume pas a la simple disparition du noyau et autres organites mais permet surtout de former une couche de cellules imperm able de par la formation des lamellae lipidiques intercorn ocytaires mais aussi extr mement r sistante et coh sive de par la formation de nouvelles structures matrice fibreuse et enveloppe corn e ou via le renforcement de structures existantes transformation des desmosomes en corn odesmosomes 2 2 2 2 1 Imperm abilit L piderme constitue une double barri re dans le sens o son imperm abilit concerne la fois la sortie de substances eau ions etc mais aussi l entr e substances toxiques etc Deux structures distinctes les lamellae lipidiques intercorn ocytaires et les jonctions serr es de la
450. sts mais cette correction est trop s v re dans le cas de donn es de puces le nombre de tests tant de plusieurs milliers Une technique r cente qui tend de plus en plus remplacer le test t de Student consiste calculer le taux de fausse d couverte ou FDR False Discovery Rate m thode d crite initialement par Benjamini et Hochberg en 1995 Reiner et al 2003 Strimmer 2008 Le FDR correspond a la proportion attendue de faux positifs parmi les g nes d clar s positifs par le test selon la valeur du seuil a ce qui permet de d terminer le seuil a ad quat en fonction de la distribution des p values du test de Student La m thode de calcul la 33 Vrais positifs p value 0 1 r sa rr PT rrr reneernepeeeeennee q 5 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151 120 1251 1301 Rang 569 g nes accept s 1045 g nes accept s 1221 g nes accept s FDR 5 FDR 10 FDR 20 Figure 14 Exemple de la d termination du nombre de g nes pour lesquels Ho est rejet e en fonction du FDR souhait m thode de Benjamini Hochberg Dans cet exemple 1346 g nes ont un ratio gt 2 ou lt 0 5 Les g nes sont class s par ordre croissant de p values d terminant leur rang i Tant que les p values restent inf rieures taux de FP souhait x rang i 1346 lignes pointill es Ho est rejet e et les g nes sont d clar s significativement r gul s Pour un taux de
451. t de d velopper un outil permettant de quantifier de fa on fiable le niveau d expression d un AM NW NI NWN grand nombre de g nes simultan ment parall lisme a l origine de l emploi du terme array Toutes les VIVA _ puces a ADN reposent sur le m me m canisme figure VV V VW VV NAN lt gt NV MA NN 3 celui de fixer sur un support un grand nombre de sondes sous la forme de d p ts distincts Figure 3 Principe de l hybridation de cibles marqu es avec des sondes immobilis es Dans le cas de deux conditions marqu es par deux fluorochromes distincts la co hybridation est g n ralement non comp titive gauche seuls les g nes tr s fortement exprim s saturant alors le support droite Dans les deux cas le rapport des fluorescences est proportionnel au ratio d expression 19 compl mentaires des acides nucl iques que l on souhaite analyser g n ralement des ADNc ou de l ADN g nomique plus rarement des ARN En plus d une simplification et transposition grande chelle du principe du Northern blot cette technique s en distingue donc par le fait que les sondes sont fix es et non marqu es alors que les cibles sont marqu es et en solution Une autre particularit de la technique des puces ADN est le fait que les r sultats bruts ne sont pas directement analysables et n cessitent une tape cruciale de normalisation Plusieurs techniques de normalisat
452. t belong to a variety of functional categories Table 1 Transcription factors represented 170 of 298 candidate genes with 94 detected in the epidermis for the first time and 20 overexpressed in GKs Therefore TFs constituted the major category of newly identified genes and displayed the highest ratios except for KR7T23 Eight of the ten TF genes with a ratio greater than 20 had less than 150 ESTs listed in the UniGene database suggesting a restricted expression pattern We describe for the first time the expression of five forkhead family members in the epidermis FOXL1 and FOXC7 had high ratios R 24 and 22 7 respectively FOXJ3 and FOXP1 were equally detected in all epidermal layers R 0 7 and FOXK2 was preferentially expressed in the basal layer R 0 37 It is to note that mutations in FOXN7 cause severe T cell immunodeficiency accompanied by the nude phenotype in mice or alopecia and nail dystrophy in humans OMIM 601705 An epidermal specific deletion of GATA3 in mice leads to perinatal lethality caused by differentiation defects especially in lipid synthesis Here we show for the first time that GATA4 is also expressed in GKs with an expression ratio of 43 when compared to basal 177 keratinocytes Moreover we evidenced the expression of ZFPM2 an inhibitor of GATA 4 function in cardiomyocytes preferentially in basal keratinocytes and three potential GATA4 target genes ANKRD1 NFE2 and HOPX overexpressed during differen
453. t de fond de l hybridation figure 8 Les donn es intensit s de fluorescence sont ensuite g n ralement transform es en donn es logarithmiques condition facilitant la normalisation et les tests statistiques figure 9 Number of Features Number of Features D 1000 Intensit Cy5 4000 8000 0 3000 F635 Median B635 l 19000 15000 Cy5 Raw Intensity gt Cy5 Log Base 2 Intensity Scatter plot F532 Median B532 Intensit Cy3 20000 Ratio Figure 9 Transformation des donn es en valeurs logarithmiques Apr s la soustraction du bruit de fond les donn es ont une distribution non sym trique la plupart des intensit s tant faibles Le passage en valeurs logarithmiques log2 ou log10 permet d obtenir une distribution sym trique par rapport la m diane des intensit s D apr s Microarray Bioinformatics Dov Stekel D Intensity A Figure 10 Scatter plot vs MA plots Ces deux types de graphes sont couramment employ s pour visualiser des donn es de puces avant ou apr s normalisation Le scatter plot permet de comparer les intensit s dans les deux canaux apr s soustraction du bruit de fond Le MA plot permet de visualiser le ratio M en fonction de l intensit moyenne A soit M log Cy5 Cy3 log Cy5 log Cy3 et A log Cy3 log Cy5 2 log V Cy3 x Cy5 D apr s http www mathworks com 29 L tape suiva
454. t enriched Kruppel like factor expressed during growth arrest J Biol Chem 271 20009 20017 Shim J H Xiao C Paschal A E Bailey S T Rao P Hayden M S Lee K Y Bussey C Steckel M Tanaka N Yamada G Akira S Matsumoto K and Ghosh S 2005 TAK1 but not TAB1 or TAB2 plays an essential role in multiple signaling pathways in vivo Genes Dev 19 2668 2681 Shulenin S Nogee L M Annilo T Wert S E Whitsett J A and Dean M 2004 ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency N Engl J Med 350 1296 1303 Simon M Haftek M Sebbag M Montezin M Girbal Neuhauser E Schmitt D and Serre G 1996 Evidence that filaggrin is a component of cornified cell envelopes in human plantar epidermis Biochem J 317 Pt 1 173 177 Simon M Jonca N Guerrin M Haftek M Bernard D Caubet C Egelrud T Schmidt R and Serre G 2001 Refined characterization of corneodesmosin proteolysis during terminal differentiation of human epidermis and its relationship to desquamation J Biol Chem 276 20292 20299 284 Singh S K Nizard C Kurfurst R Bonte F Schnebert S and Tobin D J 2008 The silver locus product Silv gp100 Pmel17 as a new tool for the analysis of melanosome transfer in human melanocyte keratinocyte co culture Exp Dermatol 17 418 426 Skerrow C J Clelland D G and Skerrow D 1989 Changes to desmosomal antigens and lectin binding sites duri
455. t knowledge on the gene repertoire expressed by keratinocytes remains largely fragmentary Among the approximately eight million human expressed sequence tags ESTs from the dbEST division of the GenBank database only 1 210 are annotated as originat ing from the epidermis although these are in fact derived from cultured keratinocytes which do not fully recapitulate the complex in vivo differentiation program In this article we describe the results of a large scale cDNA sequencing project on GKs of healthy human skin purified by a new method In order to characterize genes expressed at a low level and to avoid the repetitive sequencing of highly expressed ones we used the ORESTES open reading frame EST method to prepare a large series of small size cDNA libraries using arbitrarily chosen primers for reverse tran scription RT and PCR amplification 9 The sequencing of about 25 000 clones has produced a list of 3 387 genes expressed by GKs Some of them analyzed by quantitative RT PCR were shown to be expressed in a cell specific man ner This effort resulted in a large number of novel candidate genes of importance for the epidermis barrier function and the etiology of genodermatoses Results Purification of human granular keratinocytes As a first step in this transcriptome project we devised a method to purify GKs Iterative incubations of pieces of human epidermis with trypsin were performed to give three suspended cell fract
456. t pu tre confirm s en PCR quantitative I convient de distinguer ceux qui n ont pu tre quantifi s de facon fiable et ceux qui affichent des ratios contradictoires Pour les genes non quantifiables il peut s agir d un probleme de sensibilit de la PCR quantitative et ou d amorces peu adapt es M me si la qRT PCR est th oriquement tr s sensible certains g nes identifi s formellement par la m thode des ORESTEs n ont jamais pu tre quantifi s m me en choisissant diff rents couples d amorces Il est probable que plusieurs candidats s lectionn s partir des donn es de puces n aient pu tre quantifi s pour la m me raison D une fa on globale sur 298 candidats s lectionn s toutes sources confondues 216 72 5 ont pu tre amplifi s par PCR classique et 157 par qRT PCR confirmation par s quen age la sp cificit et ou la sensibilit tant insuffisante pour les autres g nes Il est galement possible que certains g nes d tect s sur puces ne soient pas r ellement exprim s afin de ne pas analyser les d p ts dont la fluorescence n est pas significative un seuil a t arbitrairement fix pour chaque lame une valeur qui est gale au bruit de fond 2 x cart type La distribution des intensit s pour le bruit de fond ob issant une loi normale pr s de 98 des d p ts n gatifs sont ainsi th oriquement limin s de l analyse avec un risque limit d carter des d p ts
457. t that in vivo CDSN reinforces cohesion by its own adhesive properties On the other hand adhesion provided by glycine loop domains has been suggested to mediate reversible and constantly adjustable intermolecular links similar to Velcro Steinert et al 1991 Consistent with this CDSN could give the junction the elasticity essential to prevent breaking as soon as the cell envelope rigidifies Unlike the recent Cds inactivation study Matsumoto et al 2008 our ultrastructural analysis did not show any significant differences in the number of transitional desmosomes between WT and KO neonates Moreover the electron density of the corneodesmosomes appeared unchanged Fig 5 Thus CDSN does not seem indispensable for the morphogenesis of corneodesmosomes but appears essential to their function as adhesive structures Our Cdsn KO mice developed a phenotype that was very close to that displayed by Spinks mice deficient for the serine protease inhibitor Lektl These mice exhibited fragile stratum corneum and perinatal death due to dehydration with detachment of the stratum corneum from the subjacent epidermis layers and split desmosomes Yang et al 2004 Descargues et al 2005 It was proposed that in the absence of Lektl the premature proteolysis of CDSN or Dsg contributed significantly to desmosomal fragility epidermal detachment and skin barrier defects It is interesting to note that in both models the breaking points mainly
458. taining cells LRC a permis de localiser la niche majeure que constitue le bulge un renflement cellulaire en p riph rie du follicule pileux pr s du site d attachement des muscles arrecteurs du poil en dessous des glandes s bac es Cotsarelis et al 1990 A After chase Early Anagen TRE HIECFE Before chase Doxyeyeline fed to mice for 4 8 weeks chase hf nfz PR bettas pee Brdu K14 Brdu Ki67 KERNS ic Figure 29 Identification des LRC dans l piderme murin in vivo A Des souris re oivent des injections r p t es de BrdU puis l piderme de la queue est pr lev apr s 2 jours gauche ou 70 jours droite et marqu avec des anticorps anti BrdU vert Le marquage intense du bulbe ne persiste pas mais des LRC sont visibles au niveau du bulge BG ainsi que dans l piderme interfolliculaire fl ches Braun et al 2003 B Des souris transg niques K5 tetVP16 TRE H2BGFP sont soumises a un traitement prolong a la doxycycline pour teindre l expression de l histone coupl e la GFP Seules les LRC conservent un niveau de fluorescence lev confirmant leur pr sence au niveau du bulge dans toutes les phases du cycle pilaire Tumbar et al 2004 Les cellules souches pr sentes dans le bulge sont en outre capables de se diff rencier en plusieurs lignages cellulaires ainsi une LRC unique isol e du bulge par FACS H2B GFP cultiv e puis greff e sur une sou
459. tation du VDRE bloque uniquement la r ponse au 1 25 OH 2D Ng et al 2000 Bikle et al 2002 Ca Cat Ca Receptor CaRE AP1 E a involucrin TG ao a TaS Loricrin CE Figure 51 Synergie entre l action du calcium et de la vitamine D3 Bikle et al 2004 L ensemble de ces r sultats souligne la capacit du 1 25 0H D renforcer l action du calcium au cours de la diff renciation bien que la vitamine D ne soit pas strictement requise pour la diff renciation pidermique En effet des souris d ficientes pour le VDR pr sentent un rachitisme et une alop cie mais pas de d faut majeur de la diff renciation pidermique malgr une diminution des niveaux d expression de INV FLG LOR ainsi qu une disparition des granules de k ratohyaline Xie et al 2002 Ce ph notype rappelle celui chez l homme du rachitisme d pendant de la vitamine D de type II OMIM 277440 lui aussi 100 g n ralement associ a une alop cie sans autre manifestation pidermique Toutefois certains alleles du g ne VDR semblent tre plus rarement trouv s chez les personnes atteintes de psoriasis et tre associ s une meilleure r ponse au calcipotriol un d riv de la vitamine D Halsall et al 2005 2 2 3 L3 Voie de l acide arachidonique L acide arachidonique est un acide gras naturellement pr sent la membrane plasmique sous la forme de phospholipide et lib r sous l action des phosph
460. ted epidermis and normal human skin transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis Exp Dermatol 11 59 74 Berthou C Michel L Soulie A Jean Louis F Flageul B Dubertret L Sigaux F Zhang Y and Sasportes M 1997 Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense J Immunol 159 5293 5300 Bertin J Wang L Guo Y Jacobson M D Poyet J L Srinivasula S M Merriam S DiStefano P S and Alnemri E S 2001 CARD11 and CARD14 are novel caspase recruitment domain CARD membrane associated guanylate kinase MAGUK family members that interact with BCL10 and activate NF kappa B J Biol Chem 276 11877 11882 Bickenbach J R 1981 Identification and behavior of label retaining cells in oral mucosa and skin J Dent Res 60 Spec No C 1611 1620 Bikle D D Ng D Oda Y Hanley K Feingold K and Xie Z 2002 The vitamin D response element of the involucrin gene mediates its regulation by 1 25 dihydroxyvitamin D3 J Invest Dermatol 119 1109 1113 264 Bikle D D Oda Y and Xie Z 2004 Calcium and 1 25 OH 2D interacting drivers of epidermal differentiation J Steroid Biochem Mol Biol 89 90 355 360 Bikle D D Oda Y and Xie Z 2005 Vitamin D and skin cancer a problem in gene regulation J Steroid Biochem Mol Biol 97 83 91 Bikle D D and Pillai S 1993 Vitamin D calcium and epidermal different
461. tein 569 ZNF696 67 Zinc finger protein 696 2 CCDC9 69 Coiled coil domain containing 9 6 CI Sorf40 70 Chromosome 15 open reading frame 40 LOCI 48137 73 Hypothetical protein BCO17947 ZC3H12C 74 Zinc finger CCCH type containing 12C APXL2 74 Apical protein 2 ZMYNDI9 75 Zinc finger MYND type containing 19 LRRC37B 77 Leucine rich repeat containing 37B 2 FU 32356 77 Family with sequence similarity 109 member A 3 DQXI 77 DEA Q box polypeptide 2 C9orf9 79 Chromosome 9 open reading frame 9 4 FNDC6 79 Fibronectin type Ill domain containing 6 MSTP9 82 Macrophage stimulating pseudogene 9 HES2 83 Hairy and enhancer of split 2 FU 37464 84 Hypothetical protein FLJ37464 KIAA 1862 84 KIAA 1862 protein S LOCI 96264 86 Hypothetical protein LOC 96264 A Cl orf5 86 Chromosome open reading frame 51 2 ANKRDS5 86 Ankyrin repeat domain 5 e l CXorf23 87 Chromosome X open reading frame 23 a 2 SMCR8 88 Smith Magenis syndrome chromosome region candidate 8 2 DKFZp 686L 814 88 Hypothetical protein dkfzp68611814 2 MGC34647 88 Hypothetical protein MGC34647 C orfl 05 89 Chromosome 6 open reading frame 105 FU231 86 90 Chromosome 3 open reading frame 52 SAMDI 0 91 Sterile alpha motif domain containing 10 2 KIAA 1287 9 Kiaal287 2 CI 9orf36 91 Chromosome 19 open reading frame 36 ZNF662 93 Zinc finger protein 662 2 ZNF429 97 Zinc finger protein 429 12 SMPD3 98 Sphingomyelin phosphodiesterase 3 PCGF I 100
462. tement requis pour la fonction barri re il s agit pourtant d un r gulateur de la cornification Magnusdottir et al 2007 113 Des souris d ficientes en Blimp 1 dans l piderme ont un retard dans lapparition de la fonction barri re quelques heures post partum au lieu de E17 5 mais survivent a la naissance et ne d veloppent qu un ph notype mod r et transitoire piderme frip et cailleux quatre huit jours post partum l ger retard dans l apparition du pelage En histologie des glandes s bac es anormalement larges et une hyperk ratose des infudibula hyperkeratinization ou keratosis pilaris entra nant la formation de kystes sont visibles entre J 15 et J 20 L piderme est hyperplasique et hyperk ratosique d s la premi re semaine la couche granuleuse comportant un nombre plus important d assises cellulaires et les corn ocytes apparaissant anormalement pais Dans l piderme de nouveau n _ mii y fr i Pee Gare p h UT E Li Figure 60 Inactivation du g ne Prdm1 Magnusdottir et al 2007 A Expression du g ne Prdmi dans la couche granuleuse de l piderme murin B Coupes histologiques d piderme de souris sauvages ou mut es C Ultrastructure de l piderme couche granuleuse paissie grains de profilaggrine plus gros k ratinosomes et lamellae lipidiques normaux et augmentation du volume cellulaire 114 Prdmi observ en micro
463. ter esp ces du promoteur de NPHS1 n phrine met en vidence une combinaison de quatre TFBS A retrouv e dans les promoteurs de plusieurs g nes dont ZO 1 B et la cadh rine 5 cor gul s d apr s des analyses de microdissection de glom rules suivie de PCR quantitative C permettant d identifier de nouvelles prot ines de la barri re podocytaire D 53 2 La differenciation epidermique 2 1 Presentation generale 2 1 1 La peau La peau est a la fois l organe le plus externe et le plus tendu en moyenne 1 8 m de superficie pour un individu adulte En tant que principale interface il constitue avant tout une barri re qui prot ge l organisme contre les principales agressions du milieu ext rieur telles que l entr e de pathog nes ou de substances toxiques Cette barri re s oppose aussi aux pertes hydriques potentiellement tr s importantes dans un environnement a rien Les autres fonctions incluent notamment le sens du toucher et la thermor gulation Deux tissus conjonctifs l hypoderme et le derme d origine m sodermique et un tissu pith lial de rev tement l piderme d origine ectodermique tout comme les annexes pidermiques follicules pileux ongles glandes s bac es et glandes sudoripares composent le syst me t gumentaire figure 25 Tige pilaire Epiderme Papille dermique Bulge Glande s bac e Derme Muscle arrecteur du poil Follicule pileux Vaisseaux sanguins
464. th liums stratifi s SPRR3 n est pas d tect dans l piderme sain mais seulement dans l oesophage et le col ut rin Dans des k ratinocytes primaires en culture tous les membres hormis SPRR2F voient leur expression induite par le calcium Ces g nes pr sentent en outre des r ponses diff rentes a l irradiation aux UV SPRR4 et SPRR2G les plus 89 sp cifiques de l piderme sont aussi les seuls a tre fortement induits apr s irradiation aux UVC in vitro Ainsi on constate que le patron d expression des membres du groupe n est pas corr l avec leur type ou leur classe La diversification de la r gulation semble dans ce cas plus importante que la diversification de l organisation structurale LCE5A LEP18 SPRL5A 118 aa La famille des LCE Late Ciorf42 NICE 1 99 aa Cornified Envelope proteins regroupe LCE3E LEP17 02 aa LEP16 SPRL6A 17 genes anciennement nomm s SPRL LCE3D SPRLO6B 92 aa LCE3C LEP15 SPRL3A gaa Small Proline Rich like proteins LCE3B LEP14 95 aa LEP Late Envelope Proteins ou LCE3A LEP13 89 aa E Ciorf46 xp33 encore xp skin specific proteins A STLA toaa D expression tr s tardive dans les LCE2C LEP11 110 aa LCE2B xp5 LEP10 SPRL1B 110 aa k ratinocytes granuleux ils sont LCE2A LEP9 106 aa R uA LCE4A LEP8 SPRL4A 99 aa parmi les derniers constituants tre Ciorf68 xp32 LEP7 250 aa incorpor s a l enveloppe corn e Les Ciorf45 hKPRP 579 aa LCE1F LEP6 1
465. that includes slow cycling stem cells 1 These stem cells give rise to transiently amplifying keratinocytes that constitute most of the basal layer They divide only a few times and finally move upward while differentiating to form the spinous layer The proliferating compartment is charac terized by the specific expression of cell cycle regulators and integrin family members responsible for the attachment of the epidermis to the basement membrane Growth arrested keratinocytes undergo differentiation mainly characterized by a shift in cytokeratin expression from KRTS5 keratin 5 and KRT14 in the basal layer to KRT1 and KRT10 in suprabasal layers As differentiation progresses keratinocytes from the spinous layers progressively express a small number of spe cific differentiation markers like involucrin However the differentiation program culminates in the granular layer where keratinocytes express more than 30 epidermis specific proteins including proteins that are stored in cytosolic gran ules characteristic of granular keratinocytes GKs These proteins include well known components of the cornified layer like loricrin and elafin but also recently identified ones such as keratinocyte differentiation associated protein KDAP hornerin suprabasin keratinocyte proline rich pro tein hKPRP and so on 2 5 GKs undergo a special programmed cell death called cornifi cation which gives rise to corneocytes that no longer exhibit
466. the possible role of the central basal cell Cell Tissue Kinet 7 77 88 Presland R B Haydock P V Fleckman P Nirunsuksiri W and Dale B A 1992 Characterization of the human epidermal profilaggrin gene Genomic organization and identification of an S 100 like calcium binding domain at the amino terminus J Biol Chem 267 23772 23781 Prowse D M Lee D Weiner L Jiang N Magro C M Baden H P and Brissette J L 1999 Ectopic expression of the nude gene induces hyperproliferation and defects in differentiation implications for the self renewal of cutaneous epithelia Dev Biol 212 54 67 Puissegur M P Lay G Gilleron M Botella L Nigou J Marrakchi H Mari B Duteyrat J L Guerardel Y Kremer L Barbry P Puzo G and Altare F 2007 Mycobacterial lipomannan induces granuloma macrophage fusion via a TLR2 dependent ADAM9 and betal integrin mediated pathway J Immunol 178 3161 3169 282 Pusztai L Mazouni C Anderson K Wu Y and Symmans W F 2006 Molecular classification of breast cancer limitations and potential Oncologist 11 868 877 Radoja N Gazel A Banno T Yano S and Blumenberg M 2006 Transcriptional profiling of epidermal differentiation Physiol Genomics 27 65 78 Rambaldi A Carlotti E Oldani E Della Starza I Baccarani M Cortelazzo S Lauria F Arcaini L Morra E Pulsoni A Rigacci L Rupolo M Zaja F Zinzani P L Barbui
467. tiation HOPX was recently identified as a late marker of terminal differentiation of lens epithelial cells a process that ends with denucleatosis a specialized cell death distinct from classical apoptosis It is thus tempting to speculate that HOPX could be also important for cornification signal transduction We found that 3 regulators of intracellular calcium concentration previously unidentified in the epidermis were upregulated in GKs ITPKC R 3 4 promotes the transformation of IP into IP both of which participate in calcium homeostasis SLC8A1 R 16 2 encodes a sodium calcium exchanger Finally RCAN1 R 5 5 a regulator of calcineurin dependent pathway that regulates exocytosis in mouse chromaffin cells could be involved in the extrusion of epidermal lamellar bodies Other overexpressed genes involved in signal transduction were linked to cell survival and death ARLT1 PLEKHA2 MAP3K 7 IP1 and possibly to adhesion and migration RASGRP1 CINNBPT GMIP Cytoskeleton Mechanical resistance represents another important aspect of proper barrier formation in the epidermis We unexpectedly identified keratin 23 KRT23 as a novel acidic epidermal cytokeratin strongly expressed in GKs displaying the highest ratio R 45 among the new genes KRT23 expression was described in sodium butyrate treated human pancreatic cancer cells Lipid metabolism and barrier function 178 Two genes detected in the epidermis are part
468. tion design des puces d expression g nique Les puces sur lame de verre de par leur support et m thode de fabrication peuvent contenir un nombre limit de sondes D une fa on comparable aux macroarrays sur filtres de nylon les premi res puces sur lame de verre taient des puces dites fa on ou d di es c est dire fabriqu es sp cialement pour la quantification d un petit nombre quelques centaines de g nes sp cifiques du tissu ou du processus biologique tudi apoptose voie de signalisation etc Les avantages de ce type de puces sont multiples la fabrication de puces fa on est globalement rapide et peu co teuse exception faite de la banque de sondes elle m me fragments PCR ou oligonucl otides synth tis s la fabrication des puces peut 22 facilement se faire au niveau d un laboratoire ou d une plateforme quip s d un robot de d pot et de nombreuses alternatives commerciales sont disponibles l analyse graphique des d p ts apr s hybridation est plus rapide que pour des puces tr s haute densit L inconv nient majeur concerne l tape de normalisation qui fait appel a des talons internes g nes de r f rence ou externes cf paragraphe 1 2 1 4 Bien que les puces d di es soient encore parfois employ es la multiplication des offres commerciales ou non et l augmentation de la densit des d p ts ont conduit l mergence ces derni res ann
469. tion d un grand nombre de facteurs de transcription r gul s ou non ouvre de nouvelles voies explorer pour d crypter la r gulation g nique complexe mise en jeu dans la diff renciation terminale de l piderme Elle permettra galement de mieux comprendre certaines pathologies complexes caract ris es par des anomalies du programme de diff renciation telles que le psoriasis la dermatite atopique ou les ichtyoses 168 A large scale multi technique approach identifies 49 new players of human epidermal differentiation Running title human epidermal differentiation program Keywords cell differentiation transcription factors gene regulatory networks Manuscript 3069 words 4 Tables 2 Figures Supporting information Authors N R Mattiuzzo E Toulza N Jonca G Serre and M Guerrin Institution UMR 5165 Epidermis Differentiation and Rheumatoid Autoimmunity CNRS University of Toulouse IFR 30 INSERM CNRS Toulouse Ill University CHU CHU Purpan 31059 Toulouse France Corresponding author Tel 33 561 158 433 Fax 33 561 499 036 E mail mweber udear cnrs fr Funding sources This work was supported in part by grants from the Soci t Francaise de Dermatologie the Centre National de la Recherche Scientifique and the University of Toulouse Toulouse III N R M was supported by a fellowship of the Minist re de l Enseignement Sup rieur et de la Recherche Conflict of interest none declared Abb
470. tion from benign hyperplasia J Invest Dermatol 126 869 881 Halsall J A Osborne J E Pringle J H and Hutchinson P E 2005 Vitamin D receptor gene polymorphisms particularly the novel A 1012G promoter polymorphism are associated with vitamin D3 responsiveness and non familial susceptibility in psoriasis Pharmacogenet Genomics 15 349 355 Hamilton G Colbert J D Schuettelkopf A W and Watts C 2008 Cystatin F is a cathepsin C directed protease inhibitor regulated by proteolysis Embo J 27 499 508 Hanley K Wood L Ng D C He S S Lau P Moser A Elias P M Bikle D D Williams M L and Feingold K R 2001 Cholesterol sulfate stimulates involucrin transcription in keratinocytes by increasing Fra 1 Fra 2 and Jun D J Lipid Res 42 390 398 Hansson L Stromqvist M Backman A Wallbrandt P Carlstein A and Egelrud T 1994 Cloning expression and characterization of stratum corneum chymotryptic enzyme A skin specific human serine proteinase J Biol Chem 269 19420 19426 Harbers M and Carninci P 2005 Tag based approaches for transcriptome research and genome annotation Nat Methods 2 495 502 Hatzoglou A Ader I Splingard A Flanders J Saade E Leroy I Traver S Aresta S and de Gunzburg J 2007 Gem associates with Ezrin and acts via the Rho GAP protein Gmip to down regulate the Rho pathway Mol Biol Cell 18 1242 1252 Heinzel R Appelhans H Gassen G Seemuller
471. to stratum corneum transition Ultrastructural analysis revealed numerous split junctions with the main structure remaining attached to the granular keratinocytes suggesting that the cohesive defect lies in the upper side of the junction Thus although CDSN is already present in the extracellular core of desmosomes from the stratum granulosum it seems to have a fundamental role only when cornification is complete Intriguingly we did not observe thinning of single or bundled corneocytes throughout the stratum corneum but detachment of the whole stratum corneum from the subjacent stratum granulosum The stratum granulosum to stratum corneum interface might actually be the most fragile zone because it links two epidermal layers with different junctional organizations and mechanical characteristics desmosomes and keratin intermediate filaments that are organized in taut cables in the stratum granulosum and rigid cornified envelopes linked by corneodesmosomes in the stratum corneum The underlying molecular mechanism by which CDSN assumes its adhesive function within the corneodesmosome has not been fully elucidated In vivo CDSN is known to be covalently linked to the cornified envelope Serre et al 1991 On the one hand the previously demonstrated homophilic adhesive properties of CDSN and the strong resistance of aggregates formed by bacterially recombinant CDSN to highly denaturing conditions Jonca et al 2002 Caubet et al 2004 sugges
472. tory granular cell the outermost gran ular cell as a specialized secretory cell Investig Dermatol Symp Proc 1998 3 87 100 8 Guerrin M Simon M Montezin M Haftek M Vincent C Serre G Genome Biology 2007 8 R107 Toulza et a R107 21 163 D Q D n D gt bo 1 n g R107 22 Genome Biology 2007 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al Expression cloning of human corneodesmosin proves its identity with the product of the S gene and allows improved characterization of its processing during keratinocyte differentiation Biol Chem 1998 273 22640 22647 Dias Neto E Correa RG Verjovski Almeida S Briones MR Nagai MA da Silva W Jr Zago MA Bordin S Costa FF Goldman GH et al Shotgun sequencing of the human transcriptome with ORF expressed sequence tags Proc Nati Acad Sci USA 2000 97 3491 3496 Vandesompele De Preter K Pattyn F Poppe B Van Roy N De Paepe A Speleman F Accurate normalization of real time quantitative RT PCR data by geometric averaging of multi ple internal control genes Genome Biol 2002 3 RESEARCHO0034 Bonnet Duquennoy M Abaibou H Tailhardat M Lazou K Bosset S Le Varlet B Cleuziat P Kurfurst R Study of housekeeping gene expression in human keratinocytes using OLISAtrade mark a long oligonucleotide microarray and qRT PCR Eur Dermatol 2006 6 1 36 140 Magnaldo T Fowlis D Darmon
473. trafficking in GKs Lamellar bodies are known to be acidic Accordingly we found that ATP6V0A7 R 2 was overexpressed in GKs ATP6V1A ATP6A1 was previously shown to be upregulated in the suprabasal layer but not in GKs These genes encode components of the vacuolar type H ATPase a multimeric enzyme that mediates acidification of organelles Suggesting a function for this pump in the acidification of lamellar bodies 179 In total the present work constitutes the first comparison of expression level between granular and basal keratinocytes for 157 genes Among them 49 appeared overexpressed in GKs including 20 TFs that call for further investigations to determine their contribution to the establisnment of the barrier function Furthermore the potential role of a novel keratin KRT23 and of several enzymes implicated in lipid metabolism has been highlighted These advances made in the field of keratinocyte differentiation may contribute to the deciphering of complex diseases such as atopic dermatitis psoriasis and ichthyoses which are characterized by deregulated differentiation programs Acknowledgements We give special thanks to M T Ribouchon and R Oger for excellent technical assistance We are grateful to C Offer for sequencing the qRI PCR fragments at the sequencing platform of IFR30 Toulouse and to V Leberre L Trouilh and S Sokol for their technical support to microarray experiments and statistical analysis at the
474. transactivator Get 1 Grhl3 regulates epidermal terminal differentiation and interacts functionally with LMO4 Dev Biol 299 122 136 Zeeuwen P L Ishida Yamamoto A van Vligmen Willems I M Cheng T Bergers M Iizuka H and Schalkwijk J 2007 Colocalization of cystatin M E and cathepsin V in lamellar granules and corneodesmosomes suggests a functional role in epidermal differentiation J Invest Dermatol 127 120 128 Zeeuwen P L van Vlijmen Willems I M Hendriks W Merkx G F and Schalkwijk J 2002 A null mutation in the cystatin M E gene of ichq mice causes juvenile lethality and defects in epidermal cornification Hum Mol Genet 11 2867 2875 Zenz R Scheuch H Martin P Frank C Eferl R Kenner L Sibilia M and Wagner E F 2003 c Jun regulates eyelid closure and skin tumor development through EGFR signaling Dev Cell 4 879 889 Zhang J S Wang L Huang H Nelson M and Smith D I 2001 Keratin 23 K23 a novel acidic keratin is highly induced by histone deacetylase inhibitors during differentiation of pancreatic cancer cells Genes Chromosomes Cancer 30 123 135 Zhang W Morris Q D Chang R Shai O Bakowski M A Mitsakakis N Mohammad N Robinson M D Zirngibl R Somogyi E Laurin N Eftekharpour E Sat E Grigull J Pan Q Peng W T Krogan N Greenblatt J Fehlings M van der Kooy D Aubin J Bruneau B G Rossant J Blencowe B J Frey B J and
475. transglutaminase eriplakine PRE wis DE w Laricrine de o o OH ceramide SPRRILEP its o Acides gras cholest ral Keratines 1 10 9 k a Q Autres prot ines Lien covalent Figure 43 Etapes de assemblage de l enveloppe corn e Candi et al 2005 La plaque desmosomale dont les constituants sont inclus dans l enveloppe corn e sous l action des transglutaminases comporte des membres de la famille des plakines desmoplakine p riplakine envoplakine piplakine ainsi que des prot ines a domaine armadillo plakoglobine et plakophilines Deux prot ines la p riphiline Kazerounian and Aho 2003 et la kazrine Groot et al 2004 sont galement associ es a la p riplakine dans la couche granuleuse la kazrine jouant de plus un role dans le contr le de la diff renciation via la r gulation de l activit de Rho Sevilla et al 2008 Plusieurs des prot ines de la plaque ont t montr es comme pouvant tre impliqu es dans diverses maladies g n tiques caract ris es par des cardiomyopathies et ou des anomalies au niveau de l piderme et de ses annexes figure 44 mettant en vidence leur role dans la r sistance m canique des tissus soumis a de fortes contraintes C est notamment le cas de la desmoplakine dont diff rentes mutations 85 AUTOSOMAL AUTOSOMAL sont a l origine de k ratodermies DOMINANT RECESSIVE rss palmoplantaires stri es de type II une ectodermal dysplasia syndrome
476. u niveau ultrastructural les enveloppes corn es sont plus fines et les lamellae lipidiques sont quasi absents ce qui s expliquerait par le fait que les k ratinosomes de la couche granuleuse semblent d pourvus de contenu figure 58B Certaines de ces alt rations ressemblant au ph notype observ pour des souris invalid es pour KIf4 ou Tgmi l expression de ces deux marqueurs a t quantifi e et si le niveau d expression de Klf4 est inchang l ARNm codant pour la tranglutaminase 1 est cing fois moins abondant 109 A Fig M Lor FE Sprria Si ak ty Mm 6853 small proline rich protein 2A Spri2a d PE Ly Mm 87820 small proline rich protein 2D Sprr2d Mm 10692 small proline rich protein 2F Sprrat Mm 10693 small protine tich protein 2H Sprr2n Mm 301748 smali proline rich like 1 Sprrit Mm 279773 small proline rich like 2 Sprri2 Mm41969 smali proline rich like 3 Spmi3 Mm 291769 small proline rich like 5 Spri5 Mm 176243 small proline rich ilke 7 Spri7 Mm 23784 small proline rich like 9 Sprig Mm 292457 smali proline rich like 10 Sprrit0 Mm 1417 repetin Rptn i Mm 703 100 calcium binding protein A3 100a3 004121 3 09 Sprt10 1956 Mm 21567 100 calcium binding protein AB calgranutin A 100a8 0 00009 397 2300002G24Fik 11 59 Mm2128 S100 calcium binding protein A9 calgranulinB S100a9 lt 0 00001 4 92 93 0M 16 08 Mm 24006 S100 calcium binding protein A14 S100a14 0 00492 1 53 Rie i me RIKEN 4 a Mm 358
477. ubation et bain marie a 50 C L analyse des neuf lames r alis es a permis une d tection significative sup rieure au niveau moyen du bruit de fond 2 fois l cart type sur au moins 4 des 6 chantillons pour 11 520 sondes soit 10 824 g nes diff rents La premi re analyse statistique r alis e sur ces donn es test t de Student a r v l que 624 g nes taient surexprim s dans la fraction T4 ratio gt 1 5 avec une p value inf rieure a 0 05 contre 141 sous exprim s ratio lt 0 66 p lt 0 05 Le biais clairement visible entre le nombre de g nes surexprim s et sousexprim s peut s expliquer par le fait qu au cours du processus de dissociation et d enrichissement en k ratinocytes granuleux une partie des k ratinocytes basaux et pineux restent accroch s aux lambeaux pidermiques ceux ci se repliant parfois sur eux m mes et devenant inaccessibles a la trypsine Pour cette raison la fraction T4 KG est partiellement contamin e par des k ratinocytes basaux alors que la fraction T1 KB n est pas contamin e par des k ratinocytes granuleux ce qui explique que les ratios des g nes surexprim s dans les KG sont g n ralement plus lev s que ceux des g nes sous exprim s cf fig S in Mattiuzzo et al 2009 Les r sultats de puces se sont av r s relativement coh rents en ce qui concerne des marqueurs d j d crits de la diff renciation avec 31 g nes ayant un ratio sup rieur a 1 5 dont 19
478. ude a surtout permis d identifier de nouveaux g nes candidats dans la r gulation de la diff renciation avec 7 prot ines et 33 transcrits jamais d crits comme tant r gul s dans l piderme Parmi les nouveaux g nes dont la r gulation a t confirm e par immunohistochimie sur coupe de peau la stratifine apparait surexprim e tandis que la stathmine est r prim e La stratifine SFN ou 14 3 30 est une prot ine de liaison impliqu e dans le controle du cycle cellulaire via la sequestration du complexe MPF Chan et al 1999 une mutation dominante identifi e dans ce g ne est responsable des d fauts de l piderme et des follicules pileux chez les souris de la lign e Er et favorise galement l apparition de carcinomes pidermoides Li et al 2005 La stathmine une phosphoprot ine impliqu e dans la formation du fuseau mitotique est surexprim e dans plusieurs types de cancers notamment les cancers spinocellulaires de la cavit orale Kouzu et al 2006 Un point commun aux diff rentes tudes concernant les mod les in vitro est la diff rence importante entre les mod les en monocouche et les pidermes reconstruit ces derniers exprimant un plus grand nombre de g nes associ s aux tapes tardives de la diff renciation pidermique Malgr cela les pidermes reconstruits restent des syst mes simplifi s peu adapt s pour l identification de g nes critiques pour la diff renciation pidermique in vivo 3 2
479. ug L JHN 3002 Ie 18 lueBues L dV 1 AYN ewrxod maowod L d LSNdt 9 SOUS 9AII S13 9661 IE 18 987 SAS AMII SIA 19 ds pewurxosd snayowlo1g Lds ENSI simba JUOS esip dV s UN Jo EUIXOIT dV Mis UN OULION OAUI mod swwop amyn usd s l ounespy sap 19 sonbiugssuen sunos s p suep ayjouuondiosuen Lds 00Z e 18 sdiyjiud UONBANOE oun p s jqesuodsa Ja SOAJOSUOD JUOS dg ER dY mod UOSIEI JP SAIS Sop JUEUSIUOI ay 0002 je Je uesser 2IISIP UOISAI aun Gung 19 UNs 9 sunaj oR sap uoyeorqdun AyD Idy SOUS peununu maoud aunr ye unp s L dv 1 WOL sabus p SAaJAOOUIEIay Sa SUPP Salad s93 ap 2OUUOPIO0 uonepmga aun yemauuad Ja sayNUap 339 UO SND Sinaisn q SAAIOUNEIIY Sa suep sapma 9a sed JUO U YY sanne sop swunwiuru simajoutoid sa Z761 S661 es as p uota Joouequs p 9948 dY ous yeurxoid maowoid un W WYdS auuou ZoU9 6 19 sunos e zayo sauad p A gt SUEP Gy ozz AP uola aun SUEP wapus ua S2SIUP IO Juos YYds Sap sauad sa Sun e ap ollad Np UONANOSURD ej INS SJSIUOSEQUE Sjajjo Sop JUESMPUI dY ons SUSU np nesau ne uonnadwos us anua unf 5 19 JAMND SNA soq uouo ej ap uondussuen pod IE 18 UNEN L dv WldddS dads Bl ap uoneANDe wWwepauuad 449 00 d 19 ung o Idg op aynuap uou mawn uN p uonexy d89 00 6 el amaunad ea mb ao yuanunuip sauinoid s33 ap xneaaiu saj saloualayjIp SAAIOUTEIIY SA suep L 41 V INSYO L 9349 anb soy I USM 1 10sa1do1 oytoads ofoounesay oy ZdV 1 AL
480. ules souches pidermiques C est le cas notamment des facteurs de transcription Id1 et Id2 ou de la famille des phosphatases Dusp Larderet et al 2006 dont la fonction exacte dans les cellules souches reste a encore d finir Bien qu il n y ait pas une rupture tr s marqu e entre les profils d expression des cellules souches et prog nitrices ces descriptions permettent une meilleure compr hension de la r gulation du potentiel prolif ratif dans les cellules souches D s la fin des ann es 60 plusieurs travaux ont mis en vidence l organisation en colonne des cellules de l piderme murin pour aboutir la d monstration que les cellules s organisaient en v ritables unit s prolif ratives Epidermal Proliferative Units EPU dans lesquelles l ensemble des cellules suprabasales et des corn ocytes d rivent de cellules prog nitrices situ es la base de la colonne dans la couche basale Potten 1974 Chez l homme l impossibilit de visualiser les LRC ou les EPU in vivo a impos l tude indirecte du potentiel clonog nique de cellules isol es Barrandon and Green 1987 ceci a notamment permis de confirmer la pr sence de cellules fort potentiel prolif ratif dans le follicule pileux mais dans une r gion situ e plus bas que le bulge lequel est g n ralement impossible distinguer morphologiquement chez l homme Rochat et al 1994 Concernant l piderme interfolliculaire le mod le le plus couramment a
481. ulosum and stratum corneum was not significantly different in WT and KO samples We made counts on 30 fields at magnification X20 000 corresponding to the length of 3 4 corneocytes and found 59 transitional desmosomes in the KO skin section versus 61 in the WT Hence in newborn KO mice Cdsn deficiency seems to have no consequences on the transformation of desmosomes into corncodesmosomes In the cornified layers the morphology of the comeodesmosomes from KO mouse also appeared classical Fig SEH By contrast numerous split desmosomes could be observed at the transition from stratum granulosum to stratum corneum either isolated Fig 51 or adjacent in zones of detachment Fig 51 The main structure of the split transitional desmosomes remained attached to the granular keratinocyte and no cell lysis was observed Desmosome breaking seemed to occur specifically at the stratum granulosum to stratum corneum transition because no split corneodesmosomes were observed higher in the stratum corneum Thus abnormalities due to the absence of CDSN seem to occur only when cornification takes place and lie in adhesive defects Absence of CDSN does not affect expression of differentiation markers and desmosomal proteins in neonatal epidermis Histological analysis revealed no thickening of the living layers in the epidermis from KO neonate dorsal skin To further investigate 252 q O 2 O o Q O O the effect of the
482. ult rieure des sondes sur le verre peut se faire par un traitement a la poly L lysine comme d crit par Schena et collaborateurs ou par des d riv s du silane Les sondes sont ensuite d pos es sous la forme de spots g n ralement ronds par un robot le plus souvent au moyen un syst me de d p t de type stylo plume les sondes en milieu liquide tant d pos es par simple capillarit lorsque la pointe touche le support puis fix es de facon covalente au support En parall le des puces sur lame de verre r alis es au moyen de d p ts s est d velopp e une approche alternative consistant synth tiser directement sur un support des oligonucl otides de longueur variable Plusieurs types de synth se in situ ont t d velopp s ce jour principalement bas es sur des proc d s de photolithogravure Fodor et al 1993 Pease et al 1994 ou de d p t du type jet d encre Hughes et al 2001 Ce type de technique permet d atteindre un parall lisme une densit de sondes extr mement lev jusqu plusieurs millions par cm2 Au del des avantages techniques que pr sente une forte densit de sondes surface diminu e hybridation homog ne plus facile obtenir leur nombre sans cesse croissant autorise de nouvelles approches l chelle du transcriptome entier puces pang nomiques voire du g nome entier notamment gr ce aux tiling arrays cf paragraphe suivant 1 2 1 3 Types de concep
483. un par un l o il peut tre int ressant de mettre en exergue les relations qu il peut y avoir entre eux De nombreux outils d annotation automatique existent ce jour bas s g n ralement sur l utilisation d une nomenclature pr cise d crivant les objets g nes leur appartenance une famille ou un processus voies leur fonction leur relation avec d autres objets Ce type de description employant un vocabulaire structur pr cis ou ontologie est une n cessit lorsque l on souhaite avoir une homog n it entre les annotations de donn es et exemple le plus connu est Gene Ontology Le consortium GO cr en 1998 par les bases de donn es Flybase drosophile Saccharomyces Genome Database SGD et Mouse Genome Database MGD regroupe a ce jour une vingtaine de bases de donn es partenaires Le consortium vise ind pendamment de l organisme consid r donner la description la plus pr cise possible des produits de g nes selon trois axes distincts le composant cellulaire impliqu ex r ticulum endoplasmique ribosome complexe prot ique le processus biologique associ voie m tabolique voie de signalisation et la fonction mol culaire connue liaison un r cepteur catalyse d une r action chacune de ces trois ontologies tant ind pendantes Un grand nombre d outils bas s totalement ou en partie sur les termes GO sont propos s soit par le consortium lui m me soit par la c
484. ur comprendre le r le jou non seulement dans la diff renciation pidermique mais galement dans le cadre de processus tels que la cicatrisation et l inflammation Jonctions cellulaires et prot olyse En raison de leur implication dans la coh sion tissulaire les prot ines de jonctions ainsi que les prot ases et inhibiteurs de prot ases susceptibles de moduler leur dur e de vie jouent un role crucial dans la fonction barri re de l piderme Le s quencage des ORESTEs a permis d identifier une nouvelle claudine CLDN23 fortement surexprim e au cours de la diff renciation R 25 Cette 219 claudine a galement t identifi e comme sp cifique des couches suprabasales de l piderme murin April and Barsh 2006 Toutefois son importance dans la formation des jonctions serr es pidermiques est inconnue La prot ine placentaire P11 initialement d crite comme une prot ase s rine s cr t e est fortement surexprim e dans les k ratinocytes granuleux R 35 Toulza et al 2007 Si la prot ine poss de effectivement un peptide signal sugg rant qu elle est bien s cr t e elle a t r cemment d crite comme une endoribonucl ase Laneve et al 2008 en accord avec la pr sence d un domaine conserv pfamo9412 endoribonuclease XendoU La prot ine poss de galement un domaine somatom dine B semblable celui de la vitronectine impliqu dans la liaison de l inhibiteur de prot ase PAI
485. urizing factor which is capable of attracting and retaining water in the cornified layer to achieve skin soft ness and flexibility We suggest that FLG2 might have a simi lar function Clorf8 might have lost its function during hominization A new gene characterized in this study C1orf81 is particu larly intriguing as the corresponding transcript 2 284 nt displays an ORF disruption by a human specific single nucle otide insertion in the eighth exon Figure 6b As a result a premature stop codon resides in exon 9 103 nt upstream of its 3 end Consequently the human Ciorf81 mRNA might be degraded by the nonsense mediated mRNA decay NMD pathway 39 This appears unlikely however as its expression in various tissues was detected by RT PCR Figure 6a However its expression in epidermis was too weak to Genome Biology 2007 8 R107 Toulza et al R107 15 157 D a D Nn ka a u RI07 16 Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 Toulza et al perform real time PCR experiments Our analysis suggests that the human C1orf81 gene encodes a truncated protein relative to other mammalian species including the rhesus monkey Nevertheless we do not exclude the possibility that the translation of the human Ciorf81 mRNA might produce a full length protein by a 1 ribosomal frameshift mechanism To our knowledge such a phenomenon has been uniquely described in human for the ornithine
486. urrait jouer un role au cours de la diff renciation pidermique Le g ne CCIN R 5 6 code pour la calicine composant principal du calice post acrosomal de la th que p rinucl aire des spermatozo des coque prot ique entourant la r gion post rieure du noyau Lecuyer et al 2000 En raison de sa capacit se lier aux filaments d actine et participer la rigidification de cette structure il serait int ressant d tudier le r le potentiel de cette prot ine au cours de la cornification Il faut toutefois noter que sa composition en acides amin s seulement 9 1 de glutamine ou lysine et l absence de s quence consensus n en font pas un bon candidat pour l action des transglutaminases Lipides impliqu s dans la fonction barri re Les k ratinocytes granuleux sont consid r s comme des cellules s cr toires en raison du grand nombre de corps lamellaires renfermant de nombreux lipides S cr t au pole apical de la cellule en cours de cornification le contenu de ces v sicules contribue a la formation de la barri re pidermique Parmi les candidats que nous avons identifi s figurent des enzymes impliqu es dans la synth se et la 222 modification des lipides particuli rement du cholest rol et des sphingolipides ainsi que des prot ines de transport Synth se et d gradation Deux g nes impliqu s dans la synth se de novo du cholest rol 15 20 des lipides s cr t s ont t d tect s dan
487. utations in ichthyin a new gene on chromosome 5q33 in a new form of autosomal recessive congenital ichthyosis Hum Mol Genet 13 2473 2482 Lefevre C Jobard F Caux F Bouadjar B Karaduman A Heilig R Lakhdar H Wollenberg A Verret J L Weissenbach J Ozguc M Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2001 Mutations in CGI 58 the gene encoding a new protein of the esterase lipase thioesterase subfamily in Chanarin Dorfman syndrome Am J Hum Genet 69 1002 1012 Lemaitre G Lamartine J Pitaval A Vaigot P Garin J Bouet S Petat C Soularue P Gidrol X Martin M T and Waksman G 2004 Expression profiling of genes and proteins in HaCaT keratinocytes proliferating versus differentiated state J Cell Biochem 93 1048 1062 Lepperdinger G Mullegger J and Kreil G 2001 Hyal2 less active but more versatile Matrix Biol 20 509 514 Lessin S R Huebner K Isobe M Croce C M and Steinert P M 1988 Chromosomal mapping of human keratin genes evidence of non linkage J Invest Dermatol 91 572 578 Lesueur F Oudot T Heath S Foglio M Lathrop M Prud homme J F and Fischer J 2007 ADAM33 a new candidate for psoriasis susceptibility PLoS One 2 e906 Levy Nissenbaum E Betz R C Frydman M Simon M Lahat H Bakhan T Goldman B Bygum A Pierick M Hillmer A M Jonca N Toribio J Kruse R Dewald G Cichon S Kubisch C Guerrin M
488. verexpressed in the skin and were thus studied in more detail Two isoforms of transcripts for the dermokine gene were previously reported 15 16 and we describe 13 novel mRNA isoforms that are either ubiquitous or epider mis specific depending upon alternative promoter usage The epidermis specific forms encode secreted proteins of still unclear function and are abundantly transcribed in this tis sue 17 SERPINA12 also named Vaspin visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor is an extracellular serine protease inhibitor that displays insulin sensitizing effects 38 In addition to the previously documented expression in the liver we observed that the SERPINA12 gene is highly expressed in the human epidermis Figure 4 Moreover real time PCR showed that it is specifically expressed by GKs T4 T ratio of 50 The Serpin A12 protein might thus play a role in the regulation of the complex balance between various proteases and their inhibitors operative in the desquamation process The filaggrin 2 FLG2 or ifapsoriasin IFPS gene is a new member of the EDC chromosome 1q21 3 a cluster of approximately 50 genes involved in cornification Our real time RT PCR experiments revealed that FLG2 expression dis plays strong specificity for GK Interestingly its composition is very close to that of filaggrin The degradation of filaggrin is considered to be at the origin of the free amino acid pool of the natural moist
489. via les k ratinosomes la CDSN est localis e au niveau de la partie extracellulaire des desmosomes au sein desquels elle a vraisemblablement un role d adh rence homophile Jonca et al 2002 Sa prot olyse dans la partie sup rieure de la couche corn e joue un r le fondamental lors de la 94 desquamation Simon et al 2001 R cemment une quipe japonaise a r alis un KO constitutif du g ne Cdsn chez la souris Matsumoto et al 2008 Les souris homozygotes ne survivent que quelques heures apr s la naissance et ne poss dent pas de fonction barri re efficace prouvant ainsi le r le essentiel de la corn odesmosine Chez l homme des mutations non sens du g ne CDSN sont responsables de l Hypotrichose simple du cuir chevelu HSS OMIM 146520 g notrichose autosomique dominante caract ris e par la perte progressive et exclusive des cheveux tous les autres poils du corps tant pr serv s Levy Nissenbaum et al 2003 Ces mutations induisent la production de formes tronqu es de CDSN correspondant globalement au domaine NH gt terminal de la prot ine qui contient un des domaines riches en boucles glycine Ces formes tronqu es sont retrouv es sous forme d agr gats dans le derme superficiel du cuir chevelu des patients et a la p riph rie des follicules pileux r siduels L absence de ph notype observable pour les souris h t rozygotes Cdsn Matsumoto et al 2008 sugg re fortement que le caract re dominant d
490. vitro comme in vivo Arredondo et al 2002 Chimienti et al 2003 Si les relations entre les diff rents acteurs de la signalisation calcique voie SLURP 1 ACh a7 nAChR voie du CaSR et pompes calciques du RE restent inconnues ce jour la vitamine D est connue pour son action synergique 2 2 3 L2 Voie de la vitamine D3 La peau est la source majeure de vitamine D chol calcif rol produite gr ce une r action photochimique partir du 7 d hydroxycholest rol au niveau de l piderme Pour tre biologiquement active la vitamine D3 doit tre convertie in situ ou dans le foie en 1 25 dihydroxychol calcif rol ou 1 25 OH 2D Cette mol cule lipophile se lie un r cepteur nucl aire le VDR Le complexe form interagit alors avec son partenaire le r cepteur X aux r tinoides RXR l h t rodim re VDR RXR r gulant la transcription par liaison des l ments de r ponse sp cifiques VDRE l ment de r ponse la vitamine D dans les r gions promotrices de g nes cibles Le 1 25 0H D augmente l expression de linvolucrine des transglutaminases des phospholipases C PLC ou encore des PAD1 et 3 Su et al 1994 Gibson et al 1996 Palmer et al 2008 Une tude men e au moyen de puces Affymetrix ciblant 12600 genes a permis d identifier une plus grande chelle les g nes dont l expression varie Suite a un traitement par la vitamine D3 de k ratinocytes immortalis s lign e KerTr ou de k ratinocytes prima
491. vons quantifi s et ne remet pas en cause leur surexpression m me si le ratio peut tre sur valu Au final les quantifications en PCRq ont t r alis es en prenant en compte tous les biais possibles et paraissent d un niveau de fiabilit satisfaisant Toutefois bien que la plupart des g nes impliqu s dans la fonction barri re soient surexprim s la fois au niveau de ARNm et de la prot ine une r gulation post transcriptionnelle est envisageable pour certains g nes De plus l expression de ces nouveaux g nes peut d buter plus ou moins tardivement au cours de la diff renciation Ainsi deux prot ines test es en immunohistochimie ont montr des profils diff rents avec MAPT prot ine Tau associ e aux microtubules R 6 1 progressivement surexprim e au cours de la diff renciation et SH3KBP1 une prot ine adaptatrice potentiellement impliqu e dans le trafic v siculaire et ou la signalisation R 64 restreinte a la couche granuleuse Mattiuzzo et al 2007 Chaque candidat identifi appelle donc a une validation du profil au niveau prot ique par exemple par immunohistochimie ou immunofluorescence 217 Nouveaux acteurs de la diff renciation Les diff rentes approches discut es pr c damment ont permis d identifier un nombre important de g nes jamais d crits dans l piderme et surexprim s au cours de la diff renciation L expression de chacun de ces g nes n tant d crite qu au niveau transcr
492. ween the T1 and T4 fractions Control wells containing the SYBR Green PCR master mix and primers without template cDNA emitted no significant fluorescence after 40 cycles Human Multiple Tissue cDNA panels I and II obtained from Clontech Palo Alto CA USA were used as templates for PCR analysis A control reaction with T4 cDNAs was carried out in parallel The reactions were conducted for 35 cycles in stand ard conditions The PCR products were separated on 1 5 agarose TAE gels RACE PCR experiments We performed 5 RNA ligase mediated RLM RACE using the FirstChoice RLM RACE kit Ambion Austin TX USA Briefly total RNA was dephosphorylated with calf intestine phosphatase then decapped using tobacco acid pyrophos phatase to target full length mRNA An adapter was then ligated to mRNA and reverse transcription was performed using random decamers PCR was performed to amplify the resulting cDNA using the Outer 5 RLM RACE primer and a gene specific lower primer Nested PCR was then performed with the Inner 5 RLM RACE primer The RACE nested PCR products were cloned into the pCRII TOPO vector using a TOPO T A cloning kit Invitrogen and sequenced Genome Biology 2007 Volume 8 Issue 6 Article R107 NCBI gene ID references GAPDH 2597 SOD1 6647 ACTB 60 B2M 567 HPRT1 3251 HMBS 3145 TBP 6908 UBC 7316 PNAS 123 85028 PPP2R5A 5525 RPS11 6205 RPS12 6206 RPL10 6134 EIF4A1 1973 KRTHAP1 8686 Additional data
493. work cytoarchitecture in simple and stratified epithelia Mol Cell Biol 26 559 568 Sprecher E Ishida Yamamoto A Becker O M Marekov L Miller C J Steinert P M Neldner K and Richard G 2001 Evidence for novel functions of the keratin tail emerging from a mutation causing ichthyosis hystrix J Invest Dermatol 116 511 519 Sriuranpong V Park J I Amornphimoltham P Patel V Nelkin B D and Gutkind J S 2003 Epidermal growth factor receptor independent constitutive activation of STAT3 in head and neck squamous cell carcinoma is mediated by the autocrine paracrine stimulation of the interleukin 6 gp130 cytokine system Cancer Res 63 2948 2956 Steinert P M Cantieri J S Teller D C Lonsdale Eccles J D and Dale B A 1981 Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments Proc Natl Acad Sci U S A 78 4097 4101 Steinert P M Mack J W Korge B P Gan S Q Haynes S R and Steven A C 1991 Glycine loops in proteins their occurrence in certain intermediate filament chains loricrins and single stranded RNA binding proteins Int J Biol Macromol 13 130 139 Steinert P M and Marekov L N 1995 The proteins elafin filaggrin keratin intermediate filaments loricrin and small proline rich proteins and 2 are isodipeptide cross linked components of the human epidermal cornified cell envelope J Biol Chem 270 17702 17711 Steinert P M and Mare
494. yadenylation signal GenBank DQ983818 In agreement with the HGNC we named this gene Ciorf81 To date only 16 ESTs are present in the databases one from testis and the others from pooled tissues Additional data file 1 PCR on a panel of cDNAs from 16 healthy human tissues and organs showed that spliced transcripts for this gene are detectable in most samples Figure 6a From its conceptual translation the Ciorf81 mRNA might encode a 373 amino acid protein However a second ORF was present in another frame that overlapped the first one by 87 amino acids This suggested that a longer protein might be produced by a ribosomal frameshift mechanism We explored the Ciorf81 gene ortho logues in vertebrate genomes and particularly the region cor responding to the ORF overlap exons 7 9 Compared with the C1orf81 gene from 10 other mammals exon 8 of the Genome Biology 2007 8 R107 156 http genomebiology com 2007 8 6 R 107 human gene contained a 1 base pair insertion that creates the frameshift Figure 6b The possibility of a sequence error in the present human genome assembly was excluded by sequencing the exon 8 region from two individuals Accordingly the human C1orf81 gene product would be 373 amino acids long but 762 and 714 amino acids long in the chimpanzee and rhesus monkey respectively In all cases the analysis of the peptide sequence did not reveal known domains or signal peptide Further studies are needed to uncove
495. ys propos s par Affymetrix se pr sentent sous la forme de 14 puces contenant 45 millions de sondes de 25 nucl otides espac es de 10 paires de bases soit une r solution de 35pb 23 L inconv nient des tiling arrays est principalement son co t extr mement lev pour des g nomes complets de mammif res mais aussi la sensibilit de la m thode qui conduit a identifier norm ment de r gions transcrites correspondant probablement du bruit exp rimental ou ventuellement du bruit transcriptionnel dont la fonction demeure encore nigmatique pour revue Mockler et al 2005 Yazaki et al 2007 1 2 1 4 Applications Avec l augmentation de la densit de d p ts un nombre croissant d applications a vu le jour La premi re est videmment la mesure de l expression des genes que ce soit l tude de profils d expression g nique hybridations simples ou l identification de g nes diff rentiellement exprim s par co hybridation sur un m me support ou par comparaison de profils Les premi res puces pang nomiques ont constitu un bond technologique mais aussi conceptuel en permettant de mesurer simultan ment le niveau d expression de l ensemble des g nes d un organisme y compris des g nes non li s a priori a la question scientifique pos e mais pouvant ouvrir de nouvelles voies de recherche Les exemples de ce type d tude sont trop nombreux pour tre cit s ou m me recens s pour la
496. yzed in the epidermis and hair follicle To address this issue full thickness dorsal skin from WT and KO neonates was grafted onto the back of nude mice Fig 7 Absence of CDSN in the epidermis and IRS of hair follicles from KO grafts was controlled by immunohistochemistry data not shown Macroscopically newborn KO skin developed some sparse hair that progressively disappeared and became totally absent 9 weeks after grafting In parallel the graft became hard devoid of softness and formed a scab that was continually renewed Fig 7A In contrast to the WT KO epidermis first showed a prominent hyperplasia with papillomatosis Fig 7B Hyperkeratosis and parakeratosis were obvious and infiltration of inflammatory cells was observed in the dermis together with dermal cysts which characteristically result from degenerative hair follicles 253 D O 2 oO ep q O iw aad 2704 Journal of Cell Science 122 15 k wi E O x balk balk Ti o Ea k Ke m r j i s s Fig 6 Expression analysis of epidermal differentiation markers and desmosomal proteins in neonatal KO mice A Equal amounts of protein extract from WT HET and KO neonate dorsal skin separated by SDS PAGE and analyzed by western blot with antibodies directed against keratin 10 K 10 involucrin Ivl filaggrin Fil loricrin Lor desmoglein Dsel or actin B Quantitative RT PCR analysis of
497. z D C Betts M J and Frangakis A S 2007 The molecular architecture of cadherins in native epidermal desmosomes Nature 450 832 837 Alef T Torres S Hausser I Metze D Tursen U Lestringant G G and Hennies H C 2009 Ichthyosis follicular atrophoderma and hypotrichosis caused by mutations in ST14 is associated with impaired profilaggrin processing J Invest Dermatol 129 862 809 Ali R S Falconer A Ikram M Bissett C E Cerio R and Quinn A G 2001 Expression of the peptide antibiotics human beta defensin 1 and human beta defensin 2 in normal human skin J Invest Dermatol 117 106 111 Alizadeh A A Eisen M B Davis R E Ma C Lossos I S Rosenwald A Boldrick J C Sabet H Tran T Yu X Powell J I Yang L Marti G E Moore T Hudson J Jr Lu L Lewis D B Tibshirani R Sherlock G Chan W C Greiner T C Weisenburger D D Armitage J O Warnke R Levy R Wilson W Grever M R Byrd J C Botstein D Brown P O and Staudt L M 2000 Distinct types of diffuse large B cell lymphoma identified by gene expression profiling Nature 403 503 511 Allen C T Ricker J L Chen Z and Van Waes C 2007 Role of activated nuclear factor kappaB in the pathogenesis and therapy of squamous cell carcinoma of the head and neck Head Neck 29 959 971 Altieri D C 2008 Survivin cancer networks and pathway directed drug discovery Nat Rev Cancer 8 61 70 Alw

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