Einführung in die Grundlagen der Gentechnologie
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1. agaggatccc LaagecCager G LCLECCOC tateagetea agaacatgtg Go EELE EE ggtggcgaaa LtgEgEtELES gaagcgtgge dELEPAAGEL gtaaetateg CEgataacag ggcctaacta LEtaettiedg gEYELEBEEE ET ELEOSLPELE toggtcatgag tta adadtcaat gtgaggcace COCOEAUAE Egegagarer ccgagcgcag gggaagctag Eaggeategt gatcaaggcg EOEALUESL tAEataalte Caa caagte tacgggataa cttcggggcg C CJLUCaCT aaacaggaag EER LAGEEIKE datacatatt gaaaagtoce ggcgtatcac acatgcagert CEEBLERAAD ca agagcagart taggaagcag atgcaaggag gaaacaagcg gatataggcg gtagaggate JaacgJgC ICE acgagagaga tattgtegtt ttaggtgaca cgggcgaget gcattaatga CECCCOGOLTO ctcaaaggcg agcaaaagge CadgCEicCCac CCCgacagagda EettEEgAEE gELLELELERI gggctgtgtg ECCLOAgLEC gattageaga EGAgELtAEAEL aaaaagagtt tYtLtEgeaag ttetaeggdg attatcaaaa Etaaagtata tatetiageg dactacgata AOAELEAEES aAadgggtEEL agtaagtagt gAtALEAEOT agttacatga LAteagaagt EELttaeEgtiEe attEtoagaa tacegecgeca aaaactctca CaastaaEctr geaaaatgEes GELELEESAR cgaartrgtarit ACCEDACUTe QAJJECCECE CECggagacg CSeUTCagcd cgtactgaga CCACTAagEa atggcqceca CtcCatgagec Ccagcaaccg cggetagoga accCagaaacc tgatagggte agaacgcggc ctata cgaattecgg ateggeeaar aAEtgaetEede gtaatacggt cagcaaaagg BEEEELHAED ctataaagat ETACEJCETA AdAELEAGDEE GAREAAEEGE aacccggtaa gcgaggtatg agaaggacag gAtagELEEL CagcCagactra tELSarAELE adggatEttea tatgagtaaa arcto tart cgggagggct getccagatt gcaactttart tegecagtta COCCOLCEO LE2. 1230 bp 1033 bp 653 bp 517bp 453 bp 394 bp 289 bp 234 220 bp 154 bp Calculez le nombre et la taille des fragments attendus pour tous les trois plasmides en utili sant les cartes de plasmides de la page 20 Marquez ce r sultat th orique sur la photo du gel page 19 A l aide du marqueur on peut estimer la position des bandes pour les fragments calcul s Quel r sultat obtiendra t on pour l essai avec le plasmide non fragment Marquez gale ment votre proposition sur la photo du gel Comparez le nombre et la position des fragments visibles sur le gel avec le r sultat th orique sur votre dessin Lequel des trois plasmides a t isol par votre groupe 21 U NOVARTIS 1 Pourquoi ne voit on pas tous les fragments produits par la digestion de restriction sur le gel Dans quelle mesure l analyse des fragments par lectrophor se sur gel est limit e S quence de pGEM1 5 3 61 l Lod 241 SOL OL 427 481 541 00 1 661 LA FO 841 JO JT LOT 1081 1141 ig de die di ZE Vaal 1441 4501 LSGI 1621 LOG 1741 1801 1861 ZA FIST 2041 21 01 ok oi AA 22 Oud PA 2401 2461 2024 2a 2641 2 III AOL 2621 gaatacaagc LEESEELALA gecgcggggag toegetree tatoeasaoa CCaggaaced agCarcCacada accaggegtt EA AEAEELK giaggtatet sEAdtteadee gacacgactt taggcggtgc LACET Eat JAaECCJgcad cgcgcagaaa agtggaacga EEtagateet GLLIALELDA ELESEL SALE taccatetog tateageaat GEgEELEEAL atadt
3. emploi des micropipettes Remarques g n rales e Ne r glez jamais une pipette un volume pour lequel elle na pas t con ue Ne pas forcer son m canisme en le tournant e Ne plongez jamais une pipette d pourvue de pointe dans une solution e N utilisez jamais la m me pointe de pipette pour diff rentes solutions Pipettes pour quatre cat gories de volumes de r f rence 0 5 10 ul Pipettes marqu es de blanc gt utiliser des pointes de pipettes blanches 2 20 ul Pipettes marqu es de rouge utiliser des pointes de pipettes jaunes 20 200 ul Pipettes marqu es de jaune gt utiliser des pointes de pipettes jaunes 100 1000 ul Pipettes marqu es de bleu utiliser des pointes de pipettes bleues A Bouton B Bouton d jection C Bague de r glage D Tige E Ejecteur de tige 10 U NOVARTIS R glage du volume Le volume pipeter est r gl l aide de la bague de r glage noir cannel e C Le volume r gl apparait sur le voyant trois chiffres que l on lit de haut en bas La signification des chiffres rouges ou noirs est expliqu e ci apr s au moyen d exemples Pipettes 0 5 10 ul et 2 20 ul chiffres rouges en bas 1 10 ul rouge 7 5 Lil 12 5 ul Pipette 20 200 ul o que des chiffres noirs ul 2 75 ul 125 ul Pipette 100 1000 ul o rouge chiffres rouges en haut ml 0 0 75 ml 1 ml 11 Un NOVARTIS DC Comment pipeter Placez la pointe de pipette correcte
4. ECOALE aACtgeataat ctcoaaccaag aatacgggat CECTECOgOg CACLCgtqua aaaaacagga actcatactc coggatacata ccgaaaagtg taggegtate COLOACACAT GgacdageErg cCggcatcaga gcgtaaggag aagggcgate Eaaggegatr ccagtogodaa aattcegtaart Cacaacatac ctcacattaa EEgEattaat GELE EO Cacrcaaadg tgagcaaaag Eatadgeiesr aacocgacag GELEYELEEYA JCJICELECEC ctgggctgtg COALECEIAQT addgattagea taoggetaosa ggaaaaagag teg EEEREA CECLACOg agattateada atctaaagta C LArCECAd ataactacga COACOCLEAC adgaadgLggte agagtaagta JLOJSEJECAC CdagtrLacat gLLALEAAAA EEteELarirg Ceattotgag aataccCgqc cac cCgaaaactct Cocaactgar aggcaaaatg EEOSEEEEEE EtEgdatotad Ccaccetgacg acgaggceCcCr 24 gEagEtoeseg tcagggcgcg geagattgta aaaataccgc ggtgcgggee aagttgggta gcttgcatgc catggtcata gagccggaag COLE gCo GaarCggccCa tcactgactce cggtaatacg gccagcaaaa Joca gactataaag C CLOCeUueT atagctcacg tgcacgaace Cdaccegor gagcgaggta ctagaaggac ECOgEAgCEC agcagcagar ggtctgacge aaaggatett tatatgagta CJAaECEJECE tacgggaggg CoAgELEEAAA OEAEAAGKE gLtEgEEadt gEEESEESEE dateer eoeRE gtaagttgge Leargceace aatagtgtat cacatagcag Caagga tent E CLCagCarc cCCcgcaaaaaa aatattattg ttetagadaaa tetaagaaac CLCOEC gagacggtea tcagcgggtg ccgagagtge atcaggecgec COCE CICEAC acgecaggart ctocaggt eg GCEGECECCOT Cataaagtgt C CACLICEC acgcgcgggg JELSCICLCg DEeLArCCaca ggccaggaac cgagcatcac ataccaggecg taccggatac Ccgtaggtart G CCYEtCAaU aaga
5. Editeurs Novartis Pharma AG CH 4002 Basel Auteurs Dr Anja Messerschmitt Dr Gesche Standke Dr Christiane Rockl Michel Illustrations Fonds de l industrie chimique Francfort Main Pharma Information B le Dr Marcus Baumann Contact Novartis Pharma AG Dr Christiane R ckl Michel Biotech Labor WKL 122 2 26A Postfach CH 4002 Basel Novartis Pharma AG Dr Gesche Standke Biotech Labor WKL 122 2 26A Postfach CH 4002 Basel Tel 061 696 13 72 Tel 061 696 13 72 E Mail christiane roeckl_michel novartis com E Mail gesche standke novartis com Internet www novartis ch schullabor Reproduction autoris e avec l accord de l diteur et condition d indiquer les sources Copies destin es l usage scolaire souhait es Edition 2012 Stage au Biotech Labor Table des mati res LES DASOS or dem en nine nano 5 Genie dee ide muise EN nat en amande 5 Mod les d organisme S ss dese KEES dee ge Ee NE ee Ge oe Ee ee di N N one D Bacto S Eeol it Ge GE A 6 DA LS IRAIO N RE DE Ee ek GE ee E 6 TrarisiormaO ss ES a a a aa a Ge GE tie Sen La resistance aux antibiotiques Ee ee ese is ses Di ee be a a E 7 Enzymes enzymes de restriCHON ee ee ee se ee ee Ee Re Re Re Re Re GR ee ee EA ee EA ee EA ee Ge ee PA ee Ee Ee EA Ee Ee Ee Ee 7 IAtroduction AUX travaux PrALIQUES see hdi ninn nd attentats 8 Malterielde labofaltoite uses Ses ode R 8 Glossare speeialise EG ER Ee Ann a ee BE ee ei 9 Mode d emploi des mic
6. L Mat riel Eprouvette Eppendorf blanche de 1 5ml Sachet pour d chets Eprouvette Eppendorf rouge de 1 5ml Rack Eau double distill e Thermo bloc 37 C Tampon de restriction Centrifugeuse Enzyme de restriction Nci1 20 C Micropipette 1 10 Lil ADN de plasmide issu de exp 1 Micropipette 5 50 ul Bain de glace Pointes de pipettes blanches et jaunes 16 U NOVARTIS DC Marche suivre 1 Inscrivez votre nom sur les couvercles de chaque prouvette Eppendorf blanche et rouge 2 Pipetez d apr s le sch ma suivant Pipetez l enzyme de restriction dans l prouvette rouge en dernier lieu apr s avoir bri ve ment centrifug les deux prouvettes Eprouvette rouge Eprouvette blanche 10 Hi ADN de plasmide de l exp 1 6ul ADN de plasmide de exp 1 2 5 ul eau double distillee 7 5ul eau double distillee 1 5ul tampon de restriction 1 5uL tampon de restriction 1 ul enzyme de restriction Nci1 3 Fermez les prouvettes centrifugez 1 minute et incubez les chantillons pendant 45 90 minutes 37 Quelle est l action du tampon de restriction Qu est ce qui sert de substrat serrure enzyme cl dans cette analyse de restriction Pourquoi n ajoute t on l enzyme de restriction qu la fin Pourquoi utilise t on des chantillons sans enzyme de restriction Evaluation La digestion par enzyme de restriction est analys e dans l exp rience 3 D chets Les d chets issus de cette exp rience
7. SELEAFSL aagttoggeEg atgecatecg tagtgrta Ed catagcagaa aAdgatELEas EeEadeas EEU gcaaaaaagg Eattattgaa tagaaaaata taagaaacca EOELLESELE gteacagctt ggtgttggcg gtgcdcgcata ggttgaggcc dCAgLECCCC cgaagtggcg Cacetotous Loader ELKE CagaadgtLE LAST Ed Ta bacaaltraalr D Combien de s quences de reconnaissance pouvez vous trouver dans la premi re ligne 1 22 U NOVARTIS Sequence de pBluescript 5 3 61 Tad 181 241 301 361 427 481 541 OUL 661 121 781 841 SOL Del FOZ LOST IAA BAOL 1261 1321 LS 1441 1501 Veel LEZ 1681 LIAL LOOL 1861 L921 1981 2041 ZLOT 2 LOI ol 220 2341 2401 2461 2021 2581 2641 AO 2 Tel 2 0 21 2881 ADA cacctaaatt OCCACCECCE cgagataggg GECCaacqrc accetaartca JAgC ECC gaaagcgaaa CACCACACEC gcgcaactgt agggggatgt ttegtaadacg JECCOCCCEC ateCactagt gagggttaat aAdtEeegEEEAE EEtaatgagte gaaacctgte gtattgggcg ggcgagcggt acgcaggaaa OOLEESEESDE CaagtcCagag QOLCCCLCOEL EEEESEELtSYAD adggtEegtteg CCttateccgg Cagcagcecac tgaagtggtg tgaagccagt ctggtagcgg aagaagatcc aagggatttt aadtgaagttt gcttaatcag JAaCLCeCEUL caatgatacc ccggaagggc ALELAELSESH Ccattgctac gtteccaacg COCECOQECE LOUCAagCactr gtgagtacte COJCJECAAE gaaaacgtte Egtaaeersas ggtgqagcaaa gttoaatact cCactcgagecgg Catttecceg gtaagcgtta dac aatagg ELoagtgtELg aaagggcgaa AAEELELED tttagagctt ggagcgggcg gecgcgetta tgggaagggc gELAEAAGOE ACOJCCAagEg gaggtcgacg EEtagagedg ttE
8. aide de la carte de plasmide voir page 20 on peut com parer celle ci avec le motif de bande apparaissant sur le gel et ainsi identifier le plasmide Ere N wi j Mn p a s i i Mat riel Eprouvette Eppendorf blanche de experience 2 Lampe UV Eprouvette Eppendorf rouge de l exp rience 2 Rack Tampon de charge Micropipette 5 50 ul Marqueur de poids mol culaire pour ADN Micropipette 1 10 Lil G n rateur Pointes de pipettes jaunes Cuve lectrophor se avec gel d Agarose et blanches Sachets pour d chets 18 U NOVARTIS DC a Marche suivre Pipetez dans chacune des prouvettes Eppendorf blanche et rouge 2ul de tampon de charge Attention le tampon de charge est tr s visqueux Il est donc tr s difficile d effectuer un pipetage exact Pipetez donc lentement Pourquoi faut il ajouter du tampon de charge dans les chantillons Centrifugez bri vement les chantillons Ecoutez l explication du principe de fonctionnement de l appareil lectrophor se La responsable du cours pipette 8ul du marqueur de poids mol culaire d ADN dans la pre mi re poche puits Pipetez lentement 15ul dun chantillon dans l un des puits poche du gel II faut veiller ce que la pointe de la pipette ne traverse pas le puits Lors du pipetage tenez la pi pette la verticale au dessus de la poche R p tez ce processus avec tous les chantillons Pour chaque chantil
9. bleues jaunes blanches Solution de glycog ne Eprouvettes Eppendorf 2ml Tampon TE Eprouvettes Eppendorf 1 5 ml Ethanol 98 M langeur Vortex Sachet pour d chets Centrifugeuse Flacon pour d chet Rack Bain de glace 14 U NOVARTIS Marche suivre 1 HER AA EL En 12 13 14 15 Pipetez 2ml de la culture de bact ries liquide dans une prouvette Eppendorf de 2ml et centrifugez la pendant 2 minutes Eliminez soigneusement le surnageant en le pipetant dans le flacon pour d chets R p tez les points 1 et 2 avec le reste de la culture de bact ries liquide 2 ml Pipetez dans la m me prouvette de 2ml qui contient les bact ries s diment es de la premi re centrifugation L objectif consiste obtenir toutes les bact ries de la culture liquide sous forme de s diment dans l prouvette Eppendorf de 2ml Mettez en suspension les bact ries s diment es avec 250ul de tampon pour lyse sur le m langeur vortex Incubez la suspension 5 minutes sur de la glace Ajoutez 25ul de solution au lysozyme la suspension de bact ries R chauffez l chantillon 5 minutes 95 C Centrifugez l chantillon 10 minutes Pipetez le surnageant soigneusement dans un nouveau tube 1 5ml Ajoutez au surnageant 1ul de solution au glycogene Ajoutez y 500ul d thanol glac 98 m langez bien l chantillon et placez le 10 mi nutes sur de la glace Centrifugez l chantillon 10 minutes liminez ent
10. cacgac tgtaggcggt agtarttCggt disef iu els eioie tacgcgcaga tcagtggaac cacetagate aadctiggtert d E CUCOLEEA CELACCAaEeT CE TAarCagca AEESAEELEF taatagtttg Cggtarcggert gttgtgcaaa EE EdALALIER Eotaagage geggcgaccg aaortttaaaa accgetgttg CCLCLACCEECO gggaataagg aagcatttart taaacaaata attattate U NOVARTIS 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 T29 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 L320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 PAAL 24260 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2686
11. centrifugation 3 Mettez le couvercle du rotor et refermez le couvercle de la centrifugeuse 4 Ajustez la dur e de la centrifugation avec les boutons VY et A Maintenez la vi tesse au maximum 13 400 rpm 5 Actionnez la centrifugeuse en appuyant sur start 6 Lorsque la centrifugation est termin e le couvercle se d verrouille automatiquement 13 LD NOVARTIS Exp rience 1 Purification de l ADN M thode Lorsque des bact ries transform es avec de l ADN de plasmide sont multipli es dans un milieu BL contenant un antibiotique temps de doublement env 30 minutes l ADN de plas mide qui y a t introduit se multiplie galement Dans l exp rience 1 la culture de bact ries mise votre disposition a t impr gn e par l un des trois plasmides suivants pGEM1 PBluescript ou pUC18 Afin de pouvoir identifier votre plasmide l aide de l analyse de restriction il vous faudra dans un premier temps isoler de la culture de bact ries Chromosome bact rien Membrane cellulaire intacte ADN de plasmide _ Paroi cellulaire poreuse Bact rie Sph roblaste Centrifugeuse be E od L o Pr cipitation en ethanol 7 0 Lysat de bact ries avec Cellule bact rienne ADN de plasmide fragment e Mat riel Micropipette 100 1000 pl Culture de bact ries liquide 4ml Micropipette 5 50 Lil Tampon pour lyse Micropipette 1 10 lil Solution de lysozyme Pointes de pipettes
12. doivent tre collect s dans un sachet pr vu cet effet 1 U NOVARTIS Exp rience 3 S paration et mise en vidence de fragments d ADN par lectrophor se sur gel M thode Dans l exp rience 2 vous avez d coup de l ADN de plasmide l aide d une enzyme de res triction digestion Dans l exp rience suivante les morceaux d ADN ainsi obtenus frag ments vont tre s par s d apr s leur taille Cette s paration a lieu dans un champ lec trique LADN a une charge n gative et migre donc vers le p le positif du champ lectrique Lors de l lectrophor se sur gel les fragments d ADN sont amen s traverser un gel d Agarose dans le champ lectrique que l on peut comparer une s rie de grillages Plus les fragments d ADN sont petits plus ils migrent avec facilit travers ce grillage Au cours du m me laps de temps les petits fragments d ADN traversent donc une distance plus longue que les fragments d ADN de plus grande taille Les fragments de taille identique s agglomerent en bandes paisses dans le gel Apr s cette s paration par lectrophor se les fragments d ADN doivent tre rendus visibles dans le gel Un colorant fluorescent a t ajout au gel qui rend les bandes d ADN visibles sous la lumi re UV directement apr s l lectrophor se On obtient alors un motif de bande caract ristique Si le nombre et la taille des fragments a t d termin e th oriquement l
13. duits dans le mat riel g n tique d un tre vivant ou il est possible de modifier ou d liminer des g nes de ce m me mat riel g n tique Cela permet d obtenir des micro organismes des plantes et des ani maux poss dant des propri t s d termin es La nouveaut du g nie g n tique r side dans les changes de g nes m me entre diff rentes esp ces Ainsi par exemple le g ne d une bact rie peut tre activ dans une plante Le g nie g n tique est un domaine particulier de la bio M N technologie moderne Les premi res exp riences en g nie Mod les d organismes g n tique ont t effectu es en Am rique en 1973 En principe chaque cellule peut servir de source d ADN et chaque organisme peut tre modifi g n tiquement Mais dans la recherche on n utilise que certaines esp ces du monde des micro organismes des plantes et des animaux Les mo d les particuli rement pris s sont les bact ries Escherichia coli abr viation E coli pour les micro organismes Arabidopsis Thaliana pour les plantes le poisson zebre pour le monde Tierzelie Plasmamembran Ribosom Polysom Cytoplasma Mitochondrium Golgiapparat endoplasmatisches Reticulum Kernmembran Zellkern Nucleolus Pore Pflanzenzelle Zellwand Plasmamembran Ribosom Polysom Cytoplasma Mitochondrium Golgiapparat endoplasmatisches Reticulum Kernmembran Zellkern Nucleolus Pore Chloroplast Vakuole La cellule
14. egagettg darrieCacac gagctaactc gtgccagectg CLOCCCCOJOT accagctecac gaacatgtga gEEEEESERE gLtAEgaaas JCJCLCLECT aagcgtggeg C ECaagerg tadetategt toggtaacagg gEELtAdaotars Laeettegda EOAELLELEEL EE BEOAEOEEE ggtcatgaga Cadatcaacc tgaggeaeet cogtgtagata J gagAaCEec a Egagegecaga ggaagctaga aggEeategtg atcaaggcga COCA ECOLE J AaLAaTEetE aaccaagtea acgggataat ttcggggcaa LOUTOCAaCCce aacaggaagg CALACLCLEC atacatattt aaaagtgc atat ECOC ccgaaatcgg CLECEACTC ECO ddaceCorera ggtcgaggtg gacggggaaa CTagggegCr atgEgEEgEL gatcggtgcg gattaagtig aattgtaata dEategataa GEBEEAEEE gEgtaateat aacatacgag aACcattaattg cattaatgaa C CECOCLCa tcaaaggcgg gcaaaagqgcc dJOCrCCcoec ccgacaggac gELEEAAEEE Ete toaltad ggctgtgtge GEESagteEEA aAttadcoagag gAELAFAELA aaaagagttg gtttgcaage EEtatgAdYE ttatCdaadadd taaagtatat ateteagega actacgatac CSCECACCOg Ag GCJQECCET gtaagtagtt gtgtcacgcet gttacatgat gtcagaagta CELACErgECa LLEgAAAALt aAEEAEAEERE aadetetsaa AaELgaEBLrE caaaatgccg GELLLECAR SE gaatgtattt 23 Aaaattegeg oaaadtoert gaacaagagt tEagggegat EEgtaaagea gEEAAEHAAE ggcaagtgta acagggcgcg JACCECECCI ggtaacgcca COaCECAaCEa gettgatate ggtggagete ggteataget ccggaagcat COLESDCOCEC ECggeCaaco Elda teer taataeggtte agcaaaaggc SESELAAESA tataaagata LE AELAE gEtEAEAELY aEAAAdEEELE acccggtaag caaggtatgt gaaggacagt gtagctettg agcagattac CCOACOCECa JOATCLESAaC atgagtaaac ESCECEACC ggga
15. estriction sont des endonucl ases dui n hydrolysent donc d coupent les liaisons d soxyribose phosphore ester de la double chaine de l ADN lorsqu elles reconnaissent une s quence sp cifique de l ADN C est pour cette raison que les enzymes de restriction sont galement appel s plus simplement g nes ciseaux Dans ce cours enzyme de restriction utilis est le Nci1 U NOVARTIS Introduction aux travaux pratiques Mat riel de laboratoire 1 5mL 2mL O O ODODO O Eprouvettes Eppendorf Rack portoir Pointes de pipettes Micropipettes mes Centrifugeuse Thermo bloc M langeur Vortex EET 9 CAT Cuve lectrophor se G n rateur UV Transilluminator U NOVARTIS Glossaire sp cialis Incuber Liquide de culture Pipeter S diment S lectionner Surnageant Suspendre Suspension TA Conserver dans certaines conditions milieu nutritif liquide dans lequel on r alise des cultures cellu laires Adjonction d un volume de liquide d fini l aide d une pipette El ments d un liquide r colt s par centrifugation cf surna geant Rechercher en fonction de crit res particuliers Liquide qui apr s centrifugation se trouve au dessus du s di ment ci s diment R partir des l ments solides dans une solution Liquide contenant des l ments solides r partis de mani re uniforme Temp rature ambiante env 22 C Un NOVARTIS Mode d
16. et CCCCCCOCAgLO actctagagg gtgtgaaartt aaagcctggg gELEEEEaSK agaggcggtt GEES ELCOQOS gaatcagggg cgtaaaaagg aaaaatcgac isi esels sie e GEES EAEELE CECAgEteUg cccgaccgert CLaCCJOCAC gctacagagt atetgedgEe aaacaaacca aaaaaaggat Jadaactcac CLCECLAaaec JaCAagtracCo tEERtadttg dAEDEEAY LS ataaaccage dALCCAgLCTa CJCaac greg teattcagert aadgcggtta LESELEAFED ELUELEESLELA AJECOCECEC deEgelteates adgateeadgtt aEFagELEF gcgacacgga CaggdEtate gatte atgacattaa Sequence de pUC18 5 3 Cog Edar gac gtaagcggat tcggggctgg gtgtgaaata caggetgecgoe ggcgaaaggg acgacgttot AECECCOgaC dEtateeget BEES LAA LE cgggaaactr tgcgtattgg EAeEgAEgaAAT ataacgacagg GEES geteaadgtea daad ELEEEL C CEECCLEC Cataggtegr QOOCCELATE cggeagcage tettgaagtg tgoetgaages ccgectggtag ctcaagaaga grtaagdgat aaaaatgaag aatgettaat GEES ELESE ctgcaatgat cageccggaag etaar tcgtLg CEGOCIECOC Gcggttecca GELEES tEatgogeade Etogtgadta gEESYAELEF ttggaaaacg cgatgtaaco Ccgggegage aatgttgaat dEEEER EA gcacatttec cctataaaaa ggtgadaace gecgggagca GC Laacrard CEgEAEAgat aactgttggg ggatgtgctg aaaacgacgg ACCJAaUCECT CAaCaatEreca agtgagetda gEEALYEERY BESEESELEF gotatoaget aaagaacatg goEALELEELE gaggtggcga CJLACJELCE gggaagcgtg COCLCCAaAag EAgtaaetat CactogLaac gEASELAAG AJETACCECC Cottage C LC LOALC EELSSEEALY tttetadatCa cagtgaggca CGCegtgtag aEEAdEYAAAE ggccgagcgce Coggaagec Tacagacacc acgatcaagg CCL
17. gggett G EAOAGA EE CASCEtECAEC COCCagitad EgtegtttEdg EEEEEALYPE AAtEEEAE Eed EeEdE agtgratgog atagcagaac ggatettdeEs SAOCA CEEC cCaaaaaaggg attattgaag agaaaaataa EEAdAAEPELE tataddtCdad CcaCtattaa ggcccactac Ctaaaiccgga gtoggcgagaa dESKLEAEDT CCCALLCOe CTALTACACE QU ELLECCE taddgegaat gaat tectae EagEtLtEgt gEtESE AL aaaogtgtaaa ACCACCCOCE cgcggggaga dEVELESILE atccacagaa CaggaacEegt gcatcacaaa CCAJJCUELC EgAdataEtLtY taggtatete COE Cageec acacgactta adgdeAdgEgEL alktvtdetate atccggcaaa gcgcagaaaa gtoggaacgaa Easat oer LESSLELSAE E COCECAaECC accat etgga atcagcaata COCCLCCA EC LAgeLEQCoe tatdgettea gtgcaaaaaa agtgttacca aadatELEL gegaccgagt tttaaaagtg gEtALTLIADA EaotEESAGER aataagggcg Cat ctatecag acaaataggg gttaaatcag aagaatagac AddgaargtgdaA gcgaaccate accctaaagg aggaagggaa tgecgegtaac CaL CaUder agEtggegaa agteaegaeg tgggtaccgg agcccggggg COCCCOETLEAUT Egaaattgtt gcctggggtg EESERS LES ggcggtttgc GL COgCeLOC tcaggggata aaaaaggccg dategacocE C CECCrggaa CCICELELC aAgttEegatgeE gdEEELYED ECOCCAaC EES AFdAAAEEFE EAESELE LAE cCaaaccaccg aaaggatctc AAErtsa Eet ttaadttadad agttaccaart ATAGCLOCCT cccagtgeccg aaccagccag Ccagtctatta datgttattg EEtEagEKEEL gEggi tager GEOALAAELA CeTOLTOaCEO COCLCLEQCE EEEAEERLES LEEagttEeda AAEAEELESEI acacggaaat gotLtattgtie gELEEEER U NOVARTIS tegegesrE Saget ttggcgggtg accatatgeg attegeccartt cacgecag
18. i rement le surnageant pipetez le surnageant dans le flacon pour d chets Attention Le s diment d ADN est tr s petit et donc difficilement visible Laissez le tube avec le s diment d ADN ouvert env 5 10 minutes TA l thanol s vapore Le s diment d ADN est dissout dans 30ul de tampon TE par aspiration et expulsion de la pipette T chez d viter la formation de mousse Evaluation Env 16 ul sont utilis s pour une analyse de restriction tel que d crit dans l exp rience 2 D chets Les d chets solides issus de cette exp rience doivent tre collect s dans un sachet pr vu cet effet et les d chets liquides doivent tre collect s dans le flacon pour d chets 15 U NOVARTIS Exp rience 2 Caract risation de VADN par analyse de restric tion M thode Certaines enzymes sont capables de reconna tre certaines s quences sp cifiques de nu cl otides suite de caract res sur l ADN et de d couper l ADN ces endroits Ces enzymes proviennent de bact ries et sont appel es enzymes de restriction Leur disponibilit repr sente une condition de base l laboration de l ADN Dans cette exp rience le plasmide bGEM1 pBluescript ou pUC18 s quences de nucl o tides page 22 obtenu au cours de l exp rience 1 est d coup par l enzyme de restriction Nci1 digestion La s quence reconnue par cette enzyme de restriction est CC G C GG l DAPDI Enzyme de restriction Ncil DIMI
19. la division de la cellule distribu entre les cellules filles L information g n tique sur les plasmides peut donc tr s facilement tre modifi e remplac e ou rajoutee On peut alors observer les cons quences de ces modifica tions sur une bact rie qui ne poss dait avant pas d ADN de plasmide Cette m thode s appelle la transformation des bact ries Les plasmides DGEMI1 pUC18 et pBluescript qu on utilise dans le cours sont des mol cules d ADN synth tique fabriqu es pour tre employ es dans la recherche On appelle ces plasmides de laboratoire des vecteurs car ils servent de mol cules de transport pour les fragments d ADN modifi s qui doivent tre introduits dans des cellules Les vecteurs pGEM1 pUC18 et pBluescript ont des fonctions tr s importantes telles que 1 La capacit de se multiplier dans la cellule de la bact rie ind pendamment du cycle de la cellule origin of repli cation 2 La capacit de se multiplier abondamment pour atteindre environ une centaine de copies par cellule 3 Contenir un g ne de r sistance aux antibiotiques permettant de s lec tionner les bact ries transform es de celles qui ne le sont pas Un NOVARTIS Transformation Comme en principe l introduction d ADN de plasmide pur dans des bact ries se r v le tr s inefficace les cellules bact riennes doivent tre soumises un traitement sp cifique pr a lable Ainsi elles sont soumises diverses solutions salines qui renden
20. le plus petit l ment constitutif du vivant transparents du Fonds de l industrie chimique Franc fort Main Biotechnologie Gentechnik 1996 U NOVARTIS Bact ries E coli K12 Dans le cours nous utilisons la souche de bact rie E coli K12 Les bact ries sont constitu es d une seule cellule et peuvent contenir de l ADN de plasmide en plus de leur ADN g no mique voir illustration La cellule E coli est une bact rie typique de la flore intestinale hu maine La souche de laboratoire utilis e depuis environ 50 ans E coli K 12 en raison de diff rents d fauts g n tiques ne provoque aucune maladie chez l homme et ne colonise pas la flore intestinale de mani re durable Dans les bonnes conditions de laboratoire ces bact ries se cultivent et se multiplient facilement Ainsi elles remplissent deux crit res importants pour un mod le d organismes E coli K 12 fait partie des organismes les mieux tudi s et les mieux caract ris s dans le domaine de la biologie mol culaire et actuellement il est souvent utilis comme organisme h te fiable dans la fabrication de prot ines recombinantes Plasmides Les plasmides sont des petites mol cules d ADN en forme d anneau On ne les trouve que dans les bact ries o ils servent de r servoir suppl mentaire d information g n tique Toutes les bact ries ne poss dent pas de plasmide LADN de plasmide se multiplie ind pendam ment du chromosome de la bact rie et est pendant
21. lon utilisez une poche vide L lectrophor se dure env 60 minutes 140V 120mA Attention Seul le responsable du cours utilise les appareils Quand l lectrophor se est termin e la responsable du cours portant des gants te soigneusement le support dagarose de la cuve lectrophor se Le gel est valu sous la lampe UV Attention La lumi re UV peut endommager les yeux Fermez toujours l cran protecteur avant d enclencher l appareil 19 U NOVARTIS Evaluation Pour chacun des trois plasmides utilis s GEM pBluescript et pUC18 la s quence d identification sp cifique reconnue de Nci1 est pr sente plusieurs fois Les positions de cette s quence de reconnaissance sont indiqu es ci dessous dans les trois cartes de plas mides Elles permettent de calculer la taille des fragments d ADN S quence de reconnaissance de l enzyme de restriction Nci1 CC G C GG GG C G TCC Ncil 2203 l Ncil 2238 Ncil 2460 Ncil 1702 Ncil 2663 Amp pGEM1 2865 bp MCS me LS Ncil 41 42 Ncil 1351 lt lacZ unvollst ndig Ncil 655 Ncil 2581 Amp pBluescript SK Ncil 659 2958 bp MCS pee Ncil 715 716 m Ncil 2230 Ncil 1534 Ncil 49 Ncil 2234 Ncil 84 j AF Amp lacZ MCS ma i Le Ncil 1883 Ncil 436 437 7 Ncil 1187 20 U NOVARTIS Marqueur PGEM 1 pBS pUC18 rouge blanc rouge blancrouge blanc pt LV t 2176 bp 1766 bp
22. ropipettes ii ee se se ee a AA ee ee Re Re Ee ee ee ee ee Gee Re ee ee ee ee ee ee Re 10 Mode d emploi de la centrifugeuse inner 13 Exp rience T Piriieation de ADN EE Ee a ea 1 4 Exp rience 2 Caract risation de l ADN par analyse de restriction 16 Exp rience 3 S paration et mise en vidence de fragments d ADN par lectrophor se SL OR RE RI OE OE EE nn nee l 3 Un NOVARTIS Exp rimenter le g nie g n tique Les chercheurs qui travaillent sur l ADN ne sont g n ralement pas en mesure d observer directement la plupart de leurs exp riences En effet la taille des macromol cules cellulaires comme l ADN ou les prot ines est de l ordre du nanometre Bien que le fil d ADN dans une cellule humaine atteindrait une longueur de pr s de 2 metres la mol cule n est pas visible au microscope en raison de son petit diam tre de 1 1 nanom tres Afin de rendre visible l ADN il faut des millions voire des milliards de copies de la mol cule Pour ce faire des s quences plus courtes d ADN sont int gr es dans des mol cules d ADN circulaires appel es plasmides qui se multiplient au sein des cellules des bact ries ind pendamment du cycle de la cellule Lorsqu on multiplie les bact ries on obtient en peu de temps le nombre de copies d ADN souhait es amplification Des ADN diff rents appartenant des esp ces diff rentes ou des individus diff rents au sein d une m me esp ce par ex se diff rencient par leur
23. s quence de nucl otides L aus si les diff rences dans la s quence de bases ne pouvant s observer directement sur la mo l cule on peut en rendre compte indirectement par l emploi denzymes de restriction ana lyse de restriction Le but du cours consiste diff rencier divers ADN par analyse de restriction Vous travaille rez avec des cellules de bact ries qui contiennent soit les plasmides pGEM1 pUC18 ou pBluescript La premi re exp rience consiste isoler l ADN de plasmide par analyse de res triction Au cours de la seconde exp rience vous d couperez cet ADN de plasmide l aide dun enzyme de restriction afin de s parer au moyen de l lectrophor se sur gel au cours de la troisi me exp rience les morceaux d ADN ainsi obtenus A la fin du cours vous devriez tre en mesure de d terminer quel est l ADN de plasmide que votre groupe aura analys Vous allez r aliser pendant le cours des exp riences avec des quantit s tr s petites Cela demande un travail tr s pr cis et tr s concentr Un NOVARTIS Les bases G nie g n tique N Das Rakteriarm vermeahrl die rekcmbiaante DNS animal Bakterienzelle Zellwand Plasmamembran Ribosom Cytoplasma Genom Plasmid Le g nie g n tique permet d isoler des g nes du mat riel h r ditaire et d analyser les informations contenues dans les g nes Gr ce au g nie g n tique des g nes suppl mentaires peuvent tre intro
24. sur la tige de la pipette Attention Ne jamais aspirer de liquide avec une micropipette sans pointe Presser le bouton A jusqu la premi re but e avant de plonger la pointe dans le liquide destin tre aspir Plonger la pointe verticalement dans le liquide et rel cher lentement la pression sur le bouton le liquide est aspir Attendre deux trois secondes puis retirer la pointe de la pipette du liquide Placer la pointe de la pipette contre la paroi du second r cipient en position oblique et presser lentement le bouton jusqu la premi re but e Le liquide est ainsi expuls Ensuite presser le bouton jusqu la seconde but e L air contenu ainsi comprim expulse alors l ventuel liquide r siduel hors de la pointe Retirer la pipette du r cipient tout en maintenant le bouton enfonc et ne rel cher le bouton qu une fois l op ration effectu e L limination de la pointe utilis e a lieu en pressant le bouton d jection B 12 LD NOVARTIS oc Mode d emploi de la centrifugeuse Cet appareil permet de centrifuger des prouvettes Eppendorf de 1 5 ml et 2 ml 1 Ouvrez le couvercle de la centrifugeuse en appuyant sur le bouton open 2 R partissez les prouvettes de mani re sym trique dans le rotor Attention Il faut toujours placer des prouvettes de poids environ quivalent les unes en face des autres dans le rotor afin d viter tout d s quilibre lors de la
25. t leurs parois cellu laires poreuses et jusqu un certain degr perm ables l ADN de plasmide Les bact ries ainsi trait es sont appel es bact ries comp tentes Lorsqu on incube les bact ries comp tentes avec de l ADN de plasmide dans certaines conditions une partie d entre elles va in corporer l ADN de plasmide Afin de reconna tre ces bact ries on les s lectionne en fonction d une caract ristique qu elles ont acquise par l incorporation d ADN Bact rie sensible l ampicilline Traitement par une solution saline dE f v Bact rie comp tente ADN de plasmide g Bact rie transform e r sistante l ampicilline Quand un plasmide g n tiquement modifi est introduit dans une bact rie la bact rie de vient un organisme g n tiquement modifi OGM La production et le maniement des OGM sont strictement r glement s par la loi La r sistance aux antibiotiques Les plasmides pGEM1 pUC18 et pBluescript portent comme marqueur s lectif le g ne de lenzyme lactamase responsable de la r sistance lampicilline Chez l humain la r sis tance Vampicilline peut tre contr e par l ajout d acide clavulanique qui agit comme inhibi teur de enzyme B lactamase Le g ne d ampicilline peut donc tre class comme un risque mineur Enzymes enzymes de restriction Les enzymes sont des prot ines capables de catalyser des r actions chimiques transforma tion m tabolique Les enzymes de r
26. tegeg dLAEAAEELS totgcaaaaa CagtLAttaLte taadategett ggcgaccgag ELEELaAAAAE CJ LOEGgag ELaekiEide gaataagggc dEattLatEea aacaaatagg ttactateart gttteggtga gtctgtaagc ggtgtcgggg COOACICECT gttgagcace ggccacgggg dAJCCCTAaECE gccggtgatg dattaogELtEee gtT Caaccaa agEeEdgaLAE acataacctt ttLgggetgcea gtgagtegta aggcggtttg CG ECOG ES ateaggagat taaaaaggcc aAadategacde tecccetgga gEEEESE LIE GadULEEAYLY Sgacogetge atcgccactg tacagagttg ELAEELELD dEaAAdEEAGE aaaaggatct ddacteacgr EEEAAAEEAA cagttaccaa Ga tagtEbgese CCCEAUEUCT ddacCcCageca ccagtctatr CaaegLEdEr AECOAUCECE agcggttagc aAEteatggtu EEEEAEESAEE EEgAtetude GELEIER EE ALEEAAELES cagcgtttert gacacggaaa gggttattgrt gAELtEEELE gacattaaor tgacggtgaa ggatgccggg CogeLtaac EESLLALYES gEEAEFAEAA EELYFSAOEA tececategg ccggccacga CGEJACCALEC accgactetg tacacaatta atgtatiata ggtcgactct ttaatttcga cgtrattggge cggcgagcgg aacgcaggaa gcgttgctgg ECaagicaga agELtsEELEF GEEL AOJECOEEC QCCE LTAEGCg gcagcagcca ttgaagtggt Ctgaagccag gctggtagcg caagaagatc taagggattt aaatgaagtt LAELtaated EGACECCECO gcaatgatac gecggaaggg aaLttgttEgET gEEALEtSELaA gAELEEERAF Eoettegsgie aALtggcagear gdtdadgta t ccggegtcaa ggaaaacgtt atgtraaccca gggtgagcaa tAttgaatar ctcatgageg ACatELeece tataaaaata aacctotgac agcagacaag tatgeggcart ACLC CLOCAL ggaatggtgc Eacecacgce Caatgccgoc COCIECCIoc ccggggtgcg aedggeadLEr ggettgtaca gacatacgar
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