Red Cell EZ Type Rh DI
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1. Emballage pour conservation lt 20 C ABC 303371 DR DQ 303372 1 Huit plaques de 96 tubes avec code de couleur scell es par des feuilles de couverture adh sives marqu es Elles contiennent les amorces sp cifiques de l all le HLA et les amorces du contr le interne 2 4x 700 uL R actif HLA PCR 3 9 x feuilles de thermosoudure 403905 Emballage pour conservation de 15 25 303370 1 8x2 E Gel Silicone Spacer Pad 1 mm Non inclus dans la trousse fourni dans l envoi Mat riel n cessaire non fourni Pour la PCR Taq Polym rase native ou recombinante 5 U uL Ne pas utiliser d autres polym rases thermostables ou pr parations de Taq polym rase hot start Les enzymes suivantes ont t valid es pour tre utilis es avec le HLA EZ Type coffret L utilisation d autres enzymes doit tre valid e par l utilisateur Fournisseur Produit Applied Biosystems AmpliTaq recombinant Taq polymerase Promega GoTaq Flexi DNA Polymerase Genaxis AxiTaq Thermocycleur programmable avec bloc acceptant 96 tubes PCR de 0 2 mL Micropipettes ajustables pour distribuer 1 1000 uL avec des embouts filtr s st riles Eau DNA et DNase free Bain de glace ou blocs refroidissant pour tubes de 0 6 mL ou 1 5 mL tubes et tubes PCR 0 2 mL Portoir pour tubes PCR 0 2 mL Vortex Tubes coniques en polypropyl ne 0 5 1 7 mL DNA et DNase free 10 javel ou autre agent inactivateur d ADN Apparei2. les chantillons d ADN doivent avoir une concentration entre 12 5 ng ul et 100 ng uL avec un ratio 260 nm 280 nm gt 1 60 Une faible amplification peut r sulter d une quantit insuffisante d ADN ajout e la r action PCR ou d un chantillon d ADN pauvrement purifi Des r sultats faux n gatifs peuvent r sulter d chantillons mal manipul s d erreurs de proc dure d inhibiteurs d amplification ou d chantillons d ADN pauvrement purifi Des r sultats faussement n gatifs peuvent provenir de l utilisation d une autre enzyme polym rase de l ADN que celles list es dans Mat riel requis mais non fourni Une contamination d acides nucl iques d ADN g nomique charg en exc s lors de l amplification ou une mauvaise utilisation des temp ratures indiqu es peut provoquer des r sultats faux positifs Cet essai a t d montr fonctionnant correctement lorsque l amplification est pratiqu e en utilisant les thermocycleurs PE 9600 PE 9700 et PE 2720 Perkin Elmer Applied Biosystems le PTC 100 et PTC 200 BioRad et le Mastercycler and Mastercycler EP Eppendorf Quelques ajustements au niveau des param tres du programme peuvent tre requis lors d une utilisation avec d autres thermocycleurs Les thermocycleurs doivent tre calibr s et entretenus en accord avec les instructions du fabriquant Les r sultats de cet essai ne doivent pas tre utilis s comme le seul fondement d un jugement clinique
3. PERFORMANCES SP CIFIQUES NOTE Les amorces pour chaque locus de Classe et de Classe Il sont les m mes pour tous les produits HLA EZ Type coffret Par cons quent les caract ristiques de performances ici d crites pour les analyses A B C Low et DR DQ Low s appliquent toutes les trousses HLA EZ Type coffret de faible r solution Pr cision La pr cision de l essai HLA EZ Type coffret a t valu e par 3 tudes comparatives diff rentes LIFECODES HLA EZ Type coffret 7 303371 IFUFR REV C Comparaison du HLA EZ Type coffret avec un essai de typage mol culaire ADN Cinquante chantillons couvrant une large gamme d all les des HLA de Classe et 51 chantillons couvrant une large gamme d all les des HLA de Classe Il ont t g notyp s avec l essai HLA EZ Type coffret A B C Low ou DR DQ Low Les chantillons ont galement t test s pour des all les de Classe ou de Classe Il avec une autre m thode de faible r solution PCR de typage mol culaire dans une valuation ind pendante externe La corr lation entre les deux m thodes a t de 100 pour la classe avec une limite basse de l intervalle de confiance 95 de 0 942 95 de probabilit que la corr lation soit dau moins 94 2 Et de 100 pour la classe Il avec une limite basse de l intervalle de confiance 95 de 0 943 95 de probabilit que la corr lation soit dau moins 94 3 Dans la deuxi me tude 52 chantillons couvrant un large panel d al
4. cong lateur lt 20 C jusqu 7 jours D tection NOTE Les tapes de d tection doivent avoir lieu dans une zone s par e de celle utilis e comme zone pr PCR Les appareils ne doivent pas tre partag s entre ces zones afin d viter des contaminations crois es 16 Si les tubes PCR ont t congel s les enlever du cong lateur et les d geler avant utilisation 17 Pr parer une zone de travail en mettant du papier absorbant et mettre en place le E Base Motherbase l eau d sionis e et les pipettes 18 Enlever le E Gel de son sachet et enlever le peigne Nettoyer la partie sup rieure du gel avec un tissu de laboratoire humide si n cessaire 19 Noter la partie sup rieure de la plaque du gel avec un marqueur 20 Pipeter 16 uL d eau d sionis e dans chaque puits du gel except pour le puits M 21 Si vous souhaitez utiliser un DNA ladder pipeter le volume n cessaire et completer avec de l eau si n cessaire pour obtenir un volume final de 15 20 uL 22 Perforer la feuille adh sive du premier tube de PCR tube A1 et pipeter 6 uL dans le puits correspondant du E Gel R p ter ce processus pour chacun des tubes de PCR et leur puits correspondant sur le gel Changer d embout de pipette apr s chaque transfert NOTE Ce processus est grandement facilit par l utilisation d une pipette multicanaux de 8 ou de 12 canaux capable de d livrer un volume allant de 5 20 uL 23 Brancher la Motherbase Un signal lum
5. de couleur et a vir du rouge au jaune Ne pas utiliser les gels qui apparaissent craquel s secs ou semblent avoir t congel s ou contamin s Les tubes PCR et les r actifs inclus dans ce coffret ne doivent pas tre utilis s conjointement avec des autres trousses Etant donn variations de performance des diff rents thermocycleurs le laboratoire devra peut tre tablir des param tres ajust s pour le programme du thermocycleur afin d obtenir des r sultats valides Il faudra peut tre galement adapter le joint d espacement appropri pour assurer la fermeture compl te de la feuille de scellage pendant la PCR La pr paration de l amplification peut se r aliser sur la paillasse temp rature du laboratoire 20 25 C Une temp rature plus lev e pourrait entra ner des art facts Si tel tait le cas le master mix et la plaque contenant les primers devraient tre maintenu sur une plaque froide ou sur de la glace pendant la pr paration Ne pas isoler l chantillon d ADN partir de sang h parin L h parine peut interf rer avec l amplification PCR La PCR est couverte par les licences de Roche Molecular Systems et F Hoffman LaRoche Ltd Pour plus d informations sur les licences pour utiliser la PCR contacter aux Etats Unis le Directeur des Licences chez Roche Molecular Systems Inc 1145 Atlantic Avenue Alameda California 94501 ou en dehors des Etats Unis le Responsable des Licences PCR F Hoffmann
6. 5 Crossroads Circle Cipalstraat 3 Waukesha WI 53186 USA B 2440 Geel Belgium US and International Contact Information Customer Service customerservice gen probe com Technical Support technicalsupport gen probe com www gen probe com 2005 2013 Gen Probe Incorporated 303371 IFUFR Rev C 2013 03 22 LIFECODES HLA EZ Type coffret 8 303371 IFUFR REV C
7. La Roche Ltd Grenzacherstr 124 CH 4070 Basel Suisse La pratique PCR dans le laboratoire La PCR est une m thode extr mement puissante qui permet d amplifier m me la plus petite quantit d ADN Les plus grandes pr cautions sont respecter pour viter les contaminations li es notamment aux produits des PCRs ant rieures Eviter la contamination par le produit de la PCR d amplifications ant rieures est d une importance particuli re Les pr cautions suivantes sont extr mement importantes o S paration spatiale de la zone pr PCR isolement et conservation de l ADN mise en place de la PCR et de la zone post PCR thermo cycleur chargement des gels et lectrophor se valuation Les instruments et les consommables des zones post PCR ne doivent entrer dans la zone pr PCR o Utiliser des pipettes avec une protection a rosole embouts filtr s st riles la fois dans la zone pr PCR et dans la zone post PCR o Le test de contr le n gatif CN tube de PCR n 1 pour les trousses DR DQ tubes 1 25 73 pour les A B C est un contr le environnemental destin d tecter la contamination par de l ADN et doit toujours tre r alis en parall le avec les amplifications des chantillons AVERTISSEMENTS Lorsque l essai est termin jeter le mat riel comme d chet dangereux et d contaminer le mat riel r utilisable avec 10 de javel ou un autre agent inactivateur d ADN Le transilluminateur UV utilis pour visua
8. MODE D EMPLO GEN PROBE LIF ECODES LIFECODES HLA EZ Type coffret A B C Low DR DQ Low LR ABC LR DRDQ 0843 lt 20 C 25 C R actifs ABC 303371 E Gels 303370 DR DQ 303372 15 C TABLE DES MATI RES UMLS ATIONS PR VUES EE 2 SOMMAIRE ET EXPLICAT ION aerer Eed 2 ad TL LeS EE 2 COMPOSITION DU COFFRET EE 2 Gd Un E 3 Ne 3 CHANTILLONS nada idiote mme 3 MODE OP RATOIRE ad eee nue ennemie 4 O EE A Mat rielin c ssair on fOUnnI t a nine mme MODEL ne dis eua den Das berne SEENEee AE E e ane AE iE Ei 4 attente A CONTROLE DE QUALIT EE 7 INTERPR TATION DES R SULTATS rnnnnncnnnenannuudnnnaininesuntinnsnneian 7 LIMITES DE LA HERE eege 7 PERFORMANCES SP CIFIQUES inner nine nee nee ie nnine nine nnnineneee 7 H F RENGES mmneunaamnmaunmonmenuaunauurtueaninmenneennnetininsneneniinl 8 LIFECODES HLA EZ Type coffret 1 303371 IFUFR REV C UTILISATIONS PR VUES LIFECODES HLA EZ Type coffret est un essai permettant la d termination des all les HLA de Classe et de Classe Il faible r solution en utilisant une amplification PCR d ADN g nomique humain A B C Low pour le typage des locus A B et C de Classe DR DQ Low pour le typage des locus DR et DQ de Classe Il SOMMAIRE ET EXPLICATION La m thode tablie pour la d termination des antig nes HLA a t pendant des ann es le test de lymphotoxicit Cependant avec l av nement des technologies de PCR les techniques de
9. Placer la plaque d amorce sur le fond du portoir de l appareil de thermosoudure Centrer une feuille de thermosoudure sur le dessus de la plaque d amorce Orienter la feuille de sorte que le coin avec l encoche soit sur le coin inf rieur gauche de la plaque Si l on scelle un morceau de plaque couper la feuille pour l ajuster bonne grandeur avant de sceller Garder le reste de la feuille pour un autre essai LIFECODES HLA EZ Type coffret 5 303371 IFUFR REV C NOTE Les feuilles de thermosoudure ont une face permettant le scellage qui doit tre orient e vers le bas vers la plaque d amorce pour que le scellement soit correct Le coin de la feuille de scellage avec l encoche repr sente un rep re visuel facilitant la bonne orientation Si la feuille est coup e pour tre ajust e un morceau de plaque s assurer de conserver le morceau de feuille restant de mani re ce que l orientation soit connue Sceller avec la mauvaise face orient e vers le bas entra nera une fuite du tube et un chec possible de l analyse 11 Une fois la feuille de thermosoudure correctement positionn e abaisser l l ment chauffant sur la plaque et appuyer pendant 3 5 secondes Rel cher l l ment chauffant et lui permettre de se relever Utiliser imm diatement le rouleau de scellage pour faire adh rer fermement la feuille la plaque Retirer la plaque de l appareil de thermosoudure NOTE Une dur e de scellage de plus de 5 secondes ou une pression exce
10. e sp cifique de PCR dans laquelle l amplification ne se produit que si l all le est pr sent Les chantillons ne contenant pas la cible pour un ensemble d amorces sp cifiques d un all le ne produisent pas ce produit particulier de la PCR L analyse par PCR SSP demande par cons quent la r alisation en parall le d un certain nombre d amplifications Dans le programme Touch Down Program d crit dans la proc dure de l analyse une p riode de d naturation initiale est suivie de 10 cycles de PRC deux temp ratures avec une temp rature d hybridation lev e 65 C qui garantit une amplification sp cifique de toutes les r actions SSP Viennent ensuite 20 cycles d une PCR trois temp ratures avec une temp rature d hybridation basse qui favorise une amplification suppl mentaire des produits sp cifiques de la PCR L amplification des amorces d un contr le interne ciblant l hormone de croissance humaine HGH prouve les bonnes conditions de r action pour chacun des tubes de PCR Les tubes de contr le n gatif d tectent la contamination en ADN exog ne si elle existe Les produits de la PCR sont s par s par lectrophor se sur gel d agarose sur des E Gels pr coul s Pendant l lectrophor se les produits de la PCR sont galement color s par du bromure d thidium Les produits s par s sont ensuite examin s sur un transilluminateur ultraviolet UV Un enregistrement de l analyse peut tre r alis sous la forme d une image phot
11. ercycler Mastercycler EP PTC 200 PE9700 avec bloc en or en argent doit tre ajust e de 1 0 1 5 sec pour la chauffage et le refroidissement PCR 3 Allumer le thermocycleur l avance afin de s assurer que le couvercle chauffant a le temps d atteindre la temp rature op rationnelle V rifier le programme pour tre s r qu il n a pas chang 4 Pr parer les surfaces de travail et les pipettes en les nettoyants avec de l eau de javel 10 ou un autre agent inactivateur d ADN 5 D terminer le nombre d chantillons tester Retirer les plaques d amorce ou les morceaux de plaques n cessaires la Taq polym rase et suffisamment de r actif de PCR du cong lateur et les d geler temp rature ambiante Garder tous les r actifs sur de la glace ou dans un bloc r frig r 6 Allumer l appareil de thermosoudure et lui permettre d atteindre la temp rature op rationnelle 5 7 min 7 Utiliser le tableau de formulation du m lange ma tre tableau 2 ci apr s pour pr parer un m lange ma tre pour tous les chantillons NOTE La pr paration de l amplification peut se r aliser sur la paillasse temp rature du laboratoire 20 25 C Une temp rature plus lev e pourrait entra ner des art facts Si tel tait le cas le master mix et la plaque contenant les primers devraient tre maintenu sur une plaque froide ou sur de la glace pendant la pr paration Pr paration du m lange ma tre limination du c
12. ineux rouge va appara tre et le chronom tre s allume Utiliser le bouton power bouton droit pour basculer vers le mode EG au lieu du mode EP 24 Glisser le gel sous les deux lectrodes de l E Base de la Motherbase et placer le gel de sorte que ses lectrodes fassent contact avec les lectrodes de l appareil 25 Utiliser le bouton gauche jusqu atteindre 9 minutes Appuyer sur le bouton power bouton droit pour commencer l lectrophor se Le signal rouge va tourner au vert pendant que la migration est en cours 26 A la fin de l lectrophor se le signal vert va changer en un signal rouge flash et une alarme va retentir Appuyer sur le bouton power pour arr ter la migration Le signal rouge flash deviendra un signal rouge stable D brancher l appareil et enlever le gel de la Motherbase LIFECODES HLA EZ Type coffret 6 303371 IFUFR REV C 27 Placer le gel sur le transilluminateur UV pour l observation des bandes Le gel doit tre regard et enregistr end ans les 20 minutes Si un enregistrement de l essai est d sir une photo du gel doit tre prise en utilisant un syst me de documentation de gels CONTR LE DE QUALIT Un produit de PCR de l un des sets d amorces de contr le interne 430 bp 800 bp ou 1070 bp en fonction du tube de PCR doit tre d tect pour chaque amplification sauf pour le contr le n gatif Cependant l amplification sp cifique de l all le est en comp tition avec le contr le i
13. l les de classe et Il on t typ s avec les kits HLA EZ Type coffret A B C Low ou DR DQ Low Les chantillons ont galement t test s par une technique bas e sur la PCR en basse r solution dans certains cas en haute r solution dans d autres La correlation entre les techniques pour l ensemble des chantillons a t de 100 pour les deux classes La limite basse de l intervalle de confiance 95 a t de 0 944 pour les deux comparaisons 95 de probabilit que la corr lation soit d au moins 94 4 Comparaison des r sultats du HLA EZ Type coffret au s quen age ADN Trente chantillons couvrant une large gamme d all les HLA de Classe ou de Classe II ont t test s avec l essai HLA EZ Type coffret A B C Low or DR DQ Low Les r sultats ont t compar s aux r sultats d un g notypage HLA de haute r solution s quen age ou PCR SSP de haute r solution La concordance entre les deux m thodes tait de 100 Pr cision de l essai La reproductibilit de l essai HLA EZ Type coffret a t d termin e En r sum deux chantillons repr sentant une rang e d all les ont t test s dans 20 essais s par s pour l essai A B C Low pour le DR DQ Low deux chantillons ont t test s trois fois dans 10 essais diff rents Les r sultats d montrent 100 de concordance inter s ries et pour le DR DQ intra s rie R F RENCES 1 Terasaki PI Bernoco D Park MS Ozturk G Iwaki Y Microdroplet testing fo
14. l de thermosoudure Rouleau de scellement Pour l lectrophor se et l analyse E Base Motherbase Portoir pour tubes PCR 0 2 mL Micropipettes ajustables pour distribuer 1 20 uL avec des embouts filtr s st riles Papier absorbant pour table de laboratoire Transilluminateur UV 10 javel ou autre agent inactivateur d ADN Eau d sionis e ou distill e Syst me de documentation des gels En option Un marqueur de poids mol culaire ADN 405517 Pipettes multicanaux 8 ou 12 canaux capables de d livrer 5 20 uL Bloc froid ou bain de glace permettant de recevoir les plaques PCR de 0 2 mL voir Pr cautions Proc dure l avance 1 _Isoler l ADN g nomique de tous les chantillons tester Chaque chantillon doit avoir une concentration d ADN entre 12 5 et 100 ng L avec un ratio 260 nm 280 nm entre gt 1 60 2 Programmer le thermo cycleur avec le programme HLA EZ Type coffret PCR qui est le m me pour toutes les trousses HLA EZ Type coffret Ce programme est le suivant 96 C 120 secondes 96 C 15 secondes 65 C 60 secondes 10 cycles LIFECODES HLA EZ Type coffret 4 303371 IFUFR REV C 96 C 15 secondes 61 C 50 secondes 20 cycles 722 C 30 secondes 4 C Maintenu NOTE Ce programme de cycles a t test avec des thermocycleurs d Applied Biosystems PE9700 PE9600 PE2720 Bio Rad PTC 100 PTC 200 et Eppendorf Mastercycler Mastercycler EP La vitesse de rampe sur des cycleurs plus rapides Mast
15. liser les bandes des amplicons met une forte lumi re ultraviolette ce qui peut endommager les yeux et la peau Toujours porter des habits protecteurs et des verres ou cran bloquant les UV lors de cette op ration Les E Gel contiennent une petite quantit de bromure d thidium comme colorant ADN Le bromure d thidium est un mutag ne humain connu Ne pas ouvrir les cassettes de gel Utiliser les gels selon les r glements locaux en vigueur CHANTILLONS Isoler l ADN en utilisant une m thode publi e ou une trousse commerciale destin e cet effet Resuspendre l ADN dans de l eau st rile ou dans 10 mM de Tris pH 8 0 9 0 Les chantillons ne doivent pas tre r hydrat s dans des solutions contenant plus de 0 5 mM d EDTA ou d autres agents ch lateurs Ceci peut interf rer avec la PCR Les chantillons d ADN peuvent tre test s imm diatement apr s l isolement ou conserv s dans un cong lateur poss dant un syst me de d cong lation automatique 20 C ou plus pour une p riode tendue jusqu 6 ans sans affecter les r sultats Les chantillons d ADN devraient tre dilu s une concentration de 12 5 100 ng uL avec un ratio 260 nm 280 nm gt 1 60 La pr sence de contaminants de prot ine d ARN h parine EDTA ou autres agents ch lateurs peut interf rer avec l amplification PCR d ADN purifi LIFECODES HLA EZ Type coffret 3 303371 IFUFR REV C MODE OP RATOIRE Mat riel fourni
16. nterne PCR de sorte que dans les amplifications positives pour les r actions sp cifiques du HLA le produit du contr le interne peut tre faible ou absent Ceci n est pas inqui tant Cependant si de ADN a t incorpor dans un tube PCR et qu aucune bande contr le ou bande sp cifique de l all le ne sont observ es dans cette ligne l chec d amplification est fortement indiqu De tels checs d amplification peuvent r sulter de la d t rioration d un r actif d une mauvaise programmation du protocole PCR sur le thermocycleur d un chantillon ADN pauvrement purifi d une quantit insuffisante d ADN charg e lors de la PCR d une perte de volume dans un tube de PCR mal scell ou d une erreur de pipetage d un r actif lors de la r alisation de la PCR La ligne du contr le n gatif ne doit pas contenir de bandes de produits PCR La pr sence d amplicon sp cifique dans la ligne du contr le n gatif indique une contamination par de l ADN du m lange ma tre Pour chaque essai HLA EZ Type coffret des amorces pour un contr le interne plus large du produit de la PCR sont inclues dans certains tubes de PCR Ces tubes sont r partis en suivant un sch ma dans toute la plaque d amorce Ce sch ma est not sur la feuille d enregistrement de l essai et peut tre compar aux bandes du contr le interne sur le gel pour v rifier la validit du chargement du gel Les proc dures internes de contr le qualit sont appliq
17. ographique sur pellicule ou num rique La d termination des all les est r alis e en enregistrant les bandes sp cifiques des all les partir de l image du gel sur le tableau de r sultats incluse Le mod le des bandes sp cifiques des all les est alors compar aux mod les des bandes des tables d interpr tation COMPOSITION DU COFFRET Nombre maximal de tests par coffret A B C Low 8 typages par coffret 96 r actions DR DQ Low 24 typages par coffret 32 r actions All reagents should be stored as directed by the label A B C Low Plaque d Amorce plaque de PCR de 96 tubes avec des amorces sp cifiques des all les HLA et des 403906 amorces de contr le interne HGH lyophilis es sur la surface interne La plaque est scell e par une DRDAQ Low feuille de couverture Pr t l emploi 403907 HLAPR 403908 R actif HLA PCR un tampon contenant du chlorure de magn sium des d soxynucl otides triphosphates libres dNTPs du glyc rol du rouge de cr sol et autres composants de marque diluer avant utilisation E Gel 403909 E Gel gels d agarose pr faits 96 puits 2 utilis s pour la s paration de produits de PCR Pr t l emploi LIFECODES HLA EZ Type coffret 2 303371 IFUFR REV C PR CAUTIONS Ne pas utiliser les r actifs ou gels au del de la date de p remption Ne pas utiliser les r actifs qui sont troubles ou contamin s Ne pas utiliser un r actif de PCR HLA HLA PCR Reagent qui a chang
18. ontr le n gatif et addition de l ADN Nombre de Eau DNA et R actif HLA Taq poly Volume Total Volume Echantillon Volume final tubes par DNase free uL PCR pL m rase uL du Master restant ADN pL du m lange typage Mix uL apr s PCR de addition aux l chant tubes de illon pL contr le n gatif pL Pour les chantillons dans la fourchette de 25 100 ng uL 24 163 81 2 2 246 2 236 2 26 262 2 32 219 108 3 0 330 320 35 355 48 310 154 4 5 468 5 458 5 50 508 5 96 638 319 8 5 965 5 935 5 103 1038 5 Pour les chantillons dans la fourchette de 12 5 25 ng L 24 137 81 2 2 220 2 210 2 52 262 2 32 184 108 3 0 295 285 70 355 48 260 154 4 5 418 5 408 5 100 508 5 96 535 319 8 5 862 5 832 5 206 1038 5 8 Retirer et jeter le film de scellement de la plaque d amorce ou du morceau de la plaque d amorce Pipeter 10 uL du m lange PCR dans le s tube s du contr le n gatif comme indiqu sur le tableau de r sultats AVANT d ajouter la quantit requise de l chantillon d ADN au m lange ma tre 9 Ajouter l chantillon d ADN au m lange ma tre PCR Bien m langer et pipeter 10 uL du m lange PCR de l chantillon dans chacun des tubes de la plaque PCR correspondant au format de typage 31 tubes pour le DR DQ Low 93 tubes pour le A B C Low Faire attention ne pas ajouter un chantillon suppl mentaire au x tube s du contr le n gatif 10
19. r HLA A B C and D antigens American Journal of Clinical Pathology 1978 69 103 120 2 Mullis KB Faloona F Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed chain reaction Meth Enzymology 1987 155 335 350 3 Newton CR Graham A Heptinstall LE Powell SJ Summers C Kalsheker N Smith JC Markham AF Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system ARMS Nucleic Acids Research 1989 17 2503 2516 4 Olerup O Zetterquist H HLA DR typing by PCR amplification with sequence specific primers PCR SSP in two hours An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipient matching in cadaveric transplantation Tissue Antigens 1992 39 225 235 5 Bunce M O Neill CM Barnardo MC Krausa P Browning MJ Morris PJ Welsh KI Phototyping comprehensive DNA typing for HLA A B C DRB1 DRB3 DRB4 DRB5 amp DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence specific primers PCR SSP Tissue Antigens 1995 46 355 367 6 Bunce M Young NT Welsh KI Molecular HLA Typing The brave new world Transplantation 1997 64 1505 1513 7 Marsh SG Albert ED Bodmer WF Bontrop RE Dupont B Erlich HA Geraghty DE Hansen JA Mach B Mayr WR Parham P Petersdorf EW Sasazuki T Schreuder GM Strominger JL Svejgaard A Terasaki PI Nomenclature for factors of the HLA system 2002 Tissue Antigens 2002 60 407 464 Ml ECTREP Gen Probe Incorporated Qarad b v b a 2092
20. ssive pendant l op ration de scellage peut r duire l ouverture des tubes de PCR rendant difficile la r cup ration des produits amplifi s 12 Examiner les tubes PCR apr s la mise en place de la feuille de thermosoudure Si n cessaire d loger les bulles dans le fond des tubes PCR Forcer les gouttes se trouvant sur la paroi aller dans le volume de r action Cela peut tre fait en tapant d licatement les tubes sur la table ou par une br ve centrifugation dans une centrifugeuse pour microplaque 13 D marrer le programme HLA EZ Type coffret sur le thermocycleur Transf rer la les plaque s d amorce de la glace ou du bloc refroidissant vers le bloc du thermocycleur 14 Placer le Silicone Spacer Pad fermement sur la feuille adh sive de couverture pour couvrir chaque tube soyez certain d aligner le pad correctement et soyez s r que le pad ne se d place pas lors de la fermeture du couvercle chauffant Fermer le couvercle conform ment aux instructions du fabricant du thermocycleur 15 Lorsque le thermocycleur a atteint la derni re tape du programme maintien 4 C enlever les tubes des plaques d amorce du thermocycleur et les transf rer sur un portoir de tube PCR Inspecter chacun des tubes et noter ceux dont le volume para t faible Une perte de volume peut entra ner une mauvaise amplification dans ces tubes Si l lectrophor se n est pas faite directement conserver les tubes au frigo 2 8 C jusqu 3 jours ou au
21. typage des antig nes HLA par l ADN sont devenues courantes dans le laboratoire Par rapport aux m thodes s rologiques les analyses par PCR simplifient l interpr tation des r sultats gr ce leur capacit de distinguer des changements d un seul nucl otide De plus les r actifs synth tiques des analyses par PCR permettent la fois d am liorer la stabilit des composants et de diminuer la variation d un lot l autre La plupart des tests de typage HLA sont des m thodes tapes multiples l tape d amplification des r gions HLA est suivie par une tape de s paration ind pendante m thodes RFLP ou SSOP et une tape de d tection finale En revanche l analyse par PCR SSP augmente la rapidit de l essai et diminue le temps de manipulation La m thode PCR SSP ne demande que deux tapes de travail amplification et d tection parce que l amplification et la s paration se passent pendant la PCR La d tection par lectrophor se en gel d agarose ach ve l analyse Cette utilit inh rente l analyse est encore augment e par l inclusion dans le syst me de gels d agarose pr coul s PRINCIPE Cette analyse est bas e sur la Polymerase Chain Reaction PCR qui permet un enrichissement amplification en s quences d ADN d finies Apr s la r ussite de l amplification l chantillon contient la s quence de l ADN cible en quantit suffisante pour pouvoir tre d tect e L amorce S quence Sp cifique SSP d crit un typ
22. uer INTERPR TATION DES R SULTATS Les produits de la PCR observ s par transillumination UV sont compos s de produits sp cifiques du HLA de produits du contr le interne et rarement d art facts non sp cifiques Pour tous les tubes le produit du contr le interne est le plus important les produits de la PCR sp cifiques du HLA et les art facts sont toujours inf rieurs en taille au contr le interne Se r f rer au tableau des commentaires en page 5 de la feuille de r sultats des documents du lot pour avoir de l information sur les bandes d art facts non sp cifiques les amplifications multiplexes les r actions faibles et les ventuelles r actions crois es Ces commentaires sont sp cifiques pour chaque lot Enregistrer les bandes sp cifiques des all les sur la grille de la feuille d enregistrement incluse Noter les tubes positifs sur le tableau d interpr tation appropri Utiliser les mod les des tableaux d interpr tation pour d terminer les all les pr sents pour chaque locus test LIMITES DE LA TECHNIQUE HLA EZ Type coffret contient des mat riaux pour l amplification de s quences d ADN g nomique par PCR et la d tection qualitative ult rieure de s quences sp cifique de l all le HLA de classe et de classe II par lectrophor se de gel d agarose Des variations inconnues dans les s quences de g ne peuvent affecter les r sultats Pour assurer des r sultats optimaux avec l essai HLA EZ Type coffret
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