FUNGITELL® - Associates of Cape Cod, Inc.
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1. Manipulation des sp cimens 1 Collecte des sp cimens les chantillons de s rum doivent tre collect s dans des tubes vide st riles bouchons rouges ou des tubes s parateurs de s rum SST et laiss s coaguler Le s rum est alors s par du caillot et d cant dans un r cipient appropri sans taux de 1 3 B D Glucane pouvant interf rer avec le dosage 2 Conservation des sp cimens les chantillons de s rum peuvent tre conserv s entre 2 et 8 C avant dosage ou 20 C ou une temp rature plus froide Le test doit tre effectu rapidement pour viter une d gradation possible de l chantillon 3 tiquetage des sp cimens les sp cimens doivent tre clairement tiquet s conform ment aux pratiques approuv es de l tablissement PROC DURE Remarque les r glages peuvent varier en fonction des diff rents instruments et logiciels En g n ral la m thode suivante est applicable param trer le logiciel du lecteur pour collecter les donn es en mode Vmoyenne V rifier les r glages corrects dans le manuel du logiciel pour s assurer que la valeur calcul e est le taux moyen de variation de densit optique pour tous les points de donn es recueillis D finir l intervalle entre les lectures de l instrument au minimum autoris par le logiciel et instrumenter pendant la p riode de 40 minutes du test Les param tres de longueur d onde du logiciel doivent tre de 405 nm moins le bruit2. Le dosage ne d tecte pas les zygomyc tes comme Absidia Mucor et Rhizopus 1 4 qui ne sont pas connus pour produire du 1 3 B D Glucane En outre la phase de levure du Blastomyces dermatitidis produit peu de 1 3 B D Glucane et peut ne pas tre d tect e par le dosage 5 Cette mention doit figurer dans les r sultats des tests du Dosage du Glucane R SUM ET EXPLICATION On observe une incidence accrue des infections fongiques par des pathog nes opportunistes en particulier chez les patients pr sentant un d ficit immunitaire 6 7 8 Les maladies fongiques invasives comme les infections opportunistes sont courantes parmi les affections h matologiques malignes et chez les patients atteints du SIDA et repr sentent un nombre croissant d infections nosocomiales en particulier chez les patients transplant s et ceux recevant des traitements immunosuppresseurs 9 10 De nombreuses maladies fongiques sont acquises par inhalation de spores fongiques du sol de d tritus de plantes de syst mes de traitement de l air et ou de surfaces expos es Certains champignons opportunistes sont pr sents dans sur la peau humaine le tractus intestinal et les muqueuses 11 12 Le diagnostic des mycoses invasives et des fong mies est g n ralement bas sur des techniques diagnostiques ou radiologiques non sp cifiques R cemment les marqueurs biologiques de l infection fongique ont t ajout s aux m thodes de diagnostic d
3. H Niiguchi S Azuma E and Komada Y 2004 False positive plasma 1 3 B D Glucan following immunoglobulin product replacement in adult bone marrow recipient Int J Hematol 80 97 98 Smith P B Benjamin D K Alexander B D Johnson M D Finkelman M A and Steinbach W J 2007 1 gt 3 B D Glucan levels in pediatric patients Preliminary data for the use of the beta glucan test in children Clin Vaccine Immunol 14 924 925 Ostrosky Zeichner L Alexander B D Kett D H Vazquez J Pappas P G Saeki F Ketchum P A Wingard J Schiff R Tamura H Finkelman M A Rex J H 2005 Multicenter clinical evaluation of the 1 3 8 D Glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans Clin Inf Dis 41 299 305 R F RENCES SUPPL MENTAIRES NON CIT ES a b c d Desmet S Van Wijngaerden E Maertens J Verhaegen J Verbeken E De Munter P Meersseman W Van Meensel B Van Eldere J Lagrou K 2009 Serum 1 3 B D Glucan as a diagnostic tool for Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with HIV infection or hematological malignancy J Clin Microbiol 47 3871 3874 Koo S Bryar J M Page J H Baden L R Marty F M 2009 Diagnostic performance of the 1 3 8 D Glucan assay for invasive fungal disease Clin Infect Dis 49 1650 9 Ellis M Ramadi B Finkelman M Hedstrom U Kristenson J Ali Zadeh H and Klingspor L 2007 A ent of
4. Site d s g lg Sri K Total Sg SAS 22 JSE 8 1 32 50 64 0 97 0 39 40 97 5 69 6 1 90 2 14 24 58 3 93 3 17 20 85 0 70 8 5 44 3 14 19 73 7 46 7 36 54 66 7 90 0 3 73 4 25 33 75 8 92 6 37 43 86 0 86 0 6 76 5 21 36 58 3 80 8 30 39 76 9 69 8 6 75 6 0 1 0 0 S O 0 0 S O 0 0 0 1 Total 106 163 65 0 80 9 159 196 81 1 76 8 21 359 inclut un chantillon du Site 6 Lorsque les r sultats obtenus par ACC 359 chantillons et par les centres m dicaux 285 chantillons sont compar s au diagnostic clinique la sensibilit est de 64 3 IC de 58 8 69 9 pour ACC et de 61 5 IC de 55 9 67 2 pour les centres m dicaux La sp cificit est de 86 6 IC de 82 7 90 6 pour ACC et de 79 6 IC de 74 9 84 3 pour les centres m dicaux Tableau 2 Tableau 2 R sultats des tests r alis s par les centres m dicaux pour des valeurs seuil de 60 80 pg ml par site Prouv Probable Sp cificit Sensibilit gt 80 pg ml lt 60 pg ml o0 Site o 2 o 2 y Total Zol 2 Zel Ex 3 a 2ga 2 23 3 E a SER 2 SEL SS 1 32 50 64 0 74 4 28 40 70 0 65 1 4 90 2 12 24 50 0 75 0 15 20 75 0 65 2 5 44 3 22 33 66 7 91 7 40 43 93 0 85 1 S 76 5 22 36 61 1 78 6 30 39 76 9 75 0 7 75 6 Total Sites 88 143 61 5 79 3 113 142 79 6 73 9 21 285 ACC 92 143 64 3 91 1 123 142 86 6 74 1 18 285 Centre n ayant pas r alis de test CA
5. taient n gatifs pour l infection fongique mais pr sentant d autres troubles ont t inclus une sp cificit de 81 1 a t observ e I C de 77 1 85 2 CORR LATIONS DES TESTS Quatre des centres m dicaux ont dos un total de 285 chantillons Les r sultats des tests des centres m dicaux sont corr l s 96 4 avec les r sultats des Associates of Cape Cod Les corr lations entre les r sultats retrouv s par Associates of Cape Cod et ceux retrouv s par les centres m dicaux sont comprises entre 90 6 et 99 2 EXACTITUDE Dans les tudes d exactitude dix 10 chantillons diff rents ont chacun t test s par trois centres m dicaux sur trois jours diff rents La variation intra dosage a t comprise entre 0 9 et 28 9 La variation inter dosage a t comprise entre 3 9 et 23 8 Les quatre 4 chantillons n gatifs ont t exclus de ces deux analyses R F RENCES ig 2 6 21 Lass Florl C 2009 The changing face of epidemiology of invasive fungal dis Odabasi Z Paetznick V Rodriguez J Chen E McGinnis M and Ostrosky Zeichner L 2006 Differences in beta glucan levels of culture supernatants of a variety of fungi Medical Mycology 44 267 272 De Pauw B Walsh T J Donnelly J P et al 2008 Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the Nat
6. C St2 St2 Uk1 Uk4 Uk7 Uk10 Uk13 Uk16 Uk19 D St3 St3 Uk2 Uk5 Uk8 Uk11 Uk14 Uk17 Uk20 E St4 St4 Uk2 Uk5 Uk8 Uk11 Uk14 Uk17 Uk20 F Sts St5 Uk3 Uk6 UKk9 Uk12 Uk15 Uk18 Uk21 G Neg Neg Uk3 Uk6 Uk9 Uk12 Uk15 Uk18 Uk21 H Remarque 1 les puits externes peuvent tre utilis s s il a t d montr que la performance de ces puits est comparable celle des puits internes Remarque 2 pour viter un contamination accidentelle remettre en place le couvercle de la microplaque apr s l ajout des chantillons et des r actifs dans les puits Retirer le couvercle avant de placer la plaque dans le lecteur pour viter une interf rence optique due la condensation 3 Ajout du s rum et du r actif de pr traitement a D congeler les chantillons de s rum temp rature ambiante Bien vortexer tous les chantillons b Transf rer 5 ul d chantillon de s rum dans chacun des puits d sign s Uk au moins en double R p ter la manipulation pour chaque chantillon de s rum c Ajouter 20 ul de r actif de pr traitement de s rum chaque puits contenant du s rum Remarque les tapes b et c peuvent tre conduites dans l ordre inverse selon la pr f rence du technicien d Agiter la plaque pendant 5 10 secondes pour m langer les contenus du puits la fonction agitation du lecteur de plaque peut tre utilis e
7. i Facteur CA Facteur C activ 1 33 8 D Glucane Facteur 8 S facteur B activ Facteur G ative o Facteur G gt Enzyme de procoagulation Enzyme de coagulation Voie inactiv e Boc Leu Gly Arg pNA Boc Leu Gly Arg pNA substrat artificiel MAT RIEL FOURNI AVEC LE KIT FUNGITELL Le kit Fungitell est usage diagnostique in vitro Le mat riel suivant fourni avec chaque kit est suffisant pour doser 110 puits sur deux plaques de microtitration 55 puits chacune 1 R actif Fungitell LAL sp cifique 1 3 B D Glucane lyophilis deux flacons 2 Tampon de reconstitution au Pyrosol Tris HCI 0 2 M pH 7 4 deux flacons Des flacons suppl mentaires de tampon de reconstitution au Pyrosol num ro de catalogue BC051 peuvent tre achet s s par ment 3 Glucan standard pachyman lyophilis et compl ment inerte avec la teneur en 1 3 B D Glucane stipul e sur l tiquette deux flacons Eau pure pour analyse EPA deux flacons 5 Pyroplates microplaques non enduites de 96 puits fond plat avec couvercles sans interf rence de Glucanes deux 6 KCI 1 2 M un flacon 7 KOH 0 25 M un flacon Tout le mat riel ci dessus l exception du standard ne pr sente pas de taux de 1 3 B D Glucane pouvant interf rer avec le dosage MAT RIEL N CESSAIRE NON FOURNI Tout le mat riel doit tre exempt de taux de Glucane pouvant interf rer avec le dosage Le mat riel en verre doit tre d
8. pyrog n par chaleur s che au moins 235 C pendant 7 heures ou un quivalent valid pour tre consid r convenir l emploi 1 Embouts de pipette 250 ul R f PPT25 1000 ul R f PPT10 2 Pipeteurs capables de d livrer des volumes de 5 25 ul et 100 1000 ul 3 Pipette r p tition avec embouts de seringue capable de d livrer 100 pl 4 Tubes essai pour la pr paration de la gamme d talonnage et les m langes r actionnels du traitement du s rum 13 x 100 mm verre de borosilicate R f TB013 Lecteur de plaques thermostat 37 C capable de fonctionner deux longueurs d onde 405 et 490 nm ayant une plage dynamique d au moins 2 0 unit s d absorbance associ un ordinateur ex cutant un logiciel de dosage cin tique appropri 6 Tubes st riles sans glucane bouchon vis pour aliquoter les chantillons la plupart des tubes certifi s sans ARNase ADNase et pyrog ne sont exempts de taux de 1 3 B D Glucane pouvant interf rer avec le dosage 7 Parafilm Ces produits fournis par Associates of Cape Cod Inc ACC sont certifi s sans interf rence avec le dosage des Glucanes Attention les pipettes avec bouchons en coton sont des sources potentielles de contamination au Glucane un MISES EN GARDE ET PR CAUTIONS D EMPLOI Ce produit est r serv au DIAGNOSTIC IN VITRO Le dosage Fungitell requiert une attention rigoureuse la technique et l environ
9. Dosage de 1 3 B D Glucane s rique FUNGITELL Mode d emploi 1 508 540 3444 1 888 395 2221 1 508 540 8680 CAPE COD 5 Fax O INCORPORATED Assistance technique 1 800 848 3248 C 124 Bernard E Saint Jean Drive E Falmouth MA 02536 USA Service client 1 800 525 8378 PN001268 fr Rev 1 ASSOCIATES OF T l phone 4 Num ro gratuit R vis en f vrier 2011 USAGE PR VU Le dosage Fungitell est un dosage colorim trique bas sur la r action prot ase zymog ne pour la d tection qualitative de 1 3 B D Glucane dans le s rum de patients pr sentant des sympt mes ou des conditions m dicales pr disposant les patients une infection fongique invasive La concentration s rique de 1 3 fB D Glucane composant majeur de la paroi cellulaire de diff rents champignons m dicalement importants 1 peut faciliter le diagnostic de mycoses profondes et fong mies 2 Un r sultat positif n indique pas quelle classe de champignon peut provoquer l infection Fungitell doit tre utilis en association avec d autres m thodes diagnostiques comme une culture microbiologique un examen histologique d chantillons biopsiques et un examen radiologique Important il est recommand de fournir les informations suivantes au m decin prescripteur Le dosage Fungitell ne d tecte pas certaines esp ces fongiques comme l esp ce Cryptococcus qui produit de tr s faibles taux de 1 3 B D Glucan 3 4
10. NDIDOSE 1 y avait 107 sujets pr sentant un diagnostic positif de candidose dans l tude prospective Quatre vingt trois sur 107 ont t retrouv s positifs par le dosage Fungitell Une s roth que de cent soixante quinze chantillons a t fournie Associates of Cape Cod Cent quarante cinq sur 175 ont t retrouv s positifs par le dosage Fungitell ASPERGILOSE Un total de 10 sujets pr sentait une aspergillose Huit sur 10 ont t retrouv s positifs par le dosage Fungitell FUSARIOSE Trois sujets pr sentaient une fusariose Deux sur 3 ont t retrouv s positifs par le dosage Fungitell TRAITEMENT M DICAMENTEUX ANTI FONGIQUE La pr sence ou l absence d un traitement m dicamenteux anti fongique n a pas eu d effet statistiquement significatif sur la sensibilit du dosage Cent dix huit sujets sous traitement anti fongique ont t prouvi positifs pour une infection fongique Quatre vingt deux ont t positifs au dosage sensibilit 69 5 IC de 61 2 77 8 En outre vingt quatre 24 sujets ont t positifs mais pas sous traitement anti fongique Dix huit ont t positifs au dosage sensibilit 75 IC de 57 7 92 3 SP CIFICIT Au total 170 sujets ont t retrouv s n gatifs pour l infection fongique et taient des individus apparemment sains La sp cificit a t de 86 5 avec le dosage I C de 82 8 90 1 Lorsque les 26 sujets suppl mentaires qui
11. alys s en recherchant une preuve d interf rence optique et ou des sch ma cin tiques inhabituels 6 Utiliser des v tements de protection appropri s et des gants sans talc lors de la manipulation des pr l vements de patients 7 Le s rum des patients h modialys s peuvent contenir des taux de 1 3 B D Glucane lev s lorsque certaines membranes de dialyse en cellulose sont utilis es 18 19 L h modialyse avec des membranes en triac tate de cellulose ou des membranes en m thacrylate de polym thyl ne semble pas affecter le dosage 8 Les gazes et ponges chirurgicales peuvent provoquer une lib ration de taux lev s 1 3 B D Glucane susceptibles de contribuer un r sultat positif transitoire d une contamination pour le dosage Fungitell comme cela a t observ chez des patients post chirurgicaux 20 21 9 Les kits dont le contenu est endommag ne doivent pas tre utilis s 10 Les mat riels expos s des liquides potentiellement contamin s contenant des pathog nes doivent tre limin s en conformit avec la r glementation locale Conservation des r actifs Conserver tous les r actifs tels que fournis l abri de la lumi re entre 2 et 8 C Le r actif Fungitell reconstitu doit tre conserv entre 2 et 8 C et utilis dans les 2 heures Par ailleurs le r actif Fungitell reconstitu peut tre congel 20 C pendant 20 jours puis d congel une seule fois avant utilisation
12. de fond 490 nm Si une lecture double longueur d onde n est pas disponible lire 405 nm La temp rature d incubation doit tre r gl e 37 C L agitation des plaques doit intervenir pendant 5 10 secondes avant le d but de la lecture Le mode choisi pour la courbe doit tre lin aire lin aire ou quivalent La lecture doit commencer sans d lai 1 Pr paration du standard Glucane fourni avec le kit a Dissoudre un flacon du standard Glucane avec le volume d EPA stipul sur le flacon pour obtenir une solution de 100 pg ml Vortexer au moins 30 secondes pour remettre en suspension solution 1 La solution de Glucane doit tre conserv e entre 2 et 8 C puis utilis e dans les 3 jours Les tapes b e ci dessous illustrent un exemple de pr paration d une gamme d talonnage b Pr parer 50 pg ml de standard en m langeant 500 ul d EPA et 500 ul de solution 1 dans un tube sans Glucane solution 2 Vortexer pendant au moins 10 secondes c Pr parer 25 pg ml de standard en m langeant 500 ul d EPA et 500 ul de solution 2 dans un tube sans Glucane solution 3 Vortexer pendant au moins 10 secondes d Pr parer 12 5 pg ml de standard en m langeant 500 ul d EPA et 500 ul de solution 3 dans un tube sans Glucane solution 4 Vortexer pendant au moins 10 secondes e Pr parer 6 25 pg ml de standard en m langeant 500 ul d EPA et 500 ul de solution 4 dans un tube sans Glucane solution 5 Vort
13. exer pendant au moins 10 secondes 2 Pr paration de r actif de pr traitement du s rum Le r actif alcalin de pr traitement du s rum convertit les Glucanes triple h lice en Glucanes monobrins 16 17 qui sont plus r actifs dans le dosage Le pH lev inactive aussi les s rines prot ases et les inhibiteurs de s rines prot ases dans le s rum qui peuvent donner respectivement un r sultat faux positif ou un r sultat faux n gatif 22 a Pr parer le r actif de pr traitement du s rum en combinant des volumes gaux de 0 25 M de KOH et 1 2 de M KCI et bien agiter Les volumes recommand s sont jusqu 900 ul de chaque r actif permettant deux pr parations Couvrir les flacons avec du Parafilm pour utilisation avec la seconde plaque Couvrir le flacon avec du Parafilm en utilisant la face du Parafilm qui adh rait au papier i Remarque lors du trac de la courbe standard multiplier la concentration des standards par 5 pour que la plage soit de 500 31 pg ml Saisir les standards dans les param tres du logiciels comme tant respectivement 500 250 125 62 5 et 31 pg ml Le volume de standard dans le dosage est 25 ul par puits ou cinq fois le volume de l chantillon de s rum La plaque de microtitration avec les standards St les t moins n gatifs Neg et 21 inconnus Uk tant chacun dos en double et dispos comme suit A B Stl Stl Uk1 Uk4 Uk7 Uk10 Uk13 Uk16 Uk19
14. gawa J Tanaka S Tamura H Shibata Y and Saito H 1993 Activation of Limulus coagulation factor G by several 1 3 B D Glucans Comparison of the potency of glucans with identical degree of polymerization but different conformations J Biochem 113 683 686 Kanda H Kubo K Hamasaki K Kanda Y Nakao A Kitamura T Fujita T Yamamoto K and Mimura T 2001 Influence of various hemodialysis membranes on the plasma 1 gt 3 B D Glucan level Kidney International 60 319 323 Kato A Takita T Furuhashi M Takahashi T Maruyama Y and Hishida A 2001 Elevation of blood 1 3 8 D Glucan concentrations in hemodialysis patients Nephron 89 15 19 Kanamori H Kanemitsu K Miyasaka T Ameku K Endo S Aoyagi T Inden K Hatta M Yamamoto N Kunishima H Yano H Kaku K Hirakat Y and Kaku M 2009 Measurement of 1 3 B D Glucan derived from different gauze types Tohoku J Exp Med 217 117 121 Mohr J Paetznick V Rodriguez J Finkelman M Cocanour C Rex J and Ostrosky Zeichner L 2005 A prospective pilot survey of B glucan BG seropositivity and its relationship to invasive candidiasis IC in the surgical ICU SICU ICAAC Poster M 168 22 23 24 25 Tamura H Arimoto Y Tanaka S Yoshida M Obayashi T and Kawai T 1994 Automated kinetic assay for endotoxin and 1 3 8B D Glucan in human blood Clin Chim Acta 226 109 112 Ogawa M Hori
15. ifs Gestion des chantillons probl me Si le biologiste observe des cin tiques de densit optique inhabituelle dans un test d chantillon qui sont floconneux d color s ou troubles tels ceux grossi rement h molys s lip miques ou contenant trop de bilirubine l chantillon doit tre dilu dans de l EPA et retest La dilution doit tre prise en compte dans la mention du r sultat en multipliant le r sultat par le facteur de dilution G n ralement le facteur de dilution est saisi dans la configuration du logiciel pour l chantillon et la correction est appliqu e automatiquement Les chantillons t moins des niveaux limites et hautement positifs doivent tre analys s pour v rifier que les r actifs et le dosage fonctionnent correctement Chaque utilisateur du test doit tablir un programme de contr le qualit pour assurer la qualification dans les r alisations du test LIMITES DU TEST 1 La localisation dans les tissus de l infection fongique 10 l encapsulation et la quantit de 1 3 B D Glucane produite par certains champignons peuvent affecter la concentration s rique de cet analyte La capacit r duite de contribution du 1 3 f D Glucane au flux sanguin peut r duire la capacit de d tecter certaines infections fongiques Cryptococcus spp produit de faibles taux de 1 3 B D Glucane 3 4 Les zygomyc tes dont Absidia ssp Mucor spp et Rhizopus spp ne sont pas connus pour produ
16. ional Institutes of Allergy and Infeectious disease Mycosis Study Group EORTC MSG Concensus Group Clin Inf Dis 46 1813 1821 Miyazaki T Kohno S Mitutake K Maesaki S Tanaka K I Ishikawa N and Hara K 1995 Plasma 1 3 8 D Glucan and fungal antigenemia in patients with candidemia aspergillosis and cryptococcosis J Clinical Microbiol 33 3115 3118 Mitsuya M Wada K and Yamaguchi H 1994 In vitro studies on the release of G Test positive 1 3 8 D Glucans from various fungal pathogens In Committee on Organic Dusts ICOH Report 1 94 Rylander R and Goto H editors pp 29 37 Girouard G Lachance C and Pelletier R 2007 Observations of 13 8B D Glucan detection as a diagnostic tool in endemic mycosis caused by Histoplasma or Blastomyces J Med Mycology 56 1001 1002 Walsh T J Groll A H Emerging fungal pathogens evolving challenges to immunocompromised patients for the twenty first century Transpl Infectious Dis 1999 1 247 261 Fishman J A Rubin R H Infection in organ transplant recipients New England Journal of Medicine 1998 338 1741 1751 Obayashi T Yoshida M Mori T Goto H Yasuoka A Iwasaki H Teshima H Kohno S Horichi A Ito A Yamaguchi H Shimada K and Kawai T 1995 Plasma 1 3 B D Glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes Lancet 345 17 20 Fridkin S K and Jarvis W R 1996 Epidemiology of nosoco
17. ire du 1 3 B D Glucane 1 4 Blastomyces dermatitidis en phase de levure produit peu de 1 3 B D Glucane et les r sultats du test sont g n ralement n gatifs 5 Certains individus ont des taux lev s de 1 3 B D Glucane qui tombent dans la zone ind termin e Dans de tels cas des tests suppl mentaires sont recommand s La fr quence des tests patients d pend du risque relatif d infection fongique Des fr quences de pr l vements d au moins deux trois fois par semaine sont recommand es pour les patients risque Des r sultats positifs ont t observ s chez des patients en h modialyse 18 19 des sujets trait s avec certains produits sanguins fractionn s comme l albumine s rique et les immunoglobulines 23 et chez les sp cimens ou sujets expos s des gazes contenant du glucane Les patients n cessitent 3 4 jours pour la restauration des taux initiaux de 1 3 B D Glucane apr s une exposition chirurgicale des ponges et gazes contenant du 1 gt 3 B D Glucane 20 21 En cons quence la chronologie des pr l vements chez des patients chirurgicaux doit prendre cet aspect en compte Les chantillons obtenus par des m thodes de ponction au talon ou au doigt ne sont pas acceptables car le tampon alcoolis pour pr parer le site et potentiellement la surface cutan e de prise de sang s est av r contaminer les sp cimens Les taux de 1 3 B D Glucane ont t tablis chez des sujet
18. isponibles 2 Les pathog nes fongiques opportunistes incluent Candida spp Aspergillus spp Fusarium spp Trichosporon spp Saccharomyces cerevisiae Acremonium spp Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Sporothrix schenckii et Pneumocystis jirovecii Le 1 gt 3 B D Glucane produit par ces organismes et d autres peut tre d tect par le dosage Fungitell 1 8 13 PRINCIPES DE LA PROC DURE Le dosage Fungitell mesure les taux de 1 3 B D Glucane Le dosage est bas sur une modification du m canisme du lysat d amoebocyte de limule Lymulus Amebocyte Lysate LAL 14 15 16 17 Figure 1 Le r actif Fungitell est modifi pour liminer le Facteur C et ainsi ne r agir qu au 1 3 B D Glucane par la voie du Facteur G de ce m canisme 1 3 f D Glucane active le facteur G un zymog ne s rine prot ase Le Facteur G activ convertit l enzyme inactif de procoagulation en enzyme de coagulation actif qui coupe la prot ine PNA du substrat peptidique chromog nique Boc Leu Gly Arg pNA cr ant un chromophore qui absorbe 405 nm Le dosage cin tique Fungitell d crit ci dessous est bas sur la d termination de l augmentation du taux de densit optique produite par un chantillon Ce taux est interpr t au regard d une courbe standard pour donner des estimations de la concentration de 1 3 f D Glucane dans l chantillon FIGURE 1 M canisme du lysat d amoebocyte de limule Endotoxine LPS
19. mial fungal infections Clin Micro Rev 9 499 511 Alexander B Diagnosis of fungal infection new technologies for the mycology laboratory Transpl Infectious Dis 2002 4 Suppl 3 32 37 in Europe Mycoses 52 197 205 Nucci M and Anaissie E 2009 Fungal infections in hematopoietic stem cell transplantation and solid organ transplantation Focus on aspergillosis Clin Chest Med 30 295 306 Odabasi Z Mattiuzzi G Estey E Kantarijian H Saeki F Ridge R Ketchum P Finkelman M Rex J and Ostrosky Zeichner L 2004 B Glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections Validation cut off development and performance in patients with Acute Myelogenous Leukemia and Myelodysplastic Syndrome CID 39 199 205 Iwanaga S Miyata T Tokunaga F and Muta T 1992 Molecular mechanism of hemolymph clotting system in Limulus Thrombosis Res 68 1 32 Tanaka S Aketagawa J Takahashi S Tsumuraya Y and Hashimoto Y 1991 Activation of a Limulus coagulation factor G by 13 B D Glucans Carbohydrate Res 218 167 174 Saito H Yoshioka Y Uehara N Aketagawa J Tanaka S and Shibata Y 1991 Relationship between conformation and biological response for 1 gt 3 B D Glucans in the activation of coagulation factor G from Limulus amebocyte lysate and host mediated antitumor activity Demonstration of single helix conformation as a stimulant Carbohydrate Res 217 181 190 Aketa
20. nement de test Une formation approfondie du technicien la m thode de dosage et la pr vention de la contamination est essentielle pour l efficacit du dosage 1 Certaines esp ces fongiques produisent de tr s faibles taux de 1 3 B D Glucane et ne sont g n ralement pas d tect es par le dosage Fungitell Celles ci incluent le genre Cryptococcus 3 4 ainsi que les zygomyc tes comme Absidia Mucor et Rhizopus 1 4 En outre Blastomyces dermatididis dans sa forme levure produit de faibles taux de 1 gt 3 B D Glucane et n est donc g n ralement pas d tect par le dosage Fungitell 5 Ne pas pipeter une substance avec la bouche Ne pas fumer manger ni boire dans les zones de manipulation des sp cimens ou des r actifs du kit 3 tablir un environnement propre dans lequel effectuer le dosage Utiliser des mat riels et r actifs certifi s sans interf rence avec les taux de 1 3 B D Glucane Noter que le Glucane ainsi qu une contamination fongique en provenance du corps humain de v tements de r cipients de poussi res a riennes ou aquatiques peut provoquer une interf rence avec le dosage Fungitell 4 Ne pas utiliser les r actifs au del de la date de p remption N 5 Des chantillons d color s ou troubles comme ceux grossi rement h molys s lip miques ou contenant trop de bilirubine peuvent provoquer des interf rences Si de tels chantillons sont dos s les r sultats doivent tre an
21. occus 3 4 qui produit de tr s faibles taux de 1 3 B D Glucane Le dosage ne d tecte pas les zygomyc tes comme Absidia Mucor et Rhizopus 1 4 qui ne sont pas connus pour produire du 1 3 B D Glucane De m me Blastomyces dermatitidis en phase de levure produit peu de 1 3 B D Glucane et est g n ralement ind tectable 5 R SULTAT N GATIF Des valeurs de 1 3 B D Glucane lt 60 pg ml sont interpr t es comme tant des r sultats n gatifs R SULTAT POSITIF Des valeurs gt 80 pg ml sont interpr t es comme tant positives Un r sultat positif signfie que du 1 gt 3 B D Glucane a t d tect Un r sultat positif n indique pas la pr sence d une maladie et ne doit pas tre associ aux autres signes cliniques pour tablir un diagnostic R SULTAT IND TERMIN S Des valeurs comprises entre 60 et 79 pg ml sugg rent une possible infection fongique Des pr l vements et tests de s rum suppl mentaires sont recommand s Les pr l vements et tests fr quents am liorent l utilit du diagnostic CONTR LE DE QUALIT Le coefficient de corr lation r de la courbe standard lin aire contre lin aire doit tre gt 0 980 Les puits 25 ul d EPA sont des t moins n gatifs Les t moins n gatifs doivent avoir des valeurs de taux de densit optique r elle Vmoyenne inf rieures de 50 au standard le plus faible Dans le cas contraire le dosage doit tre r p t avec de nouveaux r act
22. puis laisser incuber pendant 10 minutes 37 C dans le lecteur de plaque en incubation 4 Reconstitution du r actif Fungitell Remarque cela peut tre effectu pendant l incubation de pr traitement pour des raisons pratiques a Reconstituer un flacon de r actif Fungitell en ajoutant 2 8 ml d EPA puis 2 8 ml de tampon de reconstitution Pyrosol au moyen d un pipeteur de 1000 ul Couvrir le flacon avec du Parafilm en utilisant la face du Parafilm Agiter doucement le flacon pour dissoudre compl tement ne pas vortexer 5 Ajout de t moins n gatifs et de standards Glucane la fin de l incubation de pr traitement du s rum tape 3 d retirer la plaque du lecteur de plaque en incubation et ajouter les standards et les t moins n gatifs la plaque a Ajouter 25 ul d EPA aux puits G2 et G3 b Ajouter 25 ul aux 6 25 pg ml de solution standard 5 aux puits F2 et F3 c Ajouter 25 ul aux 12 5 pg ml de solution standard 4 aux puits E2 et E3 d Ajouter 25 ul aux 25 pg ml de solution standard 3 aux puits D2 et D3 e Ajouter 25 ul aux 50 pg ml de solution standard 2 aux puits C2 et C3 f Ajouter 25 ul aux 100 pg ml de solution standard 1 aux puits B2 et B3 6 Ajout du r actif Fungitell et proc dure d incubation de la plaque a Ajouter 100 ul de r actif Fungitell chaque puits contenant t moins n gatifs standards et chantillons au moyen du pipeteur r p tition b Introduire la plaque dans le lecteu
23. r d tecter des mycoses et fong mies Trois cent cinquante neuf 359 patients ont t test s avec le dosage Un chantillon unique a t obtenu de chaque patient Les sujets faible risque ont inclus des individus apparemment sains et des patients de sites cliniques hospitalis s pour des raisons autres que des infections fongiques Le recrutement des sujets a t conduit dans six centres m dicaux des tats Unis Quatre de ces centres ont r alis le dosage et test un total de 285 chantillons ACC a test l ensemble des 359 chantillons deux fois mais n a utilis que le second jeu de r sultats pour tablir les performances du dosage Les r sultats de deuxi me jeu d analyses n ont pas t statistiquement diff rents de ceux du premier jeu La sensibilit de l ensemble de la population des sujets 359 y compris Cryptococcus a t de 65 0 intervalle de confiance I C de 60 1 70 0 La sp cificit a t de 81 1 I C de 77 1 85 2 Tableau 1 Les r sultats des tests obtenus dans les quatre centres ont ont montr une plage de sensibilit de 50 0 66 7 La sp cificit a t comprise entre 70 0 et 93 0 sur les 285 chantillons test s Tableau 2 Tableau 1 R sultats des tests r alis s par ACC pour des valeurs seuil de 60 80 pg ml par site Prouv Probable Sp cificit Sensibilit gt 80 pg ml lt 60 pg ml 3
24. r de microplaque quilibr 37 C avec le couvercle et remuer pendant 5 10 secondes Lire la plaque sans le couvercle 405 nm moins 490 nm pendant 40 minutes 37 C Si la soustraction du bruit de fond 490 nm n est pas disponible une lecture 405 nm est acceptable En l absence de fonction d agitation sur le lecteur de microplaque on peut utiliser un agitateur de microplaque externe c Collecter les donn es et les analyser comme suit examiner les parcelles de densit optique des chantillons analyser et v rifier les mod les de trace cin tique autres qu une augmentation homog ne comparable celles des normes Les parcelles non valides indiquent une interf rence optique Calculer le taux moyen de variation de densit optique unit s de milli absorbance par minute pour tous les points entre 0 et 40 minutes INTERPR TATION DES R SULTATS Les r sultats de tests Fungitell doivent tre utilis s comme aide au diagnostic d une infection fongique Les r sultats sont exprim s en pg ml de s rum et vont du non d tectable lt 31 pg ml gt 500 pg ml et sont imprim s par le logiciel ou lus sur la courbe standard Les valeurs pr cises sup rieures 500 pg ml n cessitent une dilution de l chantillon dans de l EPA et un nouveau test Le laboratoire r alisant le test doit informer le m decin prescripteur que le test Fungitell ne d tecte pas certaines esp ces fongiques comme l esp ce Cryptoc
25. ra T and Ieki R 1996 Evaluation of the diagnostic value of the measurement of 1 3 B D Glucan in patients with pulmonary aspergillosis Respiration 63 78 83 L GENDE DES SYMBOLES z utiliser avant Contenu suffisant pour lt n gt tests LOT Code du lot IvD Dispositif m dical pour diagnostic in vitro REF R f rence n X Limite de temp rature Mi Fabricant CT Voir mode d emploi ec rer Repr sentant agr Marque CE EC REP Associates of Cape Cod International Inc Deacon Park Moorgate Road Knowsley Liverpool L33 7RX UK
26. s adultes Les taux normaux chez le nourrisson et l enfant approchent ceux des adultes 24 On ne dispose pas de donn es pour les nouveaux n s et les nourrissons de moins de 6 mois La zone de mesure est de 31 pg ml 500 pg ml Les valeurs lt 31 pg ml doivent tre mentionn es comme tant lt 31 pg ml Les valeurs gt 500 pg ml doivent tre mentionn es comme tant gt 500 pg ml sauf si l chantillon a t dilu SUSBSTANCES CR ANT DES INTERF RENCES Les conditions suivantes des chantillons peuvent cr er une interf rence avec un r sultat pr cis de dosage Fungitell H molyse Turbidit de l chantillon provoqu e par une lip mie e Pr sence visible de bilirubine S rum trouble R SULTATS ATTENDUS Les valeurs de b ta Glucane sont lev es dans diff rentes infections fongiques Quand des signes et sympt mes sont pr sents des taux de 80 pg ml ou plus la valeur pr dictive positive du test pour une infection fongique est comprise entre 74 4 et 91 7 Tableau 2 En l absence de signes et sympt mes moins de 60 pg ml les valeurs pr dictives n gatives sont comprises entre 65 1 et 85 1 PERFORMANCES ET CARACTERISTIQUES Test de comparaison Une tude prospective multicentrique a t conduite pour valider les performances du dosage Fungitell 25 Le test a t compar d autres m thodes standard de d tection c est dire h moculture biopsique et examen radiologiques pou
27. the clinical utility of serial 8 D Glucan concentrations in patients with persistent neutropenic fever J Med Microbiol 57 287 95 Marty F M Lowry C M Lempitski S J Kubiak D W Finkelman M A and Baden L R 2006 Reactivity of 1 gt 3 B D Glucan assay with commonly used intravenous antimicrobials Antimicrob Agents Chemo 50 3450 3453 Marty F M Koo S Bryar and J and Baden L R 2007 1 3 B D Glucan assay positivity in patients with Pneumocystis carinii jiroveci pneumonia Ann Int Med 147 70 72 Obayashi T Yoshida M Tamura H Aketagawa J Tanaka S and Kawai T 1992 Determination of plasma 1 3 B D Glucan A new diagnostic aid to deep mycosis J Medical and Vet Mycol 30 275 280 Tamura H Arimoto Y Tanaka S Yoshida M Obayashi T and Kawai T 1994 Automated kinetic assay for endotoxin and 1 3 8B D Glucan in human blood Clinica Chimica Acta 226 109 112 Yasuoka A Tachikawa N Shimada K Kimura S and Oka S 1996 1 gt 3 B D Glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia Clinical and Diagnostic Lab Immuno 3 197 199 Yoshida M Obayashi T Iwama A Ito M Tsunoda S Suzuki T Muroi K Ohta M Sakamoto S and Miura Y 1997 Detection of plasma 1 gt 3 8B D Glucan in patients with Fusarium Trichosporon Saccharomyces and Acremonium fungaemias J Med Vet Mycology 35 371 374 Yuasa K Goto H Iguchi M Okamu
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